JPS60196193A - ６‐ヒドロキシニコチン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、６−ヒドロキシニコチン酸の製造方法に関す
る。

有機合成法による６−ヒドロキシニコチン酸の製造法は
多く知られており、ヒドロキシ芳香族の］ルベーシュミ
ット・カルボキシル化によって、６−ヒドロキシニコチ
ン酸が２−ピロリドンから得られる。　他の合成法は、
リンゴ酸またはイソシンコメロン酸から出発するもので
ある［　３　ｒｉａｎｃＯｕｒｔら、　Ｊ、　Ｃｈｉｍ
、　Ｔｈｅｒ　、（１９７３年）　旦（２）　、　２２
６〜２３２　：Ｑｕａｒｒｏｚ。

スイス特許出願　７７３１／８０］。

これら既知の製造法は、いずれも、純粋な６−ヒドロキ
シニコチン酸の簡単で費用がかからず、しかも環境的に
問題のない製造を可能にするものではない。　これらの
方法は置換反応が定量的でないとか、反応に伴って望ま
しくない副生物が生成する、といった欠点を有している
。　副生物は夾雑物となり、反応終了後に反応生成物か
ら除去しなりればならない。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）　、シュードモナス
属（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）　、クロストリジウ
ム属（ＣＩＯ３−ｔｒｉｄｉｕｌｌ　）およびミコバク
テリウム属（Ｍ　ｌ／ＣＯ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）の
微生物がニコチン酸上で増殖すること、およびこれらの
微生物がこの基質を炭素源、窒素源およびエネルギー源
として利用することも知られている［Ａｌ１１ｎｓｏｎ
　Ｍ、　Ｊ、　Ｃ，：　Ｊ。

Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ　、（１９４３年）　１４７，
７８５　：　３ｅｈｒｍａｎ　Ｅ、　Ｊ、　、　５ｔａ
ｎｉｅｒ　Ｒ，Ｖ、　。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ　、（１９５７年＞　２
２８゜９２３］。

ニコチン酸は、すべての被検細菌によって、−次分解段
階で６−ヒドロキシニコチン酸に酸化される。　６−ヒ
ドロキシニコチン酸は直ちに、あまり高い濃度になるこ
となくさらに転換して、好気性細菌の場合には、水、二
酸化炭素およびアンモニアまでになる。

いくらか純粋な形でニコチン酸ヒドロキシラーゼを単離
することは、微生物の分解によって可能であった［Ｈｕ
ｎｔ　Ａ、　Ｌ、　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、（１９
５８年）７２．１〜７］。　ニコチン酸ヒドロキシラー
ゼは、約４００，０００ダルトンの大分子である。　こ
れはフラビン補因子、多くの金属原子（Ｆｅ、ＭＯ＞、
無機イオウおよび若干の場合にはセレンも含んでいる。

　ニコチン酸ヒドロキシラーゼは、適当な電子転移系（
たとえばチトクロム、フラビン、ＮＡＤ’Ｐ　その他）
の存在下でのみ活性である。

細胞抽出液からニコチン酸ヒドロキシラーゼを単離し、
この酵素製剤をニコチン酸のヒドロキシル化に用いるこ
とも可能である。　これを実施して、少量の６−ヒドロ
キシニコチン酸が実際に得られた［　３　ｅｌｌｒｍａ
ｎおよび３ｔａｎｉｅｒ、　Ｊ、［３ｉｏｌ　。

Ｃｈｅｍ（１９５７年＞　２２８．９２３］。　酵素を
単離する費用が高く、酵素が不安定であるにもかかわら
ず、補因子および電子転移系の再生のために、ニコチン
酸ヒドロキシラーゼをめなければならない。

本発明の課題は、この欠点を克服し、経済的な方法でニ
コチン酸から６−ヒドロキシニコチン酸を、高純度かつ
高収率で製造することを可能にする方法を提案すること
である。

このこと（よ、本発明に従って、特許請求の範囲第１項
に記載の方法によって達成される。

シュードモナス属、バチルス属およびアクロモバクタ−
属の微生物によって６−ヒドロキシニコチン酸の製造が
有利に行われることが発見された。

すなわち、アクロモバクタ−・キシロースオキシダンス
　ＤＳＭ２４０２　（菌株型）、シュードモナス・プチ
ダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）　ＫＢＩＮ
ＣＩＢＩ°０５２１．ＮＣＩＢ８１７６または、Ｅｎｓ
ｉｇｎおよびＲｉｔｔｅｎｂｅｒｇが記述している［Ｊ
。

Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ　、　２３９　（１９６４年）
　２２８５〜２２９１］バチルス属菌株、とくにアクロ
モバクタ−・キシロースオキシダンス　ＤＳＭ２７８３
を用いることができる。

好ましくは、アクロモバクタ−・キシロースオキシダン
スの新しい菌株ＤＳＭ２７８３を用いる。

名　称ニアクロモバクター・キシロースオキシダンス　
ＤＳＭ　２７８３ 単離源二ニコチン義母液 （Ａ）形態 栄養肉汁中で培養 （１）　細胞形態：桿状、長さ２〜３．５μｍ。

幅０．６μｍ （２）　配置：孤立 （３）　運動性：非常（活発、Ｓ毛によって運動 （４）　内生胞子：厳密に好気性 （５）　グラム：陰性 （６）　オキシダーゼ：陽性 （７）　カタラーゼ：陽性 この菌株は、検査したすべての特徴において、アクロモ
バクタ−・キシロースオギシダンスの代表的な菌株（Ｄ
ＳＭ２４０２＞と一致する。

（例外：アセトアミドの加水分解） 上記菌株は、バイオテクノロジー研究所の西ドイツ微生
物コレクション（ＤＳＭ＞［西ドイツのグツティン’ｙ
’ン　４３００　グリーゼバッハシュトラ−ｔ　８　］
　ニ、Ｎｏ、ＤＳＭ２４０２ｃｔ５にびＤｓＭ２７８３
として寄託されている。

新しい菌株であるＤＳＭ２７８３は、上）ホの寄託所に
１９８３年１１月１８日に寄託された。

シュードモナス・プチダの菌株ＮＣｌＢ１０５２１およ
び８１７６は、ＴＯｒｒＶ６Ｍ究所、国立産業バクテリ
ア」レクション［スコツ１〜ランドのアバディーン　Ａ
３９８ＤＣアベイロード　１３５］において入手可能で
ある。

前記菌株は、唯一の炭素源、窒素源ａ３よびエネルギー
源としてのニコチン酸によって増殖する。

前記微生物の培養は、この種類の菌株に対して既知の方
法に従って行なうことができる。　たとえば、リン酸塩
緩衝液（５０ｍｍ）ｐｌ−１’７．Ｏ１痕跡元素（ｍｇ
、／、ｌｌ）として Ｃａ　Ｃ，ｌｌ　・２Ｈ２０２０ Ｍｎ　３０４　１０ Ｆｅ　５ｏ４Ｉ　７Ｈ２０５ Ｃｏ　Ｃ，ｌｌ　・６Ｈ２００，１ Ｃｕ　ｓｏ４”　５Ｈ２００，１ ＺｎＳＯ−７Ｈ００，１ ２ Ｎａ　ｆ”’１０　ｏ４＊　２Ｈ２００，１および、増
殖を促進させるための少量の酵母エキス（ｌｖｌｅｒｃ
ｋ）　（０，０５重量％）を含有する、稀薄な殺菌した
ニコチン酸溶液（０，０５〜０．５重量％）中において
、好気性条件下で、３０’Ｃにおいて、°菌株ＤＳＭ２
７８３を２４〜４８時間発酵させる。　増殖したバイオ
マス（水分的１０ｇ／、Ｑ）は、ニコチン酸ヒドロキシ
ラーゼを多く含有している。　細胞を遠心分離し、直ら
に、または−２０℃に保存した後に直接、すなわち酵素
回収または精製することなく、ニコチン酸のヒドロキシ
ル化に用いることができる。

ニコチン酸のヒドロキシル化を実施する場合に、−次段
階すなわち６−ヒドロキシニコチン酸へのヒドロキシル
化のめいだ、ニコチン酸の分解が生じないことか望まし
い。　この産生段階では、収率を犠牲にして微生物の増
殖が行われる。

ニコチン酸のヒドロキシル化の経済にとって重要な、次
のパラメータが満たされなければならない： （ａ）　細胞はもはや増殖してはならない（二」チン酸
の消費）。

（ｂ）　二・コチン酸ヒドロキシラーゼは活性でなけれ
ばならない。

（Ｃ）　ニコチン酸の分解系路は、６−ヒトロキニコチ
ン酸の段階で停止すべきでおる。

（ｄ）　生成物（６−ヒドロキシニコチン酸）を細胞か
ら分離すべきである。

ニコチン酸の濃度を高めると、意外にも、これらのパラ
メータが同時に満たされることが発見された。　６−ヒ
ドロキシニコチン酸の製造に都合のよいこの性質は、微
生物代謝に広く及んでいるように思われる。　生成酵素
（６−ヒドロキシニコチン酸ヒドロキシラーゼ）が、高
いニコチン酸濃度によって阻害されることか考えられる
。

上述のように、菌株ＤＳＭ２７８３は希薄な溶液（０，
０５〜０．５重量％）中でとくに増殖し、その際に存在
するニコチン酸を完全に消費する。

ニコチン酸の濃度が上昇すると細胞増殖が阻害され、２
重量％以上の二］チン酸濃度では、もはや増殖が観察さ
れない。　しかし、細胞内の二」チン酸ヒドロキシラー
ゼの活性は変化しない。

酵景的ヒドロキシル化反応は、好気性条件下で、２０〜
４０’Ｃの温度および５．５〜９．０のｌ）Ｈにおいて
、有利に進行する。

０．１重量％から飽和まで、好ましくは０．５〜１０重
量％のニコチン酸溶液を用いるのか有利である。　ニコ
チン酸は、アルカリ塩溶液としても用いることができる
。　異化分解はヒドロキシル化段階後に停止する。　こ
のため、副反応および随伴反応は排除されて、６−ヒド
ロキシニコチン酸の純度および収率が非常に高くなる。

被検微生物のそのほかの有利な性質は、これらの微生物
が、ヒドロキシル化の生成物である６−ヒドロキシル”
コチン酸を溶液中に析出させることである。　これによ
って、生成物の単離がかなり簡単になる。

反応肉汁から細胞を遠心分離またはミクロろ過によって
分離した後に、透明な溶液を酸性化する。

このときに析出した白色の６−ヒドロキシニコチン酸を
ろ過し、乾燥する。

実”施例 １モル量の６−ヒドロキシニコチン酸の実験室規模の製
造を、実用的な考察のため、２段階に分けて実施した。

段階１：ニコチン酸ヒドロキシラーゼ活性の高い生物量
の製造 段階２：ニコチン酸の酵素によるヒドロキシル化これら
の両段階を、いわゆるバッチ方法に結合させることは、
当然直ちに可能である。

実施例１ （段階１）アクロモバクタ−・キシロースオキシダンス
　ＤＳＭ２７８３　バイオマスの製造Ｎａ２ＨＰＯ４−
２Ｈ２０：５１．９．＄、　Ｋ１−１２　ＰＯ２：　２
０．０’ｊ、酵母エキス２．５ｇおよびニコチン酸１０
ｇを水４７５０ｄ中に含有する栄養溶液を発酵器に満た
し、１２０℃において２０分間殺菌した。　３０’Ｃに
冷却した後に、発酵器に出発培養物５００ｄを接種し、
３０’Ｃ，ｐＨ７，０において空気を通風しながら、２
４時間発酵させた。　２４時間後に、ニコチン酸１０９
と酵母エキス２．５ｇを水に溶かした溶液２００ｍ１を
無菌状態で加え、再び発酵を行なった。　４２時間後に
培養物を回収し、アクロモバクタ−属細胞を遠心分離（
１５，０ＯＯＧにおいて３０分間）−によって分離した
。　湿った生物量３８．３　が得られた。

（段階２）ニコチン酸のヒドロキシル化３〃反応器に５
％二］チン酸す１〜リウム溶液（ｐｉ−１６，５）を充
填し、３０℃まで加熱した。

ＤＳＭ２７８３細胞を水１２０威に懸濁さぜた懸濁液を
添加し・、反応混合物を充分に撹拌しながら、反応混合
物に強く通風した。　反応混合物のｐＨ１温度および酸
素濃度を連続的に測定して調節した。

７時間後に、溶解した酸素濃度が上昇した。

この時点までに反応は終了した。　反応懸濁液をろ過し
、沈降物中の細胞は次の装入に用いた。

透明な上澄みを溌仙を酸でｐＨ１，５にし、析出した６
−ヒドロキシニコチン酸を吸引ろ過して乾燥した。

白色生成物１２１ｇが得られ、これはＨＰＬＣ分析によ
って、９８．６％の６−ヒドロキシニコチン酸を含有し
ていることがわかった。　ニコチン酸使用量にもとづい
て締出すると、９３．７％の６−ヒドロキシニコチン酸
敗率に相当する。

実施例２ （段階１）シュードモナス・プチダ　Ｎ（、ｌＢ１０５
２１　バイオマスの製造 実施例１に）ホべた栄養溶液と同じもの１．Ｉ！を２ｇ
フラスコ内で殺菌し、３０’Ｃに冷却したのち、寒天プ
レートからのシュードモナス培養物ＮＣｌＢ１０５２１
を接種した。　この培養物を培養器内で３０’Ｃにおい
て４８時間振とうした。　最大細胞密度に達したところ
で、細胞を１０．０００Ｇにおいて２０分間遠心分離し
た。　細胞をリン酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７＞　１
０ｄ中に懸濁させた。

（段階２） １〃振とうフラスコに中′性４０ｍＭ二］チン酸すトリ
ウム溶液を満たし、細胞懸濁液１０ｍ！！（段階１から
）を添加した。　この混合物を培養器内９０℃で９０分
間、強く振とうした。　細胞を遠心分離し、透明な上澄
み（１０８ｍ＞をニコチン酸および６−ヒドロキシニコ
チン酸に関して分析した。

ＨＰＬＣ分析によると、この溶液は６−ヒドロキシニコ
チン酸（Ｎａ塩）３６．１ＵＬＭを含有した。　これは
ニコチン酸の使用量にもとづいて算出すると、９７．５
％の収率に相当する。

ニコチン酸の濃度は６−ヒドロキシニコチン酸濃度の０
．２％以下であった。

この溶液を強酸で酸性化することによって、固体の６−
ヒドロキシニコチン酸を単離することができた。

実施例３ （段階１）シュードモナス・プチダ　ＮＣＩＢ８１７６
　バイオマスの製造 シュードモナス細胞を実施例１の段階１におけるように
発酵させ、湿ったバイオマス４５．３９を得た。

（段階２）ニコチン酸のヒドロキシル化３ｐ反応器に１
０％ニコチン酸す１ヘリウム溶液（ｐＨ７，０＞１１２
５ｍを充填し、３５°Ｃに熟した。　水１００ｄに懸濁
させたＮＣＴＢ８１７６バイオマスの懸濁液を添加し、
反応混合物を充分に混合しながら、強く通風した。　反
応混合物のｐＨ，温度および酸素濃度を連続的に測定し
て調節した（ｐＨ＝７．０．温度−３５°Ｃ，ＰＯ２：
５ｍｇ／、１１）。　５時間２０分後に、溶ｔｒｙ　Ｌ
　７ｊ　酸素の濃度を１段階で７　ｍｇ　／　ｆ）に増
加した。　この時間までに反応を終了した。　反応懸濁
液をＡｍｌｃｏｎ社の中空繊維製ＨＩＭＰＯ１−４，３
フイルターでろ過した。　強度に濃縮した（５０（８）
細胞り濁液は、次の装入に用いた。

透明な上澄みを濃塩酸て１）Ｈｌ、５にし、析出した純
白色の６−ヒドロキシニコチン酸を吸引ろ過してフィル
ター上で水で洗浄し、真空乾燥した（２０ミリバール、
６０’Ｃ１１０時間）。　白色生成物１２２．３ｇが得
られ、これはＨＰ　Ｌ　Ｃ分析によると９９．２％の６
−ヒドロキシニコチン酸を含有していた。　これはニコ
チン酸使用量にもとづいて９５．４％の６−ヒドロキシ
ニコチン酸収率に相当する。

特許出願人　ロング　リミテッド 代理人　弁理士　須　賀　総　夫

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）　ニコチン酸のヒドロキシル化により６−ヒドロ
   キシニコチン酸を製造する方法において、シュードモナ
   ス属、バチルス属またはアクロモバクタ−属の二］チン
   酸分解能をもつ微生物の存在下でヒドロキシル化を酵素
   的に実施することを特徴とする方法。
2. （２）　アクロモバクタ−・キシロースオキシダンス（
   Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｏｓｏｘｙｄａｎ
   ｓ　）を用いることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   の方法。
3. （３）　ＤＳＭ２７８３なる寄託番号を有するアクロモ
   バクタ−・キシロースオキシダンスを用いることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項または第２項の方法。
4. （４）　酵素的ヒドロキシル化を温度２０〜４０℃およ
   びｐＨ５，５〜９．０において好気性条件下で実施する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第３項の
   いずれかの方法。
5. （５）０．１重量％から飽和まで、好ましくは０．５〜
   １０重量％までのニコチン酸溶液を用いることを特徴と
   する特許請求の範囲第１１１ないし第４項のいずれかの
   方法。
6. （６）　ニコチン酸を６−ヒドロキシニコチン酸へ特異
   的に酵素的にヒドロキシル化するためのアクロモバクタ
   −・キシロースオキシダンスＤＳＭ２７８３゜