JPS60260518A - 人尿トリプシンインヒビタ−および人尿カリクレインの濃縮分離方法 - Google Patents
人尿トリプシンインヒビタ−および人尿カリクレインの濃縮分離方法Info
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- JPS60260518A JPS60260518A JP59116861A JP11686184A JPS60260518A JP S60260518 A JPS60260518 A JP S60260518A JP 59116861 A JP59116861 A JP 59116861A JP 11686184 A JP11686184 A JP 11686184A JP S60260518 A JPS60260518 A JP S60260518A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6445—Kallikreins (3.4.21.34; 3.4.21.35)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は尿中の人尿トリプシンインヒビター（以下ＨＵ
ＴＩと略称する）および人尿カリクレイン（以下ＨＵＫ
Ｎと略称する）を一つの吸着体により同時にしかも工業
的規模で収率よく取得する方法に関するものである。
ＴＩと略称する）および人尿カリクレイン（以下ＨＵＫ
Ｎと略称する）を一つの吸着体により同時にしかも工業
的規模で収率よく取得する方法に関するものである。
（従来の技術）
尿中トリプシンインヒビターは哺乳動物の尿中ニ存在す
る１種の酵素であり、由来する動物の種類によってその
性質が若干具なることが知られている（ Ｃａｒｌｓｏ
ｎ：Ｅｎｚｙｍｅ １Ｂ、 １７６（１９７４））。Ｈ
ＵＴＩは分子量６８０００、等電点ｐＨ２−３の糖蛋白
質であり特にトリプシン、キモトリプシン、プラスミン
（須見ら二日本生理ｉ３９．５３（１９７７））、人工
ラスターゼ（ジョンソンら：Ｈｏｐｐｅ ５ｅｙｌｅｒ
’ｓ Ｚ、ｐｈｙｓｉｏｌ、ｃｈｅｍ、３６３ 。
る１種の酵素であり、由来する動物の種類によってその
性質が若干具なることが知られている（ Ｃａｒｌｓｏ
ｎ：Ｅｎｚｙｍｅ １Ｂ、 １７６（１９７４））。Ｈ
ＵＴＩは分子量６８０００、等電点ｐＨ２−３の糖蛋白
質であり特にトリプシン、キモトリプシン、プラスミン
（須見ら二日本生理ｉ３９．５３（１９７７））、人工
ラスターゼ（ジョンソンら：Ｈｏｐｐｅ ５ｅｙｌｅｒ
’ｓ Ｚ、ｐｈｙｓｉｏｌ、ｃｈｅｍ、３６３ 。
１１６７（１９８２））などを阻害することから抗炎症
性薬剤となる可能性があり、またインフルエンザウィル
スの増殖を抑制するともいわれている（特公昭５７−１
４０７２８）。
性薬剤となる可能性があり、またインフルエンザウィル
スの増殖を抑制するともいわれている（特公昭５７−１
４０７２８）。
一方力すクレインは動物の生体内各部で生産される蛋白
質分解酵素で血清中のキニノーゲンを分解してキニンを
生成させ、それを介して血圧降下、血流量増加などの作
用を有する物質である。両者とも従来異種動物を起源と
して分離され医薬品としての利用が試みられている。特
にカリクレインは豚のすい臓及び尿を原料として製造さ
れて来た。
質分解酵素で血清中のキニノーゲンを分解してキニンを
生成させ、それを介して血圧降下、血流量増加などの作
用を有する物質である。両者とも従来異種動物を起源と
して分離され医薬品としての利用が試みられている。特
にカリクレインは豚のすい臓及び尿を原料として製造さ
れて来た。
しかしこれらは異種蛋白であるので抗原性を有し臨床に
使用した場合、頻回投与によりしばしばアナフィラキシ
−を生じ安全性に問題があった。
使用した場合、頻回投与によりしばしばアナフィラキシ
−を生じ安全性に問題があった。
人尿を原料とするＨＵＴＩ及びＨＵＫＮは同種蛋白であ
るため、上記の人体に対する副作用は生じないと考えら
れる。
るため、上記の人体に対する副作用は生じないと考えら
れる。
ＨＵＴ Ｉの従来からの濃縮精製法としては、トリクロ
ロ酢酸、硫酸アンモン、メタノールを組合せた沈澱法（
Ｎ、Ｒ，Ｓｈｕｌｍａｎ ： Ｊ、Ｂ、Ｃ，２ユ３，６
５５（１９５５））、ベントナイトを用いる方法（Ｔ、
Ａ。
ロ酢酸、硫酸アンモン、メタノールを組合せた沈澱法（
Ｎ、Ｒ，Ｓｈｕｌｍａｎ ： Ｊ、Ｂ、Ｃ，２ユ３，６
５５（１９５５））、ベントナイトを用いる方法（Ｔ、
Ａ。
Ａｓｔｒｕｐ ： ５ｃａｎ、 Ｊ、ＣＩ ｉｎ、Ｌａ
ｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、 １１ ＋ １８１（１９５９））
、ＤＥＡＥ−セルローズを用いる方法（Ｇ、 Ｊ、Ｐｒ
ｏｋｓｃｈ ： Ｊ、Ｌａｂ ＆ ＣＩ ｉｎ、Ｍｅｄ
、：４旦・４９１（１９７２））、固定化トリプシンを
用いる方法（特開昭５ｌ−１２３８１０）などの方法が
ある。またＨＵＫＮの従来からの濃縮精製法にはシリカ
ゲルを用いる方法（特公昭４６−１９０６７）、アルギ
ニン−セファロースを用いる方法（特開昭５５−９９１
５１ ）、ＷＡ−３０などのマク四ポーラス型イオン交
換樹脂を用いる方法（特開昭５Ｏ−５５１５）などが知
られ、また本発明者らによるキトサンを吸着剤として使
用するＨＵＫＮの濃縮精製法（特開５９−６８８３）が
知られている。さらにＨＵＴＩとＨＵＫＮの両者を同時
に濃縮する方法としてはアルギニン−セファロースを用
いる須見らの方法（須見洋行ら：医学と生物学Ｖｏ１．
１００ ｆｉｌ （１９８０） ）が知られている。
ｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、 １１ ＋ １８１（１９５９））
、ＤＥＡＥ−セルローズを用いる方法（Ｇ、 Ｊ、Ｐｒ
ｏｋｓｃｈ ： Ｊ、Ｌａｂ ＆ ＣＩ ｉｎ、Ｍｅｄ
、：４旦・４９１（１９７２））、固定化トリプシンを
用いる方法（特開昭５ｌ−１２３８１０）などの方法が
ある。またＨＵＫＮの従来からの濃縮精製法にはシリカ
ゲルを用いる方法（特公昭４６−１９０６７）、アルギ
ニン−セファロースを用いる方法（特開昭５５−９９１
５１ ）、ＷＡ−３０などのマク四ポーラス型イオン交
換樹脂を用いる方法（特開昭５Ｏ−５５１５）などが知
られ、また本発明者らによるキトサンを吸着剤として使
用するＨＵＫＮの濃縮精製法（特開５９−６８８３）が
知られている。さらにＨＵＴＩとＨＵＫＮの両者を同時
に濃縮する方法としてはアルギニン−セファロースを用
いる須見らの方法（須見洋行ら：医学と生物学Ｖｏ１．
１００ ｆｉｌ （１９８０） ）が知られている。
（発明が解決しようとする問題点）
上記の方法中、単独にＨＵＴ ＩまたはＨＵＫＮを精製
するものは経費および操作上の面で必ずしも満足できる
ものではなく、両者を同時に濃縮する方法も工業的規模
で実施するには吸着剤が高価であり、操作も煩雑である
。
するものは経費および操作上の面で必ずしも満足できる
ものではなく、両者を同時に濃縮する方法も工業的規模
で実施するには吸着剤が高価であり、操作も煩雑である
。
（問題を解決するための手段）
そこで本発明者らは尿中の有効成分であるＨＵＴ Ｉ
七ＨＵＫＮを１つの吸着剤で同時にしかも工業的規模で
採取した後、両者をアフィニティクロマトグラフィーを
炭゛用して分離精製するという発想で以下の研究を行な
った。
七ＨＵＫＮを１つの吸着剤で同時にしかも工業的規模で
採取した後、両者をアフィニティクロマトグラフィーを
炭゛用して分離精製するという発想で以下の研究を行な
った。
本発明者らは各種無機吸着剤、イオン交換体、たん白凝
集剤などの材料についてＨＵＴＩおよびＨＵＫＮの吸着
率、精製度をつぎのように比較検討した。なお各材料で
尿を処理するに当り、（１）２つの有効成分を同時に吸
着させることを考慮して原尿量の２％の材料、を添加し
た、（２）尿のｐＨは４．５以下にすると尿中のウロペ
プシノーゲンが活性化され、ＨＵＴ Ｉが低分子化され
るため、ｐＨ５−０以上のＰＨで行なった。同一正常人
尿を１ｅずつに分割して試料としくアンモニアアルカリ
性の場合は中和後）、各材料２０ｇずつを用いて吸着、
ついで溶出して水で十分透析した溶出液中のＨＵＴＩＨ
ＵＫＮおよびたん白質量を測定して回収率と比活性を算
出して第１表の結果を得た。
集剤などの材料についてＨＵＴＩおよびＨＵＫＮの吸着
率、精製度をつぎのように比較検討した。なお各材料で
尿を処理するに当り、（１）２つの有効成分を同時に吸
着させることを考慮して原尿量の２％の材料、を添加し
た、（２）尿のｐＨは４．５以下にすると尿中のウロペ
プシノーゲンが活性化され、ＨＵＴ Ｉが低分子化され
るため、ｐＨ５−０以上のＰＨで行なった。同一正常人
尿を１ｅずつに分割して試料としくアンモニアアルカリ
性の場合は中和後）、各材料２０ｇずつを用いて吸着、
ついで溶出して水で十分透析した溶出液中のＨＵＴＩＨ
ＵＫＮおよびたん白質量を測定して回収率と比活性を算
出して第１表の結果を得た。
上記の結果からＨＵＴ ＩおよびＨＵＫＮを同時に５０
％以上の収率で回収する吸着剤はＮｏ、 ８のキトサン
とＮｏ、 １５のアルギニン−セファロースであること
を見出した。吸着剤キトサンについては本発明者らがＩ
（ＵＫＮについて特許出願したが（特開５９−６８８３
）、さらにこの結果により（１）尿に添加するキトサン
の量を２％以上にする。
％以上の収率で回収する吸着剤はＮｏ、 ８のキトサン
とＮｏ、 １５のアルギニン−セファロースであること
を見出した。吸着剤キトサンについては本発明者らがＩ
（ＵＫＮについて特許出願したが（特開５９−６８８３
）、さらにこの結果により（１）尿に添加するキトサン
の量を２％以上にする。
（２）溶出液のアンモニアの濃度を３％にすることによ
りＨＵＫＮ以外にＨＵＴＩをも収量よく抽出され得るこ
とを見出した。しかしその代償としてＨＵＫＮの比活性
は約１／４程度に低下する。これは逆に尿中に多量に存
在するＨＵＴ Ｉがキトサンに同時に吸着溶出されたこ
とを意味する。本発明は上記の発見にもとずくもので、
人尿にキトサンをｐＨ４，５〜６．５で接触させ、尿中
のＨＵＴ ＩおよびＨｌＪＫＮを選択的にキトサンに吸
着させついで吸着体からアルカリ性水溶液で両成分を溶
出し、所望により溶出液から両成分を分離することを特
徴とするＨＵＴＩおよびＨＵＫＮの濃縮分離方法である
。
りＨＵＫＮ以外にＨＵＴＩをも収量よく抽出され得るこ
とを見出した。しかしその代償としてＨＵＫＮの比活性
は約１／４程度に低下する。これは逆に尿中に多量に存
在するＨＵＴ Ｉがキトサンに同時に吸着溶出されたこ
とを意味する。本発明は上記の発見にもとずくもので、
人尿にキトサンをｐＨ４，５〜６．５で接触させ、尿中
のＨＵＴ ＩおよびＨｌＪＫＮを選択的にキトサンに吸
着させついで吸着体からアルカリ性水溶液で両成分を溶
出し、所望により溶出液から両成分を分離することを特
徴とするＨＵＴＩおよびＨＵＫＮの濃縮分離方法である
。
キトサンと接触させる人尿のｐＨは４．５〜６．５好ま
しくはｐＨ５，５に調整するのがよい。不法の原料とし
て使用する人尿は反圧そのままでもよいが、望ましくは
、あらかじめ水酸化ナトリウムなどのアルカリ液でｐＨ
８，５に調整し夾雑ムコ多糖類などの不純物を沈澱除去
した尿または反圧中の他の有効成分、例えばウロキナー
ゼなどを採取しｐＨに調整して尿と接触させる。
しくはｐＨ５，５に調整するのがよい。不法の原料とし
て使用する人尿は反圧そのままでもよいが、望ましくは
、あらかじめ水酸化ナトリウムなどのアルカリ液でｐＨ
８，５に調整し夾雑ムコ多糖類などの不純物を沈澱除去
した尿または反圧中の他の有効成分、例えばウロキナー
ゼなどを採取しｐＨに調整して尿と接触させる。
キトサンの使用量は尿１４当り２０〜３１’すなわち２
〜３％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは約２５９すなわち約２．
５％（Ｗ／Ｖ）程度がよい。人尿中のＨＵＴＩおよびＨ
ＵＫＮはキトサンに接触させることにより選択的にキト
サンに段着される。
〜３％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは約２５９すなわち約２．
５％（Ｗ／Ｖ）程度がよい。人尿中のＨＵＴＩおよびＨ
ＵＫＮはキトサンに接触させることにより選択的にキト
サンに段着される。
吸着体を戸数し、必要に応じて水洗後、アルカリ性水溶
液で溶出する。アルカリ性水溶液は１０．５〜１２．０
の範囲のｐＨを持つのが望ましく、例えば２〜３Ｎアン
モニア水を用いてもよい。
液で溶出する。アルカリ性水溶液は１０．５〜１２．０
の範囲のｐＨを持つのが望ましく、例えば２〜３Ｎアン
モニア水を用いてもよい。
吸着体からＨＵＴＩおよびＨＵＫＮはアルカリ性水溶液
により同時に脱着、溶出される。
により同時に脱着、溶出される。
溶出液中に移行したＨＵＴ ＩおよびＨＵＫＮは、所望
により、アブロチニンーアフイニティクロマトグラフィ
ーやトリブシンーアフイニテイクロマトグラフィーのよ
うなアフイニテイクロマトグラフィーによって互に分離
採取することができる。
により、アブロチニンーアフイニティクロマトグラフィ
ーやトリブシンーアフイニテイクロマトグラフィーのよ
うなアフイニテイクロマトグラフィーによって互に分離
採取することができる。
（作用）
本発明においてキトサンは所定のｐＨにおいて人尿中の
ＨＵＴＩおよびＨＵＫＮを同時に選択的に吸着する吸着
剤として、アルカリ性水溶液は両成分を同時に脱着する
溶出剤として作用し、これらの作用が相まって人尿中か
ら両成分を簡単に濃縮分離するこ七を可能にするもので
ある。
ＨＵＴＩおよびＨＵＫＮを同時に選択的に吸着する吸着
剤として、アルカリ性水溶液は両成分を同時に脱着する
溶出剤として作用し、これらの作用が相まって人尿中か
ら両成分を簡単に濃縮分離するこ七を可能にするもので
ある。
（発明の効果）
本発明によれば、キトサンを吸着体として用いることに
よりＨＵＴＩおよびＨＵＫＮを選択的に吸着させること
ができるばかりでなく吸着体の分離、洗浄、溶出を従来
の方法におけるよりも短時間に行うことができ大量の尿
を処理する場合に極めて有利である。
よりＨＵＴＩおよびＨＵＫＮを選択的に吸着させること
ができるばかりでなく吸着体の分離、洗浄、溶出を従来
の方法におけるよりも短時間に行うことができ大量の尿
を処理する場合に極めて有利である。
また使用したキトサンは溶出後、水洗するだけで再使用
することができる。
することができる。
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
健康な成人男子圧１０１に攪拌しながら２Ｎ−塩酸を加
えてｐＨ５，５に調整した。これにキトサン２５０９を
加え、１時間攪拌して）（ＵＴＩ及びＨＵＫＮを吸着し
たキトサンを濾過して採集し、水で洗浄した後、３Ｎ−
アンモニア水で吸着分を溶出し、溶出液４００ｒｎｌを
得た。得られたＨＵＴＩの総活性は４７２００阻害単位
（回収率６５％）純度は３１０阻害単位／ｗｒ９（たん
白質）であった。
えてｐＨ５，５に調整した。これにキトサン２５０９を
加え、１時間攪拌して）（ＵＴＩ及びＨＵＫＮを吸着し
たキトサンを濾過して採集し、水で洗浄した後、３Ｎ−
アンモニア水で吸着分を溶出し、溶出液４００ｒｎｌを
得た。得られたＨＵＴＩの総活性は４７２００阻害単位
（回収率６５％）純度は３１０阻害単位／ｗｒ９（たん
白質）であった。
実施例２
健康な成人男子圧１０／に攪拌しながら２．５Ｎ−水酸
化ナトリウム液を滴下しｐＨ８，５とし生じた沈澱を濾
過して除去した後２．５Ｎ−塩酸を攪拌しながら加え、
ｐＨ５，０に調整した。これにキトサン３００ｇを加え
１時間攪拌しＨＵＴＩ及びＨＵＫＮを吸着させた後、濾
過して吸着体を得た。
化ナトリウム液を滴下しｐＨ８，５とし生じた沈澱を濾
過して除去した後２．５Ｎ−塩酸を攪拌しながら加え、
ｐＨ５，０に調整した。これにキトサン３００ｇを加え
１時間攪拌しＨＵＴＩ及びＨＵＫＮを吸着させた後、濾
過して吸着体を得た。
２．５Ｎ−アンモニア水でＨＵＴＩ及びＨＵＫＮを溶出
して抽出液３８２Ｉｎｌを得な。得られたＨＵＴＩの総
活性は４８３００阻害単位（回収率６７％）純度は３２
２阻害単位／■（たん白質）であった。一方ＨＵＫＮの
総活性は１３４５単位（回収率７８％）純度は９０単位
／１ｎｇ（たん白質）であった。
して抽出液３８２Ｉｎｌを得な。得られたＨＵＴＩの総
活性は４８３００阻害単位（回収率６７％）純度は３２
２阻害単位／■（たん白質）であった。一方ＨＵＫＮの
総活性は１３４５単位（回収率７８％）純度は９０単位
／１ｎｇ（たん白質）であった。
実施例３
健康成人男子尿２０７に攪拌しなから２．５Ｎ−水酸化
ナトリウム液を滴下しｐＨ８，５とし生じた沈澱を濾過
して除去した後２．５Ｎ−塩酸を攪拌しながら加えＰＨ
５，５に調整し、これにキトサン５００ｇを加え１時間
攪拌してＨＵＴ ＩおよヒＨＵＫＮを吸着させた。つぎ
にその吸着体から３Ｎ−アンモニア水で溶出を行なって
抽出液７００ｍ１を得た。得られたＨＵＴＩの総活性は
９５２００阻害単位（回収率６６％）、純度は３０２阻
害単位／り（たん白質）であった。またＨＵＫＮの総活
性は２７８９単位（回収率７９％）純度は８．９単位で
あった。
ナトリウム液を滴下しｐＨ８，５とし生じた沈澱を濾過
して除去した後２．５Ｎ−塩酸を攪拌しながら加えＰＨ
５，５に調整し、これにキトサン５００ｇを加え１時間
攪拌してＨＵＴ ＩおよヒＨＵＫＮを吸着させた。つぎ
にその吸着体から３Ｎ−アンモニア水で溶出を行なって
抽出液７００ｍ１を得た。得られたＨＵＴＩの総活性は
９５２００阻害単位（回収率６６％）、純度は３０２阻
害単位／り（たん白質）であった。またＨＵＫＮの総活
性は２７８９単位（回収率７９％）純度は８．９単位で
あった。
実施例４
実施例３の抽出液を０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．１
Ｍ 炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ８，０に対して透析
し、同じ緩衝液で平衡化したアプロチニン−セファロー
ス（註）カラム（直径３．０ｃｍ、高す１５ｃｍ）にト
リプシン−セファロース（註）カラム（直径３．０Ｇ１
１％高さ１５ＣＩ１１）を連結させたカラムを通過させ
た。アプロチニン−セファロースは０．５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．１Ｍ＃酸緩衝液（ｐＨ３，５）で溶出し
、ＨＵＫＮ−溶出液４１−を得た。トリプシン−セファ
ロースカラムは０．５Ｍ 塩化ナトリウムを含むグリシ
ン塩酸緩衝液ｐＨ２，６で溶 ′出しＨＵＴＩ−溶出液
４８−を得た。得られたＨＵ Ｔ Ｉ （Ｄ ＠ｆ１５
％ＨＧよ６９９８０ｆｆｉ１１１１＊（［１４３１４９
’％）純度は１３２ｏ阻害単位／η（たん白質）であり
、）ＩＵＫＮは全く含有されていなかった。ＨＵＫＮの
総活性は２０８４単位（回収率５９％）純度は８２５単
位／η（たん白質〕であり、ＨＵＴＩは全く含有されて
いなかった。
Ｍ 炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ８，０に対して透析
し、同じ緩衝液で平衡化したアプロチニン−セファロー
ス（註）カラム（直径３．０ｃｍ、高す１５ｃｍ）にト
リプシン−セファロース（註）カラム（直径３．０Ｇ１
１％高さ１５ＣＩ１１）を連結させたカラムを通過させ
た。アプロチニン−セファロースは０．５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．１Ｍ＃酸緩衝液（ｐＨ３，５）で溶出し
、ＨＵＫＮ−溶出液４１−を得た。トリプシン−セファ
ロースカラムは０．５Ｍ 塩化ナトリウムを含むグリシ
ン塩酸緩衝液ｐＨ２，６で溶 ′出しＨＵＴＩ−溶出液
４８−を得た。得られたＨＵ Ｔ Ｉ （Ｄ ＠ｆ１５
％ＨＧよ６９９８０ｆｆｉ１１１１＊（［１４３１４９
’％）純度は１３２ｏ阻害単位／η（たん白質）であり
、）ＩＵＫＮは全く含有されていなかった。ＨＵＫＮの
総活性は２０８４単位（回収率５９％）純度は８２５単
位／η（たん白質〕であり、ＨＵＴＩは全く含有されて
いなかった。
なお実施例１〜４におけるＨＵＴＩの阻害単位は国中ら
の方法（Ｂｌｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ、 Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃａＡｃｔａ ７０５，１９２（１９８２））を用
いて測定した。たたし使用したトリプシンはシグマ社製
中トリプシン タイプ■を用いた。
の方法（Ｂｌｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ、 Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃａＡｃｔａ ７０５，１９２（１９８２））を用
いて測定した。たたし使用したトリプシンはシグマ社製
中トリプシン タイプ■を用いた。
またＨＵＫＮは本発明者らが人尿から抽出精製したＨＵ
ＫＮを血管拡張測定法（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
５８，２０１（１９６５））により単位を決定しこれ
を標準品として螢光合成基質法（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ８２，１４９５（１９７７））により測定し
た。
ＫＮを血管拡張測定法（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
５８，２０１（１９６５））により単位を決定しこれ
を標準品として螢光合成基質法（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ８２，１４９５（１９７７））により測定し
た。
半白質量はＬｏｗｒｙ−Ｆｏ Ｉ ｉｎ法を用いて牛血
清アルブミンを標準にして測定した。
清アルブミンを標準にして測定した。
（註）トリプシン−セファロースおよびアブロチンーセ
ファロースの調製 トリプシン−セファロースおよびアプロチニン−セファ
ロースはトリプシンｔｙｐｅ Ｉ （シグマ社（米））
、アプロチニン（ショーエ礼（仏））、ＣＮ５ Ｂ□ｕ
＜ｔ、−ｔ７７ ｏ−ｘ ４ Ｂ （７ア７．７．ア、
。
ファロースの調製 トリプシン−セファロースおよびアプロチニン−セファ
ロースはトリプシンｔｙｐｅ Ｉ （シグマ社（米））
、アプロチニン（ショーエ礼（仏））、ＣＮ５ Ｂ□ｕ
＜ｔ、−ｔ７７ ｏ−ｘ ４ Ｂ （７ア７．７．ア、
。
ヤパン社）を用いてＰ、Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓの方法
（Ｊ。
（Ｊ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２４５ 、３０５９ （１９７
０）’）で調製した。
０）’）で調製した。
実施例５
実施例３と同様にしてアンモニア水抽出液７２〇−を得
た。抽出液中のＨＵＴＩの総活性は９３１００阻害単位
（回収率６４％）、純度は３１１阻害単位／■（たん自
尊）であり、ＨＵＫＮの総活性は２６９８単位（回収率
７７％）、純度は９．０単位／■（ｐ：ん台゛￥４）で
あった。この抽出液を０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０
５Ｍ リン酸緩衝１ｐＨ８，５に対して透析し、実施例
４で用いたアプロチニン−セファロースカラム、および
トリプシン−セファロースカラムを十分上記緩衝液で平
衝化したものに透析内液をアブロチニンーセファロース
ツイでトリプシン−セファロースカラムの順序で通過さ
せた。アプロチニン−セファロースカラムは０，５Ｍ塩
化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３，５）
で溶出し、ＨＵＫＮ溶出液４６ｒｎｌを得た。
た。抽出液中のＨＵＴＩの総活性は９３１００阻害単位
（回収率６４％）、純度は３１１阻害単位／■（たん自
尊）であり、ＨＵＫＮの総活性は２６９８単位（回収率
７７％）、純度は９．０単位／■（ｐ：ん台゛￥４）で
あった。この抽出液を０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０
５Ｍ リン酸緩衝１ｐＨ８，５に対して透析し、実施例
４で用いたアプロチニン−セファロースカラム、および
トリプシン−セファロースカラムを十分上記緩衝液で平
衝化したものに透析内液をアブロチニンーセファロース
ツイでトリプシン−セファロースカラムの順序で通過さ
せた。アプロチニン−セファロースカラムは０，５Ｍ塩
化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３，５）
で溶出し、ＨＵＫＮ溶出液４６ｒｎｌを得た。
トリプシン−セファロースカラムはｏ、ｓＭ塩化ナトリ
ウムを含むグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２，３）で溶出し
、ＨＵＴ Ｉ溶出液５’２ｒｎｌを得た。得られたＨＵ
ＫＮ溶液の総活性は２００９単位（回収率５７％）、純
度は８３１単位／■（たん白質）であり、ＨＵＴ Ｉは
全く含有されていない。またＨＵＴＩ溶液の総括性６９
５２０阻止単位（回収率４８％）、純度は１２９０阻止
単位／ｍ９（たんばく質）で、ＨＵＫＮは全く含有され
ていない。
ウムを含むグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２，３）で溶出し
、ＨＵＴ Ｉ溶出液５’２ｒｎｌを得た。得られたＨＵ
ＫＮ溶液の総活性は２００９単位（回収率５７％）、純
度は８３１単位／■（たん白質）であり、ＨＵＴ Ｉは
全く含有されていない。またＨＵＴＩ溶液の総括性６９
５２０阻止単位（回収率４８％）、純度は１２９０阻止
単位／ｍ９（たんばく質）で、ＨＵＫＮは全く含有され
ていない。
出願人 日本ケミカルリサーチ株式会社代理人 弁理士
竹 内 卓 １
竹 内 卓 １
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、人尿にキトサンをｐＨ４，５〜６．５で接触させて
尿中のトリプシンインヒビターとカリクレインを同時に
キトサンに吸着させ、次いで吸着体からアルカリ性水溶
液でトリプシンインヒビターとカリクレインを同時に溶
出し、所望により、溶出液から上記両成分を分離するこ
とを特徴とする人尿トリプシンインヒビターおよび人尿
カリクレインの濃縮分離方法。 ２、人尿にキトサンを２％（Ｗ／Ｖ）以上接触させる特
許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、人尿にキトサンを２〜３％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは
約２．５％（ｗ／Ｖ ）接触させる特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ４、アルカリ性水溶液のｐＨが１０．５〜１２．０であ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、人尿にキトサンを２％（Ｗ／Ｖ）以北、好ましくは
２〜３％（Ｗ／Ｖ）、さらに好ましくは約２．５％（Ｗ
／Ｖ）接触させ、次いで吸着体からの溶出をｐＨ１０，
５〜１２．０のアルカリ性水溶液で行う特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ６、アルカリ性水溶液がアンモニア水である特許請求の
範囲第１項、第５項記載の方法。 ７、両成分の分離をアフイニテイクロマトグラフィーに
よって行う特許請求の範囲第１項記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59116861A JPH0723397B2 (ja) | 1984-06-06 | 1984-06-06 | 人尿トリプシンインヒビターおよび人尿カリクレインの濃縮分離方法 |
| EP86304066A EP0247258B1 (en) | 1984-06-06 | 1986-05-28 | Process for concentrating and separating trypsin inhibitor and kallidinogenase in human urine |
| US07/104,634 US4780209A (en) | 1984-06-06 | 1987-10-02 | Process for concentrating and separating trypsin inhibitor and kallidinogenase in human urine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59116861A JPH0723397B2 (ja) | 1984-06-06 | 1984-06-06 | 人尿トリプシンインヒビターおよび人尿カリクレインの濃縮分離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60260518A true JPS60260518A (ja) | 1985-12-23 |
| JPH0723397B2 JPH0723397B2 (ja) | 1995-03-15 |
Family
ID=14697441
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59116861A Expired - Fee Related JPH0723397B2 (ja) | 1984-06-06 | 1984-06-06 | 人尿トリプシンインヒビターおよび人尿カリクレインの濃縮分離方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0247258B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0723397B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4780209A (en) * | 1984-06-06 | 1988-10-25 | Japan Chemical Research Co., Ltd. | Process for concentrating and separating trypsin inhibitor and kallidinogenase in human urine |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102787111A (zh) * | 2012-07-24 | 2012-11-21 | 济南维尔康生化制药有限公司 | 一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺 |
-
1984
- 1984-06-06 JP JP59116861A patent/JPH0723397B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1986
- 1986-05-28 EP EP86304066A patent/EP0247258B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4780209A (en) * | 1984-06-06 | 1988-10-25 | Japan Chemical Research Co., Ltd. | Process for concentrating and separating trypsin inhibitor and kallidinogenase in human urine |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0723397B2 (ja) | 1995-03-15 |
| EP0247258B1 (en) | 1991-03-06 |
| EP0247258A1 (en) | 1987-12-02 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |