JPS6047677A - 新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はツカルティア属に属する新規な微生物に関する
。

ジカルボン酸は合成樹脂、高級潤滑油、可塑剤、香料等
の製造原料として有用な物質であるが、合成法により製
造されていたジカルボン酸は炭素数にも限度があり、炭
素数１２個以上のジカルボン酸を製造することは国難で
あった。

そこで近年、微生物を利用した発酵法によるジカルボン
酸の製造法が注目されてきた。

従来、微生物によるジカルボン酸の製造法としてはキャ
ンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ　）属（特公昭５０−１９６
３０号等）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属（特公昭４５−
２４３９２号等）等の酵母によるものか多く、細菌によ
るものではコリネバクテリウム（Ｇｏｒｙｎａｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　）属（特公昭５６−１７０７５号等）しか
見出されていなかった。

そこで、本発明者らは、斯かる現状に鑑み、ノルマルパ
ラフィン、脂肪酸又は脂肪酸誘導体を対応するジカルボ
ン酸に変換する能力を有する菌を自然界より広く検索し
た結果、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属に属する
微生物の中に斯かる能力を有するものがあることを見出
し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はノカルディア属に属し、ノルマルパ
ラフィン、脂肪酸又は脂肪酸誘導体を資化してジカルボ
ン酸を生産する能力を有する新規なノカルディア・エス
ピー・ＫＳＭ−Ｂ−２１（微工研菌寄第７００６号）に
関するものである。

次に、木発明者らが分離、採取した本菌株の菌学的性質
を詳述する。

（ａ）形態 若い細胞は、菌糸状に育成し分枝が観察される。菌糸は
培養の進行に従って球菌状あるいは桿菌状に分断する。

菌糸の直径は　１．５ル（ｂ）各培地における生育状態 １）シュクロース、硝酸塩寒天培地： 生育は中程度であり、コロニーの色は白色ないしクリー
ム色である。にふぃ光沢がある。

２）グルコース・アスパラギン寒天培地：生育は中程度
であり、コロニーの色は白色ないしクリーム色である。

にぶい光沢がある。

３）グリセリン会アスパラギン寒天培地：生育は中程度
であり、コロニーの色は白色ないしクリーム色である。

但し、光沢はない。

４）スターチ寒天培地二二 生育は貧弱であり、コロニーの色は白色である。光沢が
なく、乾いた感じのコロニーである。

５）チロシン寒天培地二 育成は中程度であり、コロニーの色は肌色ないし淡オレ
ンジ色である。にぶい光沢がある。

６）栄養寒天培地： 生育は豊富であり、コロニーの色は肌色ないしうすピン
ク色である。光沢があ る。

７〕イースト・麦芽寒天培地： 生育は最も豊富であり、コロニーノ色ハピンク色ないし
うすオレンジ色テアル。

光沢はにぷい。

８）オートミール寒天培地： 育成は中程度であり、コロニーの色は白色、コロニー　
は、光沢がある。

（Ｃ）生理学的性質 １）生育範囲ニ一 温度ＩＥＩ〜３８６Ｃ（最適２７〜３４６Ｃ）ｐＨ５，
０〜９．２　（最適６．０〜８．３）２）ゼラチンの液
化゛（グルコース拳ペプトンゼラチン培地）：　陰性 ３）スターチの加水分解（スターチ寒天培地ン陰性 ４〕脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：ともに陰性５）メラ
ニン様色素の生成：　陰性 （ｄ）炭素源の同化性 Ｌ−アラビノース二　− Ｄ−キシロース　：　− Ｄ−グルコース　：　＋ Ｄ−フラクトース：　＋ シュクロース　：　＋ イノシトール　：　＋ Ｌ−ラムノース　二　− ラフィノース　：　− Ｄ−マンニット　：　＋ （ｅ）　ｓからの酸、ガスの生成 フラクトース二　− （ガスは生成しない） ソルビトール二　− （ガスは生成しない） （ｆ）細胞壁組成 ジアミノピメリン酸：　ｍｅｓｏ　−Ｄ　Ａ　Ｐ糖　：
アラビノース、ガラクトース （ｇ）５−フルｔｏウラシル耐性（４０ｍｇ／１８）　
：耐性あり （ｈ）分離源：　土壌 以上の菌学的性質を有する菌についてパージエイノマニ
ュアＪＬ／　（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ
　Ｄｅｔｅ−ｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇＹ）第８版（１９７５年）に基づいて検索した結果
、本菌株はノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属に属す
る新菌株と認め、ノカルディアａｘスビー＊　ＫＳＭ−
８−２１（Ｎｏｃａｒｄｉａｓｐ、　ＫＳＭ−Ｂ−２０
）と命名した。なお、本菌株は、微工研菌寄第７００６
号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。

分離源の土壌からの本菌株の分離はノルマルパラフィン
含有培地を用い常法で行なった。

本菌株の培養に使用する培地の組成は、使用する菌株が
良好に生育し、ノルマルパラフィン、脂肪酸又は脂肪酸
誘導体からのジカルボン酸の生産を順調に行なわしめる
ために適当な炭素程、窒素源あるいは有機栄養源、無機
塩などからなる。炭素源としては、炭水化物（例えば、
グルコース、フラクトース、シュクロース、マンニトー
ル等）、有機酸（例えば、クエン酸、コハク酸、脂肪酸
及びそのエステル等）、炭化水素（例えば、ｎ−ドデカ
ン・、ｎ−ヘキサデカン等）など資化されるものならば
いずれも使用できる。また、窒素源あるいは有機栄養源
としては、例えば、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝
酸アンモニウム等の硝酸塩類、酵母エキス、肉エキス、
ペプトンが挙げられる。

また、烈機塩としては各種リン酸塩、硫酸マグネシウム
などが使用できる。さらに微量の重金属塩類が使用され
るが、天然物を含む培地では必すしも添加を必要としな
い。また栄養要求を必要とする変異株を用いる場合には
、その栄養要求を満たす物質を培地に添加しなければな
らない。

培養は培地を加熱等により殺菌後、菌を接種し、２８〜
３５°Ｃで３〜５日振盪又は通気攪拌すれば良い。ｐＨ
は６．５〜８程度に調整すると良い結果が得られる。水
に難溶性の炭素源等を使用する場合には、ポリオキシエ
チレンソルビクン等の各種界面活性剤を培地に添加する
ことも可能である。

以上の如く得られた培養物は、そのまま酵素源として用
いることもできるが、菌体を培養液より分離する場合は
、通常の固液分離手段が用いられる。このように分離さ
れた生菌体及びその処理物（凍結乾燥菌体等）も酵素源
としてもちいることができる。

ノルマルパラフィン、脂肪酸又は脂肪酸誘導体を反応基
質として本菌株を上記の如く培養するとジカルボン酸が
生産される。該基質は炭素数６〜２２のものが適当であ
り、脂肪酸誘導体としては脂肪酸の低級アルキルエステ
ルが好ましい。

これらの培養液から目的物質であるジカルボン酸の採取
および精製は、一般の有機化合物の採取および精製の手
段に準じて行うことかできる。たとえば培養液から菌体
等を除去したろ液もしくは培養液そのものを酸性とし、
エチルエーテル、酢酸エチル又はクロロホルム−メタノ
ール混液等の有機溶媒で抽出する。この抽出物をカラム
クロマトグラフィーあるいは再結晶などの方法を用いて
ジカルボン酸を単離することができる。

以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。。

実施例１ 採取した土壌サンプル約０．５ｇを滅菌水１０ｍ文に懸
濁し充分撹拌後、この土壌懸濁液０．２ｍ見を下記組成
の液体培地（Ｉ）１０ｍ文（５０ｍ９．容試験管にて）
に接種し、３０℃にて４日間振盪培養を行なう。

本　液体培地（１）　組成 ｎ−ヘキサデカン　１００　ｇ （ＮＨ４）Ｉ　ＳＯ４’、　、２０　ｇＫＨＱＰＯ４２
ｇ 酵母エキス　２ｇ ＭｇＳＯ４・　？Ｈ１０５００ｍｇ Ｆｅ５０４・　７Ｈ２０１０ｍｇ Ｍｒ３Ｓ０４　・４〜Ｂ　）１２０　８＋ｎｇイオン交
換水　１　文 ＊　１．５ｈｉｉｏ　ａｎｄ　Ｒ，Ｕｃｈｉｉｏ。

Ａｇｒ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｆｆｌ、、　３５（１３
）、２０３３〜２０４２（１９７７１ 上記培養により増殖を示した培養液は、滅菌水により適
度に希釈した後、肉汁寒天培地（栄研化学製；普通寒天
培地）に移し、３０’Ｃにて２日間培養し、生じた複数
のコロニーが相互間に相異しないことを肉眼的及び顕微
鏡的に確認できるまで、肉汁寒天培地への移植を繰り返
す。

上記コロニーのうち１０個のコロニーをそれぞれ下記組
成の斜面寒天培地（ＩＩ）に接種し、３０℃で３日間培
養し、１０木の斜面培地上の菌株が肉眼的及び顕微鏡的
に同一菌株であることを確認し、また、これら１０菌株
の各培地上の性状及び生理学的性質が同一であることを
確認した。

斜面寒天４培地（ＩＩ）　組成 Ｍｇ５０　４　自　７　Ｈ２０５００ｍｇＦｅＳＯ４ｍ
　？）１２０　１０ｍｇ ＭｎＳＯ４＊４　〜　ｆｌＨｌｏ　８ｍｇポリオキシエ
チレン− ソルビタンモノラウリン酸エステル （平均ＥＯ数２０モル）　５０ｍｇ 寒天　２０　ｇ イオン交換水　ｉｉ 上記菌株の培地上の性状及び生理学的性質は前述した通
りである。上記試験の結果、各ｌＯン水溶液（２ｍ　ｌ
　）の入った凍結保存用バイアルに懸濁し、−８０℃に
て凍結保存する。かくして３ケ月凍結保存後、迅速に解
凍し得られる懸濁液の一白金耳を肉汁寒天培地に蘇生後
、前記と同条件下に各培地上での性状及び生理学的性質
を調べた結果、凍結前とは変化が認められなかった。

また、上記凍結及び解凍を１ケ月毎に５度繰り返した菌
株について同様に、各培地上での性状及び生理学的性質
を調べた結果、変化は認められなかった。

次いで、本菌株を利用してジカルボン酸を製造した例を
参考例として挙げる。

参考例１ バルミチン酸メチル５０ｇ、リン酸ニアンモニウム　１
０ｇ、リン酸−カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム（７水
塩）０．２ｇ、硫酸第一鉄（７水塩）　０．０２ｇ、（
シと酸亜鉛（７水塩）０．０１１３ｇ、硫酸マンガン（
４〜６水塩）　０．０１８ｇ、酵母エキス２ｇを水道水
１２に溶かしＰＨを７．０に調製した。この液体培地５
１を５０川１容振盪試験官に仕込み、１２０°Ｃで１５
分間蒸気滅菌した後、ノカルディアｅエスピー＃　ＫＳ
Ｍ−８−２１（Ｎｏｃａｒｄｉａｅｓｐ、　ＫＳＭ−８
−２１）を−白金耳接種し、３０℃テ８６時間振盪培養
した。

培養終了後、この培養液に９Ｎ硫酸１ｍｌを加えｐＨを
強酸性として、クロロホルム−メタノール（２二ｌ）混
液２０ｍ１で抽出した。この抽出液を減圧下濃縮した後
メタノール−ＢＦ３触媒でメチル化し、ガスクロマトグ
ラフィーにて生成物の定量を行なった。その結果を第１
表に示す。

なお生成物はガス−マス（ＧＣ−ＭＳ）によりα、ω−
テトラデカンジカルボン酸であることが確認された。図
１にα、ω−テトラデカンジカルボン酸のジメチルエス
テル（測定にあたってエステル化したもの）のマスパタ
ーンを示した。

第１表 Ｍ １事件の表示 昭和５８年特許願第５３８５０号 ２発明の名称 新規微生物 ３補正をする者 明細書および図面 ６補正の内容 別紙のとおり ／ノ；上−ａｉ−一、 明細書１７頁の第１表の後に次のとおり挿入する。

［４、図面の簡単な説明

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 スピー＠ＫＳＭ−Ｂ−２１株。 （ａ）形態 若い細胞は、菌糸状に育成し分枝か観察される。菌糸は
   培養の進行に従って球菌状あるいは桿菌状に分断する。 菌糸の直径は　１．５ル（ｂ）各培地における生育状態 １）シュクロース、硝酸塩寒天培地： 生育は中程度であり、コロニーの色は白色ないしクリー
   ム色である。にぶい光沢かある。 ２）グルコース・アスパラギン寒天培地：生育は中程度
   であり、コロニーの色は白色ないしクリーム色である。 にぶい光沢がある。 ３）グリセリン・アスパラギン寒天培地：生育は中程度
   であり、コロニーの色は白色ないしクリーム色である。 但し、光沢はない。 ４）スターチ寒天培地：： 生育は貧弱であり、コロニーの色は白色である。光沢が
   なく、乾いた感じのコロニーである。 ５）チロシン寒天培地： ■或は中程度であり、コロニーの色は肌色ないし淡オレ
   ンジ色である。にぷい光沢がある。 ６）栄養寒天培地： 生育は豊富であり、コロニーの色は肌色ないしうすピン
   ク色である。光沢があ る。 ？）イースト・麦芽寒天培地： 生育は最も豊富であり、コロニーの色はピンク色ないし
   うすオレンジ色である。 光沢はにぷい。 ８）オートミール寒天培地： 育成は中程度であり、コロニーの色は白色。コロニー　
   は、光沢がある。 （Ｃ）生理学的性質 ｌ）生茸範囲： 温度１６〜３８°Ｃ（最適２７〜３４°Ｃ）ｐＨ５，０
   〜８．２（最適６．０〜８．３）２）ゼラチンの液化（
   グルコース・ペプトンゼラチン培地）：　陰性 ３ノスターチの加水分解（スターチ寒天培地）陰性 ４）脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：ともに陰性５）メラ
   ニン様色素の生成：　陰性 （ｄ）炭素源の同化性 Ｌ−アシビノース：　− Ｄ−キシロース　二　− Ｄ−クルコース　：　＋ Ｄ−フラクトース：　＋ シュクロース　：　＋ イノシトール　：　＋ Ｌ−ラムノース　二　− ラフィノース　：　− Ｄ−マンニット　：　＋ （ｅ）糖からの酸、ガスの生成 フラグ）・−ス２− （ガスは生成しない） ソルビトール二　− （ガスは生成しない） （ｆ）細胞壁組成 ジアミノピメリン＃　：　ｍｅｓｏ　−Ｄ　Ａ　Ｐ糖　
   ＝７ラビノース、ガラクトース （ｇ）５−フルオロウラシル耐性（４０ｍｇ／１８）　
   ：耐性あり