JPH03244385A - ヒト神経成長因子の遺伝子工学的生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト神経成長因子（以下ｈＮＧＦと略記する
。）に対応する合成遺伝子ＤＮＡ、該遺伝子を有するプ
ラスミドベクター、該プラスミドベクターにより形質転
換された形質転換体、及び該形質転換体を用いてｈＮＧ
Ｆを生産する方法に関する。

〔従来の技術〕

神経細胞の生存、神経突起の伸長や神経細胞の分化に関
与しているポリペプチドとして神経成長因子（ＮＧＦ）
が知られている。雄の成熟マウス顎下腺より抽出された
ＮＧＦは、分子量１４０，０００のポリペプチドであり
、沈降定数から７３ＮＧＦと呼ばれている。そのうちの
βサブユニットは単独でＮＧＦ活性を示し、１１８個の
アミノ酸から成るポリペプチドであり、βＮＣＦと呼ば
れている。一方、ヒトのＮＧＦはマウス顎下腺のように
大量に存在する組織が認められていない。そこで、マウ
スのβＮＧＦｃＤＮＡをプローブとして、ヒト遺伝子ラ
イブラリーをスクリーニングしてｈＮＧＦ遺伝子を単離
して、それからア貴ノ酸配列が決定された（特開昭６０
−８４２９９号）。

ｈＮＧＦは神経疾患治療薬としての可能性が考えられて
おり、これには、大量のｈＮＧＦが必要とされる。一方
、最近、遺伝子工学的手法を用いて大腸菌に異種の蛋白
質を大量生産させることが可能になっており、ｈＮＧＦ
に対しても遺伝子工学的手法により生産させる試みがな
されている。

例えば、特開昭６０−８４２９９号においては天然のｈ
ＮＧＦ遺伝子を用いて遺伝子発現が試みられている。こ
の手法は、ｈＮＧＦ遺伝子を発現ベクターに組込み、当
該ベクターを保持する細胞、特に大腸菌を培養する方法
により、ｈＮＧＦを大量生産するものである。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、上記した公知技術においては、ｈＮＧＦ
遺伝子を宿主細胞において発現効率の高い塩基配列にす
ること及びベクターを発現効率の高いものにすること並
びに発現ベクターにより形質転換された細胞の培地条件
をｈＮＧＦの生産に適したものにすること等について充
分な配慮がなされているものとはいえず、容易にかつ大
量にｈＮＧＦを宿主細胞、特に大腸菌に生産させること
が難しいという問題があった。

本発明の課題は、大腸菌等の宿主細胞において発現効率
の高い塩基配列を有する新たに合成されたｈＮＧＦ遺伝
子ＤＮＡ、及び該ＤＮＡを発現効率の高いプロモータと
ともに組み込んだ組換えプラスミド、並びにこの組換え
プラスミドにより形質転換された優れたｈＮＧＦ生産能
を有する形質転換微生物を提供することにあり、更に、
この形質転換微生物を培養し、またこの際、好適な培地
条件を適用して、ｈＮＧＦを効率良く生産する新規な方
法を提供する点にある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を行
った結果、本発明を充放させたものであって、本発明の
特徴は以下の（１）〜側の点にある。

（１）下記の塩基配列を有するヒト神経成長因子をコー
ドするＤＮＡ。

ＡＧＣＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＣＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣ
ＧＴＧＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＣＧＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣ
ＴＧＴＣＴＣＴＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＡＡ
ＡＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＴＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＧＣＡ
ＡＡＧＡＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＧＡＡＧＴ
ＴＡＡＣＡＴＴＡＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＴＣＡＡＡ
ＣＡＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＴＧＣＣ
ＧＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＣＣＧＧＴＴ（、ＡＣＴＣＴＧ
ＧＣＴＧＣＣＧＣＧＧＣＡＴＣＧＡＴＴＣＴＡＡＡＣＡ
ＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＴＡＣＴＧＣＡＣＣＡＣＴＡＣＴ
ＣＡＣＡＣＣＴＴＣＧＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＣＴＡ
ＴＧＧＡＴＧＧＴＡＡＡＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＣＧ
ＴＴＴＣＡＴＣＣＧＴＡＴＣＧＡＴＡ　ＣＴ　Ｇ　ＣＡ
Ｔ　Ｇ　ＣＧ　Ｔ　ＧＴ’ＧＴ　Ｇ　ＴＡ　ＣＴ　ＧＴ
ＣＣＣＧＴＡＡＡＣ；ＣＴＧＴＴＣＧＴ（２）上記（１
）記載のＤＮＡの５′末端上流側にβラクタマーゼのシ
グナル配列をコードする　ＤＮＡを結合せしめたＤＮＡ
。

（３）　　β−ラクタマーゼのシグナル配列をコードす
るＤＮＡが下記の塩基配列を有するものである上記（２
）記載のＤＮＡ。

ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴ’Ｃ
ＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴ
ＴＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＧＣＧ （４）上記（２）又は（３）記載のＤＮＡ配列の上流側
にトリプトファン調節遺伝子が結合したＤＮＡ。

（５）上記（１）記載のＤＮＡの５′末端上流側に、ト
リプトファン調節遺伝子につながったトリプトファンオ
ペロンのｔｒｐＬポリペプタイドのＮ末端側をコードす
るＤＮＡが結合したＤＮＡ。

（６）トリプトファンｉＰ１節遺伝子につながったトリ
プトファンオペロンのｔｒｐＬポリペプタイドのＮ末端
側をコードするＤＮＡが下記の塩基配列を有する上記（
５）記載のＤＮＡ。

ＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＧＴＧＧＡＡＴＣ （７）上記（１）記載のＤＮＡの５′末端上流側に、ト
リプトファン調節遺伝子につながったトリプトファンオ
ペロンのｔｒｐＥポリペプタイドのＮ末端側をコードす
るＤＮＡが結合したＤ　Ｎ　Ａ　。

（８）トリプトファン調節遺伝子につながったトリプト
ファンオペロンのｔｒｐＥポリペプタイドのＮ末端側を
コードするＤＮＡが下記の塩基配列を有する上記（７）
記載のＤＮＡ。

ＡＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＧＡＣＴＧＧＧＧ
ＡＡＴＴＣ （９）上記（１）〜（８）いずれか記載のＤＮＡを有す
るプラスミドベクター。

００）微生物を上記（９）記載のプラスミドベクターに
より形質転換して得られた形質転換体。

（１０微生物が大腸菌である上記Ｏｎ）記載の形質転換
体。

０２）　　上記ＧＯ）又は（ＩＩ）記載の形質転換体を
培養し、ヒト神経成長因子を生産せしめることを特徴と
するヒト神経成長因子の生産方法。

０つ　誘導物質としてＩＡ（３−β−インドールアクリ
ル酸）を添加して培養を行う上記０２）記載のヒト神経
成長因子の生産方法。

ＯＩＯトリプトファンを含まない培地を用いて培養を行
う上記０２）又は０３）記載のヒト神経成長因子の生産
方法。

以下、本発明を詳述する。

ｈＮＧＦのアミノ酸配列はＵｌｌｒｉｃｈら（Ｎａｔｕ
ｒｅ。

３０３．８２１　（１９８３））により決定されており
、１１８個のアミノ酸からなる。

この１１８個のア旦ノ酸からなるｈＮＧＦ遺伝子の塩基
配列は、アミノ酸と遺伝子コドンの対応表から一応予測
はできるが、１つのアミノ酸に対応する遺伝子コドンは
複数あるため、この対応は一義的ではない。そして発現
効率の高いｈＮＧＦ遺伝子ＤＮＡの得るためには、ｈＮ
ＧＦのアミノ酸配列から予測される幾通りかの遺伝子の
塩基配列のうち、その中で使われている遺伝子コドンが
使用する宿主細胞、特に大腸菌細胞内で出現頻度の高い
ものであるかどうか、またこれを有機合成する際に、ミ
スの起こり難い構造であるかどうか、さらにはＤＮＡか
ら転写されたｍＲＮＡが２次構造を形成し易いためにリ
ポソームによる翻訳の効率低下が生しないかどうかを検
討する必要がある。

本発明においては、これらの点を検討してｈ　ＮＧＦの
構造遺伝子の塩基配列として最も適切と考えられる本発
明の特徴点（１）に示した塩基配列を設定し、該塩基配
列の前半部分と後半部分の配列を各々含むＤＮＡ配列Ａ
として示したＤＮＡ　（第１図）とＤＮＡ配列Ｂとして
示したＤＮＡ　（第２図）の−種のＤＮＡ鎖を構築し、
これらを各々別のプラスミドｐＴＲＬＢＴ１　［このプ
ラスミドは大腸菌ＨＢＩＯＩに導入し、ＨＢＩＯＩ（ｐ
ＴＲＬＢＴｌ）の形で微工研に寄託している。寄託番号
は微工研菌寄第９９０７号である。１に挿入した後、こ
の２つの組み換えプラスミドを用いて、ＤＮＡ配列Ａと
ＤＮＡ配列Ｂとが連結された全長のｈＮＧＦ遺伝子の塩
基配列を作製するものである。

上記の第１図のＤＮＡ配列Ａについて具体的に説明する
と該ＤＮＡ配列は例えば自動ＤＮＡ合威台底アブライド
ハイオシステムズ社３８０Ｂ型）を用いて有機化学合成
した８本のＤＮＡ断片より調製された２８３塩基対のＤ
ＮＡよりなり、５′側に制限酵素のＨｐａＩ部位、３′
側にＢａｍＨ１部位を有し、トリプトファン調節遺伝子
（プロモータ）の一部、β−ラクタマーゼのシグナルペ
プチド塩基配列、ｈＮＧＦのＮ末端アミノ酸のセリンか
ら第５５番目のアミノ酸のグルタミン酸までのアミノ酸
をコードする遺伝子及び終止コドンのＴＡＡ、ＴＡＧよ
りなる。さらには終止コドンの前にＳｍａ　ｒ部位（Ｃ
ＣＣＧＧＧ　）を設け、これを利用してβガラクトシダ
ーゼ遺伝子が連結できるようにしたものである。

また、第２図のＤＮＡ配列Ｂは、同様に化学合成した６
木のＤＮＡ断片より調製された２０３塩基対よりなり、
５′側に制限酵素のＥｃｏＲＩ部位、３′側にＢａｍＨ
１部位を有し、ｈＮＧＦの第５４番目のアミノ酸のフェ
ニルアラニンから第１１８番目のアルギニンまでのアミ
ノ酸をコードする遺伝子及び終止コドンのＴＡＡ、ＴＡ
Ｃ；よりなるものである。これらＤＮＡ配列八及へＢの
制限酵素切断地図を第５図に示す。ＤＮＡ配列Ａ又はＢ
はそれぞれプラスミドヘクタ−ｐＴＲＬＢＴ　１のＨｐ
ａ　Ｉ部位とＢａｍ１−Ｉ　Ｉ部位の間、ＥｃｏＲＩ部
位とＢａｍ８１部位の間に挿入され（第６．７図、プラ
スミドｐＴＲ５ＮＧＦＡ、　ｐＴＲ５’ＱＧＦＢ　）ク
ローニングが可能となる。

なおこの場合、Ｄ　Ｎ　Ａ配列Ａが挿入されたプラスミ
ド（第６図ｐＴＲＳＮＧＦＡ　）においては、ＤＮＡ配
列Ａ中のトリプトファンプロモータの一部が同プロモー
タの後半部分の塩基配列を有し、ｐＴＲＬＢＴｌのＨｐ
ａｌ　−ＢａｍＨＩ　　ＤＮＡＵＴ片中のトリプトファ
ンプロモータ前半部分と結合することによりトリプトフ
ァンプロモータが再構築されている。このようにクロー
ニングされたＤＮＡ配列Ａ又はＢは、それぞれ別個に大
腸菌により発現が可能であり、ｈＮＧＦの分割されたＡ
又はＢペプチドとして得ることができる。全長のｈＮＧ
Ｆ遺伝子は、ＤＮＡ配列Ａの３′側にある制限酵素Ｎ５
ｐＶ部位（ＴＴＣＧＡＡ）及びＤＮＡ配列Ｂの５′側に
ある同し制限酵素Ｎ５ｐＶ部位を利用して連結すること
により、作製できる（第８図参照）。このようにして作
製したｈＮＧＦ遺伝子を有するプラスミドはｐＴＲ３Ｎ
ＧＦＡ由来のトリプトファンプロモータを有しているた
め発現効率が良好であり、更にβ−ラクタマーゼのシグ
ナルペプチドをｈＮＧＦ遺伝子上流側に有するため、こ
れを保持する大腸菌を培養することにより成熟型のｈＮ
ＧＦを大腸菌のペリプラズム領域に分泌することが可能
である。

また本発明の全長ｈＮＧＦ遺伝子ＤＮＡを有するプラス
ミドを調製する別法としては以下の方法も挙げれること
ができる。（第９図参照）すなわち、前記したＤ　Ｎ　
Ａ配列Ａを有するプラスミド（ｐＴＲＳＮＧＦＡ　）を
ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断して得た断片と、プラ
スくドｐＴＲＬＢＴ　１を同しく　ＥｃｏＲＩ及びＢａ
ｍＨＩで切断して得た断片とを連結させる。

このＤＮＡ配列Ａ部分を有するプラスミド（ｐＴＲＬ−
ＮＧＦＡ’　）のＥｃｏＲｒ切断部位にリンカ−を連結
せしめた後、Ｎ５ｐＶ及びＢａｍＨＩで切断する。この
断片とＤＮＡ配列Ｂを有する前記プラスミド（ｐＴＲＬ
ＮＧＦＢ）をＮ５ｐＶ及びＢａｍＨＩで切断して得た断
片とを連結させることにより、ＤＮＡ配列ＡとＤＮ、Ａ
配列Ｂを接続させ全長のｈＮＧＦ遺伝子の塩基配列を有
するプラスミド　（ｐＴＲＬＮＧＦ）を得ることができ
る。このプラスミドは全長ｈＮＧＦ遺伝子の５′上流側
にトリプトファンプロモータにつながったトリプトファ
ンオペロンのｔｒｐＬポリペプタイドのＮ末端側（リー
ダペプタイド）をコードするＤＮＡを有するものであり
、このｔｒｐＬポリペプタイドのＮ末端側をコードする
ＤＮＡ　（図中ｔｒｐＬ　’　として示されている。）
は以下の塩基配列を有している。

ＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣし
たがって、このプラスミドによる形質転換微生物を培養
して得られるポリペフタイドは、このｔｒｐＬ由来の８
個のアミノ酸とｈＮＧＦとが融合した形態のものとなる
。

さらに本発明においては、この全長ｈＮＧＦ遺伝子の５
′上流側に、トリプトファンプロモータにつながったト
リプトファンオペロンのｔｒｐＬポリペプタイドのＮ末
端側をコードするＤＮＡを有するプラスミド（ｐＴＲＬ
ＮＧＦ）をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、この切
断断片とｐＴＲＥＢＴＩ　にのプラスミドは大腸菌ＨＢ
ＩＯＬに導入し、ＨＢＩＯＩ　（ｐＴＲＥＢＴ　１　）
の形で微工研に寄託している。寄託番号は微工研菌寄第
９９０８号である。〕のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩによ
る切断断片と連結させて新たなプラスミドを構築するこ
ともできる（第１０図参照）。これにより得られたプラ
スミド（ｐＴＲＥＮＧＦ）は全長のｈＮＧＦ遺伝子の５
′上流側にトリプトファンプロモータにつながったｔｒ
ｐＬ及びｔｒｐＥ　（アントラニル酸合成酵素）のＮ末
端側をコードするＤＮＡを含むものであり、このｔｒｐ
ＥポリペプタイドのＮ末端側をコードするＤＮＡ　（第
１０図中ｔｒｐＥ　’として示されている。）は以下の
塩基配列を有している。

ＡＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＧＡＣＴＧＧＧＧ
ＡＡＴＴＣしたがってこのプラスミドによる形質転換微
生物５二より生産されるポリペプタイドはｔｒｐＥ由来
の１０個のアミノ酸とｈＮＧＦとが融合した形態のもの
となる。

このようにして得られたプラスミドｐＴＲＬＮＧＦ及フ
ｐＴＲＥＮＧＦはいずれもｈＮＧＦを良好に発現させ［
Ｆ］。

さらに、１１８個のアミノ酸をコートした全長のｈＮＧ
Ｆ遺伝子を有するこれらのプラスミド（ｐＴＲ５ＮＧＦ
　、　　ｐＴＲＬＮＧＦ　、　ｐＴＲＥＮＧＦ）を用い
て大腸菌等の宿主微生物を常法により形質転換すれば優
れたｈ＼ＧＦ生産能を有する形質転換微生物を得ること
ができる。

圭た、この形質転換微生物を培養してｈＮＧＦを生産す
る際には培地条件として遺伝子の発現を開始させるため
に、トリプトファンのアナログ物質であるＩＡ（３−β
−インドールアクリル酸）を培地に添加するか又はトリ
プトファンを含まない培地を使用することが好ましく、
これによりｈＮＧＦの生産収率は更に向上する。

これは、次の理由によるものである。すなわち遺伝子の
発現はプロモータと称する遺伝子領域により調節されて
いる。ｔｒｐプロモータの場合はＲＮＡ合成酵素がｔｒ
ｐプロモータに結合し、この酵素がプロモータ下流に移
動しＤＮＡ塩基配列を転写することによりＲＮＡが合成
される。そして、ここで合成されたＲＮＡの情報をリポ
ソームが翻訳することによりポリペプチドが合成される
。

方、細胞内のトリプトファン濃度が増加するとトリプト
ファンがリプレッサに結合し、これを活性化させ、リプ
レッサがオペレータと称する領域に結合する。この結果
、ＲＮＡ合或合成がプロモータ部分に結合できなくなり
、ＲＮＡが合成されずポリペプチドの生成が停止するの
である。この場合、トリプトファンは抑制物質として働
く。そこで、本発明者らはｔｒｐプロモータに於ける遺
伝子発現調節を利用して、ＩＡの添加によるリプレッサ
の不活性化又はトリプトファンを含まない培地に切り替
えることにより、遺伝子発現を開始させる方法を採用し
たのである。

〔発明の効果〕

本発明においては、ｈＮＧＦ遺伝子の塩基配列を宿主微
生物特に大腸菌において発現効率の高い塩基配列とする
とともに、該遺伝子を発現効率の優れたプロモータとと
もにプラスミドに組み込んだことにより、該プラスミド
により形質転換された形質転換微生物における、該ｈＮ
ＧＦ遺伝子の発現効率は極めて良好なものとなり、また
これに加えて培地条件を更に改良した結果、ｈＮＧＦを
容易にかつ大量に生産することが可能となった。

したがって、本発明は医薬品製造において大いに貢献す
るものである。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例について具体的に説明するが、本
発明はこれによりなんら限定されるものではない。

実施例１ （１）　　ｈ　Ｎ　Ｇ　Ｆの構造遺伝子のＤＮＡ塩基配
列設計及びＤＮＡ小断片の有機化学合成 バクテリアのコドン出現頻度表（Ｃｏｕｙら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｃｌｓ　Ｒｅｓ、、　ｉｌｌ、　７０５
５（１９８２）　）を参考に大腸菌体内で出現頻度の高
い遺伝子コドンを各アミノ酸毎に選択し、さらに、遺伝
子の入れ替えが簡単になるように各種制限酵素切断部位
がｈＮＧＦ構造遺構造遺伝子女るようにしたｈＮＧＦの
塩基配列を設計した。この設計に基づき、Ａ−１〜Ａ−
８の８本の一本鎖ＤＮＡ　（第３図）及び８１〜Ｂ−６
の６本の一本鎖ＤＮＡ　（第４図）を自動ＤＮＡ合成機
（アブライドハイオシステムズ社３８０Ｂ型）を用いて
合成した。これらの−末鎖ＤＮＡは塩基対数５７〜７５
の小断片である。

合成された各−木鎖ＤＮＡをレジン担体より切り離した
後尿素変性８％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳
動した。目的の大きさのＤＮＡハンドを含むゲル断片を
切り取り、電気泳動によりＤＮＡを回収した。回収した
ＤＮＡを濃縮した後、フェノール処理、エタノール処理
して精製し、滅菌水に溶解した。以上の方法により、目
的の一本鎖ＤＮＡをｌＯＯμｇ〜２００μｇ得ることが
できた。

（２）　　ｈ　Ｎ　Ｇ　Ｆ構造遺伝子の前半部の塩基配
列を有するＤＮＡ配列配列台むプラスミドの作成（第６
図参照） 化学合成したＤＮＡ断片Ａ−２〜Ａ−７の６断片の各２
５０ｐｍｏｌをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼｌμｆ！
、（ＩＯＵ）と１０ｍＭ　ＡＴＰ２　ｕ　ｌを用いて３
７°Ｃ２１時間反応させて５′−末端をリン酸化した。

ＤＮＡ断片の各５０ｐｍｏｌを用いてＡ−１とＡ５　Ａ
−２とＡ−６Ａ−３とＡ−７，Ａ−４とＡ−８を次のよ
うにアニーリングさせた。反応’ｔＦＩＦ３ｕＱＬこ５
０μｌのミネラルオイルを加え、７５°Ｃで１０分間保
持した後４．５時間かけて冷却して、二本鎖ＤＮＡを４
本件製した。作製した４本の二本鎖ＤＮＡを混合し、ラ
イゲーションキット（宝酒造製）にて連結した。反応液
の１／４０量の１ｕｉにＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．
５μｍ（２゜５Ｕ）、４種のｄ！ＪＴＰ　１６μｌ（各
１．２５ｍＭ）　、２種のプライマー５μｉずつ（Ａ−
１の５′末端にＧＴＴを付加した後、リン酸化したＤＮ
Ａと、Ａ８の５′末端にＧを付加した後、リン酸化した
ＤＮＡ）及び緩衝液を加えて全量１００１Ｉｆｆｉとし
、且つミネラルオイル１００μｌを加えてＰＣＲ（ポリ
メラーゼチェインリアクション）増幅を行った。

条件は９４゛Ｃで１分間、５５°Ｃで２分間、７２°Ｃ
で３分間の反応を２５回繰り返して、最後に７２°Ｃで
１７分間として反応させた。その後ミネラルオイルを除
去し、エタノール沈澱処理を２回行った。ＰＣＲにより
生成したＤ　Ｎ　Ａ混合物を５％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動し、目的の大きさのＤＮＡハンドを含むゲル
断片を切り取り、電気泳動によりＤＮＡを回収した。回
収したＤＮＡを濃縮した後、フェノール処理、エタノー
ル処理して精製し、滅菌水に溶解した。精製したＤＮＡ
溶液１ｐｌにＳｍａ　Ｔを切断したＭ１３ｍｐＨファー
ジ１μＣを加え、ライゲーションキットにて連結した後
、大腸菌ＪＭ１０３株を形質転換した。挿入断片を有す
る２２個のプラークが得られ、ＤＮＡシーケンシングに
よりその内３個が目的のＤＮＡ配列Ａを有することが分
かった。目的のＤＮＡ配列配列台するＭ１３ｍｐＨファ
ージをＢａｍＨＩ　とＨｐａ　Ｉで切断して２８３塩基
対のＤＮＡ配列配列台収し、同しく　Ｈａｉｌ（Ｉ　と
ＨｐａＩで切断したｐＴＲＬＢＴ　１と連結して大腸菌
Ｃ６００株を形質転換したところ、８個のコロニーが得
られた。この８クローンの　ＤＮＡを制限酵素で切断し
て解析した結果、２個のクローンが目的のプラスミドで
あることが分かり、第１図の塩基配列からなるＤＮＡ配
列配列台するプラス祝ＦｐＴＲ３ＮＧＦＡ（３２μｇ）
を得ることができた。

なおりＮＡ配列Ａの制限酵素切断地図を第５図に示す。

（３）ｈＮＧＦ構造遺伝子の後半部のＤＮＡ配列配列台
むプラスミドの作製（第７図参照）化学台底したＤＮＡ
断片Ｂ−２〜Ｂ−５の４断片の各３００ｐｍｏｌをＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ１μＣ（ＩＯ＋、、ｌ）と１
０ｍＭ　ＡＴＰＩ　Ｏｕ　ｅと緩衝液を用いて全量１０
０μｌとして反応させ、５′末端をリン酸化した。各３
００μｍｏｌのＤＮＡ断片のＢ−１とＢ−４，Ｂ−２と
Ｂ−５Ｂ−３とＢ６を７０゛Ｃで１０分間保持した後、
４．５時間かけて冷却しアニーリングさせ、二本鎖ＤＮ
Ａを３本件製した。作製した３本の二本鎖ＤＮＡ、Ｂ−
１とＢ−４は３０．５μＬ　Ｂ−２とＢ−５は５７μｆ
、Ｂ−３とＢ−６は３９．３μｉを用いて混合し、フェ
ノール処理、エタノール処理後、ライゲーションキット
にて連結した。連結したＤＮＡを５％ポリアクリルアミ
ドゲルにて電気泳動し、目的の大きさのＤＮＡハンドを
含むゲル断片を切り取り、電気泳動によりＤＮＡを回収
した。回収したＤＮＡを濃縮した後、フェノール処理、
エタノール処理して精製し、滅菌水に溶解した。精製し
たＤＮＡの約半量を含む溶液の１μ２にＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ０．５μｌ（２，５Ｕ）、４種のｄＮＴＰｌ
　６　ｕ　ｆ　（各１．２５ｍＭ）、２種のプライマ、
つまりＢ−１の５′末端をリン酸化した［１ＮＡ２．５
μＥとＢ−６の５′末端をリン酸化したＤＮＡ３．８μ
ｌ及び緩衝液を加えて全量１００μＥとし、且つミネラ
ルオイル１００μｌを加えてＰＣＲを行った。条件は９
４°Ｃで１分間、５５°Ｃで２分間、７２”Ｃで３分間
の反応を２５回繰り返して、最後に７２°Ｃで７分間と
して反応させた。その後ミネラルオイルを除去し、エタ
ノール沈澱処理を２回行った。ＰＣＲにより生成したＤ
ＮＡの水溶液１μ２に、Ｘｂａｌ切断した後平屑化した
Ｍ１３ｍｐＨファージ１μｉを加え、ライゲーションキ
ットにて連結した後、大腸菌ＪＭ１０３株を形質転換し
た。挿入断片を有する５個のプラークが得られ、ＤＮＡ
　ンーケンシングによりその内１個が目的のＤＮＡ配列
配列台することが分かった。目的のＤＮＡ　ｇ、列Ｂを
有するＭ１３ｍｐＨファージをＥｃｏＲＩとＢａｍ　Ｈ
Ｉて切断して２０３塩基対のＤＮＡ配列配列台収じ、同
しく　ＥｃｏＲＩ　とＢａｍＨＩで切断したｐＴＲＬＢ
ＴＩと連結５て大腸菌Ｃ６００株を形質転換したところ
、１７０個のコロニーが得られた。この内の１６クロー
ンのＤＮＡを制限酵素で切断して解析した結果、全ての
クローンが目的のプラスミドであることが分かり、第２
図の塩基配列からなるＤ　Ｎ　Ａ配列Ｂを有するプラス
ミドＩ）ＴＲＬＮＧＦＢの１５２μｇを得ることができ
た。

なおりＮＡ配列Ｂの制限酵素切断地図を第５図に示す。

（４）全長ｈＮＧＦ構造遺伝子を含むプラスミドの作製
（第８図参照） プラスミドｐＴＲ５ＮＧＦＡの１μｇをＮｓｐ　（７５
２４）　Ｖを２０１ＪとＢａｍ）ＩＩを２０ｔＪを用い
て切′＃ｒ後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い
、ヘクターとＤＮＡ配列配列台むＤ　Ｎ　Ａ断片を回収
した。一方、プラスミドｐＴＲＬＮＧＦＢの７μｇをＮ
ｓｐ　（７５２４）　Ｖを２０ＵとＢａｍＨＩを４０Ｕ
を用いて切断後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行い、１９９ｂｐのＤＮＡ配列配列台むＤＮＡ断片を
回収した。これら二断片のＤＮＡＩｐｉずつをライゲー
ションキットにて連結した後、大腸菌Ｃ６００株を形質
転換し、７８８個のコロニーが得られた。この内の１６
クローンのＤＮＡを制限酵素で切断して解析した結果、
７個のクローンが目的のプラスミドであることが分かり
、シグナル配列と全長のｈＮＧＦ構造遺伝子ＤＮＡ配列
を有するプラスミ）”ｐＴＲ５ＮＧＦの２２３μｇを得
ることができた。

実施例２ 全長のｈＮＣＦ構造遺伝子ＤＮＡが、トリプトファン調
節遺伝子につながったトリプトファンオペロンのｔｒｐ
ＬポリペブタイトのＮ末端側をコードした遺伝子と連結
されたプラスミドの作製（第９図参照） プラス５１’ｐＴＲＬＢＴ　１の１μｇをＥｃｏＲＩを
１５ＵとＢａｍＨＩを２０Ｕを用いて切断後、０．８％
アガロースゲル電気泳動を行い、ヘクターのＤＮＡ断片
を回収した。一方、プラスミ）”ｐＴＲ５ＮＧＦＡの１
０μｇを同しく　ＥｃｏＲｒを７５０とＢａｍＨＩを５
０ＬＩを用いて切断後　５％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行い、１４６ｂｐのＤＮＡ配列への一部を含む
Ｄ＼Ａ断片を回収した。これら二断片のＤＮＡＩμ之ず
つをライケ゛−ソヨンキノトにて連結した後、大腸菌Ｃ
６００株を形質転換したところ、１４３個のコロニーが
得られた。この内の８クローンのＤＮＡを制限酵素で切
断して解析した結果、７個のクローンが目的のプラスミ
ドであることが分かり、プラスミドｐＴＲＬＮＧＦＡ’
　（７）　１０１１ｇを得た。

次に、このプラスミドｐＴＲＬＮＧＦＡ　’の１μｇを
ＥｃｏＲＩの１５Ｕを用いて切断後、０．８％アガロー
スゲル電気泳動を行い、ヘクターのＤＮＡ断片を回収し
た。一方、化学合成した二種のリンカ−Ｄ　Ｎ　Ａ　（
５’　−ＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＣＧＡ
ＴＴＴＴＣＣＡＣＣＧＴＧＧＣＧ−３’及び５　’　−
ＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＧＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＧＧＧＴ
ＧＧＧＡＡＧＡＧＣＴｆ、−３’　）を５００　ｐｍｏ
ｌずつ混合して、７５°Ｃで１０分間保持した後、２時
間かけて冷却しアニーリングさせ、二本鎖ＤＮＡを作製
した。この二本鎖ＤＮＡの５′末端をＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼをＩＯＵ用いてリン酸化した。

ヘクターＤＮＡとリンカ−ＤＮＡの１μｌずつをライゲ
ーションキットにて連結した後、大腸菌Ｃ６００株を形
質転換したところ、６個のコロニーが得られた。この６
クローンのＤＮＡを制限酵素で切断して解析した結果、
１個のクローンが目的のプラスミドであることが分かり
、プラスミドｐＴＲＬＮＧＦＡの２９μｇを得た。

次にプラス２ドｐＴＲＬＮＧＦＡの２ｐｇをＮｓｐ　（
７５２４）■を３０ＵとＢａｍＨＩを５００を用いて切
断後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、ヘクタ
ーとＤＮＡ配列配列台むＤＮＡ断片を回収した。

方、プラスミドｐＴＲＬＮＧＦＢの２μｇをＮ５ｐ（７
５２４）　　Ｖを３０し゛とＢａｍＨＩを５０Ｕを用い
て切断後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い
、１９９　ｂｐのＤＮＡ配列配列台むＤＮＡ断片を回収
した。これ５二断片のＤ　Ｎ　Ａ　０．５μｌずつをラ
イゲーションキットにて連結した後、大腸菌Ｃ６００株
を形質転換したところ、２２４個のコロニーが得られた
。この内の６クローンのＤＮＡを制限酵素で切断′−て
解析：た結果、２個のクローンが目的のプラスミドであ
ることが分かり、ｔｒｐＬポリペブタイトの＼末端側を
コートした遺伝子と連結されたｈ凡ＧＦ構造遺伝子の全
部のＤＮＡ配列を有するプラスミド’ｐＴＲＬ’ｊＧＦ
の１１０μｇを得ることができた。

実施例３ 全長のｈ＼ＧＦ構造遺伝子ＤＮＡが、トリプトファン調
節遺伝子につながったトリプトファンオペロンのｔｒｐ
ＥポリペブタイトのＮ末端側をコードした遺伝子と連結
されたプラスミドの作製（第１０図参照） プラスミドｐＴＲＥＢＴ　１の２．５ｐｇをＥｃｏＲＩ
を７５ＵとＢａｍＨＩを５００を用いて切断後、０．８
％アガロースゲル電気泳動を行い、ヘクターのＤＮＡ断
片を回収した。一方、プラスミドｐＴＲＬＮＧＦの１５
μｇをＥｃｏＲＩを３０ｔＪ用いて部分切断後、Ｂａｍ
ＨＩを６０Ｕ用いて切断した。次に、５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い、３６５ｂｐのｈＮＧＦのＤ
ＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を回収した。これら二断片の
Ｄ　Ｎ　Ａ　０．５μ２ずつをライゲーションキットに
て連結した後、大腸菌ＨＢ　１０１株を形質転換したと
ころ、３８３個のコロニーが得られた。この内の６クロ
ーンのＤＮＡを制限酵素で切断して解析した結果、２個
のクローンが目的のプラスミドであることが分かり、ｔ
ｒｐＥポリペブタイトのＮ末端側をコードした遺伝子と
連結されたｈＮＧＦ構造遺伝子の全部のＤＮＡ配列を有
するプラスミドｐＴＲＥＮＧＦの１２０μｇを得ること
ができた。

実施例４ 形質転換微生物によるｈＮＧＦの生産（トリブトファン
不使用） 実施例１〜３において作製されたプラスミドにより大腸
菌８８１０１株を形質転換して得られた以下の三種の遺
伝子組換え菌を培養実験に用いた。

大腸菌ＨＢＩＯＩ　［ｐＴＲ５ＮＧＦ　］　　（微工研
菌寄第１１２８５号）、大腸菌ＨＢＬ（Ｈ［ｐＴＲＬＮ
ＧＦ　］（微工研菌寄第１１２８３号）及び大腸菌ＨＢ
ＩＯＩ［ｐＴＲＥＮＧＦ］　　（微工研菌寄第１１２８
４号）これらの遺伝子組換菌をそれぞれ次のように培養
してｈＮＧＦを生産した。

保存菌株の一白金耳を１０ｍｊ２のＭ９培地（ＮＨ４Ｃ
ｊ２１　ｇ、　Ｎａ２ＨＰＯ４６ｇ、　ＫＩＩＺＰＯ４
３ｇ、　ＮａＣｊ２０、５　ｇ、　ＣａＣｊ２ｚ　・２
）１ｚＯＯ，０１５ｇ、　Ｍｇ５Ｏａ７８ｚＯＯ，５ｇ
、カザミノ酸２．５ｇ、グルコース５ｇ、酵母エキス１
．５ｇ、トリプトファン０．０４　ｇ、プロリン０．１
　ｇ、チアミン０．１ｇ、アンピシリン５０■、水Ｉ　
Ｌ　ｐＨ７，０）に接種し、３７°Ｃで一晩培養した。

前培養液の５　ｍ１２を採取し、１５．００Ｏｒｐｍで
１分間遠心分離し、菌体を回収した後、１ｍｌのＭ　９
　（−Ｔｒｐ　）培地（前記したＭ９培地より酵母エキ
ス、トリプトファンを除く）で洗浄した。菌体を５０ｍ
ｆｆ１のＭ９（−Ｔｒｐ）培地に接種し、３７°Ｃで８
時間培養した。培養８時間目の菌体を遠心分離により回
収し、５０ｍＭＴｒｉｓ−）ＩＣｆｆｉ緩衝液（ｐＨ７
，５）で洗浄後、５５０ｎｍの吸光度が約１０になるよ
うに、純水に慇濁した。この懸濁液１５０μｆｆにサン
プル緩衝液（０，２５Ｍ　　Ｔｒｉｓ　−１１ＣＩ２．
　ｐＨ６，８；　８％　ＳＤＳ　；　４０％　グリセロ
ール；２０％β〜メルカプトエタノール；０゜００４％
　ＢＰＢ）５０μｌと５０％グリセロールＢＰＢ液５μ
ｌを加え、１００　’Ｃ１５分間加熱した。この７容ン
夜の４０μｌを１４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
後、ゲルをクーマシーブリリアントブル−Ｒ−２５０で
染色したところ、標準βＮＣＦの近傍にｈ　ＮＧＦと考
えられるハントを観察できた。ゲル中の蛋白質をニトロ
セルロース膜に転写し、マウス顎下腺２．５５ＮＧＦに
対するポリクロナール抗体でｈ　Ｎ　Ｇ　Ｆを検出した
ところ、染色されたハンドとは！ご同し位置に抗体の結
合が見られた。これ↓こより大腸菌によるｈＮＧＦの発
現を確認できた。染色されたハントの色の濃さから大腸
菌が生産したｈＮＧＦ量を算出すると、菌体蛋白質量当
り大腸菌１（ＢＩＯＩ　　［ｐｒＲｕｃＦ］では２０％
、大腸菌ｉ−（Ｂ　Ｉ　Ｏ１［ｐＴＲ５ＮＧＦ　ｌでは
約３％、大腸菌ＨＢ　Ｉ　Ｏ１１ｐＴＲＥＮＧＦ　Ｆで
は約１％のｈＮＧＦが生産されていた。

実施例５ 形質転換微生物５こよるｈ：’、：ＧＦの生産試験（Ｉ
Ａ使用） 大腸菌ＨＢ　１０１−、ｐＴＲ５ＮＧＦ二、大腸菌ＨＢ
ＩＯＩＨｐＴＲＬＮＧＦ　ｌ及び大腸菌ＨＢ　１０１　
［ｐＴＲＥＮＧＦＩをそれぞれ次のように培養してｈＮ
ＧＦを生産５た。

実施例１と同様にして菌体を５Ｏｎ＋ｊ！のＭ９（−Ｔ
ｒｐ　）培地に接種し、３７°Ｃで８時間培養した。こ
の際、遺伝子を発現させるために、培養１時間目にＩＡ
を１５μｇ／ｍｆになるように添加した。培養終了後は
、実施例１と同様に処理して遺伝子組換え大腸菌のｈＮ
ＧＦ生産量を算出したところ、菌体蛋白質量当り大腸菌
ＨＢ　１０１　　Ｅ　ｐＴＲＬＮＧＦ　］では約２５％
、大腸菌ＨＢ　１０１　［ｐＴＲ５ＮＧＦ　］では約４
％、大腸菌ＨＢ　１０１１）ＴＲＥＮＧＦ］では約１％
と実施例４とほぼ同量のｈＮＧＦが生産された。

【図面の簡単な説明】

第１図は有機化学合成したＤＮＡ配列配列穴シグナル配
列とｈＮＧＦの前半部のアミノ酸との対応を示す図、第
２図は有機化学合成したＤＮＡ配列Ｂ及びｈＮＧＦの後
半部のアミノ酸との対応を示す図、第３図は有機化学合
成したＤＮＡ配列配列穴−１〜Ａ−８の８本のＤＮＡ断
片を示す図、第４図は有機化学合成したＤＮＡ配列Ｂの
Ｂ−１〜Ｂ−６の６本のＤＮＡ断片を示す図、第５図は
ＤＮＡ配列配列穴内の各種制限酵素切断部位を示す図、
第６図はプラスミドｐＴＲ３ＮＧＦＡの作製方法を示す
図、第７図はプラスミドｐＴＲＬＮＧＦＢの作製方法を
示す図、第８図はプラスミドｐＴＲ５ＮＧＦの作製方法
を示す図、第９図はプラスミドρＴＲＬＮＧＦの作製方
法を示す図、第１０図はプラスくドｐＴＲＥＮＧＦの作
製方法を示す図である。 第　　１ ■ ５′末端　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　Ｍｅｔ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ
　　Ｇｉｎ　　旧ＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣ
ＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＣＡＡＴＧＡＧ
ＴＡＴＴＣＡＡＣＴＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＡＡＧ
ＴＧＣＡＴＴＴＴＴＣＣ（：ＡＴＡＧＣＴＧＴＴＡＣＴ
ＣＡＴＡＡＧＴＴＧ３′末端 Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　　Ｐｈｅ　　Ｃｙｓ　
　　Ｌｅｕ　　　Ｐｒｏ　　　ＶａｌＴＴＴＴＧＣＧＧ
ＣＡＴＴＴＴＧｃｃＴＴｃｃＴＧＴＴＡＡＡＡＣＧＣＣ
ＧＴＡＡＡＡＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＡＴＴＴＧＣＧＡＧ
ＣＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＣＧＡＴＴＴＡＡＡＣＧＣＴＣ
ＧＡＧＡＡＧＧＧＴＧＧＧＣＴＡＡＡＡｓｐ　　Ｓｅｒ
　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｔｒｐ　　Ｖａｌ
　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ
　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ　　Ｉｌｅ　　ＬｙＴ
ＧＡＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＡＴ、ＧＧＧＴＡＧＧＣ
ＧＡＴＡＡＡＡＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＴＧＡＴＡＴＣＡ
ＡＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＣＡＴＡＣＣＣＡＴＣＣＧ
ＣＴＡＴＴＴＴＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＡＴＡＧＴ
Ｇｌｕ　　　Ｖａｌ　　　Ａｓｎ　　　ｌｉｅ　　　Ａ
ｓｎ　　　Ａｓｎ　　　Ｓｅｒ　　　ＶａｌＣＧＡＡＧ
ＴＴＡＡＣＡＴＴＡＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＡＧＣＴＴＣ
ＡＡＴＴＧＴＡＡＴＴＧＴＴＧＡＧＡｃＡＴＰｈｅ　　
Ｌｙｓ　　Ｇｉｎ　　Ｔｙｒ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　
Ｇｌｕ　　　　　　　　Ｔｅｒｍ　　Ｔｅｒｍ　　５’
末端ＴＴＣＡＡＡＣＡＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＧＡＡＣＣ
ＣＣ；ＧＧＴＡＡＴＡＧＡＡＧＴＴＴＧＴＣＡＴＧＡＡ
ＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＡＴＣＣＴＡＧ　　
３’末端第う ５′末端 Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｃｙｓ’　
　Ａｒｇ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　　Ｐｒｏ　
　Ｖａｌ　　Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｃｙｓ　
　ＡｒｇＡＡＴＴＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧ
ＡＣＣＣＡＡＡＣＣＣＧＧＴＴＧＡＣＴＣＴＧＧＣＴＧ
ＣＣＧＣＧＣＴＴＴＧＧＴＴＴＡＣＧＧＣＡＣＴＧＧＧ
ＴＴＴＧＧＧＣＣＡＡＣＴＧＡＧＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧ
３′末端 Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　　Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　
Ｈｉｓ　　Ｔｒｐ　　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ　　
Ｃｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　
Ｔｈｒ　　ＰｈｅＣＴＴＡＣＴＧＣＡＣＣＡＣＴＡＣＴ
ＣＡＣＡＣＣＴＴＧＡＡＴＧＡＣＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡ
ＧＴＧＴＧＧＡＡＶａｌ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　Ｌｅ
ｕ　　Ｔｈｒ　　Ｍｅｔ　　Ａｓｐ　　Ｇａｙ　　Ｌｙ
ｓ　　Ｇｉｎ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｔｒｐ　　Ａｒ
ｇ　　Ｐｈｅ　　Ｉｌｅ　　ＡｒＣＧＴＡＡＡＡＧＣＴ
ＴＴＧＡＣＴＡＴ（１，ＧＡＴＧＧＴＧＣＡＴＴＴＴＣ
ＧＡＡＡＣＴＧＡＴＡＣＣＴ’ＡＣＣＡｇ　　　Ｉｌｅ
　　　Ａｓｐ　　　Ｔｈｒ　　　Ａｌａ　　　Ｃｙｓ　
　　Ｖａｌ　　　Ｃｙｓ　　　ＶａｌＧＴＡＴ　ＣＧＡ
ＴＡ　ＣＴＧ　ＣＡＴ　Ｇ　ＣＧＴＧＴＣ，ＴＧＴＡ　
ＣＴＧＴ　ＣＣＣＧＴＡＡＡＣ；　ＣＴＧＴＴ　ＣＧＴ
ＴＡＡＣＡＴＡＧ　ＣＴＡＴＧＡ　ＣＧＴＡＣＧ　ＣＡ
ＣＡＣＡＣＡＴＧＡ　ＣＡＧＧＧＣＡＴＴＴ　ＣＧＡＣ
ＡＡＧＣＡＡＴＴＴｅｒｍ　　５’末端 ＡＧ ＡＴＣＣＴＡＧ ３°末端

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の塩基配列を有するヒト神経成長因子をコード
   するＤＮＡ。 【遺伝子配列があります。】 ２、請求項１記載のＤＮＡの５′末端上流側にβ−ラク
   タマーゼのシグナル配列をコードするＤＮＡを結合せし
   めたＤＮＡ。 ３、β−ラクタマーゼのシグナル配列をコードするＤＮ
   Ａが下記の塩基配列を有するものである請求項２記載の
   ＤＮＡ。 【遺伝子配列があります。】 ４、請求項２又は３記載のＤＮＡ配列の上流側にトリプ
   トファン調節遺伝子が結合したＤＮＡ。 ５、請求項１記載のＤＮＡの５′末端上流側に、トリプ
   トファン調節遺伝子につながったトリプトファンオペロ
   ンのｔｒｐＬポリペプタイドのＮ末端側をコードするＤ
   ＮＡが結合したＤＮＡ。 ６、トリプトファン調節遺伝子につながったトリプトフ
   ァンオペロンのｔｒｐＬポリペプタイドのＮ末端側をコ
   ードするＤＮＡが下記の塩基配列を有する請求項５記載
   のＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 ７、請求項１記載のＤＮＡの５′末端上流側に、トリプ
   トファン調節遺伝子につながったトリプトファンオペロ
   ンのｔｒｐＥポリペプタイドのＮ末端側をコードするＤ
   ＮＡが結合したＤＮＡ。 ８、トリプトファン調節遺伝子につながったトリプトフ
   ァンオペロンのｔｒｐＥポリペプタイドのＮ末端側をコ
   ードするＤＮＡが下記の塩基配列を有する請求項７記載
   のＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 ９、請求項１〜８いずれか記載のＤＮＡを有するプラス
   ミドベクター。 １０、微生物を請求項９記載のプラスミドベクターによ
   り形質転換して得られた形質転換体。 １１、微生物が大腸菌である請求項１０記載の形質転換
   体。 １２、請求項１０又は１１記載の形質転換体を培養し、
   ヒト神経成長因子を生産せしめることを特徴とするヒト
   神経成長因子の生産方法。 １３、誘導物質として I Ａ（３−β−インドールアク
   リル酸）を添加して培養を行う請求項１２記載のヒト神
   経成長因子の生産方法。 １４、トリプトファンを含まない培地を用いて培養を行
   う請求項１２又は１３記載のヒト神経成長因子の生産方
   法。