JPS61159170A - 血液のインタ−フエロン−γ産生能測定方法 - Google Patents

血液のインタ−フエロン−γ産生能測定方法

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JPS61159170A
JPS61159170A JP59280697A JP28069784A JPS61159170A JP S61159170 A JPS61159170 A JP S61159170A JP 59280697 A JP59280697 A JP 59280697A JP 28069784 A JP28069784 A JP 28069784A JP S61159170 A JPS61159170 A JP S61159170A
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interferon
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    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血液のインターフェロン−γ産生能を測定す
る方法に関する。
近年、採血した血液中に存在する酵素またはその代謝産
物などを測定する臨床化学的検査方法が広く行なわれる
ようになってきた。
血液中の一成分であるインターフェロン−γも、その抗
ウイルス性、抗腫瘍性などから検査項目に加えることが
考えられている。しかしながら、実際には、血液中に含
まれているインターフェロン−γが微量であることなど
から今だ実現していない。
そこで、本発明者は、採血した血液に含まれるインター
フェロン−rを直接測定するのではなく、採血した血液
のインターフェロン−γ産生能を測定することに着目し
鋭意研究した。
血液は、赤血球、白血球、血小板などの有形成分が液体
成分である血漿中に浮遊液を形成しているものであり、
血液1■3中には、通常、赤血球が男性の場合5.4 
X 10’個、女性の場合4.8 X 10’個、白血
球が成人の場合7,400個、血小板が300,000
個含まれている。
インターフェロン−γは白血球により産生されることが
知られている。
従来、ヒト血液からインター7エロンーγを産生するに
は、血液から分離した白血球を用いている。例えば、 
Y、に、YIP et al、、  Infectio
n andImmunity、 Vol、 34. N
o、 I、 131−139 (1981)、Tada
shi KASAHARA et al、、 The 
Journal ofImmunology、 Vol
、 130. No、 4.1784−1789 (1
983)などの記載からも明らかなように、血液から他
の成分を除去し、白血球を採取して、この白血球からイ
ンターフェロン−γを産生させている。
しかしながら、これらの方法を詳細に検討したところ、
血液からの白血球の回収率が30〜50q6程度と抵い
ばかシでなく、その分離操作によシ白血球がダメージを
受け、その生残率を40〜60%に低下させ、結果とし
て、血液からの白血球の有効回収率が約10〜30%に
も低下し、更には、採取した白血球からのインターフェ
ロン−γ産生量が一定しないなどの理由により、血液か
らのインターフェロン−γ産生能を推定することはきわ
めて困難であることが判明した。
本発明者は、採血した血液を用いてインターフェロン−
γ産生能を測定すべく研究を続けたところ、全血を抗凝
血剤及びミトーゲンと接触せしめ、容器中でインキュベ
ートシ、生成したインターフェロン−γを測定すること
にょシ、その血液のインターフェロン−r産生能がきわ
めて容易に安定して測定できることを見いだし、本発明
を完成した。
更に、詳細に検討を加えたところ、ミトーゲンを全血m
l当り10〜10,000μmの範囲で接触せしめるの
が好適であることが判明した。
本発明で、全血とは、採血した血液、またはその血液か
ら液体成分の血漿を除去して得られる全有形成分を他の
液体、例えば生理食塩水、緩衝液、栄養培地などに浮遊
させた液をいう。
抗凝血剤としては、全血の凝固を防止でき、かつインタ
ーフェロン−γの産生、測定に悪影響のないものであれ
ばよく、例えば、ヘパリン%ACD、    ’CPD
などが適宜使用される。
また、本発明に使用されるミトーゲンは、全血からイン
ターフェロン−γを誘導産生しうる、例えば、フィトヘ
マグルチニン、コノカナバリンA。
ポークウィードミトーゲン、スタフィロコッカルエ/テ
ロトキシン(SEA)、リポポリサツカリド、エンドト
キシン、多糖類、細菌などが適宜使用される。
なかでも、フィトヘマグルチニンは、比較的短時間、通
常10〜30時間程度で高活性のインターフェロン−γ
を誘導産生じうろことを見いだし次。
ミトーゲンの使用量としては、全血ml当り10〜10
 、000μ2の範囲が好適である。
また、必要ならば、ウィルス、核酸などのインターフェ
ロン−α誘導剤を共存させて、インター7エロンーrの
産生量を高めたシ、インターフェロン−γとともにイン
ターフェロン−α=t−同時に産生させることも自由で
ある。
全血を抗凝血剤及びミトーゲンと接触せしめ、容器中で
インキュベートするときは、全血に抗凝血剤及びミトー
ゲンを接触せしめて容器中でインターフェロン−γの産
生ができればよく、その操作手順としては、例えば、予
め所定の抗凝血剤及びミトーゲンを入れた容器中に適量
の全血を加えてインキュベートしてもよく、また、抗凝
血剤と全血との混合液を容器に入れ、これにミトーゲン
を加えてインキュベートしてもよい。また、必要ならば
、インキュベートに際して、全血、抗凝血剤、ミトーゲ
ンとともに例えば、生理食塩水、等張緩漬液、栄養培地
などを共存せしめてもよい。
使用される容器としては、その形状、容量の大小を問わ
ず、フラスコ、試験管、アンプル、マイクロプレートウ
ェルなど適宜選択できる。
インキュベート条件としては、インターフェロン−γが
産生できる条件であればよく、例えば30〜40℃にi
o〜90時間程度時間程度−。
このようにしてインキュベートしインターフェロン−γ
を産生じた全血は、そのままで、または必要によシ生理
食塩水、等張の緩衝液などで適宜希釈した後、遠心分離
または濾過などの分離操作によシ血球などの有形成分を
除去した上清またはf液がインターフェロン−γの測定
に供される。
インター7エロンーγの測定方法は、用いた全血からの
インターフェロ7−r産生量が測定できる方法であれば
よ<、例えば、ノ(イオ ア・ノセイ法(Bio As
5ay )、放射免疫測定法(1adi。
Immuno As5ay )、酵素免疫測定法(En
zymeLinked immuno 3orbent
 As5ay )  などの方法力;適宜採用できる。
近年、測定が簡便であり、迅速であり、安全性の高い測
定法として酵素免疫測定法が開発されている。酵素免疫
測定法の場合には、インターフェロン−rが抗原として
測定できる方法であればよく、例えば、二抗体サイトイ
・フチ法、変法二抗体サンドイツチ法などが適宜選択で
きる。
このようにして測定されるインターフェロン−γ産生能
は、採血した個人の臨床化学検査に充分応用できること
が判明した。
また、本発明の方法によって、癌患者から採血した血液
のインターフェロン−γ産生能が、健常者のそれと比較
してきわめて低いことも判明した。
以下、実験で本発明を説明する。
実験1 インターフェロン−γ産生能に及ぼす血液の処
理の有無の影響 インターフェロン−γ産生能に及ぼす血液の処理の有無
の影響を調べた。使用した血液は、健常者3名から採血
したヘパリン加新鮮血を用いた。
処理血液としては、血液を遠心分離し液体成分血漿を除
去して得られる全有形成分をRPM11640培地で血
液と同濃度に浮遊させた血漿除去浮遊液、及び血液を常
法に従って0.75 %塩化アンモニウム含有トリス塩
酸緩衝液(pH7,2)で処理し、赤血球を溶血させ、
遠心分離して採取される赤血球を除去した有形成分eR
PM11640培地で血液と同濃度に浮遊させた塩化ア
ンモニウム処理液を用いた。血液または処理血液1df
ニブラスチツク製試験管にとり、これにフィトヘマグル
チニン−P ’i 0 、50 、500μf含む生理
食塩水0.1−ずつを加え、37℃で24時間インキュ
ベートした。次いで、遠心分離して得られる上清を用い
て、血液17!当シのインターフェロン−γ活性を測定
し、血液のインターフェロン−γ産生能とした。
インターフェロン−γの活性は、ヒトインターフェロン
−γの放射免疫測定用キット(英国、セルチック社製造
、商品名 GAMMAINTERFERON IRMA
 KIT)を用いて測定した。
結果は、第1表に示す。
第  1  表 第1表の結果から明らかなように、血液または血液中の
全有形成分を含んだ血漿除去浮遊液の場合がインターフ
ェロン−γ産生能が高く、その値が安定していることよ
り、インターフェロン−γ産生能測定用試料として好適
である。
赤血球を溶血除去した塩化アンモニウム処理浮遊液の場
合には、インターフェロン−γ産生能が低く、その値も
一定しないことが判明した。
実験2 インターフェロ7−r産生能に及ぼすミトーゲ
ン量の影響 インターフェロン−γ産生能に及ぼすミトーゲン量の影
響を調べた。使用した血液は、健常者3名、癌患者(肝
。癌、胃癌患者各1名)から採取したヘパリン加新鮮血
を用いた。実験1の方法に従って、血液l−を試験管に
とシ、これにミトーゲンとしてフィトヘマグルチニン−
PeOll、10.100.1 、000.10,00
0μ2含む生理食塩水0.1 mtずつを加え、インキ
ュベートした後、血液1−当りのインターフェロン−γ
活性を測定し、血液のインターフェロン−r産生能−と
した。
なお、血液1m/m/フシフィトグルチニンーP  1
00,000μを添加の実験をしようとしたが、これを
満足するだけの溶解がむずかしく、実施が困難であった
結果は第2表に示す。
第  2  表 第2表の結果から明らかなように、ミトーゲン量は血液
−当9 lo〜10,000μ?が好適である。
なお、癌患者から採血した血液のインター7エロンーγ
産生能は、健常者のそれと比較してきわめて低いことが
判明した。また、健常者、癌患者各20名から採血し、
同様に血液ml当り100μmのミトーゲンを使用して
インターフェロン−r産生能を測定したところ、健常者
、癌患者のそれは、それぞれ420±100. 10±
10単位を示した。このことは、採血した血液のインタ
ーフェロン−γ産生能を測定することにより、癌の早期
発見に使用しうるものである。
以下、2〜3の実施例を述べる。
実施例 L 健常者(男、28才)から採血したヘパリン加新鮮血1
−をプラスチック製試験管にとシ、これにフィトヘマグ
ルチニン−p!−250μff加え、37℃で24時間
インキュベートし、次いで遠心分離して得られる上清中
のインターフェロン−γ活性を実験lと同様に放射免疫
測定用キットで測定した。
血液1−当りのインターフェロン−γ産生能は、約42
0単位であった。
実施例 2 健常者(女、33才)から採血したヘパリン加新鮮血1
7!に、コンカナバリンA  500μ?を加え、37
℃で64時間インキュベートし、次いで、実施例1と同
様にしてインターフェロン−γ産生能を測定した。産生
能は血液ml当り約380単位であった。
実施例 3 健常者(男、61才)から採血し之ヘパリ/加新鮮血を
遠心分離して血漿を除去し、得られる全有形成分を生理
食塩水にて遠心洗浄し、次いで、この全有形成分を血液
と同濃度になるようにRPIVLI 1640培地にて
浮遊液とした。
この浮遊液1−をプラスチック製試験管にとシ、これに
ボークウィードミトーゲン 300μfを加え、37℃
で48時間インキュベートし、との標品中のインターフ
ェロン−γ活性を二抗体サンドイツチ法による酵素免疫
測定法で測定した。
血液1rnt当シのインターフェロン−γ産生能は、約
200単位であった。なお、酵素免疫測定法による測定
値は、放射免疫測定法のそれとよく一致した。
実施例 4 肺癌患者(男、68才)から採血したヘパリン加新鮮血
を用いて、実施例1と同様に処理してインターフェロン
−r産生能を測定したところ、約20単位であった。
実施例 5 子宮癌患者(女、55才)から採血したヘパリン加新鮮
血を用いて、実施例1と同様に処理しテインターフェロ
ンーγ産生能を測定したところ、約lO単位であった。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)全血を抗凝血剤及びミトーゲンと接触せしめ、容
    器中でインキュベートし、生成したインターフェロン−
    γを測定することを特徴とする血液のインターフェロン
    −γ産生能測定方法。
  2. (2)ミトーゲンが全血ml当り10〜10,000μ
    gの範囲であることを特徴とする特許請求の範囲第(1
    )項に記載する血液のインターフェロン−γ産生能測定
    方法。
  3. (3)ミトーゲンがフィトヘマグルチニンであることを
    特徴とする特許請求の範囲第(1)項または第(2)項
    記載の血液のインターフェロン−γの産生能測定方法。
JP59280697A 1984-12-30 1984-12-30 血液のインターフェロン−γ産生能測定方法 Expired - Fee Related JPH0765996B2 (ja)

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US06/809,756 US4784946A (en) 1984-12-30 1985-12-17 Method for assaying the gamma-interferon productivity of blood
KR1019850009586A KR940000541B1 (ko) 1984-12-30 1985-12-19 인체고유 감마-인터페론의 제조방법 및 혈액의 감마-인터페론 생산능력 검정방법
CA000498281A CA1264295A (en) 1984-12-30 1985-12-20 Process for producing human-specific gamma-interferon and method for assaying the gamma-interferon productivity of blood
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FR858519382A FR2575475B1 (fr) 1984-12-30 1985-12-30 Production d'interferon-gamma specifiquement humain et procede pour le dosage de l'aptitude du sang a produire cet interferon
DE19853546331 DE3546331A1 (de) 1984-12-30 1985-12-30 Verfahren zur gewinnung von humanspezifischem gamma-interferon und verfahren zur bestimmung der gamma-interferonproduktivitaet von blut

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