JPH0423999A - カルシウムの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、生体成分中に含まれるカルシウムの定量法に
関する。臨床検査の分野では、副甲状腺の疾患、閉塞性
黄痕などの診断の目的で生体成分中、主に血中のカルシ
ウム濃度の定量が行われている。

従来の技術 生体成分中のカルシウムの定量法としては、シュウ酸ま
たはＥＤＴＡを用いた滴定法、アリザリン、０−クレゾ
ールフタレインコンプレクソンなどを用いた直接仕色法
、カルセインを用いた蛍光法、原子吸光法などの化学的
な方法が知られている（臨床検査技術全集　第６巻、臨
床化学検査■Ｄ　電解質および無機物の測定法）。

滴定法は迅速性、簡便性、試料の微量化に欠け、比色法
、蛍光法はカルシウムと有機化合物とのキレート反応が
原理であることから、どうしても２価の金属の影響があ
り、特異性の面で満足ではない。また原子吸光法は特異
性が良くないばかりでなく、特別な装置が必要な点、操
作が煩雑な点からルーチン分析に不向きである（臨床検
査技術全集　第５巻　臨床化学検査■　原子吸光分析）
。

さらに、レシチン、フォスフォリバーゼＤ　（ＥＣ。

３、１．４．４）　（以下ＰＬＤと略す）およびコリン
オキシダーゼを用いた酵素法による方法が報告されてい
る（特開昭６２−１９５２９７）。

該公報にはカルシウムイオン含有試料に天然レシチン及
びＰＬＤを加えるとカルシウムイオンによってＰＬＤが
活性化され、活性化ＰＬＤによってレシチンが分解され
てコリンを生成し、この生成コリンをコリンオキシダー
ゼで分解して生成する過酸化水素を定量することによっ
てカルシウムイオンを定量する方法が開示されている。

この方法は、■天然レシチンは、水に対する溶解性の低
さから基質量が限られてしまった約、定量域が狭い、■
天然レシチンは反応性が良すぎる（少しのＰＬＤで多量
のコリンが生成する）ので、その後に続く反応で大量の
コリンオキシダーゼが必要になる、■たとえ十分な量の
コリンオキシダーゼを使ったとしても吸光度変化が短時
間に飽和するなどの理由でどうしてもＰＬＤ量を抑える
ことになるが、ＰＬＤ量が少なければ定量域は狭くなる
、など種々の問題を抱えている。

発問が解決しようとする課題 前記特開昭６２−１９５２９７の方法において天然レシ
チンに代わる定量域の広い新しい基質の提供が求められ
ている。

課題を解決するための手段 本発明は、カルシウムイオンを含有する試料中一般式（
Ｉ） ％式％ 〔式中、ｘｌおよびＸ、は同一または異なって、びＹ２
は同一または異なって、酸素または硫黄を示す。Ｒ，お
よびＲ３は、一方が炭素数１〜４のアルキル、炭素数１
〜１０の置換アルキル、炭素数２〜１０の置換もしくは
非置換のアルケニル、アラルキル、置換もしくは非置換
のアリール、置換もしくは非置換のアルキルアミンまた
は Ｈｎｏ　　ＣＨ２ＣＨｒ）−ｉｌｉ−（ｎ　＝　１〜２
０の整数）を示し、他方は同一または異なって上記と同
義の基であるかあるいは水素または炭素数１〜２４のア
ルキルを示す。〕で表されるフォス７オリルコリン類に
フォスフォリパーゼＤを作用させ生成するコリンを定量
することを特徴とするカルシウムの定量法を提供する。

一般式（Ｉ）の各基の定義において、アルキル、置換ア
ルキルおよびアルキルアミンにおけるアルキル部分は、
直鎖または分岐状のアルキル例えばメチル、エチル、プ
ロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチノベｓｅ叶ブ
チノベｔａｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ｓ
ｅローペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、ヘプ
チル、オクチル、ノニル、デシルを包含する。置換アル
キルにおける置換基は同一または異なって置換数１〜３
のヒドロキシル、低級アルコキシ、アミノ、モノまたは
ジ低級アルキル置換アミノ、低級アルカノイル、カルボ
キシル、低級アルコキシカルボニル、スルフォを包含す
る。炭素数２〜１０の置換もくしは非置換のアルケニル
は、直鎮または分岐状の例えばビニル、アリル、プロペ
ニル、ブテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル
、ノネニル、テ゛セニルを包含する。置換アルケニルに
おける置換基は、上証置換アルキルにおけるそれと同義
である。アラルキルは、ベンジル、フェニルエチルヲ包
含スる。

置換もしくは非置換のアリールは、フェニル、ナフチル
を包含する。置換アリールにおける置換基は、上記置換
アルキルにおける置換基と同義である。

本発明の原理が次に示される。

ＰＬＤはカルシウムイオン非存在下では活性化されない
がカルシウムイオンの存在下で活性化し、ＰＬＤの活性
度はカルシウムイオンの量に比例する。

化合物（Ｉ）は活性化されていないＰＬＤの作用を受け
ないが活性化されたＰＬＤによって分解されコリンを生
成する。コリンは一定量のＰＬＤについて活性度即ちカ
ルシウムイオンの量に比例して生成する。従って生成す
るコリンを定量することによってカルシウムイオンを定
量することができる。

上記反応の反応式が以下に示される。

Ｉ Ｃ）＋２ 定 量 ＯＨ 生成するコリンは、それ自体公知のコリンの定量法を適
用することによって定量できる。例えば■コリンオキシ
ダーゼ（ＥＣ，１，ＩＪ、１７、以下ＣＬＯＤと略す）
および酸素によってコリンを分解し、定量的に生成する
過酸化水素と色源体とをノく−オキシダーゼ（以下ＰＯ
Ｄと略す）の存在下に反応させ、生成する色素を定量す
る、■コリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１，１，９９、
■、以下ＣＬＤＨと略す）フェナジンメトサルフェート
（以下ＰＭＳと略す）およびテトラゾリウム類を共存さ
せ、生成するフォルマザン色素を比色定量することによ
って定量できる。コリンの生成速度を測定することによ
り、あらかじめ作製しておいた検量線から試料中のカル
シウムイオンを算出することができる。

上記のコリンの定量法の反応式は、それぞれ下記のとお
りである。

ＯＤ ＋還元型ＦＭＳ 還元型ＰＭＳ＋テトラゾリウム塩 ホルマザン十ＰＭＳ 本発明の特徴は、ＰＬＤの基質として用いる上記のフォ
スフォリルコリン類が天然のレシチンに比べてＰＬＤに
対する反応性が低いので、天然のレシチンを用いる場合
に比べて多量の基質を用いることができ、また水に対す
る溶解度の大きい化合物は多量用いることができるので
、定量域が広くとれる点である。

本発明は酵素の至適条件下で反応を行うのが好適である
。即ち反応は５−５０℃の温度、ｐＨ５−９の緩衝液中
で行われる。ＰＬＤは、検体中のカルシウムの濃度、あ
るいは緩衝剤の種類もしくは基質の種類によって異なる
が通常０．０１１００単位／ｍｌで用いられる。またＰ
ＬＤの起源は問わないが菌由来、キャベツ由来、ビーナ
ツツ由来などいずれも使用できる。緩衝剤としては、グ
ツドの緩衝剤（同位化学研究所　第１５版総合カタログ
）、はう酸塩、酢酸塩、トリス塩酸塩、リンゴ酸塩、コ
ハク酸塩などが例示され、１０３０００ｍＭの範囲で用
いられる。

この反応系はそのままでも良好な特異性を示すが、より
厳密に特異性を増すために、必要に応じて特殊なキレー
ト剤を添加することもできる。

本発明方法はキレート法であるから、適当な時間を経た
時点で停止剤を添加して反応を停止し、しかる後に吸光
度を測定する方法をとっても良い。

この目的で加えられる停止剤としてはＧＥＤＴＡ（同位
化学研究所　第１５版総合カタログ、以下のキレート剤
についても同じ）　、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｏ
Ｈ，ＩＤＡ、ＤＨＥＧ、ＥＤＤＡ’　ＥＤＤＨＡ、ＤＰ
ＴＡ−ＯＨ，ＮＴＰ、ＨＩＤＡ、ＥＤＤＰ、ＥＤＴＰＯ
，ＮＴＰＯ，ＢＡＰＴＡ、ＴＴＨΔ、ＣｙＤＴＡなどが
あげられる。

使用濃度は１０−１０００ｍＭである。

ＰＬＤの基質としては、酵素の作用によりコリンを生成
する基質であれば、Ｋｍ値の大小は関係しないが、Ｋｍ
値が小さければ定量域が狭くなる傾向があり、好適には
０．１ｍＭ以上を示すものが用いられる。さらに反応液
中で十分に溶解し、また安定な物質の方が好適である。

このような例として次の物質があげられる。

一般式（Ｉ） 第 表 生成するコリンを検出するのに用いられる上記■■の酵
素系の反応速度は、ＰＬＤの反応速度より速いことが求
められる。このためには■についてはＣＬＯＤの濃度が
１−１００単位／ｍｌ、ＰＯＤが０．１−２００単位／
ｍｌ、色素源の濃度としては０．０２−２０ｍｇ／ｍｆ
ｊが良い。色素ｆｆ、トＬテｌｔ、ＰＯＤと過酸化水素
により色素を生成するものであればいずれも使用できる
が、ジアミノベンチジン、３．３′−ジメチルベンジジ
ン、３．３’　５．５’−テトラメチルベンジジン、３
．３’−ジメチル−Ｎ−スルフォブロビルベンジジン、
３．３’　５．５’−テトラメチル−Ｎ−スルフォブロ
ピルベンジジンもよく用いられる。また４−アミノアン
チピリン（４ＡＡ）または３−メチル−２−ベンゾチア
ゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とカップリングして色
素を生成するフェノール、ＮＮ−ジメチルトルイジン、
Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルトルイジン（ＥＨＥ
Ｔ）　、ＮＮ−ジエチルトルイジン、ＮＮジメチルアニ
リン、ＮＮ−ジエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒド
ロキシエチルアニリン、３．５−ジメトキシ−Ｎ−エチ
ル−Ｎ−ヒドロキシエチルアニリン、３．５−ジメトキ
シＮＮ−ジメチルアニリン、３．５−ジメトキシＮＮ−
ジエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェ
ニル）Ｎ′−アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、
Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）Ｎ′サクシニ
ルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）　、ＮＮ−ジスルホプ
ロビルトルイジン（ＤＳＰＴ）、３．５−ジメトキシＮ
Ｎ−ジスルホプロピルアニリン（ＤＳＰＡ）　、ＮＮ−
ジスルホプロピルアニリン、トリンダー試薬類（同位化
学研究所　第１５板縁合カタログ）などの組合せの他特
開昭６２−２９６、同５７−２９２９７、同５９−１８
２３６１　、同５６−１４５３５２　、同６３２４６３
５６で示される色素源がいずれも用いつる。

■についてはＰＭＳの他メルトラブル−（同位化学研究
所　第１５板縁合カタログ）、１−メトキシＰＭＳ　（
同位化学研究所　第１５版　総合カタログ）も使用でき
、０．０１−２■／ＩｎＩ２で用いられる。テトラゾリ
ウム塩としては、ＩＮＴ、ＭＴＴ。

Ｎｅｃ＋−ＴＢ、Ｎ　ｉ　ｔ　ｒ　ｏ−ＴＢ、ＴＢ、Ｔ
ＮＴＢ（いずれも同位化学研究所　第４５板縁合カタロ
グ）が０．０１−５■／ｍｌで用いられる。

以下に本発明を実施例および参考例によって説明する。

実施例１ ５０ｍＭ　　　ＰＩＰＥＳｉｌ衡液（ｐＨ７，０）ト　
リ　ト　ン　　Ｘ−１００１■／ｍρＥＭＳＥ　　　　
　　　　　　１■／ｍ１４ＡＡ　　　　　　　　　　　
０．５■／ｍｌＰ　Ｌ　Ｄ　　　　　　　　　　　０．
１単位／−ＣＬ　ＯＤ　　　　　　　　　　５．０単位
／−ＰＯＤ　　　　　　　　　　　１０単位／ｍｌ基質
　ＰＣ−１０，２■／ｍｌ 上記試薬３．０ｍｌに、１０ｍｇ／Ｊのカルシウム溶液
０．０２ｍを加えて３７℃で１０分間反応させ、生成す
る色素を５５５ｎｍの吸光度で測定した。この反応は下
記で示される　（ただし式中Ｒ，＝ＣＨ３（ＣＨ２）　
＋６−＋Ｒ２＝ＨＯＯＣＣＩＩ２ＣＨ，−，Ｘ、＝−Ｃ
Ｏ−、Ｘ２＝−ＣＤ−、Ｙ、＝−０−＃ヨびＹ２−０−
である）。吸光度の変化を第１図に示す。

Ｘ、−Ｙ。

ＣＨ２ コリン 十 Ｒ２−Ｘ、−Ｙ２−ＣＨＤ ＣＨ２−０−Ｐ−ＯＨ ＣＨ 試験管６本にそれぞれ呈色試薬を３．０コ入れ、３７℃
で予備加温する。次に０．　１０．　２０゜３０．４０
．５０■／〃の塩化カルシウム溶液を５０ｇずつ添加攪
拌し、そのまま３７℃で１０分間保った後、１０■／−
のグリコールエーテルジアミン４酢酸（ＧＥＤＴＡ　　
同位化学研究所　第１５板縁合カタログ）溶液を０．１
ｍｌ加えて反応を停止させた。この際カルシウムはＧＥ
ＤＴＡによりキレート化され、ＰＬＤの反応が停止する
。５５５ｎｍの吸光度を測定して第２図の検量線を得た
。

実施例２ 本発明方法と従来標準法として行われてきたクラーク・
コリツブ法、および比色法として０−クレゾールフタレ
インコンプレクソン（ＯＣＰＣ）を使う方法（いずれも
臨床検査技術全集　第６巻臨床化学検査Ｉ［Ｄ　　電解
質および無機物の測定法）を比較するために、■カルシ
ウム１０．０■／〃を含む水溶液、■カルシウムｌ０１
０■／ｄ１、マグネシウム３．０■／ｄ１を含む水溶液
、■カルシウム１０．０■／ｄ１、マグネシウム３．０
ｍｇ／ｄ１．、カリウム１００ｍｇ／ｄ１を含む水溶液
、■カルシウム９．２■／ｄ１、マグネシウム２．６ｍ
ｇ／ｄｉ！を含む血清を実施例１と同様の方法および臨
床検査技術全集第６巻　臨床化学検査ｎＤ　　電解質お
よび無機物の測定法記載の方法で測定して第２表の結果
を得た。

この結果から本発明方法が特異性の高い方法であること
がわかる。

第　　　２　　　表 本表中（） 中の数値は誤差 〈％） を示す。

実施例３ ５０ｍＭ　　　ＰＩＦＥＳ緩衝液（ｐＨ７，０）トリト
ン　Ｘ−１００１ｍｇ／ｍｃ’ ドータイトＰＭＳ”　　　　　０．２ｍｇ１０ｆドータ
イトＮ１ｔｒｏ−ＴＢ”　　　　０．２　ｍｇ／　−Ｐ
　Ｌ　Ｄ　　　　　　　　　　　０．１単位／−ＣＬＤ
Ｈ５，０単位／− 基質　ＰＣ−２０，２ｍｇ／ｄ ＄１：同仁化学研究所同第化学板縁所カタログ上記試薬
３．０−に１０■／ｄｌのカルシウム標準溶液および実
施例２の■の血清をそれぞれ０．０５ｄずつ加えて３７
℃で１０分間反応させ、生成するホルマザン色素を５３
０ｎｍの吸光度で測定した。

標準液の吸光度と比較して計算された血清中のカルシウ
ム濃度は９，２４■／〃となり、はぼ正確な値が得られ
た。

実施例４ 実施例１のＰＣ−１の代わりに上記第１表記載の基質Ｐ
Ｃ−３、ＰＣ−４、ＰＣ−５、ＰＣ−６、ＰＣ−７、Ｐ
Ｃ−８、ＰＣ−９、ＰＣ−１ｏ、ＰＣ−１１、ＰＣ−１
２、ＰＣ−１３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１５、ＰＣ’−１
６、ＰＣ−１７およびＰＣ−１８を用いた他は、実施例
１と同じ組成の試薬を作成し、試薬３．０　ｍｌ！に１
０■／ｄのカルシウム標準溶液および実施例２の■の血
清をそれぞれ０．０５ｄずつ加えて３７℃で１０分間反
応させ、生成する色素を５５５ｎｍの吸光度で測定した
。標準液の吸光度と比較して計算された血清中のカルシ
ウム濃度は第３表に示すとおりであった。

第　　　　３　　　　表 実施例５ 実施例１記載の試薬ＯＥＭＳＥの代わりにＤＳＰＴ、Ｄ
ＳＰＡ、）リンダ−試薬類のＴＯＯ３（同位化学研究所
　第１５板縁合カタログ）、ＤＡＯ３（同）　、ＨＡＬ
ＰＳ　（同）　、ＡＤＯ３（同）およびＥＨＥＴ　（和
光純薬１９８８−８９年版カタログ）を用いた他は、実
施例１と同じ組成の試薬を作成し、試薬３．０−に１０
■／ｄ１のカルシウム標準溶液および実施例２の■の血
清をそれぞれ０．０５ｍずつ加えて３７℃で１０分間反
応させ、生成する色素をそれぞれ第４表に示す波長で吸
光度を測定した。標準液の吸光度と比較して計算された
血清中のカルシウム濃度は第４表に示すとおりであった
。

第 表 実施例６ 実施例１記載の試薬の４ＡＡとＥＭＳＥの代わりに下記
に示す色素源を使った他は、実施例１と同じ組成の試薬
を作成し、試薬３．Ｏｍｌに１０■／＋２！ｉ！のカル
シウム標準溶液および実施例２の■の血清をそれぞれ０
．０２ｍ１ずつ加えて３７℃で１０分間反応させ、生成
する色素をそれぞれ第５表に示す波長で吸光度を測定し
た。標準液の吸光度と比較して計算された血清中のカル
シウム濃度は第５表に示すとおりであった。

ＣＨ。

ＣＨ。

ＣＨ３ ＣＨ。

Ｃ：０ Ｃ＝０ ＩＩ３ ＣＨ２−ＣＯＯ）Ｉ （ＢＣＭＡ） （日＾ＨＭ） ３、３’、　５．５’−テトラメチルベンジジン（ＴＩ
ＩＢＺ）３、３’、　５．５’−テトラメチル−Ｎ−ス
ルフオブロピルベンジジン（ＴＭＳＢＺ） ２．２′−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンス
ルフオニツクアシッド＞　（ＡＢＴＳ）第　　　５　　
　表 実施例７ 基質の溶解性および実施例１に準じた反応系に於ける該
基質の定量域を調べたところ、本発明の基質は特開昭６
２−１９５２９７で用いられているレシチンに比べて高
い溶解性および広い定量域を有することを確認した。

第 表 参考例１　（エステル型ＰＣ−１の合成法）卵黄より得
られるレシチンを水に懸濁し、フォスフォリパーゼＡ　
２　（ＢＣ，３，１，１，４）で処理した後、クロロホ
ルム抽出で１−ステアリル（バルミトイルも一部含まれ
る）−フォスフアテジルコリンを得る。

抽出液に無水コハク酸を添加してＰＣ−１を合成し、エ
チルエーテル／石油エーテル＝１／ｌの混合溶媒で沈澱
させ、白色無定型粉末を得る。

その他のエステル化物についてもその相当するアシル化
剤を反応させる。

参考例２　（エーテル型ＰＣ−３の合成法）参考例１で
得られた１−ステアリル（バルミトイル）−フォスファ
チジルコリンのクロロホルム溶液に１３プロパンサルト
ンを反応させた後、エチルエーテルで沈澱させ１−ステ
アリル（バルミトイル）２−スルフォブロピルフォスフ
ァチジルコリンを得る。これを再度水に溶解しフォスフ
ォリパーゼＡ１　　（ＥＣ，３，１，１，３２）で処理
して２−スルフォブロピルフォスファチジルコリンとし
、シリカゲルクロマトで単離した物にイソ酪酸クロリド
を反応させ目的物を得る。その他のエーテル化物につい
ても相当する環状サルトン、ラクトン類、またはグリシ
ジル基を持つものをそのまま反応させるか、またはヒド
ロキシ基、あるいはチオール基、あるいはクロール基、
あるいはブロム基を持つものとを触媒の元に加熱して合
成できる。

参考例３ ＰＣ−２，４〜１８は、以下のようにして合成する。グ
リセロフォスフォリルコリン〔シグマ社１９８８年プラ
イス　リスト（ＰＲＩＣＥ　ＬＩＳＴ）〕　と、下記第
７表Ａ記載の物質を５０〜６０℃で反応させた後アセト
ンで沈澱単離したものに、第７表Ｂ記載の物質を７０〜
８０℃で反応させて、アセトンで沈澱させて得る。

第 表 えて加水分解させ、 アセトン沈澱する。

発明の効果 本発明によれば、ＰＬＤの基質としてフォスフォリルコ
リン類を用いて、生体成分中に含まれるカルシウム濃度
を効率よく測定することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で測定した吸収度の変化を示す。第
２図は、実施例１で既知濃度の塩化カルシウム溶液を用
いて測定した吸光度をもとにして作成した検量線を示す
。 特許出願人　協和メデックス株式会社 第 図 第 図 しａ　シｌ　２　ｉｌ＋父

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 カルシウムイオンを含有する試料中一般式（ I ）▲数
   式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中、Ｘ＿１およびＸ＿２は同一または異なって、単
   結合またはカルボニル▲数式、化学式、表等があります
   ▼を示し、Ｙ＿１およびＹ＿２は同一または異なって、
   酸素または硫黄を示す。Ｒ＿１およびＲ＿２は、一方が
   炭素数１〜４のアルキル、炭素数１〜１０の置換アルキ
   ル、炭素数２〜１０の置換もしくは非置換のアルケニル
   、アラルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換も
   しくは非置換のアルキルアミンまたは ▲数式、化学式、表等があります▼（ｎ＝１〜２０の整
   数） を示し、他方は同一または異なって上記と同義の基であ
   るかあるいは水素または炭素数１〜２４のアルキルを示
   す。〕で表されるフォスフォリルコリン類にフォスフォ
   リパーゼＤを作用させて生成するコリンを定量すること
   を特徴とするカルシウムの定量法。