JPS60256391A - 光学活性カルボン酸及びその対掌体エステルの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般式 （式中Ｒ１はアルキル基、アラルキル基又はアリール基
、Ｒ２はアルキル基、ｎは１又は２を示す）で表わされ
る光学活性カルボン酸及びその対掌体エステルの製造法
に関する。

式Ｉのカルボン酸及びその対掌体エステルは光学活性を
有する種々の生理活性物質を合成するための原料として
利用されている。従来、式■の光学活性カルボン酸の製
造法としては、あらかじめ有機合成的にラセミ体のカル
ボン酸を合成したのち、光学分割剤を用いて分割する方
法、すなわち物理化学的に一方の光学活性体とその対掌
体とに分別する方法が知られている（特開昭５５−１１
８４５５号、同５６−８１５５７号、同５７−１８８５
６６号、ヨーロッパ特許公開第７９２００４７７号各明
細書参照）。

一方、光学活性カルボン酸エステルの製造法としては、
カルボン酸を分割したのちエステル化反応を行い、光学
活性エステルに導く方法が知られている。しかしこれら
の方法では高価な分割剤が多量に必要とされること、こ
の分割剤が不純物として製品中に混入しやすいこと、分
割工程が複雑であることなどの欠点があり、工業的な製
法としては必ずしも満足できるものではない。そこで、
本発明者らは、０体及び５体のカルボン酸エステルの混
合物を生物化学的に不斉分解することから成る式■の光
学活性カルボン酸及びその対掌体エステルの製造法を先
に提案しており、この中にはシュードモナス属の微生物
を用いるものもある（特願昭５８−１３９η号 ４７８△及び特願昭５８−１９９９４３号明細書参照）
。このうちシュードモナス属の微生物を用いる場合の製
造法に関しては、カルボン酸エステルの不斉加水分解能
を有効に発揮させる点では優れているものの、より生産
性を高めるためには、より長期間この能力を安定させた
状態で微生物を回収して再使用するか又は固定化して繰
り返し使用したいという要望があった。

本発明はこれらの要望にこたえて、シュードモナス属に
属する微生物を、その不斉加水分解能を長期間安定に維
持させた状態で繰り返し使用することにより、式Ｉの光
学活性カルボン酸及びその対掌体エステルを効率的に製
造することを目的とする。

本発明は、一般式　Ｒ２ Ｒ１−Ｃ０８−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ−Ｃｏｏ−Ｒ３Ｃｎ
〕（式中Ｂ３はアルキル基を示し、Ｒ１、Ｒ２及びｎは
前記の意味を有する）で表わされるエステルに、該エス
テルを不斉加水分解する能力を有するシュードモナス属
に属する微生物の培養液、菌体又は菌体処理物をｐＨ範
囲５〜８、温度範囲６５℃以下で繰り返し作用させるこ
とを特徴とする、一般式　Ｒ２ Ｒ，、−〇０８−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ−Ｃ０ＯＨＣＤ（
式中Ｒ，、’Ｒ２及びｎは前記の意味を有する）で表わ
される光学活性カルボン酸及びその対掌体エステルの製
造法でアル。

式Ｉ及び式■の化合物の置換基Ｒ１のだめのアルキル基
としては例えばメチル基、エチル基など、アラルキル基
としては例えばベンジル基、アリール基としては例えば
フェニル基が挙げられる。本発明に用いられるエステル
（Ｉｆ）としては、例工ばＳ−アセチル−β−メルカプ
トイソ酪酸メチル、Ｓ−アセチル−γ−メルカプトーα
−メチルーｎ−酪酸メチル、Ｓ−ベンゾイル−β−メル
カプトイソ酪酸メチル、Ｓ−フェニルアセチル−β−メ
ルカプトイソ酪酸メチルなどが挙げられる。本発明に用
いられるシュードモナス属の微生物は前記（Ｉｔ）の化
合物のエステル結合を不斉加水分解する能力を有する微
生物であって、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　Ｊ）、下Ｐと略す）、アレウギノザ（ａ６ｒｕｇｉ
ｎＯ８ａ　）、シュードモナス・アブテータ（Ｐ、ａｐ
ｔａｔａ　）、シュードモナス・オウレオファシエンス
（Ｐ、　ａｕｒｅｏｆａｃｌｅｎｓ　）、シュードモナ
ス・オーリクラリス（Ｐ、ａｕｒｉｃｕｌ、ａｒｉｓ　
）、シュードモナス・アゾトフオーマンス（Ｐ。

ａＺＯｔｏｆｏｒｍａｎｓ　）、シュードモナス・カラ
ギノボラ（Ｐ、　ｃａｒｒａｇｅｅｎｏｖｏｒａ　）、
シュードモナスｅカリオフイリイ（Ｐ、ｃａｒｙｏｐｈ
ｙｌｌ、ｉ　）、シュードモナス・セパシア（Ｐ、　ｃ
ｅｐａｃｉａ　）　、シュードモナス骨クロロラフイス
（Ｐ、　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｌ〕ｉｓ　）、シュードモ
ナス・コンベクサ（Ｐ、　ｃｏｎｖｅｘａ　）、シュー
ドモナス舎コロナファシェンス（Ｐ、　ｃｏｒｏｎａｆ
ａｃｊｅｎｓ）、′シュードモナス・クルジビニ（Ｐ、
　ｃｒｕｃｉｖｉａ、ｅ　）、シュードモナス・ダカン
フエ（Ｐ、ｄ、ａｃｕ、ｎｈａｅ　）、イ シュードモナス・プントリフへカンヌ（Ｐ。

ｄｅｎｉｔｒｊ、ｆｉｃａｎｓ　）、シュードモナスΦ
デイミヌータ（Ｐ、　ｄｉｍｉｎｕｔａ　）、シュード
モナス曽フルオレセンス（Ｐ、　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｓ　）、シュードモナス・フラッジ（Ｐ、ｆｒａｇｉ　
）　、シュードモナス拳インドロキダンス（Ｐ、１ｎｄ
ｏｌｏｘｉｄａｎｓ　）、シュードモナス１１？ルトフ
イリア（Ｐ、　ｍａｌｔｏｐｈｉｌ、ｉａ　）、シュー
ドモナス・マルギナリス（Ｐ３ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ　
）、シュードモナス・マルギネー）　（Ｐ、　ｍａｒに
１ｎａ１．ｅ　）、シュードモナスΦメラノゲナ（Ｐ、
　ｍｅｌａｎｏｇｅｎａ　）、シュードモナス台二トロ
レゾ−センス（Ｐ。

ｎ１ｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ　）、シュードモナス・オ
レオボランス（Ｐ、ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ　）　、シュ
ードモナス・オバリス（Ｐ、　ｏｖａｌｉｓ　）、シュ
ードモナス・オキザラリカス（Ｐ、ｏｘａｌａｌｉｃｕ
ｓ　）、シュードモナス・パボナセア（ｐ、　ｐａｖｏ
ｎａｃｅａｅ　）、シュードモナス・ファセオリコラ（
Ｐ、ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ　）、シュードモナス・
ポリカラー（Ｐ、ｐｏｌｙｃｏｌｏｒ　）、シュードモ
ナス・プチダ（Ｐ、ｐｕｔｉｄａ　）、シュードモナス
０プトレフアシエンス（Ｐ、ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ
）、シュードモナス・レプチリボラ（Ｐ、　ｒｅｐｔｉ
ｌｉｖｏｒａ　）、シュードモナスーリボフラビナ（Ｐ
、　ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ　）、’／　ニー　）’モ
ナス・ストリアファシェンス（Ｐ。

５ｔｒｉａｆａｃｉｅｎｓ　）、シュードモナス管スト
リアタ（Ｐ、　５ｔｒｉａｔａ　）、シュードモナス・
スタッセイ（Ｐ、５ｔｕｔｚｅｉ　）、シュードモナス
・シュリンガ−（Ｐ、ｓｙｒｉｎｇａｅ　）、シュード
モナス・トリζ）　フォーラ（Ｐ、　ｔｒｉｆｏｌｕ　
）、シュードモナス・シンキサンタ（Ｐ、　５ｙｎｘａ
ｎｔｈａ　）などが挙げられる。

％にシュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス
・プチダ及びシュードモナス・オバリスが好ましい。

これらの微生物の培養は、通常は液体培養で行われるが
、固体培養によっても行うことができる。培地としては
、微生物が通常資化し５る炭素源、窒素源、ビタミン、
ミネラルなどの成分を適宜配合したものが用いられる。

微生物の加水分解能を向」ニさせるため、培地にエステ
ルを少量添加することが好ましい。培養は微生物が生育
可能である温度及びｐＨで行われる、微生物の生育を促
進させるために通気攪拌を行ってもよい。

加水分解反応を行うに際しては、培養時又は途中で培地
にエステル（Ｉｌｌを添加してもよく、あらかじめ微生
物を培養したのち培養液にエステル（Ｉｌ）を添加して
もよい。また増殖した微生物の菌体な遠心分離等により
採取し、これをエステルを含む反応媒体に加えてもよい
。この菌体は反応後に反応媒体から分離され、再び新た
な反応媒体に加えて反応させる。この場合菌体は取り扱
い上の便宜から、乾燥菌体例えば凍結乾燥菌体、噴霧乾
燥菌体又は有機溶媒例えばアセトン、トルエン等で処理
した菌体、あるいは菌体破壊物、菌体抽出物等の菌体処
理物を用いることもできる。またこれらの菌体等を固定
化して用いてもよい。固定化する方法とし７ては、例え
ば水不溶性の担体例えばセルロース、アガロース等の多
糖類の誘導体、多孔性ガラス等への担持、架橋剤例えば
グルタルアルデヒドによる架橋、合成高分子例えばポリ
アクリルアミドゲル、光硬化性樹脂又は天然高分子例え
ば殿粉、カラギーナン等による包括等があげられる。（
反応媒体としては、例えばイオン交換水又は緩衝液が用
いられる。反応媒体又は培養液中のエステＡ・の濃度は
０．０１〜５０重量％が好ましい。エステルは水に懸濁
した状態で加えることもできる。

メタノール、アセトンなどの有機溶媒を反応液に加えて
エステルの溶解性を向上させることもできる。本発明の
シュードモナス属に属する微生物を用いて式Ｈの化合物
の不斉加水分解奄４解を行う際には、反応時のｐＨ及び
温度を調整することが好ましい。この微生物の不斉加水
分解能を長期間にわたって有効に発揮させて繰り返し使
用を可能にするには、反応時のｐＨを５〜８に調整し、
かつ反応温度を６５°Ｃ以下に維持する必要がある。ｐ
Ｈに関しては、反応が進行するに併い生成したカルボン
酸により、ｐＨが低下してくるので、この場合は中和剤
例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリ
ウムなどを添加することが好ましい。本発明の微生物が
示す不斉加水分解の能力は強酸性、強アルカリ性のｐＨ
及び比較的高温側で急速に失われる。また、反応を６５
℃をこえる温度で行うと不斉加水分解能を長期間維持す
るのが難しくなる。反応速度は低温域では低下するので
、反応温度は５°Ｃ以上が好ましい。反応液又は培養液
からの生成物の分離精製は通常の方法、例えば抽出、再
結晶、カラムクロマトグラフィ等により行うことができ
る。また菌体は例えば遠心分離により反応媒体から分離
できる。

本発明方法によれば、シュードモナス属の微生物が示す
不斉加水分解能を長期間安定に持続することができる。

また微生物のこの能力は反応時はもとより反応終了後も
維持され、反応液から回収された菌体を再度反応に用い
るので、菌体の有効利用という観点からも優れている。

下記実施例中の％は重量％を意味する。

実施例１ ’／　、：Ｌ−）”モナス・フルオレセンスＩＦＯ１２
０５５を肉エキス１．０％、食塩０，５％及びペプトン
養終了後、培養液を遠心分離し、得られた菌体の全量を
イオン交換水で洗浄したのちｐＨ３〜８の　／２　Ｍｃ
　１１　Ｖａ　ｉ　ｎ　ｅ緩衝液５０ｍ１に懸濁した。

この菌体懸濁液に（ト）−８−アセチル−β−メルカプ
トイソ酪酸メチル１　ｍｌを加え、６０℃で６時間反応
させた。この時製造されたＳ−アセチル−β−メルカプ
トイソ酪酸の生成量を液体クロマトグラフィな用いて測
定した。この時の生成９　量を活性発現率として第１表
に示す。なお、活性発現率とは、ｐＨ７での活性を１０
０とした時の活性の比率である。

第１表 なお反応終了後、菌体を遠心分離により回収し同様の反
応を５度繰り返して行ったところ、ｐＨ５〜８の範囲に
おいては再現性よく活性が発現されるが、ｐＨ５及びｐ
Ｈ９ではほとんど失活した。

実施例２ 一／　５．−　）”モナス・フルオレセンスＩＦＯ１２
０５５を肉エキス１．０％、食塩０．５％及びペプト：
／　１．０　％から成る液体培地（ｐＨ７，２）　１０
０ｍｌで に植菌し、２５℃１日間振と５培養を行った。

＾ 培養終了後、培養液を遠心分離し、得られた菌体の全量
をイオン交換水で洗浄したのち、ｐ）（Ｚｏ・　／２燐
酸緩衝液５０ｍ１に懸濁し、この菌体懸濁液に（ト）−
８−アセチル−β−メルカグトイソ酪酸１ｍｌを加え、
２０℃から４５℃の温度範囲で１７時間振とうして反応
させた。この時製造されたＳ−アセチル−β−メルカプ
トイソ酪酸の生成量を液体クロマトグラフィを用いて測
定した。この時の生成量を活性発現率として第２表に示
す。なお、活性発現率とは、６０℃で反応させた時の活
性を１００とした時の活性の比率である。

第２表 なお、反応終了後、菌体を遠心分離により回収し同様の
反応を５度繰り返して行ったところ、６５℃以下におい
ては再現性よく活性が発現されるが、５０℃ではほとん
ど失活した。

実施例６及び４ シュードモナス拳フルオレセンスＩＦＯ１２０５５の代
わりにシュードモナス・プチダＩＦＯ３７３ａ　（実ｍ
例３　）及びシュードモナス・オバリスＩＡＭ　１１５
３　（実施例４）を用いた他は、実施例１と同条件で実
験を行ったところ、実施例１とほぼ同様の結果が得られ
た。

実施例５及び６ シユードモナス争フルオレセンスＩＦＯ１２０５５０代
わりにシュードモナス壷グチダＩＦＯ６７３８（実施例
５）及びシュードモナスｅオバリスエＡＭ　１１５３　
（実施例６）を用いた他は、実施例２と同条件で実験を
行ったところ、実施例２とほぼ同様の結果が得られた。

出願人　三菱レイヨン株式会社 代理人　弁理士小　林　正　雄

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 一般式 ％式％ （式中Ｒ１はアルキル基、アラルキル基又はアリール基
   、Ｒ２及びＲ３はアルキル基、ｎは１又は２を示す）で
   表わされるエステルに、該エステルを不斉加水分解する
   能力を有するシュードモナス属に属する微生物の培養液
   、菌体又は菌体処理物をｐＨ範囲５〜８、温度範囲３５
   ℃以下で繰り返し作用させることを特徴とする、一般式
   ％式％ （式中Ｒ，、Ｒ２及びｎは前記の意味を有する）で表わ
   される光学活性カルボン酸及びその対掌付エステルの製
   造法。