JPH0614771A - アスコルビン酸の中間体およびプロセス酵素類 - Google Patents
アスコルビン酸の中間体およびプロセス酵素類Info
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- JPH0614771A JPH0614771A JP5037930A JP3793093A JPH0614771A JP H0614771 A JPH0614771 A JP H0614771A JP 5037930 A JP5037930 A JP 5037930A JP 3793093 A JP3793093 A JP 3793093A JP H0614771 A JPH0614771 A JP H0614771A
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- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01274—2,5-Didehydrogluconate reductase (1.1.1.274), i.e. 2,5-diketo-D-gluconic acid reductase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/58—Aldonic, ketoaldonic or saccharic acids
- C12P7/60—2-Ketogulonic acid
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 2,5−ジケトグルコン酸リダクターゼおよ
びその変異体を提供する。 【構成】 2,5−ジケトグルコン酸リダクターゼは 【化1】
びその変異体を提供する。 【構成】 2,5−ジケトグルコン酸リダクターゼは 【化1】
Description
【0001】
【発明の背景】本発明はアスコルビン酸の中間体および
プロセス酵素類に関する。本発明は特に、有用なタンパ
ク質の精製と、組換え技術を使用するタンパク質の生
産、およびそのようなタンパク質を化学的変換に使用す
ることに関する。更に詳しくは、本発明は2,5−ジケ
トグルコン酸(2,5−DKG)リダクターゼ(還元酵素)
の精製と組換え技術による産生、および該リダクターゼ
を用いて2,5−DKGを立体選択的に転換して、2−
ケト−L−グロン酸(2−KLG)を産生すること、およ
び2−KLGを合成し得る単一の組換え体微生物を調製
する方法に関する。産生された2−KLGはアスコルビ
ン酸(ビタミンC)製造における有用な中間体である。
プロセス酵素類に関する。本発明は特に、有用なタンパ
ク質の精製と、組換え技術を使用するタンパク質の生
産、およびそのようなタンパク質を化学的変換に使用す
ることに関する。更に詳しくは、本発明は2,5−ジケ
トグルコン酸(2,5−DKG)リダクターゼ(還元酵素)
の精製と組換え技術による産生、および該リダクターゼ
を用いて2,5−DKGを立体選択的に転換して、2−
ケト−L−グロン酸(2−KLG)を産生すること、およ
び2−KLGを合成し得る単一の組換え体微生物を調製
する方法に関する。産生された2−KLGはアスコルビ
ン酸(ビタミンC)製造における有用な中間体である。
【0002】アスコルビン酸は、健康維持におけるその
重要性の理由から合衆国内においても、また世界各地に
おいても主要な化学製品となって来た。ある種の軽い病
気、例えば風邪のような病気にかかり易い個人の体質改
善に対する有効性に関しては若干の異論もあるが、必要
量のビタミンCを摂取することは人類にとって疑いもな
く重要なことである。所謂“天然"食品では十分量のビ
タミンCが供給されないかも知れないということが、近
年、重大な関心事となって来た。従って、このビタミン
量を補強して消費者に市販する食品添加物として、また
直接的なビタミン補給の双方に対するアスコルビン酸の
大量の需要が開発されて来ている。また、アスコルビン
酸は効果的な抗酸化剤であり、従って栄養剤およびその
他の製品の防腐剤としての応用も見出されている。
重要性の理由から合衆国内においても、また世界各地に
おいても主要な化学製品となって来た。ある種の軽い病
気、例えば風邪のような病気にかかり易い個人の体質改
善に対する有効性に関しては若干の異論もあるが、必要
量のビタミンCを摂取することは人類にとって疑いもな
く重要なことである。所謂“天然"食品では十分量のビ
タミンCが供給されないかも知れないということが、近
年、重大な関心事となって来た。従って、このビタミン
量を補強して消費者に市販する食品添加物として、また
直接的なビタミン補給の双方に対するアスコルビン酸の
大量の需要が開発されて来ている。また、アスコルビン
酸は効果的な抗酸化剤であり、従って栄養剤およびその
他の製品の防腐剤としての応用も見出されている。
【0003】ビタミンCの生産に関しては多くの有用
な、また商業的にも実施し得る方法がある。これらの中
の幾つかではまず2−ケト−L−グロン酸(2−KLG)
の製造を行ない、引き続き酸性または塩基性の触媒的方
法で環化することにより比較的簡単にアスコルビン酸に
変換する方法が採られている。従って、2−KLGその
ものが経済的にも工業的にもかなりの重要な物質と成っ
て来た。
な、また商業的にも実施し得る方法がある。これらの中
の幾つかではまず2−ケト−L−グロン酸(2−KLG)
の製造を行ない、引き続き酸性または塩基性の触媒的方
法で環化することにより比較的簡単にアスコルビン酸に
変換する方法が採られている。従って、2−KLGその
ものが経済的にも工業的にもかなりの重要な物質と成っ
て来た。
【0004】今日では、比較的豊富にある例えばD−グ
ルコースの様な通常の代謝産物を、原核微生物の代謝を
利用する方法によって、2,5−ジケトグルコン酸(2,
5−DKG)へ変換させる方法が使用できる。〔例え
ば、米国特許第3,790,444号(1974年2月5
日)、第3,998,697号(1976年2月21日)、
およびEPO公告特許第0046284号(1982年
2月24日発行)参照〕。この2,5−DKG中間体は、
2電子還元法という単一な1工程反応によって、所望の
2−KLGへ変換される出発物質として有用である。該
還元反応は化学的に、または酵素触媒法によって効果的
に行なわれる。この還元反応に効果を示し得る種々の細
胞株が知られている。そのような株はBrevibacteriu
m、Arthrobater、Micrococcus、Staphylococcus、P
seudomonas、Bacillus、CitrobacterおよびCoryneba
cterium 属の中に見出される〔米国特許第3,922,
194号(1975年11月25日)、米国特許第4,2
45,049号(1981年1月13日)、および米国特
許第3,959,076号(1976年5月25日)参
照〕。事実、そのような細菌株はこの還元反応に効果的
に使用されて来た。然しながら、そのような株の利用
は、即ち、酵素を精製せずに使用するこの方法は、精製
した酵素を使用しなければ達成し得ないある種の工程に
は使用できない。例えば、固形の支持体上に酵素を固定
して連続的に生産を行なおうとする方式などがそれに当
たる。また、そのような酵素を産生するのに遺伝装置を
使用することは、それによって、2,5−DKGの変換
に最も都合の良い部位で該酵素の産生が行なわれるよう
に、この装置を操作し、局在させ得るので、この方法の
実施に当たり好ましい改善をもたらすこととなる。その
ような場所の中で最も重要なのは、2,5−DKGの生
産を行なうことのできる同一菌体内にある部位である。
即ち、単一の微生物で、それ自身の装置を使用して2,
5−DKGを製造し、次いで2,5−DKGリダクター
ゼ(還元酵素)遺伝子と、該触媒酵素を産生するための適
切なコントロール配列を使って、インサイチユ(その場)
で内性2,5−DKGを所望の生成物に変換することも
可能となるであろう。
ルコースの様な通常の代謝産物を、原核微生物の代謝を
利用する方法によって、2,5−ジケトグルコン酸(2,
5−DKG)へ変換させる方法が使用できる。〔例え
ば、米国特許第3,790,444号(1974年2月5
日)、第3,998,697号(1976年2月21日)、
およびEPO公告特許第0046284号(1982年
2月24日発行)参照〕。この2,5−DKG中間体は、
2電子還元法という単一な1工程反応によって、所望の
2−KLGへ変換される出発物質として有用である。該
還元反応は化学的に、または酵素触媒法によって効果的
に行なわれる。この還元反応に効果を示し得る種々の細
胞株が知られている。そのような株はBrevibacteriu
m、Arthrobater、Micrococcus、Staphylococcus、P
seudomonas、Bacillus、CitrobacterおよびCoryneba
cterium 属の中に見出される〔米国特許第3,922,
194号(1975年11月25日)、米国特許第4,2
45,049号(1981年1月13日)、および米国特
許第3,959,076号(1976年5月25日)参
照〕。事実、そのような細菌株はこの還元反応に効果的
に使用されて来た。然しながら、そのような株の利用
は、即ち、酵素を精製せずに使用するこの方法は、精製
した酵素を使用しなければ達成し得ないある種の工程に
は使用できない。例えば、固形の支持体上に酵素を固定
して連続的に生産を行なおうとする方式などがそれに当
たる。また、そのような酵素を産生するのに遺伝装置を
使用することは、それによって、2,5−DKGの変換
に最も都合の良い部位で該酵素の産生が行なわれるよう
に、この装置を操作し、局在させ得るので、この方法の
実施に当たり好ましい改善をもたらすこととなる。その
ような場所の中で最も重要なのは、2,5−DKGの生
産を行なうことのできる同一菌体内にある部位である。
即ち、単一の微生物で、それ自身の装置を使用して2,
5−DKGを製造し、次いで2,5−DKGリダクター
ゼ(還元酵素)遺伝子と、該触媒酵素を産生するための適
切なコントロール配列を使って、インサイチユ(その場)
で内性2,5−DKGを所望の生成物に変換することも
可能となるであろう。
【0005】本発明と関連した化学的変換における反応
過程を示すことは、本発明の有用性の意義を理解する為
に役立つであろう。代表的なアスコルビン酸の製造方法
の全工程の概要は、以下の反応式1によって示される。
過程を示すことは、本発明の有用性の意義を理解する為
に役立つであろう。代表的なアスコルビン酸の製造方法
の全工程の概要は、以下の反応式1によって示される。
【化3】
【0006】反応式1 工程は、例えば反応式1に示されるように、D−グルコ
ースのような通常微生物に利用される代謝産物から都合
よく開始される。酵素的変換により、D−グルコースは
一連の酸化過程を経由して2,5−ジケト−D−グルコ
ン酸を与える。この一連の過程は単一の微生物によって
進められることが示された〔米国特許第3,790,44
4号、EPO公告第A20,046,284号(上述);そ
のような微生物は例えばGluconobacter、Acetobacter
またはErwinia属である〕。
ースのような通常微生物に利用される代謝産物から都合
よく開始される。酵素的変換により、D−グルコースは
一連の酸化過程を経由して2,5−ジケト−D−グルコ
ン酸を与える。この一連の過程は単一の微生物によって
進められることが示された〔米国特許第3,790,44
4号、EPO公告第A20,046,284号(上述);そ
のような微生物は例えばGluconobacter、Acetobacter
またはErwinia属である〕。
【0007】アスコルビン酸製造の変法は酵素的酸化と
化学的酸化の組合わせにより、2,5−DKGを介して
一巡する方法であり、上に提示した方法に比較して、明
らかにより取り扱い難い。これらのうち代表的なもの
は、ジアセトン−2−ケト−L−グロン酸を2−KLG
の前駆体として使用するReichsteinの合成法である。
この中間体は発酵反応、水素化反応、および例えば過マ
ンガン酸塩酸化などから成る一連の還元的および酸化的
段階を経由して生成されるものであって、所要の手順は
先に示した反応手順に比較して明らかに一層複雑であ
る。2,5−DKGから2−KLGへの変換も酵素反応
的に行なわれる〔米国特許第3,922,194号、第
3,959,076号(前記)、および第4,245,049
号(1981年1月13日)〕。
化学的酸化の組合わせにより、2,5−DKGを介して
一巡する方法であり、上に提示した方法に比較して、明
らかにより取り扱い難い。これらのうち代表的なもの
は、ジアセトン−2−ケト−L−グロン酸を2−KLG
の前駆体として使用するReichsteinの合成法である。
この中間体は発酵反応、水素化反応、および例えば過マ
ンガン酸塩酸化などから成る一連の還元的および酸化的
段階を経由して生成されるものであって、所要の手順は
先に示した反応手順に比較して明らかに一層複雑であ
る。2,5−DKGから2−KLGへの変換も酵素反応
的に行なわれる〔米国特許第3,922,194号、第
3,959,076号(前記)、および第4,245,049
号(1981年1月13日)〕。
【0008】得られた2−KLGをアスコルビン酸へ変
換する手段は今日では良く知られている。これは山崎の
方法に従い、希酸の存在で加熱することにより行なう
か、または先ずメタノール中でエステル化し、次いで塩
基中でラクトン環化する方法を用いる2段階法により行
なわれる。効果的な方法については、Crawford,T.
C.ら〔Advances in Carbohydrate Chemistry
and Biochemistry,37,79〜155(1980)〕の
記載がある。これらの変法は単純明瞭であり、2−KL
Gの安定性はアスコルビン酸よりも高く、保存期間にも
良好な効果を与えた。従って、アスコルビン酸を直接合
成するよりも、所望の最終製品に変換し得る中間体、2
−KLGで大量に貯蔵する方がより一層望ましく都合が
良い。
換する手段は今日では良く知られている。これは山崎の
方法に従い、希酸の存在で加熱することにより行なう
か、または先ずメタノール中でエステル化し、次いで塩
基中でラクトン環化する方法を用いる2段階法により行
なわれる。効果的な方法については、Crawford,T.
C.ら〔Advances in Carbohydrate Chemistry
and Biochemistry,37,79〜155(1980)〕の
記載がある。これらの変法は単純明瞭であり、2−KL
Gの安定性はアスコルビン酸よりも高く、保存期間にも
良好な効果を与えた。従って、アスコルビン酸を直接合
成するよりも、所望の最終製品に変換し得る中間体、2
−KLGで大量に貯蔵する方がより一層望ましく都合が
良い。
【0009】本発明による改良法は、一層優れた変法
を、上に述べた変換法の全般にわたる幾つかの局面に効
果的に導入するものである。一例を挙げれば、2,5−
DKGを2−KLGへ変換させる酵素が分離され、精製
されたので、還元工程は、例えば酵素を固定し、液状の
基質を、固定した触媒上に連続的に供給する方法を含む
より一層管理された条件下で進行させることができる。
また、組換え技術を利用して容易に精製して使用し得る
ような酵素を大量に生産できるようになった。更に、組
換え技術により、改良された特性を持った好適な宿主細
菌へ、暗号配列およびそれに必要な発現コントロール機
構を導入することができる。このように単に2,5−D
KGから2−KLGへの変換に焦点を絞っても、次の3
段階の改良が達成される:1)変化要因に対するより厳密
なコントロール;2)連続的方法が適用できる;および3)
還元反応に関係した所望の特性を有する酵素に好適な宿
主微生物の選別。
を、上に述べた変換法の全般にわたる幾つかの局面に効
果的に導入するものである。一例を挙げれば、2,5−
DKGを2−KLGへ変換させる酵素が分離され、精製
されたので、還元工程は、例えば酵素を固定し、液状の
基質を、固定した触媒上に連続的に供給する方法を含む
より一層管理された条件下で進行させることができる。
また、組換え技術を利用して容易に精製して使用し得る
ような酵素を大量に生産できるようになった。更に、組
換え技術により、改良された特性を持った好適な宿主細
菌へ、暗号配列およびそれに必要な発現コントロール機
構を導入することができる。このように単に2,5−D
KGから2−KLGへの変換に焦点を絞っても、次の3
段階の改良が達成される:1)変化要因に対するより厳密
なコントロール;2)連続的方法が適用できる;および3)
還元反応に関係した所望の特性を有する酵素に好適な宿
主微生物の選別。
【0010】2,5−DKGの効果的なクローン化と発
現によってもたらされる改良の範囲は、広範囲に及ぶ。
特有な遺伝装置が利用できるので、リダクターゼ(還元
酵素)を暗号化している遺伝子を、2,5−DKGを産生
できる微生物に導入することが可能となり、期待できる
ようになった。このようにして、同一の細菌によって変
換の全工程、例えばグルコースまたはその他の好適な代
謝産物から安定で貯蔵性のよい中間体2−KLGへの変
換の全工程が効果的に行ない得るようになった。
現によってもたらされる改良の範囲は、広範囲に及ぶ。
特有な遺伝装置が利用できるので、リダクターゼ(還元
酵素)を暗号化している遺伝子を、2,5−DKGを産生
できる微生物に導入することが可能となり、期待できる
ようになった。このようにして、同一の細菌によって変
換の全工程、例えばグルコースまたはその他の好適な代
謝産物から安定で貯蔵性のよい中間体2−KLGへの変
換の全工程が効果的に行ない得るようになった。
【0011】
【発明の要旨】本発明は、一般的に利用し易いグルコー
スのような代謝産物を、安定な貯蔵性のよいアスコルビ
ン酸の前駆体、2−KLGへ変換させる方法の劇的な改
良を行なうものである。本発明に記載した方法の経路に
は、2,5−DKGから2−KLGへ変換する段階が包
含される。現行の2−KLG中間体の産生方法には、ど
んな良い方法でも最低2種の微生物の使用またはキラー
を生じる培養を包含しており、利用し得る酵素水準を調
節できず、またバッチ式な方法に余儀なく限定されてい
る。
スのような代謝産物を、安定な貯蔵性のよいアスコルビ
ン酸の前駆体、2−KLGへ変換させる方法の劇的な改
良を行なうものである。本発明に記載した方法の経路に
は、2,5−DKGから2−KLGへ変換する段階が包
含される。現行の2−KLG中間体の産生方法には、ど
んな良い方法でも最低2種の微生物の使用またはキラー
を生じる培養を包含しており、利用し得る酵素水準を調
節できず、またバッチ式な方法に余儀なく限定されてい
る。
【0012】本発明に含まれる重要な実施態様は、一連
のクロマトグラフィー手法により、2,5−DKGリダ
クターゼをホモジニアス(均質)な生産物とし(HPLC
(高速液体クロマトグラフィー法)により)実質的に純粋
な形で製造する方法にある。本発明にはさらに、純化さ
れた酵素そのもの、および該純化酵素を2,5−DKG
から2−KLGへの変換に使用することを包含する。そ
のような変換は該酵素を固定化した形で使用することに
より、好ましく実施される。
のクロマトグラフィー手法により、2,5−DKGリダ
クターゼをホモジニアス(均質)な生産物とし(HPLC
(高速液体クロマトグラフィー法)により)実質的に純粋
な形で製造する方法にある。本発明にはさらに、純化さ
れた酵素そのもの、および該純化酵素を2,5−DKG
から2−KLGへの変換に使用することを包含する。そ
のような変換は該酵素を固定化した形で使用することに
より、好ましく実施される。
【0013】本発明のもう一つの重要な面は、2,5−
DKGリダクターゼの産生に適する組換え発現ベクター
を構築する方法である。また、この態様は、そのように
して産生された発現ベクターと、それを導入した細胞お
よび細胞培養、および2,5−DKGを立体選択的に2
−KLGへと還元させ得るそのような細胞および細胞培
養の生産物をも包含する。更に本発明のこの態様には組
換え技術によるリダクターゼを使用して2,5−DKG
を2−KLGへ変換させる方法が含まれる。
DKGリダクターゼの産生に適する組換え発現ベクター
を構築する方法である。また、この態様は、そのように
して産生された発現ベクターと、それを導入した細胞お
よび細胞培養、および2,5−DKGを立体選択的に2
−KLGへと還元させ得るそのような細胞および細胞培
養の生産物をも包含する。更に本発明のこの態様には組
換え技術によるリダクターゼを使用して2,5−DKG
を2−KLGへ変換させる方法が含まれる。
【0014】最後に、本発明はまた、グルコースまたは
通常の微生物代謝産物を単一の組換え微生物による発酵
によって2−KLGへ変換し、更にアスコルビン酸へ変
換する方法に関する。また本発明はこの過程を進行させ
得る組換え微生物に関する。そのような微生物は、2,
5−DKGリダクターゼに対応する配列を暗号化し、そ
れを発現し得る発現ベクターによって、初期の代謝産物
を2,5−DKGへ変換できる宿主細胞を形質転換する
ことにより都合良く組み立てられる。あるいは、そのよ
うな組換え微生物は、既に2,5−DKGを産生する微
生物に、代謝産物を酸化して2,5−DKGとする働き
を有する酵素を暗号化しているベクターを導入すること
によっても構築される。いずれの場合でも、発現ベクタ
ーの構造の中にある適切な誘導プロモーターとコントロ
ール系を活用することにより、所望する変換工程の速度
を最適とするよう、酵素濃度を調節することができる。
通常の微生物代謝産物を単一の組換え微生物による発酵
によって2−KLGへ変換し、更にアスコルビン酸へ変
換する方法に関する。また本発明はこの過程を進行させ
得る組換え微生物に関する。そのような微生物は、2,
5−DKGリダクターゼに対応する配列を暗号化し、そ
れを発現し得る発現ベクターによって、初期の代謝産物
を2,5−DKGへ変換できる宿主細胞を形質転換する
ことにより都合良く組み立てられる。あるいは、そのよ
うな組換え微生物は、既に2,5−DKGを産生する微
生物に、代謝産物を酸化して2,5−DKGとする働き
を有する酵素を暗号化しているベクターを導入すること
によっても構築される。いずれの場合でも、発現ベクタ
ーの構造の中にある適切な誘導プロモーターとコントロ
ール系を活用することにより、所望する変換工程の速度
を最適とするよう、酵素濃度を調節することができる。
【0015】以下に図面について簡単に説明する。図1
は2,5−DKGリダクターゼ遺伝子の発現ベクターを
示している。図2および図3は、二者択一的な2,5−
DKGリダクターゼ遺伝子のための発現ベクターの組み
立てを示している。
は2,5−DKGリダクターゼ遺伝子の発現ベクターを
示している。図2および図3は、二者択一的な2,5−
DKGリダクターゼ遺伝子のための発現ベクターの組み
立てを示している。
【0016】図4は2,5−DKGリダクターゼ遺伝子
とpTrpl−35発現ベクターの調節(コントロール)領
域を含んでいる配列を示している。図5は、図4の配列
を有する2,5−DKGリダクターゼ発現ベクターを導
入したErwinia herbicola(ACCC21998)から
得たタンパク質抽出物の染色したゲルを示している。
とpTrpl−35発現ベクターの調節(コントロール)領
域を含んでいる配列を示している。図5は、図4の配列
を有する2,5−DKGリダクターゼ発現ベクターを導
入したErwinia herbicola(ACCC21998)から
得たタンパク質抽出物の染色したゲルを示している。
【0017】
A.定義 本発明に使用する“2,5−DKGリダクターゼ"なる用
語は、2,5−DKGを立体選択的に2−KLGへと変
化させる反応を触媒する働きを有するタンパク質を意味
する。本発明の具体的な例に於いては、Corynebacteri
um 中に存在する特定の型のこの酵素が純化され、クロ
ーン化され、発現されたが、例えばBrevibacterium、
Arthrobacter、Micrococcus、Staphylococcus、Pse
udomonas、CitrobacterおよびBcillusのような属の中
の他の細菌株もこの酵素と同じ活性を有する酵素を合成
することが知られている。これらの属は、この変換反応
の触媒に利用できるCorynebacteriumに存在するのと同
一の酵素の強力な供給源として例示される。これら天然
に存在するもの以外にも、原核生物界には、それに代わ
る供給源を見出し得ることがあろう。更に、本発明によ
ってそのような酵素を暗号化している遺伝子配列が明ら
かにされ、利用できるようになったので、その技術によ
って知り得た知識を利用して、この酵素の働きを妨害す
ることなく、事実上その働きを改良し得る配列の修飾が
できるようになった。そのように修飾され、変換された
配列も本明細書で使用する2,5−DKGリダクターゼ
の定義の中に包括される。要するに、2,5−DKGリ
ダクターゼなる用語は、機能的な定義であって、2,5
−DKGが2−KLGへと変換する反応を触媒するすべ
ての酵素を意味する。
語は、2,5−DKGを立体選択的に2−KLGへと変
化させる反応を触媒する働きを有するタンパク質を意味
する。本発明の具体的な例に於いては、Corynebacteri
um 中に存在する特定の型のこの酵素が純化され、クロ
ーン化され、発現されたが、例えばBrevibacterium、
Arthrobacter、Micrococcus、Staphylococcus、Pse
udomonas、CitrobacterおよびBcillusのような属の中
の他の細菌株もこの酵素と同じ活性を有する酵素を合成
することが知られている。これらの属は、この変換反応
の触媒に利用できるCorynebacteriumに存在するのと同
一の酵素の強力な供給源として例示される。これら天然
に存在するもの以外にも、原核生物界には、それに代わ
る供給源を見出し得ることがあろう。更に、本発明によ
ってそのような酵素を暗号化している遺伝子配列が明ら
かにされ、利用できるようになったので、その技術によ
って知り得た知識を利用して、この酵素の働きを妨害す
ることなく、事実上その働きを改良し得る配列の修飾が
できるようになった。そのように修飾され、変換された
配列も本明細書で使用する2,5−DKGリダクターゼ
の定義の中に包括される。要するに、2,5−DKGリ
ダクターゼなる用語は、機能的な定義であって、2,5
−DKGが2−KLGへと変換する反応を触媒するすべ
ての酵素を意味する。
【0018】本明細書で論じられるタンパク質およびサ
ッカライド類の酸性誘導体のような多くの化合物は、溶
液中において或いは固形物の場合はそれらが調製された
溶液に置かれていた環境に応じて種々のイオン状態を取
り得るであろうことは技術的に良く理解できる。例え
ば、グルコン酸と言う用語を使用してその分子を指定す
る場合、該有機分子が関係し得るすべてのイオン化状態
を包括するものとする。従って、例えば“D−グルコン
酸"および“D−グルコネート"は共に同一の有機構造を
示すものであって、何ら特別なイオン化状態を指定しよ
うと意図するものではない。良く知られているように、
D−グルコン酸はイオン化しない形で存在することもで
き、或いは、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはそ
の他の塩として使用することも出来る。説明されている
化合物が該当するイオン化状態のものか、あるいは非イ
オン化の態様のものかは、当業者であれば、または例え
そうでなくても、文脈を辿れば自ら明らかになるであろ
う。従って、2,5−DKGリダクターゼ・タンパク質
そのものもpHに応じて種々のイオン化状態をとり得
る。これらのすべてのイオン化状態を“2,5−DKG
リダクターゼ"なる用語は包含している。
ッカライド類の酸性誘導体のような多くの化合物は、溶
液中において或いは固形物の場合はそれらが調製された
溶液に置かれていた環境に応じて種々のイオン状態を取
り得るであろうことは技術的に良く理解できる。例え
ば、グルコン酸と言う用語を使用してその分子を指定す
る場合、該有機分子が関係し得るすべてのイオン化状態
を包括するものとする。従って、例えば“D−グルコン
酸"および“D−グルコネート"は共に同一の有機構造を
示すものであって、何ら特別なイオン化状態を指定しよ
うと意図するものではない。良く知られているように、
D−グルコン酸はイオン化しない形で存在することもで
き、或いは、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはそ
の他の塩として使用することも出来る。説明されている
化合物が該当するイオン化状態のものか、あるいは非イ
オン化の態様のものかは、当業者であれば、または例え
そうでなくても、文脈を辿れば自ら明らかになるであろ
う。従って、2,5−DKGリダクターゼ・タンパク質
そのものもpHに応じて種々のイオン化状態をとり得
る。これらのすべてのイオン化状態を“2,5−DKG
リダクターゼ"なる用語は包含している。
【0019】同様に“細胞"および“細胞培養"の用語
も、文脈上、その一方また他方の何れかを明示していな
い場合は相互互換的に使用するものである。細胞または
細胞培養の形質転換は、結局同じ働きに等しい。クロー
ン化するビヒクルまたはその他の導入手段で処理される
のは微生物の培養であるが、形質転換物質を取りこむの
は微生物そのものであることは当然明らかである。本発
明における細胞および微生物はあらゆる細菌性微生物、
または原核微生物を包含するものと定義づけられる。
も、文脈上、その一方また他方の何れかを明示していな
い場合は相互互換的に使用するものである。細胞または
細胞培養の形質転換は、結局同じ働きに等しい。クロー
ン化するビヒクルまたはその他の導入手段で処理される
のは微生物の培養であるが、形質転換物質を取りこむの
は微生物そのものであることは当然明らかである。本発
明における細胞および微生物はあらゆる細菌性微生物、
または原核微生物を包含するものと定義づけられる。
【0020】“発現ベクター"とは、その中に含まれる
DNA配列を、その配列が機能的に、それを発現させる
ことのできる他の配列と連結している場合には、それを
発現し得るベクターを意味する。明瞭に表現されていな
いけれども、発現ベクターには、エピソームまたは染色
体DNAの組み込み部分として、宿主微生物内で複製し
得るものでなければならないという意味が含まれてい
る。複製能が欠除していればそれらが効果的に作働でき
ないことは明らかである。結局、“発現ベクター"も機
能的な定義である。一般に、組換え技術では発現ベクタ
ーはしばしば“プラスミド"の形で使用され、該用語は
閉環状2本鎖DNA分子を示しており、ベクターの形で
は染色体と結合しない。一般に使用されるその他の効果
的なベクターはファージおよび開環状DNAである。本
明細書においては、“プラスミド"と“ベクター"はしば
しば相互互換的に使用される;然し、本発明において
は、同等の機能を果たす既知の、あるいはいずれ知られ
ることになる他の型の発現ベクターを全て包含するもの
である。
DNA配列を、その配列が機能的に、それを発現させる
ことのできる他の配列と連結している場合には、それを
発現し得るベクターを意味する。明瞭に表現されていな
いけれども、発現ベクターには、エピソームまたは染色
体DNAの組み込み部分として、宿主微生物内で複製し
得るものでなければならないという意味が含まれてい
る。複製能が欠除していればそれらが効果的に作働でき
ないことは明らかである。結局、“発現ベクター"も機
能的な定義である。一般に、組換え技術では発現ベクタ
ーはしばしば“プラスミド"の形で使用され、該用語は
閉環状2本鎖DNA分子を示しており、ベクターの形で
は染色体と結合しない。一般に使用されるその他の効果
的なベクターはファージおよび開環状DNAである。本
明細書においては、“プラスミド"と“ベクター"はしば
しば相互互換的に使用される;然し、本発明において
は、同等の機能を果たす既知の、あるいはいずれ知られ
ることになる他の型の発現ベクターを全て包含するもの
である。
【0021】“組換え細胞"とは、組換えDNA技術を
使用して構築されたベクターを導入された細胞を言う。
“宿主"細胞とは、形質転換を受ける前の細胞を言う。
一般に組換え細胞は、そのような組換えベクターで暗号
化されたタンパク質生成物を産生し、しかも通常はこの
ベクターが無ければそれらを産生しない;然しこの定義
には、細菌の染色体に暗号化されているか、あるいはこ
の受容菌自体が発現するタンパク質を暗号化しているベ
クターで形質転換された細胞も含まれる。この定義に
は、組換え技術による異種配列の生成物を生産するあら
ゆる細胞が包含される。
使用して構築されたベクターを導入された細胞を言う。
“宿主"細胞とは、形質転換を受ける前の細胞を言う。
一般に組換え細胞は、そのような組換えベクターで暗号
化されたタンパク質生成物を産生し、しかも通常はこの
ベクターが無ければそれらを産生しない;然しこの定義
には、細菌の染色体に暗号化されているか、あるいはこ
の受容菌自体が発現するタンパク質を暗号化しているベ
クターで形質転換された細胞も含まれる。この定義に
は、組換え技術による異種配列の生成物を生産するあら
ゆる細胞が包含される。
【0022】“通常の代謝産物"とは、発育のため、一
般に細菌に利用される炭素源を意味する。そのような代
謝産物とは、そのような微生物の栄養源として容易に利
用されるグルコース、ガラクトース、ラクトース、フル
クトースまたはその他の炭水化物である。この場合、そ
のような代謝産物とは2,5−ジケト−D−グルコン酸
に変換し得るようなそれら栄養源の酵素的誘導体をも包
含して定義される。そのような誘導体にはD−グルコン
酸、D−マンノン酸、L−グロン酸、L−イドン酸、2
−ケト−L−グルコン酸、5−ケト−D−グルコン酸、
および5−ケト−D−マンノン酸が含まれる。
般に細菌に利用される炭素源を意味する。そのような代
謝産物とは、そのような微生物の栄養源として容易に利
用されるグルコース、ガラクトース、ラクトース、フル
クトースまたはその他の炭水化物である。この場合、そ
のような代謝産物とは2,5−ジケト−D−グルコン酸
に変換し得るようなそれら栄養源の酵素的誘導体をも包
含して定義される。そのような誘導体にはD−グルコン
酸、D−マンノン酸、L−グロン酸、L−イドン酸、2
−ケト−L−グルコン酸、5−ケト−D−グルコン酸、
および5−ケト−D−マンノン酸が含まれる。
【0023】B.望ましい態様の一般的な説明 B.1 純度が充分に高い2,5−DKGリダクターゼ
の製造 純粋な2,5−DKGリダクターゼの製造のために選ば
れた細菌の望ましい属はCorynebacteriumである。然
し、細菌学的な分類は、関連のある属間の正しい命名を
確かめることが時に困難な場合があるので、必ずしも十
分確実ではない。然し、該リダクターゼが含有されてい
る細菌種の多くはCorynebacterium、Brevibacterium
およびArthrobacter属に属するcoryneform型グルー
プの仲間である。従って現在判っていることによれば、
該酵素の望ましい供給源がCoryneform型グループの一
つであるということである。
の製造 純粋な2,5−DKGリダクターゼの製造のために選ば
れた細菌の望ましい属はCorynebacteriumである。然
し、細菌学的な分類は、関連のある属間の正しい命名を
確かめることが時に困難な場合があるので、必ずしも十
分確実ではない。然し、該リダクターゼが含有されてい
る細菌種の多くはCorynebacterium、Brevibacterium
およびArthrobacter属に属するcoryneform型グルー
プの仲間である。従って現在判っていることによれば、
該酵素の望ましい供給源がCoryneform型グループの一
つであるということである。
【0024】製造の好ましい態様として、細胞培養は細
菌株より応じて選ばれる好適な条件下に、OD550が
約20またはそれ以上になるまで発育させる。次に培養
液を遠心分離に掛け、得られた細胞ペースト(ペレット
状)を処理して細胞を溶解(溶菌)する。このペーストは
処理前に、予かじめ緩衝液で洗滌して混入している培地
を除去して置くことが望ましく、洗滌を終えたペレット
は、例えばリゾチーム、または超音波、または機械的手
技を用いて処理し、細胞を開裂させる。次に、得られた
抽出物を、望ましくはセルロースを保持体とする陰イオ
ン交換樹脂、例えばDEAEセルロースを用いたイオン
交換クロマトグラフィーにより精製する。言うまでもな
く、例えばQAEまたはDEAEセファデックスのよう
な他の陰イオン交換樹脂もまた使用できる。溶出は溶出
液に溶解している塩、好ましくは塩化ナトリウムの濃度
を順次増加し、溶出溶媒のイオン強度を増加する代表的
で望ましい公知法により行なわれる。2,5−DKGリ
ダクターゼ活性を含有する溶出液分画をアフィニティー
クロマトグラフィー保持体、即ち、それが共有結合する
支持体、色素または酵素基質またはその補因子に似たそ
の他の有機リガンドに吸着させることにより、更に精製
する。もしアフィニティー保持体で処理すべき溶液が相
当量の溶質を含有している場合は、予かじめ透析を行な
うことが望ましい。特に効果的なアフィニティークロマ
トグラフィー保持体は、NADHまたはNADPHを利
用する酵素に親和性を有するアミコンマトレックスRゲ
ルブルーA(Amicon MatrexR gel blueA)である。
そのようなカラムからの溶離は、酵素と親和性のある物
質−この場合はNADP−の溶出溶媒中の濃度を増加し
て行くことにより達成される。所望のDKGリダクター
ゼ活性を含有する画分を集めて純粋なタンパク質を回収
する。この純粋なタンパク質の比活性は5単位/mgより
大きい。
菌株より応じて選ばれる好適な条件下に、OD550が
約20またはそれ以上になるまで発育させる。次に培養
液を遠心分離に掛け、得られた細胞ペースト(ペレット
状)を処理して細胞を溶解(溶菌)する。このペーストは
処理前に、予かじめ緩衝液で洗滌して混入している培地
を除去して置くことが望ましく、洗滌を終えたペレット
は、例えばリゾチーム、または超音波、または機械的手
技を用いて処理し、細胞を開裂させる。次に、得られた
抽出物を、望ましくはセルロースを保持体とする陰イオ
ン交換樹脂、例えばDEAEセルロースを用いたイオン
交換クロマトグラフィーにより精製する。言うまでもな
く、例えばQAEまたはDEAEセファデックスのよう
な他の陰イオン交換樹脂もまた使用できる。溶出は溶出
液に溶解している塩、好ましくは塩化ナトリウムの濃度
を順次増加し、溶出溶媒のイオン強度を増加する代表的
で望ましい公知法により行なわれる。2,5−DKGリ
ダクターゼ活性を含有する溶出液分画をアフィニティー
クロマトグラフィー保持体、即ち、それが共有結合する
支持体、色素または酵素基質またはその補因子に似たそ
の他の有機リガンドに吸着させることにより、更に精製
する。もしアフィニティー保持体で処理すべき溶液が相
当量の溶質を含有している場合は、予かじめ透析を行な
うことが望ましい。特に効果的なアフィニティークロマ
トグラフィー保持体は、NADHまたはNADPHを利
用する酵素に親和性を有するアミコンマトレックスRゲ
ルブルーA(Amicon MatrexR gel blueA)である。
そのようなカラムからの溶離は、酵素と親和性のある物
質−この場合はNADP−の溶出溶媒中の濃度を増加し
て行くことにより達成される。所望のDKGリダクター
ゼ活性を含有する画分を集めて純粋なタンパク質を回収
する。この純粋なタンパク質の比活性は5単位/mgより
大きい。
【0025】純度の最終的な証明は、例えばHPLCに
より、セファデックスゲル、ポリアクリルアミドゲル、
またはTSKサイジングゲルを用いたサイズセパレーシ
ョン(分子サイズ分離)によって達成される。Corynebac
terium sp ATCC31090に含有される酵素で
は、TSK/HPLCによる分離によって、全量の活性
を含有する45,000の分子量に相当するピークを得
る。然しながら、還元的または非還元的な条件で酵素を
SDS−PAGE処理すると、タンパク質は34,00
0の分子量に相当するピークに移動する。この好ましい
具体例に示したタンパク質の特性については、更に実施
例2で説明する。
より、セファデックスゲル、ポリアクリルアミドゲル、
またはTSKサイジングゲルを用いたサイズセパレーシ
ョン(分子サイズ分離)によって達成される。Corynebac
terium sp ATCC31090に含有される酵素で
は、TSK/HPLCによる分離によって、全量の活性
を含有する45,000の分子量に相当するピークを得
る。然しながら、還元的または非還元的な条件で酵素を
SDS−PAGE処理すると、タンパク質は34,00
0の分子量に相当するピークに移動する。この好ましい
具体例に示したタンパク質の特性については、更に実施
例2で説明する。
【0026】以上を要約すると、酵素の純化は細胞溶
解、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティク
ロマトグラフィーおよびサイズセパレーションによる証
明の工程から成る。細胞溶解(溶菌)以外の工程について
は、任意の順序で行なってよく、工程の移行の都度、実
施例2に示した方法に従って活性を測定することにより
チェックを行なう。
解、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティク
ロマトグラフィーおよびサイズセパレーションによる証
明の工程から成る。細胞溶解(溶菌)以外の工程について
は、任意の順序で行なってよく、工程の移行の都度、実
施例2に示した方法に従って活性を測定することにより
チェックを行なう。
【0027】B.2 精製した酵素を用いる2,5−D
KGから2−KLGへの変換 精製した酵素を用いた変換は溶液かまたは更に望ましく
は固定化型で行なう。所望の反応は還元反応であるか
ら、還元当量(reducing equivalents)の供給源を必要
とする;酵素はNADPH特異性であり、従って少なく
とも触媒量の補酵素が存在していなければならず、進行
過程中は、その還元型は絶えず再生されなければならな
い。補酵素を還元するための電子供与源は、グルコース
/グルコースデヒドロゲナーゼ(脱水素酵素)、ホルメー
ト/ホルメートデヒドロゲナーゼ、またはグルタメート
/グルタメートデヒドロゲナーゼのように、酵素と接触
する還元型基質の酸化により供与される。好適な還元当
量の供給源を選択するには、基質のコストおよび精製し
た2,5−DKGリダクターゼが必要とするNADPと
矛盾することのない酸化触媒酵素の酵素特異性を考慮し
なければならない。NADPH補酵素の再生のための他
の系としては、例えば還元当量の供給源としてH2を用
い、リポアミドデヒドロゲナーゼとヒドロゲナーゼ(水
素酵素)、またはフエレドキシンリダクターゼとヒドロ
ゲナーゼを触媒として用いるWong,C.H.ら(J.A
m.Chem.Soc.,103:6227(1981))の方法
が知られている。更に大規模製法にも適用できる他の方
法がLight,D.ら(“Organic Chemicals from B
iomass"(1983)D.L.Wise刊305〜358頁)
により記載されている。
KGから2−KLGへの変換 精製した酵素を用いた変換は溶液かまたは更に望ましく
は固定化型で行なう。所望の反応は還元反応であるか
ら、還元当量(reducing equivalents)の供給源を必要
とする;酵素はNADPH特異性であり、従って少なく
とも触媒量の補酵素が存在していなければならず、進行
過程中は、その還元型は絶えず再生されなければならな
い。補酵素を還元するための電子供与源は、グルコース
/グルコースデヒドロゲナーゼ(脱水素酵素)、ホルメー
ト/ホルメートデヒドロゲナーゼ、またはグルタメート
/グルタメートデヒドロゲナーゼのように、酵素と接触
する還元型基質の酸化により供与される。好適な還元当
量の供給源を選択するには、基質のコストおよび精製し
た2,5−DKGリダクターゼが必要とするNADPと
矛盾することのない酸化触媒酵素の酵素特異性を考慮し
なければならない。NADPH補酵素の再生のための他
の系としては、例えば還元当量の供給源としてH2を用
い、リポアミドデヒドロゲナーゼとヒドロゲナーゼ(水
素酵素)、またはフエレドキシンリダクターゼとヒドロ
ゲナーゼを触媒として用いるWong,C.H.ら(J.A
m.Chem.Soc.,103:6227(1981))の方法
が知られている。更に大規模製法にも適用できる他の方
法がLight,D.ら(“Organic Chemicals from B
iomass"(1983)D.L.Wise刊305〜358頁)
により記載されている。
【0028】代表的な変換反応においては、出発溶液は
約1〜200g/Lの濃度、好ましくは約10〜50g/
L付近の濃度の2,5−DKGを含有し、媒質のpHは約
5〜7.5、好ましくは6.4付近に調節する。このp
Hは例えばリン酸緩衝液のような好適な緩衝液を使用し
て維持する。温度範囲は約15℃〜37℃、好ましくは
25℃付近とする。還元型補酵素NADPHの濃度は、
充分な還元当量の供給源と共に、例えば約0.001m
M〜2mM、好ましくは約0.01〜0.03mMとし、
反応中その濃度を維持する。
約1〜200g/Lの濃度、好ましくは約10〜50g/
L付近の濃度の2,5−DKGを含有し、媒質のpHは約
5〜7.5、好ましくは6.4付近に調節する。このp
Hは例えばリン酸緩衝液のような好適な緩衝液を使用し
て維持する。温度範囲は約15℃〜37℃、好ましくは
25℃付近とする。還元型補酵素NADPHの濃度は、
充分な還元当量の供給源と共に、例えば約0.001m
M〜2mM、好ましくは約0.01〜0.03mMとし、
反応中その濃度を維持する。
【0029】酵素を溶液の形で供給する場合は、その濃
度は基質媒質に対し10mg/Lの程度とするが、勿論、
所望する変換反応速度により、また選ばれた酵素の特異
性に従って望ましい濃度を使用する。もし固定化酵素を
使用する場合は、上記の基質溶液を、2,5−DKGリ
ダクターゼを吸着により含有するか、または共有結合に
より結合させた固形保持体を通過させる。理想的には、
溶液中のNADPH濃度を維持させるに足りる還元当量
の供給源を変換する意味で、固形保持体に上記の好適な
触媒を含有させる。例えば、典型的な変換反応に於いて
は、溶液は2,5−DKG濃度にほぼ当量のグルコー
ス、ホルメート、グルタメートまたは溶解水素を含有し
ており、固形保持体には所望する2−KLGへの変換反
応によって生成するNADPを絶えず再生するに足りる
還元触媒を含有させる。
度は基質媒質に対し10mg/Lの程度とするが、勿論、
所望する変換反応速度により、また選ばれた酵素の特異
性に従って望ましい濃度を使用する。もし固定化酵素を
使用する場合は、上記の基質溶液を、2,5−DKGリ
ダクターゼを吸着により含有するか、または共有結合に
より結合させた固形保持体を通過させる。理想的には、
溶液中のNADPH濃度を維持させるに足りる還元当量
の供給源を変換する意味で、固形保持体に上記の好適な
触媒を含有させる。例えば、典型的な変換反応に於いて
は、溶液は2,5−DKG濃度にほぼ当量のグルコー
ス、ホルメート、グルタメートまたは溶解水素を含有し
ており、固形保持体には所望する2−KLGへの変換反
応によって生成するNADPを絶えず再生するに足りる
還元触媒を含有させる。
【0030】B.3 2,5−DKGリダクターゼのク
ローン化と発現 2,5−DKGリダクターゼの遺伝子をクローン化し、
発現させる手技を提供する本発明方法によって、純化
2,5−DKGリダクターゼを多量に入手することがで
きる様になり、また2,5−DKGを生産する微生物に
おいて、該リダクターゼを生成させることができる様に
なった。これを達成した一般的な方法を以下に要約し、
その具体的な方法を実施例3において概説する。
ローン化と発現 2,5−DKGリダクターゼの遺伝子をクローン化し、
発現させる手技を提供する本発明方法によって、純化
2,5−DKGリダクターゼを多量に入手することがで
きる様になり、また2,5−DKGを生産する微生物に
おいて、該リダクターゼを生成させることができる様に
なった。これを達成した一般的な方法を以下に要約し、
その具体的な方法を実施例3において概説する。
【0031】Corynebacterium またはその他の供給源
から得られた高分子量のDNAを、制限酵素を用いて部
分消化することにより作り出されたゲノムライブラリー
からの2,5−DKGリダクターゼ暗号化遺伝子を、プ
ラスミドかファージビヒクルにクローンする。2,5−
DKGリダクターゼを得るのに好適な制限酵素はSau3
Aである。(その代わりに、BamHIまたはPstIのよ
うに、特異性の高い制限酵素による制限消化物を使用し
ても良い)。次に、その制限消化物を、好適な細菌宿主
中で複製し得るプラスミドベクターか、都合の良い細菌
培養物中で増殖し得るファージ配列の中へ連結する。得
られたプラスミドおよびファージライブラリーを、2,
5−DKGリダクターゼの既知の部分配列に基づいて構
築されたプローブを用いてスクリーニングする(実施例
2参照)。プローブデザインの効率は、プローブ構築に
際し、細菌性宿主にとって望ましいと知られているコド
ンを選択することにより向上させることができる。所望
のクローンをプラスミドおよびファージライブラリーか
ら確認するには、所望の遺伝子が、好適で厳格な条件下
で、すべてのプローブとハイブリッドを形成する様に一
組みのプローブを使用し、ただ1個のプローブを使用す
ることから起こる誤った陽性例を排除することによって
最も効果的に行なわれる。プローブとして提供されたオ
リゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に成功したコロ
ニーまたはファージを回収し、所望の遺伝子配列との同
一性を直接的なDNA塩基配列決定法と、所望の酵素を
産生するインビボでの発現によって確認する。
から得られた高分子量のDNAを、制限酵素を用いて部
分消化することにより作り出されたゲノムライブラリー
からの2,5−DKGリダクターゼ暗号化遺伝子を、プ
ラスミドかファージビヒクルにクローンする。2,5−
DKGリダクターゼを得るのに好適な制限酵素はSau3
Aである。(その代わりに、BamHIまたはPstIのよ
うに、特異性の高い制限酵素による制限消化物を使用し
ても良い)。次に、その制限消化物を、好適な細菌宿主
中で複製し得るプラスミドベクターか、都合の良い細菌
培養物中で増殖し得るファージ配列の中へ連結する。得
られたプラスミドおよびファージライブラリーを、2,
5−DKGリダクターゼの既知の部分配列に基づいて構
築されたプローブを用いてスクリーニングする(実施例
2参照)。プローブデザインの効率は、プローブ構築に
際し、細菌性宿主にとって望ましいと知られているコド
ンを選択することにより向上させることができる。所望
のクローンをプラスミドおよびファージライブラリーか
ら確認するには、所望の遺伝子が、好適で厳格な条件下
で、すべてのプローブとハイブリッドを形成する様に一
組みのプローブを使用し、ただ1個のプローブを使用す
ることから起こる誤った陽性例を排除することによって
最も効果的に行なわれる。プローブとして提供されたオ
リゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に成功したコロ
ニーまたはファージを回収し、所望の遺伝子配列との同
一性を直接的なDNA塩基配列決定法と、所望の酵素を
産生するインビボでの発現によって確認する。
【0032】完全に機能し得る遺伝子を、その暗号配列
を導入しようとする宿主細胞中で作働し得るプロモータ
ーとリボソーム結合部位を含有する好適な発現ベクター
に連結する。現在の技術水準においては、本発明に適用
し得る多数の促進/制御系、および好適な原核生物宿主
がある。一般に、原核生物はDNA配列のクローン化に
望ましく、また2−KLGの製造方法はそのような微生
物系を用いて最も都合よく行なわれるので、クローン化
と発現の双方に、類似の宿主を使用することができる。
E.coli K12株294(ATCCNo.31446)
はクローン用宿主として特に有用である。その他の使用
し得る微生物株は、E.coli B、E.coli X177
6(ATTCNo.31537)およびE.coli DE−
1(ATCCNo.33849)のようなE.coli 株か
ら成る。発現には、先に述べた細菌株、およびE.coli
W3110(F-,λ-,原栄養性、ATTCNo.273
25)、Bacillus subtilusのような桿菌類、およびS
almonella typhimuriumまたはSerratia marcesans
のようなその他の腸内菌類、および種々のPseudomonas
種が使用し得る。宿主として特に好ましい群は、グル
コースまたはその他一般に利用し得る代謝産物を2,5
−DKGへ変換できる宿主培養物である。そのような宿
主の例としてはErwinia herbicola ATTCNo.2
1998(またはAcetomonas albosesamae の1株と
考えられている:米国特許第3,998,697号);Acet
obacter melangeneum、IFO3293、Acetobacter
cerius、IFO3263、およびGluconobacter ru
biginosus、IFO3244が含まれる。
を導入しようとする宿主細胞中で作働し得るプロモータ
ーとリボソーム結合部位を含有する好適な発現ベクター
に連結する。現在の技術水準においては、本発明に適用
し得る多数の促進/制御系、および好適な原核生物宿主
がある。一般に、原核生物はDNA配列のクローン化に
望ましく、また2−KLGの製造方法はそのような微生
物系を用いて最も都合よく行なわれるので、クローン化
と発現の双方に、類似の宿主を使用することができる。
E.coli K12株294(ATCCNo.31446)
はクローン用宿主として特に有用である。その他の使用
し得る微生物株は、E.coli B、E.coli X177
6(ATTCNo.31537)およびE.coli DE−
1(ATCCNo.33849)のようなE.coli 株か
ら成る。発現には、先に述べた細菌株、およびE.coli
W3110(F-,λ-,原栄養性、ATTCNo.273
25)、Bacillus subtilusのような桿菌類、およびS
almonella typhimuriumまたはSerratia marcesans
のようなその他の腸内菌類、および種々のPseudomonas
種が使用し得る。宿主として特に好ましい群は、グル
コースまたはその他一般に利用し得る代謝産物を2,5
−DKGへ変換できる宿主培養物である。そのような宿
主の例としてはErwinia herbicola ATTCNo.2
1998(またはAcetomonas albosesamae の1株と
考えられている:米国特許第3,998,697号);Acet
obacter melangeneum、IFO3293、Acetobacter
cerius、IFO3263、およびGluconobacter ru
biginosus、IFO3244が含まれる。
【0033】一般に、プラスミドの発現、即ち宿主細胞
と適合し得る種から誘導された複製およびコントロール
配列を含んでいるクローニングベクターは、これらの宿
主と関連して使用される。通常、ベクターは複製部位お
よび、形質転換細胞に選択性のある表現形質を提供でき
るマーキング(記号化)配列を保有している。例えばE.
coli は、E.coli の1株から誘導されたプラスミド
pBR322によって典型な形質転換を受ける(Boliver
ら、Gene,2:95(1977))。pBR322はアンピ
シリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含んでお
り、これは形質転換された細胞を容易に確認し得る手段
となる。発現に使用するためには、pBR322プラス
ミド、或いはその他の微生物プラスミドも、それ自身の
タンパク質を発現するためにその微生物によって使用さ
れ得るプロモーターを含有するか、または含有するよう
に修飾されなければならない。それらの組換えDNAの
構築(組み立て)に最も多く使用されるプロモーターは、
β−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトース・
プロモーター系(Changら、Nature,275:615(1
978);Itakuraら、Science,198:1056(19
77);(Goeddelら、Nature,281:544(197
9))、およびトリプトファン(trp)プロモーター系(Goe
ddelら、Nucleic Acids Res.,8:4057(19
80);EPO公告特許第0036776号)である。こ
れらが最も一般に使用されている間に、他の微生物のプ
ロモーターが発見され、使用され、更にそれらのヌクレ
オチド配列に関する詳細が公表されるようになって、当
業者は、それらを機能的に形質転換ベクターの遺伝子に
連結できるようになった(Siebenlistら、Cell20:2
69(1980))。
と適合し得る種から誘導された複製およびコントロール
配列を含んでいるクローニングベクターは、これらの宿
主と関連して使用される。通常、ベクターは複製部位お
よび、形質転換細胞に選択性のある表現形質を提供でき
るマーキング(記号化)配列を保有している。例えばE.
coli は、E.coli の1株から誘導されたプラスミド
pBR322によって典型な形質転換を受ける(Boliver
ら、Gene,2:95(1977))。pBR322はアンピ
シリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含んでお
り、これは形質転換された細胞を容易に確認し得る手段
となる。発現に使用するためには、pBR322プラス
ミド、或いはその他の微生物プラスミドも、それ自身の
タンパク質を発現するためにその微生物によって使用さ
れ得るプロモーターを含有するか、または含有するよう
に修飾されなければならない。それらの組換えDNAの
構築(組み立て)に最も多く使用されるプロモーターは、
β−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトース・
プロモーター系(Changら、Nature,275:615(1
978);Itakuraら、Science,198:1056(19
77);(Goeddelら、Nature,281:544(197
9))、およびトリプトファン(trp)プロモーター系(Goe
ddelら、Nucleic Acids Res.,8:4057(19
80);EPO公告特許第0036776号)である。こ
れらが最も一般に使用されている間に、他の微生物のプ
ロモーターが発見され、使用され、更にそれらのヌクレ
オチド配列に関する詳細が公表されるようになって、当
業者は、それらを機能的に形質転換ベクターの遺伝子に
連結できるようになった(Siebenlistら、Cell20:2
69(1980))。
【0034】上記のベクターおよびプロモーターに含有
されるDNA配列を適切に開裂させ、先に概説した様に
して調製した2,5−DKGリダクターゼを暗号化して
いる遺伝子配列と連結し、あらゆる不必要な、或いは阻
害的な配列を欠失させ、原核性宿主細胞に導入して該酵
素を産生させる。次いで、この酵素を先に概説したよう
に純化するか、そのままの形でまたは細胞を破壊して直
接触媒として使用してもよく、或いは、一度形質転換す
れば、グルコースまたはその他の好適な代謝産物を所望
の2−KLG生成物へ完全に変換させる効果を挙げ得る
ように宿主を選択してもよい。
されるDNA配列を適切に開裂させ、先に概説した様に
して調製した2,5−DKGリダクターゼを暗号化して
いる遺伝子配列と連結し、あらゆる不必要な、或いは阻
害的な配列を欠失させ、原核性宿主細胞に導入して該酵
素を産生させる。次いで、この酵素を先に概説したよう
に純化するか、そのままの形でまたは細胞を破壊して直
接触媒として使用してもよく、或いは、一度形質転換す
れば、グルコースまたはその他の好適な代謝産物を所望
の2−KLG生成物へ完全に変換させる効果を挙げ得る
ように宿主を選択してもよい。
【0035】B.4 単一の組換え体微生物によるグル
コースまたは他の代謝産物の2−KLGへの変換 異種宿主中で酵素を発現させる組換え技術を利用して、
単一の宿主微生物で、容易に利用し得る代謝産物から2
−KLGを産生させようとする本発明の構想を達成する
ことができる。本方法は、二つの発酵を単一の生育し得
る微生物発酵に置き換えている点、およびこの変換に必
要な酸化−還元当量が少なくとも部分的に平衡であると
いう点で、現在使用されている方法よりかなり進歩して
いる。現在のところ、天然に存在する微生物で、この連
続した全段階を触媒できるものは知られていない。
コースまたは他の代謝産物の2−KLGへの変換 異種宿主中で酵素を発現させる組換え技術を利用して、
単一の宿主微生物で、容易に利用し得る代謝産物から2
−KLGを産生させようとする本発明の構想を達成する
ことができる。本方法は、二つの発酵を単一の生育し得
る微生物発酵に置き換えている点、およびこの変換に必
要な酸化−還元当量が少なくとも部分的に平衡であると
いう点で、現在使用されている方法よりかなり進歩して
いる。現在のところ、天然に存在する微生物で、この連
続した全段階を触媒できるものは知られていない。
【0036】然しながら、グルコースまたは、例えばガ
ラクトースまたはフルクトースのような通常の代謝産物
を、2,5−DKGへ変化させる微生物は知られてい
る。また2,5−DKGを2−KLGへ変換させる他の
一群の微生物も知られており、後者の変換は、当然その
微生物の持っている単一の酵素により触媒されるが、還
元当量を供給する該微生物の力を利用している。
ラクトースまたはフルクトースのような通常の代謝産物
を、2,5−DKGへ変化させる微生物は知られてい
る。また2,5−DKGを2−KLGへ変換させる他の
一群の微生物も知られており、後者の変換は、当然その
微生物の持っている単一の酵素により触媒されるが、還
元当量を供給する該微生物の力を利用している。
【0037】本発明が包含する単一微生物によって変換
を成就しようとする方策は、先に概要を示したような
2,5−DKGリダクターゼのための発現ベクターを構
築し、通常の代謝産物をこの酵素の基質である2,5−
DKGへまず変換させることができる細胞中へこのベク
ターを導入することから成る。実施例3に示すように、
この形質転換によって2−KLGを産生する単一の微生
物が得られた。該ベクターの構築、形質転換、形質転換
により得られた微生物の利用の詳細について本明細書で
概説する。
を成就しようとする方策は、先に概要を示したような
2,5−DKGリダクターゼのための発現ベクターを構
築し、通常の代謝産物をこの酵素の基質である2,5−
DKGへまず変換させることができる細胞中へこのベク
ターを導入することから成る。実施例3に示すように、
この形質転換によって2−KLGを産生する単一の微生
物が得られた。該ベクターの構築、形質転換、形質転換
により得られた微生物の利用の詳細について本明細書で
概説する。
【0038】もう一つの変法は、グルコースまたは通常
の代謝産物を2,5−DKGへ転換させることが知られ
ている酵素を暗号化している遺伝子を、それを含有して
いる微生物(先に列挙した)からクローン、発現し、それ
らクローンされた遺伝子配列を含有する発現ベクターを
構築し、そのようなベクターを正常にリダクターゼを産
生する細胞の形質転換に使用することである。第3の方
法は、通常の代謝産物から2−KLGへ至る経路の酵素
の完全な配列で中性宿主を形質転換する方法である。こ
の最後の方法は、それがどのような発育特性を所望しよ
うとも、またどのような栄養条件を必要としようとも、
自由に宿主微生物を選択できるという利点を有する。従
って、E.coli やBacilusのように培養および発育に
関して過去に合理的な経験を経ている遺伝形質を備えた
微生物を宿主細胞として使用することは、酵素または基
質を細菌的に産生する他の手段と等質な長所が得られ
る。
の代謝産物を2,5−DKGへ転換させることが知られ
ている酵素を暗号化している遺伝子を、それを含有して
いる微生物(先に列挙した)からクローン、発現し、それ
らクローンされた遺伝子配列を含有する発現ベクターを
構築し、そのようなベクターを正常にリダクターゼを産
生する細胞の形質転換に使用することである。第3の方
法は、通常の代謝産物から2−KLGへ至る経路の酵素
の完全な配列で中性宿主を形質転換する方法である。こ
の最後の方法は、それがどのような発育特性を所望しよ
うとも、またどのような栄養条件を必要としようとも、
自由に宿主微生物を選択できるという利点を有する。従
って、E.coli やBacilusのように培養および発育に
関して過去に合理的な経験を経ている遺伝形質を備えた
微生物を宿主細胞として使用することは、酵素または基
質を細菌的に産生する他の手段と等質な長所が得られ
る。
【0039】変換を行なう能力を持った微生物が作り出
されると、本発明法の過程は、組換え酵素のための発現
ベクターの構造の性質によって、また宿主の発育特性に
応じて種々の形で進行する。例えば、宿主微生物は大量
の細胞を産生するのに好ましい条件下で、そしてまた所
望の変換に関係する酵素を暗号化しているあらゆる異種
遺伝子の発現に不都合な条件下で発育させることになろ
う。大量の細胞が蓄積された時、暗号配列の転写と翻訳
が行なわれるように、その様な遺伝子配列により供給さ
れるプロモーターを活性化させるため、培地に好適なイ
ンデューサーまたはデリプレッサーを添加する。これら
の遺伝子の好適な発現により、また所望する触媒量の酵
素の存在のもとに、1〜500g/Lの量でグルコース
のような出発物質を培地に加え、20℃〜約40℃、好
ましくは25〜37℃付近で、数時間、2−KLGへの
変換が終了するまで培養する。出発物質の濃度は連続的
な供給調節によって一定濃度に保ち、産生された2−K
LGは公知技術によりバッチ方式または連続的に回収さ
れる。
されると、本発明法の過程は、組換え酵素のための発現
ベクターの構造の性質によって、また宿主の発育特性に
応じて種々の形で進行する。例えば、宿主微生物は大量
の細胞を産生するのに好ましい条件下で、そしてまた所
望の変換に関係する酵素を暗号化しているあらゆる異種
遺伝子の発現に不都合な条件下で発育させることになろ
う。大量の細胞が蓄積された時、暗号配列の転写と翻訳
が行なわれるように、その様な遺伝子配列により供給さ
れるプロモーターを活性化させるため、培地に好適なイ
ンデューサーまたはデリプレッサーを添加する。これら
の遺伝子の好適な発現により、また所望する触媒量の酵
素の存在のもとに、1〜500g/Lの量でグルコース
のような出発物質を培地に加え、20℃〜約40℃、好
ましくは25〜37℃付近で、数時間、2−KLGへの
変換が終了するまで培養する。出発物質の濃度は連続的
な供給調節によって一定濃度に保ち、産生された2−K
LGは公知技術によりバッチ方式または連続的に回収さ
れる。
【0040】C.本発明に採用した一般的方法 後述の実施例において、プローブの構築、スクリーニン
グ、プローブの所望の物質とのハイブリダイゼーショ
ン、およびベクターの組み立てに関しては、以下に示す
一般的方法を使用した。
グ、プローブの所望の物質とのハイブリダイゼーショ
ン、およびベクターの組み立てに関しては、以下に示す
一般的方法を使用した。
【0041】C.1 プローブの作成 合成DNAプローブは、カップリング剤として2,4,6
−トリイソプロピルベンゼンスルホニル−3−ニトロ−
1,2,4−トリアゾール(TPS−NT)(deRooij,J.
ら、Rec.Trav.Chim.Pays Bas,98:537(1
979))を使用することを除き、Crea,R.およびHor
n,T.(Nucleic Acids Res.,8:2231(198
0))の方法により調製した。
−トリイソプロピルベンゼンスルホニル−3−ニトロ−
1,2,4−トリアゾール(TPS−NT)(deRooij,J.
ら、Rec.Trav.Chim.Pays Bas,98:537(1
979))を使用することを除き、Crea,R.およびHor
n,T.(Nucleic Acids Res.,8:2231(198
0))の方法により調製した。
【0042】C.2 プラスミドの分離、制限酵素によ
る切断 プラスミドは、確認された培養から、Clewell,D.
B.およびHelinski,(Biochemistry 9:4428(1
970))の透明細胞分解法を用いて分離し、Biorad
A−50アガロース・カラムクロマトグラフィーにより
精製した。少量の場合(mini−preps)はBirnboim,H.
C.(Nucleic Acids Research,7:1513(19
79))の方法を用いて作成した。
る切断 プラスミドは、確認された培養から、Clewell,D.
B.およびHelinski,(Biochemistry 9:4428(1
970))の透明細胞分解法を用いて分離し、Biorad
A−50アガロース・カラムクロマトグラフィーにより
精製した。少量の場合(mini−preps)はBirnboim,H.
C.(Nucleic Acids Research,7:1513(19
79))の方法を用いて作成した。
【0043】クローンしたプラスミドの断片は、適当な
10〜50単位の制限酵素(群)で、その使用するその制
限酵素のための適切なバッファー(群)約600μl中、
約20μgのプラスミドを処理することにより調製し、
配列決定した。各酵素について37℃で1時間、インキ
ュベートした。各酵素を用いてインキュベーションした
後、タンパク質を除去し、核酸をフェノール−クロロホ
ルム抽出およびエタノール沈澱により回収した。変法と
して、プラスミドは、MnCl2の存在下にDNAaseI消
化によるか(Anderson,S.(1981).Nucleic Aci
ds Res.9,3015)、または超音波処理(Deinige
r,P.L.(1983).Analyt.Biochem.129,2
16)することにより断片化した。
10〜50単位の制限酵素(群)で、その使用するその制
限酵素のための適切なバッファー(群)約600μl中、
約20μgのプラスミドを処理することにより調製し、
配列決定した。各酵素について37℃で1時間、インキ
ュベートした。各酵素を用いてインキュベーションした
後、タンパク質を除去し、核酸をフェノール−クロロホ
ルム抽出およびエタノール沈澱により回収した。変法と
して、プラスミドは、MnCl2の存在下にDNAaseI消
化によるか(Anderson,S.(1981).Nucleic Aci
ds Res.9,3015)、または超音波処理(Deinige
r,P.L.(1983).Analyt.Biochem.129,2
16)することにより断片化した。
【0044】切断後、標品を、50nmolのdNTPを含
有する100μlのKlenow 緩衝液(5mM KPi、pH
7.5、7mM MgCl2、1mM BME)中のT4DN
Aポリメラーゼ、または10単位のKlnow DNAポリ
メラーゼで、1時間、37℃で処理した。タンパク質を
除去し、核酸を上記のように回収し、この核酸を40μ
lの展開(load)緩衝液に懸濁させ、上記の如く、サイズ
測定のための6%ポリアクリルアミドゲル上に展開した
(別法として、断片を直接M13ベクターにクローンし
ても良い)。
有する100μlのKlenow 緩衝液(5mM KPi、pH
7.5、7mM MgCl2、1mM BME)中のT4DN
Aポリメラーゼ、または10単位のKlnow DNAポリ
メラーゼで、1時間、37℃で処理した。タンパク質を
除去し、核酸を上記のように回収し、この核酸を40μ
lの展開(load)緩衝液に懸濁させ、上記の如く、サイズ
測定のための6%ポリアクリルアミドゲル上に展開した
(別法として、断片を直接M13ベクターにクローンし
ても良い)。
【0045】DNAの塩基配列決定は、断片をM13−
誘導ベクターにクローン(Messingら、(1981)Nucl
eic Acids Res.9,309)した後、ジヌクレオチ
ド鎖ターミネーション法(Sanger,F.ら(1977).
Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,5463)に
より行なった。
誘導ベクターにクローン(Messingら、(1981)Nucl
eic Acids Res.9,309)した後、ジヌクレオチ
ド鎖ターミネーション法(Sanger,F.ら(1977).
Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,5463)に
より行なった。
【0046】C.3 ライゲーション(連結)方法 開裂した発現プラスミドを含むDNAフラグメント(断
片)を、正しくマッチングする様にT4DNAリガーゼ
を用いて適当に末端修復した所望の成分と混合すること
により結合させた(例えば、0.25μgのプラスミドか
ら切り出されたベクター断片を、20μlの反応混合液
中で1μgのプラスミドから切り出した挿入体と混合す
る)。μg量のベクターおよび挿入成分に対して約10単
位のリガーゼが必要であった。次に、得られたプラスミ
ドベクターをE.coli K12 294株(ATCC3
1446)またはDH−1(ATCC33849)へ導入
することによりクローンした。形質転換およびクローニ
ングおよび形質転換されたコロニーの選別は、後に記載
する方法により実施した。所望する配列が存在するかど
うかは、選別されたコロニーからプラスミドを分離し、
前記した様にDNAの塩基配列を決定することにより確
認した。
片)を、正しくマッチングする様にT4DNAリガーゼ
を用いて適当に末端修復した所望の成分と混合すること
により結合させた(例えば、0.25μgのプラスミドか
ら切り出されたベクター断片を、20μlの反応混合液
中で1μgのプラスミドから切り出した挿入体と混合す
る)。μg量のベクターおよび挿入成分に対して約10単
位のリガーゼが必要であった。次に、得られたプラスミ
ドベクターをE.coli K12 294株(ATCC3
1446)またはDH−1(ATCC33849)へ導入
することによりクローンした。形質転換およびクローニ
ングおよび形質転換されたコロニーの選別は、後に記載
する方法により実施した。所望する配列が存在するかど
うかは、選別されたコロニーからプラスミドを分離し、
前記した様にDNAの塩基配列を決定することにより確
認した。
【0047】製法A 2,5−ジケト−D−グルコン酸ナトリウム(カルシウ
ム)の分離および特性決定 2,5−DKGは商業的に容易に入手し難いのでErwini
a herbicola,(ATTC21998)またはAcetobacer
cerinus,IFO3263から分離して製造した。2,
5−ジケト−D−グルコン酸ナトリウムはErwiniaの発
酵から、ブロスを100〜200メッシュの陰イオン交
換カラムAG1−X8を通し、水で洗滌し、0.05N
塩酸で溶出することにより分離した。2,5−ジケト−
D−グルコン酸を含有する分画をプールし、炭酸水素ナ
トリウムでpH5.5に中和し、凍結乾燥法により乾燥
した(例としてBernaerts,M.ら、Antonie van Le
euwenhoek 37:185(1971)参照)。特性決定は
HPLCおよびTLCから成る有機酸に有用な方法によ
り実施した(Gossele,F.Zbl.Bokt,Hyg.,1:Ab
t.Orig.C,178(1980))。13C NMRによ
り、およびWakisika,Y.Agr.Biol.Chem.28:
819(1964)の記載に従い、ビス−2,4−ジニト
ロフエニルヒドラゾンを作成することにより、この化合
物の同一性を確認した(カルシウム塩の場合は、濃縮し
たブロスを陽イオン交換樹脂(Dowex50、Ca2+型)カ
ラムに通し、次に水で溶出することにより製造してもよ
い。HPLC分析により2,5−DKGを含有する分画
を集め、凍結乾燥することにより希黄色のカルシウム塩
を得た)。以下の実施例により更に詳細に説明するが、
これらは本発明を限定するものではない。
ム)の分離および特性決定 2,5−DKGは商業的に容易に入手し難いのでErwini
a herbicola,(ATTC21998)またはAcetobacer
cerinus,IFO3263から分離して製造した。2,
5−ジケト−D−グルコン酸ナトリウムはErwiniaの発
酵から、ブロスを100〜200メッシュの陰イオン交
換カラムAG1−X8を通し、水で洗滌し、0.05N
塩酸で溶出することにより分離した。2,5−ジケト−
D−グルコン酸を含有する分画をプールし、炭酸水素ナ
トリウムでpH5.5に中和し、凍結乾燥法により乾燥
した(例としてBernaerts,M.ら、Antonie van Le
euwenhoek 37:185(1971)参照)。特性決定は
HPLCおよびTLCから成る有機酸に有用な方法によ
り実施した(Gossele,F.Zbl.Bokt,Hyg.,1:Ab
t.Orig.C,178(1980))。13C NMRによ
り、およびWakisika,Y.Agr.Biol.Chem.28:
819(1964)の記載に従い、ビス−2,4−ジニト
ロフエニルヒドラゾンを作成することにより、この化合
物の同一性を確認した(カルシウム塩の場合は、濃縮し
たブロスを陽イオン交換樹脂(Dowex50、Ca2+型)カ
ラムに通し、次に水で溶出することにより製造してもよ
い。HPLC分析により2,5−DKGを含有する分画
を集め、凍結乾燥することにより希黄色のカルシウム塩
を得た)。以下の実施例により更に詳細に説明するが、
これらは本発明を限定するものではない。
【0048】実施例1 Corynebacterium からの2,
5−DKGリダクターゼの分離と精製 A.細胞溶解(溶菌)および抽出 Corynebacterium 株ATCC31090を10lの発
酵釜で発育させ、対数増殖期に回収した。発酵液を遠心
分離することにより細胞ペーストを回収し、−20℃に
貯蔵した。450gの細胞ペーストを融解させ、650m
lの20mMトリスバッファー(pH8)に再度懸濁させ、
細胞を0.5M NaClで洗滌し、遠心分離により再回
収し、次いで2mg/mlのリゾチームを含有する650ml
のトリスバッファーに再度懸濁させて、細胞内タンパク
質を遊離させた。遠心分離により細胞残渣を溶解物質か
ら分離し、生成したペレットを非イオン洗滌剤であるツ
イーン80を0.1%(w/w)含有するトリスバッファー
で再抽出した。抽出物を2,5−DKGリダクターゼ活
性について測定し、プールした。
5−DKGリダクターゼの分離と精製 A.細胞溶解(溶菌)および抽出 Corynebacterium 株ATCC31090を10lの発
酵釜で発育させ、対数増殖期に回収した。発酵液を遠心
分離することにより細胞ペーストを回収し、−20℃に
貯蔵した。450gの細胞ペーストを融解させ、650m
lの20mMトリスバッファー(pH8)に再度懸濁させ、
細胞を0.5M NaClで洗滌し、遠心分離により再回
収し、次いで2mg/mlのリゾチームを含有する650ml
のトリスバッファーに再度懸濁させて、細胞内タンパク
質を遊離させた。遠心分離により細胞残渣を溶解物質か
ら分離し、生成したペレットを非イオン洗滌剤であるツ
イーン80を0.1%(w/w)含有するトリスバッファー
で再抽出した。抽出物を2,5−DKGリダクターゼ活
性について測定し、プールした。
【0049】B.イオン交換クロマトグラフィー 粗細胞抽出物(1260ml)をバッチ式にジエチルアミノ
エチルセルロース(Whatman DE−52、湿潤容量で
250ml)へ吸着させ、室温で0.5時間撹拌し、グラ
スフィルター漏斗でこのDE−52樹脂を回収した。D
E−52樹脂を5×30cmのカラムに充填し、基線(ベ
ースライン)が確定するまでトリスバッファーで洗滌し
た(A280=0.7、A260/A280=1.7、
これは核酸が徐々にカラムから洗い出されていることを
示していた)。次いで、カラムを0−1Mのリニアー濃
度勾配のNaCl(1200ml)で110ml/hrの流速を以
て溶出させ、分画を採取し、DKGリダクターゼ活性を
測定した。明らかなDKG還元触媒活性を示す2個のピ
ークが認められた:約0.4MNaClで溶出して来るピ
ークは所望の2,5−DKGリダクターゼを含有してい
た(2,5−DKGを2−KLGへ変換させる);約0.2
5MNaClで溶出して来るもう1個のピークは2,5−
DKGを2−LKGへ変換しなかった。
エチルセルロース(Whatman DE−52、湿潤容量で
250ml)へ吸着させ、室温で0.5時間撹拌し、グラ
スフィルター漏斗でこのDE−52樹脂を回収した。D
E−52樹脂を5×30cmのカラムに充填し、基線(ベ
ースライン)が確定するまでトリスバッファーで洗滌し
た(A280=0.7、A260/A280=1.7、
これは核酸が徐々にカラムから洗い出されていることを
示していた)。次いで、カラムを0−1Mのリニアー濃
度勾配のNaCl(1200ml)で110ml/hrの流速を以
て溶出させ、分画を採取し、DKGリダクターゼ活性を
測定した。明らかなDKG還元触媒活性を示す2個のピ
ークが認められた:約0.4MNaClで溶出して来るピ
ークは所望の2,5−DKGリダクターゼを含有してい
た(2,5−DKGを2−KLGへ変換させる);約0.2
5MNaClで溶出して来るもう1個のピークは2,5−
DKGを2−LKGへ変換しなかった。
【0050】C.アフィニティクロマトグラフィー DE−52カラムから0.4Mで溶出したピークを20
mMトリスバッファー(pH8.0)に対して一夜透析した
後、Amicon Matrex Gel Blue A(この樹脂は、
染料(Cibacron blue F3GA)と共有結合している
アガロースビーズから成っており、NADHまたはNA
DPHを補因子として利用する酵素に対し親和性を有す
る)の2.5×4.5のカラムに掛けた。カラムをトリ
スバッファーで洗滌し、1.0mMのNADPで溶出し
た。分画を採取し、DKGリダクターゼ活性を測定し、
活性分画プールを限外濾過により(Amicon stirredcel
l、YM−5メンブラン)16倍まで濃縮した。
mMトリスバッファー(pH8.0)に対して一夜透析した
後、Amicon Matrex Gel Blue A(この樹脂は、
染料(Cibacron blue F3GA)と共有結合している
アガロースビーズから成っており、NADHまたはNA
DPHを補因子として利用する酵素に対し親和性を有す
る)の2.5×4.5のカラムに掛けた。カラムをトリ
スバッファーで洗滌し、1.0mMのNADPで溶出し
た。分画を採取し、DKGリダクターゼ活性を測定し、
活性分画プールを限外濾過により(Amicon stirredcel
l、YM−5メンブラン)16倍まで濃縮した。
【0051】D.高速液体クロマトグラフィー(HPL
C) Blue Aカラムから得られた濃縮物質を20mMトリス
バッファー(pH8.0)に対して一夜透析した後、20
0mMの炭酸水素アンモニウムで緩衝化したAltex T
SKカラム(0.5×60cm)に掛けた(TSKカラムは
タンパク質を分子量によって分別する)。2,5−DKG
リダクターゼ活性体は45,000ダルトンの分子量に
相対する単一のピークで溶出され、99%以上の純度を
示した。即ちこの規準によればホモジニアス(均質)であ
った。
C) Blue Aカラムから得られた濃縮物質を20mMトリス
バッファー(pH8.0)に対して一夜透析した後、20
0mMの炭酸水素アンモニウムで緩衝化したAltex T
SKカラム(0.5×60cm)に掛けた(TSKカラムは
タンパク質を分子量によって分別する)。2,5−DKG
リダクターゼ活性体は45,000ダルトンの分子量に
相対する単一のピークで溶出され、99%以上の純度を
示した。即ちこの規準によればホモジニアス(均質)であ
った。
【0052】実施例2 Corynebacterium2,5−DK
Gリダクターゼの特性決定 A.電気泳動 この酵素を、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の存在下
にアクリルアミドゲル中で電気泳動した。非還元的条件
および還元的条件のいずれにおいても、約34,000
ダルトンの分子量に相当する単一のタンパク質のバンド
を認めた。45,000ダルトンの範囲にはタンパク質
を認めなかった(HPLCでは認められた)。
Gリダクターゼの特性決定 A.電気泳動 この酵素を、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の存在下
にアクリルアミドゲル中で電気泳動した。非還元的条件
および還元的条件のいずれにおいても、約34,000
ダルトンの分子量に相当する単一のタンパク質のバンド
を認めた。45,000ダルトンの範囲にはタンパク質
を認めなかった(HPLCでは認められた)。
【0053】B.N−末端アミノ酸配列 アミノ酸配列のデータから、純化した酵素は単一のN−
末端配列を含んでいることがわかった。(μは未測定)
末端配列を含んでいることがわかった。(μは未測定)
【化4】
【0054】C.アミノ酸組成 アミノ酸加水分解の結果、次の組成を得た。
【表1】 アミノ酸 モル% アミノ酸 モル% asx 11.52 met 1.36 thr 4.75 ile 4.82 ser 3.85 leu 7.90 glx 10.47 tyr 2.40 pro 6.15 phe 2.37 gly 8.22 his 3.67 ala 14.69 lys 3.10 cys 0.00 arg 5.21 val 7.47 trp 2.05
【0055】D.速度論的パラメーター、基質特異性お
よび補因子要求性 速度論パラメーターの測定に以下の測定条件を使用し
た。 リン酸ナトリウム緩衝液 150mM,pH6.4, 25℃ NADPH 11〜300μM 酵素 10μg 2,5−DKG 0.43〜43mM 測定容量 1.0ml ミヒヤエル恒数(Km)2,5−DKG 15.5mM NADPH 33.7μM 最大速度(Vmax) 9.8単位/mg (1単位=1.0μモル/分)
よび補因子要求性 速度論パラメーターの測定に以下の測定条件を使用し
た。 リン酸ナトリウム緩衝液 150mM,pH6.4, 25℃ NADPH 11〜300μM 酵素 10μg 2,5−DKG 0.43〜43mM 測定容量 1.0ml ミヒヤエル恒数(Km)2,5−DKG 15.5mM NADPH 33.7μM 最大速度(Vmax) 9.8単位/mg (1単位=1.0μモル/分)
【0056】この酵素はNADPHに特異性を有する。
2−KDG、5−KDG、D−グルコン酸、2−KL
G、NADHでは何ら活性を認めなかった。Mg++、Mn
++、Ca++、Zn++、EDTA、システイン、ADP、A
TPの存在下で、何ら活性に変化を認めなかった。
2−KDG、5−KDG、D−グルコン酸、2−KL
G、NADHでは何ら活性を認めなかった。Mg++、Mn
++、Ca++、Zn++、EDTA、システイン、ADP、A
TPの存在下で、何ら活性に変化を認めなかった。
【0057】E.至適pH pH6.4で最高の活性が認められた。この酵素は、pH
5.0〜7.6の広い範囲にわたって活性を示した。
5.0〜7.6の広い範囲にわたって活性を示した。
【0058】F.立体特異性および定量的変換 2,5−DKGの2−KLGへの変換を計量するため
に、0.1モルのトリス:Cl(pH7.5)1ml中に2,5
−DKG、1.33mMのNADPH、0.3mgの2,5
−DKGリダクターゼを含有させて反応を行なった。2
5℃で5時間後、反応を停止し、NADPH酸化と2−
KLGの生成を分析した。0.4mMのNADPHの酸
化に相当する380nmにおける吸収の変化が観察され
た。有機酸カラムによるHPLC分析では0.42mM
の2−KLGに相当する単一のピークが認められた。2
−KDG(2−ケト−D−グルコン酸)または5−KDG
(5−ケト−D−グルコン酸)は認められなかった。この
HPLC分析の結果は、更に、凍結乾燥した反応混合物
に30分、90℃でトリメチルシリルイミダゾール/ピ
リジン(50/50)を添加して調製した過トリメチルシ
リル化誘導体を、5%の交差結合フエニルメチルシリコ
ン融解シリカ結合キャピラリーカラム(25m)を用い
たGC−MS分析により確かめられた。薄層クロマトグ
ラフィの結果も上記の結果と一致した。
に、0.1モルのトリス:Cl(pH7.5)1ml中に2,5
−DKG、1.33mMのNADPH、0.3mgの2,5
−DKGリダクターゼを含有させて反応を行なった。2
5℃で5時間後、反応を停止し、NADPH酸化と2−
KLGの生成を分析した。0.4mMのNADPHの酸
化に相当する380nmにおける吸収の変化が観察され
た。有機酸カラムによるHPLC分析では0.42mM
の2−KLGに相当する単一のピークが認められた。2
−KDG(2−ケト−D−グルコン酸)または5−KDG
(5−ケト−D−グルコン酸)は認められなかった。この
HPLC分析の結果は、更に、凍結乾燥した反応混合物
に30分、90℃でトリメチルシリルイミダゾール/ピ
リジン(50/50)を添加して調製した過トリメチルシ
リル化誘導体を、5%の交差結合フエニルメチルシリコ
ン融解シリカ結合キャピラリーカラム(25m)を用い
たGC−MS分析により確かめられた。薄層クロマトグ
ラフィの結果も上記の結果と一致した。
【0059】実施例3 組換え体2,5−DKGリダク
ターゼ A.プローブの設計 Corynebacterium 株(ATCC31090)DNAのT
mを測定したところ、7.5mMリン酸ナトリウム、1m
MEDTA(pH6.8)の溶液中で81.5℃であっ
た。これは標準として使用したPseudomonas aerugino
sa のDNA(Tm=79.7℃,G+C=67%)からの
(G+C)含量71%に相当する。したがって、構築に当
たって、高(G+C)含量の細菌DNA中にいきわたって
いることが知られているコドン(Goug,M.ら、Nuclei
c Acids Res.10,7055(1982))を使用し
た:phe,TTC;lys,AAG;val,GTG;pro,CCG;al
a,GCC;asp,GAC;gln,CAG;arg,CGC;glu,GA
G;asn,AAC;ser,TCC;ile,ATC;leu,CTG;gl
y,GGC;tyr,TAC。Corynebacterium 株(ATCC
31090)から得られた2,5−DKGリダクターゼの
部分的なアミノ酸配列は実施例2に示されている:この
配列と上記のコドンの配列を使用し、Andersonおよび
Kingstonの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA
80,6838(1983))を用いて好適なプローブを
構築した。Crea,R.ら(Nucleic Acids Res.,
8:2331(1980)のフォスフォトリエステル法に
より2つの43量体、即ち
ターゼ A.プローブの設計 Corynebacterium 株(ATCC31090)DNAのT
mを測定したところ、7.5mMリン酸ナトリウム、1m
MEDTA(pH6.8)の溶液中で81.5℃であっ
た。これは標準として使用したPseudomonas aerugino
sa のDNA(Tm=79.7℃,G+C=67%)からの
(G+C)含量71%に相当する。したがって、構築に当
たって、高(G+C)含量の細菌DNA中にいきわたって
いることが知られているコドン(Goug,M.ら、Nuclei
c Acids Res.10,7055(1982))を使用し
た:phe,TTC;lys,AAG;val,GTG;pro,CCG;al
a,GCC;asp,GAC;gln,CAG;arg,CGC;glu,GA
G;asn,AAC;ser,TCC;ile,ATC;leu,CTG;gl
y,GGC;tyr,TAC。Corynebacterium 株(ATCC
31090)から得られた2,5−DKGリダクターゼの
部分的なアミノ酸配列は実施例2に示されている:この
配列と上記のコドンの配列を使用し、Andersonおよび
Kingstonの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA
80,6838(1983))を用いて好適なプローブを
構築した。Crea,R.ら(Nucleic Acids Res.,
8:2331(1980)のフォスフォトリエステル法に
より2つの43量体、即ち
【化5】 5'GGCCTCCTCCACGGCGCGCTGGGCGTCGGCCGGC GGCACCTTG3' および
【化6】 5'CTCCATCCCGCAGCTGGGCTACGGCGTGTTCAAG GTGCCGCCG3' を合成した。このオリゴヌクレオチドプローブを100
μCi〔r−32P〕ATP(5,000Ci/mmole,Amersh
am)およびポリヌクレオチドキナーゼ(P−LBiochemic
als)によりリン酸化する。
μCi〔r−32P〕ATP(5,000Ci/mmole,Amersh
am)およびポリヌクレオチドキナーゼ(P−LBiochemic
als)によりリン酸化する。
【0060】B.プラスミドゲノムライブラリーの構築 Shillerらの方法(Antimicro.Agents Chemotherap
y 18,814(1980))により、Corynebacterium
株ATCC31090からゲノムDNAを分離した。
大きい断片(>100kb)をCsCl密度勾配遠心分離法で
純化し、Sau3Aにより部分的に消化した。消化物をア
ガロースゲル電気泳動により、1−2kb、2−3kb、3
−4kb、および4−6kbの大きさ別に組分けしてサイズ
分画した。ゲノムライブラリーは、BamHI部位の切断
と、T4DNAリガーゼを用いたSau3A断片の挿入に
より、ベクターpBR322およびpACYC184を用
いて各サイズ毎のDNA断片から作製した(Boliver,F
ら、Gene2,95(1977);Chang,A.C.Y.,お
よびCohen,S.N.J.Bacteriol.134,1141
(1978))。D.Hanahanの形質転換のプロトコール
(J.Mol.Biol.,166 557(1983))を用い
て、得られたプラスミドを用いてE.coli株NM294
(ATCC31446)またはDH−1(ATCC338
49)のrecA- 誘導株を形質転換にした。各ゲノムラ
イブラリーは104〜105の独立した組換え体から成っ
ていた。(変法として、Corynebacterium株(ATCC3
1090)DNAのBamHI断片(サイズ幅2.0〜2.
5kb)およびPst断片(サイズ幅0.5〜1.5kb)を用
いてpBR322から別のプラスミドライブラリーを作
製しても良い)。
y 18,814(1980))により、Corynebacterium
株ATCC31090からゲノムDNAを分離した。
大きい断片(>100kb)をCsCl密度勾配遠心分離法で
純化し、Sau3Aにより部分的に消化した。消化物をア
ガロースゲル電気泳動により、1−2kb、2−3kb、3
−4kb、および4−6kbの大きさ別に組分けしてサイズ
分画した。ゲノムライブラリーは、BamHI部位の切断
と、T4DNAリガーゼを用いたSau3A断片の挿入に
より、ベクターpBR322およびpACYC184を用
いて各サイズ毎のDNA断片から作製した(Boliver,F
ら、Gene2,95(1977);Chang,A.C.Y.,お
よびCohen,S.N.J.Bacteriol.134,1141
(1978))。D.Hanahanの形質転換のプロトコール
(J.Mol.Biol.,166 557(1983))を用い
て、得られたプラスミドを用いてE.coli株NM294
(ATCC31446)またはDH−1(ATCC338
49)のrecA- 誘導株を形質転換にした。各ゲノムラ
イブラリーは104〜105の独立した組換え体から成っ
ていた。(変法として、Corynebacterium株(ATCC3
1090)DNAのBamHI断片(サイズ幅2.0〜2.
5kb)およびPst断片(サイズ幅0.5〜1.5kb)を用
いてpBR322から別のプラスミドライブラリーを作
製しても良い)。
【0061】C.E.coli におけるプラスミドライブ
ラリーのスクリーニング コロニー群をマイクロ滴定皿に採取し、一夜インキュベ
ートしてから、アンピシリンまたはクロラムフェニコー
ルを含有するLBプレート上に設置したニトロセルロー
スフィルター(BA85)にスタンプした。マイクロ滴定
皿に残った部分のコロニーは42%のDMSOを加えて
保管し、−20℃に貯蔵した。
ラリーのスクリーニング コロニー群をマイクロ滴定皿に採取し、一夜インキュベ
ートしてから、アンピシリンまたはクロラムフェニコー
ルを含有するLBプレート上に設置したニトロセルロー
スフィルター(BA85)にスタンプした。マイクロ滴定
皿に残った部分のコロニーは42%のDMSOを加えて
保管し、−20℃に貯蔵した。
【0062】移植された部分のコロニーは8〜9時間、
37℃でインキュベートした後、フイルターから、1
2.5μg/mlのクロラムフェニコールまたはスペクチ
ノマイシンを含有しているプレートへ移し換え、一夜、
37℃でインキュベートすることにより増幅した。
37℃でインキュベートした後、フイルターから、1
2.5μg/mlのクロラムフェニコールまたはスペクチ
ノマイシンを含有しているプレートへ移し換え、一夜、
37℃でインキュベートすることにより増幅した。
【0063】E.coli 内のプラスミドライブラリーを
フイルターハイブリダイゼーションによりスクリーニン
グする。DNAを変性し、Itakura,Kら(Nucleic A
cidsRes.9:879〜894(1981))の記載した方
法により重複フィルターに結合させる。このハイブリダ
イゼーション用のフイルターを、フイルター当り約10
mlの5×SET、5×Denhardt溶液および50μg/ml
の変性したサケ***DNA、および0.1%ピロリン酸
ナトリウム+20%ホルムアミド中に浸漬する(5×S
ET=50mMトリス−HCl(pH8.0)、5mMEDT
A、500mMNaCl;5×Denhardtの溶液=0.1%
ウシ血清アルブミン、0.1%ポリビニルピロリドン、
0.1%フイコール;Denhardt、Biochem.Biophys.
Res.Comm.,23:641(1966)参照)。フイルタ
ーを42℃で14〜16時間、絶えず撹拌しながらプレ
ハイブリダイズし、本実施例のA項において調製した〜
1×108cpmのプローブと42℃でプローブした。A項
のプローブとハイブリダイズしたフイルタを、42℃で
0.2×SSC、0.1%SDS、0.1%ピロリン酸
ナトリウムで30分間づつ3回洗滌した。2つのフイル
ターのそれぞれをドライブロッチングし、台紙につけ、
Dupont Cronex11Rエキストラライフライトニング
−プラスインテンシファイングスクリーンを持ったKod
ak XR5X線フイルムに−70℃で4〜24時間、感
光させた。
フイルターハイブリダイゼーションによりスクリーニン
グする。DNAを変性し、Itakura,Kら(Nucleic A
cidsRes.9:879〜894(1981))の記載した方
法により重複フィルターに結合させる。このハイブリダ
イゼーション用のフイルターを、フイルター当り約10
mlの5×SET、5×Denhardt溶液および50μg/ml
の変性したサケ***DNA、および0.1%ピロリン酸
ナトリウム+20%ホルムアミド中に浸漬する(5×S
ET=50mMトリス−HCl(pH8.0)、5mMEDT
A、500mMNaCl;5×Denhardtの溶液=0.1%
ウシ血清アルブミン、0.1%ポリビニルピロリドン、
0.1%フイコール;Denhardt、Biochem.Biophys.
Res.Comm.,23:641(1966)参照)。フイルタ
ーを42℃で14〜16時間、絶えず撹拌しながらプレ
ハイブリダイズし、本実施例のA項において調製した〜
1×108cpmのプローブと42℃でプローブした。A項
のプローブとハイブリダイズしたフイルタを、42℃で
0.2×SSC、0.1%SDS、0.1%ピロリン酸
ナトリウムで30分間づつ3回洗滌した。2つのフイル
ターのそれぞれをドライブロッチングし、台紙につけ、
Dupont Cronex11Rエキストラライフライトニング
−プラスインテンシファイングスクリーンを持ったKod
ak XR5X線フイルムに−70℃で4〜24時間、感
光させた。
【0064】陽性コロニーの細胞を増殖させ、プラスミ
ドDNAをClewellおよびHelinskiの方法(Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 62,1159(1969))
によって分離した。DNAをAluIおよびPstIにより
断片化し、ベクターM13mp8およびM13mp9にサブ
クローンした(Messing,J.およびViera,J.、Gene
19,269(1982)。プローブとハイブリッド形
成したサブクローンを、そのDNAが2,5−DKGリ
ダクターゼを暗号化していることを確かめるため、ジデ
オキシ鎖ターミネーション法により塩基配列決定した
(Sanger,F.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(US
A)74:5463(1977))。
ドDNAをClewellおよびHelinskiの方法(Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 62,1159(1969))
によって分離した。DNAをAluIおよびPstIにより
断片化し、ベクターM13mp8およびM13mp9にサブ
クローンした(Messing,J.およびViera,J.、Gene
19,269(1982)。プローブとハイブリッド形
成したサブクローンを、そのDNAが2,5−DKGリ
ダクターゼを暗号化していることを確かめるため、ジデ
オキシ鎖ターミネーション法により塩基配列決定した
(Sanger,F.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(US
A)74:5463(1977))。
【0065】D.2,5−DKGリダクターゼ遺伝子の
ための発現ベクターの構築 それ自身の、または合成されたリボソーム結合部位を伴
なった2,5−DKGリダクターゼ遺伝子を、テトラサ
イクリン耐性遺伝子またはそれ以外の選択マーカーを有
し、またプラスミドCol EI、15A、またはRSF
1010から誘導された複製起源を含んでいる発現プラ
スミド上のE.coli trp(またはtac)プロモーターまた
はpACYC 184 CATプロモーターの“下流"に
挿入する。組立て物のあるものは、更に、外部から添加
されたインドールアクリル酸またはIPTGによって
2,5−DKGリダクターゼ遺伝子の発現を調節するこ
とができるE.coli trpレプレッサーまたはE.coli
lac レプレッサーを暗号化している活性遺伝子を含
有していてもよい。上記のプラスミドの種々の突然変異
体もまた、2,5−DKGリダクターゼの発現に利用さ
れる。
ための発現ベクターの構築 それ自身の、または合成されたリボソーム結合部位を伴
なった2,5−DKGリダクターゼ遺伝子を、テトラサ
イクリン耐性遺伝子またはそれ以外の選択マーカーを有
し、またプラスミドCol EI、15A、またはRSF
1010から誘導された複製起源を含んでいる発現プラ
スミド上のE.coli trp(またはtac)プロモーターまた
はpACYC 184 CATプロモーターの“下流"に
挿入する。組立て物のあるものは、更に、外部から添加
されたインドールアクリル酸またはIPTGによって
2,5−DKGリダクターゼ遺伝子の発現を調節するこ
とができるE.coli trpレプレッサーまたはE.coli
lac レプレッサーを暗号化している活性遺伝子を含
有していてもよい。上記のプラスミドの種々の突然変異
体もまた、2,5−DKGリダクターゼの発現に利用さ
れる。
【0066】E.2,5−DKGリダクターゼ発現ベク
ターの構築 2,5−DKGリダクターゼ遺伝子の一部を含有するCo
rynebacteriumSP(ATCC31090)DNAのクロ
ーンされた2.2kb BamHI断片(フラグメント)を、
実施例3に記載された43量体プローブで分離した。こ
のプラスミドの0.12kb PstI/BamHI断片を、
残りの遺伝子を含有しているCorynebacteriumSP D
NAの重複している0.88kb PstI断片を分離する
ためのプローブとして使用した。図2に示すように、p
DKGR2(2.2kb BamHI断片を含有している)を
NcoIで消化し、E.coli DNAポリメラーゼI K
lenow 断片およびdNTPsで処理して平滑末端を作
り、次いで更にBamHIで消化して0.87kbの断片を
遊離させた;この断片は低融点アガロース上を電気泳動
させて精製した。プラスミドpDKG29(0.88kb
PstI断片を含んでいる)をPst IおよびBamHIで
消化し、生成した0.76kb断片を同様に低融点アガロ
ース上で分離した。この0.87kb NcoI/BamHI
断片と0.76kbBamHI/PstI断片をSmaI/Pst
Iで消化したM13m9と混合し、ライゲーションして
完全な2,5−DKGリダクターゼ遺伝子を含有してい
るCorynebacterium SP DNAの1.6kbを挿入体
を持ったM13組換え体(“mit12”)を得た(図2)。
ターの構築 2,5−DKGリダクターゼ遺伝子の一部を含有するCo
rynebacteriumSP(ATCC31090)DNAのクロ
ーンされた2.2kb BamHI断片(フラグメント)を、
実施例3に記載された43量体プローブで分離した。こ
のプラスミドの0.12kb PstI/BamHI断片を、
残りの遺伝子を含有しているCorynebacteriumSP D
NAの重複している0.88kb PstI断片を分離する
ためのプローブとして使用した。図2に示すように、p
DKGR2(2.2kb BamHI断片を含有している)を
NcoIで消化し、E.coli DNAポリメラーゼI K
lenow 断片およびdNTPsで処理して平滑末端を作
り、次いで更にBamHIで消化して0.87kbの断片を
遊離させた;この断片は低融点アガロース上を電気泳動
させて精製した。プラスミドpDKG29(0.88kb
PstI断片を含んでいる)をPst IおよびBamHIで
消化し、生成した0.76kb断片を同様に低融点アガロ
ース上で分離した。この0.87kb NcoI/BamHI
断片と0.76kbBamHI/PstI断片をSmaI/Pst
Iで消化したM13m9と混合し、ライゲーションして
完全な2,5−DKGリダクターゼ遺伝子を含有してい
るCorynebacterium SP DNAの1.6kbを挿入体
を持ったM13組換え体(“mit12”)を得た(図2)。
【0067】このmit12の一本鎖DNAに“欠失プラ
イマー"(配列:
イマー"(配列:
【化7】 ACGGCCAGTGAATTCTATGACAGTTCCCAGC) およびM13m9DNAのAluI断片をアニーリングし
た。この鋳型−プライマー組み合せ物を、dNTPsおよ
びT4DNAリガーゼの存在下に、E.coli DNAポ
リメラーゼKlenow 断片で処理すると、Adelmanらの
記載(DNA2,183(1983))のように、インビト
ロでヘテロデュプレックスmit12RF分子が作成され
た。これらの分子を宿主tM101の形質転換に使用
し、所望の欠失を備えた組換え体ファージを、欠失プラ
イマーをプローブとして使用したプラークハイブリダイ
ゼーションによって検出した(AdelmanらDNA2,18
3(1983))。この構造物はmit12△と命名された
(図3)。
た。この鋳型−プライマー組み合せ物を、dNTPsおよ
びT4DNAリガーゼの存在下に、E.coli DNAポ
リメラーゼKlenow 断片で処理すると、Adelmanらの
記載(DNA2,183(1983))のように、インビト
ロでヘテロデュプレックスmit12RF分子が作成され
た。これらの分子を宿主tM101の形質転換に使用
し、所望の欠失を備えた組換え体ファージを、欠失プラ
イマーをプローブとして使用したプラークハイブリダイ
ゼーションによって検出した(AdelmanらDNA2,18
3(1983))。この構造物はmit12△と命名された
(図3)。
【0068】このmit12△ RF DNAをEco R
IおよびHindIIIで消化すると、2,5−DKGリダ
クターゼ遺伝子を含有している1.5kbの断片が得られ
た。ヒト成長ホルモン発現プラスミドpHGH207−
1ptrp△RI5'〔pH GH207−1ptrp △RI
5'はpHGH207−1の誘導体(de Boerら(198
3),Proc.Natl.Acad.Sci.,USA80,21)で
あって、アンピシリン耐性遺伝子とtrpプロモーターの
間のEcoRI部位が欠失している〕をEcoRIとPstI
で消化して、E.coli trp プロモーターを含有する
1.0kbの断片を得、また、pBR322をPstIとHi
ndIIIで消化して3.6kbの断片を作成した。これら
3個の断片をライゲーション(連結)することによって、
2,5−DKGリダクターゼの発現プラスミドを形成
し、これをpmit12△/trp1と命名した(図3)。この
プラスミドは宿主にテトラサイクリン耐性を付与するこ
とはできない。完全なテトラサイクリン耐性機能を暗号
化しているプラスミドは、次のようにして構築された。
Pmit12△/trp1DNAをHindIIIで消化し、
E.coli DNAポリメラーゼI Klenow 断片とdN
TPsで処理して平滑末端DNAを生成し、次にこれを
SphIで消化した;得られた5.6kb断片を低融点アガ
ロース上で電気泳動させることにより精製した。同様に
して、pBR322DNAをEcoRIで消化し、E.col
i DNAポリメラーゼI Klenow 断片とdNTPsで
処理し、SphIで消化し、得られた0.56kb断片を低
融点アガロース上で精製した。次に、これらの5.6kb
断片と0.56kb断片とを連結(ライゲーション)し、テ
トラサイクリン耐性の2,5−DKGリダクターゼ発現
プラスミドを得、これを、ptrpl−35と命名した(図
3)。このプラスミドに含まれているtrpプロモーター、
合成リボソーム結合部位、および2,5−DKGリダク
ターゼ遺伝子のDNA配列を図4に示す。
IおよびHindIIIで消化すると、2,5−DKGリダ
クターゼ遺伝子を含有している1.5kbの断片が得られ
た。ヒト成長ホルモン発現プラスミドpHGH207−
1ptrp△RI5'〔pH GH207−1ptrp △RI
5'はpHGH207−1の誘導体(de Boerら(198
3),Proc.Natl.Acad.Sci.,USA80,21)で
あって、アンピシリン耐性遺伝子とtrpプロモーターの
間のEcoRI部位が欠失している〕をEcoRIとPstI
で消化して、E.coli trp プロモーターを含有する
1.0kbの断片を得、また、pBR322をPstIとHi
ndIIIで消化して3.6kbの断片を作成した。これら
3個の断片をライゲーション(連結)することによって、
2,5−DKGリダクターゼの発現プラスミドを形成
し、これをpmit12△/trp1と命名した(図3)。この
プラスミドは宿主にテトラサイクリン耐性を付与するこ
とはできない。完全なテトラサイクリン耐性機能を暗号
化しているプラスミドは、次のようにして構築された。
Pmit12△/trp1DNAをHindIIIで消化し、
E.coli DNAポリメラーゼI Klenow 断片とdN
TPsで処理して平滑末端DNAを生成し、次にこれを
SphIで消化した;得られた5.6kb断片を低融点アガ
ロース上で電気泳動させることにより精製した。同様に
して、pBR322DNAをEcoRIで消化し、E.col
i DNAポリメラーゼI Klenow 断片とdNTPsで
処理し、SphIで消化し、得られた0.56kb断片を低
融点アガロース上で精製した。次に、これらの5.6kb
断片と0.56kb断片とを連結(ライゲーション)し、テ
トラサイクリン耐性の2,5−DKGリダクターゼ発現
プラスミドを得、これを、ptrpl−35と命名した(図
3)。このプラスミドに含まれているtrpプロモーター、
合成リボソーム結合部位、および2,5−DKGリダク
ターゼ遺伝子のDNA配列を図4に示す。
【0069】E.組換え2,5−DKGリダクターゼの
製造 形質転換に用いる細胞はLacyおよびSparksの方法(Ph
ytopathological Society,69:1293−1297
(1979))により用意した。簡単に述べると、好適な
宿主細胞、Erwinia herbicola (ATCC2199
8)、またはE.coli MM294(ATCC31464
6)の1白金耳を5mlのLB培地に接種し、30℃で1
4〜16時間、インキュベートした。この一夜を置いた
増殖物の1:100の希釈液をLB培地に接種し、OD
590が0.4となるまで培養し、4℃で遠心分離して、
細胞を回収した。回収したペレットを1/3量の10m
MNaClに再び懸濁し、4℃で再び遠心分離し、ペレッ
トを再び同量の30mMCaCl2に懸濁し、0℃で60分
間放置後、再び4℃で遠心分離し細胞を回収した。ペレ
ットを1/12容量の30mMCaCl2に再び懸濁し、4
℃で一夜貯蔵した。(別法として、細胞を30mMCaCl
2と15%グリセロールに再懸濁し、−70℃で貯蔵し
ても良い。)
製造 形質転換に用いる細胞はLacyおよびSparksの方法(Ph
ytopathological Society,69:1293−1297
(1979))により用意した。簡単に述べると、好適な
宿主細胞、Erwinia herbicola (ATCC2199
8)、またはE.coli MM294(ATCC31464
6)の1白金耳を5mlのLB培地に接種し、30℃で1
4〜16時間、インキュベートした。この一夜を置いた
増殖物の1:100の希釈液をLB培地に接種し、OD
590が0.4となるまで培養し、4℃で遠心分離して、
細胞を回収した。回収したペレットを1/3量の10m
MNaClに再び懸濁し、4℃で再び遠心分離し、ペレッ
トを再び同量の30mMCaCl2に懸濁し、0℃で60分
間放置後、再び4℃で遠心分離し細胞を回収した。ペレ
ットを1/12容量の30mMCaCl2に再び懸濁し、4
℃で一夜貯蔵した。(別法として、細胞を30mMCaCl
2と15%グリセロールに再懸濁し、−70℃で貯蔵し
ても良い。)
【0070】形質転換は、0.2mlのコンピテント細胞
と1μgのプラスミドを0℃で2時間インキュベート
し、次いで1分間42℃に加温することにより行なっ
た。3mlのLBブロスをこれに加え、4時間37℃で放
置して、細胞を回復させ、次いで細胞をLacyおよびSp
arks(上述)記載の選択培地で培養した。成功した形質転
換体をO.D.550=1.0の密度となるまで増殖さ
せ、次いで遠心分離し、0.2%のグルコースを含む最
少量の培地に再懸濁させた。次に、IAAまたはIPT
Gを培地に添加し、0.5〜1時間後、遠心分離して細
胞を回収し、リゾチームと界面活性剤(Tween80)で処
理して細胞を溶解(溶菌)させた。
と1μgのプラスミドを0℃で2時間インキュベート
し、次いで1分間42℃に加温することにより行なっ
た。3mlのLBブロスをこれに加え、4時間37℃で放
置して、細胞を回復させ、次いで細胞をLacyおよびSp
arks(上述)記載の選択培地で培養した。成功した形質転
換体をO.D.550=1.0の密度となるまで増殖さ
せ、次いで遠心分離し、0.2%のグルコースを含む最
少量の培地に再懸濁させた。次に、IAAまたはIPT
Gを培地に添加し、0.5〜1時間後、遠心分離して細
胞を回収し、リゾチームと界面活性剤(Tween80)で処
理して細胞を溶解(溶菌)させた。
【0071】上清を取り、2,5−DKGリダクターゼ
の存在を実施例2Dに示した方法で測定した(表2)。タ
ンパク質はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分析した(図5)。組換え体2,5−DKGリダクター
ゼを示すタンパク質バンドを、ウエスタンブロッティン
グ法により免疫学的に同定した(Tobin,HらProc.Na
tl.Acad.Sci.USA76,4350(1979))
の存在を実施例2Dに示した方法で測定した(表2)。タ
ンパク質はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分析した(図5)。組換え体2,5−DKGリダクター
ゼを示すタンパク質バンドを、ウエスタンブロッティン
グ法により免疫学的に同定した(Tobin,HらProc.Na
tl.Acad.Sci.USA76,4350(1979))
【0072】
【表2】 2,5−DKGリダクターゼ活性 抽 出 物 △吸光度(340nm)min-1100μL pBR322を導入した Erwinia herbicola(ATCC21998) −0.087 ptrpl−35を導入した Erwinia herbicola(ATCC21998) −1.925
【0073】実施例4 組換え微生物を2,5−DKG
に接触させることによる2−KLGの製造 凍結貯蔵していたグリセロールストックから、ptpl−3
5−形質転換Ew.herbicola(ATCC21998)の細
胞を、5mg/Lのテトラサイクリンを含有するLB固形
培地(10g/Lトリプトン、5g/L酵母エキス、10g
/LNaCl、15g/L寒天)上に画線接種し、48時
間、30℃でインキュベートした。その1コロニーを取
り、5mg/Lのテトラサイクリンを含有するLB液体培
地5mlの接種に使用し、これを試験管内で16時間、3
0℃で振盪した。この培養の1.0mlを5mg/Lテトラ
サイクリン含有LB液体培地100mlの接種に使用し、
次にこれを30℃に於いて、200rpmで16時間振盪
した。遠心分離により細胞を回収し、同量の新しいLB
培地で一度洗滌し、次いで5mg/Lのテトラサイクリン
および20g/Lの2,5−DKGを含有する50mlのL
B培地に再懸濁させた。この10mlを125mlのフラス
コ中で、200rpm、30℃で16時間振盪した。得ら
れたブロスをHPLCで分析し、2.0g/Lの2−K
LGが含有していることを認めた。pBR322を導入
したErw.herbicola(ATCC21998)を用いて同
様な方法で行なった対照培養では、2−KLGは含まれ
ていなかった。
に接触させることによる2−KLGの製造 凍結貯蔵していたグリセロールストックから、ptpl−3
5−形質転換Ew.herbicola(ATCC21998)の細
胞を、5mg/Lのテトラサイクリンを含有するLB固形
培地(10g/Lトリプトン、5g/L酵母エキス、10g
/LNaCl、15g/L寒天)上に画線接種し、48時
間、30℃でインキュベートした。その1コロニーを取
り、5mg/Lのテトラサイクリンを含有するLB液体培
地5mlの接種に使用し、これを試験管内で16時間、3
0℃で振盪した。この培養の1.0mlを5mg/Lテトラ
サイクリン含有LB液体培地100mlの接種に使用し、
次にこれを30℃に於いて、200rpmで16時間振盪
した。遠心分離により細胞を回収し、同量の新しいLB
培地で一度洗滌し、次いで5mg/Lのテトラサイクリン
および20g/Lの2,5−DKGを含有する50mlのL
B培地に再懸濁させた。この10mlを125mlのフラス
コ中で、200rpm、30℃で16時間振盪した。得ら
れたブロスをHPLCで分析し、2.0g/Lの2−K
LGが含有していることを認めた。pBR322を導入
したErw.herbicola(ATCC21998)を用いて同
様な方法で行なった対照培養では、2−KLGは含まれ
ていなかった。
【0074】実施例5 組換体微生物によるグルコース
から2−KLGの製造 凍結貯蔵していたグリセロールストックから、ptrpl−
35−形質転換Erw.herbicola(ATCC21998)
の細胞を5mg/Lのテトラサイクリンを含有するLB固
形培地(10g/Lトリプトン、5g/L酵母エキス、1
0g/LNaCl、15g/L寒天)上に画線接種し、次い
で48時間、30℃でインキュベートした。その1個の
コロニーを取り、5mg/Lのテトラサイクリンを含むL
B液体培地5mlの接種に使用し、これを試験管内で16
時間、30℃で振盪した。この培養液1mlを、5mg/L
のテトラサイクリンを含有する100mlのATCC培地
1038(3.0g/Lグルコース、5.0g/L酵母エ
キス、5.0g/Lペプトン、7.5g/LCaCO3、p
H7.0)への接種に使用し、これを500mlのフラス
コ中で、30℃で16時間、200rpmで振盪した。次
に、この培養液75mlから遠心分離により細胞を取り、
5mg/Lのテトラサイクリンと20g/Lのグリセロー
ルを含む50mlの新しいATCC培地1038に再懸濁
させ、500mlのフラスコ中、30℃、200rpmで4
8時間振盪する。得られたブロスをHPLCおよびGC
/MSで分析した結果、1.0g/Lの2−KLGを含
有していることがわかった。pBR−322を導入した
Erw.herbicola(ATCC21998)を用いて同様に
して行なった対照培養には、2−KLGは含まれていな
かった。
から2−KLGの製造 凍結貯蔵していたグリセロールストックから、ptrpl−
35−形質転換Erw.herbicola(ATCC21998)
の細胞を5mg/Lのテトラサイクリンを含有するLB固
形培地(10g/Lトリプトン、5g/L酵母エキス、1
0g/LNaCl、15g/L寒天)上に画線接種し、次い
で48時間、30℃でインキュベートした。その1個の
コロニーを取り、5mg/Lのテトラサイクリンを含むL
B液体培地5mlの接種に使用し、これを試験管内で16
時間、30℃で振盪した。この培養液1mlを、5mg/L
のテトラサイクリンを含有する100mlのATCC培地
1038(3.0g/Lグルコース、5.0g/L酵母エ
キス、5.0g/Lペプトン、7.5g/LCaCO3、p
H7.0)への接種に使用し、これを500mlのフラス
コ中で、30℃で16時間、200rpmで振盪した。次
に、この培養液75mlから遠心分離により細胞を取り、
5mg/Lのテトラサイクリンと20g/Lのグリセロー
ルを含む50mlの新しいATCC培地1038に再懸濁
させ、500mlのフラスコ中、30℃、200rpmで4
8時間振盪する。得られたブロスをHPLCおよびGC
/MSで分析した結果、1.0g/Lの2−KLGを含
有していることがわかった。pBR−322を導入した
Erw.herbicola(ATCC21998)を用いて同様に
して行なった対照培養には、2−KLGは含まれていな
かった。
【0075】実施例6 本発明微生物による2−KLG
の製造 容易に入手し得る炭素供給源から2−KLGを製造し得
ることを例示するために、次の実験を実施した。グルコースからの2−KLGの製造 次の成分を含有する培地中で、Erwinia herbicola
(ATCC21998)/ptrpl−35の細胞を発育させる
ことにより2−KLGの製造を実施した。 酵母エキス(Nestles) 10g/l 炭酸カルシウム 20g/l とうもろこし浸漬液 10g/l グルコース 20g/l テトラサイクリン 5mg/l グルコースおよびテトラサイクリンは別個に滅菌し、接
種前に添加した。
の製造 容易に入手し得る炭素供給源から2−KLGを製造し得
ることを例示するために、次の実験を実施した。グルコースからの2−KLGの製造 次の成分を含有する培地中で、Erwinia herbicola
(ATCC21998)/ptrpl−35の細胞を発育させる
ことにより2−KLGの製造を実施した。 酵母エキス(Nestles) 10g/l 炭酸カルシウム 20g/l とうもろこし浸漬液 10g/l グルコース 20g/l テトラサイクリン 5mg/l グルコースおよびテトラサイクリンは別個に滅菌し、接
種前に添加した。
【0076】接種材料は、凍結したストック培養液1.
0mlを、5g/lのグルコースおよび5mg/lのテトラサ
イクリンを含有している50mlのルリア(Luria)ブロス
に加えることにより調製した。この接種材料を含有する
250mlの遮閉フラスコを30℃で12時間振盪培養し
た。
0mlを、5g/lのグルコースおよび5mg/lのテトラサ
イクリンを含有している50mlのルリア(Luria)ブロス
に加えることにより調製した。この接種材料を含有する
250mlの遮閉フラスコを30℃で12時間振盪培養し
た。
【0077】50mlの上記の製造培地を満たした250
mlの遮閉フラスコに1mlのこの接種材料を接種した。フ
ラスコを振盪しつつ、30℃でインキュベートした。接
種時の培地のpHはとうもろこし浸漬液の酸性のため
5.1であった。57時間後にpHは8.71まで上昇
し、2−KLGはHPLCにより、0.6mg/mlの濃度
で存在していることがわかった。2−KLGの存在はH
PLCおよびGC−MSスペクトロメトリーにより確認
した。
mlの遮閉フラスコに1mlのこの接種材料を接種した。フ
ラスコを振盪しつつ、30℃でインキュベートした。接
種時の培地のpHはとうもろこし浸漬液の酸性のため
5.1であった。57時間後にpHは8.71まで上昇
し、2−KLGはHPLCにより、0.6mg/mlの濃度
で存在していることがわかった。2−KLGの存在はH
PLCおよびGC−MSスペクトロメトリーにより確認
した。
【図1】 Corynebacterium2,5−DKGリダクター
ゼのための発現ベクターの模式図である。
ゼのための発現ベクターの模式図である。
【図2】 2,5−DKGリダクターゼ遺伝子のための
発現ベクターの組み立てを示す工程図である。
発現ベクターの組み立てを示す工程図である。
【図3】 2,5−DKGリダクターゼ遺伝子のための
発現ベクターの組み立てを示す工程図である。
発現ベクターの組み立てを示す工程図である。
【図4】 pTrp1−35発現ベクターのコントロール
領域および2,5−DKGリダクターゼ遺伝子を含む配
列を示す模式図である。
領域および2,5−DKGリダクターゼ遺伝子を含む配
列を示す模式図である。
【図5】 図4に示した配列を持つ2,5−DKGリダ
クターゼ配列ベクターで形質転換したErwinia herbic
ola(ATCC21998)から抽出した蛋白質の染色ゲ
ルを示すグラフである。
クターゼ配列ベクターで形質転換したErwinia herbic
ola(ATCC21998)から抽出した蛋白質の染色ゲ
ルを示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:18) 7804−4B (C12P 7/60 C12R 1:18) 7804−4B (31)優先権主張番号 620585 (32)優先日 1984年6月14日 (33)優先権主張国 米国(US) (31)優先権主張番号 620651 (32)優先日 1984年6月14日 (33)優先権主張国 米国(US) (31)優先権主張番号 620652 (32)優先日 1984年6月14日 (33)優先権主張国 米国(US) (72)発明者 ロバート・アラン・ラザルス アメリカ合衆国カリフォルニア94403、サ ン・マテオ、ロウリエ・メドウズ66番 (72)発明者 デビッド・リチャード・ライト アメリカ合衆国カリフォルニア94114、サ ン・フランシスコ、ケースリー・ストリー ト239番 (72)発明者 ジェフリー・ビーチ・ミラー アメリカ合衆国カリフォルニア94002、ベ ルモント、コロニト・ブールバード2613番 (72)発明者 ウイリアム・ハリー・ラステター アメリカ合衆国カリフォルニア94401、サ ン・マテオ、エヌ・アイダホ・ストリート 818番
Claims (4)
- 【請求項1】 以下のアミノ酸配列で示される2,5−
ジケトグルコン酸リダクターゼまたは2,5−ジケトグ
ルコン酸リダクターゼ活性を有するその変異体をコード
しているDNA配列を含んでおり、該DNA配列を発現
することができる微生物宿主によって生産される2,5
−ジケトグルコン酸リダクターゼ活性を有する酵素であ
って、還元または非還元的SDS PAGEに於いて分
子量約34,000の位置に泳動する酵素: 【化1】 - 【請求項2】 以下のアミノ酸配列で示される2,5−
ジケトグルコン酸リダクターゼまたは2,5−ジケトグ
ルコン酸リダクターゼ活性を有するその変異体をコード
しているDNA配列を含んでおり、該DNA配列を発現
することができる発現ベクターが導入された微生物宿主
細胞を、グルコースまたは通常の代謝産物を含んでいる
培地中で適当な代謝条件下で培養することからなる、該
グルコースまたは通常の代謝産物を2−ケト−L−グロ
ン酸へ変換する方法: 【化2】 - 【請求項3】 2−ケト−L−グロン酸を希酸または熱
で処理することにより更にアスコルビン酸に変換する工
程を包含する請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 2−ケト−L−グロン酸をメタノール中
でエステル化し、次いで塩基の存在下でラクトン化する
ことにより更にアスコルビン酸に変換する工程を包含す
る請求項2に記載の方法。
Applications Claiming Priority (12)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US50840983A | 1983-06-28 | 1983-06-28 | |
US50841083A | 1983-06-28 | 1983-06-28 | |
US50862883A | 1983-06-28 | 1983-06-28 | |
US62058584A | 1984-06-14 | 1984-06-14 | |
US508410 | 1984-06-14 | ||
US620651 | 1984-06-14 | ||
US620585 | 1984-06-14 | ||
US06/620,652 US4758514A (en) | 1983-06-28 | 1984-06-14 | Ascorbic acid intermediates and process enzymes |
US508628 | 1984-06-14 | ||
US06/620,651 US4757012A (en) | 1983-06-28 | 1984-06-14 | Ascorbic acid intermediates and process enzymes |
US508409 | 1984-06-14 | ||
US620652 | 2000-07-20 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59135016A Division JPS6070073A (ja) | 1983-06-28 | 1984-06-28 | アスコルビン酸の中間体およびプロセス酵素類 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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