JPS60241888A - 新規ヒダントイナ−ゼ - Google Patents
新規ヒダントイナ−ゼInfo
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- JPS60241888A JPS60241888A JP9957884A JP9957884A JPS60241888A JP S60241888 A JPS60241888 A JP S60241888A JP 9957884 A JP9957884 A JP 9957884A JP 9957884 A JP9957884 A JP 9957884A JP S60241888 A JPS60241888 A JP S60241888A
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- carbamoyl
- acid
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、新規なヒダントイナーゼに関する。
更に詳しくは、5−置換ヒダントインを開裂加水分解し
てN−カルバモイル−し−アミノ酸を生成する活性をW
jる新規ヒダントイナーゼに関する。
てN−カルバモイル−し−アミノ酸を生成する活性をW
jる新規ヒダントイナーゼに関する。
従来、5−置換ヒダントインに作用するヒダントイナー
ゼとしては、各種動物の肝臓や腎臓、ヴ科植物や微生物
罠存在し、ジヒドロウラシルまたはジヒドロチミンを開
裂加水分解して、それぞれN−カーシバモイル−β−ア
ラニンまたはN−カルバモイル−β−アミノ−イソ酪酸
に変換するとともに、5−置換ヒダントイン類にも作用
し、立体特異的に開裂加水分解して、光学活性N−カル
バモイル−D−アミノ酸類に′&挾する作用をも有する
ジヒドロビリミジナーゼ(EC3,5,2,2)が知ら
れている(%開昭53−136583 )。
ゼとしては、各種動物の肝臓や腎臓、ヴ科植物や微生物
罠存在し、ジヒドロウラシルまたはジヒドロチミンを開
裂加水分解して、それぞれN−カーシバモイル−β−ア
ラニンまたはN−カルバモイル−β−アミノ−イソ酪酸
に変換するとともに、5−置換ヒダントイン類にも作用
し、立体特異的に開裂加水分解して、光学活性N−カル
バモイル−D−アミノ酸類に′&挾する作用をも有する
ジヒドロビリミジナーゼ(EC3,5,2,2)が知ら
れている(%開昭53−136583 )。
一方、5−置換ヒダントインからN−カルバモイル−L
−アミノ酸を生成する酵素としてはL−5−カルぜキシ
メチルヒタゝントインからN−カルバモイル−L−アス
パラギン酸を生成するカルボキシメチルヒダントイナー
ゼ(EC3,5,2゜4)が知られている(酵素ハンド
ブック朝倉書店1982年発行、p597)。
−アミノ酸を生成する酵素としてはL−5−カルぜキシ
メチルヒタゝントインからN−カルバモイル−L−アス
パラギン酸を生成するカルボキシメチルヒダントイナー
ゼ(EC3,5,2゜4)が知られている(酵素ハンド
ブック朝倉書店1982年発行、p597)。
5−1f洟ヒダントインからL−アミノ酸を生成させる
方法としては、特公昭42−16850号公報には谷種
微生物の陶体又は培養液、破砕液を用いて、L−アミノ
酸を生成させる方法、特公昭45−8633号公報には
L −Qジンを製造する方法、さらに特公昭54−22
74号公報峻び特公昭54−8749号公報にはフラポ
バクテリムアミノrネスを作用させて、5−置換ヒダン
トインからL−フェニルアラニン及びL−トリシトファ
ンを製造する方法が開示されている。本発明者らも、5
置侯ヒダントインに、アリスロバクターM DI −2
00菌株を作用させて、L−アミ7′酸を製造する方法
なすでに提案した< tVf顧昭59−70906号明
細−磐)。これらの方法は医薬、化学工業用原料、食品
添加物として有用な1.−アミノ酸の製造に極めて有効
であり、実用効果が期待される。
方法としては、特公昭42−16850号公報には谷種
微生物の陶体又は培養液、破砕液を用いて、L−アミノ
酸を生成させる方法、特公昭45−8633号公報には
L −Qジンを製造する方法、さらに特公昭54−22
74号公報峻び特公昭54−8749号公報にはフラポ
バクテリムアミノrネスを作用させて、5−置換ヒダン
トインからL−フェニルアラニン及びL−トリシトファ
ンを製造する方法が開示されている。本発明者らも、5
置侯ヒダントインに、アリスロバクターM DI −2
00菌株を作用させて、L−アミ7′酸を製造する方法
なすでに提案した< tVf顧昭59−70906号明
細−磐)。これらの方法は医薬、化学工業用原料、食品
添加物として有用な1.−アミノ酸の製造に極めて有効
であり、実用効果が期待される。
しかしながら、これらの1.−アミノ酸の製造法におい
て、5−置換ヒダントインを開裂加水分解する酵素につ
いては、明らかにされていない。このような酵素が人手
できれば有用なL−アミノ酸の製造が経済的に行なえ、
工業的利用価116は大きい、そこで、本発明者らは、
5−1ift換ヒダントインから、相当するL−アミノ
酸を生成する反応に関与する微生物酵素について研究を
行なった結宋、アリスロバクター属の菌株が、5−+i
imヒダントインを開裂加水分解して、N−カルバモイ
ル−■。
て、5−置換ヒダントインを開裂加水分解する酵素につ
いては、明らかにされていない。このような酵素が人手
できれば有用なL−アミノ酸の製造が経済的に行なえ、
工業的利用価116は大きい、そこで、本発明者らは、
5−1ift換ヒダントインから、相当するL−アミノ
酸を生成する反応に関与する微生物酵素について研究を
行なった結宋、アリスロバクター属の菌株が、5−+i
imヒダントインを開裂加水分解して、N−カルバモイ
ル−■。
−アミノ酸に変換する酵素を効率良(多普に生戸pする
ことを見い出し、本発明を完成するに到った。
ことを見い出し、本発明を完成するに到った。
(−IJち本発明は、下記の理化学的性質を有し、且つ
5−1f換ヒダントインを開裂加水分解してN−カルバ
モイルーL−アミノ酸を生byする活性を有する#r規
ヒダントイナーゼである。
5−1f換ヒダントインを開裂加水分解してN−カルバ
モイルーL−アミノ酸を生byする活性を有する#r規
ヒダントイナーゼである。
以下本発明をさらに詳細に説明する。
先ず、本酵素の理化学的性質を以下に記載する。
il1作用及び基質特異性
本酵素は、5−1を換ヒダントインのL休校び0体の開
裂加水分解をし、それぞれ相当するN−カルバモイル−
L−アミノ酸及びN−カルバモイル−D−アミノ酸に変
換する。5−114ヒダントインのうち、1蓋換基に芳
香環を!する5−ベンジルヒダントインや5−インrリ
ルメチルヒダントイン等にと(Kよく作用する。
裂加水分解をし、それぞれ相当するN−カルバモイル−
L−アミノ酸及びN−カルバモイル−D−アミノ酸に変
換する。5−114ヒダントインのうち、1蓋換基に芳
香環を!する5−ベンジルヒダントインや5−インrリ
ルメチルヒダントイン等にと(Kよく作用する。
しかしながら、5−カルfキシメチルヒダントイン(D
L−アスパラヤン酸ヒダントイン)やDL−グルタミン
酸ヒダントイン及びヒダントインには作用しない。従っ
て、公知のカルボキシメチルヒダントイナーゼとは異な
る新規のヒダントイナーゼである。
L−アスパラヤン酸ヒダントイン)やDL−グルタミン
酸ヒダントイン及びヒダントインには作用しない。従っ
て、公知のカルボキシメチルヒダントイナーゼとは異な
る新規のヒダントイナーゼである。
またジヒドロウラシルやジヒドロチミンには、はとんど
作用せず、ジヒドロピリミジナーゼとは異なる。
作用せず、ジヒドロピリミジナーゼとは異なる。
(2)至適−至適−は緩衝液としてアンモニア緩衝i(
0,05Mアンモニア水−塩化アンモニウム緩衝液、p
i−(8,0〜10.0 )を用い、5−ベンジルヒダ
ントインを基質とし、温度65℃で30分間反応させ、
生成したN−カルバモイル−DL−フェニルアラニンを
測定した場合、PI(8,0−9,0である。また緩衝
液として、酢酸緩衝液(0,05M酢酸−酢酸ナトリウ
ム緩衝液、pH4,0−5,5)とリン酸緩衝液(0,
05Mリン酸−カリウム−リン酸二ナトリウム緩衝液p
i(5,5〜8.0)を用い、N−カルバモイル−L−
フェニルアラニン又はN−カルバモイル−D−フェニル
アラニンヲ基質として、5−ベンジルヒダントイン生成
を測定した場合の至適PI(5,0〜7.0である。本
酵素は、N−カルバモイル−L−アミノ酸及びN−カル
バモイル−D−アミノ酸から5−置換ヒダントインな生
成する反応即ち逆反応作用を有する。
0,05Mアンモニア水−塩化アンモニウム緩衝液、p
i−(8,0〜10.0 )を用い、5−ベンジルヒダ
ントインを基質とし、温度65℃で30分間反応させ、
生成したN−カルバモイル−DL−フェニルアラニンを
測定した場合、PI(8,0−9,0である。また緩衝
液として、酢酸緩衝液(0,05M酢酸−酢酸ナトリウ
ム緩衝液、pH4,0−5,5)とリン酸緩衝液(0,
05Mリン酸−カリウム−リン酸二ナトリウム緩衝液p
i(5,5〜8.0)を用い、N−カルバモイル−L−
フェニルアラニン又はN−カルバモイル−D−フェニル
アラニンヲ基質として、5−ベンジルヒダントイン生成
を測定した場合の至適PI(5,0〜7.0である。本
酵素は、N−カルバモイル−L−アミノ酸及びN−カル
バモイル−D−アミノ酸から5−置換ヒダントインな生
成する反応即ち逆反応作用を有する。
(3)力価の測定法 5−ベンジルヒダントイン2.5
myを含有し、pH8,0に11M1整した0、02
M )リスー塩酸バッファー帆8mlに、10 mM塩
化コバルトQ、lIR/、酵素液0.1mlを加え、3
5−0で30分反応を行わせる。30分後に0.I N
の塩酸1ゴを加えて反応を停止する。本反応を薄1−プ
レートにスポットし、n−ブタノール:酢酸:水−4:
に1の展開溶媒で展開する。乾燥後、10 ’1 p−
ジメチルアミノベンズアルデヒドのアセトン溶液(1,
5N塩酸含有)で発色させ、デンジトメ]・リーにより
、N−カルバモイルフェニルアラニンの生成量を定1す
る。毎分1.0μモルのN−カルバモイルフェニルアラ
ニンを生成させるヒダントイナーゼの量を1単位とし、
試料のヒダントイナーゼ力価を算出する。
myを含有し、pH8,0に11M1整した0、02
M )リスー塩酸バッファー帆8mlに、10 mM塩
化コバルトQ、lIR/、酵素液0.1mlを加え、3
5−0で30分反応を行わせる。30分後に0.I N
の塩酸1ゴを加えて反応を停止する。本反応を薄1−プ
レートにスポットし、n−ブタノール:酢酸:水−4:
に1の展開溶媒で展開する。乾燥後、10 ’1 p−
ジメチルアミノベンズアルデヒドのアセトン溶液(1,
5N塩酸含有)で発色させ、デンジトメ]・リーにより
、N−カルバモイルフェニルアラニンの生成量を定1す
る。毎分1.0μモルのN−カルバモイルフェニルアラ
ニンを生成させるヒダントイナーゼの量を1単位とし、
試料のヒダントイナーゼ力価を算出する。
(4)安定−の範囲 緩衝液として、酢酸緩衝液(0,
05M酢酸−酢酸ナトリウム…4.0〜5.5)、リン
酸緩衝液(0,05Mリン酸−カリウムーリン酸=ナト
リウム緩衝液pH5,5〜8.0)、アンモニア緩衝液
(0,05Mアンモニア水−塩化アンモニウム緩衝液p
H8,0〜10.0)、ホウ酸緩衝液(0,05Mホウ
酸−ホウ酸ナトリウムPH9,5〜11.5 )を用い
て、酵素液を各−で、35−C。
05M酢酸−酢酸ナトリウム…4.0〜5.5)、リン
酸緩衝液(0,05Mリン酸−カリウムーリン酸=ナト
リウム緩衝液pH5,5〜8.0)、アンモニア緩衝液
(0,05Mアンモニア水−塩化アンモニウム緩衝液p
H8,0〜10.0)、ホウ酸緩衝液(0,05Mホウ
酸−ホウ酸ナトリウムPH9,5〜11.5 )を用い
て、酵素液を各−で、35−C。
60分インキュベート後、残存力画を測定することによ
ってめた安定PH範囲は、5.0〜10.0である。
ってめた安定PH範囲は、5.0〜10.0である。
(5)作用適温の範囲 pH8,0で10〜60分間作
用させた場合、60〜40′Cの範囲が最適である。
用させた場合、60〜40′Cの範囲が最適である。
i6) p14 、温度等による失活の条件 l)H4
,0以下及び−411以上で35℃、60分インキュベ
ートすると、完全に失活する。pH3,0において60
゛Cで20分間熱処理することにより完全に失活する。
,0以下及び−411以上で35℃、60分インキュベ
ートすると、完全に失活する。pH3,0において60
゛Cで20分間熱処理することにより完全に失活する。
(力阻害、活性化及び安定化
■阻害
阻害剤無添加時の酵素活性値を100とし、それぞれ、
塩化ニッケル、塩化鋼、ヨーr酢酸、PCMB、エチレ
ンジアミンテトラ酢酸、窒化ナトリウム、ヒPロキシル
アミン塩酸を添加し、pH8,0、温度60°0 30
分間反応した場合の残存活性を表に示す。なお、本活性
測定においてコバルトイオンは添加していない。
塩化ニッケル、塩化鋼、ヨーr酢酸、PCMB、エチレ
ンジアミンテトラ酢酸、窒化ナトリウム、ヒPロキシル
アミン塩酸を添加し、pH8,0、温度60°0 30
分間反応した場合の残存活性を表に示す。なお、本活性
測定においてコバルトイオンは添加していない。
表より、明らかな如(、’ PCMBの他に、エチレン
ジアミンテトラ酢酸により、本酵素は顕著に阻害され、
金属酵素と考えられる。
ジアミンテトラ酢酸により、本酵素は顕著に阻害され、
金属酵素と考えられる。
■活性化
本酵素は、0.1〜10mMのコバルトイオン、マンガ
ンイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン
のような金属イオンの存在下で反応させると、無添加の
場合に比べ、活性が促進される。
ンイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン
のような金属イオンの存在下で反応させると、無添加の
場合に比べ、活性が促進される。
O安定化
本酵素は、0.1〜l Q mMのコバルトイオンが共
存すると熱安定性が向ヒし、40℃で1時間、PH8で
インキュベートすると、無添加の酵素の残存活性は30
〜40チとなるが、i mMコバルトイオン共存ドでは
活性低下は見られない。
存すると熱安定性が向ヒし、40℃で1時間、PH8で
インキュベートすると、無添加の酵素の残存活性は30
〜40チとなるが、i mMコバルトイオン共存ドでは
活性低下は見られない。
(8)n製方法
培養物を遠心分離して湿潤菌体を集菌シフ、この菌体を
0.02 M )リス−塩酸緩衝液(−8,01塩化マ
ンガン1mM含有)に懸濁し、超音波処理により、函体
ケ破砕し、遠心分離にて同形分を除き、粗酵素液を得る
。
0.02 M )リス−塩酸緩衝液(−8,01塩化マ
ンガン1mM含有)に懸濁し、超音波処理により、函体
ケ破砕し、遠心分離にて同形分を除き、粗酵素液を得る
。
次いで、その粗酵素液に、3%ゾロタミン硫酸水浴液(
、H7,0)を加え、生じた沈殿を遠心分離で除き、次
いでこの上清液に硫酸アンモニウムを0.30飽和にな
るまで加え、生じた沈殿を遠心分離で除(。得られた上
清液に史に硫酸アンモニウムを0.60飽和になるまで
加え、生じた沈殿を分離して、0.02Mトリス−塩酸
緩衝液(pi(8,0、塩化マンガン1mM含有)に俗
解し、この浴液を同緩衝液で24時間透析する。
、H7,0)を加え、生じた沈殿を遠心分離で除き、次
いでこの上清液に硫酸アンモニウムを0.30飽和にな
るまで加え、生じた沈殿を遠心分離で除(。得られた上
清液に史に硫酸アンモニウムを0.60飽和になるまで
加え、生じた沈殿を分離して、0.02Mトリス−塩酸
緩衝液(pi(8,0、塩化マンガン1mM含有)に俗
解し、この浴液を同緩衝液で24時間透析する。
以ヒのようにして得た硫安分画を、上記緩衝液で平衡化
した蛋白精製用陰イオン交換樹脂カラム(MONOQフ
ァマシア製)による液体クロマトグラフィーKかけ、酵
素をカラムに吸着させる。次いで、塩化ナトリウム濃度
を0〜1Mに直線的に増加させた上記緩衝液を流して、
流出液をフラクションコレクターで分画し、活性区分を
集める。
した蛋白精製用陰イオン交換樹脂カラム(MONOQフ
ァマシア製)による液体クロマトグラフィーKかけ、酵
素をカラムに吸着させる。次いで、塩化ナトリウム濃度
を0〜1Mに直線的に増加させた上記緩衝液を流して、
流出液をフラクションコレクターで分画し、活性区分を
集める。
次いでその活性区分を、0.05M ) +)ス塩酸緩
衝液(0,2M塩化ナトリウム、imM塩化マンガン含
有)で平衡化したデルろ適用カラム(G3000sw
x 2東洋ゴ達工業社表)にかけ、同組成の緩衝液で苗
出し、活性区分を集める。この活性区分を再度、デルろ
適用カラムにかけて、クロマトグラフィーを行い、活性
区分を精製標品とする。
衝液(0,2M塩化ナトリウム、imM塩化マンガン含
有)で平衡化したデルろ適用カラム(G3000sw
x 2東洋ゴ達工業社表)にかけ、同組成の緩衝液で苗
出し、活性区分を集める。この活性区分を再度、デルろ
適用カラムにかけて、クロマトグラフィーを行い、活性
区分を精製標品とする。
(9)分子量
本酵素の分子量は高速液体クロマトグラフィー(G 5
000 sW x 2東洋督達工業製)によるデルろ過
失で測定した結果、約20万であり、エチレンジアミン
テトラ酢酸処理して後測定すると、約10万である。こ
れら分子−の異なる酵素は、分子材の異なること以外は
、その理化学的性質において同様である。
000 sW x 2東洋督達工業製)によるデルろ過
失で測定した結果、約20万であり、エチレンジアミン
テトラ酢酸処理して後測定すると、約10万である。こ
れら分子−の異なる酵素は、分子材の異なること以外は
、その理化学的性質において同様である。
(10等゛畦点 MONOP (ファマシア製)を用い
た、クロマトフオーカシング法により測定し た結果4〜4.5であった。
た、クロマトフオーカシング法により測定し た結果4〜4.5であった。
本酵素は、壊トの性質から新規ヒダントイナーゼと認め
られ、本酵素の性質を活用すれば、極めテ自用なN−カ
ルバモイル−L−アミノ酸製造が可能となる。
られ、本酵素の性質を活用すれば、極めテ自用なN−カ
ルバモイル−L−アミノ酸製造が可能となる。
灰に本酵素を製造するための具体的手段を以下に述べる
。本酵素を製造する方法としては如何なる方法でも良く
、例えば以下の方法が挙げられる。
。本酵素を製造する方法としては如何なる方法でも良く
、例えば以下の方法が挙げられる。
先ず、本酵素を製造するにあたり使用される菌としては
、アリスロバクター属に属し、上目己ヒダントイナーゼ
生産能を■する繭であれば如何なる菌でもよく、またこ
れらの面の変信もしくは変異株でも良い。そして、アリ
マロバクター蛎に鴫し、新規ヒダントイナーゼ生産症を
44−する菌の具体例として、例えばアリスロバクター
属(Arthro−bacterSP ) DK −2
00が挙げられる。
、アリスロバクター属に属し、上目己ヒダントイナーゼ
生産能を■する繭であれば如何なる菌でもよく、またこ
れらの面の変信もしくは変異株でも良い。そして、アリ
マロバクター蛎に鴫し、新規ヒダントイナーゼ生産症を
44−する菌の具体例として、例えばアリスロバクター
属(Arthro−bacterSP ) DK −2
00が挙げられる。
上記アリスロバクターDK −200は本発明者らが、
土壌中より新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質
は、以下に示す通りである。
土壌中より新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質
は、以下に示す通りである。
アリスロバクターDK −200の菌学的性質fal形
態的顕微鏡的観察 (1)細胞の形及び大きさ二〇、3〜0.5μ×0.8
〜5.0μmの桿菌である。
態的顕微鏡的観察 (1)細胞の形及び大きさ二〇、3〜0.5μ×0.8
〜5.0μmの桿菌である。
(2)細胞の多形性の有無:多形性が認められる(3)
運動性の有無 :運動性なしく轍毛は認められない。) (4)胞子の有無 :なし く5)ダラム染色 :陰性〜弱陽性だがグラム陽性粒子
を有する (6)抗酸性 :陰性 fbl各培地での生育状態 (1)肉汁摩大平板培賽 :コロニーの形状は円形で、
***は凸状であり、周辺は全縁状 であり、コロニーの色は淡白色である。
運動性の有無 :運動性なしく轍毛は認められない。) (4)胞子の有無 :なし く5)ダラム染色 :陰性〜弱陽性だがグラム陽性粒子
を有する (6)抗酸性 :陰性 fbl各培地での生育状態 (1)肉汁摩大平板培賽 :コロニーの形状は円形で、
***は凸状であり、周辺は全縁状 であり、コロニーの色は淡白色である。
(2)肉汁寒天斜面培養:適度の生育状態で糸状の生育
を示す。光沢がある (3)肉汁液体培養 :混濁の程度は均一で、液面での
生育は時になし。沈殿がある (4)肉汁ゼラチン穿刺培養:ti化する。
を示す。光沢がある (3)肉汁液体培養 :混濁の程度は均一で、液面での
生育は時になし。沈殿がある (4)肉汁ゼラチン穿刺培養:ti化する。
(5)リドマスミルク培養:中性で液体しない。
let生理的性質
(1)硝酸塩の還元 :4元しない。
(2)脱窒反応 :陽性
(31M Rテスト ニ陰性
+41 V Pテスト :陰性
(5)インドールの生成:生成しない。
(6)硫化水素の生成 :生成しない。
(カデンプン加水分解:加水分解しない。
(8)クエン酸の利用 二両方とも利用しない。
(KosθVの培地及びChristensenの培地
使用 (9)無機窒素源の利用:利用する。(硝酸塩及びアン
モニウム塩) (11色素の生成 :生成しない (1υウレアーゼ :陰性 03オキシダーゼ :陰性 (131カタラーゼ :陽性 0→酸素に対する態度:好気性 (19生胃の範囲 :温度: 17.8〜36.2”C
… :5〜10 f161o−Fテスト 二酸化 0n糖類からの酸及びガスの生成の有無:糖類 酸 が
ス ト−アラビノース − − D−キシロース + − D−グルコース 士 − D−マンノース 士 − D−フラクトース 士 − D−がラクトース 十 − 麦芽糖 士 − ショ糖 士 − 乳 糖 士 − トレハロース 士 − D−ソルビット ± − D−マンニット 十 − インジット ± − グリセリン 十 − (1&細胞壁中の二塩基性アミノ酸:リジン(メンジア
ミノピメリン酸及びア ラビノースは含まない) 119 DNAのGC含量 +21 DNA分解性 二階性 (2υ力ゼイン分解性 :陽性 123耐塩性 : NaCl2 % 生育NaCl3チ
生育弱い (7!漕炭化水素の資化性 p−オキシ安息香酸 − グルコン酸 − 乳 酸 − グルコース + ショ閘 十 キシロース + ラクトース − マンニット + なお、上記、アリスロバクターDK −200は工業技
術院微生物工業技術研究所に倣工研菌寄第7472号(
F’gRM P −7472)として寄託されている。
使用 (9)無機窒素源の利用:利用する。(硝酸塩及びアン
モニウム塩) (11色素の生成 :生成しない (1υウレアーゼ :陰性 03オキシダーゼ :陰性 (131カタラーゼ :陽性 0→酸素に対する態度:好気性 (19生胃の範囲 :温度: 17.8〜36.2”C
… :5〜10 f161o−Fテスト 二酸化 0n糖類からの酸及びガスの生成の有無:糖類 酸 が
ス ト−アラビノース − − D−キシロース + − D−グルコース 士 − D−マンノース 士 − D−フラクトース 士 − D−がラクトース 十 − 麦芽糖 士 − ショ糖 士 − 乳 糖 士 − トレハロース 士 − D−ソルビット ± − D−マンニット 十 − インジット ± − グリセリン 十 − (1&細胞壁中の二塩基性アミノ酸:リジン(メンジア
ミノピメリン酸及びア ラビノースは含まない) 119 DNAのGC含量 +21 DNA分解性 二階性 (2υ力ゼイン分解性 :陽性 123耐塩性 : NaCl2 % 生育NaCl3チ
生育弱い (7!漕炭化水素の資化性 p−オキシ安息香酸 − グルコン酸 − 乳 酸 − グルコース + ショ閘 十 キシロース + ラクトース − マンニット + なお、上記、アリスロバクターDK −200は工業技
術院微生物工業技術研究所に倣工研菌寄第7472号(
F’gRM P −7472)として寄託されている。
以上の菌学的性質からアリスロバクタ−DK −200
の分類学上の位置について、パージエイズ・マニュアル
・オプ・デタミネイティブ・バクテリオロジー第8版(
1974年)の分類と対比した結果1記菌は、多形性が
あり、グラム陽性粒子を細胞内に有し、細胞壁にリジン
を含有するがメソジアミノピメリン酸、アラビノースを
含まないこと等からアリスロパクター属に横するものと
判定される。更に既知菌のいずれとも性質の一致を見な
いことから、アリスロバクター属に嘴する新菌種の菌と
判定される。
の分類学上の位置について、パージエイズ・マニュアル
・オプ・デタミネイティブ・バクテリオロジー第8版(
1974年)の分類と対比した結果1記菌は、多形性が
あり、グラム陽性粒子を細胞内に有し、細胞壁にリジン
を含有するがメソジアミノピメリン酸、アラビノースを
含まないこと等からアリスロパクター属に横するものと
判定される。更に既知菌のいずれとも性質の一致を見な
いことから、アリスロバクター属に嘴する新菌種の菌と
判定される。
次に本酵素を生産するには、通常の通気液体培養法を採
用するのが望ましい。本酵素を製造するにあたり用いら
れる培地としては、通常の細−〇培養に用いられる培地
が用いられる。そして例えハ、酵母エキス、ペノトン、
肉エキス、コーンスチーアリカー、アミノ酸類、硫安、
硝酸アンモニウム等の1櫨以上の有機もしくは無機の窒
素源に、例えば、リン酸、硫酸マグネシウム等の無機塩
類を1種以−ヒ添加し、必快により、炭素源例えば糖類
、ビタミン等ケ適宜添加したものが好適に用いられる。
用するのが望ましい。本酵素を製造するにあたり用いら
れる培地としては、通常の細−〇培養に用いられる培地
が用いられる。そして例えハ、酵母エキス、ペノトン、
肉エキス、コーンスチーアリカー、アミノ酸類、硫安、
硝酸アンモニウム等の1櫨以上の有機もしくは無機の窒
素源に、例えば、リン酸、硫酸マグネシウム等の無機塩
類を1種以−ヒ添加し、必快により、炭素源例えば糖類
、ビタミン等ケ適宜添加したものが好適に用いられる。
(にN−カルバモイル−L−トリシトファンなどを少量
添加すれば酵素活性が増強される。
添加すれば酵素活性が増強される。
なお初発−1は4〜11、温度15〜40゛Cの条件下
で、5〜120時間培養する。
で、5〜120時間培養する。
培養終了後、培養物より酵素を採取するには、通常の酵
素採取手段を用いることができる。しかし、本酵素は、
菌体内に存在する酵素であるため、培養物より例えば、
ろ過、遠心分離等の操作により菌体を分離したのち菌体
より本酵素を採取するのが好ましい。菌体の破壊手段と
しては、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等
の破壊手段を用いる方法、す・戸チームのQ口き細胞壁
浴解酵木を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、摩耗剤を
用いて菌体をすりつぶす方法、浸透圧ショックを適用す
る方法、有機浴剤や界面活性剤により静置させる方法を
用いる。このようにして、菌体を破壊したものあるいは
溶菌させたものより、例えば、ろ過、遠心分離等の適当
な処理操作より固形物を除去して菌体抽出液を得るか、
又は水、緩衝液、有機溶剤で抽出し、これをそのまま粗
酵素液として得るか、あるいは、その抽出液に必要によ
り、凍結乾燥法、アルコール沈殿法、アセトン沈殿法等
を適宜選択して実施することにより、粗酵素粉末を得る
。
素採取手段を用いることができる。しかし、本酵素は、
菌体内に存在する酵素であるため、培養物より例えば、
ろ過、遠心分離等の操作により菌体を分離したのち菌体
より本酵素を採取するのが好ましい。菌体の破壊手段と
しては、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等
の破壊手段を用いる方法、す・戸チームのQ口き細胞壁
浴解酵木を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、摩耗剤を
用いて菌体をすりつぶす方法、浸透圧ショックを適用す
る方法、有機浴剤や界面活性剤により静置させる方法を
用いる。このようにして、菌体を破壊したものあるいは
溶菌させたものより、例えば、ろ過、遠心分離等の適当
な処理操作より固形物を除去して菌体抽出液を得るか、
又は水、緩衝液、有機溶剤で抽出し、これをそのまま粗
酵素液として得るか、あるいは、その抽出液に必要によ
り、凍結乾燥法、アルコール沈殿法、アセトン沈殿法等
を適宜選択して実施することにより、粗酵素粉末を得る
。
上記粗酵素液もしくは粗酵素粉末より更に精製標品を得
るには、例えば、イオン交換体を用いる吸着溶出法、ハ
イドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、セファデッ
クスやバイオケ9ル等を用いるゲルろ過失、アフイニテ
イクロマト法等を適宜選択し、組み合わせを実施するこ
と罠より、精製された本酵素を得ることが出来る。
るには、例えば、イオン交換体を用いる吸着溶出法、ハ
イドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、セファデッ
クスやバイオケ9ル等を用いるゲルろ過失、アフイニテ
イクロマト法等を適宜選択し、組み合わせを実施するこ
と罠より、精製された本酵素を得ることが出来る。
以下実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。
発明はこれらに限定されるものではない。
実施例1
ヒダントイナーゼの製造例
ポリペプトン1.OL酵母エキス1.0.9 、グルコ
ース1.0.9.塩化ナトリウム1.0g、N−カルバ
モイルトリプトファン0.2gを水道水に溶解し、この
PHを7.5に調整し、全竜を200meとしたもの5
0C1+/の坂ロフラスコに100x/fつ2本分注し
た。この培地を温1f120℃で15分間殺菌後、アリ
スロバクターDK −200(微工研菌与第7472号
)を接種し、温度30℃で20時間振盪培養(100a
、plmの往復)した。
ース1.0.9.塩化ナトリウム1.0g、N−カルバ
モイルトリプトファン0.2gを水道水に溶解し、この
PHを7.5に調整し、全竜を200meとしたもの5
0C1+/の坂ロフラスコに100x/fつ2本分注し
た。この培地を温1f120℃で15分間殺菌後、アリ
スロバクターDK −200(微工研菌与第7472号
)を接種し、温度30℃で20時間振盪培養(100a
、plmの往復)した。
培養終了後培養液200m1を遠心分離して得られた菌
体を生理食塩水で1回洗浄後、0.02Mトリス−塩酸
緩衝液(pH8,0、塩化マンガン1 mM含有1:懸
濁し、液量な20ゴにした。この菌体懸濁液を1()+
/ずつに分け、20 x Hzの超音波破砕機で、それ
ぞれ3分間1回処理して、遠心分離し、固形分を除去し
、粗酵素液を得た。その粗酵素液を集めて、上記トリス
−塩酸緩衝液で60罰とした後、3%グロタミン億酸水
溶液11111を攪拌しながら加え、60分間攪拌を続
けた。遠心分離によって沈殿を除去し、上清液を得た。
体を生理食塩水で1回洗浄後、0.02Mトリス−塩酸
緩衝液(pH8,0、塩化マンガン1 mM含有1:懸
濁し、液量な20ゴにした。この菌体懸濁液を1()+
/ずつに分け、20 x Hzの超音波破砕機で、それ
ぞれ3分間1回処理して、遠心分離し、固形分を除去し
、粗酵素液を得た。その粗酵素液を集めて、上記トリス
−塩酸緩衝液で60罰とした後、3%グロタミン億酸水
溶液11111を攪拌しながら加え、60分間攪拌を続
けた。遠心分離によって沈殿を除去し、上清液を得た。
その上清液に、硫酸アンモニウムを帆60飽和になるま
で加え、生じた沈殿を遠心分離で除く。得られた上清液
に更に硫酸アンモニウムを0.60飽和になるまで加え
、遠心分離により沈殿を得る。この沈殿を、0.02
M )リス−塩酸緩衝液(p”8.L塩化マンガンl
mM金含有K溶解し、この溶液を同緩衝液で24時間透
析し、10m1の酵素液を得た。
で加え、生じた沈殿を遠心分離で除く。得られた上清液
に更に硫酸アンモニウムを0.60飽和になるまで加え
、遠心分離により沈殿を得る。この沈殿を、0.02
M )リス−塩酸緩衝液(p”8.L塩化マンガンl
mM金含有K溶解し、この溶液を同緩衝液で24時間透
析し、10m1の酵素液を得た。
以上のようにして硫安分画液5耐を、0.02Mトリス
−塩酸緩衝液(p)(8,0、塩化マンガン1mM含有
)で平衡化した蛋白精製用陰イオン交換樹脂カラム(M
ono Qファマシア社製)に吸着させる。次いで、高
速液体クロマトグラフィーにより、その緩衝液を用いて
充分に洗浄し、食塩濃度を0〜1.0Mまで連続的に上
昇させる方法により溶出を行ないフラクションコレクタ
ーで分画し、活性区分を得た。本高速液体クロマトグラ
フィーを2回行なうことにより、10m/の億安分画液
からの陰イオン交換樹脂精製酵素液が得られた。この酵
素液圧0.80飽和硫酸アンモニウムを加えて塩析し、
濃縮酵素液を2’tl得た。
−塩酸緩衝液(p)(8,0、塩化マンガン1mM含有
)で平衡化した蛋白精製用陰イオン交換樹脂カラム(M
ono Qファマシア社製)に吸着させる。次いで、高
速液体クロマトグラフィーにより、その緩衝液を用いて
充分に洗浄し、食塩濃度を0〜1.0Mまで連続的に上
昇させる方法により溶出を行ないフラクションコレクタ
ーで分画し、活性区分を得た。本高速液体クロマトグラ
フィーを2回行なうことにより、10m/の億安分画液
からの陰イオン交換樹脂精製酵素液が得られた。この酵
素液圧0.80飽和硫酸アンモニウムを加えて塩析し、
濃縮酵素液を2’tl得た。
次いで、0.2M塩化す) IJウム、11nM塩化マ
ンがンを含有した0、05M)IJス塩酸緩衝液で平衡
化したデルろ適用カラム(G 3000 sw x ’
2、東洋曹達製)Kかけ、高速液体クロマトグラフィー
により、同緩衝液で溶出し、活性区分を果めた。
ンがンを含有した0、05M)IJス塩酸緩衝液で平衡
化したデルろ適用カラム(G 3000 sw x ’
2、東洋曹達製)Kかけ、高速液体クロマトグラフィー
により、同緩衝液で溶出し、活性区分を果めた。
この活性区分を再度、同じデルろ適用カラムにかけ、高
速液体クロマトグラフィーにより集めた活性区分を精製
酵素液とした。本酵素液の蛋白濃度を、プロティン・ア
ッセイ(バイオラッド社製)により測定し、活性を測定
したところ、比活性34.2単位/〜であった。
速液体クロマトグラフィーにより集めた活性区分を精製
酵素液とした。本酵素液の蛋白濃度を、プロティン・ア
ッセイ(バイオラッド社製)により測定し、活性を測定
したところ、比活性34.2単位/〜であった。
本酵素液0.5単位を用い、5−ペンシルヒダントイン
2〜.0.02M)リスー塩酸バッファー(pH8)、
1mM塩化コバルトを含む1atの浴液中、35’0,
15時間反応させた。旅沸により反応を停止して後生成
したN−カルバモイル−フェニルアラニンを薄層クロマ
トグラフィー罠より、n−ブタノール:酢酸:水−4:
1:1で展開し、p−ツメチルアミノベンズアルデヒド
試薬で発色させ、デンシトメトリーにより電縫したとこ
ろ、2、llR9/m/のN−カルバモイルフェニルア
ラニンが生成していた。この反応液にN−カルバモイル
−L−アミノ酸に特異的に反応してL−アミノ酸を生成
するシューrモナスDK −910微工研菌寄第747
3号(FEBM P−7473)の酵素を0.05Mト
リス・塩酸緩#液(pH8,0)中、35℃、15時間
反応させた。生成したし一フェニルアラニンを、ラクト
バチルス、アラビノデスATC’C8014を用いるバ
イオアッセイ法により測定したところ、0.83〜のし
一フェニルアラニンが生成していた(モル収率49.8
%対N−カルバモイルフェニルアラニン)。
2〜.0.02M)リスー塩酸バッファー(pH8)、
1mM塩化コバルトを含む1atの浴液中、35’0,
15時間反応させた。旅沸により反応を停止して後生成
したN−カルバモイル−フェニルアラニンを薄層クロマ
トグラフィー罠より、n−ブタノール:酢酸:水−4:
1:1で展開し、p−ツメチルアミノベンズアルデヒド
試薬で発色させ、デンシトメトリーにより電縫したとこ
ろ、2、llR9/m/のN−カルバモイルフェニルア
ラニンが生成していた。この反応液にN−カルバモイル
−L−アミノ酸に特異的に反応してL−アミノ酸を生成
するシューrモナスDK −910微工研菌寄第747
3号(FEBM P−7473)の酵素を0.05Mト
リス・塩酸緩#液(pH8,0)中、35℃、15時間
反応させた。生成したし一フェニルアラニンを、ラクト
バチルス、アラビノデスATC’C8014を用いるバ
イオアッセイ法により測定したところ、0.83〜のし
一フェニルアラニンが生成していた(モル収率49.8
%対N−カルバモイルフェニルアラニン)。
実施例2
本発明ヒダントイナーゼの利用例
実施例1と同様にして得た酵素液を用い、5−ベンジル
ヒダントインのかわりに、5−インドリルメチルヒダン
トインな用いて、実施例1と同様にして反応させた。生
成したN−カルバモイル−トリプトファンを実施例1と
同様にして薄層クロマトグラフィーにより定1したとこ
ろ2−1 R9/ meのN−カルバモイルトリプトフ
ァンが生成していた。この反応液に実施例1と同様にし
て、シューpモナスDK −910微工研菌寄第747
3号(FERM P −747ろ)の酵素を反応させた
。生成したL−)リデトファンをバイオアッセイ法によ
り、測定したところ、0.86#vのL−トリプトファ
ンが生成していた(モル収率49.6%qN−カルバモ
イルトリプトファン)。
ヒダントインのかわりに、5−インドリルメチルヒダン
トインな用いて、実施例1と同様にして反応させた。生
成したN−カルバモイル−トリプトファンを実施例1と
同様にして薄層クロマトグラフィーにより定1したとこ
ろ2−1 R9/ meのN−カルバモイルトリプトフ
ァンが生成していた。この反応液に実施例1と同様にし
て、シューpモナスDK −910微工研菌寄第747
3号(FERM P −747ろ)の酵素を反応させた
。生成したL−)リデトファンをバイオアッセイ法によ
り、測定したところ、0.86#vのL−トリプトファ
ンが生成していた(モル収率49.6%qN−カルバモ
イルトリプトファン)。
有機合成化学的に製造される5−#換ヒダントインから
、本酵素によって常温常圧の温和な条件下で、効率よ(
、N−カルバモイル−L−アミノ酸を製造することが可
能である。さらに、本酵素はN−カルバモイル−L−ア
ミン酸加水分解酵素との併用もしくは逐次反応により医
薬・食品添加物等として有用なL−アミノ酸の製造に有
効である。
、本酵素によって常温常圧の温和な条件下で、効率よ(
、N−カルバモイル−L−アミノ酸を製造することが可
能である。さらに、本酵素はN−カルバモイル−L−ア
ミン酸加水分解酵素との併用もしくは逐次反応により医
薬・食品添加物等として有用なL−アミノ酸の製造に有
効である。
特許出願人 電気化学工業株式会社
(25)
第1頁の続き
0発 明 者 大 峯 弘 師 町田市旭町3内
Claims (1)
- 下記の理化学的性質を有し且つ5−fit換ヒダントイ
ンを開裂加水分解してN−カルバモイル−L−アミノ酸
を生成する活性を有する新規ヒダントイナーゼ。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9957884A JPS60241888A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | 新規ヒダントイナ−ゼ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9957884A JPS60241888A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | 新規ヒダントイナ−ゼ |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60241888A true JPS60241888A (ja) | 1985-11-30 |
JPH05993B2 JPH05993B2 (ja) | 1993-01-07 |
Family
ID=14250982
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9957884A Granted JPS60241888A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | 新規ヒダントイナ−ゼ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS60241888A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0219034A2 (de) * | 1985-10-09 | 1987-04-22 | BASF Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung von mesophilen Mikroorganismen, die eine bei höherer Temperatur aktive D-Hydantoinase enthalten |
EP1568778A1 (en) * | 1992-06-30 | 2005-08-31 | Smithkline Beecham Plc | Hydantoinase from agrobacterium |
-
1984
- 1984-05-17 JP JP9957884A patent/JPS60241888A/ja active Granted
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0219034A2 (de) * | 1985-10-09 | 1987-04-22 | BASF Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung von mesophilen Mikroorganismen, die eine bei höherer Temperatur aktive D-Hydantoinase enthalten |
US4912044A (en) * | 1985-10-09 | 1990-03-27 | Basf Aktiengesellschaft | Preparation of mesophilic microorganisms which contain a D-hydantoinase which is active at elevated temperature |
EP1568778A1 (en) * | 1992-06-30 | 2005-08-31 | Smithkline Beecham Plc | Hydantoinase from agrobacterium |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH05993B2 (ja) | 1993-01-07 |
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