JP2627587B2 - 組換えdna、組換えベクター、細胞及びn−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質の取得法 - Google Patents
組換えdna、組換えベクター、細胞及びn−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質の取得法Info
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- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、組換えDNA、組換え
ベクター、細胞、N−カルバモイルサルコシン−アミド
ヒドロラーゼ活性を有するタンパク質の取得法に関す
る。
ベクター、細胞、N−カルバモイルサルコシン−アミド
ヒドロラーゼ活性を有するタンパク質の取得法に関す
る。
【0002】酵素のN−カルバモイルサルコシン−アミ
ドヒドロラーゼ(CSHアーゼ)は液体中のクレアチニ
ン含量を測定するのに必要である。クレアチニンは腎臓
を診断するための基本的パラメータである。全世界で1
年間に約十億回試験が行なわれる。それ故、コスト的に
有利な酵素CSHアーゼの調製並びに問題のない醗酵の
可能性はクレアチニン測定用診断キットを製造するため
の基本的な前提条件である。
ドヒドロラーゼ(CSHアーゼ)は液体中のクレアチニ
ン含量を測定するのに必要である。クレアチニンは腎臓
を診断するための基本的パラメータである。全世界で1
年間に約十億回試験が行なわれる。それ故、コスト的に
有利な酵素CSHアーゼの調製並びに問題のない醗酵の
可能性はクレアチニン測定用診断キットを製造するため
の基本的な前提条件である。
【0003】
【従来の技術】CSHアーゼは分子量約35kD(サブ
ユニット)、KM3×10-3mol/l及び比活性2U
/mgを有するタンパク質である。従来CSHアーゼは
アルトロバクター(Arthrobacter)から得
られた(EC3.5.1.59)。この方法の欠点は、
アルトロバクターの複雑な栄養素要求及び富化する際に
得られる低い酵素活性100〜200U/lである。
ユニット)、KM3×10-3mol/l及び比活性2U
/mgを有するタンパク質である。従来CSHアーゼは
アルトロバクター(Arthrobacter)から得
られた(EC3.5.1.59)。この方法の欠点は、
アルトロバクターの複雑な栄養素要求及び富化する際に
得られる低い酵素活性100〜200U/lである。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】それ故、本発明の課題
は、CSHアーゼの良好な富化法を開示することにより
技術水準の欠点を少なくとも一部解消することであっ
た。
は、CSHアーゼの良好な富化法を開示することにより
技術水準の欠点を少なくとも一部解消することであっ
た。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は組換えD
NAであり、これは (1) SEQ ID NO:1 配列の長さ:795塩基対 配列の種類:ヌクレオチド配列(CSHアーゼ配列)
NAであり、これは (1) SEQ ID NO:1 配列の長さ:795塩基対 配列の種類:ヌクレオチド配列(CSHアーゼ配列)
【0006】
【化2】
【0007】で表される配列、 (2) SEQ ID NO:1の配列もしくはその相
補配列と厳しいハイブリッド化条件下にハイブリダイズ
する天然の配列、又は (3) (1)又は(2)の配列がコードするアミノ酸
に対応する1個のコドンが、同じアミノ酸をコードする
他の1個のコドンにより代えられていてよい配列を有
し、その際にこのDNA配列はN−カルバモイルサルコ
シン−アミドヒドロラーゼ活性を含有するタンパク質を
コードする。
補配列と厳しいハイブリッド化条件下にハイブリダイズ
する天然の配列、又は (3) (1)又は(2)の配列がコードするアミノ酸
に対応する1個のコドンが、同じアミノ酸をコードする
他の1個のコドンにより代えられていてよい配列を有
し、その際にこのDNA配列はN−カルバモイルサルコ
シン−アミドヒドロラーゼ活性を含有するタンパク質を
コードする。
【0008】SEQ ID NO:1で表わされる本発
明によるDNAはN−カルバモイルサルコシン−アミド
ヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードし、この
タンパク質は次の配列表で表わされるアミノ酸配列を有
する: SEQ ID NO:2 配列の長さ:264アミノ酸 配列の種類:アミノ酸配列(CSHアーゼタンパク質配
列)
明によるDNAはN−カルバモイルサルコシン−アミド
ヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードし、この
タンパク質は次の配列表で表わされるアミノ酸配列を有
する: SEQ ID NO:2 配列の長さ:264アミノ酸 配列の種類:アミノ酸配列(CSHアーゼタンパク質配
列)
【0009】
【化3】
【0010】本発明は、SEQ ID NO:1で表わ
される配列に相応する、アミノ酸に関する1個のコドン
が同じアミノ酸をコードする他の1個のコドンにより代
えられていてよいDNA配列も包含し、その際にその変
化がクローン化に使用したその都度の宿主生物、特に
E.コリ(coli)中で改良されたコドンの選択性を
もたらすと有利である。それぞれの宿主生物に好適なコ
ドンの選択性は当業者に知られている。
される配列に相応する、アミノ酸に関する1個のコドン
が同じアミノ酸をコードする他の1個のコドンにより代
えられていてよいDNA配列も包含し、その際にその変
化がクローン化に使用したその都度の宿主生物、特に
E.コリ(coli)中で改良されたコドンの選択性を
もたらすと有利である。それぞれの宿主生物に好適なコ
ドンの選択性は当業者に知られている。
【0011】更に、本発明は厳しいハイブリッド化条件
下にSEQ ID NO:1で表わされる配列もしくは
その相補配列とハイブリダイズする天然のDNA配列並
びにこのDNA配列に相応する、アミノ酸に関する1個
のコドンが同じアミノ酸をコードする他の1個のコドン
により代えられていてよいDNA配列を目的とする。厳
しいハイブリッド化条件下にハイブリダイズするとは本
発明では、ハイブリッド化シグナルが高い温度、特に6
5℃で及び/又は僅少量の塩を含有する緩衝液中で洗浄
した後でも生じる場合を表わす[Maniatis及び
その他共著、“Molecular Cloning,
A laboratory manual”, Col
d Spring Harbor Laborator
y ,New York在(1982年)も参照]。
下にSEQ ID NO:1で表わされる配列もしくは
その相補配列とハイブリダイズする天然のDNA配列並
びにこのDNA配列に相応する、アミノ酸に関する1個
のコドンが同じアミノ酸をコードする他の1個のコドン
により代えられていてよいDNA配列を目的とする。厳
しいハイブリッド化条件下にハイブリダイズするとは本
発明では、ハイブリッド化シグナルが高い温度、特に6
5℃で及び/又は僅少量の塩を含有する緩衝液中で洗浄
した後でも生じる場合を表わす[Maniatis及び
その他共著、“Molecular Cloning,
A laboratory manual”, Col
d Spring Harbor Laborator
y ,New York在(1982年)も参照]。
【0012】N−カルバモイルサルコシン−アミドヒド
ロラーゼ活性を有するタンパク質には、本発明ではSE
Q ID NO:2で表わされるアミノ酸配列と共に、
それぞれのアミノ酸の欠失、挿入及び/又は変換により
並びに1個又は数個の他のポリペプチドドメイン(融合
タンパク質で生じる)との結合により得られる前記アミ
ノ酸の変異体及び誘導体も挙げられる。
ロラーゼ活性を有するタンパク質には、本発明ではSE
Q ID NO:2で表わされるアミノ酸配列と共に、
それぞれのアミノ酸の欠失、挿入及び/又は変換により
並びに1個又は数個の他のポリペプチドドメイン(融合
タンパク質で生じる)との結合により得られる前記アミ
ノ酸の変異体及び誘導体も挙げられる。
【0013】本発明による組換えDNAは、アルトロバ
クターDNAフラグメントを宿主生物、殊にE.コリ中
にクローニングしかつこの得られたクローンを直接遺伝
子発現に関して選択することにより得られる。有利に
は、CSHアーゼをコードするクローンの同定は平板活
性試験を介して行なうことができる。そのために、ホス
フェート緩衝処理したアガロース中のサルコシンオキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、N−カルバモイル−サルコ
シン、4−アミノアンチピリン及びトリブロム−3−ヒ
ドロキシ安息香酸を培地に添加する。測定原理は次の通
りである:プラス(positiv)・クローンから発
現したCSHアーゼは添加したN−カルバモイル−サル
コシンをサルコシンに変換し、これはサルコシンオキシ
ダーゼによりグリシン、ホルムアルデヒド及び過酸化水
素に分解される。ペルオキシダーゼが生成した過酸化水
素と共に、添加した染料基質を酸化的結合により暗紫色
の色素に変換する。このようにしてプラス・クローンを
呈色により確認する。
クターDNAフラグメントを宿主生物、殊にE.コリ中
にクローニングしかつこの得られたクローンを直接遺伝
子発現に関して選択することにより得られる。有利に
は、CSHアーゼをコードするクローンの同定は平板活
性試験を介して行なうことができる。そのために、ホス
フェート緩衝処理したアガロース中のサルコシンオキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、N−カルバモイル−サルコ
シン、4−アミノアンチピリン及びトリブロム−3−ヒ
ドロキシ安息香酸を培地に添加する。測定原理は次の通
りである:プラス(positiv)・クローンから発
現したCSHアーゼは添加したN−カルバモイル−サル
コシンをサルコシンに変換し、これはサルコシンオキシ
ダーゼによりグリシン、ホルムアルデヒド及び過酸化水
素に分解される。ペルオキシダーゼが生成した過酸化水
素と共に、添加した染料基質を酸化的結合により暗紫色
の色素に変換する。このようにしてプラス・クローンを
呈色により確認する。
【0014】従って、本発明の1つの目的は、請求項1
による組換えDNAのコピー少なくとも1個を異種挿入
として含有する組換えベクターでもある。本発明による
ベクターは真核性又は原核性ベクターであってもよくあ
るいは真核生物及びまた原核生物中で発現可能なベクタ
ーであってもよい。原核性のベクターが有利である。更
に、本発明によるベクターは、宿主細胞中で染色体外に
存在するか又は宿主細胞染色体中に統合されていてよ
い。宿主細胞のゲノム中に統合されるベクターは例えば
E.コリ細胞中のバクテリオファージλベクターであ
る。染色体外に存在するベクターの例はプラスミドであ
る。本発明によるベクターがプラスミドであると有利で
ある。
による組換えDNAのコピー少なくとも1個を異種挿入
として含有する組換えベクターでもある。本発明による
ベクターは真核性又は原核性ベクターであってもよくあ
るいは真核生物及びまた原核生物中で発現可能なベクタ
ーであってもよい。原核性のベクターが有利である。更
に、本発明によるベクターは、宿主細胞中で染色体外に
存在するか又は宿主細胞染色体中に統合されていてよ
い。宿主細胞のゲノム中に統合されるベクターは例えば
E.コリ細胞中のバクテリオファージλベクターであ
る。染色体外に存在するベクターの例はプラスミドであ
る。本発明によるベクターがプラスミドであると有利で
ある。
【0015】E.コリ中にクローニングした長さ5kb
のアルトロバクターDNAフラグメントによるCSHア
ーゼの発現が著しく不安定であることが明らかになっ
た。24時間後にはもはや元のプラス・クローン中でC
SHアーゼの発現を検出することができなかった。しか
しながらアルトロバクターDNAフラグメントを1.3
kbの長さに短縮した後ではその不安定性を解消できる
ことが明らかに驚異的であった。それ故、本発明による
組換えベクター中の異種挿入体の長さは1.3kbより
も長くはない。
のアルトロバクターDNAフラグメントによるCSHア
ーゼの発現が著しく不安定であることが明らかになっ
た。24時間後にはもはや元のプラス・クローン中でC
SHアーゼの発現を検出することができなかった。しか
しながらアルトロバクターDNAフラグメントを1.3
kbの長さに短縮した後ではその不安定性を解消できる
ことが明らかに驚異的であった。それ故、本発明による
組換えベクター中の異種挿入体の長さは1.3kbより
も長くはない。
【0016】本発明によるベクター上に異種挿入体は、
有利に本発明によるベクターで形質転換された宿主生物
中でCSHアーゼ発現を可能にするように発現シグナル
の制御下に存在する。この発現シグナルはその都度使用
する宿主生物に好適でなければならない。特に優れた
E.コリ中での発現には一方で誘導性発現シグナルが好
適である。例えば公知の誘導性E.コリプロモータのl
ac,tac又はtrpあるいは殊にE.コリベクター
に対して異種である発現シグナルであるサルモネラ−プ
ロモータmgl(WO 88/09373)を使用する
ことができる。
有利に本発明によるベクターで形質転換された宿主生物
中でCSHアーゼ発現を可能にするように発現シグナル
の制御下に存在する。この発現シグナルはその都度使用
する宿主生物に好適でなければならない。特に優れた
E.コリ中での発現には一方で誘導性発現シグナルが好
適である。例えば公知の誘導性E.コリプロモータのl
ac,tac又はtrpあるいは殊にE.コリベクター
に対して異種である発現シグナルであるサルモネラ−プ
ロモータmgl(WO 88/09373)を使用する
ことができる。
【0017】他方では、挿入体に対して同種である発現
シグナル、即ちアルトロバクターに由来する発現シグナ
ルも好適であることが明らかになり驚異的であった。N
−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝子
の真正プロモータ又はそれから誘導した配列を使用する
と特に優れており、これはE.コリ中で非常に高い活性
を示し驚異的である。
シグナル、即ちアルトロバクターに由来する発現シグナ
ルも好適であることが明らかになり驚異的であった。N
−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝子
の真正プロモータ又はそれから誘導した配列を使用する
と特に優れており、これはE.コリ中で非常に高い活性
を示し驚異的である。
【0018】このプロモータ領域は373塩基対のDN
Aフラグメント上に含まれていて、次の配列表で表わさ
れる: SEQ ID NO:3 配列の長さ:373塩基対 配列の種類:ヌクレオチド配列(CSHアーゼ:5′非
翻訳領域:−373〜−1)
Aフラグメント上に含まれていて、次の配列表で表わさ
れる: SEQ ID NO:3 配列の長さ:373塩基対 配列の種類:ヌクレオチド配列(CSHアーゼ:5′非
翻訳領域:−373〜−1)
【0019】
【化4】
【0020】この373bpのフラグメントばかりでな
く、短いフラグメント又はそのフラグメントから誘導し
たフラグメントもプロモータ特性を有することが確認さ
れた。
く、短いフラグメント又はそのフラグメントから誘導し
たフラグメントもプロモータ特性を有することが確認さ
れた。
【0021】更に、本発明の目的は、本発明によるDN
A又は本発明によるベクターで形質転換されている細胞
である。殊にこの細胞は細菌細胞であり、E.コリ細胞
が特に優れている。
A又は本発明によるベクターで形質転換されている細胞
である。殊にこの細胞は細菌細胞であり、E.コリ細胞
が特に優れている。
【0022】更に、本発明の目的は、(1)宿主細胞を
本発明によるDNA又はベクターにより形質転換して、
N−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝
子のコピー少なくとも1つを含有する形質転換宿主細胞
を形成し、(2)形質転換宿主細胞を好適な培地中で培
養し、(3) 形質転換宿主細胞中のN−カルバモイル
サルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝子を発現させ、か
つ(4) 発現生成物を培地又は宿主細胞から取得す
る、N−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ
活性を有するタンパク質の取得法である。
本発明によるDNA又はベクターにより形質転換して、
N−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝
子のコピー少なくとも1つを含有する形質転換宿主細胞
を形成し、(2)形質転換宿主細胞を好適な培地中で培
養し、(3) 形質転換宿主細胞中のN−カルバモイル
サルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝子を発現させ、か
つ(4) 発現生成物を培地又は宿主細胞から取得す
る、N−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ
活性を有するタンパク質の取得法である。
【0023】宿主細胞の形質転換及び形質転換宿主細胞
の培養は分子生物学の分野で当業者に公知の方法により
行なうことができる。形質転換宿主細胞中でのN−カル
バモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝子の発現
は、誘導性発現シグナルを適用する場合は誘導工程によ
りあるいは構成的に行なう。培地又は宿主細胞からの発
現生成物の富化は、ヨーロッパ特許公開第011257
1号明細書の例2bに記載されているように、DEAE
−セファデックス及びフェニル−セファロース−クロマ
トグラフィを介して細胞を砕解し、引続いて硫酸アンモ
ニウムで沈降させることにより行なうと有利である。
の培養は分子生物学の分野で当業者に公知の方法により
行なうことができる。形質転換宿主細胞中でのN−カル
バモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝子の発現
は、誘導性発現シグナルを適用する場合は誘導工程によ
りあるいは構成的に行なう。培地又は宿主細胞からの発
現生成物の富化は、ヨーロッパ特許公開第011257
1号明細書の例2bに記載されているように、DEAE
−セファデックス及びフェニル−セファロース−クロマ
トグラフィを介して細胞を砕解し、引続いて硫酸アンモ
ニウムで沈降させることにより行なうと有利である。
【0024】本発明方法で宿主細胞としてE.コリ細菌
を使うと有利である。更に、N−カルバモイルサルコシ
ン−アミドヒドロラーゼ遺伝子を含有する異種挿入体の
長さが1.3kb以下であるベクターの使用は優れてい
る。N−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ
遺伝子の発現が真正プロモータ又はその誘導配列の制御
下に行なわれるベクターの使用は特に優れている。その
ようなベクターの例はpBM62である(図3)。
を使うと有利である。更に、N−カルバモイルサルコシ
ン−アミドヒドロラーゼ遺伝子を含有する異種挿入体の
長さが1.3kb以下であるベクターの使用は優れてい
る。N−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ
遺伝子の発現が真正プロモータ又はその誘導配列の制御
下に行なわれるベクターの使用は特に優れている。その
ようなベクターの例はpBM62である(図3)。
【0025】更に本発明の目的は、本発明方法により得
られる、N−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラ
ーゼ活性を有するタンパク質である。このようなタンパ
ク質がSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を
有すると有利である。このタンパク質の誘導体及び変異
体も本発明方法により得られる。
られる、N−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラ
ーゼ活性を有するタンパク質である。このようなタンパ
ク質がSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を
有すると有利である。このタンパク質の誘導体及び変異
体も本発明方法により得られる。
【0026】更に、本発明は本発明によるタンパク質を
クレアチニンの測定に使用することでありかつN−カル
バモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ活性を有する
本発明によるタンパク質を含有するクレアチニン測定試
薬に関する。
クレアチニンの測定に使用することでありかつN−カル
バモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ活性を有する
本発明によるタンパク質を含有するクレアチニン測定試
薬に関する。
【0027】
【実施例】次に本発明を配列表及び図1〜図3に関連し
て実施例により詳説する。
て実施例により詳説する。
【0028】 SEQ ID NO:1 CSHアーゼ遺伝子のDNA配列 SEQ ID NO:2 CSHアーゼのアミノ酸配列 SEQ ID NO:3 CSHアーゼ遺伝子のプロモータとして有効な DNAフラグメント 図1は安定なプラスミドpCSHアーゼIIIを欠失に
よりpCSHアーゼIから生成する構成を示す図であ
る。
よりpCSHアーゼIから生成する構成を示す図であ
る。
【0029】図2は発現ベクターpBM61の構成を示
す図である。
す図である。
【0030】図3は発現ベクターpBM62の構成を示
す図である。
す図である。
【0031】明細書及び実施例に挙げられている微生物
及びプラスミド: アルトロバクター・スペック DSM2563 (Arthrobacter spec.) E.コリED8654 DSM2102 pBT 2a−1 DSM3148p は国際寄託機関であるドイツ微生物保存機関(Deut
sch Sammlung von Mikroorg
anismen und Zellkulturen
GmbH:DSM;Mascheroder Weg
IB, D−3300 Braunschweig在)
に寄託した。
及びプラスミド: アルトロバクター・スペック DSM2563 (Arthrobacter spec.) E.コリED8654 DSM2102 pBT 2a−1 DSM3148p は国際寄託機関であるドイツ微生物保存機関(Deut
sch Sammlung von Mikroorg
anismen und Zellkulturen
GmbH:DSM;Mascheroder Weg
IB, D−3300 Braunschweig在)
に寄託した。
【0032】例1 プラス・クローンの同定 アルトロバクター・スペックDSM2563からDNA
を常法により単離した[J.Marmur,J.Mo
l.Biol.,3(1961)208〜218;S.
Visuvanathan及びその他,J.Micro
biol.Meth.,10(1989)59〜6
4]。このようにして単離したDNAを制限酵素Eco
RI及びHindIIIで完全に切断した。市販のベク
ターpUC18(Boehringer Mannhe
im GmbH社)も同様にEcoRI/HindII
Iで切断しかつアルトロバクターからのDNAと連結し
た。生成した組換えプラスミドでコンピテントなE.コ
リ ED8654細胞(DSM2102)を形質転換し
た[Sambrook,Fritsch,Maniat
is,Molecular Cloning,第2版
1.74頁以下]。アンピシリンに対する選択性により
選択平板1個当り約200個のコロニーが得られた。C
SHアーゼをコードするクローンの同定はヨーロッパ特
許公開第0154269号明細書に記載されている呈色
試験により行なった。その際にホスフェート緩衝液pH
7.8中のサルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ、カルバモイルサルコシン、4−アミノアンチピリン
及びトリブロム−3−ヒドロキシ安息香酸を添加した。
を常法により単離した[J.Marmur,J.Mo
l.Biol.,3(1961)208〜218;S.
Visuvanathan及びその他,J.Micro
biol.Meth.,10(1989)59〜6
4]。このようにして単離したDNAを制限酵素Eco
RI及びHindIIIで完全に切断した。市販のベク
ターpUC18(Boehringer Mannhe
im GmbH社)も同様にEcoRI/HindII
Iで切断しかつアルトロバクターからのDNAと連結し
た。生成した組換えプラスミドでコンピテントなE.コ
リ ED8654細胞(DSM2102)を形質転換し
た[Sambrook,Fritsch,Maniat
is,Molecular Cloning,第2版
1.74頁以下]。アンピシリンに対する選択性により
選択平板1個当り約200個のコロニーが得られた。C
SHアーゼをコードするクローンの同定はヨーロッパ特
許公開第0154269号明細書に記載されている呈色
試験により行なった。その際にホスフェート緩衝液pH
7.8中のサルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ、カルバモイルサルコシン、4−アミノアンチピリン
及びトリブロム−3−ヒドロキシ安息香酸を添加した。
【0033】この呈色試験ではCSHアーゼが添加した
カルバモイルサルコシンをサルコシンに変換させ、この
サルコシンがサルコシンオキシダーゼによリグリシン、
ホルムアルデヒド及び過酸化水素に分解される。ペルオ
キシダーゼは生成した過酸化水素と共に、添加されてい
る染料基質を暗紫色の色素に変換する。546nmで吸
光度の上昇を測定する。平板活性試験において1000
個のコロニー当リ2個のプラス・クローンが同定され
た。
カルバモイルサルコシンをサルコシンに変換させ、この
サルコシンがサルコシンオキシダーゼによリグリシン、
ホルムアルデヒド及び過酸化水素に分解される。ペルオ
キシダーゼは生成した過酸化水素と共に、添加されてい
る染料基質を暗紫色の色素に変換する。546nmで吸
光度の上昇を測定する。平板活性試験において1000
個のコロニー当リ2個のプラス・クローンが同定され
た。
【0034】例2 CSHアーゼをコードするDNAの単離 プラス・クローンからのDNAを、コロニーを寒天板上
に塗布しかつこの寒天板のクローンを再懸濁した後で単
離した。再形質転換では、短期にE.コリ中で発現が行
なわれるが、このプラスミドが極めて高い不安定性を有
することが明らかになった。平板活性試験で検出可能な
酵素活性は急速に失なわれた。しかしこの平板溶菌液か
ら、CSHアーゼ遺伝子を含有する5kbのEcoRI
/HindIII−DNAフラグメントを単離すること
ができた。このDNAフラグメントを制限酵素KpnI
及びBamHIで切断することにより2.5kbに短縮
し、更にEcoRI/SalIで1.3kbに短縮する
ことにより安定なクローンが得られた。
に塗布しかつこの寒天板のクローンを再懸濁した後で単
離した。再形質転換では、短期にE.コリ中で発現が行
なわれるが、このプラスミドが極めて高い不安定性を有
することが明らかになった。平板活性試験で検出可能な
酵素活性は急速に失なわれた。しかしこの平板溶菌液か
ら、CSHアーゼ遺伝子を含有する5kbのEcoRI
/HindIII−DNAフラグメントを単離すること
ができた。このDNAフラグメントを制限酵素KpnI
及びBamHIで切断することにより2.5kbに短縮
し、更にEcoRI/SalIで1.3kbに短縮する
ことにより安定なクローンが得られた。
【0035】図1は、5kbのアルトロバクターDNA
フラグメントをpUC18中でクローニングすることに
より得られた組換えプラスミドpCSHアーゼI及びそ
れから欠失により生じる安定なプラスミドpCSHアー
ゼIIIを示す。
フラグメントをpUC18中でクローニングすることに
より得られた組換えプラスミドpCSHアーゼI及びそ
れから欠失により生じる安定なプラスミドpCSHアー
ゼIIIを示す。
【0036】例3 発現ベクターpBMP61の構成 CSHアーゼをコードするDNAをベクターpBT2a
−1(DSM3148P)中でクローニングした。その
ために初めにpBT2a−1からクレアチナーゼ遺伝子
をAvaIで切断することにより欠失した。生成DNA
フラグメントの末端をクレノウ酵素及び4個のヌクレオ
チドトリホスフェートで平滑にした。pCSHアーゼI
からCSHアーゼ遺伝子を制限酵素SalI及びKpn
Iで切断して取り出し、クレノウ酵素及び4個のヌクレ
オチドトリホスフェートで平滑にしかつpBT2a−1
の2.6kbのAvaIフラグメントと連結して組換え
プラスミドpBM61を生成した(図2参照)。
−1(DSM3148P)中でクローニングした。その
ために初めにpBT2a−1からクレアチナーゼ遺伝子
をAvaIで切断することにより欠失した。生成DNA
フラグメントの末端をクレノウ酵素及び4個のヌクレオ
チドトリホスフェートで平滑にした。pCSHアーゼI
からCSHアーゼ遺伝子を制限酵素SalI及びKpn
Iで切断して取り出し、クレノウ酵素及び4個のヌクレ
オチドトリホスフェートで平滑にしかつpBT2a−1
の2.6kbのAvaIフラグメントと連結して組換え
プラスミドpBM61を生成した(図2参照)。
【0037】例4 発現ベクターpBM62の構成 プラスミドpBM61はプラスミドpBT2a−1から
のプロモータlacUV5をなおも含有する。このプロ
モータは発現には必要ではない。それ故pBT2a−1
をAatII及びAvaIで切断しかつ生成した2.4
kbのAvaI/AatII−フラグメントをクレノウ
酵素及び4個のヌクレオチドトリホスフェートで平滑に
した。生成した2.4kbの大きさの平滑末端のフラグ
メントを同じように平滑にした1.2kbの大きさのp
CSHアーゼIからのSalI/KpnI−フラグメン
トと連結してプラスミドpBM62を生成した(図
3)。CSHアーゼをコードするこのプラスミドはCS
Hアーゼ遺伝子の5′−非翻訳領域に約373bpのア
ルトロバクター配列を含有し、これは配列表SEQ I
DNO:3に記載されている。
のプロモータlacUV5をなおも含有する。このプロ
モータは発現には必要ではない。それ故pBT2a−1
をAatII及びAvaIで切断しかつ生成した2.4
kbのAvaI/AatII−フラグメントをクレノウ
酵素及び4個のヌクレオチドトリホスフェートで平滑に
した。生成した2.4kbの大きさの平滑末端のフラグ
メントを同じように平滑にした1.2kbの大きさのp
CSHアーゼIからのSalI/KpnI−フラグメン
トと連結してプラスミドpBM62を生成した(図
3)。CSHアーゼをコードするこのプラスミドはCS
Hアーゼ遺伝子の5′−非翻訳領域に約373bpのア
ルトロバクター配列を含有し、これは配列表SEQ I
DNO:3に記載されている。
【0038】例5 E.コリ中でCSHアーゼの発現 CSHアーゼをコードするプラスミドpBMP61又は
pBMP62をE.コリED8654(DSM210
2)中で形質転換し[Sambrook,Fritsc
h,Maniatis,Molecular Clon
ing,第2版,1.74以下]かつアンピシリンに関
して選択した。クローンをLB5ml中で一晩培養した
後で細胞を収獲しかつ超音波で砕解し、引き続いて活性
試験を実施した。測定原理は例1の平板活性試験と同一
である。波長546nmで吸光度上昇を測定する。活性
試験はヨーロッパ特許公開第0154269号明細書に
記載されている。単位(U)は、サルコシンオキシダー
ゼ及びペルオキシダーゼによる関連する試験の測定条件
下に25℃で測定したサルコシン形成μmol/分とし
て規定されている。
pBMP62をE.コリED8654(DSM210
2)中で形質転換し[Sambrook,Fritsc
h,Maniatis,Molecular Clon
ing,第2版,1.74以下]かつアンピシリンに関
して選択した。クローンをLB5ml中で一晩培養した
後で細胞を収獲しかつ超音波で砕解し、引き続いて活性
試験を実施した。測定原理は例1の平板活性試験と同一
である。波長546nmで吸光度上昇を測定する。活性
試験はヨーロッパ特許公開第0154269号明細書に
記載されている。単位(U)は、サルコシンオキシダー
ゼ及びペルオキシダーゼによる関連する試験の測定条件
下に25℃で測定したサルコシン形成μmol/分とし
て規定されている。
【0039】組換え酵素で活性150U/l×ODが得
られる。これは出発培養物(アルトロバクター・スペッ
ク DSM2563)に比べて係数約50の上昇に相当
する。
られる。これは出発培養物(アルトロバクター・スペッ
ク DSM2563)に比べて係数約50の上昇に相当
する。
【0040】 菌 株 活性(U/l×OD) アルトロバクター・スペックDSM2563 3 E.コリ 0 E.コリ/pBMP61 150 E.コリ/pBMP62 150 例6 CSHアーゼ遺伝子の配列決定 CSHアーゼ遺伝子を含有するpCSHアーゼIIIか
らの1.3kbの大きさのアルトロバクターDNAフラ
グメントをDNAフラグメント配列の決定のために使用
した。該DNAをM13中でサブクローン化しかつ標準
法(ザンガーによるジデオキシ法)により配列決定し
た。転写解読枠が得られ、そのDNA配列はSEQ I
D NO:1に記載されている。これはSEQ ID
NO:2に配列が記載されている264個のアミノ酸を
有するタンパク質をコードする。
らの1.3kbの大きさのアルトロバクターDNAフラ
グメントをDNAフラグメント配列の決定のために使用
した。該DNAをM13中でサブクローン化しかつ標準
法(ザンガーによるジデオキシ法)により配列決定し
た。転写解読枠が得られ、そのDNA配列はSEQ I
D NO:1に記載されている。これはSEQ ID
NO:2に配列が記載されている264個のアミノ酸を
有するタンパク質をコードする。
【図1】図1は安定なプラスミドpCSHアーゼIII
を欠失によりpCSHアーゼIから生成する構成を示す
図である。
を欠失によりpCSHアーゼIから生成する構成を示す
図である。
【図2】図2は発現ベクターpBM61の構成を示す図
である。
である。
【図3】図3は発現ベクターpBM62の構成を示す図
である。
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:19) (C12N 9/80 C12R 1:19) (72)発明者 ギュンター シューマッハー ドイツ連邦共和国 ベルンリート カペ レンシュトラーセ 20
Claims (4)
- 【請求項1】 (1) SEQ ID NO:1 配列の長さ:795塩基対 配列の種類:ヌクレオチド配列(CSHアーゼ配列) 【化1】 で表わされる配列、 (2) SEQ ID NO:1の配列もしくはその相
補配列と厳しいハイブリッド化条件下にハイブリダイズ
する天然の配列又は (3) (1)又は(2)の配列がコードするアミノ酸
に対応する1個のコドンが、同じアミノ酸をコードする
他の1個のコドンにより代えられていてよい配列を含有
し、かつN−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラ
ーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴と
する組換えDNA。 - 【請求項2】 請求項1による組換えDNAのコピー少
なくとも1個を異種挿入体として含有することを特徴と
する組換えベクター。 - 【請求項3】 請求項1によるDNA又は請求項2によ
るベクターで形質転換されていることを特徴とする細
胞。 - 【請求項4】 (1) 宿主細胞を請求項1によるDN
A又は請求項2によるベクターにより形質転換して、N
−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝子
を含有する形質転換宿主細胞を形成し、 (2) 形質転換宿主細胞を好適な培地中で培養し、 (3) 形質転換宿主細胞中のN−カルバモイルサルコ
シン−アミドヒドロラーゼ遺伝子を発現させ、かつ (4) 発現生成物を培地又は宿主細胞から取得するこ
とを特徴とするN−カルバモイルサルコシン−アミドヒ
ドロラーゼ活性を有するタンパク質の取得法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4029844A DE4029844A1 (de) | 1990-09-20 | 1990-09-20 | Carbamoylsarcosinhydrolase, kloniert |
DE4029844.2 | 1990-09-20 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0556788A JPH0556788A (ja) | 1993-03-09 |
JP2627587B2 true JP2627587B2 (ja) | 1997-07-09 |
Family
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3240790A Expired - Fee Related JP2627587B2 (ja) | 1990-09-20 | 1991-09-20 | 組換えdna、組換えベクター、細胞及びn−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質の取得法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5416014A (ja) |
EP (1) | EP0476670B1 (ja) |
JP (1) | JP2627587B2 (ja) |
AT (1) | ATE180015T1 (ja) |
DE (2) | DE4029844A1 (ja) |
ES (1) | ES2133275T3 (ja) |
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---|---|---|---|---|
GB0602173D0 (en) | 2006-02-03 | 2006-03-15 | Avecia Ltd | Expression system |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59132891A (ja) * | 1982-12-27 | 1984-07-31 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | N−カルバモイルサルコシンの測定法及び測定試薬 |
JPS60203190A (ja) * | 1984-02-24 | 1985-10-14 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 1‐メチルヒダントイナーゼ、その製出法およびクレアチニンの測定法および測定試薬 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL61982A (en) * | 1980-02-15 | 1984-01-31 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes |
US4464473A (en) * | 1982-04-23 | 1984-08-07 | The Regents Of The University Of California | Ice nucleating microorganisms |
US4472502A (en) * | 1982-08-16 | 1984-09-18 | The Regents Of The University Of California | Malolactic gene |
DE4000668A1 (de) * | 1990-01-11 | 1991-07-18 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur enzymatischen bestimmung von creatinin |
-
1990
- 1990-09-20 DE DE4029844A patent/DE4029844A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-09-19 EP EP91115974A patent/EP0476670B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-19 DE DE59109126T patent/DE59109126D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-19 ES ES91115974T patent/ES2133275T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-19 AT AT91115974T patent/ATE180015T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-09-20 JP JP3240790A patent/JP2627587B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-08-17 US US08/107,042 patent/US5416014A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59132891A (ja) * | 1982-12-27 | 1984-07-31 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | N−カルバモイルサルコシンの測定法及び測定試薬 |
JPS60203190A (ja) * | 1984-02-24 | 1985-10-14 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 1‐メチルヒダントイナーゼ、その製出法およびクレアチニンの測定法および測定試薬 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE59109126D1 (de) | 1999-06-17 |
EP0476670B1 (de) | 1999-05-12 |
JPH0556788A (ja) | 1993-03-09 |
EP0476670A2 (de) | 1992-03-25 |
US5416014A (en) | 1995-05-16 |
DE4029844A1 (de) | 1992-03-26 |
ATE180015T1 (de) | 1999-05-15 |
ES2133275T3 (es) | 1999-09-16 |
EP0476670A3 (en) | 1992-10-07 |
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---|---|---|---|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |