JPS6070073A - アスコルビン酸の中間体およびプロセス酵素類 - Google Patents
アスコルビン酸の中間体およびプロセス酵素類Info
- Publication number
- JPS6070073A JPS6070073A JP59135016A JP13501684A JPS6070073A JP S6070073 A JPS6070073 A JP S6070073A JP 59135016 A JP59135016 A JP 59135016A JP 13501684 A JP13501684 A JP 13501684A JP S6070073 A JPS6070073 A JP S6070073A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- item
- acid
- reductase
- enzyme
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01274—2,5-Didehydrogluconate reductase (1.1.1.274), i.e. 2,5-diketo-D-gluconic acid reductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/58—Aldonic, ketoaldonic or saccharic acids
- C12P7/60—2-Ketogulonic acid
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明はアスコルビン酸の製造方法に関する。
本発明は特に、有用なタンパク質の精製と、組換え技術
を使用するタンパク質の生産、およびそのようなタンパ
ク質を化学的変換に使用することに関する。更に詳しく
は、本発明は2,5−ジヶトグルコン酸(2,5−DK
G)’Jダクターゼ(還元酵素)の精製と組換え技術に
よる産生、および該リダクターゼを用いて2.5− D
K Gを立体選択的に転換して、2−ケトーL−グロ
ン酸(2−KLG)を産生ずること、および2− K
T−Gを合成し得る単一の組換え体微生物を調製する方
法に関する。
を使用するタンパク質の生産、およびそのようなタンパ
ク質を化学的変換に使用することに関する。更に詳しく
は、本発明は2,5−ジヶトグルコン酸(2,5−DK
G)’Jダクターゼ(還元酵素)の精製と組換え技術に
よる産生、および該リダクターゼを用いて2.5− D
K Gを立体選択的に転換して、2−ケトーL−グロ
ン酸(2−KLG)を産生ずること、および2− K
T−Gを合成し得る単一の組換え体微生物を調製する方
法に関する。
産生された2 −K L Gはアスコルビン酸(ビタミ
ンC)製造における有用な中間体である。
ンC)製造における有用な中間体である。
アスコルビン酸は、健康維持におけるその重要性の理由
から合衆国内においても、また世界各地においても主要
な化学製品となって来た。ある種の軽い病気、例えば風
邪のような病気にかかり易い個人の体質改善に対する有
効性に関しては若干の異論もあるが、必要量のビタミン
Cを摂取することは人類にとって疑いもなく重要なこと
である。
から合衆国内においても、また世界各地においても主要
な化学製品となって来た。ある種の軽い病気、例えば風
邪のような病気にかかり易い個人の体質改善に対する有
効性に関しては若干の異論もあるが、必要量のビタミン
Cを摂取することは人類にとって疑いもなく重要なこと
である。
所謂1天然1食品では十分量のビタミンCが供給されな
いかも知れないということが、近年、重大な関心事とな
って来た。従って、このビタミン量を補強して消費者に
市販する食品添加物として、また直接的なビタミン補給
の双方に対するアスコルビン酸の大量の需要が開発され
て来ている。また、アスコルビン酸は効果的な抗酸化剤
であり、従って栄養剤およびその他の製品の防腐剤とし
ての応用も見出されている。
いかも知れないということが、近年、重大な関心事とな
って来た。従って、このビタミン量を補強して消費者に
市販する食品添加物として、また直接的なビタミン補給
の双方に対するアスコルビン酸の大量の需要が開発され
て来ている。また、アスコルビン酸は効果的な抗酸化剤
であり、従って栄養剤およびその他の製品の防腐剤とし
ての応用も見出されている。
ビタミンCの生産に関しては多くの有用な、また商業的
にも実施し得る方法がある。これらの中の幾つかではま
ず2−ケ)−L−グロン酸(2−KLG)の製造を行な
い、引き続き酸性または塩基性の触媒的方法で環化する
ことにより比較的簡単にアスコルビン酸に変換する方法
が採られている。従って、2− K L Gそのものが
経済的にも工業的にもかなり重要な物質と成って来た。
にも実施し得る方法がある。これらの中の幾つかではま
ず2−ケ)−L−グロン酸(2−KLG)の製造を行な
い、引き続き酸性または塩基性の触媒的方法で環化する
ことにより比較的簡単にアスコルビン酸に変換する方法
が採られている。従って、2− K L Gそのものが
経済的にも工業的にもかなり重要な物質と成って来た。
今日では、比較的豊富にある例えばD−グルコースの様
な通常の代謝産物を、原核微生物の代謝を利用する方法
によって、2,5−ジケトグルコン酸(2,5−DKG
)へ変換させる方法が使用できる。〔例えば、米国特許
第3,790,444号(1’974年2月5日)、第
3,998,697号(1976年2月21日)、およ
びEPO公告特許第0046284号(1982年2月
24日発行)参照〕。この2.j−DKG中間体は、2
電子還元法という単一な1工程反応によって、所望の2
− K L Gへ変換される出発物質として有用である
。該還元反応は化学的に、または酵素触媒法によって効
果的に行なわれる。
な通常の代謝産物を、原核微生物の代謝を利用する方法
によって、2,5−ジケトグルコン酸(2,5−DKG
)へ変換させる方法が使用できる。〔例えば、米国特許
第3,790,444号(1’974年2月5日)、第
3,998,697号(1976年2月21日)、およ
びEPO公告特許第0046284号(1982年2月
24日発行)参照〕。この2.j−DKG中間体は、2
電子還元法という単一な1工程反応によって、所望の2
− K L Gへ変換される出発物質として有用である
。該還元反応は化学的に、または酵素触媒法によって効
果的に行なわれる。
この還元反応に効果を示し得る種々の細菌株が知られて
いる。そのような株はBrevibacterium
。
いる。そのような株はBrevibacterium
。
Art11robate丁、 Micrococcus
、5taphylococcus 。
、5taphylococcus 。
Pseudomonas 、 Bacillus 、
C1trot)acterおよびCorynebact
erium 属の中に見出される〔米国特許第3,92
2,194号(1975年11月25日)、米国特許第
4..245,04.9号(1981年1月13日)、
および米国特許第3,959.076号(1976年5
月25日)参照〕。事実、そのような細菌株はこの還元
反応に効果的に使用されて来た。然しなから、そのよう
な株の利用は、即ち、酵素を精製せずに使用するこの方
法は、精製した酵素を使用しなければ達成し得ないある
種の工程には使用できない。
C1trot)acterおよびCorynebact
erium 属の中に見出される〔米国特許第3,92
2,194号(1975年11月25日)、米国特許第
4..245,04.9号(1981年1月13日)、
および米国特許第3,959.076号(1976年5
月25日)参照〕。事実、そのような細菌株はこの還元
反応に効果的に使用されて来た。然しなから、そのよう
な株の利用は、即ち、酵素を精製せずに使用するこの方
法は、精製した酵素を使用しなければ達成し得ないある
種の工程には使用できない。
例えば、固形の支持体上に酵素を固定して連続的に生産
を行なおうとする方式などがそれに当たる。
を行なおうとする方式などがそれに当たる。
また、そのような酵素を産生ずるのに遺伝装置を使用す
ることは、それによって、2.5− D l(Qの変換
に最も都合の良い部位で該酵素の産生が行なわれるよう
に、この装置を操作し、局在させ得るので、この方法の
実施に当たり好ましい改善をもたらすこととなる。その
ような場所の中で最も重要なのは、2.5− D K
Gの生産を行なうことのできる同一菌体内にある部位で
ある。即ち、単一の微生物で、それ自身の装置を使用し
て2.5−DKGを製造し、次いで2.5− D K
G IJダクターゼ(還元酵素)遺伝子と、該触媒酵素
を産生ずるための適切なコントロール配列を使って、イ
ンサイチュ(その場)で内性2.5− D K Gを所
望の生成物に変換することも可能となるであろう。
ることは、それによって、2.5− D l(Qの変換
に最も都合の良い部位で該酵素の産生が行なわれるよう
に、この装置を操作し、局在させ得るので、この方法の
実施に当たり好ましい改善をもたらすこととなる。その
ような場所の中で最も重要なのは、2.5− D K
Gの生産を行なうことのできる同一菌体内にある部位で
ある。即ち、単一の微生物で、それ自身の装置を使用し
て2.5−DKGを製造し、次いで2.5− D K
G IJダクターゼ(還元酵素)遺伝子と、該触媒酵素
を産生ずるための適切なコントロール配列を使って、イ
ンサイチュ(その場)で内性2.5− D K Gを所
望の生成物に変換することも可能となるであろう。
本発明と関連した化学的変換における反応過程を示すこ
とは、本発明の有用性の意義を理解する為に役立つであ
ろう。代表的なアスコルビン酸の製造方法の全工程の概
要は、以下の反応式1によって示される。
とは、本発明の有用性の意義を理解する為に役立つであ
ろう。代表的なアスコルビン酸の製造方法の全工程の概
要は、以下の反応式1によって示される。
C1(OC0OHC00H
11+
−C−OH−C−OHC=0
1 1 1
l−TO−C−HO−C−HO−C−
+ 1 1
−C−OH−一一二 −C−OH−□−−Δ −C−O
H−ム1 1 1 −C−OH−C−OI−T −C−OH111 CH20■lCH20I]CH20H 111 C=O1−ro−c−r−ro−c l 、1 1 CH2011CH20HCH20H 反応式1 工程は、例えば反応式1に示されるように、D−グルコ
ースのような通常微生物に利用される代謝産物から都合
よく開始される。酵素的変換により、D−グルコースは
一連の酸化過程を経由して2.5−ジケト−D−グルコ
ン酸を与える。この一連の過程は単一の微生物によって
進められることが示された〔米国特許第3,790,4
44号、EPO公告第A 20,0.4.6,284号
(上述);そのような微生物は例えばGluconob
acterlAcetobacterまたはErwin
ia属である〕。
H−ム1 1 1 −C−OH−C−OI−T −C−OH111 CH20■lCH20I]CH20H 111 C=O1−ro−c−r−ro−c l 、1 1 CH2011CH20HCH20H 反応式1 工程は、例えば反応式1に示されるように、D−グルコ
ースのような通常微生物に利用される代謝産物から都合
よく開始される。酵素的変換により、D−グルコースは
一連の酸化過程を経由して2.5−ジケト−D−グルコ
ン酸を与える。この一連の過程は単一の微生物によって
進められることが示された〔米国特許第3,790,4
44号、EPO公告第A 20,0.4.6,284号
(上述);そのような微生物は例えばGluconob
acterlAcetobacterまたはErwin
ia属である〕。
アスコルビン酸製造の変法は酵素的酸化と化学的酸化の
組合わせにより、2.5− D K Gを介して一巡す
る方法であり、上に提示した方法に比較して、明らかに
より取り扱い難い。これらのうち代表的なものは、ジア
セトン−2−ケトー■、−グロン酸を2− K L G
の前駆体として使用するRe1ch−steinの合成
法である。この中間体は発酵反応、水素化反応、および
例えば過マンガ酸塩酸化など△ から成る一連の還元的および酸化的段階を経由して生成
されるものであって、所要の手順は先に示した反応手順
に比較して明らかに一層複雑である。
組合わせにより、2.5− D K Gを介して一巡す
る方法であり、上に提示した方法に比較して、明らかに
より取り扱い難い。これらのうち代表的なものは、ジア
セトン−2−ケトー■、−グロン酸を2− K L G
の前駆体として使用するRe1ch−steinの合成
法である。この中間体は発酵反応、水素化反応、および
例えば過マンガ酸塩酸化など△ から成る一連の還元的および酸化的段階を経由して生成
されるものであって、所要の手順は先に示した反応手順
に比較して明らかに一層複雑である。
2、5− D K Gから2−KLGへの変換も酵素反
応的に行なわれる〔米国特許第3,922,194号、
第3.959,076号(前記)、および第4..24
5,049号(1981年1月13日)〕。
応的に行なわれる〔米国特許第3,922,194号、
第3.959,076号(前記)、および第4..24
5,049号(1981年1月13日)〕。
得られた2 −K L Gをアスコルビン酸へ変換する
手段は今日では良く知られている。これは山崎の方法に
従い、希酸の存在で加熱することにより行なうか、また
は先ずメタノール中でエステル化し、次いで塩基中でラ
クトン環化する方法を用いる2段階法により行なわれる
。効果的な方法については、Crawford、 T、
C,らCAdvances 1nCarl)ohydr
ate Chemistry and Biochem
istry、 37゜79〜155(1980))の記
載がある。これらの変法は単純明瞭であり、2−KLG
の安定性はアスコルビン酸よりも高く、保存期間にも良
好な効果を与えた。従って、アスコルビン酸を直接合成
するよりも、所望の最終製品に変換し得る中間体、2−
KLGで大量に貯蔵する方がより一層望ましく都合が良
い。
手段は今日では良く知られている。これは山崎の方法に
従い、希酸の存在で加熱することにより行なうか、また
は先ずメタノール中でエステル化し、次いで塩基中でラ
クトン環化する方法を用いる2段階法により行なわれる
。効果的な方法については、Crawford、 T、
C,らCAdvances 1nCarl)ohydr
ate Chemistry and Biochem
istry、 37゜79〜155(1980))の記
載がある。これらの変法は単純明瞭であり、2−KLG
の安定性はアスコルビン酸よりも高く、保存期間にも良
好な効果を与えた。従って、アスコルビン酸を直接合成
するよりも、所望の最終製品に変換し得る中間体、2−
KLGで大量に貯蔵する方がより一層望ましく都合が良
い。
本発明による改良法は、一層優れた変法を、上に述べた
変換法の全般にわたる幾つかの局面に効果的に導入する
ものである。−例を挙げれば、2゜5−DKGを2−K
LGへ変換させる酵素が分離され、精製されたので、還
元工程は、例えば酵素を固定し、液状の基質を、固定し
た触媒上に連続的に供給する方法を含むより一層管理さ
れた条件下で進行させることができる。また、組換え技
術を利用して容易に精製して使用し得るような酵素を大
量に生産できるようになった。更に、組換え技術により
、改良された特性を持った好適な宿主細菌へ、暗号配列
およびそれに必要な発現コントロール機構を導入するこ
とができる。このように単に2.5− D K Gから
2− K T−Gへの変換に焦点変化要因に対するより
厳密なコントロール;2)連続的方法が適用できる;お
よび3)還元反応に関係した所望の特性を有する酵素に
好適な宿主微生物の選別。
変換法の全般にわたる幾つかの局面に効果的に導入する
ものである。−例を挙げれば、2゜5−DKGを2−K
LGへ変換させる酵素が分離され、精製されたので、還
元工程は、例えば酵素を固定し、液状の基質を、固定し
た触媒上に連続的に供給する方法を含むより一層管理さ
れた条件下で進行させることができる。また、組換え技
術を利用して容易に精製して使用し得るような酵素を大
量に生産できるようになった。更に、組換え技術により
、改良された特性を持った好適な宿主細菌へ、暗号配列
およびそれに必要な発現コントロール機構を導入するこ
とができる。このように単に2.5− D K Gから
2− K T−Gへの変換に焦点変化要因に対するより
厳密なコントロール;2)連続的方法が適用できる;お
よび3)還元反応に関係した所望の特性を有する酵素に
好適な宿主微生物の選別。
2、5− D K Gの効果的なりローン化と発現によ
ってもたらされる改良の範囲は、広範囲に及ぶ。
ってもたらされる改良の範囲は、広範囲に及ぶ。
特有な遺伝装置が利用できるので、リダクターゼ(還元
酵素)を暗号化している遺伝子を、2.5−D K G
を産生できる微生物に導入することが可能となり、期待
できるようになった。このようにして、同一の細菌によ
って変換の全工程、例えはグルコースまたはその他の好
適な代謝産物から安定で貯蔵性のよい中間体2− K
L Gへの変換の全工程が効果的に行ない得るようにな
った。
酵素)を暗号化している遺伝子を、2.5−D K G
を産生できる微生物に導入することが可能となり、期待
できるようになった。このようにして、同一の細菌によ
って変換の全工程、例えはグルコースまたはその他の好
適な代謝産物から安定で貯蔵性のよい中間体2− K
L Gへの変換の全工程が効果的に行ない得るようにな
った。
発明の要旨
本発明は、一般的に利用し易いグルコースのような代謝
産物を、安定な貯蔵性のよいアスコルビン酸の前駆体、
2− K L Gへ変換させる方法の劇的な改良を行な
うものである。本発明に記載した方法の経路には、2.
5−DKGから2−KLGへ変換する段階が包含される
。現行の2− K L G中間体の産生方法には、どん
な良い方法でも最低2種の微生物の使用またはキラーを
生じる培養を包含しており、利用し得る酵素水準を調節
できず、またバッチ式な方法に余儀なく限定されている
。
産物を、安定な貯蔵性のよいアスコルビン酸の前駆体、
2− K L Gへ変換させる方法の劇的な改良を行な
うものである。本発明に記載した方法の経路には、2.
5−DKGから2−KLGへ変換する段階が包含される
。現行の2− K L G中間体の産生方法には、どん
な良い方法でも最低2種の微生物の使用またはキラーを
生じる培養を包含しており、利用し得る酵素水準を調節
できず、またバッチ式な方法に余儀なく限定されている
。
本発明に含まれる重要な実施態様は、一連のクロマトグ
ラフィー手法により、2.5− D K Gリダクター
ゼをホモジニアス(均質)な生産物としくHP L C
(高速液体クロマトグラフィー法)により)実質的に純
粋な形で製造する方法にある。本発明にはさらに、純化
された酵素ぞのもの、および該純化酵素を2.5− D
K Gから2− K L Gへの変換に使用すること
を包含する。そのような変換は該酵素を固定化した形で
使用することにより、好まし〈実施される。
ラフィー手法により、2.5− D K Gリダクター
ゼをホモジニアス(均質)な生産物としくHP L C
(高速液体クロマトグラフィー法)により)実質的に純
粋な形で製造する方法にある。本発明にはさらに、純化
された酵素ぞのもの、および該純化酵素を2.5− D
K Gから2− K L Gへの変換に使用すること
を包含する。そのような変換は該酵素を固定化した形で
使用することにより、好まし〈実施される。
本発明のもう一つの重要な面は、2.5− D KGリ
ダクターゼの産生に適する組換え発現ベクターを構築す
る方法である。また、この態様は、そのようにして産生
された発現ベクターと、それを導 ′入した細胞および
細胞培養、および2.5− D K Gを立体選択的に
2− K L Gへと還元させ得るそのような細胞およ
び細胞培養の生産物をも包含する。
ダクターゼの産生に適する組換え発現ベクターを構築す
る方法である。また、この態様は、そのようにして産生
された発現ベクターと、それを導 ′入した細胞および
細胞培養、および2.5− D K Gを立体選択的に
2− K L Gへと還元させ得るそのような細胞およ
び細胞培養の生産物をも包含する。
更に本発明のこの態様には組換え技術にょろりダクター
ゼを使用して2.5− D K Gを2− K L G
へ変換させる方法が含まれる。
ゼを使用して2.5− D K Gを2− K L G
へ変換させる方法が含まれる。
最後に、本発明はまた、グルコースまたは通常の微生物
代謝産物を単一の組換え微生物による発酵によって2−
K L Gへ変換し、更にアスコルビン酸へ変換する
方法に関する。また本発明はこの過程を進行させ得る組
換え微生物に関する。そのような微生物は、2.5−
D K G +)ダクターゼに対応する配列を暗号化し
、それを発現し得る発現ベクターによって、初期の代謝
産物を2.5− D K Gへ変換できる宿主細胞を形
質転換することにより都合良く組み立てられる。あるい
は、そのような組換え微生物は、既に2.5− D K
Gを産生ずる微生物に、代謝産物を酸化して2.5−
D K Gとする働きを有する酵素を暗号化している
ベクターを導入することによっても構築される。いずれ
の場合でも、発現ベクターの構造の中にある適切な誘導
プロモーターとコントロール系を活用することにより、
所望する変換工程の速度を最適とするよう、酵素濃度を
調節することができる。
代謝産物を単一の組換え微生物による発酵によって2−
K L Gへ変換し、更にアスコルビン酸へ変換する
方法に関する。また本発明はこの過程を進行させ得る組
換え微生物に関する。そのような微生物は、2.5−
D K G +)ダクターゼに対応する配列を暗号化し
、それを発現し得る発現ベクターによって、初期の代謝
産物を2.5− D K Gへ変換できる宿主細胞を形
質転換することにより都合良く組み立てられる。あるい
は、そのような組換え微生物は、既に2.5− D K
Gを産生ずる微生物に、代謝産物を酸化して2.5−
D K Gとする働きを有する酵素を暗号化している
ベクターを導入することによっても構築される。いずれ
の場合でも、発現ベクターの構造の中にある適切な誘導
プロモーターとコントロール系を活用することにより、
所望する変換工程の速度を最適とするよう、酵素濃度を
調節することができる。
以下に図面について簡単に説明する。
第1図は2.5− D K G IJダクターゼ遺伝子
の発現ベクターを示している。
の発現ベクターを示している。
第2図および第3図は、二者択一的な2.5− DKG
IJダクターゼ遺伝子のための発現ベクターの組み立て
を示している。
IJダクターゼ遺伝子のための発現ベクターの組み立て
を示している。
第4図は2.5− D K G IJダクターゼ遺伝子
とpTrp+ −35発現ベクターの調節(コントロー
ル)領域を含んでいる配列を示している。
とpTrp+ −35発現ベクターの調節(コントロー
ル)領域を含んでいる配列を示している。
第5図は、第4図の配列を有する2、 5− D K
Gリダクターゼ発現ベクターを導入したErwinia
herbicola(ACCC21998)から得たタ
ンパク質抽出物の染色したゲルを示している。
Gリダクターゼ発現ベクターを導入したErwinia
herbicola(ACCC21998)から得たタ
ンパク質抽出物の染色したゲルを示している。
詳細な記述
A、定義
本発明に使用する” 2.5−DKG +)ダクターゼ
なる用語は、2.5− D K Gを立体選択的に2−
KLGへと変化させる反応を触媒する働きを有するタン
パク質を意味する。本発明の具体的な例に於イテは、C
orynebacterium 中に存在する特定の型
のこの酵素が純化され、クローン化され、発現されたが
、例えばBrevibacterium 、 Arth
robacter 。
なる用語は、2.5− D K Gを立体選択的に2−
KLGへと変化させる反応を触媒する働きを有するタン
パク質を意味する。本発明の具体的な例に於イテは、C
orynebacterium 中に存在する特定の型
のこの酵素が純化され、クローン化され、発現されたが
、例えばBrevibacterium 、 Arth
robacter 。
Micrococcus、 5taphylococc
us 、Pseudomonas 。
us 、Pseudomonas 。
C1trobacLer およびBcil lusのよ
うな属の中の他の細菌株もこの酵素と同じ活性を有する
酵素を合成することが知られている。これらの属は、こ
の変換反応の触媒に利用できるCorynebacte
rium に存在するのと同一の酵素の強力な供給源と
して例示される。これら天然に存在するもの以外にも、
原核生物界には、それに代わる供給源を見出し得ること
があろう。更に、本発明によってそのような酵素を暗号
化している遺伝子配列が明らかにされ、利用できるよう
になったので、その技術によって知り得た知識を利用し
て、この酵素の働きを妨害することなく、事実」二その
働きを改良し得る配列の修飾ができるようになった。そ
のように修飾され、変換された配列も本明細書で使用す
る2゜5− D K G IJダクターゼの定義の中に
包括される。
うな属の中の他の細菌株もこの酵素と同じ活性を有する
酵素を合成することが知られている。これらの属は、こ
の変換反応の触媒に利用できるCorynebacte
rium に存在するのと同一の酵素の強力な供給源と
して例示される。これら天然に存在するもの以外にも、
原核生物界には、それに代わる供給源を見出し得ること
があろう。更に、本発明によってそのような酵素を暗号
化している遺伝子配列が明らかにされ、利用できるよう
になったので、その技術によって知り得た知識を利用し
て、この酵素の働きを妨害することなく、事実」二その
働きを改良し得る配列の修飾ができるようになった。そ
のように修飾され、変換された配列も本明細書で使用す
る2゜5− D K G IJダクターゼの定義の中に
包括される。
要するに、2.5− D K G リダクターゼなる用
語は、機能的な定義であって、2.5− D K Gが
2−KLGへと変換する反応を触媒するすべての酵素を
意味する。
語は、機能的な定義であって、2.5− D K Gが
2−KLGへと変換する反応を触媒するすべての酵素を
意味する。
本明細書で論じられるタンパク質およびサツカライド類
の酸性誘導体のような多くの化合物は、溶液中において
、或いは固形物の場合はそれらが調製された溶液に置か
れていた環境に応じて種々のイオン状態を取り得るであ
ろうことは技術的に良く理解できる。例えば、グルコン
酸と言う用語を使用してその分子を指定する場合、該有
機分子が関係し得るすべてのイオン化状態を包括するも
のとする。従って、例えばID−グルコン酸”およびI
D−グルコネート1は共に同一の有機構造を示すもので
あって、何ら特別なイオン化状態を指定しようと意図す
るものではない。良く知られているように、D−グルコ
ン酸はイオン化しない形で存在することもでき、或いは
、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはその他の塩と
して使用することも出来る。説明されている化合物が該
当するイオン化状態のものか、あるいは非イオン化の態
様のものかは、当業者であれば、または例えそうでなく
ても、文脈を辿れば自ら明らかになるであろう。従って
、2.5− D K Gリダクターゼ・タンパク質その
ものもpHに応じて種々のイオン化状態をとり得る。こ
れらのすべてのイオン化状態を”2.5−DKGIJダ
クターゼ1なる用語は包含している。
の酸性誘導体のような多くの化合物は、溶液中において
、或いは固形物の場合はそれらが調製された溶液に置か
れていた環境に応じて種々のイオン状態を取り得るであ
ろうことは技術的に良く理解できる。例えば、グルコン
酸と言う用語を使用してその分子を指定する場合、該有
機分子が関係し得るすべてのイオン化状態を包括するも
のとする。従って、例えばID−グルコン酸”およびI
D−グルコネート1は共に同一の有機構造を示すもので
あって、何ら特別なイオン化状態を指定しようと意図す
るものではない。良く知られているように、D−グルコ
ン酸はイオン化しない形で存在することもでき、或いは
、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはその他の塩と
して使用することも出来る。説明されている化合物が該
当するイオン化状態のものか、あるいは非イオン化の態
様のものかは、当業者であれば、または例えそうでなく
ても、文脈を辿れば自ら明らかになるであろう。従って
、2.5− D K Gリダクターゼ・タンパク質その
ものもpHに応じて種々のイオン化状態をとり得る。こ
れらのすべてのイオン化状態を”2.5−DKGIJダ
クターゼ1なる用語は包含している。
同様に゛細胞“および”細胞培養゛の用語も、文脈」二
、その一方また他方の何れかを明示していない場合は相
互互換的に使用するものである。細胞または細胞培養の
形質転換は、結局同じ働きに等しい。クローン化するビ
ヒクルまたはその他の導入手段で処理されるのは微生物
の培養であるが、形質転換物質を取りこむのは微生物そ
のものであることは当然明らかである。本発明における
細胞および微生物はあらゆる細菌性微生物、または原核
微生物を包含するものと定義づけられる。
、その一方また他方の何れかを明示していない場合は相
互互換的に使用するものである。細胞または細胞培養の
形質転換は、結局同じ働きに等しい。クローン化するビ
ヒクルまたはその他の導入手段で処理されるのは微生物
の培養であるが、形質転換物質を取りこむのは微生物そ
のものであることは当然明らかである。本発明における
細胞および微生物はあらゆる細菌性微生物、または原核
微生物を包含するものと定義づけられる。
7発現ベクター7とは、その中に含まれるDNA配列を
、その配列が機能的に、それを発現させることのできる
他の配列と連結している場合には、それを発現し得るベ
クターを意味する。明瞭に表現されていないけれども、
発現ベクターには、エピワームまたは染色体DNAの組
み込み部分として、宿主微生物内で複製し得るものでな
ければならないという意味が含まれている。複製能が欠
除していればそれらが効果的に作動てきないことは明ら
かである。結局、1発現ベクター9も機能的な定義であ
る。一般に、組換え技術では発現ベクターはしばしば1
プラスミド5の形で使用され、該用語は閉環状2本鎖D
NA分子を示しており、ベクターの形では染色体と結合
しない。一般に使用されるその他の効果的なベクターは
ファージおよび開環状DNAである。本明細書において
は、”プラスミド1と1ベクター1はしばしば相互互換
的に使用される;然し、本発明においては、同等の機能
を果たす既知の、あるいはいずれ知られることになる他
の型の発現ベクターを全て包含するものである。
、その配列が機能的に、それを発現させることのできる
他の配列と連結している場合には、それを発現し得るベ
クターを意味する。明瞭に表現されていないけれども、
発現ベクターには、エピワームまたは染色体DNAの組
み込み部分として、宿主微生物内で複製し得るものでな
ければならないという意味が含まれている。複製能が欠
除していればそれらが効果的に作動てきないことは明ら
かである。結局、1発現ベクター9も機能的な定義であ
る。一般に、組換え技術では発現ベクターはしばしば1
プラスミド5の形で使用され、該用語は閉環状2本鎖D
NA分子を示しており、ベクターの形では染色体と結合
しない。一般に使用されるその他の効果的なベクターは
ファージおよび開環状DNAである。本明細書において
は、”プラスミド1と1ベクター1はしばしば相互互換
的に使用される;然し、本発明においては、同等の機能
を果たす既知の、あるいはいずれ知られることになる他
の型の発現ベクターを全て包含するものである。
1組換え細胞1とは、組換えDNA技術を使用して構築
されたベクターを導入された細胞を言う。
されたベクターを導入された細胞を言う。
1宿主1細胞とは、形質転換を受ける前の細胞を言う。
一般に組換え細胞は、そのような組換えベクターで暗号
化されたタンパク質生成物を産生じ、しかも通常はこの
ベクターが無ければそれらを産生じない逼然しこの定義
には、細菌の染色体に暗帰化されているか、あるいはこ
の受容菌自体が発現するタンパク質を暗号化しているベ
クターで形質転換された細胞も含まれる。この定義には
、組換え技術による異種配列の生成物を生産するあらゆ
る細胞が包含される。
化されたタンパク質生成物を産生じ、しかも通常はこの
ベクターが無ければそれらを産生じない逼然しこの定義
には、細菌の染色体に暗帰化されているか、あるいはこ
の受容菌自体が発現するタンパク質を暗号化しているベ
クターで形質転換された細胞も含まれる。この定義には
、組換え技術による異種配列の生成物を生産するあらゆ
る細胞が包含される。
1通常の代謝産物”とは、発育のため、一般に細菌に利
用される炭素源を意味する。そのような代謝産物とは、
そのような微生物の栄養源として容易に利用されるグル
コース、ガラクトース、ラクトース、フルクトースまた
はその他の炭水化物である。この場合、そのような代謝
産物とは2,5−ジケ)−D−グルコン酸に変換し得る
ようなそれら栄養源の酵素的誘導体をも包含して定義さ
れる。そのような誘導体にはD−グルコン酸、D−−r
7 /ン酸、■−−クロン酸、L−イドン酸、2−ケ
ト−I) −クルコン酸、5−ケト−ローグルコン酸、
および5−ケトーD−マンノン酸が含まれる。
用される炭素源を意味する。そのような代謝産物とは、
そのような微生物の栄養源として容易に利用されるグル
コース、ガラクトース、ラクトース、フルクトースまた
はその他の炭水化物である。この場合、そのような代謝
産物とは2,5−ジケ)−D−グルコン酸に変換し得る
ようなそれら栄養源の酵素的誘導体をも包含して定義さ
れる。そのような誘導体にはD−グルコン酸、D−−r
7 /ン酸、■−−クロン酸、L−イドン酸、2−ケ
ト−I) −クルコン酸、5−ケト−ローグルコン酸、
および5−ケトーD−マンノン酸が含まれる。
−ゼの製造
純粋な2.5− D K G リダクターゼの製造のた
めに選ばれた細菌の望ましい属はCorynebact
criumである。然し、細菌学的な分類は、関連のあ
る態量の正しい命名を確かめることが時に困難な場合が
あるので、必ずしも十分確実ではない。然し、該リダク
ターゼが含有されている細菌種の多くはCoryneb
acterium 、 Brevil)acteriu
m およびArthro−bacter属に属するco
ryne form型グループの仲間である。従って現
在判っていることによれば、該酵素の望ましい供給源が
Corync form型グループの一つであるという
ことである。
めに選ばれた細菌の望ましい属はCorynebact
criumである。然し、細菌学的な分類は、関連のあ
る態量の正しい命名を確かめることが時に困難な場合が
あるので、必ずしも十分確実ではない。然し、該リダク
ターゼが含有されている細菌種の多くはCoryneb
acterium 、 Brevil)acteriu
m およびArthro−bacter属に属するco
ryne form型グループの仲間である。従って現
在判っていることによれば、該酵素の望ましい供給源が
Corync form型グループの一つであるという
ことである。
製造の好ましい態様として、細胞培養は細菌株より応じ
て選ばれる好適な条件下に、0D550が約20または
それ以上になるまで発育させる。
て選ばれる好適な条件下に、0D550が約20または
それ以上になるまで発育させる。
次に培養液を遠心分離に掛け、得られた細胞ペースト(
ペレット状)を処理して細胞を溶解(溶菌)する。この
ペーストは処理前に、予かしめ緩衝液で洗滌して混入し
ている培地を除去して置くことが望ましく、洗滌を終え
たペレットは、例えばリゾチーム、または超音波、また
は機械的手技を用いて処理し、細胞を開裂させる。次に
、得られた抽出物を、望ましくはセルロースを保持体と
する陰イオン交換樹脂、例えばDEAEセルロースを用
いたイオン交換クロマトグラフィーにより精製する。言
うまでもなく、例えばQAEまたはDEAEセファデッ
クスのような他の陰イオン交換樹脂もまた使用できる。
ペレット状)を処理して細胞を溶解(溶菌)する。この
ペーストは処理前に、予かしめ緩衝液で洗滌して混入し
ている培地を除去して置くことが望ましく、洗滌を終え
たペレットは、例えばリゾチーム、または超音波、また
は機械的手技を用いて処理し、細胞を開裂させる。次に
、得られた抽出物を、望ましくはセルロースを保持体と
する陰イオン交換樹脂、例えばDEAEセルロースを用
いたイオン交換クロマトグラフィーにより精製する。言
うまでもなく、例えばQAEまたはDEAEセファデッ
クスのような他の陰イオン交換樹脂もまた使用できる。
溶出は溶出液に溶解している塩、好ましくは塩化す)
IJウムの濃度を順次増加し、溶出溶媒のイオン強度を
増加する代表的で望ましい公知法により行なわれる。2
.5− DKGリダククーゼ活性を含有する溶出液分画
をアフィニティークロマトグラフィー保持体、即ち、そ
れが共有結合する支持体、色素または酵素基質またはそ
の補因子に似たその他の有機リガンドに吸着させること
により、更に精製する。もしア△イニティー保持体で処
理す表き溶液が相当量の溶質を含有している場合は、予
かしめ透析を行なうことが望ましい。特に効果的なアフ
イニテイクロマトグラフイー保持体は、NADHまたは
N A D P Hを利用する酵素に親和性を有するア
ミコンマトレツR。
IJウムの濃度を順次増加し、溶出溶媒のイオン強度を
増加する代表的で望ましい公知法により行なわれる。2
.5− DKGリダククーゼ活性を含有する溶出液分画
をアフィニティークロマトグラフィー保持体、即ち、そ
れが共有結合する支持体、色素または酵素基質またはそ
の補因子に似たその他の有機リガンドに吸着させること
により、更に精製する。もしア△イニティー保持体で処
理す表き溶液が相当量の溶質を含有している場合は、予
かしめ透析を行なうことが望ましい。特に効果的なアフ
イニテイクロマトグラフイー保持体は、NADHまたは
N A D P Hを利用する酵素に親和性を有するア
ミコンマトレツR。
クス ゲルブルーA (A+n1con Matrex
kgel blueA)である。そのようなカラムから
の溶離は、酵素と親和性のある物質−この場合はNAD
P−の溶出溶媒中の濃度を増加して行くことにより達成
される。所望のD K G IJダクターゼ活性を含有
する画分を集めて純粋なタンパク質を回収する。この純
粋なタンパク質の比活性は5単位/l’lfjより大き
い。
kgel blueA)である。そのようなカラムから
の溶離は、酵素と親和性のある物質−この場合はNAD
P−の溶出溶媒中の濃度を増加して行くことにより達成
される。所望のD K G IJダクターゼ活性を含有
する画分を集めて純粋なタンパク質を回収する。この純
粋なタンパク質の比活性は5単位/l’lfjより大き
い。
純度の最終的な証明は、例えばHP L Cにより、セ
ファデックスゲル、ポリアクリルアミドゲル、またはT
SKサイジングゲルを用いたサイズセパレーション(分
子サイズ分離)によって達成される。Coryneba
cterium Sp ATCC3l Q 9 Qに含
有される酵素では、TSK/HPLCによる分離によっ
て、全量の活性を含有する4 5,000の分子量に相
当するピークを得る。然しなから、還元的または非還元
的な条件で酵素を5DS−PAGF、処理すると、タン
パク質は34,000の分子量に相当するピークに移動
する。この好ましい具体例に示したタンパク質の特性に
ついては、更に実施例2で説明する。
ファデックスゲル、ポリアクリルアミドゲル、またはT
SKサイジングゲルを用いたサイズセパレーション(分
子サイズ分離)によって達成される。Coryneba
cterium Sp ATCC3l Q 9 Qに含
有される酵素では、TSK/HPLCによる分離によっ
て、全量の活性を含有する4 5,000の分子量に相
当するピークを得る。然しなから、還元的または非還元
的な条件で酵素を5DS−PAGF、処理すると、タン
パク質は34,000の分子量に相当するピークに移動
する。この好ましい具体例に示したタンパク質の特性に
ついては、更に実施例2で説明する。
以」―を要約すると、酵素の純化は細胞溶解、陰イオン
交換クロマトグラフィー、アフイニテイクロマトグラフ
イーおよびサイズセパレーションによる証明の工程から
成る。細胞溶解(溶菌)以外の工程については、任意の
順序で行なってよく、工程の移行の都度、実施例2に示
した方法に従って活性を測定することによりチェックを
行なう。
交換クロマトグラフィー、アフイニテイクロマトグラフ
イーおよびサイズセパレーションによる証明の工程から
成る。細胞溶解(溶菌)以外の工程については、任意の
順序で行なってよく、工程の移行の都度、実施例2に示
した方法に従って活性を測定することによりチェックを
行なう。
精製した酵素を用いた変換は溶液かまたは更に望ましく
は固定化型で行なう。所望の反応は還元反応であるから
、還元当量(reducing equivalenE
s)の供給源を必要とする;酵素はN A D P H
特異性であり、従って少なくとも触媒量の補酵素が存在
していなければならず、進行過程中は、その還元型は絶
えず再生されなければならない。補酵素を還元するため
の電子供与源は、グルコース/グルコースデヒドロゲナ
ーゼ(脱水素酵素)、ホルメート/ホルメートデヒドロ
ゲナーゼ、またはグルタメート/グルタメートデヒドロ
ゲナーゼのように、酵素と接触する還元型基質の酸化に
より供与される。好適な還元当量の供給源を選択するに
は、基質のコストおよび精製した2、 5− D K
G IJダクターゼか必要とするNADPと矛盾するこ
とのない酸化触媒酵素の酵素特異性を考慮しなりればな
らない。N A D P H補酵素の再生のための他の
系としては、例えは還元当量の供給源としてH2を用い
、リポアミドデヒドロゲナーゼとヒドロゲナーゼ(水素
酵素)、またはフェレドキシンリダクターゼとヒドロゲ
ナーゼを触媒として用いるWong 、 C0H0ら(
J、Am、 Chem、 Soc、、] 0 :3 :
6227(1981))の方法が知られている。更に大
規模製法にも適用できる他の方法がLight、 D。
は固定化型で行なう。所望の反応は還元反応であるから
、還元当量(reducing equivalenE
s)の供給源を必要とする;酵素はN A D P H
特異性であり、従って少なくとも触媒量の補酵素が存在
していなければならず、進行過程中は、その還元型は絶
えず再生されなければならない。補酵素を還元するため
の電子供与源は、グルコース/グルコースデヒドロゲナ
ーゼ(脱水素酵素)、ホルメート/ホルメートデヒドロ
ゲナーゼ、またはグルタメート/グルタメートデヒドロ
ゲナーゼのように、酵素と接触する還元型基質の酸化に
より供与される。好適な還元当量の供給源を選択するに
は、基質のコストおよび精製した2、 5− D K
G IJダクターゼか必要とするNADPと矛盾するこ
とのない酸化触媒酵素の酵素特異性を考慮しなりればな
らない。N A D P H補酵素の再生のための他の
系としては、例えは還元当量の供給源としてH2を用い
、リポアミドデヒドロゲナーゼとヒドロゲナーゼ(水素
酵素)、またはフェレドキシンリダクターゼとヒドロゲ
ナーゼを触媒として用いるWong 、 C0H0ら(
J、Am、 Chem、 Soc、、] 0 :3 :
6227(1981))の方法が知られている。更に大
規模製法にも適用できる他の方法がLight、 D。
ら(”Organic Chemicals from
Biomass″(1983) D、L、Wise刊
305〜358頁)により記載されている。
Biomass″(1983) D、L、Wise刊
305〜358頁)により記載されている。
代表的な変換反応においては、出発溶液は約1〜200
g/Lの濃度、好ましくは約10〜50g/I−付近の
濃度の2.5− D K Gを含有し、媒質のpLTは
約5〜7.5、好ましくは64付近に調節する。このp
Hは例えばリン酸緩衝液のような好適な緩衝液を使用し
て維持する。温度範囲は約15℃〜37℃、好ましくは
25℃付近とする。還元型補酵素N A D P Hの
濃度は、充分な還元当量の供給源と共に、例えば約0.
001mM〜2 m M 、好ましくは約0,01〜0
.03mMとし、反応中その濃度を維持する。
g/Lの濃度、好ましくは約10〜50g/I−付近の
濃度の2.5− D K Gを含有し、媒質のpLTは
約5〜7.5、好ましくは64付近に調節する。このp
Hは例えばリン酸緩衝液のような好適な緩衝液を使用し
て維持する。温度範囲は約15℃〜37℃、好ましくは
25℃付近とする。還元型補酵素N A D P Hの
濃度は、充分な還元当量の供給源と共に、例えば約0.
001mM〜2 m M 、好ましくは約0,01〜0
.03mMとし、反応中その濃度を維持する。
酵素を溶液の形で供給する場合は、その濃度は基質媒質
に対しIC1&/Lの程度とするが、勿論、所望する変
換反応速度により、また選ばれた酵素の特異性に従って
望ましい濃度を使用する。もし固定化酵素を使用する場
合は、」1記の基質溶液を、2、5− D K G I
Jダクターゼを吸着により含有するか、または共有結合
により結合させた固形保持体を通過させる。理想的には
、溶液中のNADPH濃度を維持させるに足りる還元当
量の供給源を変換する意味で、固形保持体に上記の好適
な触媒を含有させる。例えば、典型的な変換反応に於い
ては、溶液は2.5− D K G濃度にほぼ当量のグ
ルコース、ホルメート、グルタメートまたは溶解水素を
含有しており、固形保持体には所望する2−1(LGへ
の変換反応によって生成するNADr’を絶えず再生す
るに足りる還元触媒を含有させる。
に対しIC1&/Lの程度とするが、勿論、所望する変
換反応速度により、また選ばれた酵素の特異性に従って
望ましい濃度を使用する。もし固定化酵素を使用する場
合は、」1記の基質溶液を、2、5− D K G I
Jダクターゼを吸着により含有するか、または共有結合
により結合させた固形保持体を通過させる。理想的には
、溶液中のNADPH濃度を維持させるに足りる還元当
量の供給源を変換する意味で、固形保持体に上記の好適
な触媒を含有させる。例えば、典型的な変換反応に於い
ては、溶液は2.5− D K G濃度にほぼ当量のグ
ルコース、ホルメート、グルタメートまたは溶解水素を
含有しており、固形保持体には所望する2−1(LGへ
の変換反応によって生成するNADr’を絶えず再生す
るに足りる還元触媒を含有させる。
B、3 2.5−DKGリダクターゼのクローン化と発
現 2、5− D K G リダクターゼの遺伝子をクロー
ン化し、発現させる手技を提供する本発明方法によって
、純化2.5− D K G +)ダクターゼを多量に
入手することができる様になり、また2、 5− D
K Gを生産する微生物において、該リダクターゼを生
成させることができる様になった。これを達成した一般
的な方法を以下に要約し、その具体的な方法を実施例3
において概説する。
現 2、5− D K G リダクターゼの遺伝子をクロー
ン化し、発現させる手技を提供する本発明方法によって
、純化2.5− D K G +)ダクターゼを多量に
入手することができる様になり、また2、 5− D
K Gを生産する微生物において、該リダクターゼを生
成させることができる様になった。これを達成した一般
的な方法を以下に要約し、その具体的な方法を実施例3
において概説する。
Corynebacterium またはその他の供給
源から得られた高分子量のDNAを、制限酵素を用いて
部分消化することにより作り出されたゲノムライブラリ
ーからの2.5− D K Gリダクターゼ暗号化遺伝
子を、プラスミドかファージビヒクルにクローンする。
源から得られた高分子量のDNAを、制限酵素を用いて
部分消化することにより作り出されたゲノムライブラリ
ーからの2.5− D K Gリダクターゼ暗号化遺伝
子を、プラスミドかファージビヒクルにクローンする。
2.5− D K Gリダクターゼを得るのに好適な制
限酵素はSau 3 Aである。(その代わりに、Ba
m1−IIまたはPstTのように、特異性の高い制限
酵素による制限消化物を使用しても良い)。次に、この
制限消化物を、好適な細菌宿主中で複製し得るプラスミ
ドベクターか、都合の良い細菌培養物中で増殖し得るフ
ァージ配列の中へ連結する。
限酵素はSau 3 Aである。(その代わりに、Ba
m1−IIまたはPstTのように、特異性の高い制限
酵素による制限消化物を使用しても良い)。次に、この
制限消化物を、好適な細菌宿主中で複製し得るプラスミ
ドベクターか、都合の良い細菌培養物中で増殖し得るフ
ァージ配列の中へ連結する。
得られたプラスミドおよびファージライブラリーを、2
.5− D K G IJダクターゼの既知の部分配列
に基づいて構築されたプローブを用いてスフIJ −ニ
ングする(実施例2参照)。プローブデザインの効率は
、プローブ構築に際し、細菌性宿主にとって望ましいと
知られているコドンを選択することにより向−1−させ
ることができる。所望のクローンをプラスミドおよびフ
ァージライブラリーから確認するには、所望の遺伝子が
、好適で厳格な条件下で、すべてのプローブとハイブリ
ッドを形成する様に−組みのプローブを使用し、ただ1
個のプローブを使用することから起こる誤った陽性例を
排除することによって最も効果的に行なわれる。
.5− D K G IJダクターゼの既知の部分配列
に基づいて構築されたプローブを用いてスフIJ −ニ
ングする(実施例2参照)。プローブデザインの効率は
、プローブ構築に際し、細菌性宿主にとって望ましいと
知られているコドンを選択することにより向−1−させ
ることができる。所望のクローンをプラスミドおよびフ
ァージライブラリーから確認するには、所望の遺伝子が
、好適で厳格な条件下で、すべてのプローブとハイブリ
ッドを形成する様に−組みのプローブを使用し、ただ1
個のプローブを使用することから起こる誤った陽性例を
排除することによって最も効果的に行なわれる。
プローブとして提供されたオリゴヌクレオチドとのハイ
ブリッド形成に成功したコロニーまたはファージを回収
し、所望の遺伝子配列との同一性を直接的なりNA塩基
配列決定法と、所望の酵素を産生ずるインビボでの発現
によって確認する。
ブリッド形成に成功したコロニーまたはファージを回収
し、所望の遺伝子配列との同一性を直接的なりNA塩基
配列決定法と、所望の酵素を産生ずるインビボでの発現
によって確認する。
完全に機能し得る遺伝子を、その暗号配列を導入しよう
とする宿主細胞中で作動し得るプロモーターとリポソー
ム結合部位を含有する好適な発現ベクターに連結する。
とする宿主細胞中で作動し得るプロモーターとリポソー
ム結合部位を含有する好適な発現ベクターに連結する。
現在の技術水準においては、本発明に適用し得る多数の
促進/制御系、および好適な原核生物宿主がある。一般
に、原核生物はDNA配列のクローン化に望ましく、ま
た2−KL Gの製造方法はそのような微生物系を用い
て最も都合よく行なわれるので、クローン化と発現の双
方に、類似の宿主を使用することができる。E。
促進/制御系、および好適な原核生物宿主がある。一般
に、原核生物はDNA配列のクローン化に望ましく、ま
た2−KL Gの製造方法はそのような微生物系を用い
て最も都合よく行なわれるので、クローン化と発現の双
方に、類似の宿主を使用することができる。E。
coli K12株294(ATCCA31446 )
はクローン用宿主として特に有用である。その他の使用
し得る微生物株は、E、coli B、E、coliX
1776(ATTC五31537 )およびE、col
i DE−1(ATCCA33849 )のようなE、
coli 株から成る。発現には、先に述べた細菌株、
およびE、coliw311o (F 、λ 原栄養性
、AT、TC煮27325 )、Bacillus 5
ul)Lilusのような桿菌類、およびSalmon
ella typbimuriumまたはSerraL
iamarcesans のようなその他の腸内菌類、
および種々のP scudomonas種が使用し得る
。宿主として特に好ましい群は、グルコースまたはその
他一般に利用し得る代謝産物を2.5−DKGへ変換で
きる宿主培養物である。そのような宿主の例としてはE
rwinia hcrl)icola ATTCA 2
1998 (またはAcecomonas albos
esamaeの1株と考えられている:米国特許第3,
998,697号) ; Acetobacterme
langeneum 、 I FO3293、AceL
obacter cerius。
はクローン用宿主として特に有用である。その他の使用
し得る微生物株は、E、coli B、E、coliX
1776(ATTC五31537 )およびE、col
i DE−1(ATCCA33849 )のようなE、
coli 株から成る。発現には、先に述べた細菌株、
およびE、coliw311o (F 、λ 原栄養性
、AT、TC煮27325 )、Bacillus 5
ul)Lilusのような桿菌類、およびSalmon
ella typbimuriumまたはSerraL
iamarcesans のようなその他の腸内菌類、
および種々のP scudomonas種が使用し得る
。宿主として特に好ましい群は、グルコースまたはその
他一般に利用し得る代謝産物を2.5−DKGへ変換で
きる宿主培養物である。そのような宿主の例としてはE
rwinia hcrl)icola ATTCA 2
1998 (またはAcecomonas albos
esamaeの1株と考えられている:米国特許第3,
998,697号) ; Acetobacterme
langeneum 、 I FO3293、AceL
obacter cerius。
IF03263、およびGluconol〕acter
rubiginosus 。
rubiginosus 。
TFO3244が含まれる。
一般に、プラスミドの発現、即ち宿主細胞と適合し得る
種から誘導された複製およびコントロール配列を含んで
いるクローニングベクターは、これらの宿主と関連して
使用される。通常、ベクターは複製部位および、形質転
換細胞に選択性のある表現形質を提供できるマーキング
(記号化)配列を保有している。例えばE 、col
i は、E、coliの1株から誘導されたプラスミド
PBR322によって典型な形質転換を受ける( Bo
liver ら、Gene 、 2 : 95 (19
77) )。PBR322はアンピシリンおよびテトラ
サイクリン耐性の遺伝子を含んでおり、これは形質転換
された細胞を容易に確認し得る手段となる。発現に使用
するためには、pBR322プラスミド、或いはその他
の微生物プラスミドも、それ自身のタンパク質を発現す
るためにその微生物によって使用され得るプロモーター
を含有するか、または含有するように修飾されなければ
ならない。それらの組換えDNAの構築(組み立て)に
最も多く使用されるプロモーターは、β−ラクタマーゼ
(ペニシリナーゼ)およびラクト−スープDモーター系
(Changら、Nature。
種から誘導された複製およびコントロール配列を含んで
いるクローニングベクターは、これらの宿主と関連して
使用される。通常、ベクターは複製部位および、形質転
換細胞に選択性のある表現形質を提供できるマーキング
(記号化)配列を保有している。例えばE 、col
i は、E、coliの1株から誘導されたプラスミド
PBR322によって典型な形質転換を受ける( Bo
liver ら、Gene 、 2 : 95 (19
77) )。PBR322はアンピシリンおよびテトラ
サイクリン耐性の遺伝子を含んでおり、これは形質転換
された細胞を容易に確認し得る手段となる。発現に使用
するためには、pBR322プラスミド、或いはその他
の微生物プラスミドも、それ自身のタンパク質を発現す
るためにその微生物によって使用され得るプロモーター
を含有するか、または含有するように修飾されなければ
ならない。それらの組換えDNAの構築(組み立て)に
最も多く使用されるプロモーターは、β−ラクタマーゼ
(ペニシリナーゼ)およびラクト−スープDモーター系
(Changら、Nature。
275:615(1978) Hltakura ら、
S cience 、 l 98:1056(1977
) ;(Goeddelら、Nature、 281
:544(1979))、およびトリプトファン(tr
p)プロモーター系(Goeddel ら、Nucle
ic Ac1dsRes、、8:40s7(1980)
; EpO公告特許第0036776号)である。これ
らが最も一般に使用されている間に、他の微生物のプロ
モーターが発見され、使用され、更にそれらのヌクレオ
チド配列に関する詳細が公表されるようになって、当業
者は、それらを機能的に形質転換ベクターの遺伝子に連
結できるようになった( 5icbenliscら、C
el I20: 269(1980))。
S cience 、 l 98:1056(1977
) ;(Goeddelら、Nature、 281
:544(1979))、およびトリプトファン(tr
p)プロモーター系(Goeddel ら、Nucle
ic Ac1dsRes、、8:40s7(1980)
; EpO公告特許第0036776号)である。これ
らが最も一般に使用されている間に、他の微生物のプロ
モーターが発見され、使用され、更にそれらのヌクレオ
チド配列に関する詳細が公表されるようになって、当業
者は、それらを機能的に形質転換ベクターの遺伝子に連
結できるようになった( 5icbenliscら、C
el I20: 269(1980))。
」−記のベクターおよびプロモーターに含有されるDN
A配列を適切に開裂させ、先に概説した様にして調製し
た2、 5− D K G IJダクターゼを暗号化し
ている遺伝子配列と連結し、あらゆる不必要な、或いは
阻害的な配列を欠失させ、原核性宿主細胞に導入して該
酵素を産生させる。次いで、この酵素を先に概説したよ
うに純化するか、そのままの形でまたは細胞を破壊して
直接触媒として使用してもよく、或いは、一度形質転換
すれば、グルコースまたはその他の好適な代謝産物を所
望の2− K L G生成物へ完全に変換させる効果を
挙げ得るように宿主を選択してもよい。
A配列を適切に開裂させ、先に概説した様にして調製し
た2、 5− D K G IJダクターゼを暗号化し
ている遺伝子配列と連結し、あらゆる不必要な、或いは
阻害的な配列を欠失させ、原核性宿主細胞に導入して該
酵素を産生させる。次いで、この酵素を先に概説したよ
うに純化するか、そのままの形でまたは細胞を破壊して
直接触媒として使用してもよく、或いは、一度形質転換
すれば、グルコースまたはその他の好適な代謝産物を所
望の2− K L G生成物へ完全に変換させる効果を
挙げ得るように宿主を選択してもよい。
または他の代謝産物の2− K L Gへの変換異種宿
主中で酵素を発現させる組換え技術を利用して、単一の
宿主微生物で、容易に利用し得る代謝産物から2−KL
Gを産生させようとする本発明の構想を達成することが
できる。本方法は、二つの発酵を単一の生育し得る微生
物発酵に置き換えている点、およびこの変換に必要な酸
化−還元当量が少なくとも部分的に平衡であるという点
で、現在使用されている方法よりかなり進歩している。
主中で酵素を発現させる組換え技術を利用して、単一の
宿主微生物で、容易に利用し得る代謝産物から2−KL
Gを産生させようとする本発明の構想を達成することが
できる。本方法は、二つの発酵を単一の生育し得る微生
物発酵に置き換えている点、およびこの変換に必要な酸
化−還元当量が少なくとも部分的に平衡であるという点
で、現在使用されている方法よりかなり進歩している。
現在のところ、天然に存在する微生物で、この連続した
全段階を触媒できるものは知られていない。
全段階を触媒できるものは知られていない。
然しなから、グルコースまたは、例えばガラクトースま
たはフルクトースのような通常の代謝産物を、2.5−
D K Gへ変化させる微生物は知られている。また
2、 5− D K Gを2−KLGへ変換させる他の
一群の微生物も知られており、後者の変換は、当然その
微生物の持っている単一の酵素により触媒されるが、還
元当量を供給する該微生物の力を利用している。
たはフルクトースのような通常の代謝産物を、2.5−
D K Gへ変化させる微生物は知られている。また
2、 5− D K Gを2−KLGへ変換させる他の
一群の微生物も知られており、後者の変換は、当然その
微生物の持っている単一の酵素により触媒されるが、還
元当量を供給する該微生物の力を利用している。
本発明が包含する単一微生物によって変換を成就しよう
とする方策は、先に概要を示したような2、5− D
K G IJダクターゼのための発現ベクターを構築し
、通常の代謝産物をこの酵素の基質である’2.5−
D K Gへまず変換させることができる細胞中へこの
ベクターを導入することから成る。実施例3に示すよう
に、この形質転換によって2−K L Gを産生ずる単
一の微生物が得られた。該ベクターの構築、形質転換、
形質転換により得られた微生物の利用の詳細について本
明細書で概説する。
とする方策は、先に概要を示したような2、5− D
K G IJダクターゼのための発現ベクターを構築し
、通常の代謝産物をこの酵素の基質である’2.5−
D K Gへまず変換させることができる細胞中へこの
ベクターを導入することから成る。実施例3に示すよう
に、この形質転換によって2−K L Gを産生ずる単
一の微生物が得られた。該ベクターの構築、形質転換、
形質転換により得られた微生物の利用の詳細について本
明細書で概説する。
もう一つの変法は、グルコースまたは通常の代謝産物を
2.5− D K Gへ転換させることが知られている
酵素を暗号化している遺伝子を、それを含有している微
生物(先に列挙した)からクローン、発現し、それらク
ローンされた遺伝子配列を含有する発現ベクターを構築
し、そのようなベクターを正常にリダクターゼを産生ず
る細胞の形質転換に使用することである。第3の方法は
、通常の代謝産物から2−KLGへ至る経路の酵素の完
全な配列で中性宿主を形質転換する方法である。この最
後の方法は、それがどのような発育特性を所望しようと
も、またどのような栄養条件を必要としようとも、自由
に宿主微生物を選択できるという利点を有する。従って
、E 、 col iやBacilusのように培養お
よび発育に関して過去に合理的な経験を経ている遺伝形
質を備えた微生物を宿主細胞として使用することは、酵
素または基質を細菌的に産生ずる他の手段と等質な長所
が得られる。
2.5− D K Gへ転換させることが知られている
酵素を暗号化している遺伝子を、それを含有している微
生物(先に列挙した)からクローン、発現し、それらク
ローンされた遺伝子配列を含有する発現ベクターを構築
し、そのようなベクターを正常にリダクターゼを産生ず
る細胞の形質転換に使用することである。第3の方法は
、通常の代謝産物から2−KLGへ至る経路の酵素の完
全な配列で中性宿主を形質転換する方法である。この最
後の方法は、それがどのような発育特性を所望しようと
も、またどのような栄養条件を必要としようとも、自由
に宿主微生物を選択できるという利点を有する。従って
、E 、 col iやBacilusのように培養お
よび発育に関して過去に合理的な経験を経ている遺伝形
質を備えた微生物を宿主細胞として使用することは、酵
素または基質を細菌的に産生ずる他の手段と等質な長所
が得られる。
変換を行なう能力を持った微生物が作り出されると、本
発明法の過程は、組換え酵素のための発現ベクターの構
造の性質によって、また宿主の発育特性に応じて種々の
形で進行する。例えば、宿主微生物は大量の細胞を産生
ずるのに好ましい条件下で、そしてまた所望の変換に関
係する酵素を暗号化しているあらゆる異種遺伝子の発現
に不都合な条件下で発育させることになろう。大量の細
胞が蓄積された時、暗号配列の転写と翻訳が行なわれる
ように、その様な遺伝子配列により供給されるプロモー
ターを活性化させるため、培地に好適なインデューサー
またはデリプレッサーを添加する。これらの遺伝子の好
適な発現により、また所望する触媒量の酵素の存在のも
とに、1〜500q / Lの量でグルコースのような
出発物質を培地に加え、20°C〜約40°C1好まし
くは25〜37℃付近で、数時間、2− K r−cへ
の変換が終了するまで培養する。出発物質の濃度は連続
的な供給調節によって一定濃度に保ち、産生された2−
KLGは公知技術によりバッチ方式または連続的に回収
される。
発明法の過程は、組換え酵素のための発現ベクターの構
造の性質によって、また宿主の発育特性に応じて種々の
形で進行する。例えば、宿主微生物は大量の細胞を産生
ずるのに好ましい条件下で、そしてまた所望の変換に関
係する酵素を暗号化しているあらゆる異種遺伝子の発現
に不都合な条件下で発育させることになろう。大量の細
胞が蓄積された時、暗号配列の転写と翻訳が行なわれる
ように、その様な遺伝子配列により供給されるプロモー
ターを活性化させるため、培地に好適なインデューサー
またはデリプレッサーを添加する。これらの遺伝子の好
適な発現により、また所望する触媒量の酵素の存在のも
とに、1〜500q / Lの量でグルコースのような
出発物質を培地に加え、20°C〜約40°C1好まし
くは25〜37℃付近で、数時間、2− K r−cへ
の変換が終了するまで培養する。出発物質の濃度は連続
的な供給調節によって一定濃度に保ち、産生された2−
KLGは公知技術によりバッチ方式または連続的に回収
される。
後述の実施例において、プローブの構築、スクリーニン
グ、プローブの所望の物質とのハイブリダイゼーション
、およびベクターの組み立てに関しては、以下に示す一
般的方法を使用した。
グ、プローブの所望の物質とのハイブリダイゼーション
、およびベクターの組み立てに関しては、以下に示す一
般的方法を使用した。
合成りNAプローブは、カップリング剤として2.4.
6−1− IJイソプロピルベンゼンスルホニル−3−
ニトロ−1,2,4−トリアゾール(TPS−NT)
(de Rooij、 J、ら、Rec、 Trav、
Chim、 Pays Bas。
6−1− IJイソプロピルベンゼンスルホニル−3−
ニトロ−1,2,4−トリアゾール(TPS−NT)
(de Rooij、 J、ら、Rec、 Trav、
Chim、 Pays Bas。
98:537(1979))を使用することを除き、C
rea、 RoおよびHorn、 T、 (Nuclc
ic Ac1ds Res、。
rea、 RoおよびHorn、 T、 (Nuclc
ic Ac1ds Res、。
8:2231(1980))の方法により調製した。
プラスミドは、確認された培養から、Clewell。
D、B、およびHe1inski 、 (Bioche
mistry 9 : 4428 (1970))の透
明細胞分解法を用いて分離し、Biorad A −5
0アガロース・カラムクロマトグラフィーにより精製し
た。少量の場合(mini−preps)は Birn
boim、H,C,(Nucleic Ac1ds R
e5earch、7 :1513(1979))の方法
を用いて作成した。
mistry 9 : 4428 (1970))の透
明細胞分解法を用いて分離し、Biorad A −5
0アガロース・カラムクロマトグラフィーにより精製し
た。少量の場合(mini−preps)は Birn
boim、H,C,(Nucleic Ac1ds R
e5earch、7 :1513(1979))の方法
を用いて作成した。
クローンしたプラスミドの断片は、適当な10〜50単
位の制限酵素(群)で、その使用するその制限酵素のた
めの適切なバッファー(群)約600μβ中、約20μ
gのプラスミドを処理することにより調製し、配列決定
した。各酵素について37℃で1時間、インキュベート
した。各酵素を用いてインキュベーションした後、タン
パク質を除去し、核酸をフェノール−クロロホルム抽出
およびエタノール沈澱により回収した。変法として、プ
ラスミドは、M nC(12の存在下にDNAase:
[消化によるか(Anderson、 S、 (198
1) 、 NucleicAcids Res、 9.
3015) 、または超音波処理(Deiniger、
P、L、 (1983)、 Analyt、 Bio
chem、 129゜216)することにより断片化し
た。
位の制限酵素(群)で、その使用するその制限酵素のた
めの適切なバッファー(群)約600μβ中、約20μ
gのプラスミドを処理することにより調製し、配列決定
した。各酵素について37℃で1時間、インキュベート
した。各酵素を用いてインキュベーションした後、タン
パク質を除去し、核酸をフェノール−クロロホルム抽出
およびエタノール沈澱により回収した。変法として、プ
ラスミドは、M nC(12の存在下にDNAase:
[消化によるか(Anderson、 S、 (198
1) 、 NucleicAcids Res、 9.
3015) 、または超音波処理(Deiniger、
P、L、 (1983)、 Analyt、 Bio
chem、 129゜216)することにより断片化し
た。
切断後、標品を、50 nmol のdNTPを含有す
る100.JのK 1 enow 緩衝液(5mM K
Pi 1pH7,5,7mM MgCl2.1 mM
BME ) 中のT4DNAポリメラーゼ、または10
単位のKlnowDNAポリメラーゼで、1時間、37
℃で処理しせ、上記の如く、サイズ測定のため6%ポリ
アクリルアミドゲル上に展開した(別法として、断片を
直接M13ベクターにクローンしても良い)。
る100.JのK 1 enow 緩衝液(5mM K
Pi 1pH7,5,7mM MgCl2.1 mM
BME ) 中のT4DNAポリメラーゼ、または10
単位のKlnowDNAポリメラーゼで、1時間、37
℃で処理しせ、上記の如く、サイズ測定のため6%ポリ
アクリルアミドゲル上に展開した(別法として、断片を
直接M13ベクターにクローンしても良い)。
DNAの塩基配列決定は、断片をM13−誘導ベクター
にクローン(Messing ら、(1981)Nuc
leic Ac1ds Res、 9 、309 )
した後、ジヌクレオチド鎖ターミネーション法(San
ger、 F、ら(1g77 )、 Proc、 Na
tl、 Acad、 Sci、 tJsA 74.54
63)により行なった。
にクローン(Messing ら、(1981)Nuc
leic Ac1ds Res、 9 、309 )
した後、ジヌクレオチド鎖ターミネーション法(San
ger、 F、ら(1g77 )、 Proc、 Na
tl、 Acad、 Sci、 tJsA 74.54
63)により行なった。
開裂した発現プラスミドを含むDNAフラグメント(断
片)を、正しくマツチングする様にT4D N A I
Jガーゼを用いて適当に末端修復した所望の成分と混合
することにより結合させた(例えば、0.25μ9のプ
ラスミドから切り出されたベクター断片を、20μ召の
反応混合液中で1μgのプラスミドから切り出した挿入
体と混合する)。μg量のベクターおよび挿入成分に対
して約10単位のりガーゼが必要であった。次に、得ら
れたプラスミドベクターをE、C0IiK122941
株(ATCC3144−6)またはDH−1(ATCC
33849)へ導入することによりクローンした。形質
転換およびクローニングおよび形質転換されたコロニー
の選別は、後に記載する方法により実施した。所望する
配列が存在するかどうかは、選別されたコロニーからプ
ラスミドを分離し、前記した様にDNAの塩基配列を決
定することにより確認した。
片)を、正しくマツチングする様にT4D N A I
Jガーゼを用いて適当に末端修復した所望の成分と混合
することにより結合させた(例えば、0.25μ9のプ
ラスミドから切り出されたベクター断片を、20μ召の
反応混合液中で1μgのプラスミドから切り出した挿入
体と混合する)。μg量のベクターおよび挿入成分に対
して約10単位のりガーゼが必要であった。次に、得ら
れたプラスミドベクターをE、C0IiK122941
株(ATCC3144−6)またはDH−1(ATCC
33849)へ導入することによりクローンした。形質
転換およびクローニングおよび形質転換されたコロニー
の選別は、後に記載する方法により実施した。所望する
配列が存在するかどうかは、選別されたコロニーからプ
ラスミドを分離し、前記した様にDNAの塩基配列を決
定することにより確認した。
製法A
2.5−ジケト−D−グルコン酸ナトリウム(力2.5
− D K Gは商業的に容易に入手し難いのでErw
inia hcrbicola、 (ATTC2199
8)またはAceLobacer cerinus、
IFO3263から分離して製造した。2.5−ジケト
−D−グルコン酸ナトリウムはErwiniaの発酵か
ら、ブロスを100〜200メツシユの陰イオン交換カ
ラムAGl−X8を通し、水で洗滌し、0.05N塩酸
で溶出することにより分離した。2,5−ジケトローグ
ルコン酸を含有する分画をプールし、炭酸水素ナトリウ
ムでpH5,5に中和し、凍結乾燥法により乾燥した(
例としてBernacrts、 M、ら、Antoni
e van Leeuwqnhoek37:185(1
971)参照)。特性決定はHPLCおよびT L C
から成る有機酸に有用な方法により実施した( Gos
sele、 F、 Zbl、 Bokt、 Hyg、、
l : Abt。
− D K Gは商業的に容易に入手し難いのでErw
inia hcrbicola、 (ATTC2199
8)またはAceLobacer cerinus、
IFO3263から分離して製造した。2.5−ジケト
−D−グルコン酸ナトリウムはErwiniaの発酵か
ら、ブロスを100〜200メツシユの陰イオン交換カ
ラムAGl−X8を通し、水で洗滌し、0.05N塩酸
で溶出することにより分離した。2,5−ジケトローグ
ルコン酸を含有する分画をプールし、炭酸水素ナトリウ
ムでpH5,5に中和し、凍結乾燥法により乾燥した(
例としてBernacrts、 M、ら、Antoni
e van Leeuwqnhoek37:185(1
971)参照)。特性決定はHPLCおよびT L C
から成る有機酸に有用な方法により実施した( Gos
sele、 F、 Zbl、 Bokt、 Hyg、、
l : Abt。
Orig、 C,178(1980))。13CNMR
により、およびWakisika、 Y、 Agr、
Biol 、 Chem、28 : 819(1964
,) の記載に従い、ビス−2,4−ジニトロフェニル
ヒドラゾンを作成することにより、・ζ、の化合物の同
一性を確認した(カルシウム塩の場合は、濃縮したブロ
スを陽イオン交換樹脂(Dowex2+ 50、Ca 型)カラムに通し、次に水で溶出すること
により製造してもよい。T−I P L C分析により
2.5−D K Gを含有する分画を集め、凍結乾燥す
ることにより希黄色のカルシウム塩を得た)。
により、およびWakisika、 Y、 Agr、
Biol 、 Chem、28 : 819(1964
,) の記載に従い、ビス−2,4−ジニトロフェニル
ヒドラゾンを作成することにより、・ζ、の化合物の同
一性を確認した(カルシウム塩の場合は、濃縮したブロ
スを陽イオン交換樹脂(Dowex2+ 50、Ca 型)カラムに通し、次に水で溶出すること
により製造してもよい。T−I P L C分析により
2.5−D K Gを含有する分画を集め、凍結乾燥す
ることにより希黄色のカルシウム塩を得た)。
以下の実施例により更に詳細に説明するが、これらは本
発明を限定するものではない。
発明を限定するものではない。
リダクターゼの分離と精製
A、細胞溶解(溶菌)および抽出
Corynebacter ium株ATCC3109
0を10dの発酵釜で発育させ、対数増殖期に回収した
。発酵液を遠心分離することにより細胞ペーストを回収
し、−20℃に貯蔵した。450gの細胞ペーストを融
解させ、650m/の20mM+−リスバッファー(p
H8)に再度懸濁させ、細胞を0.5MNaC,gで洗
滌し、遠心分離により再回収し、次いテ2 m9 /
meのリゾチームを含有する650meのトリスバッフ
ァーに再度懸濁させて、細胞内タンパク質を遊離させた
。遠心分離により細胞残渣を溶解物質から分離し、生成
したペレットを非イオン洗滌剤であるツイーン80を0
.1 % (w/w)含有するトリスバッファーで再抽
出した。抽出物を2゜5− D K G IJダクター
ゼ活性について測定し、プールした。
0を10dの発酵釜で発育させ、対数増殖期に回収した
。発酵液を遠心分離することにより細胞ペーストを回収
し、−20℃に貯蔵した。450gの細胞ペーストを融
解させ、650m/の20mM+−リスバッファー(p
H8)に再度懸濁させ、細胞を0.5MNaC,gで洗
滌し、遠心分離により再回収し、次いテ2 m9 /
meのリゾチームを含有する650meのトリスバッフ
ァーに再度懸濁させて、細胞内タンパク質を遊離させた
。遠心分離により細胞残渣を溶解物質から分離し、生成
したペレットを非イオン洗滌剤であるツイーン80を0
.1 % (w/w)含有するトリスバッファーで再抽
出した。抽出物を2゜5− D K G IJダクター
ゼ活性について測定し、プールした。
B、イオン交換クロマトグラフィー
粗細胞抽出物(1260mJ)をバッチ式にジエチルア
ミノエチルセルロース(Whatman DE−52、
湿潤容量で250mJ)へ吸着させ、室温で0.5時間
攪拌し、グラスフィルター漏斗でこのDE−52樹脂を
回収した。DE−52樹脂を5×30anのカラムに充
填し、基線(ベースライン)が確定するまでトリスバッ
ファーで洗滌した(A 280=0.7、A260/A
28(1=1.7、これは核酸が徐々にカラムから洗い
出されていることを示していた)。次いで、カラムを0
−IMのリニアー濃度勾配のN2O召(1200肩l)
で110 ml/hrノ流速を以て溶出させ、分画を採
取し、D K G IJダクターゼ活性を測定した。明
らかなりKG還元触媒活性を示す2個のピークが認めら
れた:約Q、 4 M NaC/Jで溶出して来るピー
クは所望の2.5− D K G IJダクターゼを含
有していた(2.5−DKGを2−KLGへ変換させる
);約0.25 M NaCeで溶出して来るもう1個
のピークは2.5−DKGを2−LKGへ変換しなかっ
た。
ミノエチルセルロース(Whatman DE−52、
湿潤容量で250mJ)へ吸着させ、室温で0.5時間
攪拌し、グラスフィルター漏斗でこのDE−52樹脂を
回収した。DE−52樹脂を5×30anのカラムに充
填し、基線(ベースライン)が確定するまでトリスバッ
ファーで洗滌した(A 280=0.7、A260/A
28(1=1.7、これは核酸が徐々にカラムから洗い
出されていることを示していた)。次いで、カラムを0
−IMのリニアー濃度勾配のN2O召(1200肩l)
で110 ml/hrノ流速を以て溶出させ、分画を採
取し、D K G IJダクターゼ活性を測定した。明
らかなりKG還元触媒活性を示す2個のピークが認めら
れた:約Q、 4 M NaC/Jで溶出して来るピー
クは所望の2.5− D K G IJダクターゼを含
有していた(2.5−DKGを2−KLGへ変換させる
);約0.25 M NaCeで溶出して来るもう1個
のピークは2.5−DKGを2−LKGへ変換しなかっ
た。
DE−52カラムから0.4 Mで溶出したピークを2
0mM1−リスバッファー(pH8,0)に対して一夜
透析した後、Am1con Matrex Gel B
lue A (この樹脂は、染料(C1bacron
blue F3GA )と共有結合しているアガロース
ビーズから成っており、N A D HまたはNADP
Hを補因子として利用する酵素に対し親和性を有する)
の2.5X4.5のカラムに掛けた。カラムをトリスバ
ッファーで洗滌し、1、QmMのNADPで溶出した。
0mM1−リスバッファー(pH8,0)に対して一夜
透析した後、Am1con Matrex Gel B
lue A (この樹脂は、染料(C1bacron
blue F3GA )と共有結合しているアガロース
ビーズから成っており、N A D HまたはNADP
Hを補因子として利用する酵素に対し親和性を有する)
の2.5X4.5のカラムに掛けた。カラムをトリスバ
ッファーで洗滌し、1、QmMのNADPで溶出した。
分画を採取し、D K G IJダクターゼ活性を測定
し、活性分画プールを限外沢過により(Am1con
5tirredcel+ 、 Y M−5メンプラン)
16倍まで濃縮した。
し、活性分画プールを限外沢過により(Am1con
5tirredcel+ 、 Y M−5メンプラン)
16倍まで濃縮した。
Blue A カラムから得られた濃縮物質を20mM
トリスバッファー(pH8,0)に対して一夜透析した
後、200mMの炭酸水素アンモニウムで緩衝化したA
ltex T S Kカラム(0,5x60z)に掛け
た( T S Kカラムはタンパク質を分子量によって
分別する)。2.5− D K G IJダクターゼ活
性体は4.5,000ダルトンの分子量に相対する単一
のピークで溶出され、99%以上の純度を示した。
トリスバッファー(pH8,0)に対して一夜透析した
後、200mMの炭酸水素アンモニウムで緩衝化したA
ltex T S Kカラム(0,5x60z)に掛け
た( T S Kカラムはタンパク質を分子量によって
分別する)。2.5− D K G IJダクターゼ活
性体は4.5,000ダルトンの分子量に相対する単一
のピークで溶出され、99%以上の純度を示した。
即ちこの規準によればホモジニアス(均質)であった。
A、電気泳動
この酵素を、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の存在
下にアクリルアミドゲル中で電気泳動した。
下にアクリルアミドゲル中で電気泳動した。
非還元的条件および還元的条件のいずれにおいても、約
34,000ダルトンの分子量に相当する単一のタンパ
ク質のバンドを認めた。45,000ダルトンの範囲に
はタンパク質を認めなかった(HPLCでは認められた
)。
34,000ダルトンの分子量に相当する単一のタンパ
ク質のバンドを認めた。45,000ダルトンの範囲に
はタンパク質を認めなかった(HPLCでは認められた
)。
B、N−末端アミノ酸配列
アミノ酸配列のデータから、純化した酵素は単一のN−
末端配列を含んでいることがわかった。
末端配列を含んでいることがわかった。
(μは未測定)
thr val pro ser ile val l
eu asn asp gly asnser ile
pro gln Ieu gly tyr gly
val phe Iysval pro pro al
a asp ala gln arg aha val
gluglu aha leu glu val g
ly tyr p his ile aspμ ala
μ μ tyr gly C,アミノ酸組成 アミノ酸加水分解の結果、次の組成を得た。
eu asn asp gly asnser ile
pro gln Ieu gly tyr gly
val phe Iysval pro pro al
a asp ala gln arg aha val
gluglu aha leu glu val g
ly tyr p his ile aspμ ala
μ μ tyr gly C,アミノ酸組成 アミノ酸加水分解の結果、次の組成を得た。
asX 11.52 meL 1..36thr 4.
75 ile 4.82 Ser3.85 1eu 7.90 g1x 10.47 tyr 2.40PrO6,15
phe 2.37 g1y 8.22 hi、s 3.67ala 14.
69 lys 3.1.0cys O,00arg 5
.21 val 7.47 trp 2.05 D、速度論的パラメーター、基質特異性および補因子要
求性 速度論パラメーターの測定に以下の測定条件を使用した
。
75 ile 4.82 Ser3.85 1eu 7.90 g1x 10.47 tyr 2.40PrO6,15
phe 2.37 g1y 8.22 hi、s 3.67ala 14.
69 lys 3.1.0cys O,00arg 5
.21 val 7.47 trp 2.05 D、速度論的パラメーター、基質特異性および補因子要
求性 速度論パラメーターの測定に以下の測定条件を使用した
。
IJ 7酸−)−)リウム緩衝液 15QmM、PH6
,4゜25°C N A D P H11〜300μM 酵素 10μg 2、5− D K G O,43〜43mM測定容量
1.0尻e ミヒヤエル恒数(Km)2.5−DKG 15.5mM
NADPH33,7μM 最大速度(■max)9.8単位/mg(1単位=1.
0μモル/分) この酵素はNADPHに特異性を有する。2−KDG、
5−KDG、D−グルコン酸、2−KLG、NADHで
は何ら活性を認めなかった。
,4゜25°C N A D P H11〜300μM 酵素 10μg 2、5− D K G O,43〜43mM測定容量
1.0尻e ミヒヤエル恒数(Km)2.5−DKG 15.5mM
NADPH33,7μM 最大速度(■max)9.8単位/mg(1単位=1.
0μモル/分) この酵素はNADPHに特異性を有する。2−KDG、
5−KDG、D−グルコン酸、2−KLG、NADHで
は何ら活性を認めなかった。
1斗 」H−旧−++
Mg 1Mn 、 Ca 、 Zn 1EDTA、シス
ティン、ADP、ATPの存在下で、何ら活性に変化を
認めなかった。
ティン、ADP、ATPの存在下で、何ら活性に変化を
認めなかった。
E、至適pH
PH6,4で最高の活性が認められた。この酵素は、p
H5,0〜7.6の広い範囲にわたって活性を示した。
H5,0〜7.6の広い範囲にわたって活性を示した。
2、5− D K Gの2−KLGへの変換を計量する
ために、0.1モルのトリス: C1(pH7,5)
1.ml中に2.5−DKG、1.33mMのNADP
H,0,3■の2.5− D K G +)ダクターゼ
を含有させて反応を行なった。25℃で5時間後、反応
を停止し、N A D P H酸化と2−KLGの生成
を分析した。
ために、0.1モルのトリス: C1(pH7,5)
1.ml中に2.5−DKG、1.33mMのNADP
H,0,3■の2.5− D K G +)ダクターゼ
を含有させて反応を行なった。25℃で5時間後、反応
を停止し、N A D P H酸化と2−KLGの生成
を分析した。
Q、 4 m MのN A D P Hの酸化に相当す
る380nmにおける吸収の変化が観察された。有機酸
カラムによるHPLC分析では0.42mMの2−KL
Gに相当する単一のピークが認められた。2−KDG(
2−ケト−ローグルコン酸)または5−KDG(5−ケ
)−D−グルコン酸)は認められなかった。このHP
T−C分析の結果は、更に、凍結乾燥した反応混合物に
30分、90℃でトリメチルシリルイミダゾール/ピリ
ジン(50150)を添加して調製した過トリメチルシ
リル化誘導体を、5幅の交差結合フェニルメチルシリコ
ン融解シリカ結合キャピラリーカラム(25m)を用い
たGC−MS分析により確かめられた。薄層クロマトグ
ラフィの結果も上記の結果と一致した。
る380nmにおける吸収の変化が観察された。有機酸
カラムによるHPLC分析では0.42mMの2−KL
Gに相当する単一のピークが認められた。2−KDG(
2−ケト−ローグルコン酸)または5−KDG(5−ケ
)−D−グルコン酸)は認められなかった。このHP
T−C分析の結果は、更に、凍結乾燥した反応混合物に
30分、90℃でトリメチルシリルイミダゾール/ピリ
ジン(50150)を添加して調製した過トリメチルシ
リル化誘導体を、5幅の交差結合フェニルメチルシリコ
ン融解シリカ結合キャピラリーカラム(25m)を用い
たGC−MS分析により確かめられた。薄層クロマトグ
ラフィの結果も上記の結果と一致した。
A、プローブの設計
Corynebacterium株(ATCC3109
0) DNAのTmを測定したところ、7.5mMリン
酸ナトリウム、1 mM E DTA (p)−16,
8)の溶液中で81.5℃であった。これは標準として
使用したP seudomonas aerugino
saのDNA(Tm=79.7℃、G十C=67%)か
らの(G −1−、C)含量71%に相当する。従って
、構築に当たって、高(C@−,C)含量の細菌DNA
中にいきわたっていることが知られているコドン(Go
ug、 M、ら、NucleicAcids Res、
10.7055(1982) )を使用した:pHe
、 TTC; Iys、 AAG ; va+ 、
GTG ; pro、 CCG ;ala。
0) DNAのTmを測定したところ、7.5mMリン
酸ナトリウム、1 mM E DTA (p)−16,
8)の溶液中で81.5℃であった。これは標準として
使用したP seudomonas aerugino
saのDNA(Tm=79.7℃、G十C=67%)か
らの(G −1−、C)含量71%に相当する。従って
、構築に当たって、高(C@−,C)含量の細菌DNA
中にいきわたっていることが知られているコドン(Go
ug、 M、ら、NucleicAcids Res、
10.7055(1982) )を使用した:pHe
、 TTC; Iys、 AAG ; va+ 、
GTG ; pro、 CCG ;ala。
GCC; asp、 GAC; gln、 CAG ;
arg、 CGC; glu、 GAG; asn、
AAC; ser、 TCC; ice、 ATC;
Ieu、 CTG ; gly。
arg、 CGC; glu、 GAG; asn、
AAC; ser、 TCC; ice、 ATC;
Ieu、 CTG ; gly。
GGC; tyr、 TACoCorynebacte
rium株(ATCC31090)から得られた2、
5− D K Gリダクターゼの部分的なアミノ酸配列
は実施例2に示されている:この配列と上記のコドンの
配列を使用し、AndersonおよびKingsto
nの方法(Proc、 Natl。
rium株(ATCC31090)から得られた2、
5− D K Gリダクターゼの部分的なアミノ酸配列
は実施例2に示されている:この配列と上記のコドンの
配列を使用し、AndersonおよびKingsto
nの方法(Proc、 Natl。
Acad、Sci、USA 80.6838(1983
))を用いて好適なプローブを構築した。Crea、
R,ら(NucleicAcids Res、、 8
: 2331(1980)のフォスフオトリエステル法
により2つの43量体、即ち5’ GGCCTCCTC
CACGGCGCGCTGGGCGTCGGCCGGC
GGCACCTTG3/および5’CTCCATCCC
GCAGCTGGGCTACGGCGTGTTCAAG
GTGC,CGCCG3’を合成した。このオリゴヌク
レオチドプローブを100 μci (r−32P ’
) AT P (5,0OOC!/mmole 、 A
mersham )およびポリヌクレオチドキナーゼ(
P −L Biochemicals )によりリン酸
化する。
))を用いて好適なプローブを構築した。Crea、
R,ら(NucleicAcids Res、、 8
: 2331(1980)のフォスフオトリエステル法
により2つの43量体、即ち5’ GGCCTCCTC
CACGGCGCGCTGGGCGTCGGCCGGC
GGCACCTTG3/および5’CTCCATCCC
GCAGCTGGGCTACGGCGTGTTCAAG
GTGC,CGCCG3’を合成した。このオリゴヌク
レオチドプローブを100 μci (r−32P ’
) AT P (5,0OOC!/mmole 、 A
mersham )およびポリヌクレオチドキナーゼ(
P −L Biochemicals )によりリン酸
化する。
5hiller らの方法(Antimicro、 A
gents Chemo−therapy 18.81
4(1980))により、Corynel〕acLer
iu株ATCC31090からゲノムDNAを分離した
。
gents Chemo−therapy 18.81
4(1980))により、Corynel〕acLer
iu株ATCC31090からゲノムDNAを分離した
。
大きい断片(> 100kb) をCsC1密度勾配遠
心分離法で純化し、Sau 3 Aにより部分的に消化
した。消化物をアガロースゲル電気泳動により、1−2
kl)、2−3kb、 3−4kb、および4−5kb
の大きさ別に組分けしてサイズ分画した。ゲノムライブ
ラリーは、BamHI部位の切断と、T4DNAリガー
ゼを用いた5au3A断片の挿入により、ベクターpB
R322およびp A CY C184を用いて各サイ
ズ毎のDNA断片から作製した( Bol 1ver
。
心分離法で純化し、Sau 3 Aにより部分的に消化
した。消化物をアガロースゲル電気泳動により、1−2
kl)、2−3kb、 3−4kb、および4−5kb
の大きさ別に組分けしてサイズ分画した。ゲノムライブ
ラリーは、BamHI部位の切断と、T4DNAリガー
ゼを用いた5au3A断片の挿入により、ベクターpB
R322およびp A CY C184を用いて各サイ
ズ毎のDNA断片から作製した( Bol 1ver
。
Fら、Gene 2.95(1977) ;Chang
、 A、C,Y、、およびCohen、 S、N、J
、Bacteriol、 134 、1141(197
8))。D 、 Hanahanの形質転換のプロトコ
ール(J、 Mo1.Biol、、す刷 557(19
83))を用いて、得られたプラスミドを用いてE、c
oli、株NM294(ATCC31446)またはD
I−T −1(ATCC33849)のrec A−誘
導株を形質転換にした。
、 A、C,Y、、およびCohen、 S、N、J
、Bacteriol、 134 、1141(197
8))。D 、 Hanahanの形質転換のプロトコ
ール(J、 Mo1.Biol、、す刷 557(19
83))を用いて、得られたプラスミドを用いてE、c
oli、株NM294(ATCC31446)またはD
I−T −1(ATCC33849)のrec A−誘
導株を形質転換にした。
各ゲノムライブラリーは10〜10 の独立した組換え
体から成っていた。(変法として、Coryne −b
acterium株(A’TCC31090) DNA
のBamHI断片(サイズ幅2.0〜2,5kb) お
よびPst断片(サイズ幅0.5〜]、、5kb)を用
いてpBR322から別のプラスミドライブラリーを作
製しても良い)。
体から成っていた。(変法として、Coryne −b
acterium株(A’TCC31090) DNA
のBamHI断片(サイズ幅2.0〜2,5kb) お
よびPst断片(サイズ幅0.5〜]、、5kb)を用
いてpBR322から別のプラスミドライブラリーを作
製しても良い)。
コロニ一群をマイクロ滴定圧に採取し、−夜インキユベ
ートしてから、アンピシリンまたはクロラムフェニコー
ルを含有するL Bプレート上に設置シタニトロセルロ
ースフィルター(BA35)にスタンプした。マイクロ
滴定圧に残った部分のコロニーは42%のDMSOを加
えて保管し、−20℃に貯蔵した。
ートしてから、アンピシリンまたはクロラムフェニコー
ルを含有するL Bプレート上に設置シタニトロセルロ
ースフィルター(BA35)にスタンプした。マイクロ
滴定圧に残った部分のコロニーは42%のDMSOを加
えて保管し、−20℃に貯蔵した。
移植された部分のコロニーは8〜9時間、3゛7°Cで
インキュベートした後、フィルターから、12.5μQ
/meのクロラムフェニコールまたはスペクチノマイシ
ンを含有しているプレートへ移し換え、−夜、37℃で
インキュベートすることにより増幅した。
インキュベートした後、フィルターから、12.5μQ
/meのクロラムフェニコールまたはスペクチノマイシ
ンを含有しているプレートへ移し換え、−夜、37℃で
インキュベートすることにより増幅した。
E、coli 内のプラスミドライブラリーをフィルタ
ーハイブリダイゼーションによりスク1ノ−ニングする
。r)NAを変性し、I takura、 Kら(Nu
cleicAcids Res、 9 :879〜89
4(1981))の記載した方法により重複フィルター
に結合させる。このハイブリダイゼーション用のフィル
ターを、フィルター当り約10 mlの5 x S E
T、 5 x Denhardt溶液および50μQ
/meの変性したサケ***DNA、および゛0.1%ピ
ロリン酸ナトリウム斗20%ホルムアミド中に浸漬する
( 5 x S F、T=5 QmM )リ ス−HC
l (pH8,0)、5 mM E DTA、 5 0
0mM NaC,5; 5 x Denhardtの
溶液二〇、1%ウシ血清アルブミン、o、1foポリビ
ニルピロリドン、0.1%フィコール; Denhar
dtlBiochem、 Biophys、 Res。
ーハイブリダイゼーションによりスク1ノ−ニングする
。r)NAを変性し、I takura、 Kら(Nu
cleicAcids Res、 9 :879〜89
4(1981))の記載した方法により重複フィルター
に結合させる。このハイブリダイゼーション用のフィル
ターを、フィルター当り約10 mlの5 x S E
T、 5 x Denhardt溶液および50μQ
/meの変性したサケ***DNA、および゛0.1%ピ
ロリン酸ナトリウム斗20%ホルムアミド中に浸漬する
( 5 x S F、T=5 QmM )リ ス−HC
l (pH8,0)、5 mM E DTA、 5 0
0mM NaC,5; 5 x Denhardtの
溶液二〇、1%ウシ血清アルブミン、o、1foポリビ
ニルピロリドン、0.1%フィコール; Denhar
dtlBiochem、 Biophys、 Res。
Comm、、23:641(1966)−+参照)。フ
ィルターを42℃で14〜16時間、絶えず攪拌しなが
らプレハイブリダイズし、本実施例のA項において調製
した〜1×1108CPのプローブと42℃でプローブ
した。A項のプローブとハイブリダイズしたフィルタを
、42℃で0.2 x S S C,0,1%SDS、
0.1%ピロリン酸ナトリウムで30分間つつ3回洗滌
した。2つのフィルターのそれぞれをドライブロツチン
グし、台紙につけ、DupontCronex l l
Rエキストラライフライトニングープラスインテンシ
ファイングスクリーンを持ったKodak XR5X線
フィルムに一70℃で4〜24時間、感光させた。
ィルターを42℃で14〜16時間、絶えず攪拌しなが
らプレハイブリダイズし、本実施例のA項において調製
した〜1×1108CPのプローブと42℃でプローブ
した。A項のプローブとハイブリダイズしたフィルタを
、42℃で0.2 x S S C,0,1%SDS、
0.1%ピロリン酸ナトリウムで30分間つつ3回洗滌
した。2つのフィルターのそれぞれをドライブロツチン
グし、台紙につけ、DupontCronex l l
Rエキストラライフライトニングープラスインテンシ
ファイングスクリーンを持ったKodak XR5X線
フィルムに一70℃で4〜24時間、感光させた。
陽性コロニーの細胞を増殖させ、プラスミドDNAをC
lewe11およびHe1inskiの方法(Proc
。
lewe11およびHe1inskiの方法(Proc
。
Natl、 Acad、 Sci、 USA 62.1
159(1969))によって分離した。DNAをAb
+1および遍隻■により断片化し、ベクターM13mp
8およびM131np9 に■サブクローンした( M
C55iy1g 、 J、およびViera、 J、、
Gene 19,269(1982)。プローブとハイ
ブリッド形成したサブクローンを、そのDNAが2.5
− D K G IJダクターゼを暗号化していること
を確かめるため、ジデオキシ鎖ターミネーション法によ
り塩基配列決定した( Sanger、 F、ら、Pr
oc、Natl、Acad、Sci、(USA)74:
5463(1977))。
159(1969))によって分離した。DNAをAb
+1および遍隻■により断片化し、ベクターM13mp
8およびM131np9 に■サブクローンした( M
C55iy1g 、 J、およびViera、 J、、
Gene 19,269(1982)。プローブとハイ
ブリッド形成したサブクローンを、そのDNAが2.5
− D K G IJダクターゼを暗号化していること
を確かめるため、ジデオキシ鎖ターミネーション法によ
り塩基配列決定した( Sanger、 F、ら、Pr
oc、Natl、Acad、Sci、(USA)74:
5463(1977))。
それ自身の、または合成されたリポソーム結合部位を伴
なった2、 5− D K G IJダクターゼ遺伝子
を、テトラサイクリン耐性遺伝子またはそれ以外の選択
マーカーを有し、またプラスミドCo1EI、15A、
またはRS F 1010から誘導された複製起源を含
んでいる発現プラスミド上のE、coli trp(ま
たはtac )プロモーターまたはpACYC184C
AT プロモーターの1下流1に挿入する。
なった2、 5− D K G IJダクターゼ遺伝子
を、テトラサイクリン耐性遺伝子またはそれ以外の選択
マーカーを有し、またプラスミドCo1EI、15A、
またはRS F 1010から誘導された複製起源を含
んでいる発現プラスミド上のE、coli trp(ま
たはtac )プロモーターまたはpACYC184C
AT プロモーターの1下流1に挿入する。
組立て物のあるものは、更に、外部から添加されたイン
ドールアクリル酸またはIPTGによって2、5−D
K G IJダクターゼ遺伝子の発現を調節することが
できるE、coli trpレプレッサーまたはE、c
oli Iac レプレッサーを暗号化している活性遺
伝子を含有していてもよい。上記のプラスミドの種々の
突然変異体もまた、2.5− D K G IJダクタ
ーゼの発現に利用される。
ドールアクリル酸またはIPTGによって2、5−D
K G IJダクターゼ遺伝子の発現を調節することが
できるE、coli trpレプレッサーまたはE、c
oli Iac レプレッサーを暗号化している活性遺
伝子を含有していてもよい。上記のプラスミドの種々の
突然変異体もまた、2.5− D K G IJダクタ
ーゼの発現に利用される。
構築
2、5− D K G IJダクターゼ遺伝子の一部を
含有するCorynebacteriumS P (A
TCC31090)DNAのクローンされた2、2kb
とHI断片(フラグメント)を、実施例3に記載された
43量体プローブで分離した。このプラスミドの0.1
2kb Pst I /Bam i(I断片を、残りの
遺伝子を含有しているCoryne+:+acteri
um SP DNAの重複している0、88 kb P
stI断片を分離するためのプローブとして使用した。
含有するCorynebacteriumS P (A
TCC31090)DNAのクローンされた2、2kb
とHI断片(フラグメント)を、実施例3に記載された
43量体プローブで分離した。このプラスミドの0.1
2kb Pst I /Bam i(I断片を、残りの
遺伝子を含有しているCoryne+:+acteri
um SP DNAの重複している0、88 kb P
stI断片を分離するためのプローブとして使用した。
第2図に示すようにpDKGR2(2,2kbμ+m
HI断片を含有している)をNc。
HI断片を含有している)をNc。
■で消化し、E、 coli DNAポリメラーゼ■K
1 enow 断片およびdNTPsで処理して平滑
末端を作り、次いで更にBam HIで消化してQ、8
7kl)の断片を遊離させた;この断片4は低融点アガ
ロース上を電気泳動させて精製した。プラスミドPDK
G 29 (0,88kb Pstl断片を含んでいる
)をPsL IおよびBam HTで消化し、生成した
0、 7.6 kb断片を同様に低融点アガロース−L
で分離した。この0,87 kb Nco工/ Bam
H4断片と0.76kb県狸H■/初■断片を一初劇
■/照■で消化したM13m9と混合し、ライゲーショ
ンして完全な2.5− D K G IJダクターゼ遺
伝子を含有しているCorynebacterium
SP DNAの1,6kbを挿入体を持ったM13組換
え体(”m1t12”)を得た(第2図)。
1 enow 断片およびdNTPsで処理して平滑
末端を作り、次いで更にBam HIで消化してQ、8
7kl)の断片を遊離させた;この断片4は低融点アガ
ロース上を電気泳動させて精製した。プラスミドPDK
G 29 (0,88kb Pstl断片を含んでいる
)をPsL IおよびBam HTで消化し、生成した
0、 7.6 kb断片を同様に低融点アガロース−L
で分離した。この0,87 kb Nco工/ Bam
H4断片と0.76kb県狸H■/初■断片を一初劇
■/照■で消化したM13m9と混合し、ライゲーショ
ンして完全な2.5− D K G IJダクターゼ遺
伝子を含有しているCorynebacterium
SP DNAの1,6kbを挿入体を持ったM13組換
え体(”m1t12”)を得た(第2図)。
コノmi【12の一本鎖DNAに1欠失プライマー’(
配列: ACGGCCAGTGAA、TTCTATGA
CAGTTCCCAGC)およびM 13 m 9 D
N AのAlu■断片をアニーリングした。この鋳型
−プライマー組み合せ物を、dNTPs およびT4D
NAリガーゼの存在下に、E、coli D N Aポ
リメラーゼKlenow 断片で処理すると、Adel
manらの記載(DNA2,183(1983))のよ
うに、インビトロでヘテロデュプレックスmit 12
RF分子が作成された。これらの分子を宿主tM10
1の形質転換に使用し、所望の欠失を備えた組換え体フ
ァージを、欠失プライマーをプローブとして使用したプ
ラークハイブリダイゼーションによって検出した( A
dclmanら+DNA2,183(1983))。こ
の構造物はmit 12△と命名された(第3図)。
配列: ACGGCCAGTGAA、TTCTATGA
CAGTTCCCAGC)およびM 13 m 9 D
N AのAlu■断片をアニーリングした。この鋳型
−プライマー組み合せ物を、dNTPs およびT4D
NAリガーゼの存在下に、E、coli D N Aポ
リメラーゼKlenow 断片で処理すると、Adel
manらの記載(DNA2,183(1983))のよ
うに、インビトロでヘテロデュプレックスmit 12
RF分子が作成された。これらの分子を宿主tM10
1の形質転換に使用し、所望の欠失を備えた組換え体フ
ァージを、欠失プライマーをプローブとして使用したプ
ラークハイブリダイゼーションによって検出した( A
dclmanら+DNA2,183(1983))。こ
の構造物はmit 12△と命名された(第3図)。
このm1L12△RF DNAをEco R■およびT
−1ind IIIで消化すると、2.5− D K
Gリダクターゼ遺伝子を含有している1、5kb の断
片が得られた。ヒト成長ホルモン発現プラスミドpHG
T−T207−1ptrp△RI 5’CPHGI−I
207−1.pt rp△に15′ はpHGH207
1の誘導体(de Boer ラ(1983) 、 P
roc、 Na11. Acad、Sci、、 U S
A 8Q 。
−1ind IIIで消化すると、2.5− D K
Gリダクターゼ遺伝子を含有している1、5kb の断
片が得られた。ヒト成長ホルモン発現プラスミドpHG
T−T207−1ptrp△RI 5’CPHGI−I
207−1.pt rp△に15′ はpHGH207
1の誘導体(de Boer ラ(1983) 、 P
roc、 Na11. Acad、Sci、、 U S
A 8Q 。
21)であって、アンピシリン耐性遺伝子とtrpプロ
モーターの間のEcoR■部位が欠失している〕をEc
oRIとPst ■で消化して、F、 、 col i
trpプロモーターを含有するl、Qkbの断片を得
、また、pBR322を包■とU山世−■で消化して3
6kb の断片を作成しこ。これら3個の断片をライゲ
ーション(連結)することによって、2.5−D K
G IJダクターゼの発現プラスミドを形成し、これを
pmit12△/1rplと命名した(第3図)。
モーターの間のEcoR■部位が欠失している〕をEc
oRIとPst ■で消化して、F、 、 col i
trpプロモーターを含有するl、Qkbの断片を得
、また、pBR322を包■とU山世−■で消化して3
6kb の断片を作成しこ。これら3個の断片をライゲ
ーション(連結)することによって、2.5−D K
G IJダクターゼの発現プラスミドを形成し、これを
pmit12△/1rplと命名した(第3図)。
このプラスミドは宿主にテトラサイクリン耐性を付与す
ることはできない。完全なテトラサイクリン耐性機能を
暗号化しているプラスミドは、次のようにして構築され
た。Pm1L12△/lrp ]−DNAを男可■で消
化し、E、coli D N Aポリメラーゼ1に、l
enow 断片とd N T P sで処理して平滑末
端DNAを生成し、次にこれを5ph1で消化した;得
られた5、5kb 断片を低融点アガロース上で電気泳
動させることにより精製した。同様にして、pBR32
2DNAを腹RIで消化し、E 、 col 1DNA
ポリメラ一ゼIKlenow 断片とd N T P
sで処理し、Sph I で消化し、得られた0、56
kb断片を低融点アガロース上で精製した。次に、これ
らの5,5kb 断片と0.56 kb断片とを連結(
ライゲーション)し、テトラサイクリン耐性の2゜5−
D K Gリダクターゼ発現プラスミドを得、これを
、ptrpl−35と命名した(第3図)。このプラス
ミドに含まれているtrpプロモーター、合成リポソー
ム結合部位、および2.5− D K G IJダクタ
ーゼ遺伝子のDNA配列を第4図に示す。
ることはできない。完全なテトラサイクリン耐性機能を
暗号化しているプラスミドは、次のようにして構築され
た。Pm1L12△/lrp ]−DNAを男可■で消
化し、E、coli D N Aポリメラーゼ1に、l
enow 断片とd N T P sで処理して平滑末
端DNAを生成し、次にこれを5ph1で消化した;得
られた5、5kb 断片を低融点アガロース上で電気泳
動させることにより精製した。同様にして、pBR32
2DNAを腹RIで消化し、E 、 col 1DNA
ポリメラ一ゼIKlenow 断片とd N T P
sで処理し、Sph I で消化し、得られた0、56
kb断片を低融点アガロース上で精製した。次に、これ
らの5,5kb 断片と0.56 kb断片とを連結(
ライゲーション)し、テトラサイクリン耐性の2゜5−
D K Gリダクターゼ発現プラスミドを得、これを
、ptrpl−35と命名した(第3図)。このプラス
ミドに含まれているtrpプロモーター、合成リポソー
ム結合部位、および2.5− D K G IJダクタ
ーゼ遺伝子のDNA配列を第4図に示す。
E、組換え2.5−DKGIJダクターゼの製造形質転
換に用いる細胞はLacyおよび5parksの方法(
1’hy+opathological 5ocieL
y、 59 :1293−1297(1979))によ
り用意した。簡単に述べると、好適な宿主細胞、Erw
inia 11crbicola (ATCC2199
8)、またはE、coliMM 294(ATCC31
4646)の1白金耳を5mlのI−B培地に接種し、
30℃で14〜16時間、インキュベートした。この−
夜を置いた増殖物の1 : 100の希釈液をLB培地
に接種し、0D59oが0.4となるまで培養し、4℃
で遠心分離して、細胞を回収した。回収したペレットを
1/3量の10mMNaC1に再び懸濁し、4℃で再び
遠心分離し、ペレットを再び同量の30rn M Ca
C12に懸濁し、0℃で60分間放置後、再び4℃で
遠心分離し細胞を回収した。ペレットを1/12容量の
30mMCaCe2 に再び懸濁り、、4℃で一夜貯蔵
した。(別法として、細胞を30mM Ca C12と
15%グリセロールに再懸濁し、−70℃で貯蔵しても
良い。) 形質転換は、0.2 mlのコンピテント細胞と1μg
のプラスミドを0℃で2時間インキュベートし、次いで
1分間42℃に加温することにより行なった。3 ml
のL Bブロスをこれに加え、4時間37で ℃放置して、細胞を回復させ、次いで細胞をLacy△ および5parks (上述)記載の選択培地で培養し
た。
換に用いる細胞はLacyおよび5parksの方法(
1’hy+opathological 5ocieL
y、 59 :1293−1297(1979))によ
り用意した。簡単に述べると、好適な宿主細胞、Erw
inia 11crbicola (ATCC2199
8)、またはE、coliMM 294(ATCC31
4646)の1白金耳を5mlのI−B培地に接種し、
30℃で14〜16時間、インキュベートした。この−
夜を置いた増殖物の1 : 100の希釈液をLB培地
に接種し、0D59oが0.4となるまで培養し、4℃
で遠心分離して、細胞を回収した。回収したペレットを
1/3量の10mMNaC1に再び懸濁し、4℃で再び
遠心分離し、ペレットを再び同量の30rn M Ca
C12に懸濁し、0℃で60分間放置後、再び4℃で
遠心分離し細胞を回収した。ペレットを1/12容量の
30mMCaCe2 に再び懸濁り、、4℃で一夜貯蔵
した。(別法として、細胞を30mM Ca C12と
15%グリセロールに再懸濁し、−70℃で貯蔵しても
良い。) 形質転換は、0.2 mlのコンピテント細胞と1μg
のプラスミドを0℃で2時間インキュベートし、次いで
1分間42℃に加温することにより行なった。3 ml
のL Bブロスをこれに加え、4時間37で ℃放置して、細胞を回復させ、次いで細胞をLacy△ および5parks (上述)記載の選択培地で培養し
た。
成功した形質転換体を0.D、5.。=1.oの密度と
なるまで増殖させ、次いで遠心分離し、0.2%のグル
コースを含む最少量の培地に再懸濁させた。次に、IA
AまたはIPTGを培地に添加し、0,5〜1時間後、
遠心分離して細胞を回収し、リゾチームと界面活性剤(
Tween 80 )で処理して細胞を溶解(溶菌)さ
せた。
なるまで増殖させ、次いで遠心分離し、0.2%のグル
コースを含む最少量の培地に再懸濁させた。次に、IA
AまたはIPTGを培地に添加し、0,5〜1時間後、
遠心分離して細胞を回収し、リゾチームと界面活性剤(
Tween 80 )で処理して細胞を溶解(溶菌)さ
せた。
−上清を取り、2.5− D K Gリダクターゼの存
在を実施例2Dに示した方法で測定した(第1表)。
在を実施例2Dに示した方法で測定した(第1表)。
タンパク質はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より分析した(第5図)。組換え体2,5D K G
IJダクターゼを示すタンパク質バンドを、ウェスタン
ブロッティング法により免疫学的に同定した( Tab
in 、 JTら、Proc、 Natl 、 Aca
d、Sci。
より分析した(第5図)。組換え体2,5D K G
IJダクターゼを示すタンパク質バンドを、ウェスタン
ブロッティング法により免疫学的に同定した( Tab
in 、 JTら、Proc、 Natl 、 Aca
d、Sci。
USA亘、4350(1979))
第1表
1)BR322を導入した
Erwinia hcrl)icola(ATCC21
998) o、o 87PLrpl−35を導入した Erwinia herbicola(ATC:C21
998) 1.925実施例4 組換え微生物を2.5
−DKGに接触させることによる2 −K L Gの製
造凍結貯蔵していたグリセロールストックから、ptp
l−35−形質転換Ew、hcrbicola (AT
CC21998)の細胞を、5■/Lのテトラサイクリ
ンを含有するL B固形培地(10g/L)リプトン、
5g/L酵母エキス、109./ L NaCd、15
fl/L寒天)上に画線接種し、48時間、30℃で
インキュベートした。その1コロニーを取り、5mfl
/Lのテトラサイクリンを含有するLB液体培地5ml
の接種に使用し、これを試験管内で16時間、30℃で
振盪した。この培養の1.、 Omeを5 mf/ /
Lテトラサイクリン含有LB液体培地toomgの接
種に使用し、次にこれを30℃に於いて、200rpm
で16時間振盪した。遠心分離により細胞を回収し、同
量の新しいI、B培地で一度洗滌し、次いで5m9/T
−のテトラサイクリンおよび20g/Lの2.5− D
K Gを含有する50m1のL B培地に再懸濁させ
た。この10rnlを125ゴのフラスコ中で、20O
rpm、30℃で16時間振盪した。
998) o、o 87PLrpl−35を導入した Erwinia herbicola(ATC:C21
998) 1.925実施例4 組換え微生物を2.5
−DKGに接触させることによる2 −K L Gの製
造凍結貯蔵していたグリセロールストックから、ptp
l−35−形質転換Ew、hcrbicola (AT
CC21998)の細胞を、5■/Lのテトラサイクリ
ンを含有するL B固形培地(10g/L)リプトン、
5g/L酵母エキス、109./ L NaCd、15
fl/L寒天)上に画線接種し、48時間、30℃で
インキュベートした。その1コロニーを取り、5mfl
/Lのテトラサイクリンを含有するLB液体培地5ml
の接種に使用し、これを試験管内で16時間、30℃で
振盪した。この培養の1.、 Omeを5 mf/ /
Lテトラサイクリン含有LB液体培地toomgの接
種に使用し、次にこれを30℃に於いて、200rpm
で16時間振盪した。遠心分離により細胞を回収し、同
量の新しいI、B培地で一度洗滌し、次いで5m9/T
−のテトラサイクリンおよび20g/Lの2.5− D
K Gを含有する50m1のL B培地に再懸濁させ
た。この10rnlを125ゴのフラスコ中で、20O
rpm、30℃で16時間振盪した。
得られたブロスをHPLCで分析し、2.(1/Lの2
− K L Gが含有していることを認めた。pBR3
22を導入したErw、 herbicola (AT
CC21998)を用いて同様な方法で行なった対照培
養では、2− K L Gは含まれていなかった。
− K L Gが含有していることを認めた。pBR3
22を導入したErw、 herbicola (AT
CC21998)を用いて同様な方法で行なった対照培
養では、2− K L Gは含まれていなかった。
2− K L Gの製造
ptrp+−35−形質転換Erw、 herbico
la (ATCC21998) の細胞を5πg/Lの
テトラサイクリンを含有するL B固形培地(10Q
/ L トIJプトン、5 g/I−酵母エキス、10
Q / T−NaC1,1,5g/L寒天)」二に画
線接種し、次いで48時間、30℃でインキュベートし
た。その1個のコロニーを取り、5F’l&/Lのテト
ラサイクリンを含むLB液体培地5mlの接種に使用し
、これを試験管内で16時間、30℃で振盪した。この
培養液1mlを、5ダ/Lのテトラサイクリンを含有す
る100m1のATCC培地1038 (3,0g/L
グルコース、5.097L酵母エキス、5.0Ii’/
Lペプトン、7.5g/ L CaCO3、pH7,0
)への接種に使用し、これを500m1のフラスコ中で
、30℃で16時間、20 Orpmで振盪した。次に
、この培養液75meから遠心分離により細胞を取り、
5mfl/Lのテトラサイクリンと209/Lのグリセ
ロールを含む50m1の新しいATCC培地1038に
再懸濁させ、500m/のフラスコ中、30°C,20
0丁Pmで48時間振盪する。得られたブロスをHP
L CおよびGC/MSで分析した結果、1.0g/L
の2−K L Gを含有していることがわかった。pB
R−322を導入したErw、 herbicola
(ATCC21998)を用いて同様にして行なった対
照培養には、2−K LGは含まれていなかった。
la (ATCC21998) の細胞を5πg/Lの
テトラサイクリンを含有するL B固形培地(10Q
/ L トIJプトン、5 g/I−酵母エキス、10
Q / T−NaC1,1,5g/L寒天)」二に画
線接種し、次いで48時間、30℃でインキュベートし
た。その1個のコロニーを取り、5F’l&/Lのテト
ラサイクリンを含むLB液体培地5mlの接種に使用し
、これを試験管内で16時間、30℃で振盪した。この
培養液1mlを、5ダ/Lのテトラサイクリンを含有す
る100m1のATCC培地1038 (3,0g/L
グルコース、5.097L酵母エキス、5.0Ii’/
Lペプトン、7.5g/ L CaCO3、pH7,0
)への接種に使用し、これを500m1のフラスコ中で
、30℃で16時間、20 Orpmで振盪した。次に
、この培養液75meから遠心分離により細胞を取り、
5mfl/Lのテトラサイクリンと209/Lのグリセ
ロールを含む50m1の新しいATCC培地1038に
再懸濁させ、500m/のフラスコ中、30°C,20
0丁Pmで48時間振盪する。得られたブロスをHP
L CおよびGC/MSで分析した結果、1.0g/L
の2−K L Gを含有していることがわかった。pB
R−322を導入したErw、 herbicola
(ATCC21998)を用いて同様にして行なった対
照培養には、2−K LGは含まれていなかった。
造
容易に入手し得る炭素供給源から2−K L Gを製造
し得ることを例示するために、次の実験を実施した。
し得ることを例示するために、次の実験を実施した。
次の成分を含有する培地中で、Erwinia her
bicola(ATCC21998)/’PLrPl−
35の細胞を発育させることにより2− K L Gの
製造を実施した。
bicola(ATCC21998)/’PLrPl−
35の細胞を発育させることにより2− K L Gの
製造を実施した。
酵母エキス(Nestles ) 109 / (1炭
酸カルシウム 20Q/(1 とうもろこし浸漬液 10 f//1 グルコース 20g/l テトラサイクリン 5πf//(1 グルコースおよびテトラサイクリンは別個に滅菌し、接
種前に添加した。
酸カルシウム 20Q/(1 とうもろこし浸漬液 10 f//1 グルコース 20g/l テトラサイクリン 5πf//(1 グルコースおよびテトラサイクリンは別個に滅菌し、接
種前に添加した。
接種材料は、凍結したストック培養液1.0 mlを、
5g/lのグルコースおよび5 ml’j / nのテ
トラサイクリンを含有している50m/のルリア(Lu
ria)ブロスに加えることにより調製した。この接種
材料を含有する250m/の遮閉フラスコを30℃で1
2時間振盪培養した。
5g/lのグルコースおよび5 ml’j / nのテ
トラサイクリンを含有している50m/のルリア(Lu
ria)ブロスに加えることにより調製した。この接種
材料を含有する250m/の遮閉フラスコを30℃で1
2時間振盪培養した。
50m/の上記の製造培地を満たした2 50 mlの
遮閉フラスコに1 mlのこの接種材料を接種した。
遮閉フラスコに1 mlのこの接種材料を接種した。
フラスコを振盪しつつ、30℃でインキュベートした。
接種時の培地のpT−Tはとうもろこし浸漬液の酸性の
ため5.1であった。57時間後にpHは8.71まで
」1昇し、2− K L GはHP L Cにより、0
.6πg/mlの濃度で存在していることがわかった。
ため5.1であった。57時間後にpHは8.71まで
」1昇し、2− K L GはHP L Cにより、0
.6πg/mlの濃度で存在していることがわかった。
2− K L Gの存在はHP L CおよびC,C−
MSスペクトロメトリーにより確認した。
MSスペクトロメトリーにより確認した。
第1図はCorynebacterium2.5− D
K Gリダクターゼのための発現ベクターの模式図、
第2図および第3図は2.5− D K G +)ダク
ターゼ遺伝子のための発現ベクターの組み立てを示す工
程図、第4図はpTrp 1−35 発現ベクターのコ
ントロール領域および2.5− D K G IJダク
ターゼ遺伝子を含む配列を示す模式図、第5図は第4図
に示した配列を持つ2.5− D K G IJダクタ
ーゼ発現ベクターで形質転換したErwinia he
rl)icola (ATCC21993)から抽出し
た蛋白質の染色ゲルを示すグラフである。
K Gリダクターゼのための発現ベクターの模式図、
第2図および第3図は2.5− D K G +)ダク
ターゼ遺伝子のための発現ベクターの組み立てを示す工
程図、第4図はpTrp 1−35 発現ベクターのコ
ントロール領域および2.5− D K G IJダク
ターゼ遺伝子を含む配列を示す模式図、第5図は第4図
に示した配列を持つ2.5− D K G IJダクタ
ーゼ発現ベクターで形質転換したErwinia he
rl)icola (ATCC21993)から抽出し
た蛋白質の染色ゲルを示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、実質的に不純物を含有しない2,5−ジケトグルコ
ン酸リダクターゼ。 2、実施例1dに記載の基準によりホモジニアスな2,
5−ジケトグルコン酸リダクターゼ。 3、比活性が5単位/mf/タンパク質より大である2
、5−ジケトグルコン酸リダクターゼ。 4、(a) 2.5−ジケトグルコン酸リダクターゼを
産生ずる細胞を溶菌し、 (bl 陰イオン交換カラムに工程(a)の溶菌物を吸
着させ、然る後にカラムから酵素を溶出させ、FC+
(b)の工程で得られた溶出液をアフイニテイ力ラムで
処理し、酵素をアフィニティーカラムから溶出させ、 (di 溶出液から酵素を回収する、 ことから成る2、5−ジケトグルコン酸リダクターゼの
製造方法。 5、細菌細胞がCorynebacterium属であ
る第4項に記載の方法。 5、CorynebacteriumがCoryneb
acterium Sp。 ATCC31090である第5項に記載の方法。 7、陰イオン交換カラムがDEAEセルロースである第
4項に記載の方法。 8、アフィニティー吸着剤がチバクロン・ブルーF3.
GAである第4項に記載の方法。 9、第4項に記載の方法により製造される2、5−ジケ
トグルコン酸リダクターゼ。 10、還元性または非還元性のSDS 、PAGEにお
いて、約34,000の分子量に相当する移動を示す2
,5−ジケトグルコン酸リダクターゼ活性を有する酵素
。 11、実施例2に開示したN−末端アミノ酸配列を有し
、2.5−ジケトグルコン酸活性を有するタンパク質。 12、 2.5−ジケトグルコン酸を含有する混合物を
第1項、第2項、または第9項に記載した酵素、と接触
させることから成る2、5−ジヶトグルコン酸を2−ケ
トーL−グロン酸へ、変換させる方法。 13.第1項、第2項、または第9項に記載した酵素を
溶液で供給する第12項に記載の方法。 14、第1項、第2項、または第9項に記載した酵素を
固定化型で供給する第12項に記載の方法。 15、還元当量物をインビトロで供給する第12項に記
載の方法。 16、 2.5−ジケトグルコン酸リダクターゼを暗号
化しているDNA配列を、細菌宿主に適合し得るプロモ
ーターへ機能的に結合させることから成る、該DNA配
列を発現し得る複製可能な発現ビヒクルを組み立てる方
法。 17、組換え宿主細胞により産生される2、5−ジケト
グルコン酸リダクターゼ。 18、 2.5−ジケトグルコン酸リダクターゼを発現
し得る組換えベクターを含有する組換え宿主細胞を培養
することから成る2、5−ジケトグルコン酸リダクター
ゼの製造方法。 19、好適な宿主細胞において2,5−ジケトグルコン
酸リダクターゼを暗号化しているDNA配列を発現する
ことができる組換え発現ベクター。 20、 2.5−ジケトグルコン酸リダクターゼを暗号
化しているDNA配列が、当該DNA配列を発現し得る
プロモータに機能的に結合している組換え発現ビヒクル
。 21、第19項または第20項に記載の発現ベクターで
形質転換された微生物宿主細胞または細胞培養。 22、 2.5−ジケトグルコン酸リダクターゼを暗号
化しているDNA配列を含有し、それを発現することが
できる組換え細胞または細胞培養。 23、第21項に記載の細胞または細胞培養によって産
生される2、5−ジケトグルコン酸リダクターゼ。 24、 2.5−ジケトグルコン酸を含有する混合物を
第17項または第23項に記載のりダクターゼと接触さ
せることから成る2、5−ジケトグルコン酸を2−ケト
ーL−グロン酸に変換させる方法。 25、 2.5−ジケトグルコン酸を含有する混合物を
、2,5−ジケトグルコン酸リダクターゼ遺伝子を発現
する組換え宿主細胞を含有する培養と接触させることか
ら成る2、5−ジケトグルコン酸を2−ヶ)−L−グロ
ン酸に変換する方法。 26.2−ケトーL−グロン酸を更にアスコルビン酸へ
変換する工程を含む第25項に記載の方法。 27、通常の代謝産物を2−ケトーL−グロン酸へ変換
させることのできる組換え細胞。 28、通常の代謝産物を2−ヶ)−L−グロン酸へ変化
させるために必要とする1またはそれ以上の酵素を暗号
化している発現ベクターで形質転換された組換え微生物
。 29、発現ベクターが2,5−ジケトグルコン酸リダク
ターゼを暗号化している第28項に記載の微生物。 30、Erwinia属に属する第29項に記載の微生
物。 31、通常の代謝産物がグルコースである第27項に記
載の微生物。 32、好適な代謝条件下で、通常の代謝産物を含有して
いる培地中、当該通常の代謝産物を2−ケトーL−グロ
ン酸へ変換させ得る組換え細菌細胞を培養することから
成る、該通常の代謝産物を2−ケトーL−グロン酸へ変
換させる方法。 33、組換え宿主細胞が、2,5−ジケトグルコン酸リ
ダクターゼを暗号化しているDNA配列を発現し得る発
現ベクターを含有している第32項に記載の方法。 34、組換え細胞がErwinia属に属する第33項
に記載の方法。 35、通常の代謝産物がグルコースである第32項に記
載の方法。 36、 2−ヶ)−L−1”ロン酸カアスコルビン酸へ
変換される第32項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (12)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US50840983A | 1983-06-28 | 1983-06-28 | |
US50841083A | 1983-06-28 | 1983-06-28 | |
US50862883A | 1983-06-28 | 1983-06-28 | |
US62058584A | 1984-06-14 | 1984-06-14 | |
US508410 | 1984-06-14 | ||
US620651 | 1984-06-14 | ||
US620585 | 1984-06-14 | ||
US06/620,652 US4758514A (en) | 1983-06-28 | 1984-06-14 | Ascorbic acid intermediates and process enzymes |
US508628 | 1984-06-14 | ||
US06/620,651 US4757012A (en) | 1983-06-28 | 1984-06-14 | Ascorbic acid intermediates and process enzymes |
US508409 | 1984-06-14 | ||
US620652 | 2000-07-20 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5037930A Division JPH0740936B2 (ja) | 1983-06-28 | 1993-02-26 | アスコルビン酸の中間体およびプロセス酵素類 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6070073A true JPS6070073A (ja) | 1985-04-20 |
JPH0586186B2 JPH0586186B2 (ja) | 1993-12-10 |
Family
ID=27560082
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59135016A Granted JPS6070073A (ja) | 1983-06-28 | 1984-06-28 | アスコルビン酸の中間体およびプロセス酵素類 |
JP5037930A Expired - Lifetime JPH0740936B2 (ja) | 1983-06-28 | 1993-02-26 | アスコルビン酸の中間体およびプロセス酵素類 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5037930A Expired - Lifetime JPH0740936B2 (ja) | 1983-06-28 | 1993-02-26 | アスコルビン酸の中間体およびプロセス酵素類 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP0132308B1 (ja) |
JP (2) | JPS6070073A (ja) |
AR (1) | AR243606A1 (ja) |
AT (1) | ATE61409T1 (ja) |
AU (1) | AU594921B2 (ja) |
BR (1) | BR8403146A (ja) |
CA (1) | CA1339107C (ja) |
DE (2) | DE3484216D1 (ja) |
DK (1) | DK175702B1 (ja) |
IE (1) | IE57551B1 (ja) |
IL (5) | IL89242A (ja) |
NZ (2) | NZ223397A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0711764A1 (en) | 1994-11-11 | 1996-05-15 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Process for producing L-ascorbic acid |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60118186A (ja) * | 1983-11-17 | 1985-06-25 | Shionogi & Co Ltd | 2・5−ジケト−d−グルコン酸リダクタ−ゼ |
US5008193A (en) * | 1984-06-14 | 1991-04-16 | Genentech, Inc. | Ascorbic acid intermediates and process enzymes |
GB8519536D0 (en) * | 1985-08-02 | 1985-09-11 | Biogen Nv | Vitamin c precursor |
ATE78297T1 (de) * | 1985-08-02 | 1992-08-15 | Biogen Inc | Herstellung eines vitamin-c-vorlaeufers mittels genetisch modifizierter organismen. |
US5082785A (en) * | 1987-01-30 | 1992-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Biosynthesis of 2 keto-l-gulonic acid |
US5376544A (en) * | 1992-09-08 | 1994-12-27 | Rutgers The State University Of New Jersey | Enzymes for the production of 2-keto-L-gulonic acid |
CN1119414C (zh) * | 1997-12-30 | 2003-08-27 | 中国科学院上海生物工程研究中心 | 突变的2,5二酮基-d-葡萄糖酸还原酶及其基因工程表达 |
CN114729124B (zh) | 2019-11-19 | 2024-05-24 | 索尔维特殊聚合物美国有限责任公司 | 制备聚砜(psu)聚合物的方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5021559B2 (ja) * | 1973-03-22 | 1975-07-23 | ||
JPS5135487A (en) * | 1974-09-20 | 1976-03-25 | Shionogi Seiyaku Kk | 22 keto ll guronsan no seizohoho |
US4245049A (en) * | 1980-01-21 | 1981-01-13 | Pfizer Inc. | Preparation of 2-keto-L-gulonic acid |
JPS6041596B2 (ja) * | 1980-08-14 | 1985-09-18 | 塩野義製薬株式会社 | 2,5−ジケト−d−グルコン酸の製造方法 |
JPS58162298A (ja) * | 1982-03-05 | 1983-09-26 | Shionogi & Co Ltd | 2−ケト−l−グロン酸の製造方法 |
US4543331A (en) * | 1982-03-05 | 1985-09-24 | Shionogi & Co., Ltd. | Fermentative or enzymatic production of 2-keto-L-gulonic acid |
JPS60118186A (ja) * | 1983-11-17 | 1985-06-25 | Shionogi & Co Ltd | 2・5−ジケト−d−グルコン酸リダクタ−ゼ |
-
1984
- 1984-06-25 IL IL89242A patent/IL89242A/xx unknown
- 1984-06-25 AU AU29832/84A patent/AU594921B2/en not_active Expired
- 1984-06-25 IL IL89241A patent/IL89241A/xx unknown
- 1984-06-25 DE DE8484304277T patent/DE3484216D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1984-06-25 AT AT84304277T patent/ATE61409T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-06-25 EP EP84304277A patent/EP0132308B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-06-25 IL IL72225A patent/IL72225A/xx unknown
- 1984-06-25 EP EP87202624A patent/EP0305608B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-06-25 DE DE8787202624T patent/DE3485981T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-06-26 DK DK198403107A patent/DK175702B1/da not_active IP Right Cessation
- 1984-06-27 NZ NZ223397A patent/NZ223397A/en unknown
- 1984-06-27 NZ NZ208687A patent/NZ208687A/en unknown
- 1984-06-27 IE IE1629/84A patent/IE57551B1/en unknown
- 1984-06-27 AR AR84297042A patent/AR243606A1/es active
- 1984-06-27 BR BR8403146A patent/BR8403146A/pt unknown
- 1984-06-28 CA CA000457803A patent/CA1339107C/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-06-28 JP JP59135016A patent/JPS6070073A/ja active Granted
-
1989
- 1989-02-09 IL IL89241A patent/IL89241A0/xx unknown
- 1989-02-09 IL IL89242A patent/IL89242A0/xx unknown
-
1993
- 1993-02-26 JP JP5037930A patent/JPH0740936B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0711764A1 (en) | 1994-11-11 | 1996-05-15 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Process for producing L-ascorbic acid |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK310784A (da) | 1984-12-29 |
CA1339107C (en) | 1997-07-29 |
AR243606A1 (es) | 1993-08-31 |
JPH0586186B2 (ja) | 1993-12-10 |
IE57551B1 (en) | 1992-12-16 |
IL72225A (en) | 1990-08-31 |
EP0132308B1 (en) | 1991-03-06 |
EP0305608B1 (en) | 1992-11-11 |
EP0132308A1 (en) | 1985-01-30 |
AU594921B2 (en) | 1990-03-22 |
IL89241A (en) | 1990-08-31 |
DE3485981T2 (de) | 1993-06-09 |
IL89241A0 (en) | 1989-09-10 |
IL89242A (en) | 1990-08-31 |
JPH0740936B2 (ja) | 1995-05-10 |
DE3484216D1 (de) | 1991-04-11 |
NZ223397A (en) | 1995-03-28 |
NZ208687A (en) | 1991-07-26 |
ATE61409T1 (de) | 1991-03-15 |
DK175702B1 (da) | 2005-01-24 |
AU2983284A (en) | 1985-01-03 |
EP0305608A1 (en) | 1989-03-08 |
JPH0614771A (ja) | 1994-01-25 |
IL89242A0 (en) | 1989-09-10 |
IL72225A0 (en) | 1984-10-31 |
IE841629L (en) | 1984-12-28 |
BR8403146A (pt) | 1985-02-12 |
DE3485981D1 (de) | 1992-12-17 |
DK310784D0 (da) | 1984-06-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4757012A (en) | Ascorbic acid intermediates and process enzymes | |
US5032514A (en) | Metabolic pathway engineering to increase production of ascorbic acid intermediates | |
AU612672B2 (en) | Ascorbic acid intermediates and process enzymes | |
EP0373181B1 (en) | Novel coenzyme independent l-sorbosone dehydrogenase | |
US4758514A (en) | Ascorbic acid intermediates and process enzymes | |
US5004690A (en) | Ascorbic acid intermediates and process enzymes | |
JPS6070073A (ja) | アスコルビン酸の中間体およびプロセス酵素類 | |
JP2526021B2 (ja) | 遺伝子的に修飾された生物体を使用するビタミンc先駆体の製造 | |
US8962287B2 (en) | Scyllo-inositol-producing cell and scyllo-inositol production method using said cells | |
EP0385415B1 (en) | Process for producing NADH oxidase | |
JP2004159587A (ja) | ロドコッカス(Rhodococcus)属細菌組換え体、及びそれを用いた光学活性体の製造方法 | |
JPS63157986A (ja) | 遺伝子組換によるl−フエニルアラニンの製造方法 | |
CA1341085C (en) | Recombinant 2,5-diketogluconic acid reductase production | |
KR101411920B1 (ko) | 신규 리비톨 탈수소화효소 및 이를 이용한 l-리불로스의 생산방법 | |
WO1991013156A1 (en) | Method for enhancing recovery of recombinant proteins | |
JPH02286077A (ja) | バチルス・エス・ピー、l―乳酸脱水素酵素遺伝子を含有するdna断片およびそれを含有する組み換え体プラスミド並びにl―乳酸脱水素酵素遺伝子およびそれを含有する組み換え体プラスミド。 | |
JPH08103269A (ja) | カルボニルレダクターゼ遺伝子の塩基配列及びその利用法 | |
KR101479135B1 (ko) | 아스페르기루스 플라버스 유래 솔비톨 탈수소화효소와 nadh 산화효소와의 커플링에 의한 l-자일룰로스의 생산 | |
JP2002542784A (ja) | Gluconobactersuboxydansソルビトールデヒドロゲナーゼ、その遺伝子および使用方法 | |
JPH10136987A (ja) | ピコリン酸類の製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term |