JP2615443B2 - Ｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンデアセチラーゼの製造方法 - Google Patents
Ｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンデアセチラーゼの製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンデアセチラーゼの製造方法に関するものであ
る。本発明による酵素、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンデアセチラーゼは、医薬品として重要であり、また医
薬、工業及び農業、食品の分野で有用な原料となるＤ−
グルコサミンの生産に使用される。またＤ−グルコサミ
ンは、近年特に抗菌性、抗腫瘍性などの生理活性を持つ
グルコサミノオリゴ糖の出発物質として、注目されてい
る有用な物質である。
ルコサミンデアセチラーゼの製造方法に関するものであ
る。本発明による酵素、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンデアセチラーゼは、医薬品として重要であり、また医
薬、工業及び農業、食品の分野で有用な原料となるＤ−
グルコサミンの生産に使用される。またＤ−グルコサミ
ンは、近年特に抗菌性、抗腫瘍性などの生理活性を持つ
グルコサミノオリゴ糖の出発物質として、注目されてい
る有用な物質である。
【０００２】
【従来の技術】Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセ
チラーゼは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのアセト
アミド基に作用してＤ−グルコサミンを生成する酵素で
ある。従来、Ｄ−グルコサミンは、キチンを加水分解し
て得られるＮ−アセチルＤ−グルコサミンを化学的に脱
アセチルして調製されており、該加水分解には濃アルカ
リ及び鉱酸が用いられている。
チラーゼは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのアセト
アミド基に作用してＤ−グルコサミンを生成する酵素で
ある。従来、Ｄ−グルコサミンは、キチンを加水分解し
て得られるＮ−アセチルＤ−グルコサミンを化学的に脱
アセチルして調製されており、該加水分解には濃アルカ
リ及び鉱酸が用いられている。
【０００３】しかし、上記の酸、アルカリを用いる方法
では、脱アセチルと同時に他の必要とする結合も分解し
て、目的とするＤ−グルコサミンの収率の低下を来し、
また使用した酸、アルカリの処理に多大の費用を要す
る、という欠点を有する。
では、脱アセチルと同時に他の必要とする結合も分解し
て、目的とするＤ−グルコサミンの収率の低下を来し、
また使用した酸、アルカリの処理に多大の費用を要す
る、という欠点を有する。
【０００４】Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを脱アセ
チルする別法としては、温和な条件下にＮ−アセチル−
Ｄ−グルコサミンにのみ作用し副生成物を産しない利点
を持つことが予想される酵素、例えばデアセチラーゼを
用いる方法が考えられる。しかし、Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンデアセチラーゼについての知見は、これま
でにビブリオ属細菌による報告があるばかりであり、工
業的に利用できる技術は未だ確立されていない。
チルする別法としては、温和な条件下にＮ−アセチル−
Ｄ−グルコサミンにのみ作用し副生成物を産しない利点
を持つことが予想される酵素、例えばデアセチラーゼを
用いる方法が考えられる。しかし、Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンデアセチラーゼについての知見は、これま
でにビブリオ属細菌による報告があるばかりであり、工
業的に利用できる技術は未だ確立されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｄ−グルコ
サミンの製造に有用なＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
デアセチラーゼを工業的に製造できる方法を提供するこ
とを目的とする。
サミンの製造に有用なＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
デアセチラーゼを工業的に製造できる方法を提供するこ
とを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる従
来の欠点を解決すべく鋭意研究した結果、アルテロモナ
ス属に属する微生物が、 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサ
ミンデアセチラーゼを誘導的に多く生産することを見い
だし、本発明を完成するに至った。
来の欠点を解決すべく鋭意研究した結果、アルテロモナ
ス属に属する微生物が、 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサ
ミンデアセチラーゼを誘導的に多く生産することを見い
だし、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明はアルテロモナス属に属
する微生物を培養し、その培養物からＮ−アセチル−Ｄ
−グルコサミンデアセチラーゼを採取することを特徴と
する、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラーゼ
の製造方法である。
する微生物を培養し、その培養物からＮ−アセチル−Ｄ
−グルコサミンデアセチラーゼを採取することを特徴と
する、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラーゼ
の製造方法である。
【０００８】本発明のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
デアセチラーゼを産生する微生物は、アルテロモナス
（Alteromonas）属に属し、例えば以下に示すような菌
学的性質を有するものが挙げられる。
デアセチラーゼを産生する微生物は、アルテロモナス
（Alteromonas）属に属し、例えば以下に示すような菌
学的性質を有するものが挙げられる。
【０００９】本発明に用いられる微生物は、アルテロモ
ナス属に属し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセ
チラーゼの生産能を有するものであれば、いずれも使用
することができる。例えば、本発明者らがマリアナトラ
フ海域の深層水から分離した海洋細菌Ｍｃｔ−９菌株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３６９）を例示することができ
る。
ナス属に属し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセ
チラーゼの生産能を有するものであれば、いずれも使用
することができる。例えば、本発明者らがマリアナトラ
フ海域の深層水から分離した海洋細菌Ｍｃｔ−９菌株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３６９）を例示することができ
る。
【００１０】Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチ
ラーゼ生産性海洋細菌Ｍｃｔ−９菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５３６９）の菌学的性質は、下記の通りである。
ラーゼ生産性海洋細菌Ｍｃｔ−９菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５３６９）の菌学的性質は、下記の通りである。
【００１１】１．形態的性質 （１）細胞形態 ：曲稈状(curved rod) （２）運動性 ：＋ （３）鞭毛形態 ：極ベン毛 （４）グラム染色：陰性 ２．生理的性質 （１）発光性 ：− （２）増殖温度 ４℃ ：＋ ３５℃ ：＋ ４０℃ ：＋ （３）硝酸塩の還元 ：− （４）Ｏ−Ｆテスト ：Oxidative （５）オキシダーゼ ：＋ （６）カタラーゼ ：＋ （７）ＤＮＡの分解 ：− （８）ゼラチンの分解：＋ （９）キチンの分解 ：＋ （10）デンプンの分解：− （11）炭素化合物の資化性 Ｄ−マンノース ：− Ｄ−フラクトース ：− シュークロース ：＋ マルトース ：＋ Ｎ−アセチルグルコサミン：＋ コハク酸塩 ：＋ フマル酸塩 ：＋ クエン酸塩 ：− エリスリトール ：− グリセロール ：− ソルビトール ：− ＤＬ−リンゴ酸塩 ：− α−ケトグルタル酸塩 ：− ｍ−ヒドロキシ安息香酸塩：− （12）色素産生 ：− （13）塩類要求性：＋ ３．菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）：４０ ４．分離源：マリアナトラフ海域の水深約４０００ｍの
海水 上記菌学的性質の試験方法は、主として絵面良男：沿岸
環境調査マニュアルII〔水質・微生物篇〕、日本海洋学
会編、恒星社厚生閣、P.356-364(1990)に従った。また
駒形和男：微生物の分類と同定（下）、（改訂版、長谷
川武治編著）、学会出版センター、P.99-161(1985)を参
考にした。
海水 上記菌学的性質の試験方法は、主として絵面良男：沿岸
環境調査マニュアルII〔水質・微生物篇〕、日本海洋学
会編、恒星社厚生閣、P.356-364(1990)に従った。また
駒形和男：微生物の分類と同定（下）、（改訂版、長谷
川武治編著）、学会出版センター、P.99-161(1985)を参
考にした。
【００１２】なお、発光性は J.L.Reichelt 及び P.Bau
mann: Arch.Mikrobiol., 94,283(1973)、硝酸塩の還元
は Φ.Enger et al.: Int.J.Syst.Bacteriol., 37,416
(1987)、デンプンの分解及び炭素化合物の資化性は M.A
kagawa-Matsushita et al.: Int.J.Syst.Bacteriol.,4
2,621(1992)、P.Baumann et al.: J.Bacteriol.,107,26
8(1971)、L.Baumann et al.: J.Bacteriol.,110,402(19
72)および菌体内ＤＮＡのＧＣ含量は薮内英子他：新し
い分類学に伴走する細菌同定法、菜根出版、P.88-97(19
87)をそれぞれ参考にして測定した。
mann: Arch.Mikrobiol., 94,283(1973)、硝酸塩の還元
は Φ.Enger et al.: Int.J.Syst.Bacteriol., 37,416
(1987)、デンプンの分解及び炭素化合物の資化性は M.A
kagawa-Matsushita et al.: Int.J.Syst.Bacteriol.,4
2,621(1992)、P.Baumann et al.: J.Bacteriol.,107,26
8(1971)、L.Baumann et al.: J.Bacteriol.,110,402(19
72)および菌体内ＤＮＡのＧＣ含量は薮内英子他：新し
い分類学に伴走する細菌同定法、菜根出版、P.88-97(19
87)をそれぞれ参考にして測定した。
【００１３】以上の菌学的性質をＶｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍ
ａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１（Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ．及
びＪ．Ｇ．Ｈｏｌｔ編，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌ
ｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒ，１９８４）を参考にし、
Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（第９版、
Ｊ．Ｇ．Ｈｏｌｔ，Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ，Ｐ．Ｈ．Ａ．
Ｓｎｅａｔｈ，Ｊ．Ｔ．Ｓｔａｌｅｙ，Ｓ．Ｔ．Ｗｉｌ
ｌｉａｍｓ編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎ
ｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９９４）と対比した結果、
本海洋細菌Ｍｃｔ−９菌株（ＦＥＲＭＢＰ−５３６９）
はアルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属に属す
る細菌で、多くの性質がアルテロモナス・ウンジナ（Ａ
ｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｕｎｄｉｎａ）に類似してい
た。しかし、３５℃での増殖（Ｍｃｔ−９：＋；Ａ．ｕ
ｎｄｉｎａ：−）および菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（Ｍｃ
ｔ−９：４０モル％；Ａ．ｕｎｄｉｎａ：４３−４４モ
ル％）がアルテロモナス・ウンジナとは異なっていた。
ａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１（Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ．及
びＪ．Ｇ．Ｈｏｌｔ編，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌ
ｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒ，１９８４）を参考にし、
Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（第９版、
Ｊ．Ｇ．Ｈｏｌｔ，Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ，Ｐ．Ｈ．Ａ．
Ｓｎｅａｔｈ，Ｊ．Ｔ．Ｓｔａｌｅｙ，Ｓ．Ｔ．Ｗｉｌ
ｌｉａｍｓ編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎ
ｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９９４）と対比した結果、
本海洋細菌Ｍｃｔ−９菌株（ＦＥＲＭＢＰ−５３６９）
はアルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属に属す
る細菌で、多くの性質がアルテロモナス・ウンジナ（Ａ
ｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｕｎｄｉｎａ）に類似してい
た。しかし、３５℃での増殖（Ｍｃｔ−９：＋；Ａ．ｕ
ｎｄｉｎａ：−）および菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（Ｍｃ
ｔ−９：４０モル％；Ａ．ｕｎｄｉｎａ：４３−４４モ
ル％）がアルテロモナス・ウンジナとは異なっていた。
【００１４】この海洋細菌Ｍｃｔ−９菌株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５３６９）を用いて、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンデアセチラーゼを生産するには、当該菌体を適当
な培地に接種し、好ましくは誘導物質の存在下で常法に
従って培養すればよい。この誘導物質としては、キチ
ン、キチン分解物、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンオリゴマーを単独又は
これらのうちの２種以上を組み合わせたものを使用でき
る。好ましい誘導物質としては、Ｎ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンオリ
ゴマーが挙げられ、最も好ましい誘導物質はＮ−アセチ
ル−Ｄ−グルコサミンである。誘導物質は０．１ｇ／リ
ットル以上、好ましくは１．０〜５０ｇ／リットルの濃
度で加える。培地としては、まず公知のものがいずれも
使用できる。例えば、炭素源としてグルコース、マルト
ース、キシロース、スクロース、ペプトン等が例示で
き、窒素源としては、イーストエキス、ペプトン、肉エ
キス、アミノ酸溶液等の有機窒素、または硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム等の無機窒素が例示できる。ま
た誘導物質を炭素源、窒素源としてもよい。無機塩とし
ては、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸ナ
トリウム、リン酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリ
ウム、塩化カルシウム等を適宜組み合わせて使用でき
る。上記培地のｐＨは、適当な酸または塩基を加えるこ
とにより、６．５から８．０の範囲内に調整され、オー
トクレーブにより殺菌される。培養温度は、２〜３５
℃、好ましくは１０〜２２℃で１２〜４８時間通気攪拌
又は振盪培養を行う。また上記の炭素源、窒素源、無機
塩及び寒天を適宜含有する平板培地を使用し、培養温度
は２〜３５℃、好ましくは１０〜２２℃で１５〜７２時
間培養を行う。また、本菌の培養は、静置でも行われ
る。
ＢＰ−５３６９）を用いて、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンデアセチラーゼを生産するには、当該菌体を適当
な培地に接種し、好ましくは誘導物質の存在下で常法に
従って培養すればよい。この誘導物質としては、キチ
ン、キチン分解物、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンオリゴマーを単独又は
これらのうちの２種以上を組み合わせたものを使用でき
る。好ましい誘導物質としては、Ｎ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンオリ
ゴマーが挙げられ、最も好ましい誘導物質はＮ−アセチ
ル−Ｄ−グルコサミンである。誘導物質は０．１ｇ／リ
ットル以上、好ましくは１．０〜５０ｇ／リットルの濃
度で加える。培地としては、まず公知のものがいずれも
使用できる。例えば、炭素源としてグルコース、マルト
ース、キシロース、スクロース、ペプトン等が例示で
き、窒素源としては、イーストエキス、ペプトン、肉エ
キス、アミノ酸溶液等の有機窒素、または硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム等の無機窒素が例示できる。ま
た誘導物質を炭素源、窒素源としてもよい。無機塩とし
ては、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸ナ
トリウム、リン酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリ
ウム、塩化カルシウム等を適宜組み合わせて使用でき
る。上記培地のｐＨは、適当な酸または塩基を加えるこ
とにより、６．５から８．０の範囲内に調整され、オー
トクレーブにより殺菌される。培養温度は、２〜３５
℃、好ましくは１０〜２２℃で１２〜４８時間通気攪拌
又は振盪培養を行う。また上記の炭素源、窒素源、無機
塩及び寒天を適宜含有する平板培地を使用し、培養温度
は２〜３５℃、好ましくは１０〜２２℃で１５〜７２時
間培養を行う。また、本菌の培養は、静置でも行われ
る。
【００１５】培養によって得られた培養物から培養液と
菌体とを分離する方法としては、従来から行われている
遠心分離法やろ過等の方法が使用できるが、遠心分離法
が好適である。菌体内に蓄積された該酵素を菌体から抽
出する方法としては、従来から行われている超音波によ
る菌体破砕、あるいはガラス・ビーズと共に回転させる
ダイノミル細胞破砕機による菌体破砕、またはリゾチー
ム等の酵素やトルエン等の有機溶媒による細胞膜の破壊
等の方法が挙げられる。これらの中から適当な方法を選
択して菌体から酵素の抽出を行うことにより、酵素を採
取することができる。
菌体とを分離する方法としては、従来から行われている
遠心分離法やろ過等の方法が使用できるが、遠心分離法
が好適である。菌体内に蓄積された該酵素を菌体から抽
出する方法としては、従来から行われている超音波によ
る菌体破砕、あるいはガラス・ビーズと共に回転させる
ダイノミル細胞破砕機による菌体破砕、またはリゾチー
ム等の酵素やトルエン等の有機溶媒による細胞膜の破壊
等の方法が挙げられる。これらの中から適当な方法を選
択して菌体から酵素の抽出を行うことにより、酵素を採
取することができる。
【００１６】これらの方法で抽出された粗酵素液から N
-アセチル-D-グルコサミンデアセチラーゼをさらに精製
する必要がある場合には、通常実施されている一般的な
酵素の精製手段である硫酸アンモニウム沈殿法、イオン
交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過法、吸着クロ
マトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、調製用電気
泳動法等を適宜組み合わせることによって、精製を行う
ことができる。
-アセチル-D-グルコサミンデアセチラーゼをさらに精製
する必要がある場合には、通常実施されている一般的な
酵素の精製手段である硫酸アンモニウム沈殿法、イオン
交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過法、吸着クロ
マトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、調製用電気
泳動法等を適宜組み合わせることによって、精製を行う
ことができる。
【００１７】本発明により得られたＮ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンデアセチラーゼは、以下の理化学的性質を
有する。
グルコサミンデアセチラーゼは、以下の理化学的性質を
有する。
【００１８】(1)作用：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンのアセトアミド基に作用してD-グルコサミンを生成す
る (2)基質特異性：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに作
用するが、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンオリゴマー
には作用しない。
ンのアセトアミド基に作用してD-グルコサミンを生成す
る (2)基質特異性：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに作
用するが、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンオリゴマー
には作用しない。
【００１９】(3)至適pH：7.8〜8.0（図１に示され
る。） (4)安定pH：6.0〜8.0 （37℃、30分間インキュベート
後、70％以上の活性が保持される。） (5)至適温度：48℃（図２に示される。） (6)熱安定性：43℃（pH7.8、30分間インキュベート後、
70％以上の活性が保持される。） なお活性は、以下の方法により測定した。すなわち、20
0 mMリン酸緩衝液（pH7.8）0.1 mlに基質として10％Ｎ
−アセチル−Ｄ−グルコサミン溶液0.3 mlを加え、さら
に酵素溶液0.1 mlを加え、48℃で30分間インキュベート
する。その後、生成したＤ−グルコサミンをインドール
・塩酸法で比色定量する。酵素の１単位（ユニット）
は、１分間に1μmolのＤ−グルコサミンを生成する酵素
量とする。
る。） (4)安定pH：6.0〜8.0 （37℃、30分間インキュベート
後、70％以上の活性が保持される。） (5)至適温度：48℃（図２に示される。） (6)熱安定性：43℃（pH7.8、30分間インキュベート後、
70％以上の活性が保持される。） なお活性は、以下の方法により測定した。すなわち、20
0 mMリン酸緩衝液（pH7.8）0.1 mlに基質として10％Ｎ
−アセチル−Ｄ−グルコサミン溶液0.3 mlを加え、さら
に酵素溶液0.1 mlを加え、48℃で30分間インキュベート
する。その後、生成したＤ−グルコサミンをインドール
・塩酸法で比色定量する。酵素の１単位（ユニット）
は、１分間に1μmolのＤ−グルコサミンを生成する酵素
量とする。
【００２０】
【発明の効果】本発明によるＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンデアセチラーゼは、医薬品、農業、工業、食品の
分野で有用な原料となるＤ−グルコサミンを処理に多大
な費用や労力を要するアルカリ、酸等の化学製品を使用
することなく、かつ純粋かつ簡便に製造する際に有用に
製造する技術を提供するものである。さらに、本発明は
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラーゼを工業
的に製造する技術をも提供するものである。
サミンデアセチラーゼは、医薬品、農業、工業、食品の
分野で有用な原料となるＤ−グルコサミンを処理に多大
な費用や労力を要するアルカリ、酸等の化学製品を使用
することなく、かつ純粋かつ簡便に製造する際に有用に
製造する技術を提供するものである。さらに、本発明は
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラーゼを工業
的に製造する技術をも提供するものである。
【００２１】以下、実施例により本発明をさらに詳細に
説明する。
説明する。
【００２２】
【実施例】実施例１：培地２００ｍｌ当たり、０．６ｇ
の硝酸アンモニウム、０．２ｇのリン酸水素二カリウ
ム、２ｇの塩化ナトリウム、０．１２ｇの硫酸マグネシ
ウム、０．０２ｇの塩化カルシウム、１０ｇのグルコー
ス、３ｇのアガーをそれぞれ含有したｐＨ７．４の平板
培地に、アルテロモナスｓｐ．Ｍｃｔ−９（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−５３６９）を接種し、２０℃で４８時間培養した。
その後、滅菌スパチュラを用いて集めた菌体を、市販の
Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ（商品名，Ｄｉｆｃｏ製）溶
液５００ｍｌに当該酵素の誘導物質のＮ−アセチル−Ｄ
−グルコサミン２５ｇを加えた液体培地（ｐＨ７．４）
に接種し、混和後、２０℃で２４時間、好気的に振とう
培養した。
の硝酸アンモニウム、０．２ｇのリン酸水素二カリウ
ム、２ｇの塩化ナトリウム、０．１２ｇの硫酸マグネシ
ウム、０．０２ｇの塩化カルシウム、１０ｇのグルコー
ス、３ｇのアガーをそれぞれ含有したｐＨ７．４の平板
培地に、アルテロモナスｓｐ．Ｍｃｔ−９（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−５３６９）を接種し、２０℃で４８時間培養した。
その後、滅菌スパチュラを用いて集めた菌体を、市販の
Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ（商品名，Ｄｉｆｃｏ製）溶
液５００ｍｌに当該酵素の誘導物質のＮ−アセチル−Ｄ
−グルコサミン２５ｇを加えた液体培地（ｐＨ７．４）
に接種し、混和後、２０℃で２４時間、好気的に振とう
培養した。
【００２３】その後、培養液を10000×gで15分間遠心分
離を行い、湿重量20gの菌体を得た。得られた菌体は、4
0 mlの生理食塩水にけん濁し、0℃で10分間超音波処理
（20秒間作動、20秒間休止）を行った後、16000×gで1時
間遠心分離を行い、上清液を得た。この上清液中の N-
アセチル-D-グルコサミンデアセチラーゼの総活性は12.
6ユニット、比活性は0.0063ユニット/mg-タンパク質で
あった。
離を行い、湿重量20gの菌体を得た。得られた菌体は、4
0 mlの生理食塩水にけん濁し、0℃で10分間超音波処理
（20秒間作動、20秒間休止）を行った後、16000×gで1時
間遠心分離を行い、上清液を得た。この上清液中の N-
アセチル-D-グルコサミンデアセチラーゼの総活性は12.
6ユニット、比活性は0.0063ユニット/mg-タンパク質で
あった。
【００２４】この上清液を、予め10mMのリン酸緩衝液
（pH7.0）で平衡化した35 mlの DEAEBio-Gel A（商品
名，Bio-Rad製）カラムに通し目的とする酵素を吸着さ
せた。カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、段階
的に塩化ナトリウムの濃度を変化させて溶出し総活性1
0.7ユニット、比活性0.069ユニットのN-アセチル-D-グ
ルコサミンデアセチラーゼを得た。
（pH7.0）で平衡化した35 mlの DEAEBio-Gel A（商品
名，Bio-Rad製）カラムに通し目的とする酵素を吸着さ
せた。カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、段階
的に塩化ナトリウムの濃度を変化させて溶出し総活性1
0.7ユニット、比活性0.069ユニットのN-アセチル-D-グ
ルコサミンデアセチラーゼを得た。
【００２５】Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−ア
セチル−Ｄ−グルコサミンのオリゴマー（２から６量
体）について、各基質に対するＮ−アセチル−Ｄ−グル
コサミンデアセチラーゼの活性を測定した。本酵素はＮ
−アセチル−Ｄ−グルコサミン以外には、全く作用しな
かった。
セチル−Ｄ−グルコサミンのオリゴマー（２から６量
体）について、各基質に対するＮ−アセチル−Ｄ−グル
コサミンデアセチラーゼの活性を測定した。本酵素はＮ
−アセチル−Ｄ−グルコサミン以外には、全く作用しな
かった。
【図１】アルテロモナスｓｐ．ＭＣＴ−９（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５３６９）由来Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
デアセチラーゼの至適ｐＨ曲線を示し、■は４０ｍＭ酢
酸ナトリウム緩衝液、◆は４０ｍＭリン酸二水素カリウ
ム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、●は４０ｍＭホウ
酸／塩化カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、△は４０
ｍＭ炭酸水素ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液を使
用した結果を示す。
ＢＰ−５３６９）由来Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
デアセチラーゼの至適ｐＨ曲線を示し、■は４０ｍＭ酢
酸ナトリウム緩衝液、◆は４０ｍＭリン酸二水素カリウ
ム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、●は４０ｍＭホウ
酸／塩化カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、△は４０
ｍＭ炭酸水素ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液を使
用した結果を示す。
【図２】同酵素の温度活性曲線を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】アルテロモナス(Alteromonas)属に属する
微生物を培養し、その培養物からＮ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンデアセチラーゼを採取することを特徴とす
る、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラーゼの
製造方法。 - 【請求項２】前記微生物が海洋細菌アルテロモナス属細
菌Mct-9菌株(Alteromonas Mct-9菌株)である請求項１記
載のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラーゼの
製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7081988A JP2615443B2 (ja) | 1995-03-13 | 1995-03-13 | Ｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンデアセチラーゼの製造方法 |
| US08/609,107 US5731184A (en) | 1995-03-13 | 1996-02-29 | Process for producing N-acetyl-D-glucosamine deacetylase |
| EP96301658A EP0732400B1 (en) | 1995-03-13 | 1996-03-11 | Process for producing N-acetyl-D-glucosamine deacetylase |
| NO19961004A NO317723B1 (no) | 1995-03-13 | 1996-03-12 | Fremgangsmate for fremstilling av N-acetyl-D-glukosamindeacetylase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7081988A JP2615443B2 (ja) | 1995-03-13 | 1995-03-13 | Ｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンデアセチラーゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08242854A JPH08242854A (ja) | 1996-09-24 |
| JP2615443B2 true JP2615443B2 (ja) | 1997-05-28 |
Family
ID=13761863
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7081988A Expired - Lifetime JP2615443B2 (ja) | 1995-03-13 | 1995-03-13 | Ｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンデアセチラーゼの製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5731184A (ja) |
| EP (1) | EP0732400B1 (ja) |
| JP (1) | JP2615443B2 (ja) |
| NO (1) | NO317723B1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101035043B1 (ko) | 2002-07-01 | 2011-05-19 | 아르키온 라이프 사이언씨즈 엘엘씨 | 글루코사민 및 ｎ-아세틸글루코사민의 제조를 위한 물질및 공정 |
| CN104327128A (zh) * | 2014-11-19 | 2015-02-04 | 北大医药重庆大新药业股份有限公司 | 一种氨基葡萄糖盐酸盐的制备方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0691819B2 (ja) * | 1991-05-27 | 1994-11-16 | 工業技術院長 | デアセチラーゼの製造方法 |
| US5219749A (en) * | 1991-10-09 | 1993-06-15 | Institute For Molecular Biology & Biotechnology/Forth | Process for isolating and preparing purified chitin deacetylase |
| FR2701488B1 (fr) * | 1993-02-15 | 1995-05-05 | Ifremer | Bactéries du type Alteromonas, polysaccharides produits par ces bactéries, ose contenu dans ces polysaccharides et applications. |
| JPH0763370B2 (ja) * | 1993-03-12 | 1995-07-12 | 工業技術院長 | Ｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンデアセチラーゼ |
-
1995
- 1995-03-13 JP JP7081988A patent/JP2615443B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-02-29 US US08/609,107 patent/US5731184A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-03-11 EP EP96301658A patent/EP0732400B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-12 NO NO19961004A patent/NO317723B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0732400B1 (en) | 2000-02-02 |
| NO961004D0 (no) | 1996-03-12 |
| NO961004L (no) | 1996-09-16 |
| US5731184A (en) | 1998-03-24 |
| NO317723B1 (no) | 2004-12-13 |
| JPH08242854A (ja) | 1996-09-24 |
| EP0732400A3 (en) | 1996-10-23 |
| EP0732400A2 (en) | 1996-09-18 |
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