JPS6070073A - アスコルビン酸の中間体およびプロセス酵素類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明はアスコルビン酸の製造方法に関する。

本発明は特に、有用なタンパク質の精製と、組換え技術
を使用するタンパク質の生産、およびそのようなタンパ
ク質を化学的変換に使用することに関する。更に詳しく
は、本発明は２，５−ジヶトグルコン酸（２，５−ＤＫ
Ｇ）’Ｊダクターゼ（還元酵素）の精製と組換え技術に
よる産生、および該リダクターゼを用いて２．５−　Ｄ
　Ｋ　Ｇを立体選択的に転換して、２−ケトーＬ−グロ
ン酸（２−ＫＬＧ）を産生ずること、および２−　Ｋ　
Ｔ−Ｇを合成し得る単一の組換え体微生物を調製する方
法に関する。

産生された２　−Ｋ　Ｌ　Ｇはアスコルビン酸（ビタミ
ンＣ）製造における有用な中間体である。

アスコルビン酸は、健康維持におけるその重要性の理由
から合衆国内においても、また世界各地においても主要
な化学製品となって来た。ある種の軽い病気、例えば風
邪のような病気にかかり易い個人の体質改善に対する有
効性に関しては若干の異論もあるが、必要量のビタミン
Ｃを摂取することは人類にとって疑いもなく重要なこと
である。

所謂１天然１食品では十分量のビタミンＣが供給されな
いかも知れないということが、近年、重大な関心事とな
って来た。従って、このビタミン量を補強して消費者に
市販する食品添加物として、また直接的なビタミン補給
の双方に対するアスコルビン酸の大量の需要が開発され
て来ている。また、アスコルビン酸は効果的な抗酸化剤
であり、従って栄養剤およびその他の製品の防腐剤とし
ての応用も見出されている。

ビタミンＣの生産に関しては多くの有用な、また商業的
にも実施し得る方法がある。これらの中の幾つかではま
ず２−ケ）−Ｌ−グロン酸（２−ＫＬＧ）の製造を行な
い、引き続き酸性または塩基性の触媒的方法で環化する
ことにより比較的簡単にアスコルビン酸に変換する方法
が採られている。従って、２−　Ｋ　Ｌ　Ｇそのものが
経済的にも工業的にもかなり重要な物質と成って来た。

今日では、比較的豊富にある例えばＤ−グルコースの様
な通常の代謝産物を、原核微生物の代謝を利用する方法
によって、２，５−ジケトグルコン酸（２，５−ＤＫＧ
）へ変換させる方法が使用できる。〔例えば、米国特許
第３，７９０，４４４号（１’９７４年２月５日）、第
３，９９８，６９７号（１９７６年２月２１日）、およ
びＥＰＯ公告特許第００４６２８４号（１９８２年２月
２４日発行）参照〕。この２．ｊ−ＤＫＧ中間体は、２
電子還元法という単一な１工程反応によって、所望の２
−　Ｋ　Ｌ　Ｇへ変換される出発物質として有用である
。該還元反応は化学的に、または酵素触媒法によって効
果的に行なわれる。

この還元反応に効果を示し得る種々の細菌株が知られて
いる。そのような株はＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
。

Ａｒｔ１１ｒｏｂａｔｅ丁、　Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ
、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　。

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　、　
Ｃ１ｔｒｏｔ）ａｃｔｅｒおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　属の中に見出される〔米国特許第３，９２
２，１９４号（１９７５年１１月２５日）、米国特許第
４．．２４５，０４．９号（１９８１年１月１３日）、
および米国特許第３，９５９．０７６号（１９７６年５
月２５日）参照〕。事実、そのような細菌株はこの還元
反応に効果的に使用されて来た。然しなから、そのよう
な株の利用は、即ち、酵素を精製せずに使用するこの方
法は、精製した酵素を使用しなければ達成し得ないある
種の工程には使用できない。

例えば、固形の支持体上に酵素を固定して連続的に生産
を行なおうとする方式などがそれに当たる。

また、そのような酵素を産生ずるのに遺伝装置を使用す
ることは、それによって、２．５−　Ｄ　ｌ（Ｑの変換
に最も都合の良い部位で該酵素の産生が行なわれるよう
に、この装置を操作し、局在させ得るので、この方法の
実施に当たり好ましい改善をもたらすこととなる。その
ような場所の中で最も重要なのは、２．５−　Ｄ　Ｋ　
Ｇの生産を行なうことのできる同一菌体内にある部位で
ある。即ち、単一の微生物で、それ自身の装置を使用し
て２．５−ＤＫＧを製造し、次いで２．５−　Ｄ　Ｋ　
Ｇ　ＩＪダクターゼ（還元酵素）遺伝子と、該触媒酵素
を産生ずるための適切なコントロール配列を使って、イ
ンサイチュ（その場）で内性２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇを所
望の生成物に変換することも可能となるであろう。

本発明と関連した化学的変換における反応過程を示すこ
とは、本発明の有用性の意義を理解する為に役立つであ
ろう。代表的なアスコルビン酸の製造方法の全工程の概
要は、以下の反応式１によって示される。

Ｃ１（ＯＣ０ＯＨＣ００Ｈ １１＋ −Ｃ−ＯＨ−Ｃ−ＯＨＣ＝０ １　１　１ ｌ−ＴＯ−Ｃ−ＨＯ−Ｃ−ＨＯ−Ｃ− ＋　１　１ −Ｃ−ＯＨ−一一二　−Ｃ−ＯＨ−□−−Δ　−Ｃ−Ｏ
Ｈ−ム１　１　１ −Ｃ−ＯＨ−Ｃ−ＯＩ−Ｔ　−Ｃ−ＯＨ１１１ ＣＨ２０■ｌＣＨ２０Ｉ］ＣＨ２０Ｈ １１１ Ｃ＝Ｏ１−ｒｏ−ｃ−ｒ−ｒｏ−ｃ ｌ　、１　１ ＣＨ２０１１ＣＨ２０ＨＣＨ２０Ｈ 反応式１ 工程は、例えば反応式１に示されるように、Ｄ−グルコ
ースのような通常微生物に利用される代謝産物から都合
よく開始される。酵素的変換により、Ｄ−グルコースは
一連の酸化過程を経由して２．５−ジケト−Ｄ−グルコ
ン酸を与える。この一連の過程は単一の微生物によって
進められることが示された〔米国特許第３，７９０，４
４４号、ＥＰＯ公告第Ａ　２０，０．４．６，２８４号
（上述）；そのような微生物は例えばＧｌｕｃｏｎｏｂ
ａｃｔｅｒｌＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒまたはＥｒｗｉｎ
ｉａ属である〕。

アスコルビン酸製造の変法は酵素的酸化と化学的酸化の
組合わせにより、２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇを介して一巡す
る方法であり、上に提示した方法に比較して、明らかに
より取り扱い難い。これらのうち代表的なものは、ジア
セトン−２−ケトー■、−グロン酸を２−　Ｋ　Ｌ　Ｇ
の前駆体として使用するＲｅ１ｃｈ−ｓｔｅｉｎの合成
法である。この中間体は発酵反応、水素化反応、および
例えば過マンガ酸塩酸化など△ から成る一連の還元的および酸化的段階を経由して生成
されるものであって、所要の手順は先に示した反応手順
に比較して明らかに一層複雑である。

２、５−　Ｄ　Ｋ　Ｇから２−ＫＬＧへの変換も酵素反
応的に行なわれる〔米国特許第３，９２２，１９４号、
第３．９５９，０７６号（前記）、および第４．．２４
５，０４９号（１９８１年１月１３日）〕。

得られた２　−Ｋ　Ｌ　Ｇをアスコルビン酸へ変換する
手段は今日では良く知られている。これは山崎の方法に
従い、希酸の存在で加熱することにより行なうか、また
は先ずメタノール中でエステル化し、次いで塩基中でラ
クトン環化する方法を用いる２段階法により行なわれる
。効果的な方法については、Ｃｒａｗｆｏｒｄ、　Ｔ、
Ｃ，らＣＡｄｖａｎｃｅｓ　１ｎＣａｒｌ）ｏｈｙｄｒ
ａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、　３７゜７９〜１５５（１９８０））の記
載がある。これらの変法は単純明瞭であり、２−ＫＬＧ
の安定性はアスコルビン酸よりも高く、保存期間にも良
好な効果を与えた。従って、アスコルビン酸を直接合成
するよりも、所望の最終製品に変換し得る中間体、２−
ＫＬＧで大量に貯蔵する方がより一層望ましく都合が良
い。

本発明による改良法は、一層優れた変法を、上に述べた
変換法の全般にわたる幾つかの局面に効果的に導入する
ものである。−例を挙げれば、２゜５−ＤＫＧを２−Ｋ
ＬＧへ変換させる酵素が分離され、精製されたので、還
元工程は、例えば酵素を固定し、液状の基質を、固定し
た触媒上に連続的に供給する方法を含むより一層管理さ
れた条件下で進行させることができる。また、組換え技
術を利用して容易に精製して使用し得るような酵素を大
量に生産できるようになった。更に、組換え技術により
、改良された特性を持った好適な宿主細菌へ、暗号配列
およびそれに必要な発現コントロール機構を導入するこ
とができる。このように単に２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇから
２−　Ｋ　Ｔ−Ｇへの変換に焦点変化要因に対するより
厳密なコントロール；２）連続的方法が適用できる；お
よび３）還元反応に関係した所望の特性を有する酵素に
好適な宿主微生物の選別。

２、５−　Ｄ　Ｋ　Ｇの効果的なりローン化と発現によ
ってもたらされる改良の範囲は、広範囲に及ぶ。

特有な遺伝装置が利用できるので、リダクターゼ（還元
酵素）を暗号化している遺伝子を、２．５−Ｄ　Ｋ　Ｇ
を産生できる微生物に導入することが可能となり、期待
できるようになった。このようにして、同一の細菌によ
って変換の全工程、例えはグルコースまたはその他の好
適な代謝産物から安定で貯蔵性のよい中間体２−　Ｋ　
Ｌ　Ｇへの変換の全工程が効果的に行ない得るようにな
った。

発明の要旨 本発明は、一般的に利用し易いグルコースのような代謝
産物を、安定な貯蔵性のよいアスコルビン酸の前駆体、
２−　Ｋ　Ｌ　Ｇへ変換させる方法の劇的な改良を行な
うものである。本発明に記載した方法の経路には、２．
５−ＤＫＧから２−ＫＬＧへ変換する段階が包含される
。現行の２−　Ｋ　Ｌ　Ｇ中間体の産生方法には、どん
な良い方法でも最低２種の微生物の使用またはキラーを
生じる培養を包含しており、利用し得る酵素水準を調節
できず、またバッチ式な方法に余儀なく限定されている
。

本発明に含まれる重要な実施態様は、一連のクロマトグ
ラフィー手法により、２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇリダクター
ゼをホモジニアス（均質）な生産物としくＨＰ　Ｌ　Ｃ
（高速液体クロマトグラフィー法）により）実質的に純
粋な形で製造する方法にある。本発明にはさらに、純化
された酵素ぞのもの、および該純化酵素を２．５−　Ｄ
　Ｋ　Ｇから２−　Ｋ　Ｌ　Ｇへの変換に使用すること
を包含する。そのような変換は該酵素を固定化した形で
使用することにより、好まし〈実施される。

本発明のもう一つの重要な面は、２．５−　Ｄ　ＫＧリ
ダクターゼの産生に適する組換え発現ベクターを構築す
る方法である。また、この態様は、そのようにして産生
された発現ベクターと、それを導　′入した細胞および
細胞培養、および２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇを立体選択的に
２−　Ｋ　Ｌ　Ｇへと還元させ得るそのような細胞およ
び細胞培養の生産物をも包含する。

更に本発明のこの態様には組換え技術にょろりダクター
ゼを使用して２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇを２−　Ｋ　Ｌ　Ｇ
へ変換させる方法が含まれる。

最後に、本発明はまた、グルコースまたは通常の微生物
代謝産物を単一の組換え微生物による発酵によって２−
　Ｋ　Ｌ　Ｇへ変換し、更にアスコルビン酸へ変換する
方法に関する。また本発明はこの過程を進行させ得る組
換え微生物に関する。そのような微生物は、２．５−　
Ｄ　Ｋ　Ｇ　＋）ダクターゼに対応する配列を暗号化し
、それを発現し得る発現ベクターによって、初期の代謝
産物を２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇへ変換できる宿主細胞を形
質転換することにより都合良く組み立てられる。あるい
は、そのような組換え微生物は、既に２．５−　Ｄ　Ｋ
　Ｇを産生ずる微生物に、代謝産物を酸化して２．５−
　Ｄ　Ｋ　Ｇとする働きを有する酵素を暗号化している
ベクターを導入することによっても構築される。いずれ
の場合でも、発現ベクターの構造の中にある適切な誘導
プロモーターとコントロール系を活用することにより、
所望する変換工程の速度を最適とするよう、酵素濃度を
調節することができる。

以下に図面について簡単に説明する。

第１図は２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクターゼ遺伝子
の発現ベクターを示している。

第２図および第３図は、二者択一的な２．５−　ＤＫＧ
ＩＪダクターゼ遺伝子のための発現ベクターの組み立て
を示している。

第４図は２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクターゼ遺伝子
とｐＴｒｐ＋　−３５発現ベクターの調節（コントロー
ル）領域を含んでいる配列を示している。

第５図は、第４図の配列を有する２、　５−　Ｄ　Ｋ　
Ｇリダクターゼ発現ベクターを導入したＥｒｗｉｎｉａ
ｈｅｒｂｉｃｏｌａ（ＡＣＣＣ２１９９８）から得たタ
ンパク質抽出物の染色したゲルを示している。

詳細な記述 Ａ、定義 本発明に使用する”　２．５−ＤＫＧ　＋）ダクターゼ
なる用語は、２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇを立体選択的に２−
ＫＬＧへと変化させる反応を触媒する働きを有するタン
パク質を意味する。本発明の具体的な例に於イテは、Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　中に存在する特定の型
のこの酵素が純化され、クローン化され、発現されたが
、例えばＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　、　Ａｒｔｈ
ｒｏｂａｃｔｅｒ　。

Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ　、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　。

Ｃ１ｔｒｏｂａｃＬｅｒ　およびＢｃｉｌ　ｌｕｓのよ
うな属の中の他の細菌株もこの酵素と同じ活性を有する
酵素を合成することが知られている。これらの属は、こ
の変換反応の触媒に利用できるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　に存在するのと同一の酵素の強力な供給源と
して例示される。これら天然に存在するもの以外にも、
原核生物界には、それに代わる供給源を見出し得ること
があろう。更に、本発明によってそのような酵素を暗号
化している遺伝子配列が明らかにされ、利用できるよう
になったので、その技術によって知り得た知識を利用し
て、この酵素の働きを妨害することなく、事実」二その
働きを改良し得る配列の修飾ができるようになった。そ
のように修飾され、変換された配列も本明細書で使用す
る２゜５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクターゼの定義の中に
包括される。

要するに、２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　リダクターゼなる用
語は、機能的な定義であって、２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇが
２−ＫＬＧへと変換する反応を触媒するすべての酵素を
意味する。

本明細書で論じられるタンパク質およびサツカライド類
の酸性誘導体のような多くの化合物は、溶液中において
、或いは固形物の場合はそれらが調製された溶液に置か
れていた環境に応じて種々のイオン状態を取り得るであ
ろうことは技術的に良く理解できる。例えば、グルコン
酸と言う用語を使用してその分子を指定する場合、該有
機分子が関係し得るすべてのイオン化状態を包括するも
のとする。従って、例えばＩＤ−グルコン酸”およびＩ
Ｄ−グルコネート１は共に同一の有機構造を示すもので
あって、何ら特別なイオン化状態を指定しようと意図す
るものではない。良く知られているように、Ｄ−グルコ
ン酸はイオン化しない形で存在することもでき、或いは
、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはその他の塩と
して使用することも出来る。説明されている化合物が該
当するイオン化状態のものか、あるいは非イオン化の態
様のものかは、当業者であれば、または例えそうでなく
ても、文脈を辿れば自ら明らかになるであろう。従って
、２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇリダクターゼ・タンパク質その
ものもｐＨに応じて種々のイオン化状態をとり得る。こ
れらのすべてのイオン化状態を”２．５−ＤＫＧＩＪダ
クターゼ１なる用語は包含している。

同様に゛細胞“および”細胞培養゛の用語も、文脈」二
、その一方また他方の何れかを明示していない場合は相
互互換的に使用するものである。細胞または細胞培養の
形質転換は、結局同じ働きに等しい。クローン化するビ
ヒクルまたはその他の導入手段で処理されるのは微生物
の培養であるが、形質転換物質を取りこむのは微生物そ
のものであることは当然明らかである。本発明における
細胞および微生物はあらゆる細菌性微生物、または原核
微生物を包含するものと定義づけられる。

７発現ベクター７とは、その中に含まれるＤＮＡ配列を
、その配列が機能的に、それを発現させることのできる
他の配列と連結している場合には、それを発現し得るベ
クターを意味する。明瞭に表現されていないけれども、
発現ベクターには、エピワームまたは染色体ＤＮＡの組
み込み部分として、宿主微生物内で複製し得るものでな
ければならないという意味が含まれている。複製能が欠
除していればそれらが効果的に作動てきないことは明ら
かである。結局、１発現ベクター９も機能的な定義であ
る。一般に、組換え技術では発現ベクターはしばしば１
プラスミド５の形で使用され、該用語は閉環状２本鎖Ｄ
ＮＡ分子を示しており、ベクターの形では染色体と結合
しない。一般に使用されるその他の効果的なベクターは
ファージおよび開環状ＤＮＡである。本明細書において
は、”プラスミド１と１ベクター１はしばしば相互互換
的に使用される；然し、本発明においては、同等の機能
を果たす既知の、あるいはいずれ知られることになる他
の型の発現ベクターを全て包含するものである。

１組換え細胞１とは、組換えＤＮＡ技術を使用して構築
されたベクターを導入された細胞を言う。

１宿主１細胞とは、形質転換を受ける前の細胞を言う。

一般に組換え細胞は、そのような組換えベクターで暗号
化されたタンパク質生成物を産生じ、しかも通常はこの
ベクターが無ければそれらを産生じない逼然しこの定義
には、細菌の染色体に暗帰化されているか、あるいはこ
の受容菌自体が発現するタンパク質を暗号化しているベ
クターで形質転換された細胞も含まれる。この定義には
、組換え技術による異種配列の生成物を生産するあらゆ
る細胞が包含される。

１通常の代謝産物”とは、発育のため、一般に細菌に利
用される炭素源を意味する。そのような代謝産物とは、
そのような微生物の栄養源として容易に利用されるグル
コース、ガラクトース、ラクトース、フルクトースまた
はその他の炭水化物である。この場合、そのような代謝
産物とは２，５−ジケ）−Ｄ−グルコン酸に変換し得る
ようなそれら栄養源の酵素的誘導体をも包含して定義さ
れる。そのような誘導体にはＤ−グルコン酸、Ｄ−−ｒ
　７　／ン酸、■−−クロン酸、Ｌ−イドン酸、２−ケ
ト−Ｉ）　−クルコン酸、５−ケト−ローグルコン酸、
および５−ケトーＤ−マンノン酸が含まれる。

−ゼの製造 純粋な２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　リダクターゼの製造のた
めに選ばれた細菌の望ましい属はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｃｒｉｕｍである。然し、細菌学的な分類は、関連のあ
る態量の正しい命名を確かめることが時に困難な場合が
あるので、必ずしも十分確実ではない。然し、該リダク
ターゼが含有されている細菌種の多くはＣｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　、　Ｂｒｅｖｉｌ）ａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　およびＡｒｔｈｒｏ−ｂａｃｔｅｒ属に属するｃｏ
ｒｙｎｅ　ｆｏｒｍ型グループの仲間である。従って現
在判っていることによれば、該酵素の望ましい供給源が
Ｃｏｒｙｎｃ　ｆｏｒｍ型グループの一つであるという
ことである。

製造の好ましい態様として、細胞培養は細菌株より応じ
て選ばれる好適な条件下に、０Ｄ５５０が約２０または
それ以上になるまで発育させる。

次に培養液を遠心分離に掛け、得られた細胞ペースト（
ペレット状）を処理して細胞を溶解（溶菌）する。この
ペーストは処理前に、予かしめ緩衝液で洗滌して混入し
ている培地を除去して置くことが望ましく、洗滌を終え
たペレットは、例えばリゾチーム、または超音波、また
は機械的手技を用いて処理し、細胞を開裂させる。次に
、得られた抽出物を、望ましくはセルロースを保持体と
する陰イオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥセルロースを用
いたイオン交換クロマトグラフィーにより精製する。言
うまでもなく、例えばＱＡＥまたはＤＥＡＥセファデッ
クスのような他の陰イオン交換樹脂もまた使用できる。

溶出は溶出液に溶解している塩、好ましくは塩化す）　
ＩＪウムの濃度を順次増加し、溶出溶媒のイオン強度を
増加する代表的で望ましい公知法により行なわれる。２
．５−　ＤＫＧリダククーゼ活性を含有する溶出液分画
をアフィニティークロマトグラフィー保持体、即ち、そ
れが共有結合する支持体、色素または酵素基質またはそ
の補因子に似たその他の有機リガンドに吸着させること
により、更に精製する。もしア△イニティー保持体で処
理す表き溶液が相当量の溶質を含有している場合は、予
かしめ透析を行なうことが望ましい。特に効果的なアフ
イニテイクロマトグラフイー保持体は、ＮＡＤＨまたは
Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈを利用する酵素に親和性を有するア
ミコンマトレツＲ。

クス　ゲルブルーＡ　（Ａ＋ｎ１ｃｏｎ　Ｍａｔｒｅｘ
ｋｇｅｌ　ｂｌｕｅＡ）である。そのようなカラムから
の溶離は、酵素と親和性のある物質−この場合はＮＡＤ
Ｐ−の溶出溶媒中の濃度を増加して行くことにより達成
される。所望のＤ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクターゼ活性を含有
する画分を集めて純粋なタンパク質を回収する。この純
粋なタンパク質の比活性は５単位／ｌ’ｌｆｊより大き
い。

純度の最終的な証明は、例えばＨＰ　Ｌ　Ｃにより、セ
ファデックスゲル、ポリアクリルアミドゲル、またはＴ
ＳＫサイジングゲルを用いたサイズセパレーション（分
子サイズ分離）によって達成される。Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　Ｓｐ　ＡＴＣＣ３ｌ　Ｑ　９　Ｑに含
有される酵素では、ＴＳＫ／ＨＰＬＣによる分離によっ
て、全量の活性を含有する４　５，０００の分子量に相
当するピークを得る。然しなから、還元的または非還元
的な条件で酵素を５ＤＳ−ＰＡＧＦ、処理すると、タン
パク質は３４，０００の分子量に相当するピークに移動
する。この好ましい具体例に示したタンパク質の特性に
ついては、更に実施例２で説明する。

以」―を要約すると、酵素の純化は細胞溶解、陰イオン
交換クロマトグラフィー、アフイニテイクロマトグラフ
イーおよびサイズセパレーションによる証明の工程から
成る。細胞溶解（溶菌）以外の工程については、任意の
順序で行なってよく、工程の移行の都度、実施例２に示
した方法に従って活性を測定することによりチェックを
行なう。

精製した酵素を用いた変換は溶液かまたは更に望ましく
は固定化型で行なう。所望の反応は還元反応であるから
、還元当量（ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｅｑｕｉｖａｌｅｎＥ
ｓ）の供給源を必要とする；酵素はＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ
特異性であり、従って少なくとも触媒量の補酵素が存在
していなければならず、進行過程中は、その還元型は絶
えず再生されなければならない。補酵素を還元するため
の電子供与源は、グルコース／グルコースデヒドロゲナ
ーゼ（脱水素酵素）、ホルメート／ホルメートデヒドロ
ゲナーゼ、またはグルタメート／グルタメートデヒドロ
ゲナーゼのように、酵素と接触する還元型基質の酸化に
より供与される。好適な還元当量の供給源を選択するに
は、基質のコストおよび精製した２、　５−　Ｄ　Ｋ　
Ｇ　ＩＪダクターゼか必要とするＮＡＤＰと矛盾するこ
とのない酸化触媒酵素の酵素特異性を考慮しなりればな
らない。Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ補酵素の再生のための他の
系としては、例えは還元当量の供給源としてＨ２を用い
、リポアミドデヒドロゲナーゼとヒドロゲナーゼ（水素
酵素）、またはフェレドキシンリダクターゼとヒドロゲ
ナーゼを触媒として用いるＷｏｎｇ　、　Ｃ０Ｈ０ら（
Ｊ、Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、］　０　：３　：
６２２７（１９８１））の方法が知られている。更に大
規模製法にも適用できる他の方法がＬｉｇｈｔ、　Ｄ。

ら（”Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ｆｒｏｍ
　Ｂｉｏｍａｓｓ″（１９８３）　Ｄ、Ｌ、Ｗｉｓｅ刊
３０５〜３５８頁）により記載されている。

代表的な変換反応においては、出発溶液は約１〜２００
ｇ／Ｌの濃度、好ましくは約１０〜５０ｇ／Ｉ−付近の
濃度の２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇを含有し、媒質のｐＬＴは
約５〜７．５、好ましくは６４付近に調節する。このｐ
Ｈは例えばリン酸緩衝液のような好適な緩衝液を使用し
て維持する。温度範囲は約１５℃〜３７℃、好ましくは
２５℃付近とする。還元型補酵素Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈの
濃度は、充分な還元当量の供給源と共に、例えば約０．
００１ｍＭ〜２　ｍ　Ｍ　、好ましくは約０，０１〜０
．０３ｍＭとし、反応中その濃度を維持する。

酵素を溶液の形で供給する場合は、その濃度は基質媒質
に対しＩＣ１＆／Ｌの程度とするが、勿論、所望する変
換反応速度により、また選ばれた酵素の特異性に従って
望ましい濃度を使用する。もし固定化酵素を使用する場
合は、」１記の基質溶液を、２、５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　Ｉ
Ｊダクターゼを吸着により含有するか、または共有結合
により結合させた固形保持体を通過させる。理想的には
、溶液中のＮＡＤＰＨ濃度を維持させるに足りる還元当
量の供給源を変換する意味で、固形保持体に上記の好適
な触媒を含有させる。例えば、典型的な変換反応に於い
ては、溶液は２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ濃度にほぼ当量のグ
ルコース、ホルメート、グルタメートまたは溶解水素を
含有しており、固形保持体には所望する２−１（ＬＧへ
の変換反応によって生成するＮＡＤｒ’を絶えず再生す
るに足りる還元触媒を含有させる。

Ｂ、３　２．５−ＤＫＧリダクターゼのクローン化と発
現 ２、５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　リダクターゼの遺伝子をクロー
ン化し、発現させる手技を提供する本発明方法によって
、純化２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　＋）ダクターゼを多量に
入手することができる様になり、また２、　５−　Ｄ　
Ｋ　Ｇを生産する微生物において、該リダクターゼを生
成させることができる様になった。これを達成した一般
的な方法を以下に要約し、その具体的な方法を実施例３
において概説する。

Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　またはその他の供給
源から得られた高分子量のＤＮＡを、制限酵素を用いて
部分消化することにより作り出されたゲノムライブラリ
ーからの２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇリダクターゼ暗号化遺伝
子を、プラスミドかファージビヒクルにクローンする。

２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇリダクターゼを得るのに好適な制
限酵素はＳａｕ　３　Ａである。（その代わりに、Ｂａ
ｍ１−ＩＩまたはＰｓｔＴのように、特異性の高い制限
酵素による制限消化物を使用しても良い）。次に、この
制限消化物を、好適な細菌宿主中で複製し得るプラスミ
ドベクターか、都合の良い細菌培養物中で増殖し得るフ
ァージ配列の中へ連結する。

得られたプラスミドおよびファージライブラリーを、２
．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクターゼの既知の部分配列
に基づいて構築されたプローブを用いてスフＩＪ　−ニ
ングする（実施例２参照）。プローブデザインの効率は
、プローブ構築に際し、細菌性宿主にとって望ましいと
知られているコドンを選択することにより向−１−させ
ることができる。所望のクローンをプラスミドおよびフ
ァージライブラリーから確認するには、所望の遺伝子が
、好適で厳格な条件下で、すべてのプローブとハイブリ
ッドを形成する様に−組みのプローブを使用し、ただ１
個のプローブを使用することから起こる誤った陽性例を
排除することによって最も効果的に行なわれる。

プローブとして提供されたオリゴヌクレオチドとのハイ
ブリッド形成に成功したコロニーまたはファージを回収
し、所望の遺伝子配列との同一性を直接的なりＮＡ塩基
配列決定法と、所望の酵素を産生ずるインビボでの発現
によって確認する。

完全に機能し得る遺伝子を、その暗号配列を導入しよう
とする宿主細胞中で作動し得るプロモーターとリポソー
ム結合部位を含有する好適な発現ベクターに連結する。

現在の技術水準においては、本発明に適用し得る多数の
促進／制御系、および好適な原核生物宿主がある。一般
に、原核生物はＤＮＡ配列のクローン化に望ましく、ま
た２−ＫＬ　Ｇの製造方法はそのような微生物系を用い
て最も都合よく行なわれるので、クローン化と発現の双
方に、類似の宿主を使用することができる。Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣＡ３１４４６　）
はクローン用宿主として特に有用である。その他の使用
し得る微生物株は、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｂ、Ｅ、ｃｏｌｉＸ
１７７６（ＡＴＴＣ五３１５３７　）およびＥ、ｃｏｌ
ｉ　ＤＥ−１（ＡＴＣＣＡ３３８４９　）のようなＥ、
ｃｏｌｉ　株から成る。発現には、先に述べた細菌株、
およびＥ、ｃｏｌｉｗ３１１ｏ　（Ｆ　、λ　原栄養性
、ＡＴ、ＴＣ煮２７３２５　）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５
ｕｌ）Ｌｉｌｕｓのような桿菌類、およびＳａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ　ｔｙｐｂｉｍｕｒｉｕｍまたはＳｅｒｒａＬ
ｉａｍａｒｃｅｓａｎｓ　のようなその他の腸内菌類、
および種々のＰ　ｓｃｕｄｏｍｏｎａｓ種が使用し得る
。宿主として特に好ましい群は、グルコースまたはその
他一般に利用し得る代謝産物を２．５−ＤＫＧへ変換で
きる宿主培養物である。そのような宿主の例としてはＥ
ｒｗｉｎｉａ　ｈｃｒｌ）ｉｃｏｌａ　ＡＴＴＣＡ　２
１９９８　（またはＡｃｅｃｏｍｏｎａｓ　ａｌｂｏｓ
ｅｓａｍａｅの１株と考えられている：米国特許第３，
９９８，６９７号）　；　Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｍｅ
ｌａｎｇｅｎｅｕｍ　、　Ｉ　ＦＯ３２９３、ＡｃｅＬ
ｏｂａｃｔｅｒ　ｃｅｒｉｕｓ。

ＩＦ０３２６３、およびＧｌｕｃｏｎｏｌ〕ａｃｔｅｒ
　ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ　。

ＴＦＯ３２４４が含まれる。

一般に、プラスミドの発現、即ち宿主細胞と適合し得る
種から誘導された複製およびコントロール配列を含んで
いるクローニングベクターは、これらの宿主と関連して
使用される。通常、ベクターは複製部位および、形質転
換細胞に選択性のある表現形質を提供できるマーキング
（記号化）配列を保有している。例えばＥ　、ｃｏｌ　
ｉ　は、Ｅ、ｃｏｌｉの１株から誘導されたプラスミド
ＰＢＲ３２２によって典型な形質転換を受ける（　Ｂｏ
ｌｉｖｅｒ　ら、Ｇｅｎｅ　、　２　：　９５　（１９
７７）　）。ＰＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラ
サイクリン耐性の遺伝子を含んでおり、これは形質転換
された細胞を容易に確認し得る手段となる。発現に使用
するためには、ｐＢＲ３２２プラスミド、或いはその他
の微生物プラスミドも、それ自身のタンパク質を発現す
るためにその微生物によって使用され得るプロモーター
を含有するか、または含有するように修飾されなければ
ならない。それらの組換えＤＮＡの構築（組み立て）に
最も多く使用されるプロモーターは、β−ラクタマーゼ
（ペニシリナーゼ）およびラクト−スープＤモーター系
（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ。

２７５：６１５（１９７８）　Ｈｌｔａｋｕｒａ　ら、
Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ　、　ｌ　９８：１０５６（１９７７
）　；（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ、　２８１　
：５４４（１９７９））、およびトリプトファン（ｔｒ
ｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ら、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、８：４０ｓ７（１９８０）
；　ＥｐＯ公告特許第００３６７７６号）である。これ
らが最も一般に使用されている間に、他の微生物のプロ
モーターが発見され、使用され、更にそれらのヌクレオ
チド配列に関する詳細が公表されるようになって、当業
者は、それらを機能的に形質転換ベクターの遺伝子に連
結できるようになった（　５ｉｃｂｅｎｌｉｓｃら、Ｃ
ｅｌ　Ｉ２０：　２６９（１９８０））。

」−記のベクターおよびプロモーターに含有されるＤＮ
Ａ配列を適切に開裂させ、先に概説した様にして調製し
た２、　５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクターゼを暗号化し
ている遺伝子配列と連結し、あらゆる不必要な、或いは
阻害的な配列を欠失させ、原核性宿主細胞に導入して該
酵素を産生させる。次いで、この酵素を先に概説したよ
うに純化するか、そのままの形でまたは細胞を破壊して
直接触媒として使用してもよく、或いは、一度形質転換
すれば、グルコースまたはその他の好適な代謝産物を所
望の２−　Ｋ　Ｌ　Ｇ生成物へ完全に変換させる効果を
挙げ得るように宿主を選択してもよい。

または他の代謝産物の２−　Ｋ　Ｌ　Ｇへの変換異種宿
主中で酵素を発現させる組換え技術を利用して、単一の
宿主微生物で、容易に利用し得る代謝産物から２−ＫＬ
Ｇを産生させようとする本発明の構想を達成することが
できる。本方法は、二つの発酵を単一の生育し得る微生
物発酵に置き換えている点、およびこの変換に必要な酸
化−還元当量が少なくとも部分的に平衡であるという点
で、現在使用されている方法よりかなり進歩している。

現在のところ、天然に存在する微生物で、この連続した
全段階を触媒できるものは知られていない。

然しなから、グルコースまたは、例えばガラクトースま
たはフルクトースのような通常の代謝産物を、２．５−
　Ｄ　Ｋ　Ｇへ変化させる微生物は知られている。また
２、　５−　Ｄ　Ｋ　Ｇを２−ＫＬＧへ変換させる他の
一群の微生物も知られており、後者の変換は、当然その
微生物の持っている単一の酵素により触媒されるが、還
元当量を供給する該微生物の力を利用している。

本発明が包含する単一微生物によって変換を成就しよう
とする方策は、先に概要を示したような２、５−　Ｄ　
Ｋ　Ｇ　ＩＪダクターゼのための発現ベクターを構築し
、通常の代謝産物をこの酵素の基質である’２．５−　
Ｄ　Ｋ　Ｇへまず変換させることができる細胞中へこの
ベクターを導入することから成る。実施例３に示すよう
に、この形質転換によって２−Ｋ　Ｌ　Ｇを産生ずる単
一の微生物が得られた。該ベクターの構築、形質転換、
形質転換により得られた微生物の利用の詳細について本
明細書で概説する。

もう一つの変法は、グルコースまたは通常の代謝産物を
２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇへ転換させることが知られている
酵素を暗号化している遺伝子を、それを含有している微
生物（先に列挙した）からクローン、発現し、それらク
ローンされた遺伝子配列を含有する発現ベクターを構築
し、そのようなベクターを正常にリダクターゼを産生ず
る細胞の形質転換に使用することである。第３の方法は
、通常の代謝産物から２−ＫＬＧへ至る経路の酵素の完
全な配列で中性宿主を形質転換する方法である。この最
後の方法は、それがどのような発育特性を所望しようと
も、またどのような栄養条件を必要としようとも、自由
に宿主微生物を選択できるという利点を有する。従って
、Ｅ　、　ｃｏｌ　ｉやＢａｃｉｌｕｓのように培養お
よび発育に関して過去に合理的な経験を経ている遺伝形
質を備えた微生物を宿主細胞として使用することは、酵
素または基質を細菌的に産生ずる他の手段と等質な長所
が得られる。

変換を行なう能力を持った微生物が作り出されると、本
発明法の過程は、組換え酵素のための発現ベクターの構
造の性質によって、また宿主の発育特性に応じて種々の
形で進行する。例えば、宿主微生物は大量の細胞を産生
ずるのに好ましい条件下で、そしてまた所望の変換に関
係する酵素を暗号化しているあらゆる異種遺伝子の発現
に不都合な条件下で発育させることになろう。大量の細
胞が蓄積された時、暗号配列の転写と翻訳が行なわれる
ように、その様な遺伝子配列により供給されるプロモー
ターを活性化させるため、培地に好適なインデューサー
またはデリプレッサーを添加する。これらの遺伝子の好
適な発現により、また所望する触媒量の酵素の存在のも
とに、１〜５００ｑ　／　Ｌの量でグルコースのような
出発物質を培地に加え、２０°Ｃ〜約４０°Ｃ１好まし
くは２５〜３７℃付近で、数時間、２−　Ｋ　ｒ−ｃへ
の変換が終了するまで培養する。出発物質の濃度は連続
的な供給調節によって一定濃度に保ち、産生された２−
ＫＬＧは公知技術によりバッチ方式または連続的に回収
される。

後述の実施例において、プローブの構築、スクリーニン
グ、プローブの所望の物質とのハイブリダイゼーション
、およびベクターの組み立てに関しては、以下に示す一
般的方法を使用した。

合成りＮＡプローブは、カップリング剤として２．４．
６−１−　ＩＪイソプロピルベンゼンスルホニル−３−
ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＴＰＳ−ＮＴ）　
（ｄｅ　Ｒｏｏｉｊ、　Ｊ、ら、Ｒｅｃ、　Ｔｒａｖ、
　Ｃｈｉｍ、　Ｐａｙｓ　Ｂａｓ。

９８：５３７（１９７９））を使用することを除き、Ｃ
ｒｅａ、　ＲｏおよびＨｏｒｎ、　Ｔ、　（Ｎｕｃｌｃ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

８：２２３１（１９８０））の方法により調製した。

プラスミドは、確認された培養から、Ｃｌｅｗｅｌｌ。

Ｄ、Ｂ、およびＨｅ１ｉｎｓｋｉ　、　（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　９　：　４４２８　（１９７０））の透
明細胞分解法を用いて分離し、Ｂｉｏｒａｄ　Ａ　−５
０アガロース・カラムクロマトグラフィーにより精製し
た。少量の場合（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐｓ）は　Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ、Ｈ，Ｃ，（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ、７　：１５１３（１９７９））の方法
を用いて作成した。

クローンしたプラスミドの断片は、適当な１０〜５０単
位の制限酵素（群）で、その使用するその制限酵素のた
めの適切なバッファー（群）約６００μβ中、約２０μ
ｇのプラスミドを処理することにより調製し、配列決定
した。各酵素について３７℃で１時間、インキュベート
した。各酵素を用いてインキュベーションした後、タン
パク質を除去し、核酸をフェノール−クロロホルム抽出
およびエタノール沈澱により回収した。変法として、プ
ラスミドは、Ｍ　ｎＣ（１２の存在下にＤＮＡａｓｅ：
［消化によるか（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｓ、　（１９８
１）　、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　９．
３０１５）　、または超音波処理（Ｄｅｉｎｉｇｅｒ、
　Ｐ、Ｌ、　（１９８３）、　Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　１２９゜２１６）することにより断片化し
た。

切断後、標品を、５０　ｎｍｏｌ　のｄＮＴＰを含有す
る１００．ＪのＫ　１　ｅｎｏｗ　緩衝液（５ｍＭ　Ｋ
Ｐｉ　１ｐＨ７，５，７ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１　ｍＭ　
ＢＭＥ　）　中のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、または１０
単位のＫｌｎｏｗＤＮＡポリメラーゼで、１時間、３７
℃で処理しせ、上記の如く、サイズ測定のため６％ポリ
アクリルアミドゲル上に展開した（別法として、断片を
直接Ｍ１３ベクターにクローンしても良い）。

ＤＮＡの塩基配列決定は、断片をＭ１３−誘導ベクター
にクローン（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ら、（１９８１）Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９　、３０９　）　
した後、ジヌクレオチド鎖ターミネーション法（Ｓａｎ
ｇｅｒ、　Ｆ、ら（１ｇ７７　）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔＪｓＡ　７４．５４
６３）により行なった。

開裂した発現プラスミドを含むＤＮＡフラグメント（断
片）を、正しくマツチングする様にＴ４Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｉ
Ｊガーゼを用いて適当に末端修復した所望の成分と混合
することにより結合させた（例えば、０．２５μ９のプ
ラスミドから切り出されたベクター断片を、２０μ召の
反応混合液中で１μｇのプラスミドから切り出した挿入
体と混合する）。μｇ量のベクターおよび挿入成分に対
して約１０単位のりガーゼが必要であった。次に、得ら
れたプラスミドベクターをＥ、Ｃ０ＩｉＫ１２２９４１
株（ＡＴＣＣ３１４４−６）またはＤＨ−１（ＡＴＣＣ
３３８４９）へ導入することによりクローンした。形質
転換およびクローニングおよび形質転換されたコロニー
の選別は、後に記載する方法により実施した。所望する
配列が存在するかどうかは、選別されたコロニーからプ
ラスミドを分離し、前記した様にＤＮＡの塩基配列を決
定することにより確認した。

製法Ａ ２．５−ジケト−Ｄ−グルコン酸ナトリウム（力２．５
−　Ｄ　Ｋ　Ｇは商業的に容易に入手し難いのでＥｒｗ
ｉｎｉａ　ｈｃｒｂｉｃｏｌａ、　（ＡＴＴＣ２１９９
８）またはＡｃｅＬｏｂａｃｅｒ　ｃｅｒｉｎｕｓ、　
ＩＦＯ３２６３から分離して製造した。２．５−ジケト
−Ｄ−グルコン酸ナトリウムはＥｒｗｉｎｉａの発酵か
ら、ブロスを１００〜２００メツシユの陰イオン交換カ
ラムＡＧｌ−Ｘ８を通し、水で洗滌し、０．０５Ｎ塩酸
で溶出することにより分離した。２，５−ジケトローグ
ルコン酸を含有する分画をプールし、炭酸水素ナトリウ
ムでｐＨ５，５に中和し、凍結乾燥法により乾燥した（
例としてＢｅｒｎａｃｒｔｓ、　Ｍ、ら、Ａｎｔｏｎｉ
ｅ　ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｑｎｈｏｅｋ３７：１８５（１
９７１）参照）。特性決定はＨＰＬＣおよびＴ　Ｌ　Ｃ
から成る有機酸に有用な方法により実施した（　Ｇｏｓ
ｓｅｌｅ、　Ｆ、　Ｚｂｌ、　Ｂｏｋｔ、　Ｈｙｇ、、
　ｌ　：　Ａｂｔ。

Ｏｒｉｇ、　Ｃ，１７８（１９８０））。１３ＣＮＭＲ
により、およびＷａｋｉｓｉｋａ、　Ｙ、　Ａｇｒ、　
Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ、２８　：　８１９（１９６４
，）　の記載に従い、ビス−２，４−ジニトロフェニル
ヒドラゾンを作成することにより、・ζ、の化合物の同
一性を確認した（カルシウム塩の場合は、濃縮したブロ
スを陽イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ２＋ ５０、Ｃａ　型）カラムに通し、次に水で溶出すること
により製造してもよい。Ｔ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ分析により
２．５−Ｄ　Ｋ　Ｇを含有する分画を集め、凍結乾燥す
ることにより希黄色のカルシウム塩を得た）。

以下の実施例により更に詳細に説明するが、これらは本
発明を限定するものではない。

リダクターゼの分離と精製 Ａ、細胞溶解（溶菌）および抽出 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ株ＡＴＣＣ３１０９
０を１０ｄの発酵釜で発育させ、対数増殖期に回収した
。発酵液を遠心分離することにより細胞ペーストを回収
し、−２０℃に貯蔵した。４５０ｇの細胞ペーストを融
解させ、６５０ｍ／の２０ｍＭ＋−リスバッファー（ｐ
Ｈ８）に再度懸濁させ、細胞を０．５ＭＮａＣ，ｇで洗
滌し、遠心分離により再回収し、次いテ２　ｍ９　／　
ｍｅのリゾチームを含有する６５０ｍｅのトリスバッフ
ァーに再度懸濁させて、細胞内タンパク質を遊離させた
。遠心分離により細胞残渣を溶解物質から分離し、生成
したペレットを非イオン洗滌剤であるツイーン８０を０
．１　％　（ｗ／ｗ）含有するトリスバッファーで再抽
出した。抽出物を２゜５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクター
ゼ活性について測定し、プールした。

Ｂ、イオン交換クロマトグラフィー 粗細胞抽出物（１２６０ｍＪ）をバッチ式にジエチルア
ミノエチルセルロース（Ｗｈａｔｍａｎ　ＤＥ−５２、
湿潤容量で２５０ｍＪ）へ吸着させ、室温で０．５時間
攪拌し、グラスフィルター漏斗でこのＤＥ−５２樹脂を
回収した。ＤＥ−５２樹脂を５×３０ａｎのカラムに充
填し、基線（ベースライン）が確定するまでトリスバッ
ファーで洗滌した（Ａ　２８０＝０．７、Ａ２６０／Ａ
２８（１＝１．７、これは核酸が徐々にカラムから洗い
出されていることを示していた）。次いで、カラムを０
−ＩＭのリニアー濃度勾配のＮ２Ｏ召（１２００肩ｌ）
で１１０　ｍｌ／ｈｒノ流速を以て溶出させ、分画を採
取し、Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクターゼ活性を測定した。明
らかなりＫＧ還元触媒活性を示す２個のピークが認めら
れた：約Ｑ、　４　Ｍ　ＮａＣ／Ｊで溶出して来るピー
クは所望の２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクターゼを含
有していた（２．５−ＤＫＧを２−ＫＬＧへ変換させる
）；約０．２５　Ｍ　ＮａＣｅで溶出して来るもう１個
のピークは２．５−ＤＫＧを２−ＬＫＧへ変換しなかっ
た。

ＤＥ−５２カラムから０．４　Ｍで溶出したピークを２
０ｍＭ１−リスバッファー（ｐＨ８，０）に対して一夜
透析した後、Ａｍ１ｃｏｎ　Ｍａｔｒｅｘ　Ｇｅｌ　Ｂ
ｌｕｅ　Ａ　（この樹脂は、染料（Ｃ１ｂａｃｒｏｎ　
ｂｌｕｅ　Ｆ３ＧＡ　）と共有結合しているアガロース
ビーズから成っており、Ｎ　Ａ　Ｄ　ＨまたはＮＡＤＰ
Ｈを補因子として利用する酵素に対し親和性を有する）
の２．５Ｘ４．５のカラムに掛けた。カラムをトリスバ
ッファーで洗滌し、１、ＱｍＭのＮＡＤＰで溶出した。

分画を採取し、Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクターゼ活性を測定
し、活性分画プールを限外沢過により（Ａｍ１ｃｏｎ　
５ｔｉｒｒｅｄｃｅｌ＋　、　Ｙ　Ｍ−５メンプラン）
１６倍まで濃縮した。

Ｂｌｕｅ　Ａ　カラムから得られた濃縮物質を２０ｍＭ
トリスバッファー（ｐＨ８，０）に対して一夜透析した
後、２００ｍＭの炭酸水素アンモニウムで緩衝化したＡ
ｌｔｅｘ　Ｔ　Ｓ　Ｋカラム（０，５ｘ６０ｚ）に掛け
た（　Ｔ　Ｓ　Ｋカラムはタンパク質を分子量によって
分別する）。２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクターゼ活
性体は４．５，０００ダルトンの分子量に相対する単一
のピークで溶出され、９９％以上の純度を示した。

即ちこの規準によればホモジニアス（均質）であった。

Ａ、電気泳動 この酵素を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在
下にアクリルアミドゲル中で電気泳動した。

非還元的条件および還元的条件のいずれにおいても、約
３４，０００ダルトンの分子量に相当する単一のタンパ
ク質のバンドを認めた。４５，０００ダルトンの範囲に
はタンパク質を認めなかった（ＨＰＬＣでは認められた
）。

Ｂ、Ｎ−末端アミノ酸配列 アミノ酸配列のデータから、純化した酵素は単一のＮ−
末端配列を含んでいることがわかった。

（μは未測定） ｔｈｒ　ｖａｌ　ｐｒｏ　ｓｅｒ　ｉｌｅ　ｖａｌ　ｌ
ｅｕ　ａｓｎ　ａｓｐ　ｇｌｙ　ａｓｎｓｅｒ　ｉｌｅ
　ｐｒｏ　ｇｌｎ　Ｉｅｕ　ｇｌｙ　ｔｙｒ　ｇｌｙ　
ｖａｌ　ｐｈｅ　Ｉｙｓｖａｌ　ｐｒｏ　ｐｒｏ　ａｌ
ａ　ａｓｐ　ａｌａ　ｇｌｎ　ａｒｇ　ａｈａ　ｖａｌ
　ｇｌｕｇｌｕ　ａｈａ　ｌｅｕ　ｇｌｕ　ｖａｌ　ｇ
ｌｙ　ｔｙｒ　ｐ　ｈｉｓ　ｉｌｅ　ａｓｐμ　ａｌａ
　μ　μ　ｔｙｒ　ｇｌｙ Ｃ，アミノ酸組成 アミノ酸加水分解の結果、次の組成を得た。

ａｓＸ　１１．５２　ｍｅＬ　１．．３６ｔｈｒ　４．
７５　ｉｌｅ　４．８２ Ｓｅｒ３．８５　１ｅｕ　７．９０ ｇ１ｘ　１０．４７　ｔｙｒ　２．４０ＰｒＯ６，１５
ｐｈｅ　２．３７ ｇ１ｙ　８．２２　ｈｉ、ｓ　３．６７ａｌａ　１４．
６９　ｌｙｓ　３．１．０ｃｙｓ　Ｏ，００ａｒｇ　５
．２１ ｖａｌ　７．４７　ｔｒｐ　２．０５ Ｄ、速度論的パラメーター、基質特異性および補因子要
求性 速度論パラメーターの測定に以下の測定条件を使用した
。

ＩＪ　７酸−）−）リウム緩衝液　１５ＱｍＭ、ＰＨ６
，４゜２５°Ｃ Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ１１〜３００μＭ 酵素　１０μｇ ２、５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　Ｏ，４３〜４３ｍＭ測定容量　
１．０尻ｅ ミヒヤエル恒数（Ｋｍ）２．５−ＤＫＧ　１５．５ｍＭ
ＮＡＤＰＨ３３，７μＭ 最大速度（■ｍａｘ）９．８単位／ｍｇ（１単位＝１．
０μモル／分） この酵素はＮＡＤＰＨに特異性を有する。２−ＫＤＧ、
５−ＫＤＧ、Ｄ−グルコン酸、２−ＫＬＧ、ＮＡＤＨで
は何ら活性を認めなかった。

１斗　」Ｈ−旧−＋＋ Ｍｇ　１Ｍｎ　、　Ｃａ　、　Ｚｎ　１ＥＤＴＡ、シス
ティン、ＡＤＰ、ＡＴＰの存在下で、何ら活性に変化を
認めなかった。

Ｅ、至適ｐＨ ＰＨ６，４で最高の活性が認められた。この酵素は、ｐ
Ｈ５，０〜７．６の広い範囲にわたって活性を示した。

２、５−　Ｄ　Ｋ　Ｇの２−ＫＬＧへの変換を計量する
ために、０．１モルのトリス：　Ｃ１（ｐＨ７，５）　
１．ｍｌ中に２．５−ＤＫＧ、１．３３ｍＭのＮＡＤＰ
Ｈ，０，３■の２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　＋）ダクターゼ
を含有させて反応を行なった。２５℃で５時間後、反応
を停止し、Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ酸化と２−ＫＬＧの生成
を分析した。

Ｑ、　４　ｍ　ＭのＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈの酸化に相当す
る３８０ｎｍにおける吸収の変化が観察された。有機酸
カラムによるＨＰＬＣ分析では０．４２ｍＭの２−ＫＬ
Ｇに相当する単一のピークが認められた。２−ＫＤＧ（
２−ケト−ローグルコン酸）または５−ＫＤＧ（５−ケ
）−Ｄ−グルコン酸）は認められなかった。このＨＰ　
Ｔ−Ｃ分析の結果は、更に、凍結乾燥した反応混合物に
３０分、９０℃でトリメチルシリルイミダゾール／ピリ
ジン（５０１５０）を添加して調製した過トリメチルシ
リル化誘導体を、５幅の交差結合フェニルメチルシリコ
ン融解シリカ結合キャピラリーカラム（２５ｍ）を用い
たＧＣ−ＭＳ分析により確かめられた。薄層クロマトグ
ラフィの結果も上記の結果と一致した。

Ａ、プローブの設計 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株（ＡＴＣＣ３１０９
０）　ＤＮＡのＴｍを測定したところ、７．５ｍＭリン
酸ナトリウム、１　ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ　（ｐ）−１６，
８）の溶液中で８１．５℃であった。これは標準として
使用したＰ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏ
ｓａのＤＮＡ（Ｔｍ＝７９．７℃、Ｇ十Ｃ＝６７％）か
らの（Ｇ　−１−、Ｃ）含量７１％に相当する。従って
、構築に当たって、高（Ｃ＠−，Ｃ）含量の細菌ＤＮＡ
中にいきわたっていることが知られているコドン（Ｇｏ
ｕｇ、　Ｍ、ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、
　１０．７０５５（１９８２）　）を使用した：ｐＨｅ
　、　ＴＴＣ；　Ｉｙｓ、　ＡＡＧ　；　ｖａ＋　、　
ＧＴＧ　；　ｐｒｏ、　ＣＣＧ　；ａｌａ。

ＧＣＣ；　ａｓｐ、　ＧＡＣ；　ｇｌｎ、　ＣＡＧ　；
　ａｒｇ、　ＣＧＣ；　ｇｌｕ、　ＧＡＧ；　ａｓｎ、
　ＡＡＣ；　ｓｅｒ、　ＴＣＣ；　ｉｃｅ、　ＡＴＣ；
　Ｉｅｕ、　ＣＴＧ　；　ｇｌｙ。

ＧＧＣ；　ｔｙｒ、　ＴＡＣｏＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ株（ＡＴＣＣ３１０９０）から得られた２、　
５−　Ｄ　Ｋ　Ｇリダクターゼの部分的なアミノ酸配列
は実施例２に示されている：この配列と上記のコドンの
配列を使用し、ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＫｉｎｇｓｔｏ
ｎの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０．６８３８（１９８３
））を用いて好適なプローブを構築した。Ｃｒｅａ、　
Ｒ，ら（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　８　
：　２３３１（１９８０）のフォスフオトリエステル法
により２つの４３量体、即ち５’　ＧＧＣＣＴＣＣＴＣ
ＣＡＣＧＧＣＧＣＧＣＴＧＧＧＣＧＴＣＧＧＣＣＧＧＣ
ＧＧＣＡＣＣＴＴＧ３／および５’ＣＴＣＣＡＴＣＣＣ
ＧＣＡＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＴＴＣＡＡＧ
ＧＴＧＣ，ＣＧＣＣＧ３’を合成した。このオリゴヌク
レオチドプローブを１００　μｃｉ　（ｒ−３２Ｐ　’
）　ＡＴ　Ｐ　（５，０ＯＯＣ！／ｍｍｏｌｅ　、　Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ　）およびポリヌクレオチドキナーゼ（
Ｐ　−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）によりリン酸
化する。

５ｈｉｌｌｅｒ　らの方法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ、　Ａ
ｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏ−ｔｈｅｒａｐｙ　１８．８１
４（１９８０））により、Ｃｏｒｙｎｅｌ〕ａｃＬｅｒ
ｉｕ株ＡＴＣＣ３１０９０からゲノムＤＮＡを分離した
。

大きい断片（＞　１００ｋｂ）　をＣｓＣ１密度勾配遠
心分離法で純化し、Ｓａｕ　３　Ａにより部分的に消化
した。消化物をアガロースゲル電気泳動により、１−２
ｋｌ）、２−３ｋｂ、　３−４ｋｂ、および４−５ｋｂ
の大きさ別に組分けしてサイズ分画した。ゲノムライブ
ラリーは、ＢａｍＨＩ部位の切断と、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いた５ａｕ３Ａ断片の挿入により、ベクターｐＢ
Ｒ３２２およびｐ　Ａ　ＣＹ　Ｃ１８４を用いて各サイ
ズ毎のＤＮＡ断片から作製した（　Ｂｏｌ　１ｖｅｒ　
。

Ｆら、Ｇｅｎｅ　２．９５（１９７７）　；Ｃｈａｎｇ
　、　Ａ、Ｃ，Ｙ、、およびＣｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、Ｊ
、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３４　、１１４１（１９７
８））。Ｄ　、　Ｈａｎａｈａｎの形質転換のプロトコ
ール（Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、す刷　５５７（１９
８３））を用いて、得られたプラスミドを用いてＥ、ｃ
ｏｌｉ、株ＮＭ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）またはＤ
Ｉ−Ｔ　−１（ＡＴＣＣ３３８４９）のｒｅｃ　Ａ−誘
導株を形質転換にした。

各ゲノムライブラリーは１０〜１０　の独立した組換え
体から成っていた。（変法として、Ｃｏｒｙｎｅ　−ｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ株（Ａ’ＴＣＣ３１０９０）　ＤＮＡ
のＢａｍＨＩ断片（サイズ幅２．０〜２，５ｋｂ）　お
よびＰｓｔ断片（サイズ幅０．５〜］、、５ｋｂ）を用
いてｐＢＲ３２２から別のプラスミドライブラリーを作
製しても良い）。

コロニ一群をマイクロ滴定圧に採取し、−夜インキユベ
ートしてから、アンピシリンまたはクロラムフェニコー
ルを含有するＬ　Ｂプレート上に設置シタニトロセルロ
ースフィルター（ＢＡ３５）にスタンプした。マイクロ
滴定圧に残った部分のコロニーは４２％のＤＭＳＯを加
えて保管し、−２０℃に貯蔵した。

移植された部分のコロニーは８〜９時間、３゛７°Ｃで
インキュベートした後、フィルターから、１２．５μＱ
／ｍｅのクロラムフェニコールまたはスペクチノマイシ
ンを含有しているプレートへ移し換え、−夜、３７℃で
インキュベートすることにより増幅した。

Ｅ、ｃｏｌｉ　内のプラスミドライブラリーをフィルタ
ーハイブリダイゼーションによりスク１ノ−ニングする
。ｒ）ＮＡを変性し、Ｉ　ｔａｋｕｒａ、　Ｋら（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　９　：８７９〜８９
４（１９８１））の記載した方法により重複フィルター
に結合させる。このハイブリダイゼーション用のフィル
ターを、フィルター当り約１０　ｍｌの５　ｘ　Ｓ　Ｅ
　Ｔ、　５　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液および５０μＱ
／ｍｅの変性したサケ***ＤＮＡ、および゛０．１％ピ
ロリン酸ナトリウム斗２０％ホルムアミド中に浸漬する
（　５　ｘ　Ｓ　Ｆ、Ｔ＝５　ＱｍＭ　）リ　ス−ＨＣ
ｌ　（ｐＨ８，０）、５　ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ、　５　０
　０ｍＭ　ＮａＣ，５；　５　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔの
溶液二〇、１％ウシ血清アルブミン、ｏ、１ｆｏポリビ
ニルピロリドン、０．１％フィコール；　Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔｌＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、、２３：６４１（１９６６）−＋参照）。フ
ィルターを４２℃で１４〜１６時間、絶えず攪拌しなが
らプレハイブリダイズし、本実施例のＡ項において調製
した〜１×１１０８ＣＰのプローブと４２℃でプローブ
した。Ａ項のプローブとハイブリダイズしたフィルタを
、４２℃で０．２　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，０，１％ＳＤＳ、
０．１％ピロリン酸ナトリウムで３０分間つつ３回洗滌
した。２つのフィルターのそれぞれをドライブロツチン
グし、台紙につけ、ＤｕｐｏｎｔＣｒｏｎｅｘ　ｌ　ｌ
　Ｒエキストラライフライトニングープラスインテンシ
ファイングスクリーンを持ったＫｏｄａｋ　ＸＲ５Ｘ線
フィルムに一７０℃で４〜２４時間、感光させた。

陽性コロニーの細胞を増殖させ、プラスミドＤＮＡをＣ
ｌｅｗｅ１１およびＨｅ１ｉｎｓｋｉの方法（Ｐｒｏｃ
。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　６２．１
１５９（１９６９））によって分離した。ＤＮＡをＡｂ
＋１および遍隻■により断片化し、ベクターＭ１３ｍｐ
８およびＭ１３１ｎｐ９　に■サブクローンした（　Ｍ
Ｃ５５ｉｙ１ｇ　、　Ｊ、およびＶｉｅｒａ、　Ｊ、、
Ｇｅｎｅ　１９，２６９（１９８２）。プローブとハイ
ブリッド形成したサブクローンを、そのＤＮＡが２．５
−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクターゼを暗号化していること
を確かめるため、ジデオキシ鎖ターミネーション法によ
り塩基配列決定した（　Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、ら、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）７４：
５４６３（１９７７））。

それ自身の、または合成されたリポソーム結合部位を伴
なった２、　５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクターゼ遺伝子
を、テトラサイクリン耐性遺伝子またはそれ以外の選択
マーカーを有し、またプラスミドＣｏ１ＥＩ、１５Ａ、
またはＲＳ　Ｆ　１０１０から誘導された複製起源を含
んでいる発現プラスミド上のＥ、ｃｏｌｉ　ｔｒｐ（ま
たはｔａｃ　）プロモーターまたはｐＡＣＹＣ１８４Ｃ
ＡＴ　プロモーターの１下流１に挿入する。

組立て物のあるものは、更に、外部から添加されたイン
ドールアクリル酸またはＩＰＴＧによって２、５−Ｄ　
Ｋ　Ｇ　ＩＪダクターゼ遺伝子の発現を調節することが
できるＥ、ｃｏｌｉ　ｔｒｐレプレッサーまたはＥ、ｃ
ｏｌｉ　Ｉａｃ　レプレッサーを暗号化している活性遺
伝子を含有していてもよい。上記のプラスミドの種々の
突然変異体もまた、２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクタ
ーゼの発現に利用される。

構築 ２、５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクターゼ遺伝子の一部を
含有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍＳ　Ｐ　（Ａ
ＴＣＣ３１０９０）ＤＮＡのクローンされた２、２ｋｂ
とＨＩ断片（フラグメント）を、実施例３に記載された
４３量体プローブで分離した。このプラスミドの０．１
２ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ　／Ｂａｍ　ｉ（Ｉ断片を、残りの
遺伝子を含有しているＣｏｒｙｎｅ＋：＋ａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　ＳＰ　ＤＮＡの重複している０、８８　ｋｂ　Ｐ
ｓｔＩ断片を分離するためのプローブとして使用した。

第２図に示すようにｐＤＫＧＲ２（２，２ｋｂμ＋ｍ　
ＨＩ断片を含有している）をＮｃ。

■で消化し、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ■Ｋ
　１　ｅｎｏｗ　断片およびｄＮＴＰｓで処理して平滑
末端を作り、次いで更にＢａｍ　ＨＩで消化してＱ、８
７ｋｌ）の断片を遊離させた；この断片４は低融点アガ
ロース上を電気泳動させて精製した。プラスミドＰＤＫ
Ｇ　２９　（０，８８ｋｂ　Ｐｓｔｌ断片を含んでいる
）をＰｓＬ　ＩおよびＢａｍ　ＨＴで消化し、生成した
０、　７．６　ｋｂ断片を同様に低融点アガロース−Ｌ
で分離した。この０，８７　ｋｂ　Ｎｃｏ工／　Ｂａｍ
　Ｈ４断片と０．７６ｋｂ県狸Ｈ■／初■断片を一初劇
■／照■で消化したＭ１３ｍ９と混合し、ライゲーショ
ンして完全な２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクターゼ遺
伝子を含有しているＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ＳＰ　ＤＮＡの１，６ｋｂを挿入体を持ったＭ１３組換
え体（”ｍ１ｔ１２”）を得た（第２図）。

コノｍｉ【１２の一本鎖ＤＮＡに１欠失プライマー’（
配列：　ＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡ、ＴＴＣＴＡＴＧＡ
ＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＣ）およびＭ　１３　ｍ　９　Ｄ
　Ｎ　ＡのＡｌｕ■断片をアニーリングした。この鋳型
−プライマー組み合せ物を、ｄＮＴＰｓ　およびＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼの存在下に、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｄ　Ｎ　Ａポ
リメラーゼＫｌｅｎｏｗ　断片で処理すると、Ａｄｅｌ
ｍａｎらの記載（ＤＮＡ２，１８３（１９８３））のよ
うに、インビトロでヘテロデュプレックスｍｉｔ　１２
　ＲＦ分子が作成された。これらの分子を宿主ｔＭ１０
１の形質転換に使用し、所望の欠失を備えた組換え体フ
ァージを、欠失プライマーをプローブとして使用したプ
ラークハイブリダイゼーションによって検出した（　Ａ
ｄｃｌｍａｎら＋ＤＮＡ２，１８３（１９８３））。こ
の構造物はｍｉｔ　１２△と命名された（第３図）。

このｍ１Ｌ１２△ＲＦ　ＤＮＡをＥｃｏ　Ｒ■およびＴ
−１ｉｎｄ　ＩＩＩで消化すると、２．５−　Ｄ　Ｋ　
Ｇリダクターゼ遺伝子を含有している１、５ｋｂ　の断
片が得られた。ヒト成長ホルモン発現プラスミドｐＨＧ
Ｔ−Ｔ２０７−１ｐｔｒｐ△ＲＩ　５’ＣＰＨＧＩ−Ｉ
２０７−１．ｐｔ　ｒｐ△に１５′　はｐＨＧＨ２０７
１の誘導体（ｄｅ　Ｂｏｅｒ　ラ（１９８３）　、　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　Ｕ　Ｓ
　Ａ　８Ｑ　。

２１）であって、アンピシリン耐性遺伝子とｔｒｐプロ
モーターの間のＥｃｏＲ■部位が欠失している〕をＥｃ
ｏＲＩとＰｓｔ　■で消化して、Ｆ、　、　ｃｏｌ　ｉ
　ｔｒｐプロモーターを含有するｌ、Ｑｋｂの断片を得
、また、ｐＢＲ３２２を包■とＵ山世−■で消化して３
６ｋｂ　の断片を作成しこ。これら３個の断片をライゲ
ーション（連結）することによって、２．５−Ｄ　Ｋ　
Ｇ　ＩＪダクターゼの発現プラスミドを形成し、これを
ｐｍｉｔ１２△／１ｒｐｌと命名した（第３図）。

このプラスミドは宿主にテトラサイクリン耐性を付与す
ることはできない。完全なテトラサイクリン耐性機能を
暗号化しているプラスミドは、次のようにして構築され
た。Ｐｍ１Ｌ１２△／ｌｒｐ　］−ＤＮＡを男可■で消
化し、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ１に、ｌ
ｅｎｏｗ　断片とｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ　ｓで処理して平滑末
端ＤＮＡを生成し、次にこれを５ｐｈ１で消化した；得
られた５、５ｋｂ　断片を低融点アガロース上で電気泳
動させることにより精製した。同様にして、ｐＢＲ３２
２ＤＮＡを腹ＲＩで消化し、Ｅ　、　ｃｏｌ　１ＤＮＡ
ポリメラ一ゼＩＫｌｅｎｏｗ　断片とｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ　
ｓで処理し、Ｓｐｈ　Ｉ　で消化し、得られた０、５６
ｋｂ断片を低融点アガロース上で精製した。次に、これ
らの５，５ｋｂ　断片と０．５６　ｋｂ断片とを連結（
ライゲーション）し、テトラサイクリン耐性の２゜５−
　Ｄ　Ｋ　Ｇリダクターゼ発現プラスミドを得、これを
、ｐｔｒｐｌ−３５と命名した（第３図）。このプラス
ミドに含まれているｔｒｐプロモーター、合成リポソー
ム結合部位、および２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクタ
ーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を第４図に示す。

Ｅ、組換え２．５−ＤＫＧＩＪダクターゼの製造形質転
換に用いる細胞はＬａｃｙおよび５ｐａｒｋｓの方法（
１’ｈｙ＋ｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｏｃｉｅＬ
ｙ、　５９　：１２９３−１２９７（１９７９））によ
り用意した。簡単に述べると、好適な宿主細胞、Ｅｒｗ
ｉｎｉａ　１１ｃｒｂｉｃｏｌａ　（ＡＴＣＣ２１９９
８）、またはＥ、ｃｏｌｉＭＭ　２９４（ＡＴＣＣ３１
４６４６）の１白金耳を５ｍｌのＩ−Ｂ培地に接種し、
３０℃で１４〜１６時間、インキュベートした。この−
夜を置いた増殖物の１　：　１００の希釈液をＬＢ培地
に接種し、０Ｄ５９ｏが０．４となるまで培養し、４℃
で遠心分離して、細胞を回収した。回収したペレットを
１／３量の１０ｍＭＮａＣ１に再び懸濁し、４℃で再び
遠心分離し、ペレットを再び同量の３０ｒｎ　Ｍ　Ｃａ
　Ｃ１２に懸濁し、０℃で６０分間放置後、再び４℃で
遠心分離し細胞を回収した。ペレットを１／１２容量の
３０ｍＭＣａＣｅ２　に再び懸濁り、、４℃で一夜貯蔵
した。（別法として、細胞を３０ｍＭ　Ｃａ　Ｃ１２と
１５％グリセロールに再懸濁し、−７０℃で貯蔵しても
良い。） 形質転換は、０．２　ｍｌのコンピテント細胞と１μｇ
のプラスミドを０℃で２時間インキュベートし、次いで
１分間４２℃に加温することにより行なった。３　ｍｌ
のＬ　Ｂブロスをこれに加え、４時間３７で ℃放置して、細胞を回復させ、次いで細胞をＬａｃｙ△ および５ｐａｒｋｓ　（上述）記載の選択培地で培養し
た。

成功した形質転換体を０．Ｄ、５．。＝１．ｏの密度と
なるまで増殖させ、次いで遠心分離し、０．２％のグル
コースを含む最少量の培地に再懸濁させた。次に、ＩＡ
ＡまたはＩＰＴＧを培地に添加し、０，５〜１時間後、
遠心分離して細胞を回収し、リゾチームと界面活性剤（
Ｔｗｅｅｎ　８０　）で処理して細胞を溶解（溶菌）さ
せた。

−上清を取り、２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇリダクターゼの存
在を実施例２Ｄに示した方法で測定した（第１表）。

タンパク質はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より分析した（第５図）。組換え体２，５Ｄ　Ｋ　Ｇ　
ＩＪダクターゼを示すタンパク質バンドを、ウェスタン
ブロッティング法により免疫学的に同定した（　Ｔａｂ
ｉｎ　、　ＪＴら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ亘、４３５０（１９７９）） 第１表 １）ＢＲ３２２を導入した Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈｃｒｌ）ｉｃｏｌａ（ＡＴＣＣ２１
９９８）　ｏ、ｏ　８７ＰＬｒｐｌ−３５を導入した Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ（ＡＴＣ：Ｃ２１
９９８）　１．９２５実施例４　組換え微生物を２．５
−ＤＫＧに接触させることによる２　−Ｋ　Ｌ　Ｇの製
造凍結貯蔵していたグリセロールストックから、ｐｔｐ
ｌ−３５−形質転換Ｅｗ、ｈｃｒｂｉｃｏｌａ　（ＡＴ
ＣＣ２１９９８）の細胞を、５■／Ｌのテトラサイクリ
ンを含有するＬ　Ｂ固形培地（１０ｇ／Ｌ）リプトン、
５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０９．／　Ｌ　ＮａＣｄ、１５
　ｆｌ／Ｌ寒天）上に画線接種し、４８時間、３０℃で
インキュベートした。その１コロニーを取り、５ｍｆｌ
／Ｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ液体培地５ｍｌ
の接種に使用し、これを試験管内で１６時間、３０℃で
振盪した。この培養の１．、　Ｏｍｅを５　ｍｆ／　／
　Ｌテトラサイクリン含有ＬＢ液体培地ｔｏｏｍｇの接
種に使用し、次にこれを３０℃に於いて、２００ｒｐｍ
で１６時間振盪した。遠心分離により細胞を回収し、同
量の新しいＩ、Ｂ培地で一度洗滌し、次いで５ｍ９／Ｔ
−のテトラサイクリンおよび２０ｇ／Ｌの２．５−　Ｄ
　Ｋ　Ｇを含有する５０ｍ１のＬ　Ｂ培地に再懸濁させ
た。この１０ｒｎｌを１２５ゴのフラスコ中で、２０Ｏ
ｒｐｍ、３０℃で１６時間振盪した。

得られたブロスをＨＰＬＣで分析し、２．（１／Ｌの２
−　Ｋ　Ｌ　Ｇが含有していることを認めた。ｐＢＲ３
２２を導入したＥｒｗ、　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ　（ＡＴ
ＣＣ２１９９８）を用いて同様な方法で行なった対照培
養では、２−　Ｋ　Ｌ　Ｇは含まれていなかった。

２−　Ｋ　Ｌ　Ｇの製造 ｐｔｒｐ＋−３５−形質転換Ｅｒｗ、　ｈｅｒｂｉｃｏ
ｌａ　（ＡＴＣＣ２１９９８）　の細胞を５πｇ／Ｌの
テトラサイクリンを含有するＬ　Ｂ固形培地（１０Ｑ　
／　Ｌ　トＩＪプトン、５　ｇ／Ｉ−酵母エキス、１０
　Ｑ　／　Ｔ−ＮａＣ１，１，５ｇ／Ｌ寒天）」二に画
線接種し、次いで４８時間、３０℃でインキュベートし
た。その１個のコロニーを取り、５Ｆ’ｌ＆／Ｌのテト
ラサイクリンを含むＬＢ液体培地５ｍｌの接種に使用し
、これを試験管内で１６時間、３０℃で振盪した。この
培養液１ｍｌを、５ダ／Ｌのテトラサイクリンを含有す
る１００ｍ１のＡＴＣＣ培地１０３８　（３，０ｇ／Ｌ
グルコース、５．０９７Ｌ酵母エキス、５．０Ｉｉ’／
Ｌペプトン、７．５ｇ／　Ｌ　ＣａＣＯ３、ｐＨ７，０
）への接種に使用し、これを５００ｍ１のフラスコ中で
、３０℃で１６時間、２０　Ｏｒｐｍで振盪した。次に
、この培養液７５ｍｅから遠心分離により細胞を取り、
５ｍｆｌ／Ｌのテトラサイクリンと２０９／Ｌのグリセ
ロールを含む５０ｍ１の新しいＡＴＣＣ培地１０３８に
再懸濁させ、５００ｍ／のフラスコ中、３０°Ｃ，２０
０丁Ｐｍで４８時間振盪する。得られたブロスをＨＰ　
Ｌ　ＣおよびＧＣ／ＭＳで分析した結果、１．０ｇ／Ｌ
の２−Ｋ　Ｌ　Ｇを含有していることがわかった。ｐＢ
Ｒ−３２２を導入したＥｒｗ、　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ　
（ＡＴＣＣ２１９９８）を用いて同様にして行なった対
照培養には、２−Ｋ　ＬＧは含まれていなかった。

造 容易に入手し得る炭素供給源から２−Ｋ　Ｌ　Ｇを製造
し得ることを例示するために、次の実験を実施した。

次の成分を含有する培地中で、Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒ
ｂｉｃｏｌａ（ＡＴＣＣ２１９９８）／’ＰＬｒＰｌ−
３５の細胞を発育させることにより２−　Ｋ　Ｌ　Ｇの
製造を実施した。

酵母エキス（Ｎｅｓｔｌｅｓ　）　１０９　／　（１炭
酸カルシウム　２０Ｑ／（１ とうもろこし浸漬液　１０　ｆ／／１ グルコース　２０ｇ／ｌ テトラサイクリン　５πｆ／／（１ グルコースおよびテトラサイクリンは別個に滅菌し、接
種前に添加した。

接種材料は、凍結したストック培養液１．０　ｍｌを、
５ｇ／ｌのグルコースおよび５　ｍｌ’ｊ　／　ｎのテ
トラサイクリンを含有している５０ｍ／のルリア（Ｌｕ
ｒｉａ）ブロスに加えることにより調製した。この接種
材料を含有する２５０ｍ／の遮閉フラスコを３０℃で１
２時間振盪培養した。

５０ｍ／の上記の製造培地を満たした２　５０　ｍｌの
遮閉フラスコに１　ｍｌのこの接種材料を接種した。

フラスコを振盪しつつ、３０℃でインキュベートした。

接種時の培地のｐＴ−Ｔはとうもろこし浸漬液の酸性の
ため５．１であった。５７時間後にｐＨは８．７１まで
」１昇し、２−　Ｋ　Ｌ　ＧはＨＰ　Ｌ　Ｃにより、０
．６πｇ／ｍｌの濃度で存在していることがわかった。

２−　Ｋ　Ｌ　Ｇの存在はＨＰ　Ｌ　ＣおよびＣ，Ｃ−
ＭＳスペクトロメトリーにより確認した。

【図面の簡単な説明】

第１図はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ２．５−　Ｄ
　Ｋ　Ｇリダクターゼのための発現ベクターの模式図、
第２図および第３図は２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　＋）ダク
ターゼ遺伝子のための発現ベクターの組み立てを示す工
程図、第４図はｐＴｒｐ　１−３５　発現ベクターのコ
ントロール領域および２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダク
ターゼ遺伝子を含む配列を示す模式図、第５図は第４図
に示した配列を持つ２．５−　Ｄ　Ｋ　Ｇ　ＩＪダクタ
ーゼ発現ベクターで形質転換したＥｒｗｉｎｉａ　ｈｅ
ｒｌ）ｉｃｏｌａ　（ＡＴＣＣ２１９９３）から抽出し
た蛋白質の染色ゲルを示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、実質的に不純物を含有しない２，５−ジケトグルコ
   ン酸リダクターゼ。 ２、実施例１ｄに記載の基準によりホモジニアスな２，
   ５−ジケトグルコン酸リダクターゼ。 ３、比活性が５単位／ｍｆ／タンパク質より大である２
   、５−ジケトグルコン酸リダクターゼ。 ４、（ａ）　２．５−ジケトグルコン酸リダクターゼを
   産生ずる細胞を溶菌し、 （ｂｌ　陰イオン交換カラムに工程（ａ）の溶菌物を吸
   着させ、然る後にカラムから酵素を溶出させ、ＦＣ＋　
   （ｂ）の工程で得られた溶出液をアフイニテイ力ラムで
   処理し、酵素をアフィニティーカラムから溶出させ、 （ｄｉ　溶出液から酵素を回収する、 ことから成る２、５−ジケトグルコン酸リダクターゼの
   製造方法。 ５、細菌細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属であ
   る第４項に記載の方法。 ５、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍがＣｏｒｙｎｅｂ
   ａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｓｐ。 ＡＴＣＣ３１０９０である第５項に記載の方法。 ７、陰イオン交換カラムがＤＥＡＥセルロースである第
   ４項に記載の方法。 ８、アフィニティー吸着剤がチバクロン・ブルーＦ３．
   ＧＡである第４項に記載の方法。 ９、第４項に記載の方法により製造される２、５−ジケ
   トグルコン酸リダクターゼ。 １０、還元性または非還元性のＳＤＳ　、ＰＡＧＥにお
   いて、約３４，０００の分子量に相当する移動を示す２
   ，５−ジケトグルコン酸リダクターゼ活性を有する酵素
   。 １１、実施例２に開示したＮ−末端アミノ酸配列を有し
   、２．５−ジケトグルコン酸活性を有するタンパク質。 １２、　２．５−ジケトグルコン酸を含有する混合物を
   第１項、第２項、または第９項に記載した酵素、と接触
   させることから成る２、５−ジヶトグルコン酸を２−ケ
   トーＬ−グロン酸へ、変換させる方法。 １３．第１項、第２項、または第９項に記載した酵素を
   溶液で供給する第１２項に記載の方法。 １４、第１項、第２項、または第９項に記載した酵素を
   固定化型で供給する第１２項に記載の方法。 １５、還元当量物をインビトロで供給する第１２項に記
   載の方法。 １６、　２．５−ジケトグルコン酸リダクターゼを暗号
   化しているＤＮＡ配列を、細菌宿主に適合し得るプロモ
   ーターへ機能的に結合させることから成る、該ＤＮＡ配
   列を発現し得る複製可能な発現ビヒクルを組み立てる方
   法。 １７、組換え宿主細胞により産生される２、５−ジケト
   グルコン酸リダクターゼ。 １８、　２．５−ジケトグルコン酸リダクターゼを発現
   し得る組換えベクターを含有する組換え宿主細胞を培養
   することから成る２、５−ジケトグルコン酸リダクター
   ゼの製造方法。 １９、好適な宿主細胞において２，５−ジケトグルコン
   酸リダクターゼを暗号化しているＤＮＡ配列を発現する
   ことができる組換え発現ベクター。 ２０、　２．５−ジケトグルコン酸リダクターゼを暗号
   化しているＤＮＡ配列が、当該ＤＮＡ配列を発現し得る
   プロモータに機能的に結合している組換え発現ビヒクル
   。 ２１、第１９項または第２０項に記載の発現ベクターで
   形質転換された微生物宿主細胞または細胞培養。 ２２、　２．５−ジケトグルコン酸リダクターゼを暗号
   化しているＤＮＡ配列を含有し、それを発現することが
   できる組換え細胞または細胞培養。 ２３、第２１項に記載の細胞または細胞培養によって産
   生される２、５−ジケトグルコン酸リダクターゼ。 ２４、　２．５−ジケトグルコン酸を含有する混合物を
   第１７項または第２３項に記載のりダクターゼと接触さ
   せることから成る２、５−ジケトグルコン酸を２−ケト
   ーＬ−グロン酸に変換させる方法。 ２５、　２．５−ジケトグルコン酸を含有する混合物を
   、２，５−ジケトグルコン酸リダクターゼ遺伝子を発現
   する組換え宿主細胞を含有する培養と接触させることか
   ら成る２、５−ジケトグルコン酸を２−ヶ）−Ｌ−グロ
   ン酸に変換する方法。 ２６．２−ケトーＬ−グロン酸を更にアスコルビン酸へ
   変換する工程を含む第２５項に記載の方法。 ２７、通常の代謝産物を２−ケトーＬ−グロン酸へ変換
   させることのできる組換え細胞。 ２８、通常の代謝産物を２−ヶ）−Ｌ−グロン酸へ変化
   させるために必要とする１またはそれ以上の酵素を暗号
   化している発現ベクターで形質転換された組換え微生物
   。 ２９、発現ベクターが２，５−ジケトグルコン酸リダク
   ターゼを暗号化している第２８項に記載の微生物。 ３０、Ｅｒｗｉｎｉａ属に属する第２９項に記載の微生
   物。 ３１、通常の代謝産物がグルコースである第２７項に記
   載の微生物。 ３２、好適な代謝条件下で、通常の代謝産物を含有して
   いる培地中、当該通常の代謝産物を２−ケトーＬ−グロ
   ン酸へ変換させ得る組換え細菌細胞を培養することから
   成る、該通常の代謝産物を２−ケトーＬ−グロン酸へ変
   換させる方法。 ３３、組換え宿主細胞が、２，５−ジケトグルコン酸リ
   ダクターゼを暗号化しているＤＮＡ配列を発現し得る発
   現ベクターを含有している第３２項に記載の方法。 ３４、組換え細胞がＥｒｗｉｎｉａ属に属する第３３項
   に記載の方法。 ３５、通常の代謝産物がグルコースである第３２項に記
   載の方法。 ３６、　２−ヶ）−Ｌ−１”ロン酸カアスコルビン酸へ
   変換される第３２項に記載の方法。