JPS60239426A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体Info
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- JPS60239426A JPS60239426A JP9527784A JP9527784A JPS60239426A JP S60239426 A JPS60239426 A JP S60239426A JP 9527784 A JP9527784 A JP 9527784A JP 9527784 A JP9527784 A JP 9527784A JP S60239426 A JPS60239426 A JP S60239426A
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- Japan
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- antibody
- cells
- pneumocystis carinii
- antigen
- cyst
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は七ツクローナル抗体、詳しくはニューeシスチ
ス・カリニ (Pntwmogztis tarini
i)の栄養型(trafiktsztpitt )の膜
抗原及び嚢子(cyst)の膜抗原に特異反応性を有す
る七ツク0−ナル抗体に関する。
ス・カリニ (Pntwmogztis tarini
i)の栄養型(trafiktsztpitt )の膜
抗原及び嚢子(cyst)の膜抗原に特異反応性を有す
る七ツク0−ナル抗体に関する。
ニューモシスチス・カリニは、めわゆる日和見感染病原
体(σ戸pσrtunistit pathtqtn
)の一つであシ、広くヒトや他の哺乳動物等の宿主の肺
等に存在しておシ、宿主が健康な場合は不顕性感染の形
をとっているが、例えば宿主が抵抗力の弱い小児、先天
的免疫不全児や白血病やその他の癌の治療のためステ0
イド剤や制癌剤等の投与を受けている場合、また自己免
疫疾患のため免疫抑制剤の長期投与を受けている場合免
疫能が低下するために1肺胞内で急激に増殖して顕在化
し、極めて重篤な肺炎(二l−モシスチス・カリニ肺炎
)を発症させる。この肺炎の診断は通常極めて困難であ
シ、その確定診断は開胸肺生検、閉鎖的肺生検、気管支
鏡的生検等の生検によらねばならず、かかる生検は患者
にとシ大変な侵襲及び苦痛を与え、重篤な患者では困難
である。この様な現状からよシ安全に且つ早期に確実に
上記肺炎の診断を行なうための免疫血清学的診断法の確
立が要望されておシ、神体結合反応を利用する方法や螢
光抗体法の主なものであるため満足な結果は得られてい
ない。また近年上記免疫学的診断のための純粋な抗原を
作製するだめの集シスト法やシスト純化法が確立され〔
猪飼ら、寄生生学雑誌、第28巻、第2号、第71〜8
0頁(1979年)〕、これによシ得られる抗原を用い
たオクテ0ニイ(0uchtzrlony )法や免疫
電気泳動法による抗体の検索技術が試みられた〔灰塚ら
、広大成語、27:315〜326.1979)。しか
し尚診断法としては好成績は得られていない。
体(σ戸pσrtunistit pathtqtn
)の一つであシ、広くヒトや他の哺乳動物等の宿主の肺
等に存在しておシ、宿主が健康な場合は不顕性感染の形
をとっているが、例えば宿主が抵抗力の弱い小児、先天
的免疫不全児や白血病やその他の癌の治療のためステ0
イド剤や制癌剤等の投与を受けている場合、また自己免
疫疾患のため免疫抑制剤の長期投与を受けている場合免
疫能が低下するために1肺胞内で急激に増殖して顕在化
し、極めて重篤な肺炎(二l−モシスチス・カリニ肺炎
)を発症させる。この肺炎の診断は通常極めて困難であ
シ、その確定診断は開胸肺生検、閉鎖的肺生検、気管支
鏡的生検等の生検によらねばならず、かかる生検は患者
にとシ大変な侵襲及び苦痛を与え、重篤な患者では困難
である。この様な現状からよシ安全に且つ早期に確実に
上記肺炎の診断を行なうための免疫血清学的診断法の確
立が要望されておシ、神体結合反応を利用する方法や螢
光抗体法の主なものであるため満足な結果は得られてい
ない。また近年上記免疫学的診断のための純粋な抗原を
作製するだめの集シスト法やシスト純化法が確立され〔
猪飼ら、寄生生学雑誌、第28巻、第2号、第71〜8
0頁(1979年)〕、これによシ得られる抗原を用い
たオクテ0ニイ(0uchtzrlony )法や免疫
電気泳動法による抗体の検索技術が試みられた〔灰塚ら
、広大成語、27:315〜326.1979)。しか
し尚診断法としては好成績は得られていない。
発明の目′的
上記現状に鑑み、本発明者らもニューモシスチス・カリ
ニ肺炎を早期に確実にしかも安全に診断1 できる免疫
学的診断法の確立を目的として鋭意研究を重ねた結果、
患者血中に循環する循環抗原と特異選択的反応性を有し
、該抗原の検出・測定に有効な特定の七ツクローナル抗
体の作成に成功し、ここに本発明を完成するに至った。
ニ肺炎を早期に確実にしかも安全に診断1 できる免疫
学的診断法の確立を目的として鋭意研究を重ねた結果、
患者血中に循環する循環抗原と特異選択的反応性を有し
、該抗原の検出・測定に有効な特定の七ツクローナル抗
体の作成に成功し、ここに本発明を完成するに至った。
発明の構成
即ち本発明は、ニュー七シスチス°カリニ由来抗原で免
疫した哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との
融合細胞によシ産生され、ニューモシスチス・カリニの
栄養型膜抗原及び嚢子膜抗原に特異反応性を有すること
を特徴とする七ツク0−ナル抗体に係る。
疫した哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との
融合細胞によシ産生され、ニューモシスチス・カリニの
栄養型膜抗原及び嚢子膜抗原に特異反応性を有すること
を特徴とする七ツク0−ナル抗体に係る。
本発明の七ツク0−ナル抗体は、後記に詳述する通シ、
特定の免疫細胞と骨髄腫細胞との細胞融合により作成さ
れ、選別されたバイプリドーマの培養によシ得られるこ
と及びニュー七シスチス。
特定の免疫細胞と骨髄腫細胞との細胞融合により作成さ
れ、選別されたバイプリドーマの培養によシ得られるこ
と及びニュー七シスチス。
カリニの栄養型膜抗原及び嚢子膜抗原と特異的に結合す
ることを特徴とする。
ることを特徴とする。
上記本発明抗体は、その特異性を利用して、各種免疫測
定法における特異抗体として利用でき、・これによシ簡
単な操作で容易迅速且つ安全に、し早期診断技術を提供
できる。
定法における特異抗体として利用でき、・これによシ簡
単な操作で容易迅速且つ安全に、し早期診断技術を提供
できる。
以下、本発明上ツク0−ナル抗体の製造法につき詳述す
る。本発明抗体は特定の融合細胞によシ収得される。該
融合細胞を得るだめの一方の親細胞としては・ニューモ
シスチス・カリニ由来抗原で免疫した哺乳動物の免疫細
胞を用いる。該免疫細胞は、ニューモシスチス・カリニ
由来抗原を免疫抗原として用いて通常の方法に従い調製
される。
る。本発明抗体は特定の融合細胞によシ収得される。該
融合細胞を得るだめの一方の親細胞としては・ニューモ
シスチス・カリニ由来抗原で免疫した哺乳動物の免疫細
胞を用いる。該免疫細胞は、ニューモシスチス・カリニ
由来抗原を免疫抗原として用いて通常の方法に従い調製
される。
ここで免疫抗原としてはニュー七シスチス・カリニ病原
体自体シストであってもよく、該病原体で感染した哺乳
動物の感染組織例えば肺組織やその精製物であってもよ
く、更には之等のフラグメントをハづテンとして通常の
方法に従い担体と結合させたものであってもよい。特に
好ましい免疫抗原としてはニューモシスチス・カリニ感
染“哺乳動物の肺よシスト純化法に従って集めたシスト
又は該シストの膜成分分離上清を挙げることができる。
体自体シストであってもよく、該病原体で感染した哺乳
動物の感染組織例えば肺組織やその精製物であってもよ
く、更には之等のフラグメントをハづテンとして通常の
方法に従い担体と結合させたものであってもよい。特に
好ましい免疫抗原としてはニューモシスチス・カリニ感
染“哺乳動物の肺よシスト純化法に従って集めたシスト
又は該シストの膜成分分離上清を挙げることができる。
また上記免疫抗原で免疫する哺乳動物としては特に限定
はないが、細胞融合に用いる他方の親細胞とする骨髄腫
細騨六の適合性を考慮して選択されるのが望ましく、一
般にはマウス、ヌードマウス、ラット等を使用するのが
よい。免疫方法は一般的手法に従うことができ、例えば
上記免疫抗 □原を通常の緩衝液や生理食塩水に懸濁さ
せたものあるいはこれとフロイシドの補助液等との混合
液 。
はないが、細胞融合に用いる他方の親細胞とする骨髄腫
細騨六の適合性を考慮して選択されるのが望ましく、一
般にはマウス、ヌードマウス、ラット等を使用するのが
よい。免疫方法は一般的手法に従うことができ、例えば
上記免疫抗 □原を通常の緩衝液や生理食塩水に懸濁さ
せたものあるいはこれとフロイシドの補助液等との混合
液 。
を哺乳動物に腹腔内、皮下等の適当な経路で投与して一
次刺激後、必要に応じて同様の操作を繰返・せばよい。
次刺激後、必要に応じて同様の操作を繰返・せばよい。
免疫抗原の投与量は、該抗原の種類、投与経路、哺乳動
物の種類等に応じて適宜決定されるが、該抗原としてシ
ストの膜成分分離上清を用いてこれをマウスに腹腔内投
与する場合は、通常線投与量が1回あたシ10μy−I
Ily/マウス程度とするのがよく、病原体自体(シス
ト)を同様に用いる場合は、通常総投与量1回あたシ約
!×105〜lXl06個/マウスとするのが適当であ
る。引き続く細胞融合に用いる免疫細胞は、上記最終投
与の約3日後に摘出した膵臓細胞が好適である。
物の種類等に応じて適宜決定されるが、該抗原としてシ
ストの膜成分分離上清を用いてこれをマウスに腹腔内投
与する場合は、通常線投与量が1回あたシ10μy−I
Ily/マウス程度とするのがよく、病原体自体(シス
ト)を同様に用いる場合は、通常総投与量1回あたシ約
!×105〜lXl06個/マウスとするのが適当であ
る。引き続く細胞融合に用いる免疫細胞は、上記最終投
与の約3日後に摘出した膵臓細胞が好適である。
また上記免疫細胞と融合させる他方の親細胞としての骨
髄腫細胞(、:工0−マ細胞)としては、既に確立され
ている公知の各種細胞株、例えばマウスにおけるNS
l −Ay4/i (Eur、 J、Immttnol
、。
髄腫細胞(、:工0−マ細胞)としては、既に確立され
ている公知の各種細胞株、例えばマウスにおけるNS
l −Ay4/i (Eur、 J、Immttnol
、。
6:511−519(+976))、P3(P3×63
/lf8.6.5.3 ) (、Natxlrl 、
256,495−497(+975))、P 3−U
l (Current Topics inMitro
bioloqy and Immunoloyy 、
31 : l −7(+978))、MPCl 1−
45.6TG1.7 (Cell。
/lf8.6.5.3 ) (、Natxlrl 、
256,495−497(+975))、P 3−U
l (Current Topics inMitro
bioloqy and Immunoloyy 、
31 : l −7(+978))、MPCl 1−
45.6TG1.7 (Cell。
8:405’−415(1976))、S P 210
− A y14CNtltstrt 、276 : 2
69−270(1978))、FO(J、 Itptm
unol、 Mltk、 、 35 : 1−21(+
980))、X 63.6.5.3 (J、 Ivun
ttntpl、 。
− A y14CNtltstrt 、276 : 2
69−270(1978))、FO(J、 Itptm
unol、 Mltk、 、 35 : 1−21(+
980))、X 63.6.5.3 (J、 Ivun
ttntpl、 。
123: 1548−1550(1979))、519
415XX O,BU、l (/、 Ex戸、Med、
、 148:313323(+978))、X45
等や、ラットにおける2 1 Q、 RCY3. Ap
1.2.3(Nature 、 277 :131−1
33(+979))、Y3. Afl、 2.3等をい
ずれも使用できる。
415XX O,BU、l (/、 Ex戸、Med、
、 148:313323(+978))、X45
等や、ラットにおける2 1 Q、 RCY3. Ap
1.2.3(Nature 、 277 :131−1
33(+979))、Y3. Afl、 2.3等をい
ずれも使用できる。
上記免疫細胞と骨髄腫細胞との融合反応は、基本的には
公知の方法、例えばオイ(Oi )及びヘルツエンベル
ク(Htrxtnbtry )の方法(Selecte
dMethods in Ce1lular Immu
noloyy、 351−371、 F、 H,Fre
eman & Co、、USA出版(1980)等に準
じて、融合促進剤の存在下に、通常の栄養培地中で行な
われる。融合促進剤としては通常用いられるポリエチレ
ンクリコール(PEG)やセンダイウィルス(IIVJ
)等を使用でき、更に所望によシ融合効率を高めるため
にジメチルスルホ牛シト等の補助剤を添加使用すること
もできる。免疫細胞と骨髄腫細胞との使用比は、通常の
方法と変シがなく、例えば骨髄腫@胞に対し、免疫細胞
を約1−10倍用いればよい。上記融合時の培地として
は、この種の細胞培養に使用される通常の各種栄養培地
をいずれも使用できるOその代表例としては例えばRP
MI−1640培地、その他ダルベツコ改質MEN培地
等を例示でき、2等培地には通常用られるように例えば
牛胎児血清(FO5)、非必須アミノ酸混合液・じルじ
ン酸ナトリウム、2−メルカプトエタノール等の血液補
液を添加しておくこともできる。融合は、上記免疫細胞
と骨髄腫細胞との所定量を血清を含まない上記培地内で
よく混ぜて遠沈し、上清を除去した後、予め37°C程
度に加温したPEG、例えば平均分子量約1000〜6
000のものを、培地に約30〜60%(F/F) の
濃度とがるように加えたものを細胞の沈渣に滴下して混
ぜ合すことによシ行なわれる。これを37°Cで60秒
ないし数分間反応させ、適当な培地を逐次添加して10
分前後室温におき遠沈し、上清を除去する操作を行なう
ことによシ、所望のハイプリドーマが形成される。
公知の方法、例えばオイ(Oi )及びヘルツエンベル
ク(Htrxtnbtry )の方法(Selecte
dMethods in Ce1lular Immu
noloyy、 351−371、 F、 H,Fre
eman & Co、、USA出版(1980)等に準
じて、融合促進剤の存在下に、通常の栄養培地中で行な
われる。融合促進剤としては通常用いられるポリエチレ
ンクリコール(PEG)やセンダイウィルス(IIVJ
)等を使用でき、更に所望によシ融合効率を高めるため
にジメチルスルホ牛シト等の補助剤を添加使用すること
もできる。免疫細胞と骨髄腫細胞との使用比は、通常の
方法と変シがなく、例えば骨髄腫@胞に対し、免疫細胞
を約1−10倍用いればよい。上記融合時の培地として
は、この種の細胞培養に使用される通常の各種栄養培地
をいずれも使用できるOその代表例としては例えばRP
MI−1640培地、その他ダルベツコ改質MEN培地
等を例示でき、2等培地には通常用られるように例えば
牛胎児血清(FO5)、非必須アミノ酸混合液・じルじ
ン酸ナトリウム、2−メルカプトエタノール等の血液補
液を添加しておくこともできる。融合は、上記免疫細胞
と骨髄腫細胞との所定量を血清を含まない上記培地内で
よく混ぜて遠沈し、上清を除去した後、予め37°C程
度に加温したPEG、例えば平均分子量約1000〜6
000のものを、培地に約30〜60%(F/F) の
濃度とがるように加えたものを細胞の沈渣に滴下して混
ぜ合すことによシ行なわれる。これを37°Cで60秒
ないし数分間反応させ、適当な培地を逐次添加して10
分前後室温におき遠沈し、上清を除去する操作を行なう
ことによシ、所望のハイプリドーマが形成される。
得られる所望ハイプリドーマの分離は、通常の選択用培
地、例えばHAT培地(しボ+サンチン、アミノプテリ
ン及びチ、ニシンを含む培地)を用いて行なわれる。該
HAT培地での細胞培養は、バイプリドーマ以外の細胞
(未融合細胞)が死滅するのに充分な時間、通常数日〜
数週間を要して行なわれる。本発明における上記バイプ
リドーマの選択は、好ましくは、上記HAT培地での培
養後、更に培養物をHTQ地(じホ牛サンチン及びチ三
ジンを含む培地)で数日〜数週間培養することによシ行
なわれる。
地、例えばHAT培地(しボ+サンチン、アミノプテリ
ン及びチ、ニシンを含む培地)を用いて行なわれる。該
HAT培地での細胞培養は、バイプリドーマ以外の細胞
(未融合細胞)が死滅するのに充分な時間、通常数日〜
数週間を要して行なわれる。本発明における上記バイプ
リドーマの選択は、好ましくは、上記HAT培地での培
養後、更に培養物をHTQ地(じホ牛サンチン及びチ三
ジンを含む培地)で数日〜数週間培養することによシ行
なわれる。
かくして得られるハイプリドーマは、通常の限界希釈法
に従い、目的とする抗体の産生株の検索及び単一り0−
ン化を行なわれる。該目的抗体産生株の検索は、ニュー
モシスチス・カリニ栄養型又は嚢子の細胞膜に対する交
互反応性を検討することによシ実施される。その方法は
例えばELISA法(E3tpall 、 E、 、
Myth、 Enxymol、 、 7Q、419−4
39(1980)) 、プラーク法、スポット決、凝集
反応性、オクテ0ニイ法、ラジオイムノアッセイ(RI
A)法等の一般の抗体の検出に利用される各種方法に従
うことができる〔「ハイプリドーマ法とtツク0−ナル
抗体」、株式会社R&Dづラニンジ発行、l’fi30
〜53、昭和57年3月5日〕。より具体的には、ニュ
ーモシスチス・カリニ感染哺乳動物の肺をシスト純化法
〔猪飼itか、寄生虫学雑誌、第28巻、第2号、第7
1−80頁(1979年)〕にて精製したものを、例え
ばコレステ0−ル、レシチシ等を用いてプレートにコー
ティング(塗抹)し、該プレート上で上記ニューモシス
チス・カリニと被検抗体(上記ハイブリドーマの培養上
清)とを反応させ、この反応物の存在を、通常の方法例
えば前記融合にマウスの細胞を用いた場合は、FITC
(フルオレッtインイ′ソチオシアナート)−抗マウス
r−グロブリンを用いた螢光抗体法等により確認する(
上記反応物は螢光色素によシ染色される)。上記バイプ
リドーマの分離及び目的抗体産生株の検索操作は、これ
らを数回繰返して行なうのが望ましく、これにより目的
抗体産生株の単一りO−ン化が行ない得る。
に従い、目的とする抗体の産生株の検索及び単一り0−
ン化を行なわれる。該目的抗体産生株の検索は、ニュー
モシスチス・カリニ栄養型又は嚢子の細胞膜に対する交
互反応性を検討することによシ実施される。その方法は
例えばELISA法(E3tpall 、 E、 、
Myth、 Enxymol、 、 7Q、419−4
39(1980)) 、プラーク法、スポット決、凝集
反応性、オクテ0ニイ法、ラジオイムノアッセイ(RI
A)法等の一般の抗体の検出に利用される各種方法に従
うことができる〔「ハイプリドーマ法とtツク0−ナル
抗体」、株式会社R&Dづラニンジ発行、l’fi30
〜53、昭和57年3月5日〕。より具体的には、ニュ
ーモシスチス・カリニ感染哺乳動物の肺をシスト純化法
〔猪飼itか、寄生虫学雑誌、第28巻、第2号、第7
1−80頁(1979年)〕にて精製したものを、例え
ばコレステ0−ル、レシチシ等を用いてプレートにコー
ティング(塗抹)し、該プレート上で上記ニューモシス
チス・カリニと被検抗体(上記ハイブリドーマの培養上
清)とを反応させ、この反応物の存在を、通常の方法例
えば前記融合にマウスの細胞を用いた場合は、FITC
(フルオレッtインイ′ソチオシアナート)−抗マウス
r−グロブリンを用いた螢光抗体法等により確認する(
上記反応物は螢光色素によシ染色される)。上記バイプ
リドーマの分離及び目的抗体産生株の検索操作は、これ
らを数回繰返して行なうのが望ましく、これにより目的
抗体産生株の単一りO−ン化が行ない得る。
かくして得られる目的抗体産生株(ハイづリドーマ)は
、通常の培地で継代培養でき、また液体窒素中で容易に
長期間安定に保存することができる。該ハイプリドーマ
の代表例は後記実施例に示す通シであり、これは本発明
者らによシ分譲可能な状態で保持されている。
、通常の培地で継代培養でき、また液体窒素中で容易に
長期間安定に保存することができる。該ハイプリドーマ
の代表例は後記実施例に示す通シであり、これは本発明
者らによシ分譲可能な状態で保持されている。
上記ハイプリドーマからの本発明上ツク0−ナル抗体の
製造は、常法に従い該ハイプリドーマを培養し、培養上
清から分離する方法、あるいは上記ハイプリドーマをこ
れと適合性のある哺乳動物に投与し、増殖させ、該動物
の腹水よシ分離する方法等の通常の方法によシ実施でき
る。前者の方法は特に高純度のものを得るのに適してお
シ、後者の方法は大量生産に適している。
製造は、常法に従い該ハイプリドーマを培養し、培養上
清から分離する方法、あるいは上記ハイプリドーマをこ
れと適合性のある哺乳動物に投与し、増殖させ、該動物
の腹水よシ分離する方法等の通常の方法によシ実施でき
る。前者の方法は特に高純度のものを得るのに適してお
シ、後者の方法は大量生産に適している。
上記で製造された本発明の七ツク0−ナル抗体は、更に
精製することもでき、例えば硫安分画法、DEAEtル
0−スカラムクDマドタラフィー等のゲル濾過法などの
通常の分離手段によりIgG画分を単離するととによシ
本発明の七ツクローナル抗体を収得できる。
精製することもでき、例えば硫安分画法、DEAEtル
0−スカラムクDマドタラフィー等のゲル濾過法などの
通常の分離手段によりIgG画分を単離するととによシ
本発明の七ツクローナル抗体を収得できる。
かくして得られる本発明上ツク0−ナル抗体は・後記す
る通シ、ニューモシスチス・カリニの栄養型及び嚢子の
細胞膜抗原と特異選択的に反応するものであシ、その利
用によって二1−℃シスチス・カリニ肺炎の診断、治療
等に有用なものである。
る通シ、ニューモシスチス・カリニの栄養型及び嚢子の
細胞膜抗原と特異選択的に反応するものであシ、その利
用によって二1−℃シスチス・カリニ肺炎の診断、治療
等に有用なものである。
実施例
以下に、実施例及び試験例を挙げ、本発明を更(1)
ニューモシスチス・カリニ抗原の調整1)吉日らの方法
(寄生虫学雑誌VD1.3Q。
ニューモシスチス・カリニ抗原の調整1)吉日らの方法
(寄生虫学雑誌VD1.3Q。
IN戸戸1.(1981)730 )によシ得たニュー
モシスチス・カリニ感染Bal’b/を系スートマウス
の肺を取シ出し、生理食塩水に5%(V/V)となるよ
う懸濁させた後、ウオーリンク プレンター(Wari
ng bltndtr 、日本精機社製)でホモジナイ
ズした。これを生理食塩水で5倍希釈して1%懸濁液と
した。
モシスチス・カリニ感染Bal’b/を系スートマウス
の肺を取シ出し、生理食塩水に5%(V/V)となるよ
う懸濁させた後、ウオーリンク プレンター(Wari
ng bltndtr 、日本精機社製)でホモジナイ
ズした。これを生理食塩水で5倍希釈して1%懸濁液と
した。
l)ニューモシスチス・カリニ感染ラット及び同感染ヒ
トの肺よシスト純化法に従いシストを分離精製し、これ
を生理食塩水に1%(F/F)となるよう懸濁させた。
トの肺よシスト純化法に従いシストを分離精製し、これ
を生理食塩水に1%(F/F)となるよう懸濁させた。
(2)免疫化
1)上記(1)の1) で調製した懸濁液(抗原液)の
1容量部を同量のフロイド完全アジ1バントと混合して
エマルジョンとし、その1 mlをBa1b/C系マウ
スの腹腔内に投与し一次抗原刺激とした。該−次抗原刺
激の40日後に、同一の抗原液のl ttrtを同様に
投与して二次抗原刺激とし、その3日後に免疫されたマ
ウスの牌臓細胞を取り出し、免疫細胞としての単細胞浮
遊液を調整した。
1容量部を同量のフロイド完全アジ1バントと混合して
エマルジョンとし、その1 mlをBa1b/C系マウ
スの腹腔内に投与し一次抗原刺激とした。該−次抗原刺
激の40日後に、同一の抗原液のl ttrtを同様に
投与して二次抗原刺激とし、その3日後に免疫されたマ
ウスの牌臓細胞を取り出し、免疫細胞としての単細胞浮
遊液を調整した。
11)前記の(1)の +1)で得たニュー七シスチス
・カリニ感染ラットよυ分離されたシストの生理食塩水
懸濁液の抗原(5X105個/マウス)をBath l
t系マウスに前記(2)の 1)と同様に免疫化を行な
い、牌臓細胞を取シ出し単細胞浮遊液を調製した。
・カリニ感染ラットよυ分離されたシストの生理食塩水
懸濁液の抗原(5X105個/マウス)をBath l
t系マウスに前記(2)の 1)と同様に免疫化を行な
い、牌臓細胞を取シ出し単細胞浮遊液を調製した。
■)前記(1)の 11)で得たニューモシスチス・カ
リニ感染しト肺よシ分離されたシストの生理食塩水懸濁
液の抗原(5XIO5個/マウス)をBttl b /
c 系マウスに前記(2)の 1)と同様に免疫化を
行ない、牌臓細胞を取シ出し、単細胞浮遊液を調製した
。
リニ感染しト肺よシ分離されたシストの生理食塩水懸濁
液の抗原(5XIO5個/マウス)をBttl b /
c 系マウスに前記(2)の 1)と同様に免疫化を
行ない、牌臓細胞を取シ出し、単細胞浮遊液を調製した
。
(3)細胞融合
1)上記(2)の 1)で得た免疫細胞と、マウス三工
O−マ細胞(戸3X631g8.6.5.3)、〔京都
大学、結核胸部疾患研究所、桂義元教授よシ入手〕とを
1=2となるように混合し、イーグルの培地で洗浄後、
沈渣に50%ポリエチレンクリコール(Mr4000)
を滴下し、37°Cで90秒間イン士ユベートして、3
7°CのRPMI−1640培地を20M/滴下した後
、10分間放置して融合細胞懸濁液を得た。
O−マ細胞(戸3X631g8.6.5.3)、〔京都
大学、結核胸部疾患研究所、桂義元教授よシ入手〕とを
1=2となるように混合し、イーグルの培地で洗浄後、
沈渣に50%ポリエチレンクリコール(Mr4000)
を滴下し、37°Cで90秒間イン士ユベートして、3
7°CのRPMI−1640培地を20M/滴下した後
、10分間放置して融合細胞懸濁液を得た。
予め3時間前にフィーダーとして正常マウス牌臓細胞を
5X105個/ウェル又は正常マウス腹腔細胞を2X1
0”個/ウェルとなるように蒔種調製した96六マイク
ロプレートの各ウェルに、HAT選択培地(10−”M
シボ中サンチン、4×10’Mアミノづテリン、1.6
X 10−5Mチ、ニシン及び10%FC5を含むR
PMI−1640培地)に懸濁した。これに上記融合細
胞懸濁液0.1st(2X105細胞/ウエル)を加え
、2〜3日間隔で各ウェルのHAT培地の牛量を交換し
ながら細胞を増殖させた。2週間後各ウェルの培地をH
T培地(10−”&t、ポ牛サコサンチン、6 X 1
0−5Mチミジン及びlO%FC5を含むPRMI−1
640培地)に交換し、更に1週間細胞の増殖を行なわ
せ、次いで増殖細胞を24穴プレートに移し、lO%F
C5を含むRPMI 164,0培地にて・7日間培養
を継続して、融合細胞の一次スクリーニングを行なった
。該スクリーニングは培養上清を用い、後記する塗抹標
本による螢光抗体法にて、特にニューモシスチス・カリ
ニの栄−養型膜抗原及び嚢子膜抗原に強い螢光を与える
ウェルの細胞を。
5X105個/ウェル又は正常マウス腹腔細胞を2X1
0”個/ウェルとなるように蒔種調製した96六マイク
ロプレートの各ウェルに、HAT選択培地(10−”M
シボ中サンチン、4×10’Mアミノづテリン、1.6
X 10−5Mチ、ニシン及び10%FC5を含むR
PMI−1640培地)に懸濁した。これに上記融合細
胞懸濁液0.1st(2X105細胞/ウエル)を加え
、2〜3日間隔で各ウェルのHAT培地の牛量を交換し
ながら細胞を増殖させた。2週間後各ウェルの培地をH
T培地(10−”&t、ポ牛サコサンチン、6 X 1
0−5Mチミジン及びlO%FC5を含むPRMI−1
640培地)に交換し、更に1週間細胞の増殖を行なわ
せ、次いで増殖細胞を24穴プレートに移し、lO%F
C5を含むRPMI 164,0培地にて・7日間培養
を継続して、融合細胞の一次スクリーニングを行なった
。該スクリーニングは培養上清を用い、後記する塗抹標
本による螢光抗体法にて、特にニューモシスチス・カリ
ニの栄−養型膜抗原及び嚢子膜抗原に強い螢光を与える
ウェルの細胞を。
選び出した。
上記スクリーニングによシ選択された各ウェル細胞を、
次いで上記と同様にフィーターを加えた96穴プレート
の各ウェルに平均0.3個/ウェルでまき、■0%FC
5を含むRPNI−1640培地で2週間培養し、培養
されfc44 。
次いで上記と同様にフィーターを加えた96穴プレート
の各ウェルに平均0.3個/ウェルでまき、■0%FC
5を含むRPNI−1640培地で2週間培養し、培養
されfc44 。
ウェル細胞を上記と同様のスクリーニング操作に供して
二次スクリー二、、/夕して、ニュー七シスチス・カリ
ニの栄養型膜抗原及び嚢子膜抗原に強い螢光を与える2
ウエルの細胞を得た。これをIF12及び2GIOとす
る。
二次スクリー二、、/夕して、ニュー七シスチス・カリ
ニの栄養型膜抗原及び嚢子膜抗原に強い螢光を与える2
ウエルの細胞を得た。これをIF12及び2GIOとす
る。
得られた2ウエル細胞について再度上記選別操作を行な
って目的とする5種の七ツク0−ン株(IF12−8、
IF12−11.l’12−21.2GI O−3及び
IF5−8 )を得た。
って目的とする5種の七ツク0−ン株(IF12−8、
IF12−11.l’12−21.2GI O−3及び
IF5−8 )を得た。
i)前記(2)の i)で得た単細胞浮遊液を用い、上
記(3)の 1)と同様に、細胞融合及びクローン化を
行なって、目的とするモノクローン株を得九m)前記(
2)の 爾)で得た単細胞浮遊液を用い、上記(3)の
1)と同様に細胞融合及びクローン化を行なって、目
的とするモノクローン株を得た。
記(3)の 1)と同様に、細胞融合及びクローン化を
行なって、目的とするモノクローン株を得九m)前記(
2)の 爾)で得た単細胞浮遊液を用い、上記(3)の
1)と同様に細胞融合及びクローン化を行なって、目
的とするモノクローン株を得た。
(4) スクリーニング(塗抹標本による螢光抗体法)
無螢光スライドグラス(MATSUNAJdl 、 I
NI)、 ’。
無螢光スライドグラス(MATSUNAJdl 、 I
NI)、 ’。
Ltd、 )に、ニューモシスチス・カリニ感染ヌード
マウスの肺割面を塗抹し、10〜15分風乾後、該スラ
イドクラスに37°C下にア七トンを10分間接触作用
させた。同温度で30分間乾燥後、スライドクラス上を
冷リン酸塩緩衝液(NaH2PO4・2H209,00
f 5Na2HPO4・12H2064,549、Na
C11160、Of及び蒸留水20gから成る、7 H
7,1〜7.2ζ以下「PBS」と略す)で3〜4回洗
浄し、これに前記(3)の各ウェル内培養細胞上清10
0μlを滴下接触させ、七イストチエンバー内で37℃
下1時間放置して反応させた。次いで上記スライドグラ
スを4℃下に冷PBSで1時間を要して頻回にPBSを
交換しつつ洗浄した後、これにPBSで20倍希釈した
FITC−抗マウスIfG f)サイ血清〔〕−ド番号
F232、DAKO社製) 0.1 mlを滴下し、t
イストチエンバー内で37℃下に1時間放置して反応さ
せた。更に上記と同様にPBSを頻回に交換しつつ冷P
ESで4%’C下に1時間を要してスライドクラス上反
応物を洗浄し、シリセリン−PBS(9: 1重量比)
混液1滴を加えて反応物を封入し、このスライドグラス
につき、螢光顕微鏡下で螢光の有無乃至強度を鏡検し、
強い螢光のみもれるものを陽性としてスクリーニングし
た。
マウスの肺割面を塗抹し、10〜15分風乾後、該スラ
イドクラスに37°C下にア七トンを10分間接触作用
させた。同温度で30分間乾燥後、スライドクラス上を
冷リン酸塩緩衝液(NaH2PO4・2H209,00
f 5Na2HPO4・12H2064,549、Na
C11160、Of及び蒸留水20gから成る、7 H
7,1〜7.2ζ以下「PBS」と略す)で3〜4回洗
浄し、これに前記(3)の各ウェル内培養細胞上清10
0μlを滴下接触させ、七イストチエンバー内で37℃
下1時間放置して反応させた。次いで上記スライドグラ
スを4℃下に冷PBSで1時間を要して頻回にPBSを
交換しつつ洗浄した後、これにPBSで20倍希釈した
FITC−抗マウスIfG f)サイ血清〔〕−ド番号
F232、DAKO社製) 0.1 mlを滴下し、t
イストチエンバー内で37℃下に1時間放置して反応さ
せた。更に上記と同様にPBSを頻回に交換しつつ冷P
ESで4%’C下に1時間を要してスライドクラス上反
応物を洗浄し、シリセリン−PBS(9: 1重量比)
混液1滴を加えて反応物を封入し、このスライドグラス
につき、螢光顕微鏡下で螢光の有無乃至強度を鏡検し、
強い螢光のみもれるものを陽性としてスクリーニングし
た。
上記操作はニュー七シスチス・カリニ感染ラット及びヒ
トの肺割面の塗抹標本を用いて同様にして実施された。
トの肺割面の塗抹標本を用いて同様にして実施された。
また対比のため正常ヌードマウスの肺の塗抹標本をも作
成して同様に行なわれた。
成して同様に行なわれた。
(5)セック0−ン株による本発明抗体の製造1)上記
(4)の 1)のスクリーニング操作によシ強い螢光の
みられたウェル内組11!(IF12−8)を、lO%
pcsを加えた7?J’J(I−164Q培地で培養し
、そのlX107個を1週間前にプリ7、 テy (p
rfstlPlt 、アルドリッチ社製)0.511t
を腹腔内に投与したBALB/C系マウスの腹腔内に投
与し、1週間後よ93回おきに腹水を採取することによ
シ本発明の七ノクロナル抗体(以下抗体Aと称す)を得
た。
(4)の 1)のスクリーニング操作によシ強い螢光の
みられたウェル内組11!(IF12−8)を、lO%
pcsを加えた7?J’J(I−164Q培地で培養し
、そのlX107個を1週間前にプリ7、 テy (p
rfstlPlt 、アルドリッチ社製)0.511t
を腹腔内に投与したBALB/C系マウスの腹腔内に投
与し、1週間後よ93回おきに腹水を採取することによ
シ本発明の七ノクロナル抗体(以下抗体Aと称す)を得
た。
11)〜■)前記(3)の 1)で得た各セック0−ナ
ル株の夫々を用い、上記(5)の :)と同様にして腹
水を採取し、下記各七ツクローナル抗体B〜Eの夫々を
得た。
ル株の夫々を用い、上記(5)の :)と同様にして腹
水を採取し、下記各七ツクローナル抗体B〜Eの夫々を
得た。
(5)のII) IF12−11 抗体B(5)のII
I) l?+2−21 抗体C(5)ノIV) 2G1
0−3 抗体D(5)の°V) IF5−8 抗体E vl)上記で製造された抗体Aの20g/に最終濃度3
3%になるように飽和硫酸ア:jeニウムを加えて、4
°Cで一昼夜攪拌した後、遠沈(iooo。
I) l?+2−21 抗体C(5)ノIV) 2G1
0−3 抗体D(5)の°V) IF5−8 抗体E vl)上記で製造された抗体Aの20g/に最終濃度3
3%になるように飽和硫酸ア:jeニウムを加えて、4
°Cで一昼夜攪拌した後、遠沈(iooo。
RPM30分間)して分離し、沈殿をPBSに溶解し、
PBSで4日間透析してマウスIfG分画を得た(以下
この七ツクローナル抗体を抗体Fと称す)。
PBSで4日間透析してマウスIfG分画を得た(以下
この七ツクローナル抗体を抗体Fと称す)。
VD> (3) ノ、 II )f得た’f:)クロy
株を用イーc(5)of)と同様にして腹水を分離して
、本発明の七ツク0−ナル抗体(以下抗体Gと称す)を
得た。
株を用イーc(5)of)と同様にして腹水を分離して
、本発明の七ツク0−ナル抗体(以下抗体Gと称す)を
得た。
Vlll) (3) ノlit )で得たE / 90
− y株を用いて(5)ノ1)と同様にして腹水を分離
して、本発明の七ツク0−ナル抗体(以下抗体Hと称す
)を得た。
− y株を用いて(5)ノ1)と同様にして腹水を分離
して、本発明の七ツク0−ナル抗体(以下抗体Hと称す
)を得た。
試験例
(1) IqG tプクラスのオクテ0ニイーテスト上
記実施例で得た各tツクローナル抗体のサブクラスを、
ラビットで作成した抗マウスIfG クラス特異抗体〔
マイルズ社製〕を用いてオクテ〇二イー法に従い検討し
た。
記実施例で得た各tツクローナル抗体のサブクラスを、
ラビットで作成した抗マウスIfG クラス特異抗体〔
マイルズ社製〕を用いてオクテ〇二イー法に従い検討し
た。
その結果、本発明抗体A、EはいずれもIfG、。
IfG2tl及びIqG2b %を含んでいることが確
認された。
認された。
(2) シスト標本を用いた螢光抗体法による解析ニュ
ーモシスチス・カリニのシスト標本に対する本発明抗体
の特異反応性を、前述した螢光抗体法に準じて検索した
。
ーモシスチス・カリニのシスト標本に対する本発明抗体
の特異反応性を、前述した螢光抗体法に準じて検索した
。
シスト標本としては、猪飼らの方法〔寄生生学雑誌、第
28巻第2号、第71〜80頁(1979年)〕によシ
純化したヌードマウス、ラット及びヒトの肺からのシス
トを用いた。
28巻第2号、第71〜80頁(1979年)〕によシ
純化したヌードマウス、ラット及びヒトの肺からのシス
トを用いた。
上記シストの生理食塩水浮遊液1滴(シスト約I X
10”個)を無螢光スライドクラスに滴下し、以後実施
例の(4)に示す方法と同様にして風乾、アtトシ固定
、乾燥、洗浄後、これに本発明tツク0−ナル抗体A
、、−Ifの各々0.1 mlを滴下接触反応させ、引
き続き同様にPBS洗浄、FITC−抗マウスIfG
ウ+j千血清との反応、洗浄、封入操作を行ない、螢光
の強度を鏡検した。
10”個)を無螢光スライドクラスに滴下し、以後実施
例の(4)に示す方法と同様にして風乾、アtトシ固定
、乾燥、洗浄後、これに本発明tツク0−ナル抗体A
、、−Ifの各々0.1 mlを滴下接触反応させ、引
き続き同様にPBS洗浄、FITC−抗マウスIfG
ウ+j千血清との反応、洗浄、封入操作を行ない、螢光
の強度を鏡検した。
その結果、本発明の七ツク0−ナル抗体は、いずれのシ
スト標本に対しても該シストの膜表面に強い螢光が認め
られた。これは添付図面からも明らかである。即ち第1
図は本発明抗体としてIE12−11(100倍希釈)
を選び、ヌードマウス感染肺塗抹標本につき行なった上
記試験結果を示す螢光顕微鏡写真(倍率1000倍で撮
影)であシ、第2図は本発明抗体としてI E I 2
、−8 (I O0倍希釈)を選び、ヌードマウス感染
肺からのシスト純化法によるシスト標本につき行なった
上記試験結果を示す螢光顕微鏡写真(倍率1000倍で
撮影)である。いずれの図面においても強い螢光(第1
図では3つの集塊及び第2図では2個のシスト)の認め
られることが判る。
スト標本に対しても該シストの膜表面に強い螢光が認め
られた。これは添付図面からも明らかである。即ち第1
図は本発明抗体としてIE12−11(100倍希釈)
を選び、ヌードマウス感染肺塗抹標本につき行なった上
記試験結果を示す螢光顕微鏡写真(倍率1000倍で撮
影)であシ、第2図は本発明抗体としてI E I 2
、−8 (I O0倍希釈)を選び、ヌードマウス感染
肺からのシスト純化法によるシスト標本につき行なった
上記試験結果を示す螢光顕微鏡写真(倍率1000倍で
撮影)である。いずれの図面においても強い螢光(第1
図では3つの集塊及び第2図では2個のシスト)の認め
られることが判る。
これに対して、対照として正常ヌードマウス、ラット及
びヒトの肺の塗抹標本につき同一操作を繰返した結果、
全く螢光は認められなかった。
びヒトの肺の塗抹標本につき同一操作を繰返した結果、
全く螢光は認められなかった。
第1図及び第2図は本発明抗体を用いた螢光抗体法によ
る解析結果を示す螢光顕微鏡写真である。 (以 上) 第 11ズ 手続補正書(71F幻 昭和59年8月29日 2・発明0名称 。、、。−す、抗体 3、補正をする者 01か3名) 4、代理人 大阪市東区平野町2の10沢の鶴ビル電話06−203
−0941(代)8、補正の内容 別紙添附の通り 補正の内容 (1) 明細書第24頁第14〜15行「図面の簡単な
説明」の項の記載を次の通9訂正します。 「 第1図及び第2図は、本発明抗体を用iた螢光抗体
法によシ螢光が認められる生物試料の形態を示す螢光顕
微鏡写真である・」(以 上)
る解析結果を示す螢光顕微鏡写真である。 (以 上) 第 11ズ 手続補正書(71F幻 昭和59年8月29日 2・発明0名称 。、、。−す、抗体 3、補正をする者 01か3名) 4、代理人 大阪市東区平野町2の10沢の鶴ビル電話06−203
−0941(代)8、補正の内容 別紙添附の通り 補正の内容 (1) 明細書第24頁第14〜15行「図面の簡単な
説明」の項の記載を次の通9訂正します。 「 第1図及び第2図は、本発明抗体を用iた螢光抗体
法によシ螢光が認められる生物試料の形態を示す螢光顕
微鏡写真である・」(以 上)
Claims (1)
- ■ ニューモシスチス・カリニ由来抗原で免疫した哺乳
動物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との融合細胞に
よシ産生され、二1−℃シスチス・カリニの栄養型膜抗
原及び嚢子膜抗原に特異反応性を有することを特徴とす
るtツク0−ナル抗体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9527784A JPS60239426A (ja) | 1984-05-11 | 1984-05-11 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9527784A JPS60239426A (ja) | 1984-05-11 | 1984-05-11 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60239426A true JPS60239426A (ja) | 1985-11-28 |
Family
ID=14133276
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9527784A Pending JPS60239426A (ja) | 1984-05-11 | 1984-05-11 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS60239426A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4925800A (en) * | 1986-12-04 | 1990-05-15 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibody against human pneumocystis carinii |
-
1984
- 1984-05-11 JP JP9527784A patent/JPS60239426A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4925800A (en) * | 1986-12-04 | 1990-05-15 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibody against human pneumocystis carinii |
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