JPS60142926A - モノクロ−ナル抗体とその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新リンホカイン１に特異性を示すモノクロー
ナル抗体とその製造方法に関する。

モノクローナル抗体については、Ｃｅｓａｒ　Ｍｉｌｓ
ｔｅｉｎが　「　Ｓｃｉｅｎｔｉｆ　ｉｃ　Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ　Ｊ　Ｖｏ！，　２４３　、　Ｎｏ．　４　、　
５６〜５４頁（１９８０年）で詳細に解説している。

リンホカイン、とりわけ悪性腫瘍に対して障害古性を有
するリンホカインについては、リンホトキシンやツモア
　ネクロシス　ファクターなどが泪られている。

リンホトキシンは、青木隆−ほか共著「リンホカイン」
新免疫学叢書６、８７〜１０５頁（１９７９年）医学書
院、Ｂｌｏｏｍ　Ｂ．　Ｒ．　＆Ｇｌａｄｅ　Ｐ．　Ｒ
．共編［ｌｎＶｉｔｒｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｃｅ
ｌｌ　−＋ｎｅｄｉａｔｅｄ　ｉｍｍｕｎｉｔｙＪＡｃ
ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（　１９７１年）、および
Ｃｅｌ　ｌｕｌａｒ−　’Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏ
ｌ．　３８、３８８　−　４０２頁（　１９７８年）な
どに記載され、ツモア　ネクロシス　ファクターは、Ｃ
ａｒｓｗｅｌｌ　Ｅ．　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．、　Ｐｒ，
　Ｎａｉｌ．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ．　、　［Ｊ．Ｓ．Ａ．　、　Ｖｏｌ．　７２、
Ｎα９、３６６６〜３６７０頁（　１９７５年）および
Ｅ．Ｐｉｃｋ編Ｔｕ＋ｎｏｒ　ＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃ
ｔｏｒ　ｉｎ　Ｌｙｍｐｌ】ｏｋｉｎｅｓ　Ｖｏｌ．　
ｌ、２３５　−　２７２頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ　（１９８１年）などに記載されている。

また、最近、大西冶夫らが特開昭５８−１４６２９３号
公報でリンホカインの一種である抗腫瘍性糖蛋白質を明
らかにしている。

本発明者らは、リンホカインについて多年研究してきた
。その結果、従来知られているこれらのリンホカインと
は、全く違った理化学的性質を有する新リンホカイン■
の存在を認め、そのモノクローナル抗体とその製造方法
を確立して、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、理化学的性質が、■分子量 ２０、ＯＯＯ±２，０００ ■等電点 ｐ■＝　５．６±０．２ ■易動度 Ｄｉｓｃ　−’　ＰＡ（）Ｅで、Ｒｆ＝０．２９±００
２■　紫外線吸収スペクトル ２８０　ｎｍ付近に最大吸収 ■　溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶。

エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに難溶
乃至不溶 ■　呈色反応 ローリ−法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示ず■　作　用 ＫＢ細胞およびＬ９２９細胞に対して細胞障害活性を示
し、インターフェロン活性を実質的に示さず ■　水溶液での活性安定性 ＰＨ７，２で加分間保持する条件により６０℃まで安定
、４℃で１６時間保持する条件によりＰＨ４０乃至１１
．０の範囲で安定、デイスパーゼ（１）ＩＳＰＡＳｇ）
処理により不安定 ■　−１０℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定である新リ
ンホカイン■（本明細書を通じて、本物質を新リンホカ
イン１と言う。）に特異性を示すモノクローナル抗体と
その製造方法に関する。

まず、新リンホカイン１の製造方法について述べる。

新リンホカイン１の製造方法は、新すンホカイン■産生
能を有するヒト由来の細胞、例えば白血球、リンパ球、
培養株化された細胞などに誘導剤を作用させて生成せし
めればよい。

ヒト由来の白血球、リンパ球は、ヒトから採取した血液
を分離して調製すればよい。

培養株化されたヒト由来の細胞は、常法に従って、生体
外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で増殖させた細胞が使用できる
。

しかしながら、本発明の場合には、培養株化された細胞
の増殖に際し、ヒト以外の温血動物体内に直接移植する
か、または拡散チャンバー内へ接種して、その温血動物
の体液の供給を受けながら増殖させる方が望ましい。

即ち、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で増殖させる場合と
は違って、高価な血清などを含む栄養培地が不要、また
は大幅に節約できるばかりではなく、細胞増殖中の維持
管理も極めて容易であり、その上、得られた細胞から誘
導生成される新リンホカイン１活性が高い特徴を有して
いる。

ヒト以外の温血動物を利用する方法は、培養株化されだ
ヒト由来の細胞を、ヒト以外の温血動物体内に移植し、
あるいは、その動物の体液の供給を受けることのできる
拡散チャンバーを動物体内に埋設して通常の飼育をすれ
ば、温血動物体から供給される栄養物を含有する体液を
利用してその細胞が容易に増殖しうるのである。

更に、生体外（ｉｎ　ｖｉ　ｔｒｏ）で増殖させる場合
と比較して、この細胞の増殖が安定であること、その増
殖速度が大きいこと、得られる細胞量が多いこと、更に
は、細胞当りの新リンホカイン■の収量が著しく増加す
ることも大きな特徴である。

本発明で使用する培養株化されたヒト由来の細胞は、ヒ
ト以外の温血動物体内に移植して容易に増殖し得て、し
かも新すンホカインＩ産生能を有する細胞であればよく
、例えば、［蛋白質核酸酵素Ｖｏ１．２（ｌｓ　Ｎα６
　Ｊ　６１６〜６４３頁（１９７５年）に記載されてい
るヒト由来の各種株化細胞を用いることカテきる。とり
わけ、１−Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌへ
４ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、　Ｉ　Ｊ　１１６
〜１１７頁（１９７５年）に記載されているＮａｍａｌ
ｖａ細胞、Ｉ、　Ｍｉｙｏｓｈｉ著「Ｎａｔｕｒｅ　Ｖ
ｏｌ、　２６７　ｊ　８４３〜８４４頁（１９７７年）
に記載されているＢＡＬＬ−１細胞、ＴＡＬＬ−１細胞
、ＮＡＬＬ−１細胞、［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ。

１１３　Ｊ　１．３３４〜１３４５頁（’１．９７４年
）記載のＭ　−７００２細胞、Ｂ−７１０１細胞、「組
織培養」第６巻、第１３号、５２７〜５４６頁（１９８
０年）に記載されているＪ　１３１．、細胞、Ｌ’　１
３　Ｖ　−Ｓａ細胞、ＥＢＶ−Ｗａ細ｌ包、１；：　１
３Ｖ　−１１０ｍ胞、ＭＯＬ　Ｔ　−３細胞ヤ、−ｔの
他ＢＡＬＭ２細胞、ＣＣＲＦ−８Ｂ細胞（Ａ’Ｉ’ＣＣ
ＣＣＬ　１２０）ＣＣ几Ｅ−ＣＥＭ細胞、Ｉ）ＮＤ−４
］細胞などの株化されたリンパ芽球様細胞や、また、正
常な単核細胞顆粒性白血球細胞などを各種ウィルス、薬
剤、放射線などで処理し培養株化させた細胞などが好適
である。

また、これらヒト由来の細胞の新すンホカイン■産生能
を有する遺伝子を、例えば、ポリエチレングリコールや
センダイウィルスなどを利用する細胞融合の手段、ＤＮ
Ａリガーゼ、制限酵素（ヌクレアーゼ）、ＤＮＡポリメ
ラーゼなどの酵素を利用する遺伝子組み換えの手段など
によって処理し、その増殖速度を高めたり、細胞当りの
新すンホカイン■産生能を高めだりして使用してもよく
、本明細書に記載する株化細胞のみに限定されるもので
はない。これらの細胞は、後に述べる新リンホカイン■
を誘導生成させるまでの過程で、単独、または２種以上
を混合して自由に利用される。必要ならば、これに、例
えばヒトから採取し調製される白血球、リンパ球などを
併用することもてきる。

本発明で使用する温血動物は、ヒト由来の細胞が増殖し
得るものであればよく、例えばニヮ）　ｌ）、ハトなど
の鳥類、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ヤキ、フタ、ウマ
、ウノ、モルモット、ラット、ター１−ラット、ハムス
ター、普通マウス、ヌードマウスなどの咄乳類が使用で
きる。

これらの動物にヒト由来の細胞を移植すると好捷しくな
い免疫反応を起すおそれがあるので、その反応をできる
たけ抑えるため、使用する動物はできるだけ幼若な状態
、即ちυ［４、胚、胎児、捷だけ新生期、幼少期のもの
の方が好−ましい。

まだ、これら動物に例えば２００〜６００レム程度のエ
ックス線若しくはガンマ線を照射するが、または抗血清
若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処理をほど
こして、免疫反応を弱めて移植してもよい。

使用する動物がヌードマウスあるいはヌードラットの場
合には、成長したものであっても免疫反１芯が弱いので
、これらの前処理を必要とするとともなく、培養株化さ
れたヒト由来の細胞が移植でき、急速に増殖できるので
特に好都合である。

まだ、培養株化ネれたヒト由来の細胞を例えば先づハム
スターに移植し増殖させた後、この１“ｒ４１Ｉ胞を四
にヌードマウスに移植するなどのように、ヒト以外の温
血動物間で移植してヒト由来の細胞の増殖をより安定化
したり、更にそれらから誘導生成される新すンホカイン
■肝を増加させることも自由である。

この場合、同種間、同属間は勿論のこと、同綱間、同門
間移植であってもよい。ヒト由来の細胞を移植する動物
体内の部位は、移植した細胞が増殖しうる部位であれば
よく、例えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下など自由に選ば
れる。

壕だ、動物体内にヒト由来の細胞を移植することなく、
動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾過膜、例えば孔
径約１０−７〜ＩＬｆ”ｍを有するメンブランフィルタ
−１限外濾過膜捷だはフォローファイバーなどを設けた
公知の各種形状、大きさの拡散チャンバーを動物体内、
例えば腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含む体
液の供給を受けつつ、そのチャンバー内で前述の培養株
化されたヒト由来の細胞を何れも増殖させることができ
る。

また必要に応じて、このチャンバー内の栄養物を含む溶
液を動物体内の体液と接続し、ａ流させるようにしたチ
ャンバーを、例えば動物体表に取付け、チャンバー内の
ヒト由来の細胞の増殖状態をその表ｊｍに設けた窓を通
じて透視できるようにすることも、また、このチャンバ
一部分のみを着脱交換できるようにして動物を塙殺せず
に寿命一杯１削胞を増殖させて、動物個体当りの細胞生
産量を更に高めることもできる。

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来の
１判ｌ胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト由来α
細胞のみが容易に採取できるたけでなく、好ましくない
免疫反応を起す心配も少ないので、免疫反応を抑制する
前処置の必要もなく、各種温血動物を自由に利用できる
特徴を有している。

移植した動物の維持管理は、その動物の通常の飼育管理
を続ければよく、移植後といえども特別の取扱いは何ら
必要としないので好都合である。

ヒト由来の細胞を増殖させるだめの期間は通常１〜１０
週の期間で目的を達成することができる。

このようにして得られるヒト由来の、細胞数は動物個体
当り約１０７〜１０１２個、捷たけそれ以上に達するこ
とも見出した。

換言すれば、動物生体内で増殖させたヒト由来の細胞数
は、動物個体当り移植した４細胞数の約１０２〜１０倍
、またはそれ以上にも達し、生体外の栄養培地に接種し
て増殖させる場合の約１０１〜１０６倍、寸たーそれ以
上にも達して、新すンポヵインＩの製造のために極めて
好都合である。

このようにして増殖させたヒト由来の、細胞から新リン
ホカイン■を誘導生成させる方法は自由である。それが
、増殖した動物体内のま１で新リンホカイン１誘導剤を
作用させることもできる。例えば、腹腔内の腹水に浮遊
状で増殖したヒト由来の細胞に、丑だ皮下に生じた腫瘍
細胞に、ｎ７　＋Ｊンホカイン■誘導剤を直接作用させ
て新すンポヵイン１を誘導生成させ、次いで、その血清
、腹水甘たけ腫瘍から祈リンホカイン１を精製採取すれ
ばよい。

１だ、ヒト由来の増殖♀１１１胞をヒト以外の動物体内
から取り出し、生体外で新すンホカイン■誘導剤を作用
させて新リンホカイン１を誘導生成させることもできる
。例えば、腹水中で増殖したヒト由来の細胞を採取し、
まだは皮下に生じたヒト由来の細胞を含む腫瘍を摘出、
分散［−１得られる細胞を約２０〜４０℃に保った栄養
培地にボ１）１胞濃度が約１０５〜１０８／　ｍｌにな
るよう浮遊させ、これに新リンホカイン１誘導剤を作用
させることによって新リンホカイン■を誘導生成させ、
これを精製採取すればよい。

更に、ヒト由来の細胞を拡散チャンバー内で増殖させた
場合は、増殖させた細胞をチャンバー内のままで、また
はチャンバーから取り出して、新すンホカインＩｉ導剤
を作用させ、新リンホカイン１を誘導生成させることも
できる。

また、前述のようにヒト以外の温血動物を利用して得ら
れるヒト由来の細胞を、必要ならば、更にインビトロで
１〜４日間程一度培養し細胞の増殖世代を同調させるな
どした後、新リンホカイン１誘導剤を作用させ新リンホ
カイン１を誘導生成させることも自由である。

寸だ、例えば、増殖させたヒト由来の細胞に先づ動物体
内のままで新リンホカイン１を誘導生成させた後、次い
で、同一動物個体の特定の部位捷だは全体から採取した
ヒト由来の細胞に動物体外で新リンホカイン１を誘導生
成させる方法、また、一度新リンホカイン１の誘導生成
に使用した細胞を、更に２度以上新すンホカイン■の誘
導生成に使用する方法、捷たは１動物体内に埋設、若し
くは接続するチャンバーを交換して得られる細胞数を増
加させる方法などによって、使用する動物個体当りの新
すンホカイン■生成量を更に高めることも自由である。

本発明の新すンホカイン■誘導剤としては、α−インタ
ーフェロン誘導剤として仰られているウィルス、核酸、
ヌクレオチドなどやｒ−インターフェロン誘導剤として
知られているフィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ
、ポークウィードミトーゲン、リポポリサツカリド、エ
ンドトキシン、多塘類、細菌などが、適宜用いられる。

捷だ、感作化された細胞にとっては、抗原も新リンホカ
イン１の誘導剤である。

更に、ヒト由来の細胞から新リンホカイン■を誘導生成
させるに際し、新すンホカインＩｉ導剤として、α−イ
ンターフェロンＭＮ　４　ｔｔ’ｌ　トｒ−インターフ
ェロン誘導剤とを併用することにより新リンホカイン１
の生産計を高めることも自由である。

また、これら誘導生成によって新リンホカイン１が産生
されるだけでなく、種特異性の高いヒトインターフェロ
ンも同時に産生されることが判明した。

このことは、貴重な２種以上のヒト生理活性物質の同時
生産を可能にし、更に、ヒト由来の細胞の高度利用を可
能にし、新リンホカイン■及びヒ］・インターフェロン
を大量に安価に供給する点からきわめて好都合である。

このようにして誘導生成された酌ｒリンホカイン■は、
公知の精製分離法、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分
離、濃縮、凍結乾燥などを行うことによって容易に精製
分離し、採取することができる。更に高度の精製を必要
とする場合には、例えば、イオン交換体への吸着−ｍ出
、ゲル濾過および等電点分画、電気泳動、イオン交換ク
ロマトグラフィー、高速度液体クロマトグラフィー、カ
ラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフ
イーなと公知の方法を組合せれば、最高純度の新リンホ
カイン■を採取することも可能である。

本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、前述のよう
にして得られた新リンホカイン■を抗原として、ヒト以
外の温血動物を免疫し、該動物から抗体産生細胞を採取
し、この細胞と骨髄腫細胞とを融合せしめ、得られる融
合細胞から新リンホカイン■に特異性を示す抗体産生能
を有する融合細胞を選択し、この選択細胞を増殖させ、
生成した新リンホカインＩに特異性を示すモノクローナ
ル抗体を採取すればよい。

新リンホカインＩで、ヒト以外の温血動物を免疫する方
法は、例えば、ニワトす、ハｌ−、イヌ、ネコ、ザル、
ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、モルモット、ラット
、ハムスター、マウスｆｘト（７）ヒト以外の温血動物
の例えば、静脈、腹腔、皮下などに、抗原として新リン
ホカイン■を水溶液、乳化液、懸濁液などとして注入し
た後、３日以上飼育して抗体産生を誘導すればよい。才
だ、新リンホカイン■を特公昭５Ｂ−２３８４７号公報
に記載している方法で、新リンホカイン■の糖質結合物
に変えた後、抗原として利用することも有利に実施でき
る。

抗原の注入は、１回だけでもよいし、必要ならば、約１
〜５日間隔で２回以上注入してもよい。

このようにして免疫し、抗体産生を誘導させた動物のひ
臓細胞と同種、または異種動物由来の骨ａ腫（ｍｙｅｌ
ｏｍａ　）細胞とを、例えば、ＫＯＩＩ　ｌ　ｅ　ｒな
とが［Ｎａｔｕｒｅ　ｊ　Ｖｏｌ　、　２５６．４９５
−４９７頁（１９７５年）、および「Ｂｕｒ、　Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｊ　Ｖｏｌ、６．５１１〜５１９貞
（１９７６年）で報告している方法により融合せしめ、
得られる融合（ｈｙｂｒｉｄ　）細胞を選択してクロー
／化し、次いで、生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）、まだは生
体内で培養し、この培養物より特異性の高いモノクロー
ナル抗体を採取する。なかでも、生体内での培養は、生
体外の場合と比較して、高価な血清を必要としないばか
りでなく、融合細胞の増殖速度が犬であり、かつ多量の
モノクローナル抗体を産生じ得るので極めて有利である
。

生体内で培養する場合には、免疫して抗体産生を誘導さ
せた動物と同種または異種の温血動物に融合細胞を移植
し、または拡散チャンバー内へ接種してその温血動物の
体液の供給を受けながら増殖させ、得られる腹水、血清
などの体液からモノクローナル抗体を採取するか、捷だ
は、生体内で増殖させた融合細胞を、さらに無血清培地
中で約１〜５日間の短期間培養を行ない、その培養物か
らモノクローナル抗体を採取すればよい。

以上述べたようにして生成したモノクローナル抗体は、
常法に従って、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分離、
濃縮、凍結乾燥などを行うことによって容易に精製分離
し、採取することができる。

更に高度の精製を必要とする場合には、例えば、イオン
交換体への吸着−溶出、ゲル濾過、等電点分画、電気泳
動、イオン交換クロマトグラフィー、高速度液体クロマ
トグラフィー、カラムクロマトグラフィー、アフィニテ
ィクロマｉ・グラフィーなど公知の方法を組合せれば、
最高純度のモノクローナル抗体を採取することも可能で
ある。

また、高純度の新リンホカイン１を、例えば、ブロムシ
アン活性化セファロースなどの担体に固定化し、この固
定化した新すンホカイン■ゲルを用いて精製し、モノク
ローナル抗体を高収率で採取することも有利に利用でき
る。

このようにして得られるモノクローナル抗体は、悪性腫
瘍に対して障害活性を有する新リンホカイン■に特異性
を示すことにより、ヒトの疾病の診断剤、新リンホカイ
ン■を製造するだめのアフィニティクロマトグラフィー
のリガンド（ｌｉｇａｎｄ）などとして有利に利用でき
る。

新リンホカイン■の活性は、標的細胞としてＫＢ細胞、
まだはＬ９２９細胞を用いて測定した。即ち、ＫＢ細胞
を用いる場合には、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ
ａｐｙＲｅｐｏｒｔｓ　Ｐａｒｔｓ　３、Ｖｏｌ、　３
、随２、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　１９７２の記載に準じて
、ＫＢ細胞の増殖抑制活性を測定し、Ｌ９２９細胞を用
いる場合には、Ｅ、　Ｐｉｃｋ編、Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃ
ｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎ
ｅｓ　Ｖｏｌ　。　■　、２４５〜２４９頁、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８１年）の記載に準じて
、アクチノマイシンＤ存在下でのＬ９２９細胞に与える
細胞障害活性を測定した。本明細書では、特にことわら
ない限り、Ｌ９２９細胞を用いる活性測安方法を採用し
た。

以下、本発明の実施例を述べる。

実施例１−１８）　部分精製した新リンホカインｌの調
製 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製し
た抗血清を注射して、ノ・ムスターの免疫反応を弱めた
後、その皮下にＢＡＬＬ−１細胞を移植し、その後通常
の方法で３週間飼育また。皮下に生じた腫瘤を摘出して
細切し、生理食塩水中で分散させほぐした。得られた細
胞を血清添加のＲＰＭＩ　１６４０培地（ｐＨ７，２）
で洗浄し、同培地に約２　Ｘ　Ｉ（１／ｍｅになるよう
懸濁した。本細胞懸濁液に対して、ｍ／！当り約４００
赤血球凝集価のセンダイウィルスを添加し、３７℃で２
４時間保って新リンホカイン■を誘導生成させた。

これを約４℃、約ｉ、ｏｏｏ　ｇで遠心分離し、沈澱物
を除去し、得られた上清をＰＨ７，２，０，０１Ｍ　’
Ｊン酸塩緩衝液を含有する生理食塩水で２０時間透析し
、更に、精密濾過して得だ濾液を、抗インターフェロン
抗体を固定化している抗体カラムに流し、その非吸着画
分を採取し、更に、これをクロマトフォーカッソング法
により活性画分を採取し、濃縮し、凍結乾燥して新リン
ホカイン１活性を含有する粉末を得た。

本粉末の比活性は、約１０単位７ｍ９蛋白質であった。

また、新リンホカイン■の収量は、ハムスター１匹当り
約３，０００万単位であった、実施例１−（ｂ）　抗新
すンホカイン■抗体の調製実施例１−（ａ）の方法で得
だ新リンホカイン■を生理食塩水に蛋白質濃度として約
０．０５　ｗ／ｖ％になるように溶解し、これとフロイ
ンｌ−完全アシュバント乳化液とを等量混合して、この
混合ｔｊ、０．２ｍｌをマウスの皮下に注射し、７日後
再び同様に注射（７てマウスを免疫した。その抗体産生
能を廟する細胞に抗新リンホカイン１抗体を誘導生成せ
しめ、このマウスからひ臓を摘出し、細切分散して得ら
れるひ腫細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３−　Ｘ　６３−　
Ａｇ　８（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）
とを、血清無含有Ｅａｇｌｅの最少基本培地で調製した
５０　ｗ／ｖ％ポリエチレングリコール−１，０００溶
Ｑ（ＰＨ７，２、温度３７℃）に、それぞれ１０’／ｍ
ｌになるように浮遊させて５分間保った後、前記基本培
地で２０倍に希釈し、次いで、Ｄａｖ　ｉ　ｓｏｎなと
がＳｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　ＧｅｎｅｔｉｃｓｌＶｏ
ｌ、　２．１７５〜１７６頁（１９７６年）に報告して
いる方法に準じてヒポキサンチン−アミノプテリン−チ
ミジン培養液で増殖しうる融合細胞を採取し、この融合
細胞から抗新すンホカイン■抗体産生能を有する融合細
胞を選択した。１４！られた融合細胞をマウス腹腔内に
１匹当り約１０個移植して２週間飼育した後、これを屠
殺して腹水、血液などの体液を集め、遠心分離し、この
上清を硫安塩析して飽和度：３０〜５０％の沈澱画分を
集め、次いで透析し、虹に、この液を、実施例１−（ａ
ｌの方法で得た新リンホカイン１をブロムシアン活性化
セファロースと室温下で反応させて得られる固定化新リ
ンホカイン１ゲルを用いてアフィニティ、クロマトグラ
フィーを行ない、抗新リンホカインｌ抗体画分を得、透
析した後、濃縮し、凍結乾燥して、新リンホカイン１の
モノクローナル抗体粉末を採取した。

本品は、新リンホカイン１の細胞障害活性に対して免疫
学的に特異的な中和活性を示した。

このモノクローナル抗体の水浴液での安定性を中和活性
の測定により調べた結果、ＰＨ７２で３０分間保持する
条件では、６０℃で８０％以上の活性が残存し、７０℃
で９０％以上の活性が失なわれた。また、４℃で１６時
間保持する条件で１．Ｈ４，０〜１．１．０の範囲では
安定であり、ＰＨ２，０では９０％以上の活性が失なわ
れた。

更に、このモノクローナル抗体の性質を調べだ結果、２
−メルカプトエタノールに不安定であり、抗マウスイム
ノグロブリンＭ抗体と特異的抗原抗体反応を示すことが
判明した。

従って、このモノクローナル抗体は、イムノグロブリン
間クラスに分類される抗体である。

実施例１−（Ｃ）　高純度に精製した新リンホカイン■
の調製とその理化学的性質 実施例１−（ａ）の方法で調製した新リンホカイン■の
部分精製品を、実施例】−（ｂ）の方法で調製したモノ
クローナル抗体を固定化したゲルを用いてアフィニティ
クロマトグラフィーを行ない、新リンホカインｌの活性
画分を採取し、透析し、濃縮して凍結乾燥した。

本品は、高純度に精製されだ新リンホカイン■であって
、その比活性は、約１０９単位／・ｎｇ蛋白質であった
。また、本品はＫＢ細胞を用いる活性測定方法において
もほぼ同じ比活性を示した。

本品を用いて、理化学的性質を調査した、■分子量 に、　Ｗｅｂｅｒ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｏｓｂｏｍ、　Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　。

Ｖｏｌ、　２４４．４４０６頁（１９６９年）の記載に
準じて、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り調べた。即ち、０１％Ｓ　Ｄ　Ｓ存在Ｆ、　］（１１
％アクリルアミドゲルカラに試別約Ｙｏ）ｚｇを負荷し
、カジノ、当り８ｍＡで４時間泳動後、抽出し、その活
性測定から分子量をめたところ、２０，０００±２、０
００であった。

■等電点 スウェーデン、ｉノＩぐ１３社製、等電点電気泳動用ゲ
ル、商品名Ａへ４Ｐｌ−１０１，１，Ｎ１３　ＰＡＧＰ
Ｌ八Ｔ　ｆへ（、＋＋３．５〜９５）を用いて、２５　
Ｗ　、　２時間泳動した結果、等電点ｐ１は５６±０２
であった。

■　電気易動度 Ｂ、　Ｊ、　ＤａｖｉｓｌＡｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃ
ａｃｌ、　Ｓｃｉ、　、　Ｖｏｌ。

１２】、４０４頁（１９６４年）の記載に準して、７５
％アクリルアミドゲルカラムに試料約１０Ｊｔｇ負荷し
、ＰＨ８，３、カラム当り：３ｍＡで２時間泳動後、抽
出してその活性測定から電気易動度をめたところ、ｌ（
Ｊ　０．２９±００２であった。

■　紫外線吸収スペクトル 株′Ａ、会社島津製作所製の分光光度計、商品名ＵＶ−
２５０を用いて紫外部での吸収スペクトルを調べた結果
、２８０　ｎｍ付近に最大吸収を示した。

（■　溶剤に対する俗解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可ｍ。

エチルエーテル、酢酸エチルｔ　ｉｔ　ｔｒｏｔ　クロ
ロホルムに離溶乃至不溶であった。

■　呈色反応 ローリ−法またはミクロビー−レット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示した。

■作　用 １＜１３細胞およびＬ９２ｙ細胞に対して細胞障害活性
を示した。インターフェロン活性は実質的に示さなかっ
た。

■　水ｍ液での活性安定性 １）熱安定性 約１．Ｘ］Ｏ”単位／ｍｌの試料を各温度ｔこよりＰＨ
７，２で３０分間保持した後、残存する活性を測定した
結果、６０　’Ｃまで安定であった。

！り　ｐｌ］安定性 約１．Ｘ１０６単位／ｍｌの試料０．１ｍｌを各ＰＨ援
（ｉｆｉｆｊ、　（ＰＨ２−７°°Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ
　ｂｕ（ｒｅｒ、　Ｐ）！　７〜８゛＝　Ｐｈｏｓｐｈ
ａｔ　ｂｕｆｆｅｒ、　ＰＨ８〜ＩＩ　−Ｇｌｙｃｉｎ
ｅ　−ＮａＯＨｂｕｆｆｅｒ）　１ｒｎｌに加え、４℃
で１６時間保持した後、この０．１　ｍｌをｐＨ７，２
，００５Ｍリン酸塩緩衝液でＰＨ７２に調整して残存す
る活性を測定した結果、ＰＨ４，０乃至１１．０の範囲
で安定であった。

１１１）ディスパーゼ（ＤＩＳＰＡＳＩシ）に対する安
定性 約１×１０単位／　ｍｌの試料にディスパーゼ（合同酒
精株式会社製造のバシラス属細菌由来のプロテアーゼ）
１００単位／ｍｌになるように加え、ＰＨ７，２１，、
温度３７℃で０乃至２時間反応させ、経時的にサンプリ
ングし、牛血清アルブミンをｌ　ｗ／ｖ％になるように
加えて反応を止めた。この液の新リンホカインｌの残存
活性を測定した結果、新リンホカイン■はディスパーゼ
処理により不安定で、その反応につれて新リンホカイン
■の活性が失なわれた。

■　凍結貯蔵による安定性 ＰＨ７，２の水溶液を一１０℃で凍結し１ケ月間貯蔵し
た後、融解し、活性を測定した結果、活性の低下は見ら
れなかった。

以上の結果から、新リンホカイン１は、従来知られてい
るリンホトキ・ンニ／、Ｉｌｌ　Ｎ　Ｆｌ　インターフ
ェロンなどのリンホカインとは、明らかに違った理化学
的性質を有する。

従って、新リンホカイン１の細胞障害活性と免　。

疫学的に特異的中和性を示す本発明のモノクローナル抗
体は、新規なモノクローナル抗体である。

実施例　２ 実施例１−（Ｃ）の方法で得た高純度新リンホカイン■
を抗原に用いた以外は、実施例１−（ｂ）と同様にマウ
スを免疫して得られたひ臓細胞とマウス骨儲鵬細胞Ｐ３
−ＮＳ−１／１−Ａｇ４−１　（大日本製薬株式会社製
）とを、１４０ｍＭ　ＮａＣ１，５４ｍＭ　Ｋ　ＣＩ　
。

１　ｍＭ　Ｎａｌ−１２ＰＯ４，２ｍＭ　ＣａＣｌ２を
含有する塩類溶液に、それぞれ１０　／ｍｅになるよう
に浮遊させ、これに、予じめ紫外線で不活化したセンダ
イウィルスを含有する前記塩類溶液を水冷下で混合し、
この混合液を５分後に３７℃の１．ｔ　Ｐ　ＩＶＩ　Ｊ
培地で約２０倍に希釈し、次いで、実施例１〜（１））
と同様にして抗ｌスリノホ力イン］産生能を有する融合
細胞を選択した。

得られた融合細胞を、公知の方法で免疫反応を弱めた生
後７日のハムスターの腹腔内に１匹当り約１０個移植し
、実施例ｉ　−（１〕）と同様にし７てモノクローナル
抗体を採ルした。

本市は、実施例１１ｂ）で調製したモノクローナル抗体
と同様に新リンホカイン■の細胞障害活性に対し免疫学
的に特異的中和活性を示した。

このモノクローナル抗体の水溶液での安定性を、その中
和活性の測定により調べた結果、ｐＨ７，２で３０分間
保持する条件では、６０℃で８℃％以」二の活性が残存
し、７０℃で９０％以上の活性が失なわれた。寸だ、４
℃で１６時間保持する条件では、ＰＨ２，０〜１１０の
範囲で安定であった。

更に、このモノクローナル抗体の性質を調べた結果、２
−メルカプトエタノールに安定であり、抗マウスイムノ
グロブリンＯ抗体と特異的抗原抗体反応を示すことが判
明した。

従って、このモノクローナル抗体は、イムノグロブリン
（３クラスに分類される抗体である。

実施例　３ 実施例２の方法のうち、マウス嘴髄腫細胞Ｐ３−ＮＳ−
１／ｘ−Ａ、ｇ　４−　］の代りに、ＳＰ２１０４ｇ１
４　（犬日本製薬株式会社製）を用いた以外は、実施例
２と同様に行ない、新リンホカイン■のモノクローナル
抗体を製造した。

本市は、新リンホカイン１の細胞障害活性と免疫学的に
特異的中和性を調ベプこところ、実施例２の場合と同様
の結果が得られた。

従って、このモノクローナル抗体は、イムノグロブリン
Ｇクラスに分類される抗体である。

特許出！頭人 手続補正書 昭和５９年１２月１５日 １　事件の表示 昭和５８年特許願第２４４５９８号 ２　発明の名称 モノクローナル抗体とその製造方法 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４　補正の対象 明細書の１特許請求の範囲」および ５　補正の内容 （１）［−特許請求の範囲」の項を、別紙の通り補正し
まず。

（２）　明＋Ｍ１　！１第６ＪＥｊ第１０行記載ノ１−
可溶。」を１−可溶、」に補正し１ず。

（３）同第６頁第１８〜１９行記載の［Ｋ　Ｂ細胞およ
びＬ９２９　、ｉ：ｌ］胞に対して細胞障害活性を示し
、」を「１〈■３細胞に対して細胞増殖抑制活性をおよ
び１ノ９２９　、ｊ４１１］　Ｅに対して細胞障害活性
を示し、」に補正し−まず。

（４）同第用頁第２行記載の［ＣＣＲ，Ｅ−ＣＩ号〜１
細胞、」をｌ　ＣＣＩＮＦ　−ＣＥＭ細胞、ゴに補正し
丑す。

（５）　同第］９頁第１６行記載のＪ’ＫｏｈｌｃｒＪ
をｌ’Ｇ、　ｆ（ｏｈｌｅｒ　ｊに補正します。

（６）　同？Ｘ２２貞第９〜１ｏ行記載ノ１−活性ｒ１
４１１安方法を採用した。」を「活性測定方法を採用し
た。」に補正します。

（７）同頁Ｑ％　２８頁り８行記城の１Ｍ、　Ｏｓｂｏ
ｍ、　ｊを「ＩＶＩ、　０ｓｂｏｒｎ、　Ｊに補正し寸
す。

（８）同第２８＠第１１〜１２行記或の［Ｋ　Ｂ　、Ｙ
ＩＩＩ胞および１．９ｚ９．１１胞に対して細胞障害活
性を示した。」を１Ｋ　Ｂ細胞に対して細胞増殖抑制活
性をおよびＬ９２９細胞に対して細胞障害活性を示した
。」に補正します。

（９）同第２９頁第２行記載のｌ’Ｐｈｏｓｐｈａｔ　
ｂｕｆｆｅｒ、　Ｊを［Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆ
ｅｒ、　Ｊに補正します。

（１０）　同第３０頁第５行記載のビ１’　Ｎ　Ｆ　Ｊ
を「ツモアネクロ／ス　ファクター（ｉ″Ｎｌ”）Ｊに
補正し捷す。

（Ｉυ　同第３１頁第７行記載の「約１０個移植し、」
を「約１０　個移植し、」に補正１〜斗す。

２、特許請求の範囲 （１）　理化学的性質が、 ■分子量 ２０．０００±２，０００ ■等電点 ｐＪ、＝＝５．５±０．２ ■易動度 Ｄｉｓｃ　−ＰＡＧＥで、Ｒｆ＝０．２ｇ±００２■　
紫外線吸収スペクトル ２８０１ｍ付近に最大吸収 ■　溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶、エチルエ
ーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに難溶乃至不ｍ
０ ■　呈色反応 ローリ−法捷たはミクロビー−レット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法捷だはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示す０作　用 びＬ　９２９　、ｌ＋ｌＢ胞に対して細胞障害活性を示
し、インターフェロン活性を実質的に示さす ■　水溶液での活性安定性 ｐｌＩ７２で１３０分間保持する条件により６０　℃ｔ
で安定、４℃で１６時間保持する条件によりｐＨ４，０
乃至１１．０の範囲で安定、デイスパーゼ（１）ＬＳＬ
’ＡＳＥ）処理によシネ安定■　−１０℃での凍結貯蔵
で１ケ月以上安定である新リンホカインＩに対して特異
性を示すモノクローナル抗体、 （２）　理化学的性質が、 ■分子量 ２０、ＯＯＯ±２，０００ ■等電点 ｐ１＝５．６±０．２ ■易動度 Ｄｉ　ｓｃ　−ＰＡＧＥテ、Ｉ（ｆ　＝０．２９±０．
０２■　紫外線吸収スペクトル ２８０＋ｉｍ付近に最大吸収 ■　溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶、エチルエ
ーテル、酢酸エチルまだＩはクロロホルムに難溶乃至不
溶 ■　呈色反応 ローリ−法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示す０作　用 びＬ９２９　Ｈｉｌｌ胞に対して細胞障害活性を示し、
インターフェロン活性を実質的に示さす ■　水溶液での活性安定性 ｐＨ７，２で（９）分間保持する条件により０℃まで安
定、４℃で１６時間保持する条件によりｐｌ−１４，０
乃至１１．０の範囲で安定、デイスパーゼ（１）ＩＳｌ
’ＡＳｈ：）処理により不安定■　−１０℃での凍結貯
蔵で１ケ月以上安定である新リンホカインＩを抗原とし
てヒト以外の温血動物を免疫し、該動物から抗体産生細
胞を採取し、これと骨髄腫細胞とを融合せしめ、得られ
る融合細胞から抗折リンフＩ＝、カインＩ抗体産生能を
有する融合訓胞を選択し、次いで、この選択細胞を増夕
（αさせ新リンホカインＩに特異性を示すモノクローナ
ル抗体を産勺三せｌ、めることを特徴としたモノクロー
ナル抗体の製造方法。

手続補正書 昭和６０年２月号日 特許庁長官　志　賀　学　殿 ］、事件の表示 昭和５８年特許願第２４４５９８号 ２　発明の名称 モノクローナル抗体とその製造方法 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 昭和６０年１月２８日 ５　補正の対象 昭和５９年１２月１５日付手続補正書の「補正の内容」
欄 ６、補正の内容 補正の内容（７）中の「同頁第２８頁第１８行」を「同
第２６頁第１８行」に補正します。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）理化学的性質が、 ■分子量 ２０、ＯＯＯ±２，０００ ■等電点 ｐｉ＝５．６±０２ ■易動度 Ｄｉｓｃ　−ＰＡｏｌうで、Ｉ’ｌ、ｆ＝０．２９±０
   ０２■　紫外線吸収スペクトル ２８０　ｎｍイづ近に最大吸収 ■　溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水捷だけリン酸塩緩衝液に可溶。エチルエ
   ーテル、酢酸エチルまだはクロロホルムに難溶乃至不溶
   。 ■　呈色反応 ローリ−法まだはミクロビー−レット法で蛋白質陽性反
   応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
   糖質陽性反応を示す０作　用 ＫＢ細胞およびＬ９２９細胞に対して細胞障害活性を示
   し、インターフェロン活性を実質的に示さず ■　水溶液での活性安定性 ＰＨ７，２で３０分間保持する条件により６０　’Ｃ−
   ｊで安定、４℃で１６時間保持する条件によりＰＨ４０
   乃至１１０の範囲で安定、デイスパーゼ（ＤｉＳＰＡＳ
   Ｅ）処理により不安定 ■　−１０℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定である新リ
   ンホカイン■に対して特異性を示すモノクローナル抗体
   。 （２）　理化学的性質が、 ■分子量 ２０．０００±２，０００ ■等電点 ｐＩ＝５．６±０２ ■易動度 １）ｉｓｃ　−ＰＡＧＥで、Ｒｆ＝０．２９±００２■
   　紫外線吸収スペクトル ２８０　ｎｍ付近に最大吸収 ■　溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水または１ノン酸１話緩衝液に可溶。エチ
   ルエーテル、酢酸エチルまだはクロロホルムに難溶乃至
   不溶 ■　呈色反応 口−り一法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
   応を示し、フェノール（Ｉｉ１１酸法またはアン）ｏン
   硫酸法で糖りｇｌ場性反［邑を示す０作　用 Ｋ　１３細胞およびＬ９２９細胞に文寸してｉｔ（ＩＩ
   　ｌｌ担１旅害ｌ舌１生を示し、インターフェロン！舌
   ４生を実Ｊ色的に示さず ■　水ｍ液での活性安定性 ＰＨ　７．２で３０分間保持する条件により６０　’Ｃ
   　ｉで安定、４℃で１６時間保持する条イ牛によりｐ）
   ］４０乃至１１０の範囲で安定、デイスノ＜ーセ（＋）
   ｌｓＰＡｓｇ）処理により不安定■　−１０℃での凍結
   貯蔵で１ケ月以上安定である新リンホカイン■を抗原と
   してヒト以外の温血動物を免疫し、該動物から抗体産生
   細胞を採取し、これと骨髄腫細胞とを融合せしめ、得ら
   れる融合細胞から抗新すンホカイン■抗体産生能を有す
   る融合細胞を選択し、次いで、この選択細胞を増殖させ
   新リンホカイン■に特異性を示すモノクローナル抗体を
   産生せしめることを特徴としたモノクローナル抗体の製
   造方法。