JPS60239426A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は七ツクローナル抗体、詳しくはニューｅシスチ
ス・カリニ　（Ｐｎｔｗｍｏｇｚｔｉｓ　ｔａｒｉｎｉ
ｉ）の栄養型（ｔｒａｆｉｋｔｓｚｔｐｉｔｔ　）の膜
抗原及び嚢子（ｃｙｓｔ）の膜抗原に特異反応性を有す
る七ツク０−ナル抗体に関する。

ニューモシスチス・カリニは、めわゆる日和見感染病原
体（σ戸ｐσｒｔｕｎｉｓｔｉｔ　ｐａｔｈｔｑｔｎ　
）の一つであシ、広くヒトや他の哺乳動物等の宿主の肺
等に存在しておシ、宿主が健康な場合は不顕性感染の形
をとっているが、例えば宿主が抵抗力の弱い小児、先天
的免疫不全児や白血病やその他の癌の治療のためステ０
イド剤や制癌剤等の投与を受けている場合、また自己免
疫疾患のため免疫抑制剤の長期投与を受けている場合免
疫能が低下するために１肺胞内で急激に増殖して顕在化
し、極めて重篤な肺炎（二ｌ−モシスチス・カリニ肺炎
）を発症させる。この肺炎の診断は通常極めて困難であ
シ、その確定診断は開胸肺生検、閉鎖的肺生検、気管支
鏡的生検等の生検によらねばならず、かかる生検は患者
にとシ大変な侵襲及び苦痛を与え、重篤な患者では困難
である。この様な現状からよシ安全に且つ早期に確実に
上記肺炎の診断を行なうための免疫血清学的診断法の確
立が要望されておシ、神体結合反応を利用する方法や螢
光抗体法の主なものであるため満足な結果は得られてい
ない。また近年上記免疫学的診断のための純粋な抗原を
作製するだめの集シスト法やシスト純化法が確立され〔
猪飼ら、寄生生学雑誌、第２８巻、第２号、第７１〜８
０頁（１９７９年）〕、これによシ得られる抗原を用い
たオクテ０ニイ（０ｕｃｈｔｚｒｌｏｎｙ　）法や免疫
電気泳動法による抗体の検索技術が試みられた〔灰塚ら
、広大成語、２７：３１５〜３２６．１９７９）。しか
し尚診断法としては好成績は得られていない。

発明の目′的 上記現状に鑑み、本発明者らもニューモシスチス・カリ
ニ肺炎を早期に確実にしかも安全に診断１　できる免疫
学的診断法の確立を目的として鋭意研究を重ねた結果、
患者血中に循環する循環抗原と特異選択的反応性を有し
、該抗原の検出・測定に有効な特定の七ツクローナル抗
体の作成に成功し、ここに本発明を完成するに至った。

発明の構成 即ち本発明は、ニュー七シスチス°カリニ由来抗原で免
疫した哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との
融合細胞によシ産生され、ニューモシスチス・カリニの
栄養型膜抗原及び嚢子膜抗原に特異反応性を有すること
を特徴とする七ツク０−ナル抗体に係る。

本発明の七ツク０−ナル抗体は、後記に詳述する通シ、
特定の免疫細胞と骨髄腫細胞との細胞融合により作成さ
れ、選別されたバイプリドーマの培養によシ得られるこ
と及びニュー七シスチス。

カリニの栄養型膜抗原及び嚢子膜抗原と特異的に結合す
ることを特徴とする。

上記本発明抗体は、その特異性を利用して、各種免疫測
定法における特異抗体として利用でき、・これによシ簡
単な操作で容易迅速且つ安全に、し早期診断技術を提供
できる。

以下、本発明上ツク０−ナル抗体の製造法につき詳述す
る。本発明抗体は特定の融合細胞によシ収得される。該
融合細胞を得るだめの一方の親細胞としては・ニューモ
シスチス・カリニ由来抗原で免疫した哺乳動物の免疫細
胞を用いる。該免疫細胞は、ニューモシスチス・カリニ
由来抗原を免疫抗原として用いて通常の方法に従い調製
される。

ここで免疫抗原としてはニュー七シスチス・カリニ病原
体自体シストであってもよく、該病原体で感染した哺乳
動物の感染組織例えば肺組織やその精製物であってもよ
く、更には之等のフラグメントをハづテンとして通常の
方法に従い担体と結合させたものであってもよい。特に
好ましい免疫抗原としてはニューモシスチス・カリニ感
染“哺乳動物の肺よシスト純化法に従って集めたシスト
又は該シストの膜成分分離上清を挙げることができる。

また上記免疫抗原で免疫する哺乳動物としては特に限定
はないが、細胞融合に用いる他方の親細胞とする骨髄腫
細騨六の適合性を考慮して選択されるのが望ましく、一
般にはマウス、ヌードマウス、ラット等を使用するのが
よい。免疫方法は一般的手法に従うことができ、例えば
上記免疫抗　□原を通常の緩衝液や生理食塩水に懸濁さ
せたものあるいはこれとフロイシドの補助液等との混合
液　。

を哺乳動物に腹腔内、皮下等の適当な経路で投与して一
次刺激後、必要に応じて同様の操作を繰返・せばよい。

免疫抗原の投与量は、該抗原の種類、投与経路、哺乳動
物の種類等に応じて適宜決定されるが、該抗原としてシ
ストの膜成分分離上清を用いてこれをマウスに腹腔内投
与する場合は、通常線投与量が１回あたシ１０μｙ−Ｉ
Ｉｌｙ／マウス程度とするのがよく、病原体自体（シス
ト）を同様に用いる場合は、通常総投与量１回あたシ約
！×１０５〜ｌＸｌ０６個／マウスとするのが適当であ
る。引き続く細胞融合に用いる免疫細胞は、上記最終投
与の約３日後に摘出した膵臓細胞が好適である。

また上記免疫細胞と融合させる他方の親細胞としての骨
髄腫細胞（、：工０−マ細胞）としては、既に確立され
ている公知の各種細胞株、例えばマウスにおけるＮＳ　
ｌ　−Ａｙ４／ｉ　（Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｉｍｍｔｔｎｏｌ
、。

６：５１１−５１９（＋９７６））、Ｐ３（Ｐ３×６３
／ｌｆ８．６．５．３　）　（、Ｎａｔｘｌｒｌ　、　
２５６，４９５−４９７（＋９７５））、Ｐ　３−Ｕ　
ｌ　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎＭｉｔｒｏ
ｂｉｏｌｏｑｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｙｙ　、　
３１　：　ｌ　−７（＋９７８））、ＭＰＣｌ　１−　
４５．６ＴＧ１．７　（Ｃｅｌｌ。

８：４０５’−４１５（１９７６））、Ｓ　Ｐ　２１０
−　Ａ　ｙ１４ＣＮｔｌｔｓｔｒｔ　、２７６　：　２
６９−２７０（１９７８））、ＦＯ（Ｊ、　Ｉｔｐｔｍ
ｕｎｏｌ、　Ｍｌｔｋ、　、　３５　：　１−２１（＋
９８０））、Ｘ　６３．６．５．３　（Ｊ、　Ｉｖｕｎ
ｔｔｎｔｐｌ、　。

１２３：　１５４８−１５５０（１９７９））、５１９
４１５ＸＸ　Ｏ，ＢＵ、ｌ　（／、　Ｅｘ戸、Ｍｅｄ、
　、　１４８：３１３３２３（＋９７８））、Ｘ４５　
等や、ラットにおける２　１　Ｑ、　ＲＣＹ３．　Ａｐ
１．２．３（Ｎａｔｕｒｅ　、　２７７　：１３１−１
３３（＋９７９））、Ｙ３．　Ａｆｌ、　２．３等をい
ずれも使用できる。

上記免疫細胞と骨髄腫細胞との融合反応は、基本的には
公知の方法、例えばオイ（Ｏｉ　）及びヘルツエンベル
ク（Ｈｔｒｘｔｎｂｔｒｙ　）の方法（Ｓｅｌｅｃｔｅ
ｄＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｙｙ、　３５１−３７１、　Ｆ、　Ｈ，Ｆｒｅ
ｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、、ＵＳＡ出版（１９８０）等に準
じて、融合促進剤の存在下に、通常の栄養培地中で行な
われる。融合促進剤としては通常用いられるポリエチレ
ンクリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルス（ＩＩＶＪ
）等を使用でき、更に所望によシ融合効率を高めるため
にジメチルスルホ牛シト等の補助剤を添加使用すること
もできる。免疫細胞と骨髄腫細胞との使用比は、通常の
方法と変シがなく、例えば骨髄腫＠胞に対し、免疫細胞
を約１−１０倍用いればよい。上記融合時の培地として
は、この種の細胞培養に使用される通常の各種栄養培地
をいずれも使用できるＯその代表例としては例えばＲＰ
ＭＩ−１６４０培地、その他ダルベツコ改質ＭＥＮ培地
等を例示でき、２等培地には通常用られるように例えば
牛胎児血清（ＦＯ５）、非必須アミノ酸混合液・じルじ
ン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール等の血液補
液を添加しておくこともできる。融合は、上記免疫細胞
と骨髄腫細胞との所定量を血清を含まない上記培地内で
よく混ぜて遠沈し、上清を除去した後、予め３７°Ｃ程
度に加温したＰＥＧ、例えば平均分子量約１０００〜６
０００のものを、培地に約３０〜６０％（Ｆ／Ｆ）　の
濃度とがるように加えたものを細胞の沈渣に滴下して混
ぜ合すことによシ行なわれる。これを３７°Ｃで６０秒
ないし数分間反応させ、適当な培地を逐次添加して１０
分前後室温におき遠沈し、上清を除去する操作を行なう
ことによシ、所望のハイプリドーマが形成される。

得られる所望ハイプリドーマの分離は、通常の選択用培
地、例えばＨＡＴ培地（しボ＋サンチン、アミノプテリ
ン及びチ、ニシンを含む培地）を用いて行なわれる。該
ＨＡＴ培地での細胞培養は、バイプリドーマ以外の細胞
（未融合細胞）が死滅するのに充分な時間、通常数日〜
数週間を要して行なわれる。本発明における上記バイプ
リドーマの選択は、好ましくは、上記ＨＡＴ培地での培
養後、更に培養物をＨＴＱ地（じホ牛サンチン及びチ三
ジンを含む培地）で数日〜数週間培養することによシ行
なわれる。

かくして得られるハイプリドーマは、通常の限界希釈法
に従い、目的とする抗体の産生株の検索及び単一り０−
ン化を行なわれる。該目的抗体産生株の検索は、ニュー
モシスチス・カリニ栄養型又は嚢子の細胞膜に対する交
互反応性を検討することによシ実施される。その方法は
例えばＥＬＩＳＡ法（Ｅ３ｔｐａｌｌ　、　Ｅ、　、　
Ｍｙｔｈ、　Ｅｎｘｙｍｏｌ、　、　７Ｑ、４１９−４
３９（１９８０））　、プラーク法、スポット決、凝集
反応性、オクテ０ニイ法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）法等の一般の抗体の検出に利用される各種方法に従
うことができる〔「ハイプリドーマ法とｔツク０−ナル
抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄづラニンジ発行、ｌ’ｆｉ３０
〜５３、昭和５７年３月５日〕。より具体的には、ニュ
ーモシスチス・カリニ感染哺乳動物の肺をシスト純化法
〔猪飼ｉｔか、寄生虫学雑誌、第２８巻、第２号、第７
１−８０頁（１９７９年）〕にて精製したものを、例え
ばコレステ０−ル、レシチシ等を用いてプレートにコー
ティング（塗抹）し、該プレート上で上記ニューモシス
チス・カリニと被検抗体（上記ハイブリドーマの培養上
清）とを反応させ、この反応物の存在を、通常の方法例
えば前記融合にマウスの細胞を用いた場合は、ＦＩＴＣ
（フルオレッｔインイ′ソチオシアナート）−抗マウス
ｒ−グロブリンを用いた螢光抗体法等により確認する（
上記反応物は螢光色素によシ染色される）。上記バイプ
リドーマの分離及び目的抗体産生株の検索操作は、これ
らを数回繰返して行なうのが望ましく、これにより目的
抗体産生株の単一りＯ−ン化が行ない得る。

かくして得られる目的抗体産生株（ハイづリドーマ）は
、通常の培地で継代培養でき、また液体窒素中で容易に
長期間安定に保存することができる。該ハイプリドーマ
の代表例は後記実施例に示す通シであり、これは本発明
者らによシ分譲可能な状態で保持されている。

上記ハイプリドーマからの本発明上ツク０−ナル抗体の
製造は、常法に従い該ハイプリドーマを培養し、培養上
清から分離する方法、あるいは上記ハイプリドーマをこ
れと適合性のある哺乳動物に投与し、増殖させ、該動物
の腹水よシ分離する方法等の通常の方法によシ実施でき
る。前者の方法は特に高純度のものを得るのに適してお
シ、後者の方法は大量生産に適している。

上記で製造された本発明の七ツク０−ナル抗体は、更に
精製することもでき、例えば硫安分画法、ＤＥＡＥｔル
０−スカラムクＤマドタラフィー等のゲル濾過法などの
通常の分離手段によりＩｇＧ画分を単離するととによシ
本発明の七ツクローナル抗体を収得できる。

かくして得られる本発明上ツク０−ナル抗体は・後記す
る通シ、ニューモシスチス・カリニの栄養型及び嚢子の
細胞膜抗原と特異選択的に反応するものであシ、その利
用によって二１−℃シスチス・カリニ肺炎の診断、治療
等に有用なものである。

実施例 以下に、実施例及び試験例を挙げ、本発明を更（１）　
ニューモシスチス・カリニ抗原の調整１）吉日らの方法
（寄生虫学雑誌ＶＤ１．３Ｑ。

ＩＮ戸戸１．（１９８１）７３０　）によシ得たニュー
モシスチス・カリニ感染Ｂａｌ’ｂ／を系スートマウス
の肺を取シ出し、生理食塩水に５％（Ｖ／Ｖ）となるよ
う懸濁させた後、ウオーリンク　プレンター（Ｗａｒｉ
ｎｇ　ｂｌｔｎｄｔｒ　、日本精機社製）でホモジナイ
ズした。これを生理食塩水で５倍希釈して１％懸濁液と
した。

ｌ）ニューモシスチス・カリニ感染ラット及び同感染ヒ
トの肺よシスト純化法に従いシストを分離精製し、これ
を生理食塩水に１％（Ｆ／Ｆ）となるよう懸濁させた。

（２）免疫化 １）上記（１）の１）　で調製した懸濁液（抗原液）の
１容量部を同量のフロイド完全アジ１バントと混合して
エマルジョンとし、その１　ｍｌをＢａ１ｂ／Ｃ系マウ
スの腹腔内に投与し一次抗原刺激とした。該−次抗原刺
激の４０日後に、同一の抗原液のｌ　ｔｔｒｔを同様に
投与して二次抗原刺激とし、その３日後に免疫されたマ
ウスの牌臓細胞を取り出し、免疫細胞としての単細胞浮
遊液を調整した。

１１）前記の（１）の　＋１）で得たニュー七シスチス
・カリニ感染ラットよυ分離されたシストの生理食塩水
懸濁液の抗原（５Ｘ１０５個／マウス）をＢａｔｈ　ｌ
ｔ系マウスに前記（２）の　１）と同様に免疫化を行な
い、牌臓細胞を取シ出し単細胞浮遊液を調製した。

■）前記（１）の　１１）で得たニューモシスチス・カ
リニ感染しト肺よシ分離されたシストの生理食塩水懸濁
液の抗原（５ＸＩＯ５個／マウス）をＢｔｔｌ　ｂ　／
　ｃ　系マウスに前記（２）の　１）と同様に免疫化を
行ない、牌臓細胞を取シ出し、単細胞浮遊液を調製した
。

（３）細胞融合 １）上記（２）の　１）で得た免疫細胞と、マウス三工
Ｏ−マ細胞（戸３Ｘ６３１ｇ８．６．５．３）、〔京都
大学、結核胸部疾患研究所、桂義元教授よシ入手〕とを
１＝２となるように混合し、イーグルの培地で洗浄後、
沈渣に５０％ポリエチレンクリコール（Ｍｒ４０００）
を滴下し、３７°Ｃで９０秒間イン士ユベートして、３
７°ＣのＲＰＭＩ−１６４０培地を２０Ｍ／滴下した後
、１０分間放置して融合細胞懸濁液を得た。

予め３時間前にフィーダーとして正常マウス牌臓細胞を
５Ｘ１０５個／ウェル又は正常マウス腹腔細胞を２Ｘ１
０”個／ウェルとなるように蒔種調製した９６六マイク
ロプレートの各ウェルに、ＨＡＴ選択培地（１０−”Ｍ
シボ中サンチン、４×１０’Ｍアミノづテリン、１．６
　Ｘ　１０−５Ｍチ、ニシン及び１０％ＦＣ５を含むＲ
ＰＭＩ−１６４０培地）に懸濁した。これに上記融合細
胞懸濁液０．１ｓｔ（２Ｘ１０５細胞／ウエル）を加え
、２〜３日間隔で各ウェルのＨＡＴ培地の牛量を交換し
ながら細胞を増殖させた。２週間後各ウェルの培地をＨ
Ｔ培地（１０−”＆ｔ、ポ牛サコサンチン、６　Ｘ　１
０−５Ｍチミジン及びｌＯ％ＦＣ５を含むＰＲＭＩ−１
６４０培地）に交換し、更に１週間細胞の増殖を行なわ
せ、次いで増殖細胞を２４穴プレートに移し、ｌＯ％Ｆ
Ｃ５を含むＲＰＭＩ　１６４，０培地にて・７日間培養
を継続して、融合細胞の一次スクリーニングを行なった
。該スクリーニングは培養上清を用い、後記する塗抹標
本による螢光抗体法にて、特にニューモシスチス・カリ
ニの栄−養型膜抗原及び嚢子膜抗原に強い螢光を与える
ウェルの細胞を。

選び出した。

上記スクリーニングによシ選択された各ウェル細胞を、
次いで上記と同様にフィーターを加えた９６穴プレート
の各ウェルに平均０．３個／ウェルでまき、■０％ＦＣ
５を含むＲＰＮＩ−１６４０培地で２週間培養し、培養
されｆｃ４４　。

ウェル細胞を上記と同様のスクリーニング操作に供して
二次スクリー二、、／夕して、ニュー七シスチス・カリ
ニの栄養型膜抗原及び嚢子膜抗原に強い螢光を与える２
ウエルの細胞を得た。これをＩＦ１２及び２ＧＩＯとす
る。

得られた２ウエル細胞について再度上記選別操作を行な
って目的とする５種の七ツク０−ン株（ＩＦ１２−８、
ＩＦ１２−１１．ｌ’１２−２１．２ＧＩ　Ｏ−３及び
ＩＦ５−８　）を得た。

ｉ）前記（２）の　ｉ）で得た単細胞浮遊液を用い、上
記（３）の　１）と同様に、細胞融合及びクローン化を
行なって、目的とするモノクローン株を得九ｍ）前記（
２）の　爾）で得た単細胞浮遊液を用い、上記（３）の
　１）と同様に細胞融合及びクローン化を行なって、目
的とするモノクローン株を得た。

（４）　スクリーニング（塗抹標本による螢光抗体法）
無螢光スライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＪｄｌ　、　Ｉ
ＮＩ）、　’。

Ｌｔｄ、　）に、ニューモシスチス・カリニ感染ヌード
マウスの肺割面を塗抹し、１０〜１５分風乾後、該スラ
イドクラスに３７°Ｃ下にア七トンを１０分間接触作用
させた。同温度で３０分間乾燥後、スライドクラス上を
冷リン酸塩緩衝液（ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２０９，００
ｆ　５Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２０６４，５４９、Ｎａ
Ｃ１１１６０、Ｏｆ及び蒸留水２０ｇから成る、７　Ｈ
７，１〜７．２ζ以下「ＰＢＳ」と略す）で３〜４回洗
浄し、これに前記（３）の各ウェル内培養細胞上清１０
０μｌを滴下接触させ、七イストチエンバー内で３７℃
下１時間放置して反応させた。次いで上記スライドグラ
スを４℃下に冷ＰＢＳで１時間を要して頻回にＰＢＳを
交換しつつ洗浄した後、これにＰＢＳで２０倍希釈した
ＦＩＴＣ−抗マウスＩｆＧ　ｆ）サイ血清〔〕−ド番号
Ｆ２３２、ＤＡＫＯ社製）　０．１　ｍｌを滴下し、ｔ
イストチエンバー内で３７℃下に１時間放置して反応さ
せた。更に上記と同様にＰＢＳを頻回に交換しつつ冷Ｐ
ＥＳで４％’Ｃ下に１時間を要してスライドクラス上反
応物を洗浄し、シリセリン−ＰＢＳ（９：　１重量比）
混液１滴を加えて反応物を封入し、このスライドグラス
につき、螢光顕微鏡下で螢光の有無乃至強度を鏡検し、
強い螢光のみもれるものを陽性としてスクリーニングし
た。

上記操作はニュー七シスチス・カリニ感染ラット及びヒ
トの肺割面の塗抹標本を用いて同様にして実施された。

また対比のため正常ヌードマウスの肺の塗抹標本をも作
成して同様に行なわれた。

（５）セック０−ン株による本発明抗体の製造１）上記
（４）の　１）のスクリーニング操作によシ強い螢光の
みられたウェル内組１１！（ＩＦ１２−８）を、ｌＯ％
ｐｃｓを加えた７？Ｊ’Ｊ（Ｉ−１６４Ｑ培地で培養し
、そのｌＸ１０７個を１週間前にプリ７、　テｙ　（ｐ
ｒｆｓｔｌＰｌｔ　、アルドリッチ社製）０．５１１ｔ
を腹腔内に投与したＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投
与し、１週間後よ９３回おきに腹水を採取することによ
シ本発明の七ノクロナル抗体（以下抗体Ａと称す）を得
た。

１１）〜■）前記（３）の　１）で得た各セック０−ナ
ル株の夫々を用い、上記（５）の　：）と同様にして腹
水を採取し、下記各七ツクローナル抗体Ｂ〜Ｅの夫々を
得た。

（５）のＩＩ）　ＩＦ１２−１１　抗体Ｂ（５）のＩＩ
Ｉ）　ｌ？＋２−２１　抗体Ｃ（５）ノＩＶ）　２Ｇ１
０−３　抗体Ｄ（５）の°Ｖ）　ＩＦ５−８　抗体Ｅ ｖｌ）上記で製造された抗体Ａの２０ｇ／に最終濃度３
３％になるように飽和硫酸ア：ｊｅニウムを加えて、４
°Ｃで一昼夜攪拌した後、遠沈（ｉｏｏｏ。

ＲＰＭ３０分間）して分離し、沈殿をＰＢＳに溶解し、
ＰＢＳで４日間透析してマウスＩｆＧ分画を得た（以下
この七ツクローナル抗体を抗体Ｆと称す）。

ＶＤ＞　（３）　ノ、　ＩＩ　）ｆ得た’ｆ：）クロｙ
株を用イーｃ（５）ｏｆ）と同様にして腹水を分離して
、本発明の七ツク０−ナル抗体（以下抗体Ｇと称す）を
得た。

Ｖｌｌｌ）　（３）　ノｌｉｔ　）で得たＥ　／　９０
−　ｙ株を用いて（５）ノ１）と同様にして腹水を分離
して、本発明の七ツク０−ナル抗体（以下抗体Ｈと称す
）を得た。

試験例 （１）　ＩｑＧ　ｔプクラスのオクテ０ニイーテスト上
記実施例で得た各ｔツクローナル抗体のサブクラスを、
ラビットで作成した抗マウスＩｆＧ　クラス特異抗体〔
マイルズ社製〕を用いてオクテ〇二イー法に従い検討し
た。

その結果、本発明抗体Ａ、ＥはいずれもＩｆＧ、。

ＩｆＧ２ｔｌ及びＩｑＧ２ｂ　％を含んでいることが確
認された。

（２）　シスト標本を用いた螢光抗体法による解析ニュ
ーモシスチス・カリニのシスト標本に対する本発明抗体
の特異反応性を、前述した螢光抗体法に準じて検索した
。

シスト標本としては、猪飼らの方法〔寄生生学雑誌、第
２８巻第２号、第７１〜８０頁（１９７９年）〕によシ
純化したヌードマウス、ラット及びヒトの肺からのシス
トを用いた。

上記シストの生理食塩水浮遊液１滴（シスト約Ｉ　Ｘ　
１０”個）を無螢光スライドクラスに滴下し、以後実施
例の（４）に示す方法と同様にして風乾、アｔトシ固定
、乾燥、洗浄後、これに本発明ｔツク０−ナル抗体Ａ　
、、−Ｉｆの各々０．１　ｍｌを滴下接触反応させ、引
き続き同様にＰＢＳ洗浄、ＦＩＴＣ−抗マウスＩｆＧ　
ウ＋ｊ千血清との反応、洗浄、封入操作を行ない、螢光
の強度を鏡検した。

その結果、本発明の七ツク０−ナル抗体は、いずれのシ
スト標本に対しても該シストの膜表面に強い螢光が認め
られた。これは添付図面からも明らかである。即ち第１
図は本発明抗体としてＩＥ１２−１１（１００倍希釈）
を選び、ヌードマウス感染肺塗抹標本につき行なった上
記試験結果を示す螢光顕微鏡写真（倍率１０００倍で撮
影）であシ、第２図は本発明抗体としてＩ　Ｅ　Ｉ　２
、−８　（Ｉ　Ｏ０倍希釈）を選び、ヌードマウス感染
肺からのシスト純化法によるシスト標本につき行なった
上記試験結果を示す螢光顕微鏡写真（倍率１０００倍で
撮影）である。いずれの図面においても強い螢光（第１
図では３つの集塊及び第２図では２個のシスト）の認め
られることが判る。

これに対して、対照として正常ヌードマウス、ラット及
びヒトの肺の塗抹標本につき同一操作を繰返した結果、
全く螢光は認められなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明抗体を用いた螢光抗体法によ
る解析結果を示す螢光顕微鏡写真である。 （以　上） 第　１１ズ 手続補正書（７１Ｆ幻 昭和５９年８月２９日 ２・発明０名称　。、、。−す、抗体 ３、補正をする者 ０１か３名） ４、代理人 大阪市東区平野町２の１０沢の鶴ビル電話０６−２０３
−０９４１（代）８、補正の内容 別紙添附の通り 補正の内容 （１）　明細書第２４頁第１４〜１５行「図面の簡単な
説明」の項の記載を次の通９訂正します。 「　第１図及び第２図は、本発明抗体を用ｉた螢光抗体
法によシ螢光が認められる生物試料の形態を示す螢光顕
微鏡写真である・」（以　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ■　ニューモシスチス・カリニ由来抗原で免疫した哺乳
   動物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との融合細胞に
   よシ産生され、二１−℃シスチス・カリニの栄養型膜抗
   原及び嚢子膜抗原に特異反応性を有することを特徴とす
   るｔツク０−ナル抗体。