JPH0614771A - アスコルビン酸の中間体およびプロセス酵素類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ２，５−ジケトグルコン酸リダクターゼおよ
びその変異体を提供する。 【構成】 ２，５−ジケトグルコン酸リダクターゼは 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】本発明はアスコルビン酸の中間体および
プロセス酵素類に関する。本発明は特に、有用なタンパ
ク質の精製と、組換え技術を使用するタンパク質の生
産、およびそのようなタンパク質を化学的変換に使用す
ることに関する。更に詳しくは、本発明は２,５−ジケ
トグルコン酸(２,５−ＤＫＧ)リダクターゼ(還元酵素)
の精製と組換え技術による産生、および該リダクターゼ
を用いて２,５−ＤＫＧを立体選択的に転換して、２−
ケト−Ｌ−グロン酸(２−ＫＬＧ)を産生すること、およ
び２−ＫＬＧを合成し得る単一の組換え体微生物を調製
する方法に関する。産生された２−ＫＬＧはアスコルビ
ン酸(ビタミンＣ)製造における有用な中間体である。

【０００２】アスコルビン酸は、健康維持におけるその
重要性の理由から合衆国内においても、また世界各地に
おいても主要な化学製品となって来た。ある種の軽い病
気、例えば風邪のような病気にかかり易い個人の体質改
善に対する有効性に関しては若干の異論もあるが、必要
量のビタミンＣを摂取することは人類にとって疑いもな
く重要なことである。所謂“天然"食品では十分量のビ
タミンＣが供給されないかも知れないということが、近
年、重大な関心事となって来た。従って、このビタミン
量を補強して消費者に市販する食品添加物として、また
直接的なビタミン補給の双方に対するアスコルビン酸の
大量の需要が開発されて来ている。また、アスコルビン
酸は効果的な抗酸化剤であり、従って栄養剤およびその
他の製品の防腐剤としての応用も見出されている。

【０００３】ビタミンＣの生産に関しては多くの有用
な、また商業的にも実施し得る方法がある。これらの中
の幾つかではまず２−ケト−Ｌ−グロン酸(２−ＫＬＧ)
の製造を行ない、引き続き酸性または塩基性の触媒的方
法で環化することにより比較的簡単にアスコルビン酸に
変換する方法が採られている。従って、２−ＫＬＧその
ものが経済的にも工業的にもかなりの重要な物質と成っ
て来た。

【０００４】今日では、比較的豊富にある例えばＤ−グ
ルコースの様な通常の代謝産物を、原核微生物の代謝を
利用する方法によって、２,５−ジケトグルコン酸(２,
５−ＤＫＧ)へ変換させる方法が使用できる。〔例え
ば、米国特許第３,７９０,４４４号(１９７４年２月５
日)、第３,９９８,６９７号(１９７６年２月２１日)、
およびＥＰＯ公告特許第００４６２８４号(１９８２年
２月２４日発行)参照〕。この２,５−ＤＫＧ中間体は、
２電子還元法という単一な１工程反応によって、所望の
２−ＫＬＧへ変換される出発物質として有用である。該
還元反応は化学的に、または酵素触媒法によって効果的
に行なわれる。この還元反応に効果を示し得る種々の細
胞株が知られている。そのような株はＢrevibacteriu
m、Ａrthrobater、Ｍicrococcus、Ｓtaphylococcus、Ｐ
seudomonas、Ｂacillus、ＣitrobacterおよびＣoryneba
cterium 属の中に見出される〔米国特許第３,９２２,
１９４号(１９７５年１１月２５日)、米国特許第４,２
４５,０４９号(１９８１年１月１３日)、および米国特
許第３,９５９,０７６号(１９７６年５月２５日)参
照〕。事実、そのような細菌株はこの還元反応に効果的
に使用されて来た。然しながら、そのような株の利用
は、即ち、酵素を精製せずに使用するこの方法は、精製
した酵素を使用しなければ達成し得ないある種の工程に
は使用できない。例えば、固形の支持体上に酵素を固定
して連続的に生産を行なおうとする方式などがそれに当
たる。また、そのような酵素を産生するのに遺伝装置を
使用することは、それによって、２,５−ＤＫＧの変換
に最も都合の良い部位で該酵素の産生が行なわれるよう
に、この装置を操作し、局在させ得るので、この方法の
実施に当たり好ましい改善をもたらすこととなる。その
ような場所の中で最も重要なのは、２,５−ＤＫＧの生
産を行なうことのできる同一菌体内にある部位である。
即ち、単一の微生物で、それ自身の装置を使用して２,
５−ＤＫＧを製造し、次いで２,５−ＤＫＧリダクター
ゼ(還元酵素)遺伝子と、該触媒酵素を産生するための適
切なコントロール配列を使って、インサイチユ(その場)
で内性２,５−ＤＫＧを所望の生成物に変換することも
可能となるであろう。

【０００５】本発明と関連した化学的変換における反応
過程を示すことは、本発明の有用性の意義を理解する為
に役立つであろう。代表的なアスコルビン酸の製造方法
の全工程の概要は、以下の反応式１によって示される。

【化３】

【０００６】反応式１ 工程は、例えば反応式１に示されるように、Ｄ−グルコ
ースのような通常微生物に利用される代謝産物から都合
よく開始される。酵素的変換により、Ｄ−グルコースは
一連の酸化過程を経由して２,５−ジケト−Ｄ−グルコ
ン酸を与える。この一連の過程は単一の微生物によって
進められることが示された〔米国特許第３,７９０,４４
４号、ＥＰＯ公告第Ａ２０,０４６,２８４号(上述);そ
のような微生物は例えばＧluconobacter、Ａcetobacter
またはＥrwinia属である〕。

【０００７】アスコルビン酸製造の変法は酵素的酸化と
化学的酸化の組合わせにより、２,５−ＤＫＧを介して
一巡する方法であり、上に提示した方法に比較して、明
らかにより取り扱い難い。これらのうち代表的なもの
は、ジアセトン−２−ケト−Ｌ−グロン酸を２−ＫＬＧ
の前駆体として使用するＲeichsteinの合成法である。
この中間体は発酵反応、水素化反応、および例えば過マ
ンガン酸塩酸化などから成る一連の還元的および酸化的
段階を経由して生成されるものであって、所要の手順は
先に示した反応手順に比較して明らかに一層複雑であ
る。２,５−ＤＫＧから２−ＫＬＧへの変換も酵素反応
的に行なわれる〔米国特許第３,９２２,１９４号、第
３,９５９,０７６号(前記)、および第４,２４５,０４９
号(１９８１年１月１３日)〕。

【０００８】得られた２−ＫＬＧをアスコルビン酸へ変
換する手段は今日では良く知られている。これは山崎の
方法に従い、希酸の存在で加熱することにより行なう
か、または先ずメタノール中でエステル化し、次いで塩
基中でラクトン環化する方法を用いる２段階法により行
なわれる。効果的な方法については、Ｃrawford,Ｔ．
Ｃ．ら〔Ａdvances in Ｃarbohydrate Ｃhemistry
and Ｂiochemistry,３７,７９〜１５５(１９８０)〕の
記載がある。これらの変法は単純明瞭であり、２−ＫＬ
Ｇの安定性はアスコルビン酸よりも高く、保存期間にも
良好な効果を与えた。従って、アスコルビン酸を直接合
成するよりも、所望の最終製品に変換し得る中間体、２
−ＫＬＧで大量に貯蔵する方がより一層望ましく都合が
良い。

【０００９】本発明による改良法は、一層優れた変法
を、上に述べた変換法の全般にわたる幾つかの局面に効
果的に導入するものである。一例を挙げれば、２,５−
ＤＫＧを２−ＫＬＧへ変換させる酵素が分離され、精製
されたので、還元工程は、例えば酵素を固定し、液状の
基質を、固定した触媒上に連続的に供給する方法を含む
より一層管理された条件下で進行させることができる。
また、組換え技術を利用して容易に精製して使用し得る
ような酵素を大量に生産できるようになった。更に、組
換え技術により、改良された特性を持った好適な宿主細
菌へ、暗号配列およびそれに必要な発現コントロール機
構を導入することができる。このように単に２,５−Ｄ
ＫＧから２−ＫＬＧへの変換に焦点を絞っても、次の３
段階の改良が達成される:１)変化要因に対するより厳密
なコントロール;２)連続的方法が適用できる;および３)
還元反応に関係した所望の特性を有する酵素に好適な宿
主微生物の選別。

【００１０】２,５−ＤＫＧの効果的なクローン化と発
現によってもたらされる改良の範囲は、広範囲に及ぶ。
特有な遺伝装置が利用できるので、リダクターゼ(還元
酵素)を暗号化している遺伝子を、２,５−ＤＫＧを産生
できる微生物に導入することが可能となり、期待できる
ようになった。このようにして、同一の細菌によって変
換の全工程、例えばグルコースまたはその他の好適な代
謝産物から安定で貯蔵性のよい中間体２−ＫＬＧへの変
換の全工程が効果的に行ない得るようになった。

【００１１】

【発明の要旨】本発明は、一般的に利用し易いグルコー
スのような代謝産物を、安定な貯蔵性のよいアスコルビ
ン酸の前駆体、２−ＫＬＧへ変換させる方法の劇的な改
良を行なうものである。本発明に記載した方法の経路に
は、２,５−ＤＫＧから２−ＫＬＧへ変換する段階が包
含される。現行の２−ＫＬＧ中間体の産生方法には、ど
んな良い方法でも最低２種の微生物の使用またはキラー
を生じる培養を包含しており、利用し得る酵素水準を調
節できず、またバッチ式な方法に余儀なく限定されてい
る。

【００１２】本発明に含まれる重要な実施態様は、一連
のクロマトグラフィー手法により、２,５−ＤＫＧリダ
クターゼをホモジニアス(均質)な生産物とし(ＨＰＬＣ
(高速液体クロマトグラフィー法)により)実質的に純粋
な形で製造する方法にある。本発明にはさらに、純化さ
れた酵素そのもの、および該純化酵素を２,５−ＤＫＧ
から２−ＫＬＧへの変換に使用することを包含する。そ
のような変換は該酵素を固定化した形で使用することに
より、好ましく実施される。

【００１３】本発明のもう一つの重要な面は、２,５−
ＤＫＧリダクターゼの産生に適する組換え発現ベクター
を構築する方法である。また、この態様は、そのように
して産生された発現ベクターと、それを導入した細胞お
よび細胞培養、および２,５−ＤＫＧを立体選択的に２
−ＫＬＧへと還元させ得るそのような細胞および細胞培
養の生産物をも包含する。更に本発明のこの態様には組
換え技術によるリダクターゼを使用して２,５−ＤＫＧ
を２−ＫＬＧへ変換させる方法が含まれる。

【００１４】最後に、本発明はまた、グルコースまたは
通常の微生物代謝産物を単一の組換え微生物による発酵
によって２−ＫＬＧへ変換し、更にアスコルビン酸へ変
換する方法に関する。また本発明はこの過程を進行させ
得る組換え微生物に関する。そのような微生物は、２,
５−ＤＫＧリダクターゼに対応する配列を暗号化し、そ
れを発現し得る発現ベクターによって、初期の代謝産物
を２,５−ＤＫＧへ変換できる宿主細胞を形質転換する
ことにより都合良く組み立てられる。あるいは、そのよ
うな組換え微生物は、既に２,５−ＤＫＧを産生する微
生物に、代謝産物を酸化して２,５−ＤＫＧとする働き
を有する酵素を暗号化しているベクターを導入すること
によっても構築される。いずれの場合でも、発現ベクタ
ーの構造の中にある適切な誘導プロモーターとコントロ
ール系を活用することにより、所望する変換工程の速度
を最適とするよう、酵素濃度を調節することができる。

【００１５】以下に図面について簡単に説明する。図１
は２,５−ＤＫＧリダクターゼ遺伝子の発現ベクターを
示している。図２および図３は、二者択一的な２,５−
ＤＫＧリダクターゼ遺伝子のための発現ベクターの組み
立てを示している。

【００１６】図４は２,５−ＤＫＧリダクターゼ遺伝子
とpＴrpl−３５発現ベクターの調節(コントロール）領
域を含んでいる配列を示している。図５は、図４の配列
を有する２,５−ＤＫＧリダクターゼ発現ベクターを導
入したＥrwinia herbicola(ＡＣＣＣ２１９９８)から
得たタンパク質抽出物の染色したゲルを示している。

【００１７】

【詳細な記述】

Ａ．定義 本発明に使用する“２,５−ＤＫＧリダクターゼ"なる用
語は、２,５−ＤＫＧを立体選択的に２−ＫＬＧへと変
化させる反応を触媒する働きを有するタンパク質を意味
する。本発明の具体的な例に於いては、Ｃorynebacteri
um 中に存在する特定の型のこの酵素が純化され、クロ
ーン化され、発現されたが、例えばＢrevibacterium、
Ａrthrobacter、Ｍicrococcus、Ｓtaphylococcus、Ｐse
udomonas、ＣitrobacterおよびＢcillusのような属の中
の他の細菌株もこの酵素と同じ活性を有する酵素を合成
することが知られている。これらの属は、この変換反応
の触媒に利用できるＣorynebacteriumに存在するのと同
一の酵素の強力な供給源として例示される。これら天然
に存在するもの以外にも、原核生物界には、それに代わ
る供給源を見出し得ることがあろう。更に、本発明によ
ってそのような酵素を暗号化している遺伝子配列が明ら
かにされ、利用できるようになったので、その技術によ
って知り得た知識を利用して、この酵素の働きを妨害す
ることなく、事実上その働きを改良し得る配列の修飾が
できるようになった。そのように修飾され、変換された
配列も本明細書で使用する２,５−ＤＫＧリダクターゼ
の定義の中に包括される。要するに、２,５−ＤＫＧリ
ダクターゼなる用語は、機能的な定義であって、２,５
−ＤＫＧが２−ＫＬＧへと変換する反応を触媒するすべ
ての酵素を意味する。

【００１８】本明細書で論じられるタンパク質およびサ
ッカライド類の酸性誘導体のような多くの化合物は、溶
液中において或いは固形物の場合はそれらが調製された
溶液に置かれていた環境に応じて種々のイオン状態を取
り得るであろうことは技術的に良く理解できる。例え
ば、グルコン酸と言う用語を使用してその分子を指定す
る場合、該有機分子が関係し得るすべてのイオン化状態
を包括するものとする。従って、例えば“Ｄ−グルコン
酸"および“Ｄ−グルコネート"は共に同一の有機構造を
示すものであって、何ら特別なイオン化状態を指定しよ
うと意図するものではない。良く知られているように、
Ｄ−グルコン酸はイオン化しない形で存在することもで
き、或いは、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはそ
の他の塩として使用することも出来る。説明されている
化合物が該当するイオン化状態のものか、あるいは非イ
オン化の態様のものかは、当業者であれば、または例え
そうでなくても、文脈を辿れば自ら明らかになるであろ
う。従って、２,５−ＤＫＧリダクターゼ・タンパク質
そのものもpＨに応じて種々のイオン化状態をとり得
る。これらのすべてのイオン化状態を“２,５−ＤＫＧ
リダクターゼ"なる用語は包含している。

【００１９】同様に“細胞"および“細胞培養"の用語
も、文脈上、その一方また他方の何れかを明示していな
い場合は相互互換的に使用するものである。細胞または
細胞培養の形質転換は、結局同じ働きに等しい。クロー
ン化するビヒクルまたはその他の導入手段で処理される
のは微生物の培養であるが、形質転換物質を取りこむの
は微生物そのものであることは当然明らかである。本発
明における細胞および微生物はあらゆる細菌性微生物、
または原核微生物を包含するものと定義づけられる。

【００２０】“発現ベクター"とは、その中に含まれる
ＤＮＡ配列を、その配列が機能的に、それを発現させる
ことのできる他の配列と連結している場合には、それを
発現し得るベクターを意味する。明瞭に表現されていな
いけれども、発現ベクターには、エピソームまたは染色
体ＤＮＡの組み込み部分として、宿主微生物内で複製し
得るものでなければならないという意味が含まれてい
る。複製能が欠除していればそれらが効果的に作働でき
ないことは明らかである。結局、“発現ベクター"も機
能的な定義である。一般に、組換え技術では発現ベクタ
ーはしばしば“プラスミド"の形で使用され、該用語は
閉環状２本鎖ＤＮＡ分子を示しており、ベクターの形で
は染色体と結合しない。一般に使用されるその他の効果
的なベクターはファージおよび開環状ＤＮＡである。本
明細書においては、“プラスミド"と“ベクター"はしば
しば相互互換的に使用される;然し、本発明において
は、同等の機能を果たす既知の、あるいはいずれ知られ
ることになる他の型の発現ベクターを全て包含するもの
である。

【００２１】“組換え細胞"とは、組換えＤＮＡ技術を
使用して構築されたベクターを導入された細胞を言う。
“宿主"細胞とは、形質転換を受ける前の細胞を言う。
一般に組換え細胞は、そのような組換えベクターで暗号
化されたタンパク質生成物を産生し、しかも通常はこの
ベクターが無ければそれらを産生しない;然しこの定義
には、細菌の染色体に暗号化されているか、あるいはこ
の受容菌自体が発現するタンパク質を暗号化しているベ
クターで形質転換された細胞も含まれる。この定義に
は、組換え技術による異種配列の生成物を生産するあら
ゆる細胞が包含される。

【００２２】“通常の代謝産物"とは、発育のため、一
般に細菌に利用される炭素源を意味する。そのような代
謝産物とは、そのような微生物の栄養源として容易に利
用されるグルコース、ガラクトース、ラクトース、フル
クトースまたはその他の炭水化物である。この場合、そ
のような代謝産物とは２,５−ジケト−Ｄ−グルコン酸
に変換し得るようなそれら栄養源の酵素的誘導体をも包
含して定義される。そのような誘導体にはＤ−グルコン
酸、Ｄ−マンノン酸、Ｌ−グロン酸、Ｌ−イドン酸、２
−ケト−Ｌ−グルコン酸、５−ケト−Ｄ−グルコン酸、
および５−ケト−Ｄ−マンノン酸が含まれる。

【００２３】Ｂ．望ましい態様の一般的な説明 Ｂ．１ 純度が充分に高い２,５−ＤＫＧリダクターゼ
の製造 純粋な２,５−ＤＫＧリダクターゼの製造のために選ば
れた細菌の望ましい属はＣorynebacteriumである。然
し、細菌学的な分類は、関連のある属間の正しい命名を
確かめることが時に困難な場合があるので、必ずしも十
分確実ではない。然し、該リダクターゼが含有されてい
る細菌種の多くはＣorynebacterium、Ｂrevibacterium
およびＡrthrobacter属に属するcoryneform型グルー
プの仲間である。従って現在判っていることによれば、
該酵素の望ましい供給源がＣoryneform型グループの一
つであるということである。

【００２４】製造の好ましい態様として、細胞培養は細
菌株より応じて選ばれる好適な条件下に、ＯＤ５５０が
約２０またはそれ以上になるまで発育させる。次に培養
液を遠心分離に掛け、得られた細胞ペースト(ペレット
状)を処理して細胞を溶解(溶菌)する。このペーストは
処理前に、予かじめ緩衝液で洗滌して混入している培地
を除去して置くことが望ましく、洗滌を終えたペレット
は、例えばリゾチーム、または超音波、または機械的手
技を用いて処理し、細胞を開裂させる。次に、得られた
抽出物を、望ましくはセルロースを保持体とする陰イオ
ン交換樹脂、例えばＤＥＡＥセルロースを用いたイオン
交換クロマトグラフィーにより精製する。言うまでもな
く、例えばＱＡＥまたはＤＥＡＥセファデックスのよう
な他の陰イオン交換樹脂もまた使用できる。溶出は溶出
液に溶解している塩、好ましくは塩化ナトリウムの濃度
を順次増加し、溶出溶媒のイオン強度を増加する代表的
で望ましい公知法により行なわれる。２,５−ＤＫＧリ
ダクターゼ活性を含有する溶出液分画をアフィニティー
クロマトグラフィー保持体、即ち、それが共有結合する
支持体、色素または酵素基質またはその補因子に似たそ
の他の有機リガンドに吸着させることにより、更に精製
する。もしアフィニティー保持体で処理すべき溶液が相
当量の溶質を含有している場合は、予かじめ透析を行な
うことが望ましい。特に効果的なアフィニティークロマ
トグラフィー保持体は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを利
用する酵素に親和性を有するアミコンマトレックス^Rゲ
ルブルーＡ(Ａmicon Ｍatrex^R gel blueＡ)である。
そのようなカラムからの溶離は、酵素と親和性のある物
質−この場合はＮＡＤＰ−の溶出溶媒中の濃度を増加し
て行くことにより達成される。所望のＤＫＧリダクター
ゼ活性を含有する画分を集めて純粋なタンパク質を回収
する。この純粋なタンパク質の比活性は５単位／mgより
大きい。

【００２５】純度の最終的な証明は、例えばＨＰＬＣに
より、セファデックスゲル、ポリアクリルアミドゲル、
またはＴＳＫサイジングゲルを用いたサイズセパレーシ
ョン(分子サイズ分離)によって達成される。Ｃorynebac
terium sp ＡＴＣＣ３１０９０に含有される酵素で
は、ＴＳＫ／ＨＰＬＣによる分離によって、全量の活性
を含有する４５,０００の分子量に相当するピークを得
る。然しながら、還元的または非還元的な条件で酵素を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理すると、タンパク質は３４,００
０の分子量に相当するピークに移動する。この好ましい
具体例に示したタンパク質の特性については、更に実施
例２で説明する。

【００２６】以上を要約すると、酵素の純化は細胞溶
解、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティク
ロマトグラフィーおよびサイズセパレーションによる証
明の工程から成る。細胞溶解(溶菌)以外の工程について
は、任意の順序で行なってよく、工程の移行の都度、実
施例２に示した方法に従って活性を測定することにより
チェックを行なう。

【００２７】Ｂ．２ 精製した酵素を用いる２,５−Ｄ
ＫＧから２−ＫＬＧへの変換 精製した酵素を用いた変換は溶液かまたは更に望ましく
は固定化型で行なう。所望の反応は還元反応であるか
ら、還元当量(reducing equivalents)の供給源を必要
とする;酵素はＮＡＤＰＨ特異性であり、従って少なく
とも触媒量の補酵素が存在していなければならず、進行
過程中は、その還元型は絶えず再生されなければならな
い。補酵素を還元するための電子供与源は、グルコース
／グルコースデヒドロゲナーゼ(脱水素酵素)、ホルメー
ト／ホルメートデヒドロゲナーゼ、またはグルタメート
／グルタメートデヒドロゲナーゼのように、酵素と接触
する還元型基質の酸化により供与される。好適な還元当
量の供給源を選択するには、基質のコストおよび精製し
た２,５−ＤＫＧリダクターゼが必要とするＮＡＤＰと
矛盾することのない酸化触媒酵素の酵素特異性を考慮し
なければならない。ＮＡＤＰＨ補酵素の再生のための他
の系としては、例えば還元当量の供給源としてＨ₂を用
い、リポアミドデヒドロゲナーゼとヒドロゲナーゼ(水
素酵素)、またはフエレドキシンリダクターゼとヒドロ
ゲナーゼを触媒として用いるＷong,Ｃ．Ｈ．ら(Ｊ．Ａ
m．Ｃhem．Ｓoc．,１０３:６２２７(１９８１))の方法
が知られている。更に大規模製法にも適用できる他の方
法がＬight,Ｄ．ら(“Ｏrganic Ｃhemicals from Ｂ
iomass"(１９８３)Ｄ．Ｌ．Ｗise刊３０５〜３５８頁)
により記載されている。

【００２８】代表的な変換反応においては、出発溶液は
約１〜２００g／Ｌの濃度、好ましくは約１０〜５０g／
Ｌ付近の濃度の２,５−ＤＫＧを含有し、媒質のpＨは約
５〜７．５、好ましくは６．４付近に調節する。このp
Ｈは例えばリン酸緩衝液のような好適な緩衝液を使用し
て維持する。温度範囲は約１５℃〜３７℃、好ましくは
２５℃付近とする。還元型補酵素ＮＡＤＰＨの濃度は、
充分な還元当量の供給源と共に、例えば約０．００１m
Ｍ〜２mＭ、好ましくは約０．０１〜０．０３mＭとし、
反応中その濃度を維持する。

【００２９】酵素を溶液の形で供給する場合は、その濃
度は基質媒質に対し１０mg／Ｌの程度とするが、勿論、
所望する変換反応速度により、また選ばれた酵素の特異
性に従って望ましい濃度を使用する。もし固定化酵素を
使用する場合は、上記の基質溶液を、２,５−ＤＫＧリ
ダクターゼを吸着により含有するか、または共有結合に
より結合させた固形保持体を通過させる。理想的には、
溶液中のＮＡＤＰＨ濃度を維持させるに足りる還元当量
の供給源を変換する意味で、固形保持体に上記の好適な
触媒を含有させる。例えば、典型的な変換反応に於いて
は、溶液は２,５−ＤＫＧ濃度にほぼ当量のグルコー
ス、ホルメート、グルタメートまたは溶解水素を含有し
ており、固形保持体には所望する２−ＫＬＧへの変換反
応によって生成するＮＡＤＰを絶えず再生するに足りる
還元触媒を含有させる。

【００３０】Ｂ．３ ２,５−ＤＫＧリダクターゼのク
ローン化と発現 ２,５−ＤＫＧリダクターゼの遺伝子をクローン化し、
発現させる手技を提供する本発明方法によって、純化
２,５−ＤＫＧリダクターゼを多量に入手することがで
きる様になり、また２,５−ＤＫＧを生産する微生物に
おいて、該リダクターゼを生成させることができる様に
なった。これを達成した一般的な方法を以下に要約し、
その具体的な方法を実施例３において概説する。

【００３１】Ｃorynebacterium またはその他の供給源
から得られた高分子量のＤＮＡを、制限酵素を用いて部
分消化することにより作り出されたゲノムライブラリー
からの２,５−ＤＫＧリダクターゼ暗号化遺伝子を、プ
ラスミドかファージビヒクルにクローンする。２,５−
ＤＫＧリダクターゼを得るのに好適な制限酵素はＳau３
Ａである。(その代わりに、ＢamＨＩまたはＰstＩのよ
うに、特異性の高い制限酵素による制限消化物を使用し
ても良い)。次に、その制限消化物を、好適な細菌宿主
中で複製し得るプラスミドベクターか、都合の良い細菌
培養物中で増殖し得るファージ配列の中へ連結する。得
られたプラスミドおよびファージライブラリーを、２,
５−ＤＫＧリダクターゼの既知の部分配列に基づいて構
築されたプローブを用いてスクリーニングする(実施例
２参照)。プローブデザインの効率は、プローブ構築に
際し、細菌性宿主にとって望ましいと知られているコド
ンを選択することにより向上させることができる。所望
のクローンをプラスミドおよびファージライブラリーか
ら確認するには、所望の遺伝子が、好適で厳格な条件下
で、すべてのプローブとハイブリッドを形成する様に一
組みのプローブを使用し、ただ１個のプローブを使用す
ることから起こる誤った陽性例を排除することによって
最も効果的に行なわれる。プローブとして提供されたオ
リゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に成功したコロ
ニーまたはファージを回収し、所望の遺伝子配列との同
一性を直接的なＤＮＡ塩基配列決定法と、所望の酵素を
産生するインビボでの発現によって確認する。

【００３２】完全に機能し得る遺伝子を、その暗号配列
を導入しようとする宿主細胞中で作働し得るプロモータ
ーとリボソーム結合部位を含有する好適な発現ベクター
に連結する。現在の技術水準においては、本発明に適用
し得る多数の促進／制御系、および好適な原核生物宿主
がある。一般に、原核生物はＤＮＡ配列のクローン化に
望ましく、また２−ＫＬＧの製造方法はそのような微生
物系を用いて最も都合よく行なわれるので、クローン化
と発現の双方に、類似の宿主を使用することができる。
Ｅ．coli Ｋ１２株２９４(ＡＴＣＣＮo．３１４４６)
はクローン用宿主として特に有用である。その他の使用
し得る微生物株は、Ｅ．coli Ｂ、Ｅ．coli Ｘ１７７
６(ＡＴＴＣＮo．３１５３７)およびＥ．coli ＤＥ−
１(ＡＴＣＣＮo．３３８４９)のようなＥ．coli 株か
ら成る。発現には、先に述べた細菌株、およびＥ．coli
Ｗ３１１０(Ｆ^-,λ^-,原栄養性、ＡＴＴＣＮo．２７３
２５)、Ｂacillus subtilusのような桿菌類、およびＳ
almonella typhimuriumまたはＳerratia marcesans
のようなその他の腸内菌類、および種々のＰseudomonas
種が使用し得る。宿主として特に好ましい群は、グル
コースまたはその他一般に利用し得る代謝産物を２,５
−ＤＫＧへ変換できる宿主培養物である。そのような宿
主の例としてはＥrwinia herbicola ＡＴＴＣＮo．２
１９９８(またはＡcetomonas albosesamae の１株と
考えられている:米国特許第３,９９８,６９７号);Ａcet
obacter melangeneum、ＩＦＯ３２９３、Ａcetobacter
cerius、ＩＦＯ３２６３、およびＧluconobacter ru
biginosus、ＩＦＯ３２４４が含まれる。

【００３３】一般に、プラスミドの発現、即ち宿主細胞
と適合し得る種から誘導された複製およびコントロール
配列を含んでいるクローニングベクターは、これらの宿
主と関連して使用される。通常、ベクターは複製部位お
よび、形質転換細胞に選択性のある表現形質を提供でき
るマーキング(記号化)配列を保有している。例えばＥ．
coli は、Ｅ．coli の１株から誘導されたプラスミド
pＢＲ３２２によって典型な形質転換を受ける(Ｂoliver
ら、Ｇene,２:９５(１９７７))。pＢＲ３２２はアンピ
シリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含んでお
り、これは形質転換された細胞を容易に確認し得る手段
となる。発現に使用するためには、pＢＲ３２２プラス
ミド、或いはその他の微生物プラスミドも、それ自身の
タンパク質を発現するためにその微生物によって使用さ
れ得るプロモーターを含有するか、または含有するよう
に修飾されなければならない。それらの組換えＤＮＡの
構築(組み立て)に最も多く使用されるプロモーターは、
β−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトース・
プロモーター系(Ｃhangら、Ｎature,２７５:６１５(１
９７８);Ｉtakuraら、Ｓcience,１９８:１０５６(１９
７７);(Ｇoeddelら、Ｎature,２８１:５４４(１９７
９))、およびトリプトファン(trp)プロモーター系(Ｇoe
ddelら、Ｎucleic Ａcids Ｒes．,８:４０５７(１９
８０);ＥＰＯ公告特許第００３６７７６号)である。こ
れらが最も一般に使用されている間に、他の微生物のプ
ロモーターが発見され、使用され、更にそれらのヌクレ
オチド配列に関する詳細が公表されるようになって、当
業者は、それらを機能的に形質転換ベクターの遺伝子に
連結できるようになった(Ｓiebenlistら、Ｃell２０:２
６９(１９８０))。

【００３４】上記のベクターおよびプロモーターに含有
されるＤＮＡ配列を適切に開裂させ、先に概説した様に
して調製した２,５−ＤＫＧリダクターゼを暗号化して
いる遺伝子配列と連結し、あらゆる不必要な、或いは阻
害的な配列を欠失させ、原核性宿主細胞に導入して該酵
素を産生させる。次いで、この酵素を先に概説したよう
に純化するか、そのままの形でまたは細胞を破壊して直
接触媒として使用してもよく、或いは、一度形質転換す
れば、グルコースまたはその他の好適な代謝産物を所望
の２−ＫＬＧ生成物へ完全に変換させる効果を挙げ得る
ように宿主を選択してもよい。

【００３５】Ｂ．４ 単一の組換え体微生物によるグル
コースまたは他の代謝産物の２−ＫＬＧへの変換 異種宿主中で酵素を発現させる組換え技術を利用して、
単一の宿主微生物で、容易に利用し得る代謝産物から２
−ＫＬＧを産生させようとする本発明の構想を達成する
ことができる。本方法は、二つの発酵を単一の生育し得
る微生物発酵に置き換えている点、およびこの変換に必
要な酸化−還元当量が少なくとも部分的に平衡であると
いう点で、現在使用されている方法よりかなり進歩して
いる。現在のところ、天然に存在する微生物で、この連
続した全段階を触媒できるものは知られていない。

【００３６】然しながら、グルコースまたは、例えばガ
ラクトースまたはフルクトースのような通常の代謝産物
を、２,５−ＤＫＧへ変化させる微生物は知られてい
る。また２,５−ＤＫＧを２−ＫＬＧへ変換させる他の
一群の微生物も知られており、後者の変換は、当然その
微生物の持っている単一の酵素により触媒されるが、還
元当量を供給する該微生物の力を利用している。

【００３７】本発明が包含する単一微生物によって変換
を成就しようとする方策は、先に概要を示したような
２,５−ＤＫＧリダクターゼのための発現ベクターを構
築し、通常の代謝産物をこの酵素の基質である２,５−
ＤＫＧへまず変換させることができる細胞中へこのベク
ターを導入することから成る。実施例３に示すように、
この形質転換によって２−ＫＬＧを産生する単一の微生
物が得られた。該ベクターの構築、形質転換、形質転換
により得られた微生物の利用の詳細について本明細書で
概説する。

【００３８】もう一つの変法は、グルコースまたは通常
の代謝産物を２,５−ＤＫＧへ転換させることが知られ
ている酵素を暗号化している遺伝子を、それを含有して
いる微生物(先に列挙した)からクローン、発現し、それ
らクローンされた遺伝子配列を含有する発現ベクターを
構築し、そのようなベクターを正常にリダクターゼを産
生する細胞の形質転換に使用することである。第３の方
法は、通常の代謝産物から２−ＫＬＧへ至る経路の酵素
の完全な配列で中性宿主を形質転換する方法である。こ
の最後の方法は、それがどのような発育特性を所望しよ
うとも、またどのような栄養条件を必要としようとも、
自由に宿主微生物を選択できるという利点を有する。従
って、Ｅ．coli やＢacilusのように培養および発育に
関して過去に合理的な経験を経ている遺伝形質を備えた
微生物を宿主細胞として使用することは、酵素または基
質を細菌的に産生する他の手段と等質な長所が得られ
る。

【００３９】変換を行なう能力を持った微生物が作り出
されると、本発明法の過程は、組換え酵素のための発現
ベクターの構造の性質によって、また宿主の発育特性に
応じて種々の形で進行する。例えば、宿主微生物は大量
の細胞を産生するのに好ましい条件下で、そしてまた所
望の変換に関係する酵素を暗号化しているあらゆる異種
遺伝子の発現に不都合な条件下で発育させることになろ
う。大量の細胞が蓄積された時、暗号配列の転写と翻訳
が行なわれるように、その様な遺伝子配列により供給さ
れるプロモーターを活性化させるため、培地に好適なイ
ンデューサーまたはデリプレッサーを添加する。これら
の遺伝子の好適な発現により、また所望する触媒量の酵
素の存在のもとに、１〜５００g／Ｌの量でグルコース
のような出発物質を培地に加え、２０℃〜約４０℃、好
ましくは２５〜３７℃付近で、数時間、２−ＫＬＧへの
変換が終了するまで培養する。出発物質の濃度は連続的
な供給調節によって一定濃度に保ち、産生された２−Ｋ
ＬＧは公知技術によりバッチ方式または連続的に回収さ
れる。

【００４０】Ｃ．本発明に採用した一般的方法 後述の実施例において、プローブの構築、スクリーニン
グ、プローブの所望の物質とのハイブリダイゼーショ
ン、およびベクターの組み立てに関しては、以下に示す
一般的方法を使用した。

【００４１】Ｃ．１ プローブの作成 合成ＤＮＡプローブは、カップリング剤として２,４,６
−トリイソプロピルベンゼンスルホニル−３−ニトロ−
１,２,４−トリアゾール(ＴＰＳ−ＮＴ)(deＲooij,Ｊ．
ら、Ｒec．Ｔrav．Ｃhim．Ｐays Ｂas,９８:５３７(１
９７９))を使用することを除き、Ｃrea,Ｒ．およびＨor
n,Ｔ．(Ｎucleic Ａcids Ｒes．,８:２２３１(１９８
０))の方法により調製した。

【００４２】Ｃ．２ プラスミドの分離、制限酵素によ
る切断 プラスミドは、確認された培養から、Ｃlewell,Ｄ．
Ｂ．およびＨelinski,(Ｂiochemistry ９:４４２８(１
９７０))の透明細胞分解法を用いて分離し、Ｂiorad
Ａ−５０アガロース・カラムクロマトグラフィーにより
精製した。少量の場合(mini−preps)はＢirnboim,Ｈ．
Ｃ．(Ｎucleic Ａcids Ｒesearch,７:１５１３(１９
７９))の方法を用いて作成した。

【００４３】クローンしたプラスミドの断片は、適当な
１０〜５０単位の制限酵素(群)で、その使用するその制
限酵素のための適切なバッファー(群)約６００μl中、
約２０μgのプラスミドを処理することにより調製し、
配列決定した。各酵素について３７℃で１時間、インキ
ュベートした。各酵素を用いてインキュベーションした
後、タンパク質を除去し、核酸をフェノール−クロロホ
ルム抽出およびエタノール沈澱により回収した。変法と
して、プラスミドは、ＭnＣl₂の存在下にＤＮＡaseＩ消
化によるか(Ａnderson,Ｓ.(１９８１)．Ｎucleic Ａci
ds Ｒes．９,３０１５)、または超音波処理(Ｄeinige
r,Ｐ．Ｌ．(１９８３)．Ａnalyt．Ｂiochem．１２９,２
１６)することにより断片化した。

【００４４】切断後、標品を、５０nmolのdＮＴＰを含
有する１００μlのＫlenow 緩衝液(５mＭ ＫＰi、pＨ
７．５、７mＭ ＭgＣl₂、１mＭ ＢＭＥ)中のＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ、または１０単位のＫlnow ＤＮＡポリ
メラーゼで、１時間、３７℃で処理した。タンパク質を
除去し、核酸を上記のように回収し、この核酸を４０μ
lの展開(load)緩衝液に懸濁させ、上記の如く、サイズ
測定のための６％ポリアクリルアミドゲル上に展開した
(別法として、断片を直接Ｍ１３ベクターにクローンし
ても良い)。

【００４５】ＤＮＡの塩基配列決定は、断片をＭ１３−
誘導ベクターにクローン(Ｍessingら、(１９８１)Ｎucl
eic Ａcids Ｒes．９,３０９)した後、ジヌクレオチ
ド鎖ターミネーション法(Ｓanger,Ｆ．ら(１９７７)．
Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ７４,５４６３)に
より行なった。

【００４６】Ｃ．３ ライゲーション(連結)方法 開裂した発現プラスミドを含むＤＮＡフラグメント(断
片)を、正しくマッチングする様にＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて適当に末端修復した所望の成分と混合すること
により結合させた(例えば、０．２５μgのプラスミドか
ら切り出されたベクター断片を、２０μlの反応混合液
中で１μgのプラスミドから切り出した挿入体と混合す
る)。μg量のベクターおよび挿入成分に対して約１０単
位のリガーゼが必要であった。次に、得られたプラスミ
ドベクターをＥ．coli Ｋ１２ ２９４株(ＡＴＣＣ３
１４４６)またはＤＨ−１(ＡＴＣＣ３３８４９)へ導入
することによりクローンした。形質転換およびクローニ
ングおよび形質転換されたコロニーの選別は、後に記載
する方法により実施した。所望する配列が存在するかど
うかは、選別されたコロニーからプラスミドを分離し、
前記した様にＤＮＡの塩基配列を決定することにより確
認した。

【００４７】製法Ａ ２,５−ジケト−Ｄ−グルコン酸ナトリウム(カルシウ
ム)の分離および特性決定 ２,５−ＤＫＧは商業的に容易に入手し難いのでＥrwini
a herbicola,(ＡＴＴＣ２１９９８)またはＡcetobacer
cerinus,ＩＦＯ３２６３から分離して製造した。２,
５−ジケト−Ｄ−グルコン酸ナトリウムはＥrwiniaの発
酵から、ブロスを１００〜２００メッシュの陰イオン交
換カラムＡＧ１−Ｘ８を通し、水で洗滌し、０．０５Ｎ
塩酸で溶出することにより分離した。２,５−ジケト−
Ｄ−グルコン酸を含有する分画をプールし、炭酸水素ナ
トリウムでpＨ５．５に中和し、凍結乾燥法により乾燥
した(例としてＢernaerts,Ｍ．ら、Ａntonie van Ｌe
euwenhoek ３７:１８５(１９７１)参照)。特性決定は
ＨＰＬＣおよびＴＬＣから成る有機酸に有用な方法によ
り実施した(Ｇossele,Ｆ．Ｚbl．Ｂokt,Ｈyg．,１:Ａb
t．Ｏrig．Ｃ,１７８(１９８０))。¹³Ｃ ＮＭＲによ
り、およびＷakisika,Ｙ．Ａgr．Ｂiol．Ｃhem．２８:
８１９(１９６４)の記載に従い、ビス−２,４−ジニト
ロフエニルヒドラゾンを作成することにより、この化合
物の同一性を確認した(カルシウム塩の場合は、濃縮し
たブロスを陽イオン交換樹脂(Ｄowex５０、Ｃa²⁺型)カ
ラムに通し、次に水で溶出することにより製造してもよ
い。ＨＰＬＣ分析により２,５−ＤＫＧを含有する分画
を集め、凍結乾燥することにより希黄色のカルシウム塩
を得た)。以下の実施例により更に詳細に説明するが、
これらは本発明を限定するものではない。

【００４８】実施例１ Ｃorynebacterium からの２,
５−ＤＫＧリダクターゼの分離と精製 Ａ．細胞溶解(溶菌)および抽出 Ｃorynebacterium 株ＡＴＣＣ３１０９０を１０lの発
酵釜で発育させ、対数増殖期に回収した。発酵液を遠心
分離することにより細胞ペーストを回収し、−２０℃に
貯蔵した。４５０gの細胞ペーストを融解させ、６５０m
lの２０mＭトリスバッファー(pＨ８)に再度懸濁させ、
細胞を０．５Ｍ ＮaＣlで洗滌し、遠心分離により再回
収し、次いで２mg／mlのリゾチームを含有する６５０ml
のトリスバッファーに再度懸濁させて、細胞内タンパク
質を遊離させた。遠心分離により細胞残渣を溶解物質か
ら分離し、生成したペレットを非イオン洗滌剤であるツ
イーン８０を０．１％(w／w)含有するトリスバッファー
で再抽出した。抽出物を２,５−ＤＫＧリダクターゼ活
性について測定し、プールした。

【００４９】Ｂ．イオン交換クロマトグラフィー 粗細胞抽出物(１２６０ml)をバッチ式にジエチルアミノ
エチルセルロース(Ｗhatman ＤＥ−５２、湿潤容量で
２５０ml)へ吸着させ、室温で０．５時間撹拌し、グラ
スフィルター漏斗でこのＤＥ−５２樹脂を回収した。Ｄ
Ｅ−５２樹脂を５×３０cmのカラムに充填し、基線(ベ
ースライン)が確定するまでトリスバッファーで洗滌し
た(Ａ２８０＝０．７、Ａ２６０／Ａ２８０＝１．７、
これは核酸が徐々にカラムから洗い出されていることを
示していた)。次いで、カラムを０−１Ｍのリニアー濃
度勾配のＮaＣl(１２００ml)で１１０ml／hrの流速を以
て溶出させ、分画を採取し、ＤＫＧリダクターゼ活性を
測定した。明らかなＤＫＧ還元触媒活性を示す２個のピ
ークが認められた:約０．４ＭＮaＣlで溶出して来るピ
ークは所望の２,５−ＤＫＧリダクターゼを含有してい
た(２,５−ＤＫＧを２−ＫＬＧへ変換させる);約０．２
５ＭＮaＣlで溶出して来るもう１個のピークは２,５−
ＤＫＧを２−ＬＫＧへ変換しなかった。

【００５０】Ｃ．アフィニティクロマトグラフィー ＤＥ−５２カラムから０．４Ｍで溶出したピークを２０
mＭトリスバッファー(pＨ８．０)に対して一夜透析した
後、Ａmicon Ｍatrex Ｇel Ｂlue Ａ(この樹脂は、
染料(Ｃibacron blue Ｆ３ＧＡ)と共有結合している
アガロースビーズから成っており、ＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨを補因子として利用する酵素に対し親和性を有す
る)の２．５×４．５のカラムに掛けた。カラムをトリ
スバッファーで洗滌し、１．０mＭのＮＡＤＰで溶出し
た。分画を採取し、ＤＫＧリダクターゼ活性を測定し、
活性分画プールを限外濾過により(Ａmicon stirredcel
l、ＹＭ−５メンブラン)１６倍まで濃縮した。

【００５１】Ｄ．高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬ
Ｃ) Ｂlue Ａカラムから得られた濃縮物質を２０mＭトリス
バッファー(pＨ８．０)に対して一夜透析した後、２０
０mＭの炭酸水素アンモニウムで緩衝化したＡltex Ｔ
ＳＫカラム(０．５×６０cm)に掛けた(ＴＳＫカラムは
タンパク質を分子量によって分別する)。２,５−ＤＫＧ
リダクターゼ活性体は４５,０００ダルトンの分子量に
相対する単一のピークで溶出され、９９％以上の純度を
示した。即ちこの規準によればホモジニアス(均質)であ
った。

【００５２】実施例２ Ｃorynebacterium２,５−ＤＫ
Ｇリダクターゼの特性決定 Ａ．電気泳動 この酵素を、ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)の存在下
にアクリルアミドゲル中で電気泳動した。非還元的条件
および還元的条件のいずれにおいても、約３４,０００
ダルトンの分子量に相当する単一のタンパク質のバンド
を認めた。４５,０００ダルトンの範囲にはタンパク質
を認めなかった(ＨＰＬＣでは認められた)。

【００５３】Ｂ．Ｎ−末端アミノ酸配列 アミノ酸配列のデータから、純化した酵素は単一のＮ−
末端配列を含んでいることがわかった。(μは未測定）

【化４】

【００５４】Ｃ．アミノ酸組成 アミノ酸加水分解の結果、次の組成を得た。

【表１】 アミノ酸 モル％ アミノ酸 モル％ ａｓｘ １１．５２ met １．３６ thr ４．７５ ile ４．８２ ser ３．８５ leu ７．９０ glx １０．４７ tyr ２．４０ pro ６．１５ phe ２．３７ gly ８．２２ his ３．６７ ala １４．６９ lys ３．１０ cys ０．００ arg ５．２１ val ７．４７ trp ２．０５

【００５５】Ｄ．速度論的パラメーター、基質特異性お
よび補因子要求性 速度論パラメーターの測定に以下の測定条件を使用し
た。 リン酸ナトリウム緩衝液 １５０mＭ,pＨ６．４, ２５℃ ＮＡＤＰＨ １１〜３００μＭ 酵素 １０μg ２,５−ＤＫＧ ０．４３〜４３mＭ 測定容量 １．０ml ミヒヤエル恒数(Ｋm)２,５−ＤＫＧ １５．５mＭ ＮＡＤＰＨ ３３．７μＭ 最大速度(Ｖmax) ９．８単位／mg (１単位＝１．０μモル／分)

【００５６】この酵素はＮＡＤＰＨに特異性を有する。
２−ＫＤＧ、５−ＫＤＧ、Ｄ−グルコン酸、２−ＫＬ
Ｇ、ＮＡＤＨでは何ら活性を認めなかった。Ｍg⁺⁺、Ｍn
⁺⁺、Ｃa⁺⁺、Ｚn⁺⁺、ＥＤＴＡ、システイン、ＡＤＰ、Ａ
ＴＰの存在下で、何ら活性に変化を認めなかった。

【００５７】Ｅ．至適pＨ pＨ６．４で最高の活性が認められた。この酵素は、pＨ
５．０〜７．６の広い範囲にわたって活性を示した。

【００５８】Ｆ．立体特異性および定量的変換 ２,５−ＤＫＧの２−ＫＬＧへの変換を計量するため
に、０．１モルのトリス:Ｃl(pＨ７．５)１ml中に２,５
−ＤＫＧ、１．３３mＭのＮＡＤＰＨ、０．３mgの２,５
−ＤＫＧリダクターゼを含有させて反応を行なった。２
５℃で５時間後、反応を停止し、ＮＡＤＰＨ酸化と２−
ＫＬＧの生成を分析した。０．４mＭのＮＡＤＰＨの酸
化に相当する３８０nmにおける吸収の変化が観察され
た。有機酸カラムによるＨＰＬＣ分析では０．４２mＭ
の２−ＫＬＧに相当する単一のピークが認められた。２
−ＫＤＧ(２−ケト−Ｄ−グルコン酸)または５−ＫＤＧ
(５−ケト−Ｄ−グルコン酸)は認められなかった。この
ＨＰＬＣ分析の結果は、更に、凍結乾燥した反応混合物
に３０分、９０℃でトリメチルシリルイミダゾール／ピ
リジン(５０／５０)を添加して調製した過トリメチルシ
リル化誘導体を、５％の交差結合フエニルメチルシリコ
ン融解シリカ結合キャピラリーカラム(２５ｍ）を用い
たＧＣ−ＭＳ分析により確かめられた。薄層クロマトグ
ラフィの結果も上記の結果と一致した。

【００５９】実施例３ 組換え体２，５−ＤＫＧリダク
ターゼ Ａ．プローブの設計 Ｃorynebacterium 株(ＡＴＣＣ３１０９０)ＤＮＡのＴ
mを測定したところ、７．５mＭリン酸ナトリウム、１m
ＭＥＤＴＡ(pＨ６．８)の溶液中で８１．５℃であっ
た。これは標準として使用したＰseudomonas aerugino
sa のＤＮＡ(Ｔm＝７９．７℃,Ｇ＋Ｃ＝６７％)からの
(Ｇ＋Ｃ)含量７１％に相当する。したがって、構築に当
たって、高(Ｇ＋Ｃ)含量の細菌ＤＮＡ中にいきわたって
いることが知られているコドン(Ｇoug,Ｍ．ら、Ｎuclei
c Ａcids Ｒes．１０,７０５５(１９８２))を使用し
た:phe,ＴＴＣ;lys,ＡＡＧ;val,ＧＴＧ;pro,ＣＣＧ;al
a,ＧＣＣ;asp,ＧＡＣ;gln,ＣＡＧ;arg,ＣＧＣ;glu,ＧＡ
Ｇ;asn,ＡＡＣ;ser,ＴＣＣ;ile,ＡＴＣ;leu,ＣＴＧ;gl
y,ＧＧＣ;tyr,ＴＡＣ。Ｃorynebacterium 株(ＡＴＣＣ
３１０９０)から得られた２,５−ＤＫＧリダクターゼの
部分的なアミノ酸配列は実施例２に示されている:この
配列と上記のコドンの配列を使用し、Ａndersonおよび
Ｋingstonの方法(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ
８０,６８３８(１９８３))を用いて好適なプローブを
構築した。Ｃrea,Ｒ．ら(Ｎucleic Ａcids Ｒes．,
８:２３３１(１９８０)のフォスフォトリエステル法に
より２つの４３量体、即ち

【化５】 ５'ＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＧＧＣＧＣＧＣＴＧＧＧＣＧＴＣＧＧＣＣＧＧＣ ＧＧＣＡＣＣＴＴＧ３' および

【化６】 ５'ＣＴＣＣＡＴＣＣＣＧＣＡＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＴＴＣＡＡＧ ＧＴＧＣＣＧＣＣＧ３' を合成した。このオリゴヌクレオチドプローブを１００
μＣi〔r−³²Ｐ〕ＡＴＰ(５,０００Ｃi／mmole,Ａmersh
am)およびポリヌクレオチドキナーゼ(Ｐ−ＬＢiochemic
als)によりリン酸化する。

【００６０】Ｂ．プラスミドゲノムライブラリーの構築 Ｓhillerらの方法(Ａntimicro．Ａgents Ｃhemotherap
y １８,８１４(１９８０))により、Ｃorynebacterium
株ＡＴＣＣ３１０９０からゲノムＤＮＡを分離した。
大きい断片(＞１００kb)をＣsＣl密度勾配遠心分離法で
純化し、Ｓau３Ａにより部分的に消化した。消化物をア
ガロースゲル電気泳動により、１−２kb、２−３kb、３
−４kb、および４−６kbの大きさ別に組分けしてサイズ
分画した。ゲノムライブラリーは、ＢamＨＩ部位の切断
と、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼを用いたＳau３Ａ断片の挿入に
より、ベクターpＢＲ３２２およびpＡＣＹＣ１８４を用
いて各サイズ毎のＤＮＡ断片から作製した(Ｂoliver,Ｆ
ら、Ｇene２,９５(１９７７);Ｃhang,Ａ．Ｃ．Ｙ．,お
よびＣohen,Ｓ．Ｎ．Ｊ．Ｂacteriol．１３４,１１４１
(１９７８))。Ｄ．Ｈanahanの形質転換のプロトコール
(Ｊ．Ｍol．Ｂiol．,１６６ ５５７(１９８３))を用い
て、得られたプラスミドを用いてＥ．coli株ＮＭ２９４
(ＡＴＣＣ３１４４６)またはＤＨ−１(ＡＴＣＣ３３８
４９)のrecＡ^- 誘導株を形質転換にした。各ゲノムラ
イブラリーは１０⁴〜１０⁵の独立した組換え体から成っ
ていた。(変法として、Ｃorynebacterium株(ＡＴＣＣ３
１０９０)ＤＮＡのＢamＨＩ断片(サイズ幅２．０〜２．
５kb)およびＰst断片(サイズ幅０．５〜１．５kb)を用
いてpＢＲ３２２から別のプラスミドライブラリーを作
製しても良い)。

【００６１】Ｃ．Ｅ．coli におけるプラスミドライブ
ラリーのスクリーニング コロニー群をマイクロ滴定皿に採取し、一夜インキュベ
ートしてから、アンピシリンまたはクロラムフェニコー
ルを含有するＬＢプレート上に設置したニトロセルロー
スフィルター(ＢＡ８５)にスタンプした。マイクロ滴定
皿に残った部分のコロニーは４２％のＤＭＳＯを加えて
保管し、−２０℃に貯蔵した。

【００６２】移植された部分のコロニーは８〜９時間、
３７℃でインキュベートした後、フイルターから、１
２．５μg／mlのクロラムフェニコールまたはスペクチ
ノマイシンを含有しているプレートへ移し換え、一夜、
３７℃でインキュベートすることにより増幅した。

【００６３】Ｅ．coli 内のプラスミドライブラリーを
フイルターハイブリダイゼーションによりスクリーニン
グする。ＤＮＡを変性し、Ｉtakura,Ｋら(Ｎucleic Ａ
cidsＲes．９:８７９〜８９４(１９８１))の記載した方
法により重複フィルターに結合させる。このハイブリダ
イゼーション用のフイルターを、フイルター当り約１０
mlの５×ＳＥＴ、５×Ｄenhardt溶液および５０μg／ml
の変性したサケ***ＤＮＡ、および０．１％ピロリン酸
ナトリウム＋２０％ホルムアミド中に浸漬する(５×Ｓ
ＥＴ＝５０mＭトリス−ＨＣl(pＨ８．０)、５mＭＥＤＴ
Ａ、５００mＭＮaＣl;５×Ｄenhardtの溶液＝０．１％
ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、
０．１％フイコール;Ｄenhardt、Ｂiochem．Ｂiophys．
Ｒes．Ｃomm．,２３:６４１(１９６６)参照)。フイルタ
ーを４２℃で１４〜１６時間、絶えず撹拌しながらプレ
ハイブリダイズし、本実施例のＡ項において調製した^〜
１×１０⁸cpmのプローブと４２℃でプローブした。Ａ項
のプローブとハイブリダイズしたフイルタを、４２℃で
０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸
ナトリウムで３０分間づつ３回洗滌した。２つのフイル
ターのそれぞれをドライブロッチングし、台紙につけ、
Ｄupont Ｃronex１１Ｒエキストラライフライトニング
−プラスインテンシファイングスクリーンを持ったＫod
ak ＸＲ５Ｘ線フイルムに−７０℃で４〜２４時間、感
光させた。

【００６４】陽性コロニーの細胞を増殖させ、プラスミ
ドＤＮＡをＣlewellおよびＨelinskiの方法(Ｐroc．Ｎa
tl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ ６２,１１５９(１９６９))
によって分離した。ＤＮＡをＡluＩおよびＰstＩにより
断片化し、ベクターＭ１３mp８およびＭ１３mp９にサブ
クローンした(Ｍessing,Ｊ．およびＶiera,Ｊ．、Ｇene
１９,２６９(１９８２)。プローブとハイブリッド形
成したサブクローンを、そのＤＮＡが２,５−ＤＫＧリ
ダクターゼを暗号化していることを確かめるため、ジデ
オキシ鎖ターミネーション法により塩基配列決定した
(Ｓanger,Ｆ．ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳ
Ａ)７４:５４６３(１９７７))。

【００６５】Ｄ．２,５−ＤＫＧリダクターゼ遺伝子の
ための発現ベクターの構築 それ自身の、または合成されたリボソーム結合部位を伴
なった２,５−ＤＫＧリダクターゼ遺伝子を、テトラサ
イクリン耐性遺伝子またはそれ以外の選択マーカーを有
し、またプラスミドＣol ＥＩ、１５Ａ、またはＲＳＦ
１０１０から誘導された複製起源を含んでいる発現プラ
スミド上のＥ．coli trp(またはtac)プロモーターまた
はpＡＣＹＣ １８４ ＣＡＴプロモーターの“下流"に
挿入する。組立て物のあるものは、更に、外部から添加
されたインドールアクリル酸またはＩＰＴＧによって
２,５−ＤＫＧリダクターゼ遺伝子の発現を調節するこ
とができるＥ．coli trpレプレッサーまたはＥ．coli
lac レプレッサーを暗号化している活性遺伝子を含
有していてもよい。上記のプラスミドの種々の突然変異
体もまた、２,５−ＤＫＧリダクターゼの発現に利用さ
れる。

【００６６】Ｅ．２,５−ＤＫＧリダクターゼ発現ベク
ターの構築 ２,５−ＤＫＧリダクターゼ遺伝子の一部を含有するＣo
rynebacteriumＳＰ(ＡＴＣＣ３１０９０)ＤＮＡのクロ
ーンされた２．２kb ＢamＨＩ断片(フラグメント)を、
実施例３に記載された４３量体プローブで分離した。こ
のプラスミドの０．１２kb ＰstＩ／ＢamＨＩ断片を、
残りの遺伝子を含有しているＣorynebacteriumＳＰ Ｄ
ＮＡの重複している０．８８kb ＰstＩ断片を分離する
ためのプローブとして使用した。図２に示すように、p
ＤＫＧＲ２(２．２kb ＢamＨＩ断片を含有している)を
ＮcoＩで消化し、Ｅ．coli ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋ
lenow 断片およびdＮＴＰsで処理して平滑末端を作
り、次いで更にＢamＨＩで消化して０．８７kbの断片を
遊離させた;この断片は低融点アガロース上を電気泳動
させて精製した。プラスミドpＤＫＧ２９(０．８８kb
ＰstＩ断片を含んでいる)をＰst ＩおよびＢamＨＩで
消化し、生成した０．７６kb断片を同様に低融点アガロ
ース上で分離した。この０．８７kb ＮcoＩ／ＢamＨＩ
断片と０．７６kbＢamＨＩ／ＰstＩ断片をＳmaＩ／Ｐst
Ｉで消化したＭ１３m９と混合し、ライゲーションして
完全な２,５−ＤＫＧリダクターゼ遺伝子を含有してい
るＣorynebacterium ＳＰ ＤＮＡの１．６kbを挿入体
を持ったＭ１３組換え体(“mit１２”)を得た(図２)。

【００６７】このmit１２の一本鎖ＤＮＡに“欠失プラ
イマー"(配列:

【化７】 ＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＣ) およびＭ１３m９ＤＮＡのＡluＩ断片をアニーリングし
た。この鋳型−プライマー組み合せ物を、dＮＴＰsおよ
びＴ₄ＤＮＡリガーゼの存在下に、Ｅ．coli ＤＮＡポ
リメラーゼＫlenow 断片で処理すると、Ａdelmanらの
記載(ＤＮＡ２,１８３(１９８３))のように、インビト
ロでヘテロデュプレックスmit１２ＲＦ分子が作成され
た。これらの分子を宿主tＭ１０１の形質転換に使用
し、所望の欠失を備えた組換え体ファージを、欠失プラ
イマーをプローブとして使用したプラークハイブリダイ
ゼーションによって検出した(ＡdelmanらＤＮＡ２,１８
３(１９８３))。この構造物はmit１２△と命名された
(図３)。

【００６８】このmit１２△ ＲＦ ＤＮＡをＥco Ｒ
ＩおよびＨindＩＩＩで消化すると、２,５−ＤＫＧリダ
クターゼ遺伝子を含有している１．５kbの断片が得られ
た。ヒト成長ホルモン発現プラスミドpＨＧＨ２０７−
１ptrp△ＲＩ５'〔pＨ ＧＨ２０７−１ptrp △ＲＩ
５'はpＨＧＨ２０７−１の誘導体(de Ｂoerら(１９８
３),Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．,ＵＳＡ８０,２１)で
あって、アンピシリン耐性遺伝子とtrpプロモーターの
間のＥcoＲＩ部位が欠失している〕をＥcoＲＩとＰstＩ
で消化して、Ｅ．coli trp プロモーターを含有する
１．０kbの断片を得、また、pＢＲ３２２をＰstＩとＨi
ndＩＩＩで消化して３．６kbの断片を作成した。これら
３個の断片をライゲーション(連結)することによって、
２,５−ＤＫＧリダクターゼの発現プラスミドを形成
し、これをpmit１２△／trp１と命名した(図３)。この
プラスミドは宿主にテトラサイクリン耐性を付与するこ
とはできない。完全なテトラサイクリン耐性機能を暗号
化しているプラスミドは、次のようにして構築された。
Ｐmit１２△／trp１ＤＮＡをＨindＩＩＩで消化し、
Ｅ．coli ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋlenow 断片とdＮ
ＴＰsで処理して平滑末端ＤＮＡを生成し、次にこれを
ＳphＩで消化した;得られた５．６kb断片を低融点アガ
ロース上で電気泳動させることにより精製した。同様に
して、pＢＲ３２２ＤＮＡをＥcoＲＩで消化し、Ｅ．col
i ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋlenow 断片とdＮＴＰsで
処理し、ＳphＩで消化し、得られた０．５６kb断片を低
融点アガロース上で精製した。次に、これらの５．６kb
断片と０．５６kb断片とを連結(ライゲーション)し、テ
トラサイクリン耐性の２,５−ＤＫＧリダクターゼ発現
プラスミドを得、これを、ptrpl−３５と命名した(図
３)。このプラスミドに含まれているtrpプロモーター、
合成リボソーム結合部位、および２,５−ＤＫＧリダク
ターゼ遺伝子のＤＮＡ配列を図４に示す。

【００６９】Ｅ．組換え２,５−ＤＫＧリダクターゼの
製造 形質転換に用いる細胞はＬacyおよびＳparksの方法(Ｐh
ytopathological Ｓociety,６９:１２９３−１２９７
(１９７９))により用意した。簡単に述べると、好適な
宿主細胞、Ｅrwinia herbicola (ＡＴＣＣ２１９９
８)、またはＥ．coli ＭＭ２９４(ＡＴＣＣ３１４６４
６)の１白金耳を５mlのＬＢ培地に接種し、３０℃で１
４〜１６時間、インキュベートした。この一夜を置いた
増殖物の１:１００の希釈液をＬＢ培地に接種し、ＯＤ
₅₉₀が０．４となるまで培養し、４℃で遠心分離して、
細胞を回収した。回収したペレットを１／３量の１０m
ＭＮaＣlに再び懸濁し、４℃で再び遠心分離し、ペレッ
トを再び同量の３０mＭＣaＣl₂に懸濁し、０℃で６０分
間放置後、再び４℃で遠心分離し細胞を回収した。ペレ
ットを１／１２容量の３０mＭＣaＣl₂に再び懸濁し、４
℃で一夜貯蔵した。(別法として、細胞を３０mＭＣaＣl
₂と１５％グリセロールに再懸濁し、−７０℃で貯蔵し
ても良い。)

【００７０】形質転換は、０．２mlのコンピテント細胞
と１μgのプラスミドを０℃で２時間インキュベート
し、次いで１分間４２℃に加温することにより行なっ
た。３mlのＬＢブロスをこれに加え、４時間３７℃で放
置して、細胞を回復させ、次いで細胞をＬacyおよびＳp
arks(上述)記載の選択培地で培養した。成功した形質転
換体をＯ．Ｄ．₅₅₀＝１．０の密度となるまで増殖さ
せ、次いで遠心分離し、０．２％のグルコースを含む最
少量の培地に再懸濁させた。次に、ＩＡＡまたはＩＰＴ
Ｇを培地に添加し、０．５〜１時間後、遠心分離して細
胞を回収し、リゾチームと界面活性剤(Ｔween８０)で処
理して細胞を溶解(溶菌)させた。

【００７１】上清を取り、２,５−ＤＫＧリダクターゼ
の存在を実施例２Ｄに示した方法で測定した(表２)。タ
ンパク質はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分析した(図５)。組換え体２,５−ＤＫＧリダクター
ゼを示すタンパク質バンドを、ウエスタンブロッティン
グ法により免疫学的に同定した(Ｔobin,ＨらＰroc．Ｎa
tl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ７６,４３５０(１９７９))

【００７２】

【表２】 ２,５−ＤＫＧリダクターゼ活性 抽 出 物 △吸光度(３４０nm)min^-1１００μＬ pＢＲ３２２を導入した Ｅrwinia herbicola(ＡＴＣＣ２１９９８) −０．０８７ ptrpl−３５を導入した Ｅrwinia herbicola(ＡＴＣＣ２１９９８) −１．９２５

【００７３】実施例４ 組換え微生物を２,５−ＤＫＧ
に接触させることによる２−ＫＬＧの製造 凍結貯蔵していたグリセロールストックから、ptpl−３
５−形質転換Ｅw．herbicola(ＡＴＣＣ２１９９８)の細
胞を、５mg／Ｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ固形
培地(１０g／Ｌトリプトン、５g／Ｌ酵母エキス、１０g
／ＬＮaＣl、１５g／Ｌ寒天)上に画線接種し、４８時
間、３０℃でインキュベートした。その１コロニーを取
り、５mg／Ｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ液体培
地５mlの接種に使用し、これを試験管内で１６時間、３
０℃で振盪した。この培養の１．０mlを５mg／Ｌテトラ
サイクリン含有ＬＢ液体培地１００mlの接種に使用し、
次にこれを３０℃に於いて、２００rpmで１６時間振盪
した。遠心分離により細胞を回収し、同量の新しいＬＢ
培地で一度洗滌し、次いで５mg／Ｌのテトラサイクリン
および２０g／Ｌの２,５−ＤＫＧを含有する５０mlのＬ
Ｂ培地に再懸濁させた。この１０mlを１２５mlのフラス
コ中で、２００rpm、３０℃で１６時間振盪した。得ら
れたブロスをＨＰＬＣで分析し、２．０g／Ｌの２−Ｋ
ＬＧが含有していることを認めた。pＢＲ３２２を導入
したＥrw．herbicola(ＡＴＣＣ２１９９８)を用いて同
様な方法で行なった対照培養では、２−ＫＬＧは含まれ
ていなかった。

【００７４】実施例５ 組換体微生物によるグルコース
から２−ＫＬＧの製造 凍結貯蔵していたグリセロールストックから、ptrpl−
３５−形質転換Ｅrw．herbicola(ＡＴＣＣ２１９９８)
の細胞を５mg／Ｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ固
形培地(１０g／Ｌトリプトン、５g／Ｌ酵母エキス、１
０g／ＬＮaＣl、１５g／Ｌ寒天)上に画線接種し、次い
で４８時間、３０℃でインキュベートした。その１個の
コロニーを取り、５mg／Ｌのテトラサイクリンを含むＬ
Ｂ液体培地５mlの接種に使用し、これを試験管内で１６
時間、３０℃で振盪した。この培養液１mlを、５mg／Ｌ
のテトラサイクリンを含有する１００mlのＡＴＣＣ培地
１０３８(３．０g／Ｌグルコース、５．０g／Ｌ酵母エ
キス、５．０g／Ｌペプトン、７．５g／ＬＣaＣＯ₃、p
Ｈ７．０)への接種に使用し、これを５００mlのフラス
コ中で、３０℃で１６時間、２００rpmで振盪した。次
に、この培養液７５mlから遠心分離により細胞を取り、
５mg／Ｌのテトラサイクリンと２０g／Ｌのグリセロー
ルを含む５０mlの新しいＡＴＣＣ培地１０３８に再懸濁
させ、５００mlのフラスコ中、３０℃、２００rpmで４
８時間振盪する。得られたブロスをＨＰＬＣおよびＧＣ
／ＭＳで分析した結果、１．０g／Ｌの２−ＫＬＧを含
有していることがわかった。pＢＲ−３２２を導入した
Ｅrw．herbicola(ＡＴＣＣ２１９９８)を用いて同様に
して行なった対照培養には、２−ＫＬＧは含まれていな
かった。

【００７５】実施例６ 本発明微生物による２−ＫＬＧ
の製造 容易に入手し得る炭素供給源から２−ＫＬＧを製造し得
ることを例示するために、次の実験を実施した。グルコースからの２−ＫＬＧの製造 次の成分を含有する培地中で、Ｅrwinia herbicola
(ＡＴＣＣ２１９９８)/ptrpl−３５の細胞を発育させる
ことにより２−ＫＬＧの製造を実施した。 酵母エキス(Ｎestles) １０g／l 炭酸カルシウム ２０g／l とうもろこし浸漬液 １０g／l グルコース ２０g／l テトラサイクリン ５mg／l グルコースおよびテトラサイクリンは別個に滅菌し、接
種前に添加した。

【００７６】接種材料は、凍結したストック培養液１．
０mlを、５g／lのグルコースおよび５mg／lのテトラサ
イクリンを含有している５０mlのルリア(Ｌuria)ブロス
に加えることにより調製した。この接種材料を含有する
２５０mlの遮閉フラスコを３０℃で１２時間振盪培養し
た。

【００７７】５０mlの上記の製造培地を満たした２５０
mlの遮閉フラスコに１mlのこの接種材料を接種した。フ
ラスコを振盪しつつ、３０℃でインキュベートした。接
種時の培地のpＨはとうもろこし浸漬液の酸性のため
５．１であった。５７時間後にpＨは８．７１まで上昇
し、２−ＫＬＧはＨＰＬＣにより、０．６mg／mlの濃度
で存在していることがわかった。２−ＫＬＧの存在はＨ
ＰＬＣおよびＧＣ−ＭＳスペクトロメトリーにより確認
した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｃorynebacterium２,５−ＤＫＧリダクター
ゼのための発現ベクターの模式図である。

【図２】 ２,５−ＤＫＧリダクターゼ遺伝子のための
発現ベクターの組み立てを示す工程図である。

【図３】 ２,５−ＤＫＧリダクターゼ遺伝子のための
発現ベクターの組み立てを示す工程図である。

【図４】 pＴrp１−３５発現ベクターのコントロール
領域および２,５−ＤＫＧリダクターゼ遺伝子を含む配
列を示す模式図である。

【図５】 図４に示した配列を持つ２,５−ＤＫＧリダ
クターゼ配列ベクターで形質転換したＥrwinia herbic
ola(ＡＴＣＣ２１９９８)から抽出した蛋白質の染色ゲ
ルを示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:18） 7804−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 7/60 Ｃ１２Ｒ 1:18） 7804−4Ｂ (31)優先権主張番号 ６２０５８５ (32)優先日 1984年６月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６２０６５１ (32)優先日 1984年６月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６２０６５２ (32)優先日 1984年６月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ロバート・アラン・ラザルス アメリカ合衆国カリフォルニア94403、サ ン・マテオ、ロウリエ・メドウズ66番 (72)発明者 デビッド・リチャード・ライト アメリカ合衆国カリフォルニア94114、サ ン・フランシスコ、ケースリー・ストリー ト239番 (72)発明者 ジェフリー・ビーチ・ミラー アメリカ合衆国カリフォルニア94002、ベ ルモント、コロニト・ブールバード2613番 (72)発明者 ウイリアム・ハリー・ラステター アメリカ合衆国カリフォルニア94401、サ ン・マテオ、エヌ・アイダホ・ストリート 818番

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下のアミノ酸配列で示される２,５−
   ジケトグルコン酸リダクターゼまたは２,５−ジケトグ
   ルコン酸リダクターゼ活性を有するその変異体をコード
   しているＤＮＡ配列を含んでおり、該ＤＮＡ配列を発現
   することができる微生物宿主によって生産される２,５
   −ジケトグルコン酸リダクターゼ活性を有する酵素であ
   って、還元または非還元的ＳＤＳ ＰＡＧＥに於いて分
   子量約３４,０００の位置に泳動する酵素: 【化１】
2. 【請求項２】 以下のアミノ酸配列で示される２,５−
   ジケトグルコン酸リダクターゼまたは２,５−ジケトグ
   ルコン酸リダクターゼ活性を有するその変異体をコード
   しているＤＮＡ配列を含んでおり、該ＤＮＡ配列を発現
   することができる発現ベクターが導入された微生物宿主
   細胞を、グルコースまたは通常の代謝産物を含んでいる
   培地中で適当な代謝条件下で培養することからなる、該
   グルコースまたは通常の代謝産物を２−ケト−Ｌ−グロ
   ン酸へ変換する方法: 【化２】
3. 【請求項３】 ２−ケト−Ｌ−グロン酸を希酸または熱
   で処理することにより更にアスコルビン酸に変換する工
   程を包含する請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 ２−ケト−Ｌ−グロン酸をメタノール中
   でエステル化し、次いで塩基の存在下でラクトン化する
   ことにより更にアスコルビン酸に変換する工程を包含す
   る請求項２に記載の方法。