DE3485981T2

DE3485981T2 - Biosynthetische 2,5-diketoglukonsaeure-reduktase, verfahren, rekombinante zellen und expressionsvektoren zu deren herstellung und ihre verwendung zur herstellung von 2-keto-l-gulonsaeure.

Info

Publication number: DE3485981T2
Application number: DE8787202624T
Authority: DE
Inventors: David Aaron Estell; Robert Alan Lazarus; David Richard Light; Jeffrey Veach Miller; William Harry Rastetter
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1983-06-28
Filing date: 1984-06-25
Publication date: 1993-06-09
Anticipated expiration: 2004-06-26
Also published as: DE3484216D1; CA1339107C; IL72225A; EP0305608B1; ATE61409T1; EP0132308B1; NZ208687A; IE57551B1; DK310784A; IL89242A; BR8403146A; JPH0586186B2; EP0305608A1; AU594921B2; JPH0614771A; DE3485981D1; NZ223397A; IE841629L; IL72225A0; AR243606A1

Description

Die Erfindung betrifft Aspekte eines Verfahrens zur Herstellung von Ascorbinsäure. Sie bezieht sich speziell auf die Reinigung eines brauchbaren Proteins, auf die Herstellung von Proteinen unter Anwendung von Rekombinationstechniken und auf die Verwendung solcher Proteine in chemischen Umwandlungen. Insbesondere bezieht die Erfindung sich auf die Reinigung von und die rekombinante Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure-(2,5-DKG)reduktase und die Verwendung der so erzeugten Reduktase bei der stereoselektiven Umwandlung von 2,5-DKG in 2-Keto-L-gulonsäure (2 KLG).
Ascorbinsäure ist in den USA und sonst in der Welt ein bedeutendes chemisches Produkt geworden wegen ihrer Wichtigkeit zur Aufrechterhaltung der Gesundheit. Obwohl es eine gewisse kontroverse Einstellung hinsichtlich ihrer Wirksamkeit bei der Verbesserung der Neigung von Individuen zur Verkürzung von kleineren Leiden wie beispielsweise der gewöhnlichen Erkältung geben mag, besteht kein Zweifel, daß es essentiell für Menschen ist, erforderliche Mengen an Vitamin C mit der Nahrung auf zunehmen. In den letzten Jahren ist es eine wichtige Frage geworden, daß "natürliche" Lebensmittel angemessene Mengen an Vitamin C nicht liefern könnten. Daher hat sich ein großer Bedarf an Vitamin C entwickelt, sowohl als Zusatz zu Lebensmitteln, die an den Verbraucher mit erhöhten Gehalten dieses Vitamins geliefert werden, als auch als direkte Vitaminergänzung. Weiter ist Ascorbinsäure ein wirksames Antioxidans und findet so Anwendungen wie als ein Konservierungsstoff sowohl in Nahrungsprodukten als auch in anderen Produkten.
Es ist eine Anzahl von Verfahren, einige kommerziell entwicklungsfähig, für die Herstellung von Vitamin C verfügbar. Mehrere dieser ergeben die vorherige Darstellung von 2-Ketogulonsäure (2-KLG), welche dann ziemlich einfach zu Ascorbinsäure durch säure- oder basenkatalysierte Cyclisierung umgewandelt werden kann. Daher ist 2-KLG selbst ein Material von beträchtlicher ökonomischer und industrieller Wichtigkeit geworden.
Auf dem Fachgebiet sind derzeit Mittel vorhanden, um relativ reichlich vorkommende gewöhnliche Metaboliten, wie beispielsweise D-Glucose, in 2,5-Diketogluconsäure (2,5-DKG) nach Verfahren, die den Metabolismus von prokaryotischen Mikroorganismen einschließen, umzuwandeln. Siehe beispielsweise US Patent 3,790,444 (5. Februar 1974); 3,998,697 (21. Dezember 1976) und EPA Anmeldungsveröffentlichung Nr. 0046284, veröffentlicht 24. Februar 1982. Die Verfügbarkeit dieses 2,5-DKG-Zwischenproduktes bietet ein Ausgangsmaterial, das in die gewünschte 2-KLG nur durch die einzige Stufe einer Zweielektronenreduktion umgewandelt wird. Die Reduktion kann chemisch durchgeführt oder enzymatisch katalysiert werden. Es sind verschiedene Bakterienstämme bekannt, die diese Reduktion durchführen können. Solche Stämme werden in den Arten Brevibacterium, Arthrobacter, Micrococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus, Citrobacter und Corynebacterium gefunden. Siehe beispielsweise US 3,922,194 (25. November 1975), US 4,245,049 (13. Januar 1981) und US 3,959,076 (25. Mai 1976). Solche Stämme wurden tatsächlich zur Herbeiführung dieser Reduktion verwendet; beispielsweise zeigt die EP-A-0 088 408, welche Stand der Technik gemäß Art. 54(3) EPÜ ist, die Verwendung eines rohen Extraktes von Corynebacterium, um die Reduktion von 2,5-DKG zu 2-KLG durchzuführen. Jedoch erlaubt die Verwendung solcher Stämme per se und ohne Enzymereinigung nicht bestimmte alternative Wege, welche bei Verwendung von gereinigtem Enzym zugänglich sind. Ein solches System würde beispielsweise die kontinuierliche Herstellung durch Immobilisierung des Enzyms auf einem festen Träger erlauben. Weiterhin ist der Zugang zu genetischem Mechanismus zur Herstellung eines solchen Enzyms geeignet, Verbesserungen bei der Durchführung dieses Verfahrens zu machen, da dieser Mechanismus manipuliert und lokalisiert werden kann, um die Herstellung des Enzyms an einem am meisten geeigneten Platz für die Umwandlung von 2,5-DKG zu erreichen. Am wichtigsten unter solchen Orten ist ein Platz innerhalb desselben Organismus, der zur Durchführung der Herstellung von 2,5-DKG in der Lage ist. So wäre ein einziger Organismus fähig, seinen eigenen Mechanismus zur Herstellung von 2,5-DKG und dann zur Umwandlung dieses endogenen 2,5-DKG in situ in das gewünschte Produkt unter Verwendung des 2,5-DKG-Reduktasegens und geeigneter Kontrollsequenzen zur Produktion des Katalysators auszunutzen.
Es ist hilfreich zum Verständnis des Kontextes, in welchem die Erfindung Anwendung findet, das Verfahren in den Termini der relevanten chemischen Umwandlungen wiederzugeben. Eine Aufstellung eines typischen Gesamtverfahrens zur Herstellung von Ascorbinsäure ist im Reaktionsschema 1 gezeigt.
D-Glucose D-Glucon- 2-Keto-D- 2, 5-Diketo- 2-Keto-L- Ascorsäure gluconsre. D-gluconsre. gulonsre. binsre.

Reaktionsschema 1

Das Verfahren beginnt geeigneterweise mit einem für gewöhnlich von einem Mikroorganismus benutzten Metaboliten, wie beispielsweise D-Glucose, welche die für das Reaktionsschema 1 gewählte Illustration darstellt. Durch enzymatische Umwandlungen erfährt D-Glucose eine Reihe von oxidativen Stufen zum Erhalt von 2,5-Diketo-D-gluconsäure. Es ist gezeigt worden, daß diese Reihe von Stufen in einem einzigen Organismus durchgeführt werden kann. (US Patent 3,790,444, EPA-Anmeldung A20046284 (supra); solche Organismen sind beispielsweise von der Art Gluconobacter, Acetobacter oder Erwinia).
Alternative Herstellungsweisen von Ascorbinsäure haben das 2,5-DKG-Zwischenprodukt durch eine Kombination von fermentativen und chemischen Oxidationen umgangen und sie sind deutlich mühseliger als das gezeigte Verfahren. Typisch hierfür ist die Reichstein-Synthese, bei der Diaceton-2-keto-L-gulonsäure als ein Vorläufer für 2-KLG verwendet wird. Dieses Zwischenprodukt wird durch eine Reihe von reduzierenden und oxidierenden Stufen unter Einschluß von Fermentation, Hydrierung und z. B. Permanganat-Oxidation erzeugt, und die erforderliche Sequenz ist deutlich komplexer als die bei den gezeigten Reaktionen vorkommende. Die Umwandlung von 2,5-DKG in 2-KLG kann ebenfalls enzymatisch durchgeführt werden (US Patent 3,922,194; 3,959,076 (supra); und 4,245 049 (13. Jan. 1981).
Derzeit sind Mittel zur Umwandlung des erhaltenen 2-KLG in Ascorbinsäure auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Dies kann entweder in Anwesenheit von verdünnter Säure und Wärme nach der Methode von Yamazaki oder in einem Zweistufenverfahren unter Anwendung von vorhergehender Veresterung in Methanol mit anschließender Lactonisierung in Base durchgeführt werden. Effektive Arbeitsweisen sind in Crawford et al., Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 37, 79-155 (1980) beschrieben. Diese Alternativen sind geradlinig und nützen die größere Stabilität und Lagerbeständigkeit von 2-KLG gegenüber Ascorbinsäure aus. Daher ist es mehr wünschenswert und bequemer, das 2-KLG-Zwischenprodukt für die nachfolgende Umwandlung in das gewünschte Endprodukt zu lagern, als die Ascorbinsäure direkt zu synthetisieren.
Wegen der Verbesserungen der vorliegenden Erfindung sind andere bessere Mittel verfügbar, um bestimmte Aspekte dieser Gesamtumwandlung zu bewirken. Da das für die Umwandlung von 2,5-DKG in 2-KLG verantwortliche Enzym isoliert und gereinigt wurde, kann gemäß einem Weg die Reduktionsstufe unter stärker kontrollierten Bedingungen durchgeführt werden, einschließlich der, bei denen das Enzym immobilisiert ist und die Lösungs-Substrate kontinuierlich über den immobilisierten Katalysator geführt werden. Zusätzlich macht die Verfügbarkeit von Rekombinationstechniken die Herstellung großer Mengen von solchem, für leichte Reinigung zugänglichem Enzym möglich. Weiter erlauben Rekombinationstechniken die Überführung der Codierungssequenzen und der notwendigen Expressionskontrollmechanismen in geeignete Gastorganismen mit verbesserten Charakteristiken. Wenn daher nur die Umwandlung von 2,5-DKG in 2-KLG betrachtet wird, sind drei Verbesserungen erzielbar: 1) genauere Kontrolle gegenüber Variablen; 2) Verfügbarkeit kontinuierlicher Verfahrensführung; und 3) Auswahl eines Gastorganismus für das Enzym, welcher für die Reduktionsreaktion einschlägige, erwünschte Qualitäten hat.
Der Umfang der Verbesserung, ermöglicht durch effektives Klonen und Expression der 2,5-DKG-Reduktase ist jedoch sogar breiter. Wegen der Verfügbarkeit des geeigneten genetischen Mechanismus ist möglich, wie auch erwünscht, einen zur Bildung von 2,5-DKG fähigen Organismus mit dem die Reduktase kodierenden Gen zu transformieren. Auf diese Weise kann derselbe Organismus das gesamte Verfahren der Umwandlung von beispielsweise Glucose oder anderem geeigneten Metaboliten in das stabile, lagerfähige 2-KLG bewirken.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bewirkt dramatische Verbesserungen bei dem Verfahren zur Umwandlung eines gewöhnlich verfügbaren Metaboliten wie Glucose in 2-KLG, einem stabilen, lagerfähigen Vorläufer für Ascorbinsäure. Der Pfad des durch die vorliegende Erfindung beschriebenen Verfahrens umfaßt die Stufe der Umwandlung von 2,5-DKG in 2-KLG. Die laufenden Verfahren zur Bildung des 2-KLG-Zwischenproduktes umfassen höchstens die Entfaltung von wenigstens zwei Organismen oder abgetöteten Kulturen hiervon, erlauben keine Regulierung der verfügbaren Enzympegel und sind auf ansatzweise Verfahren beschränkt.
Ein überwiegender Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von 2,5-DKG-Reduktase in praktisch reiner Form durch eine Reihe von chromatographischen Stufen, welche ein homogenes Produkt (durch HPLC) ergeben. Weitere Gesichtspunkte dieses Aspektes der Erfindung schließen das gereinigte Enzym selbst und die Verwendung dieses gereinigten Enzyms bei der Umwandlung von 2,5-DKG zu 2-KLG ein. Eine solche Umwandlung kann, bevorzugt, unter Verwendung des Enzyms in immobilisierter Form durchgeführt werden.
Ein anderer wichtiger Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren für die Konstruktion eines rekombinanten Expressionsvektors für die Herstellung von 2,5-DKG-Reduktase. Andere Gesichtspunkte dieses Aspektes schließen den so hergestellten Expressionsvektor, mit ihm transformierte Zellen und Zellkulturen und das Produkt solcher Zellen und Zellkulturen, welche zur Durchführung der Reduktion von 2,5-DKG stereospezifisch zu 2-KLG in der Lage sind, ein. Ein noch anderer Gesichtspunkt dieses Aspektes der Erfindung ist ein Verfahren zur Umwandlung von 2,5-DKG zu 2-KLG unter Verwendung von rekombinanter Reduktase.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt einen Expressionsvektor für das 2,5-DKG-Reduktasegen.
Fig. 2 und 3 zeigen die Konstruktion eines alternativen Expressionsvektors für das 2,5-DKG-Reduktasegen.
Fig. 4 zeigt eine Sequenz unter Einschluß des 2,5-DKG-Reduktasegens und der Kontrollbereiche des pTrpl-35-Expressionsvektors.
Fig. 5 zeigt ein gefärbtes Gel von Proteinextrakt aus Erwinia herbicola (ATCC 21998), transformiert mit dem 2,5-DKG- Reduktase-Expressionsvektor, welcher die Sequenz von Fig. 4 hat.

Ins Einzelne gehende Beschreibung

A. Definitionen

"2,5-DKG-Reduktase", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Protein, welches in der Lage ist, die Umwandlung von 2,5-DKG stereoselektiv zu 2-KLG zu katalysieren. In dem spezifischen Beispiel hierin wurde die besondere Form dieses Enzyms, das in Corynebakterium vorliegt, gereinigt, geklont und exprimiert. Jedoch ist es ebenfalls bekannt, daß andere Bakterienarten wie beispielsweise solche der Art Brevibacterium, Arthrobacter, Micrococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Citrobacter und Bacillus ein Enzym mit derselben Aktivität wie dieses Enzym synthetisieren. Diese Arten sind Beispiele für potentielle Quellen für ein ähnliches Enzym zu demjenigen in Corynebacterium vorliegenden, welches zur Katalyse dieser Umwandlung verfügbar sein kann. Alternative Quellen zusätzlich zu diesen natürlich vorkommenden im prokaryotischen Reich können sehr wohl gefunden werden. Da die vorliegende Erfindung die genetische Sequenz, welche solche Enzyme kodiert, veröffentlicht und verfügbar macht, sind zusätzlich Modifikationen der Sequenz, welche die Leistungsfähigkeit dieses Systems nicht stören und diese, tatsächlich, erhöhen können, ebenfalls für den Fachkundigen auf dem Gebiet verfügbar. Solche Modifikationen und geänderten Sequenzen sind in die Definition von 2,5-DKG-Reduktase, wie in dieser Beschreibung verwendet, eingeschlossen. Kurz gesagt hat der Ausdruck 2,5-DKG-Reduktase eine funktionelle Definition und bezieht sich auf ein beliebiges Enzym, welches die Umwandlung von 2,5-DKG zu 2-KLG katalysiert.
Auf dem Fachgebiet ist wohlbekannt, daß zahlreiche der in der vorliegenden Beschreibung diskutierten Verbindungen, wie Proteine, und die sauren Derivate von Sacchariden in einer Vielzahl von Ionisationszuständen in Abhängigkeit von ihren Umgebungsmedien, falls in Lösung oder auf den Lösungen, aus denen sie hergestellt wurden, falls in fester Form, existieren können. Die Verwendung eines Ausdruckes wie beispielsweise Gluconsäure zur Bezeichnung solcher Moleküle dient dazu, alle Ionisationszustände des betreffenden organischen Moleküls einzuschließen. So betrifft beispielsweise sowohl "D-Gluconsäure" als auch "D-Gluconat" dieselbe organische Einheit, und sollen nicht zur Spezifizierung besonderer Ionisationszustände dienen. Es ist wohlbekannt, daß D-Gluconsäure in nicht-ionisierter Form existieren kann, oder, beispielsweise, als Natriumsalz, Kaliumsalz oder anderes Salz verfügbar sein kann.
Die ionisierte oder nicht-ionisierte Form, in welcher die Verbindung in der Veröffentlichung vorliegt, ergibt sich für den Fachmann entweder aus dem Kontext oder ist nicht relevant. So kann das 2,5-DKG-Reduktaseprotein selbst in einer Vielzahl von Ionisationszuständen in Abhängigkeit vom pH existieren. Alle diese Ionisationszustände werden durch den Ausdruck "2,5-DKG- Reduktase" umfaßt.
In gleicher Weise werden "Zellen" und "Zellkulturen" austauschbar verwendet, falls der Kontext es nicht deutlich macht, daß auf das eine oder das andere Bezug genommen wird. Transformation von Zellen oder einer Zellkultur führt zur selben Aktivität; es ist selbstverständlich klar, daß es der Organismus selbst ist, welcher das transformierende Material aufnimmt, obwohl es eine Kultur von ihnen ist, welche mit dem klonenden Träger oder dem anderen transformierenden Mittel behandelt wird. Die Zellen und Mikroorganismen dieser Erfindung sind so definiert, daß sie beliebige bakterielle oder prokaryotische Organismen einschließen.
"Expressionsvektor" schließt Vektoren ein, welche in der Lage sind, hierin enthaltene DNA-Sequenzen zu exprimieren, wo solche Sequenzen durchführbar an andere Sequenzen, die zur Herbeiführung ihrer Expression in der Lage sind, gebunden sind. Es wird einbezogen, obwohl nicht explizit angegeben, daß Expressionsvektoren replizierbar in den Gastorganismen sein müssen, entweder als Episome oder als ein integraler Teil einer chromosomen DNA; selbstverständlich würde ein Mangel an Replizierbarkeit sie effektiv unwirksam machen. Insgesamt wird "Expressionsvektor" auch als eine funktionelle Definition angegeben. Im allgemeinen liegen Expressionsvektoren mit Anwendbarkeit bei Rekombinationstechniken oftmals in Form von "Plasmiden" vor, wobei dieser Ausdruck sich auf kreisringförmige, doppelsträngige DNA-Moleküle bezieht, welche, in ihrer Vektorform, nicht an das Chromosom gebunden sind. Andere effektive Vektoren, die häufig verwendet werden, sind Phagen und nicht-ringförmige DNA. In der vorliegenden Beschreibung werden "Plasmid" und "Vektor" oftmals austauschbar verwendet; jedoch soll die Erfindung solche anderen Formen von Expressionsvektoren einschließen, welche äquivalenten Funktionen dienen und welche bekannt sind oder nachfolgend bekannt werden.
"Rekombinante Zellen" bezieht sich auf Zellen, welche mit Vektoren, die unter Verwendung von Rekombinations-DNA-Techniken konstruiert wurden, transformiert wurden. "Gast"-Zellen bezieht sich auf solche Zellen, bevor sie transformiert wurden. Im allgemeinen erzeugen rekombinante Zellen Proteinprodukte, welche durch solche rekombinante Vektoren kodiert sind und welche sie ohne sie normalerweise nicht produzieren könnten; jedoch umfaßt die Definition ebenfalls Zellen, welche mit Vektoren, die Proteine kodieren, welche koinzidierend in dem bakteriellen Chromosom kodiert oder in anderer Weise endogen in der Empfängerzelle exprimiert sind, transformiert wurden. Die Definition schließt eine beliebige Zelle ein, welche das Produkt einer xenogenen Sequenz aufgrund von Rekombinationstechniken erzeugt.
"Gewöhnlicher Metabolit" bezieht sich auf solche Kohlenstoffquellen, wie sie üblicherweise von Bakterien für das Wachstum ausgenutzt werden. Beispiele solcher Metaboliten sind Glucose, Galactose, Lactose, Fructose oder andere Kohlenhydrate, welche leicht zugängliche Nährstoffe für solche Organismen sind. Solche Metaboliten werden hier so definiert, daß sie enzymatische Derivate solcher Nährstoffe einschließen, welche zu 2,5-Diketo- D-gluconsäure konvertierbar sind. Solche Derivate schließen D-Gluconsäure, D-Mannonsäure, L-Gulonsäure, L-Idonsäure, 2-Keto-D-gluconsäure, 5-Keto-D-gluconsäure und 5-Keto-D-mannonsäure ein.

B. Allgemeine Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen

B.1 Herstellung von praktisch reiner 2,5-DKG-Reduktase

Eine bevorzugte Art, aus welcher ein Organismus zur Herstellung von reiner 2,5-DKG-Reduktase ausgewählt wird, ist Corynebacterium. Jedoch ist die Bakterientaxonomie ausreichend unsicher, so daß es manchmal schwierig ist, die korrekte Bezeichnung zwischen miteinander verwandten Arten sicherzustellen. Jedoch sind zahlreiche dieser Spezien, welche sich als Reduktase enthaltend herausgestellt haben, Glieder der Coryneformgruppe, einschließlich der Arten Corynebacterium, Brevibacterium und Arthrobacter; aufgrund des derzeitigen Wissens scheint es daher so zu sein, daß die bevorzugte Quelle für das Enzym ein Glied der Coryneformgruppe ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Präparation wird Zellkultur unter geeigneten Bedingungen in Abhängigkeit von dem ausgewählten Bakterienstamm bis zu einem OD&sub5;&sub5;&sub0; von etwa 20 oder höher gezüchtet. Die Kultur wird dann zentrifugiert, und die erhaltene Zellenpaste (Pellet) wird zur Lyse der Zellen behandelt. Die Paste wird vorzugsweise vorher in einer Pufferlösung zur Entfernung von verunreinigendem Medium gewaschen, und das gewaschene Pellet wird beispielsweise mit Lysozym oder durch Beschallung oder mit mechanischen Mitteln behandelt, um die Zellen offenzubrechen. Die erhaltenen Extrakte werden dann der Reinigung durch Ionenaustauscherchromatographie, vorzugsweise unter Verwendung eines Trägers auf Zellulosebasis für einen Anionenaustauscher,wie beispielsweise DEAE- Zellulose unterzogen. Andere Anionenaustauscherharze wie beispielsweise QAE oder DEAE-Sephadex können selbstverständlich ebenfalls verwendet werden. Die Elution wird durch auf dem Fachgebiet bekannte Mittel bewirkt, typischerweise und bevorzugt durch Erhöhung der Ionenstärke der Elutionslösung durch Erhöhung der Konzentration von aufgelösten Salzen, vorzugsweise Natriumchlorid. Die Fraktion des 2,5-DKG-Reduktaseaktivität enthaltenden Eluates wird dann weiterhin durch Adsorption auf einem Affinitätschromatographieträger - d. h. einem Trägersystem, an welchem sie kovalent gebunden ist, einem Farbstoff oder anderen organischen Liganden, welcher dem Enzymsubstrat oder seinem Cofaktor ähnlich ist, gereinigt. Falls die mit dem Affinitätsträger zu behandelnde Lösung wesentliche Mengen an gelösten Stoffen enthält, ist eine vorherige Dialyse wünschenswert. Ein besonders effektiver Affinitätschromatographieträger ist Amicon Matrex®-Gel blau A, welches eine Affinität für Enzyme unter Verwendung von NADH oder NADPH aufweist. Die Elution aus solchen Säulen kann durch Erhöhung der Konzentration des Materials, für welches das Enzym eine Affinität aufweist, in der Elutionslösung, in diesem Fall NADP, durchgeführt werden. Die gewünschte DKG-Reduktaseaktivität enthaltenden Fraktionen werden dann zur Gewinnung des reinen Proteins zusammengegeben. Die spezifische Aktivität des reinen Proteins ist größer als 5 Einheiten/mg.
Die endgültige Verifikation der Reinigung wird durch eine Größentrennung unter Verwendung von z. B. Sephadexgelen, Polyacrylamidgelen oder TSK-Sizinggelen unter Anwendung von HPLC erreicht. Für das in Corynebacterium sp ATCC31090 enthaltene Enzym ergibt die Trennung nach der TSK/HPLC-Methode einen Peak, der dem Molekulargewicht 45 000 entspricht und das gesamte Komplement der Aktivität enthält. Wenn das Enzym jedoch SDS-PAGE, entweder unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen, unterworfen wird, wandert das Protein entsprechend einem MW von 34 000. Zusätzliche Charakteristika des Proteins dieser bevorzugten Ausführungsform sind in Beispiel 2 gegeben.
Insgesamt umfaßt die Reinigung des Enzyms die Stufen der Zelllyse, Anionenaustauscherchromatographie, Affinitätschromatographie und Verifikation durch Größentrennung. Mit Ausnahme der Zellyse können die Stufen in beliebiger geeigneter Reihenfolge durchgeführt werden und der Übergang zwischen den Stufen durch Untersuchung der Aktivität entsprechend der Arbeitsweise in Beispiel 2 überwacht werden.

B.2 Umwandlung von 2,5-DKG in 2-KLG unter Verwendung von gereinigtem Enzym

Die Umwandlung kann mit dem gereinigten Enzym entweder in Lösung, oder, bevorzugt, in immobilisierter Form, durchgeführt werden. Da die gewünschte Reaktion eine Reduktion ist, ist eine Quelle an reduzierenden Äquivalenten erforderlich; das Enzym ist spezifisch für NADPH, und daher muß wenigstens eine katalytische Menge des Coenzyms vorhanden sein und die reduzierte Form konstant während des Verfahrens regeneriert werden. Quellen für Elektronen für die Reduktion des Coenzyms können durch ein beliebiges reduziertes Substrat in Kontakt mit einem Enzym für dessen Oxidation wie Glucose/Glucosedehydrogenase; Formiat/Formiatdehydrogenase oder Glutamat/Glutamatdehydrogenase bereitgestellt werden. Die Beobachtung bei der Auswahl einer geeigneten Quelle an Reduktionsäquivalenten schließt die Kosten des Substrates und der Spezifität des die Oxidation katalysierenden Enzyms, welches mit dem NADP-Erfordernis der gereinigten 2,5-DKG- Reduktase kompatibel sein muß, ein. Andere Systeme zur Regenerierung von NADPH-Cofaktoren sind auf dem Fachgebiet bekannt, wobei beispielsweise H&sub2; als Quelle an Reduktionsäquivalenten und Lipoamiddehydrogenase und Hydrogenase oder Ferredoxinreduktase und Hydrogenase als Katalysatoren verwendet werden, wie von Wong, C.H. et al., J. Am. Chem. Soc., 103:6227 (1981) beschrieben ist. Zusätzliche Systeme, welche auf Verfahren in großem Maßstab anwendbar sind, werden von Light, D., et al. 1983 in "Organic Chemicals from Biomass", D.L. Wise, ed., pp.305-358, beschrieben.
Bei einer typischen Umwandlung enthält die Ausgangslösung 2,5-DKG in dem Konzentrationsbereich von etwa 1-200 g/L, bevorzugt ungefähr 10-50 g/L, wobei der pH des Mediums auf etwa 5-7,5, bevorzugt ungefähr 6,4 kontrolliert wird. Der pH kann unter Verwendung geeigneter Puffer wie beispielsweise Phosphatpuffer aufrechterhalten werden. Der Temperaturbereich beträgt etwa 15ºC bis 37ºC, vorzugsweise rund 25ºC. Die Konzentration an reduzierendem Cofaktor NADPH typischerweise rund 0,001 mM bis 2 mM, bevorzugt rund 0,01-0,03 mM, mit ausreichender Quelle an reduzierenden Äquivalenten, um solche Konzentrationen während der Reaktion aufrechtzuerhalten.
Falls das Enzym in Lösung angeliefert wird, liegt seine Konzentration in der Größenordnung von 10 mg/L an Substratmedium, obwohl selbstverständlich die bevorzugte, angewandte Konzentration von der gewünschten Umwandlungsrate und dem spezifischen, ausgewählten Enzym abhängig ist. Falls immobilisierte Enzyme eingesetzt werden, wird die zuvor beschriebene Substratlösung über einen festen Träger geführt, der 2,5-DKG- Reduktase adsorbiert oder kovalent gebunden enthält. Idealerweise enthält der feste Träger ebenfalls einen geeigneten Katalysator, wie er zuvor für die Umwandlung der Quelle an reduzierenden Äquivalenten beschrieben wurde, in ausreichenden Mengen, um die Konzentration an NADPH in der Lösung aufrechtzuerhalten. Beispielsweise enthält die Lösung bei einer typischen Umwandlung eine annähernd äquimolare Menge an Glucose, Formiat, Gluatamat oder aufgelöstem Wasserstoff zu der 2,5-DKG-Konzentration, und der feste Träger enthält ausreichend Reduktionskatalysator, um das durch die gewünschte Umwandlung zu 2-KLG gebildete NADP kontinuierlich rückzuführen.

B.3 Klonen und Expression von 2,5-DKG-Reduktase

Sowohl die Verfügbarkeit von großen Mengen an gereinigter 2,5-DKG-Reduktase als auch ihre Fähigkeit, in situ in einem Organismus, welcher 2,5-DKG macht, gebildet zu werden, wird stark durch das erfindungsgemäße Verfahren unterstützt, welches ein Mittel zum Klonen und zur Expression des Gens für das Reduktaseenzym liefert. Die allgemeine Arbeitsweise, nach welcher dies erreicht wird, wird wie folgt zusammengefaßt, und ein spezifisches Beispiel für solche Arbeitsweisen ist im folgenden in Beispiel 3 angegeben.
Das 2,5-DKG-Reduktase kodierende Gen wird in entweder einem Plasmid oder einem Phagenträger aus einer Genombibliothek kloniert, erzeugt durch partielle Verdauung mit DNA mit hohem Molekulargewicht aus Cornebacterium oder anderer geeigneter Quelle unter Verwendung eines Restriktionsenzyms. Für 2,5-DKG-Reduktase ist ein geeignetes Restriktionsenzym Sau 3A. (Alternativ kann eine Grenzverdauung mit einem Restriktionsenzym mit größerer Spezifität wie BamHI oder PstI benutzt werden.) Die Restriktionsverdauung wird dann an entweder Plasmidvektoren, welche in geeigneten Bakteriengästen replizierbar sind, oder in Phagensequenzen, die zur Vervielfachung in geeigneten Bakterienkulturen fähig sind, verknüpft. Die erhaltenen Plasmid- und Phagenbibliotheken werden dann unter Verwendung von Sonden, welche auf der bekannten partiellen Sequenz des 2,5-DKG-Reduktaseproteins (siehe Beispiel 2) aufgebaut sind, ausgesiebt. Die Effizienz des Sondendesigns kann durch Auswahl solche Kodone für die Sondenkonstruktion verbessert werden, welche bekanntermaßen von bakteriellen Gästen bevorzugt werden. Die Identifizierung der gewünschten Klone aus den Plasmid- und Phagenbibliotheken wird am besten durch eine Reihe von Sonden durchgeführt, so daß das gewünschte Gen an alle Sonden unter geeignet strengen Bedingungen hybridisiert und falsche Positive von der Verwendung nur einer eliminierten Sonde ausgeschlossen werden. Bei der Gewinnung von Kolonien oder Phagen, welche erfolgreich bei der Hybridisierung mit den als Sonden bereitgestellten Oligonucleotiden sind, wird die Identität der Sequenz mit dem gewünschten Gen durch direkte Sequenzierung der DNA und durch in vivo-Expression zur Gewinnung des gewünschten Enzyms bestätigt.
Das vollständige funktionelle Gen wird in einen geeigneten Expressionsvektor verknüpft, der einen Promotor und einen Ribosombindeplatz enthält, der in der Gastzelle, in welche die Kodierungssequenz überführt wird, wirksam ist. Bei dem derzeitigen Stand auf dem Fachgebiet gibt es eine Anzahl von Promotions/Kontrollsystemen und geeigneten,verfügbaren prokaryotischen Gästen, welche für die vorliegende Erfindung geeignet sind. Ähnliche Gäste können sowohl für das Klonen als auch für die Expression verwendet werden, da Prokaryoten im allgemeinen bevorzugt für das Klonen von DNA-Sequenzen sind, und das Verfahren der 2-KGL-Produktion am geeignetsten mit solchen mikrobiellen Systemen verbunden wird. E. coli K12 Stamm 294 (ATCC No. 31446) ist besonders brauchbar als Klonungsgast. Andere mikrobielle Stämme, welche verwendet werden können, schließen ein E. coli Stämme wie E. coli B, E. coli X1776 (ATCC No. 31537) und E. coli DH-1 (ATCC No.33849). Für die Expression können die zuvorgenannten Stämme wie auch E. coli W3110 (F&supmin;, λ&supmin;, prototroph, ATTC No.27325), Bazillen wie Bacillus subtilus und andere Enterobakterien wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcesans und verschiedene Pseudomonas-Spezien verwendet werden. Eine besonders bevorzugte Gruppe von Gästen schließt solche Kulturen ein, welche in der Lage sind, Glucose oder einen anderen üblicherweise verfügbaren Metaboliten zu 2,5-DKG umzuwandeln. Beispiele solcher Gäste schließen Erwinia herbicola ATCC No. 21998 (auch angesehen als Acetomonas albosesamae in US-Patent 3 998 697); Acetobacter melanogeneum, IFO 3293, Acetobacter cerinus, IFO 3263 und Gluconobacter rubiginosus, IFO 3244 ein.
Im allgemeinen werden Plasmidexpressions- oder Klonungsvektoren, welche Replikations- und Kontrollsequenzen enthalten, die von mit der Gastzelle verträglichen Spezien abstammen, in Verbindung mit diesen Gästen eingesetzt. Der Vektor trägt üblicherweise einen Replikationsplatz, ebenso Markierungssequenzen, welche in der Lage sind, phenotypische Auswahl in transformierten Zellen bereitzustellen. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322, einem Plasmid, abstammend von einer E. coli Spezies (Bolivar, et al., Gene 2: 95 (1977)) transformiert. pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinwiderstandsfähigkeit und liefert so ein einfaches Mittel zur Identifizierung von transformierten Zellen. Zur Verwendung bei der Expression muß das pBR322-Plasmid oder ein anderes mikrobielles Plasmid ebenfalls Promotoren enthalten oder so modifiziert sein, daß es Promotoren enthält, die von dem mikrobiellen Organismus für die Expression seiner eigenen Proteine ausgenutzt werden können. Solche Promotoren, die am häufigsten bei der Konstruktion von rekombinanter DNA verwendet werden, schließen die β-Lactamase (Penicillinase)- und Lactose-promotorsysteme (Chang et al, Nature, 275: 615 (1978); Itakura, et al., Science, 198: 1056 (1977); (Goeddel, et al Nature 281: 544 (1979)) und ein Tryptophan-(trp)-Promotorsystem (Goeddel, et al, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EPA Anmeldungs-Veröffentlichung No. 0036776) ein. Während dies die am häufigsten verwendeten Promotoren sind, wurden andere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet, und Einzelheiten hinsichtlich ihrer Nucleotidsequenzen wurden veröffentlicht, wodurch der Fachmann in die Lage versetzt wird, sie funktionell in wirksamer Beziehung zu Genen in Transformationsvektoren zu verknüpfen (Siebenlist, et al, Cell 20: 269 (1980)).
Durch geeignetes Spalten und Verknüpfen von DNA-Sequenzen, die in die zuvor erwähnten Vektoren und Promotoren eingeschlossen sind, mit Gensequenzen, hergestellt wie zuvor ausgeführt und 2,5-DKG-Reduktase kodierend und durch Weglassen irgendwelcher nicht erforderlichen oder hemmenden Sequenzen werden prokaryotische Gastzellen so transformiert, daß sie dazu gebracht werden, das Enzym zu produzieren. Das Enzym kann dann entweder gereinigt werden, wie zuvor ausgeführt, die intakten oder zerbrochenen Zellen können direkt als Katalysatoren verwendet werden, oder alternativ kann der Gast so ausgewählt werden, daß er, nachdem er einmal transformiert wurde, in der Lage ist, die gesamte Umwandlung von Glucose oder einem anderen geeigneten Metaboliten zu dem gewünschten 2-KLG-Produkt durchzuführen.

C. Bei der Erfindung angewandte allgemeine Methoden

In den nachfolgenden Beispielen wurden die folgenden allgemeinen Arbeitsweisen in Verbindung mit der Sondenkonstruktion, dem Aussieben, der Hybridisierung der Sonde an das gewünschte Material und bei der Vektorkonstruktion angewandt.

C.1 Sondenpräparation

Synthetische DNA-Sonden wurden nach der Methode von Crea, R. und Horn, T., Nucleic Acids Res., 8: 2231 (1980) mit der Ausnahme hergestellt, daß 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonyl-3- nitro-1,2,4-triazol (TPS-NT) als Kupplungsmittel verwendet wurde (de Roo&ijlig;, J. et al., Rec. Trav. Chim. Pays-Bas, 98: 537 (1979))

C.2 Isolierung von Plasmiden, Spaltung mit Restriktionsenzymen

Es wurden Plasmide aus den angegebenen Kulturen unter Verwendung der geklärten Lysatmethode von Clewell, D.B. und Helinski, Biochemistry 9: 4428 (1970), auf welche hiermit Bezug genommen wird, isoliert und durch Säulenchromatographie auf Biorad A-50 Agarose gereinigt. Kleinere Mengen (Mini-preps) wurden unter Verwendung der Arbeitsweise von Birnboim, H.C. Nucleic Acids Research, 7: 1513 (1979) hergestellt.
Fragmente der geklonten Plasmide wurden für das Sequenzieren durch Behandlung von etwa 20 ug der Plasmide mit 10 bis 50 Einheiten des geeigneten Restriktionsenzyms oder der Sequenz der Restriktionsenzyme in annähernd 600 ul Lösung, welche den geeigneten Puffer für das verwendete Restriktionsenzym (oder die Sequenz der Puffer) enthielt, hergestellt; jede Enzyminkubation erfolgte bei 37ºC für eine Stunde. Nach der Inkubation mit jedem Enzym wurde das Protein entfernt und Nucleinsäuren durch Phenol-Chloroformextraktion und Ethanolfällung gewonnen. Alternativ wurden Plasmide durch DNAase-I-Verdauung in Anwesenheit von MnCl&sub2;(Anderson, S. (1981). Nucleic Acids Res. 9, 3015) oder durch Beschallung (Deininger, P.L. (1983). Analyt. Biochem. 129, 216) fragmentiert.
Nach der Spaltung wurde die Präparation für eine Stunde bei 37ºC mit 10 Einheiten Klenow DNA-Polymerase oder T4 DNA- Polymerase in 100 ul Klenow-Puffer (50 mM KPi, pH 7,5, 7 mM MgCl&sub2;, 1 mM BME), der 50 nmol dNTP enthielt, behandelt. Das Protein wurde entfernt, und die Nucleinsäuren, wie zuvor, gewonnen und die Nucleinsäuren in 40 ul an Beladungspuffer für die Beladung auf 6% Polyacrylamidgel, wie zuvor beschrieben, für die Größentrennung suspendiert. (Alternativ können Fragmente direkt in einen M13-Vektor kloniert werden.)
Die DNA-Sequenzierung wurde nach der Dideoxynucleotidkettenabschlußmethode (Sanger, F. et al (1977). Prox. Natl. Acad. Sci., USA 74, 5463) nach Klonen der Fragmente in einen von M13 abgeleiteten Vektor (Messing et al (1981), Nucleic Acids Res. 9, 309) durchgeführt.

C.3 Verknüpfungsarbeitsweisen

DNA-Fragmente einschließlich gespaltener Expressionsplasmide wurden durch Vermischen der gewünschten Komponenten (z. B. Vektorfragment, geschnitten aus 0,25 ug Plasmid, wird mit Insertschnitt aus 1 ug Plasmid in 20 ul Reaktionsgemisch vermischt, verknüpft, wobei diese Komponenten am Ende geeignet zugeschnitten waren, um ein korrektes Einfangen zu ermöglichen, mit T4 DNA-Ligase. Annähernd 10 Einheiten Ligase waren für ug-Mengen an Vektor und Insertkomponenten erforderlich. Die erhaltenen Plasmidvektoren wurden dann durch Transformation von E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31446) oder DH-I (ATCC 33849) geklont. Die Transformation und das Klonen und eine Auswahl von transformierten Kolonien wurden, wie zuvor beschrieben, durchgeführt. Die Anwesenheit der gewünschten Sequenz wurde durch Isolierung der Plasmide aus ausgewählten Kolonien und DNA-Sequenzierung, wie zuvor beschrieben, bestätigt.

Präparation A

Isolierung und Charakterisierung von Natrium (Calcium)-2,5- diketo-D-gluconat

Da 2,5-DKG nicht leicht im Handel erhältlich ist, wurde es durch Isolierung aus Erwinia herbicola, (ATCC 21998) oder aus Acetobacter cerinus, IFO 3263 hergestellt. Natrium-2,5-diketo- D-gluconat wurde aus der Erwinia-Fermentation durch Durchführen der Nährlösung durch AGI-X8, 100-200 mesh Anionenaustauschersäule, Waschen mit Wasser und Elution mit 0,05 N HCl isoliert. 2,5-Diketo-D-gluconsäure enthaltende Fraktionen wurden zusammengegeben, mit Natriumbicarbonat auf pH 5,5 neutralisiert und zur Trockne lyophilisiert. (Siehe beispielsweise Bernaerts, M. et al; Antonie van Leeuwenhoek 37: 185 (1971)).
Die Charakterisierung wurde nach Methoden, welche für organische Säuren brauchbar sind, unter Einschluß von HPLC und TLC (Gossele, F. et al., Zbl. Bokt. Hyg., 1: Abt.Orig. C.178 (1980)) durchgeführt. ¹³C NMR und die Bildung
des Bis-2,4-dinitrophenylhydrazons, wie von Wakisika, Y. Agr. Biol. Chem. 28: 819 (1964) beschrieben, bestätigten die Identität der Verbindung. (Alternativ kann das Calciumsalz durch Durchführen der konzentrierten Nährlösung durch eine Säule eines Kationenaustauscherharzes (Dowex 50, Ca²&spplus;-Form) mit anschließender Elution mit Wasser hergestellt werden. Fraktionen mit einem Gehalt von 2,5-DKG, ermittelt durch HPLC- Analyse, werden zusammengegeben und lyophilisiert, um ein blaßgelbes Calciumsalz zu ergeben.)
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung jedoch nicht der Beschränkung der Erfindung:

Beispiel 1 -- Isolierung und Reinigung von 2,5-DKG-Reduktase aus Corynebacterium

A. Zell-Lyse und Extraktion

Cornebacterium sp. ATCC 31090 wurde in einem 10 l Fermenter gezüchtet und während des log-Phasen-Wachstums geerntet. Die Zellpaste wurde durch Zentrifugieren der Fermentationslösung gewonnen und bei -20ºC gelagert. 450 g der Zellenpaste wurden aufgetaut, in 650 ml 20 mM Tris-puffer pH 8,0, 0,5M NaCl zum Waschen der Zellen resuspendiert, und die Zellen durch Zentrifugieren erneut geerntet, gefolgt von einer Suspension in 650 ml Tris-puffer mit einem Gehalt von 2 mg/ml Lysozyme zur Freisetzung intrazellulärer Proteine. Die Zelltrümmer wurden von dem löslichen Material durch Zentrifugieren abgetrennt, und das erhaltene Pellet wurde mit Tris-puffer mit einem Gehalt von 0,1% (Gew./Gew.) Tween 80, einem nicht-ionischen Detergens, reextrahiert. Die Extrakte wurden auf 2,5-DKG-Reduktaseaktivität untersucht und zusammengegeben.

B. Ionenaustauscherchromatographie

Der rohe Zellenextrakt (1260 ml) wurde ansatzweise auf Diethylaminoethylcellulose (Whatman DE-52, 250 ml naß abgesetztes Volumen) adsorbiert, und für 0,5 h bei Zimmertemperatur gerührt, anschließend das DE-52 Harz in einem Glasfiltertrichter gewonnen. Das DE-52 Harz wurde in eine 5·30 cm Säule gepackt und mit Tris-puffer gewaschen, bis die Basislinie sich aufgebaut hatte (A280 = 0,7, A260/A280 = 1,7, was anzeigt, daß Nucleinsäuren langsam aus der Säule ausgewaschen wurden). Die Säule wurde dann mit einem 0-1M linearen NaCl-Gradienten (1200 ml) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 110 ml/h eluiert, und die Fraktionen wurden gesammelt und auf DKG-Reduktaseaktivität untersucht. Zwei ausgeprägte Peaks der Aktivität zur Katalyse der DKG-Reduktion wurden gefunden: ein Peak, eluierend bei annähernd 0,4M NaCl, enthielt die gewünschte 2,5-DKG-Reduktase (die 2,5-DKG in 2-KLG umwandelt); ein anderer Peak, eluierend bei annähernd 0,25M NaCl, wandelte 2,5-DKG nicht in 2-KLG um.

C. Affinitätschromatographie

Der bei 0,4M eluierende Peak aus der DE-52-Säule wurde über Nacht gegen 20 mM Tris pH 8,0 dialysiert, auf eine 2,5·4,5 Säule mit Amicon Matrex Gel Blue A aufgegeben; (dieses Harz besteht aus Agaroseperlen mit einem kovalent gebundenen Farbstoff (Cibacron blue F3GA), welcher eine Affinität für Enzyme besitzt, die NADH oder NADPH als Cofaktor benutzen). Die Säule wurde mit Tris-Puffer gewaschen und mit 1,0 mM NADP eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und auf DKG-Reduktaseaktivität untersucht, und der Zusammenschnitt der Aktivität wurde 16-fach durch Ultrafiltration (gerührte Amicon-Zelle, YM-5-Membrane) konzentriert.

D. Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)

Das konzentrierte Material aus der Blue A-Säule wurde über Nacht gegen 20 mM Tris pH 8,0 dialysiert und auf eine Altex TSK-Säule (0,5·60 cm), gepuffert mit 200 mM Ammoniumbicarbonat aufgegeben. (Die TSK-Säule trennt Proteine nach dem Molekulargewicht.) Die 2,5-DKG-Reduktaseaktivität eluierte in einem einzigen Peak, der einer Molekülaktivität entspricht, die in einem einzigen Peak, der einem Molekulargewicht von 45 000 Daltons entspricht, eluierte und zeigte > 99% Reinheit -- d. h. war homogen nach diesem Kriterium.

Beispiel 2 -- Charakterisierung von Corynebacterium-2,5-DKG- reduktase

A. Elektrophorese

Das Enzym wurde in einem Acrylamidgel bei Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat (SDS) elektrophoriert. Unter sowohl nicht-reduzierenden als auch reduzierenden Bedingungen wurde eine einzelne Proteinbande mit einem Molekulargewicht von annähernd 34 000 Daltons gefunden. Es wurde kein Protein in dem Bereich von 45 000 Dalton gefunden (wie dies bei der HPLC gefunden wurde).

B. N-Endständige Aminosäuresequenz

Aminosäuresequenzdaten zeigen, daß das gereinigte Enzym eine einzelne N-endständige Sequenz enthält. (u = nicht bestimmt)

C. Aminosäurezusammensetzung

Die Daten der Aminosäurehydrolyse ergeben folgende Zusammensetzung:

AA Mol-%

asx 11,52
thr 4,75
ser 3,85
glx 10,47
pro 6,15
gly 8,22
ala 14,69
cys 0,00
val 7,47
met 1,36
ile 4,82
leu 7,90
tyr 2,40
phe 2,37
his 3,67
lys 3,10
arg 5,21
trp 2,05

D. Kinetische Parameter, Substratspezifität und Cofaktorerfordernisse

Die folgenden Untersuchungsbedingungen wurden zur Bestimmung der kinetischen Parameter angewandt:
Natriumphosphatpuffer 150 mM, pH 6,4, 25ºC
NADPH 11-300 uM
Enzym 10 ug
2,5-DKG 0,43-43 mM
Untersuchungsvolumen 1,0 ml
Michaelis-Konstanten (Km) 2,5-DKG 15,5 mM
NADPH: 33,7 uM
Maximale Geschwindigkeit (Vmax) 9,8 Einheiten/mg (1 Einheit = 1,0 uMol/min)
Das Enzym ist spezifisch für NADPH. Es wurde keine Aktivität mit 2-KDG, 5-KDG, D-Gluconsäure, 2-KLG, NADH beobachtet.
Keine Veränderung der Aktivität wurde bei Anwesenheit von Mg&spplus;&spplus;, Mn&spplus;&spplus;, Ca&spplus;&spplus;, Zn&spplus;&spplus;, EDTA, Cystein, ADP, ATP beobachtet.

E. pH-Optimum

Maximale Aktivität wurde bei pH 6,4 beobachtet. Das Enzym ist über einen breiten pH-Bereich von 5,0-7,6 aktiv.

F. Stereospezifität und quantitative Umwandlung

Um die Umwandlung von 2,5-DKG in 2-KGL zu quantifizieren, wurde eine Reaktion bei einem Gehalt von 2-DKG, 1,33 mM NADPH, 0,3 mg 2,5-DKG-Reduktase in 1 ml 0,1M Tris: Cl pH 7,5 durchgeführt. Nach 5 h bei 25ºC hatte die Reaktion abgestoppt und wurde auf NADPH-Oxidation und 2-KLG-Produktion analysiert. Eine Veränderung in der Absorption bei 380 nm, entsprechend zu 0,40 mM oxidierter NADPH wurde beobachtet. Die HPLC-Analyse auf einer Säule organischer Säuren zeigte einen einzigen Peak entsprechend 0,42 mM 2-KLG. Keine 2-KDG (2-Keto-D-gluconsäure) oder 5-KDG (5-Keto-D-gluconsäure) wurde beobachtet. Die HPLC-Analysen wurden durch Analyse der GCMS von per-trimethylsilylierten Derivaten, hergestellt durch Zugabe von Trimethylsilylimidazol/Pyridin: 50/50 zu einem lyophilisierten Reaktionsgemisch für 30 min bei 90ºC, auf einer 25 m 5% vernetzten Phenylmethylsilikon- geschmolzenen Siliziumdioxidgebundenen Kapillarsäule verifiziert. Die Schichtchromatographie stimmt mit den zuvorgenannten Ergebnissen ebenfalls überein.

Beispiel 3 -- Rekombinante 2,5-DKG-Reduktase

A. Sondendesign

Der Tm-Wert von Corynebacterium sp. (ATCC 31090) DNA wurde gemessen und zu 81,5ºC in 7,5 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA (pH 6,8) gefunden. Dies entspricht einem G+C-Gehalt von 71% unter Verwendung von Pseudomonas aeruginosa DNA (Tm = 79,7ºC, G+C = 67%) als Standard. Daher wurden bei den Konstruktionen solche Codone, welche bekannterweise in bakteriellen DNA's mit hohem G+C-Gehalt vorherrschen (Goug, M., et al Nucleic Acids Res. 10, 7055 (1982)) verwendet: phe, TTC; lys, AAG; val, GTG; pro, CCG; ala, GCC; asp, GAC; gln, CAG; arg, CGC; glu, GAG; asn, AAC; ser, TCC; ile, ATC; leu, CTG; gly, GGC; tyr, TAC. Die partielle Aminosäuresequenz der 2,5-DKG-Reduktase aus Corynebacterium sp. (ATCC 31090) ist in Beispiel 2 gezeigt; diese Sequenz und die zuvorgenannten Codone wurden benutzt, um geeignete Sonden zu konstruieren, wobei die Methode von Anderson und Kongston (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6838 [1983]) verwendet wurde. Zwei 43-mere wurden nach der Phosphotriestermethode von Crea, R. et al., Nucleic Acids Res., 8: 2331 (1980) synthetisiert
Die Oligonucleotidsonden wurden mit 100 uCi [γ&supmin;³² P] (5000 Ci/mmol, Amersham) und Polynucleotidkinase (P-L-Biochemicals) phosphoryliert.

B. Konstruktion einer Plasmidgenombibliothek

Genom-DNA wurde aus Corynebacterium sp. ATCC 31090 nach der Methode von Schiller et al. Antimicro. Agents Chemotherapy, 18, 814 (1980) isoliert. Große Fragmente (> 100 kb) wurden durch CsCl-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und partiell mit Sau 3A digestiert. Das digestierte Produkt wurde durch Agarosegelelektrophorese zu Größenklassen von 1-2 kb, 2-3 kb, 3-4 kb und 4-6 kgb größenfraktioniert. Eine Genombibliothek wurde aus jeder Größenklasse von DNA-Fragmenten unter Verwendung der Vektoren pBR322 und pACYC184 (Bolivar, F. et al Gene 2, 95 (1977)); Chang, A.C.Y. und Cohen, S.N. J. Bacteriol. 134, 1141 (1978)) durch Spaltung des BamHI- Platzes und Insertion der Sau3A-Fragmente unter Verwendung von T4 DNA-Ligase hergestellt. Die erhaltenen Plasmide wurden eingesetzt, um ein recA&supmin;-Derivat von E. coli Stamm MM294.
(ATCC 31446) oder DH-1 (ATCC 33849) unter Anwendung des Transformationsprotokolls von D. Hanahan (J. Mol. Biol., 166, 557 1983), auf welche hiermit Bezug genommen wird, zu transformieren. Jede Genombibliothek enthielt 10&sup4;-10&sup5; unabhängige Rekombinanten. (Bei einer alternativen Arbeitsweise können zusätzliche Plasmidbibliotheken in pBR322 unter Verwendung von BamHI-Fragmenten (Größenbereich 2,0-2,5 Kb) und Pst-Fragmenten (Größenbereich 0,5-1,5 Kb) von Corynebacterium sp. (ATCC 31090)-DNA hergestellt werden.)

C. Aussieben der Plasmidbibliothek in E. coli

Die Kolonien wurden in Mikrotiterplatten eingegeben, über Nacht inkubiert und auf Mitrocellulosefilter (BA85), die auf LB-Platten mit einem Gehalt von Ampicillin oder Chloramphenicol angeordnet waren, aufgedrückt. Die verbleibenden Portionen der Kolonien in den Mikrotiterschalen wurden durch Zugabe von 25 ul von 42%iger DMSO und Lagerung bei -20ºC konserviert.
Die überführten Portionen der Kolonien wurden für 8 bis 9 Stunden bei 37ºC inkubiert und durch Überführung der Filter auf Platten mit einem Gehalt von 12,5 ug/ml Chloramphenicol oder Spectinomycin und Inkubieren bei 37ºC über Nacht vervielfacht.
Die Plasmidbibliothek in E. coli wird durch Filterhybridisierung ausgesiebt. Die DNA wird denaturiert und an Duplikatfilter gebunden, wie von Itakura, K. et al. Nucleic Acids Res. 9: 879-894 (1981) beschrieben. Die Filter für die Hybridisierung werden in etwa 10 ml pro Filter von 5X SET, 5X Denhardt'sche Lösung und 50 ug/ml denaturierter Lachssperma- DNA und 0,1% Natriumpyrophosphat + 20% Formamid (5X SET = 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA, 500 mM NaCl, 5X Denhardt'sche Lösung = 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% Polyvinylpyrolidon, 0,1 96 Ficoll, siehe Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Comm., 23: 641 (1966)) benetzt. Die Filter werden unter kontinuierlichem Rühren bei 42º für 14-16 h vorhybridisiert und mit 1·10&sup8; cpm der Sonde, so hergestellt wie in Unterabschnitt A dieses Beispiels, bei 42ºC versetzt.
Die Filter, welche mit den Sonden von Unterabschnitt A hybridisiert wurden, werden mit 0,2·SSC, 1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat bei 42ºC für 3·30 min gewaschen. Jedes der Duplikatfilter wird trockengelöscht, auf Karton montiert und Kodak XR5 Röntgenfilm mit Dupont Cronex 11R Xtra life Lightning-plus Intensivierungsschirmen bei -70ºC für 4-24 h exponiert.
Zellen aus positiven Kolonien wurden aufgezüchtet und es wurde Plasmid-DNA nach der Methode von Clewell und Helinski (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 1159 (1969)) isoliert. DNA wurde mit AluI und PstI fragmentiert und in die Vektoren M13mp8 und M13mp9 (Messing, J. und Viera, J. (1982) Gene 19, 269) subkloniert. Subklone, die an den Sonden hybridisierten, wurden unter Anwendung der Dideoxy-Kettenabschlußmethode (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977)) sequenziert, um zu verifizieren, daß die DNA für die 2,5-DKG-Reduktase kodierte.

D. Konstruktion von Expressionsvektoren für 2,5-DKG-Reduktasegen

Das 2,5-DKG-Reduktasegen, begleitet von entweder seinem eigenen oder einem synthetischen Bindungsplatz, wird "strömungsabwärts" von dem E. Coli trp (oder tac)-Promotor oder dem pACYC184 CAT- Promotor auf Expressionsplasmiden, die ebenfalls ein tetracyclinresistentes Gen oder einen anderen selektierbaren Marker und einen Ursprung von Replikation, abstammend von Plasmiden ColE1, 15A oder RSF1010, enthalten, eingesetzt. Einige Konstrukte können zusätzlich ein aktives Gen, kodierend für E. Coli trp-Repressor oder den E. Coli lac-Repressor, welches die Regulierung der Expression des 2,5-DKG-Reduktasegens durch exogen zugesetzte Indolacrylsäure oder IPTG erlaubt, enthalten. Verschiedene mutierte Versionen der obigen Plasmide werden ebenfalls zur Expression von 2,5-DKG-Reduktase benutzt.

Konstruktion von Expressions-Vektor für 2,5-DKG-Reduktase

Ein geklontes 2,2 Kb BamHI-Fragment von Corynebacterium sp (ATCC 31090)-DNA, enthaltend einen Abschnitt des 2,5-DKG-Reduktasegens, wurde mit den 43-mer-Sonden isoliert, wie in Beispiel 3 beschrieben. Ein 0,12 Kb PstI/BamHI-Fragment dieses Plasmids wurde weiter als eine Sonde zur Isolierung eines überlappenden 0,88 Kb PstI-Fragmentes von Corynebacterium sp-DNA, welche den Rest des Gens enthielt, verwendet. Wie in Fig. 2 beschrieben, wurde pDKGR2 (enthaltend das 2,2 Kb BamHI-Fragment) mit NcoI digeriert, mit E. Coli-DNA-Polymerase I Klenow-Fragment und dNTPs zur Erzeugung von glattendiger DNA behandelt, dann weiter mit BamHI zur Freisetzung eines 0,87 Kb Fragmentes digeriert; dieses Fragment wurde durch Elektrophorese auf Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt. Das Plasmid pDKGR9 (enthaltend das 0,88 Kb PstI Fragment) wurde mit PstI und BamHI digeriert, und das erhaltene 0,76 Kb Fragment in ähnlicher Weise auf Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt isoliert. Das 0,87 Kb NcoI/BamHI Fragment und das 0,76 Kb BamHI/PstI Fragment wurden dann kombiniert mit Sma I/PstI - digeriertem M13mp9 und verknüpft, um einen M13-Rekombinaten ("mit12") mit einem 1,6 Kb Einschub von Corynebacterium sp-DNA, enthaltend das gesamte 2,5-DKG-Reduktasegen (Fig. 2), zu erhalten.
An mit12-einzelsträngige DNA wurde ein "Löschprimer" (Sequenz AGGGGCAGTGAATTCTATGACAGTTCCCAGC) und AluI Fragmente von M13mp9-DNA annelliert. Diese Kombination Schablone-Primer wurde dann mit E. Coli-DNA-Polymerase-Klenow-Fragment in Anwesenheit von dNTPs und T4 DNA-Ligase zur Erzeugung von Hetero-duplexmit12-RF-Molekülen, wie von Adelman et al., (DNA 2, 183 (1983) beschrieben, in vitro behandelt. Diese Moleküle wurden verwendet, um den Gast tM101 und rekombinante Phage, beinhaltend den gewünschten Löschprimer als Sonde (Adelman et al., (DNA 2, 183 (1983)), zu transformieren. Diese Konstruktion wurde als mit12Δ (Fig. 3) bezeichnet.
Die mit12Δ RF-DNA wurde mit EcoRI und HindIII digeriert, um ein 1,5 Kb Fragment, enthaltend das 2,5-DKG-Reduktasegen, zu ergeben. Das menschliches Wachstumshormon-Expressionplasmid, pHGH207-1ptrp ΔR15', (pHGH207-1ptrp ΔR15' ist ein Derivat von pHGH207-1 (de Boer et al., (1983), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80, 21), in dem der EcoRI-Platz zwischen dem Ampicillinresistenzgen und dem trp-Promotor weggelassen wurde) wurde mit EcoRI und PstI digeriert, um ein 1,0 Kb Fragment zu erhalten, das den E. Coli trp-Promotor enthält, und pBR322 wurde mit PstI und HindIII digeriert, um ein 3,6 Kb Fragment zu erhalten. Diese drei Fragmente wurden miteinander verbunden, um ein Expressionsplasmid für 2,5-DKG-Reduktase, bezeichnet pmit12Δ/trpI (Fig. 3), zu bilden. Diese Plasmid war nicht fähig, Gastzellen Tetracyclinresistenz zu erteilen. Ein Plasmid, das eine vollständige Tetracyclinresistenzfunktion kodieren würde, wurde wie folgt konstruiert. pmit12Δ/trpI-DNA wurde mit HindIII digeriert, mit E. Coli-DNA-Polymerase I Klenow-Fragment und dNTPs zur Bildung von glattendiger DNA behandelt, dann digeriert SphI; das erhaltene 5,6 Kb Fragment wurde durch Elektrophorese auf niedrigschmelzender Agarose gereinigt. In ähnlicher Weise wurde pBR322 DNA mit EcoRI digeriert, mit E. Coli-DNA- Polymerase I Klenow-Fragment und dNTPs behandelt, mit SphI digeriert, und das erhaltene 0,56 Kb Fragment auf niedrigschmelzender Agarose gereinigt. Die 5,6 Kb und 0,56 Kb Fragmente wurden dann miteinander verknüpft, um ein tetracyclinresistentes 2,5-DKG-Reduktase-Expressionsplasmid, bezeichnet als ptrpI-35 (Fig. 3) zu ergeben. Die DNA-Sequenz des trp- Promotors, des synthetischen Bindungsplatzes und des auf diesem Plasmid enthaltenen 2,5-DKG-Reduktasegens ist in Fig. 4 gezeigt.

E. Herstellung von rekombinanter 2,5-DKG-Reduktase

Es werden Zellen zur Transformation nach der Methode von Lacy und Sparks, Ph to atholo ical Societ, 69:1293-1297 (1979) hergestellt. Kurz gesagt, wird eine Schleife von geeigneten Gastzellen, Erwinia herbicola (ATCC 21998) oder E. Coli MM294 ATCC 314646) in 5 ml LB-Medium eingeimpft und bei 30ºC für 14-16 h inkubiert. Eine 1:100-Verdünnung dieses Übernacht- Wachstums wird in LB eingeimpft, die Kultur bis OD&sub5;&sub5;&sub0; von 0,4 gezüchtet und die Zellen durch Zentrifugieren bei 4ºC gewonnen. Das Pellet wird in 1/3 Volumen von 10 mM NaCl resuspendiert, erneut bei 4ºC zentrifugiert, das Pellet in einem gleichen Volumen von 30 mM CaCl&sub2; resuspendiert, und nach 60 Minuten bei 0ºC werden die Zellen erneut bei 4ºC zentrifugiert. Das Pellet wird in 1/12 Volumen von 30 mM CaCl&sub2; resuspendiert und bei 4ºC über Nacht aufbewahrt. (Alternativ können die Zellen in 30 mM CaCl&sub2;, 15% Glycerin resuspendiert und bei -70ºC aufbewahrt werden)
Die Transformation wird durch Inkubation von 1 ug Plasmid in 0,2 ml kompetenter Zellen bei 0ºC für 2 h, gefolgt von Erhitzen auf 42ºC für 1 min, durchgeführt. 3 ml LB-Brühe wird zugesetzt, und die Zellen werden sich für 4 h bei 37ºC erholen gelassen, dann werden die Zellen auf selektives Medium, wie von Lacy und Sparks (supra) beschrieben, auf Platten überführt. Erfolgreiche Transformanten werden in LB-Brühe bis zu einer Dichte OD&sub5;&sub5;&sub0; = 1,0 wachsen gelassen, dann zentrifugiert und in minimalem Medium in Anwesenheit von 0,2% Glucose resuspendiert. IAA oder IPTG wird dann zu dem Medium zugesetzt, und nach 0,5-1,0 h werden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen und durch Behandlung mit Lysozym und einem Detergens (Tween 80) lysiert.
Die überstehende Flüssigkeit wird auf Anwesenheit von 2,5-DKG- Reduktase untersucht, wie in Beispiel 2D. ausgeführt (Tabelle 1), und die Proteine werden mittels SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese (Fig. 5) analysiert. Die Proteinbande, welche die rekombinante 2,5-DKG-Reduktase wiedergibt, wurde immunologisch unter Anwendung der Western-Blottingarbeitsweise (Tobin, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350 (1979) identifiziert.

Tabelle I

Extrakt 2,5-DKG-Reduktase-Aktivität spez. Absorption (340 nm) min&supmin;¹/ 100 ul)
pBR322 transformiert Erwinia herbicola (ATCC 21998) -0,087
ptrpI-35 transformiert Erwinia herbicola (ATCC 21998) -1,925

Beispiel 4 -- Herstellung von 2-KLG durch Kontaktieren von rekombinantem Organismus mit 2,5-DKG

Zellen von ptrpI-35-transformierter Erw. herbicola (ATCC 21998) wurden aus einem gefrorenen Glycerinvorrat auf festes LB-Medium (log/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 10 g/L NaCl, 15 g/L Agar), das 5 mg/L Tetracyclin enthielt, aufgestrichen, dann 48 h bei 30ºC inkubiert. Eine einzelne Kolonie wurde aufgenommen und zum Beimpfen von 5 ml flüssigem LB-Medium, enthaltend 5 mg/L Tetracyclin, verwendet, und dieses wurde in einem Reagensglas für 16 h bei 30ºC geschüttelt. 1,0 ml dieser Kultur wurde zum Impfen von 100 ml flüssigem LB-Medium, enthaltend 5 mg/L Tetracyclin, verwendet und dieses wurde bei 200 Upm für 16 h bei 30ºC geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet, einmal in einem gleichen Volumen von frischem LB-Medium gewaschen, dann in 50 ml LB-Medium, enthaltend 5 mg/L Tetracyclin und 20 g/L 2,5-DKG, resuspendiert. Ein 10 ml Aliquot hiervon wurde in einem 125 ml Kolben bei 200 Upm für 16 h bei 30ºC geschüttelt. Die erhaltene Brühe wurde mittels HPLC analysiert, und es wurde gefunden, daß sie 2,0 g/L an 2-KLG enthielt. Eine Kontrollkultur, enthaltend pBR322-transformierte Erw. herbicola (ATCC 21998), behandelt in ähnlicher Weise, enthielt keine 2-KLG.
Diese Anmeldung ist eine Ausscheidungsanmeldung der Europäischen Patentanmeldung No. 84.304277.1, welche als EP-A-0132308 veröffentlicht wurde. Die folgenden sind Ansprüche der Stammanmeldung, welche innerhalb des Umfanges der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind.
A. Ein rekombinantes Plasmid, umfassend DNA-Segment, kodierend ein Enzym mit 2,5-DKG-Reduktaseaktivität.
B. Ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Mikroorganismus, der in der Lage ist, Glucose zu 2-KLG umzuwandeln, das die Transformation einer Gastzelle, die in der Lage ist, Glucose in 2,5-DKG umzuwandeln, mit einem Expressionsvektor, der für 2,5-DKG-Reduktaseaktivität kodiert, umfaßt.
C. Das Verfahren von C., worin diese Gastzelle zur Art Erwinia gehört.
D. Das Verfahren von C., worin diese Gastzelle Erwinia herbicola (ATCC 21998) ist.
E. Ein Verfahren zur Konstruktion eine replizierbaren Expressionsträgers, der in der Lage ist, die Expression eine DNA- Sequenz, die 2,5-DKG-Reduktase kodiert, durchzuführen, welches Verfahren das wirksame Binden dieser DNA-Sequenz an einen mit einem Bakteriengast verträglichen Promotor umfaßt.
F. Ein rekombinanter Expressionsvektor, der in der Lage ist, die Expression einer DNA-Sequenz, die 2,5-DKG-Reduktase kodiert, in geeignete Gastzellen zu bewirken.
G. Ein rekombinanter Expressionsträger, worin die DNA-Sequenz, die 2,5-DKG-Reduktase kodiert, wirksam an einen Promotor gebunden ist, der in der Lage ist, die Expression dieser DNA-Sequenz zu bewirken.
H. Mikrobielle Gastzellen oder Zellkultur, transformiert mit dem Expressionsvektor von F oder G.
I. Die DNA-Sequenz von Fig. 4.
J. Die DNA-Sequenz von Fig. 4, umfassend das 296. bis 1854. Nucleotid.

Claims

1. Rekombinante Zelle oder Zellkultur, enthaltend die DNA-Sequenz, welche 2,5-DKG-Reduktase der in Fig. 4 angeführten Aminosäuresequenz kodiert, oder eine Variante hiervon, welche 2,5-DKG-Reduktaseaktivität besitzt, und mit der Fähigkeit, ihre Expression herbeizuführen.

2. Enzym mit 2,5-DKG-Reduktaseaktivität, hergestellt durch die Zellen oder Zellkultur von Anspruch 1, das in reduzierende oder nicht-reduzierende SDS PAGE entsprechend einem M.G. von annähernd 34.000 migriert.

3. Protein mit 2,5-DKG-Reduktaseaktivität, hergestellt durch die Zellen oder Zellkultur nach Anspruch 1, welches die N-endständige Aminosäuresequenz besitzt:

4. Enzym 2,5-DKG-Reduktase nach Anspruch 2 oder 3 im wesentlichen frei von Verunreinigungen.

5. Enzym 2,5-DKG-Reduktase nach Anspruch 2 oder 3, welches durch HPLC homogen ist.

6. Enzym 2,5-DKG-Reduktase nach Anspruch 2 oder 3 mit einer spezifischen Aktivität größer als 5 U/mg Protein.

7. Verfahren zur Herstellung von 2,5-DKG-Reduktase, welches umfaßt die Kultivierung rekombinanter Gastzellen, die einen rekombinanten Vektor enthalten, der fähig ist, die Expression von 2,5-DKG-Reduktase der in Fig. 4 angeführten Aminosäuresequenz herbeizuführen oder einer Variante hiervon mit 2,5-DKG-Reduktaseaktivität.

8. Verfahren nach Anspruch 7, weiterhin umfassend:

a. Lyse von dieses Enzym produzierenden Zellen; und

b. Adsorbieren des Lysates von Stufe a. auf einer Anionenaustauschersäule und Eluieren des Enzyms von der Säule; und

c. Behandeln der Portionen des Eluates aus Stufe b. in einer Affinitätssäule und Eluieren des Enzyms aus der Affinitätssäule; und

d. Gewinnen des Enzyms aus dem Eluat.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, in welchem dar rekombinante Vektor 2,5-DKG kodierende und von Bakterienzellen der Art Corynebacterium ableitbare DNA einschließt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, in welchem das Corynebacterium Corynebacterium Sp. ATCC 31090 ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, in welchem die Anionenaustauschersäule DEAE-Cellulose ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, in welchem das Affinitätsadsorbens Cibacron blue F3GA ist.

13. Verfahren zur Umwandlung von 2,5-DKG in 2-KLG, welches die Kontaktierung einer 2,5-DKG umfassenden Mischung mit einer Reduktase eines der Ansprüche 2-6 umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, in welchem das Enzym in Lösung angeliefert wird.

15. Verfahren zur Umwandlung von 2,5-DKG in 2-KLG, welches das Kontaktieren einer 2,5-DKG umfassenden Mischung mit einer 2,5-DKG-Reduktase nach einem der Ansprüche 2-6, oder wie von den Zellen oder der Zellkultur von Anspruch 1 gebildet, worin das Enzym immobilisiert ist, umfaßt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, in welchem reduzierende Äquivalente in vitro angeliefert werden.

17. Verfahren zur Umwandlung von 2,5-DKG in 2-KLG, welches das Kontaktieren einer 2,5-DKG umfassenden Mischung mit einer Kultur umfaßt, die rekombinante Gastzellen enthält, welche das Gen für 2,5-DKG-Reduktase der in Fig. 4 angeführten Aminosäuresequenz oder eine Variante hiervon, welche 2,5-DKG-Reduktaseaktivität besitzt, exprimieren.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13-17, weiter umfassend die Umwandlung des 2-KLG in Ascorbinsäure.