JPS59208463A - ルミネツセント標識を含む固相イムノアツセイ法 - Google Patents
ルミネツセント標識を含む固相イムノアツセイ法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、液体試料中の被分析体である抗原、ハプテン
もしくは抗体、または細胞その他の粒状物質上に存在す
るか、もしくはこれらに付着している被分析体を定量す
るためのルミネッセント標識を使用する固相イムノアッ
セイ法に関する。
もしくは抗体、または細胞その他の粒状物質上に存在す
るか、もしくはこれらに付着している被分析体を定量す
るためのルミネッセント標識を使用する固相イムノアッ
セイ法に関する。
生物学的由来の物質を検出するためには多数の方法があ
る。方法論的に１つの大きな群をなすも（力 のはイムノアッセイである。この方法では抗原（または
ハプテン）およびそれらに対応する抗体を用いて試料を
相互に結合させる。イムノアッセイのきわめて重要な一
方法は固相イムノアッセイテアル（参照：キャラトラ、
Ｊ 、ＢＩＯＣＨＥＭ、 、 １００ ：３１ｃ（１９
６Ｓ）：キャットら、５ＣＩＥＮＣＥ 、 １５８ ：
１５７０（１９６７）；米国特許第３，６４６，３４６
号明細書（キャットら）；これらの参考文献および特許
明細書、ならびにのちに引用する参考文献および特許明
細書を関連する箇所で参考のため引用する）。
る。方法論的に１つの大きな群をなすも（力 のはイムノアッセイである。この方法では抗原（または
ハプテン）およびそれらに対応する抗体を用いて試料を
相互に結合させる。イムノアッセイのきわめて重要な一
方法は固相イムノアッセイテアル（参照：キャラトラ、
Ｊ 、ＢＩＯＣＨＥＭ、 、 １００ ：３１ｃ（１９
６Ｓ）：キャットら、５ＣＩＥＮＣＥ 、 １５８ ：
１５７０（１９６７）；米国特許第３，６４６，３４６
号明細書（キャットら）；これらの参考文献および特許
明細書、ならびにのちに引用する参考文献および特許明
細書を関連する箇所で参考のため引用する）。
放射能をもつ原子、たとえば１２５工、′３１工、３Ｈ
および１４Ｃが固相イムノアッセイにおいて標識として
慣用されている。これによる同相ラジオイムノアッセイ
はきわめて高感度であるが、一般に認められている欠点
をもつ。標識物の放射性のため、このアッセイには厳重
な規制条件が与えられ、試薬の保存寿命が比較的短かく
、また廃棄物処理の問題が生じる。
および１４Ｃが固相イムノアッセイにおいて標識として
慣用されている。これによる同相ラジオイムノアッセイ
はきわめて高感度であるが、一般に認められている欠点
をもつ。標識物の放射性のため、このアッセイには厳重
な規制条件が与えられ、試薬の保存寿命が比較的短かく
、また廃棄物処理の問題が生じる。
ラジオイムノアッセイの欠点を克服するために。
（８）
代替となる標識法が幾つか開発された。これらのうち主
なものは、放射性標識の代わりに酵素を用いる酵素イム
ノアッセイ（ＥＩＡ、 ＥＬＩＳＡ）である（米国特許
第３，５５１，５５５号明細書（シュールズ）参照）。
なものは、放射性標識の代わりに酵素を用いる酵素イム
ノアッセイ（ＥＩＡ、 ＥＬＩＳＡ）である（米国特許
第３，５５１，５５５号明細書（シュールズ）参照）。
標識として慣用されるものは西洋ワサビのＲルオキシダ
ーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、およびグルコースオキシダーゼである。酵素イムノ
アッセイは、酵素標識がきわめて安定であり、特殊な設
備および機器を必要としない点で、ラジオイムノアッセ
イよりも有利である。しかし酵素イムノアッセイは一般
にラジオイムノアッセイよりも時間を要し、実施するの
にいっそう手間がかかる。
ーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、およびグルコースオキシダーゼである。酵素イムノ
アッセイは、酵素標識がきわめて安定であり、特殊な設
備および機器を必要としない点で、ラジオイムノアッセ
イよりも有利である。しかし酵素イムノアッセイは一般
にラジオイムノアッセイよりも時間を要し、実施するの
にいっそう手間がかかる。
ルミネッセント標識が放射性標識または酵素標識の代わ
りに用いられている（参照：米国特許第４．２０１，７
６３号（モンソニーら）；米国特許第６．９９２，６６
１号（）・ルテ）；米国特許第５，９９９，９４８号（
ディンプルファーら）各明細書；Ａ。クーン著「螢光抗
体法」；Ｊ。ダニエリ編「一般細胞化学的方法」ｖｏ：
ｃ、１）。フルオレセインが最も一般的に用いられてい
る標識である。螢光イムノアッセイはラジオイムノアッ
セイがもつ使用し易さという利点、および酵素イムノア
ッセイがもつ試薬の安定性という利点をもつが、先行技
術による螢光イムノアッセイにはラジオイムノアッセイ
または酵素イムノアッセイがもつ感度の高さがいずれも
欠如している。この感度の欠如は研究用および臨床用に
問題であり、従って螢光イムノアッセイはこれらの用途
におけるアッセイのためにはほとんど選択されていない
。
りに用いられている（参照：米国特許第４．２０１，７
６３号（モンソニーら）；米国特許第６．９９２，６６
１号（）・ルテ）；米国特許第５，９９９，９４８号（
ディンプルファーら）各明細書；Ａ。クーン著「螢光抗
体法」；Ｊ。ダニエリ編「一般細胞化学的方法」ｖｏ：
ｃ、１）。フルオレセインが最も一般的に用いられてい
る標識である。螢光イムノアッセイはラジオイムノアッ
セイがもつ使用し易さという利点、および酵素イムノア
ッセイがもつ試薬の安定性という利点をもつが、先行技
術による螢光イムノアッセイにはラジオイムノアッセイ
または酵素イムノアッセイがもつ感度の高さがいずれも
欠如している。この感度の欠如は研究用および臨床用に
問題であり、従って螢光イムノアッセイはこれらの用途
におけるアッセイのためにはほとんど選択されていない
。
本発明によれば、液体試料中の被験物質である抗原、ハ
プテンまたは抗体を定量するための固相イムノアッセイ
法が提供される。この固相イムノアッセイには螢光標識
、燐光標識または原子螢光標識などのルミネッセント標
識が含まれる。
プテンまたは抗体を定量するための固相イムノアッセイ
法が提供される。この固相イムノアッセイには螢光標識
、燐光標識または原子螢光標識などのルミネッセント標
識が含まれる。
本発明の固相イムノアッセイには免疫反応体が付着した
（１）寸法約１０μｍ以下の多数の水不溶性粒子、また
は叩細胞が用いられる。被分析体、または被分析体を含
有する反応生成物、前記粒子もしくは細胞が実質的に懸
濁した状態で免疫反応体と反応させるか、または免疫反
応体と競合的にもしくは免疫反応体に対して競合的に反
応させる。ルミネッセント標識が付着したまたは後続の
反応により付着する粒子または細胞をミクロ沖過（ｍｉ
、ｃｒｏｆｉｌ、ｔｒａｔ、１ｏｎ）により濃縮して、
借切に被分析体を含有していた液体試料の容積よりも実
質的に小さい容積にする。濃縮された粒子または細胞に
付着したルミネッセント標識の実質的にすべてのルミネ
ッセンスを測定する。
（１）寸法約１０μｍ以下の多数の水不溶性粒子、また
は叩細胞が用いられる。被分析体、または被分析体を含
有する反応生成物、前記粒子もしくは細胞が実質的に懸
濁した状態で免疫反応体と反応させるか、または免疫反
応体と競合的にもしくは免疫反応体に対して競合的に反
応させる。ルミネッセント標識が付着したまたは後続の
反応により付着する粒子または細胞をミクロ沖過（ｍｉ
、ｃｒｏｆｉｌ、ｔｒａｔ、１ｏｎ）により濃縮して、
借切に被分析体を含有していた液体試料の容積よりも実
質的に小さい容積にする。濃縮された粒子または細胞に
付着したルミネッセント標識の実質的にすべてのルミネ
ッセンスを測定する。
また本発明によれば、液体試料中に含有される細胞その
他の粒状物質上に存在するか、またはこれらに付着した
被分析体を定量するための固相イムノアッセイ法が提供
される。この同相イムノアッセイには前記のルミネッセ
ント標識が用いられる。
他の粒状物質上に存在するか、またはこれらに付着した
被分析体を定量するための固相イムノアッセイ法が提供
される。この同相イムノアッセイには前記のルミネッセ
ント標識が用いられる。
被分析体、たとえば表面抗原、可溶性蛋白質、・・ブテ
ンもしくはウィルス、または被分析体を含有する反応生
成物を、これらの被分析体が存在するか、または付着し
ている細胞または粒状物質を実質的に懸濁した状態にし
て、免疫反応体と反応させるか、または免疫反応体と競
合的にもしくは免疫反応体に対して競合的に反応させる
。ルミネッセント標識が付着した、または後続の反応に
より付着する粒子または細胞をミクロ濾過により濃縮し
て、液体試料の容量よりも実質的に小さな容量にする。
ンもしくはウィルス、または被分析体を含有する反応生
成物を、これらの被分析体が存在するか、または付着し
ている細胞または粒状物質を実質的に懸濁した状態にし
て、免疫反応体と反応させるか、または免疫反応体と競
合的にもしくは免疫反応体に対して競合的に反応させる
。ルミネッセント標識が付着した、または後続の反応に
より付着する粒子または細胞をミクロ濾過により濃縮し
て、液体試料の容量よりも実質的に小さな容量にする。
濃縮された細胞に付着したルミネッセント標識の実質的
にすべてのルミネッセンスを測定する。
にすべてのルミネッセンスを測定する。
液体試料中の被分析体を定量するためのアッセイには、
寸法（すなわち直径）約１０μｍ以下の細胞または多数
の水不溶性粒子からなる粒状固相を用いる。粒子は細菌
、哺乳動物細胞の断片、まりに’ｒｌリマー性支持体た
とえばポリスチレンラテックスであってもよい。粒子は
標識を励起するビーム、および得られるルミネッセンス
に対して実質的に透明であろう。
寸法（すなわち直径）約１０μｍ以下の細胞または多数
の水不溶性粒子からなる粒状固相を用いる。粒子は細菌
、哺乳動物細胞の断片、まりに’ｒｌリマー性支持体た
とえばポリスチレンラテックスであってもよい。粒子は
標識を励起するビーム、および得られるルミネッセンス
に対して実質的に透明であろう。
アッセイの速度および感度は被分析体（または被分析体
を含有する反応生成物）を同相が懸濁された状態で該同
相上の免疫反応体と反応させるか、またはこれと競合的
に反応させることにより高められる。粒状同相の表面積
が大きいため、多量の免疫反応体を反応の場に供するこ
とができる。固相を実質的に懸濁させることにより、こ
れらの免疫反応体を被分析体（または被分析体を含有す
る反応生成物）を含有する液状媒質全体に分散させる。
を含有する反応生成物）を同相が懸濁された状態で該同
相上の免疫反応体と反応させるか、またはこれと競合的
に反応させることにより高められる。粒状同相の表面積
が大きいため、多量の免疫反応体を反応の場に供するこ
とができる。固相を実質的に懸濁させることにより、こ
れらの免疫反応体を被分析体（または被分析体を含有す
る反応生成物）を含有する液状媒質全体に分散させる。
これにより被分析体、または被分析体を含有する反応生
成物に関する反応が迅速かつ完全になる。
成物に関する反応が迅速かつ完全になる。
細胞その他の粒状物質上に存在するかまたはこれらに付
着する被分析体の定量のためのアッセイでは、これらの
細胞または粒状物質が同相として用いられる。細胞はた
とえば＃ｌＩＩ菌または補乳動物の細胞であってもよく
、一方粒状物質は細胞断片またはポリマー性の支持体か
らなっていてもよい。
着する被分析体の定量のためのアッセイでは、これらの
細胞または粒状物質が同相として用いられる。細胞はた
とえば＃ｌＩＩ菌または補乳動物の細胞であってもよく
、一方粒状物質は細胞断片またはポリマー性の支持体か
らなっていてもよい。
このアッセイの速度および感度は、同様に被分析体、ま
たは被分析体を含有する反応生成物を、細胞または粒状
物質を懸濁状態として免疫反応体と反応させるか、また
は免疫反応体と競合的にもしくは免疫反応体に対して競
合的に反応させることにより高められる。
たは被分析体を含有する反応生成物を、細胞または粒状
物質を懸濁状態として免疫反応体と反応させるか、また
は免疫反応体と競合的にもしくは免疫反応体に対して競
合的に反応させることにより高められる。
いずれのアッセイの同相もミクロ沖過によって液体試料
の容積よりも実質的に小さな容積にまで濃縮することが
できる。これにより２つの利点が得られる。第１に、被
分析体を定量前に濃縮することができ、これによりアッ
セイの感度が実質的に濃縮率に等しい率だけ増大する。
の容積よりも実質的に小さな容積にまで濃縮することが
できる。これにより２つの利点が得られる。第１に、被
分析体を定量前に濃縮することができ、これによりアッ
セイの感度が実質的に濃縮率に等しい率だけ増大する。
第２に、同相の容積をルミネッセンス測定装置（たとえ
ば前面螢光計）が実質的にすべてのルミネッセント標識
を観察しうる容積にまで濃縮することができる。
ば前面螢光計）が実質的にすべてのルミネッセント標識
を観察しうる容積にまで濃縮することができる。
代表的な固相は、たとえば免疫反応体が付着した０、８
μｍの粒子の０．３容量％懸濁液からなっていてもよい
。この懸濁液２０μｌに含有される同相は表面積４．４
函および体積０．０６μｌをもつ。したがって、液体試
料１００μｌＶＣ含有される被分析体は、理論上免疫反
応体との反応およびミクロ濾過ののち１，６６７倍に濃
縮することが可能である。少量の同相を済過して寸法（
すなわち直径）１〜５鮨のスポットを形成させることが
好都合である。次いで被分析体を、標識された免疫反応
体と反応させることができる。これにより実質的にすべ
ての固相を前面螢光計により観察することができるであ
ろう。
μｍの粒子の０．３容量％懸濁液からなっていてもよい
。この懸濁液２０μｌに含有される同相は表面積４．４
函および体積０．０６μｌをもつ。したがって、液体試
料１００μｌＶＣ含有される被分析体は、理論上免疫反
応体との反応およびミクロ濾過ののち１，６６７倍に濃
縮することが可能である。少量の同相を済過して寸法（
すなわち直径）１〜５鮨のスポットを形成させることが
好都合である。次いで被分析体を、標識された免疫反応
体と反応させることができる。これにより実質的にすべ
ての固相を前面螢光計により観察することができるであ
ろう。
本発明のアッセイは、体液たとえば血清、血漿、尿、唾
液、または体液以外の液体たとえば細胞培養液、飲料水
または廃液などの液体試料に含有される被分析体である
ｌ原、ハプテンもしくは抗体の定量のため並びに細胞そ
の他の粒状物質上に存在するか、もしくはこれらに付着
するこれら被分析体を定量するために有用である。さら
に関心を引く多種の生物学的物質が天然に粒状で存在す
る。
液、または体液以外の液体たとえば細胞培養液、飲料水
または廃液などの液体試料に含有される被分析体である
ｌ原、ハプテンもしくは抗体の定量のため並びに細胞そ
の他の粒状物質上に存在するか、もしくはこれらに付着
するこれら被分析体を定量するために有用である。さら
に関心を引く多種の生物学的物質が天然に粒状で存在す
る。
その例は細菌性抗原および哺乳動物細胞の表面抗原であ
る。８用胞その他の粒状物質上に存在するか、またはこ
れらに付着する被分析体の定量のためのアッセイを、こ
れらの系にそのまま適用することができる。さらに、生
細胞についてアッセイを行うこともできる。可溶性の蛋
白質、ハプテンおよびウィルスは既知の方法で（米国特
許第４，２０１．７６３号明細書（モンソニーら）勢照
）、既知の方法により製造された顕微鏡的サイズのラテ
ックス粒子（ブラックレイ編「乳化重合」、アプライド
・サイエンス・パノリッシャーズ出版、英国エセックス
、１９７５）に付着させることができる。
る。８用胞その他の粒状物質上に存在するか、またはこ
れらに付着する被分析体の定量のためのアッセイを、こ
れらの系にそのまま適用することができる。さらに、生
細胞についてアッセイを行うこともできる。可溶性の蛋
白質、ハプテンおよびウィルスは既知の方法で（米国特
許第４，２０１．７６３号明細書（モンソニーら）勢照
）、既知の方法により製造された顕微鏡的サイズのラテ
ックス粒子（ブラックレイ編「乳化重合」、アプライド
・サイエンス・パノリッシャーズ出版、英国エセックス
、１９７５）に付着させることができる。
本発明のアッセイ法を実施するに際しては、多数の代替
となるアッセイ構成を採用することができる。以下にこ
れらの可能なアッセイ構成の幾つかにつき説明する。
となるアッセイ構成を採用することができる。以下にこ
れらの可能なアッセイ構成の幾つかにつき説明する。
液体試料中の被分析体である抗原、ハプテンまたは抗体
を定量するためのサントゝイソチ型アッセイにおいては
、被分析体に結合するかまたは被分析体により結合され
る免疫反応体を、被分析体と反応させるために同相に付
着させることができる。
を定量するためのサントゝイソチ型アッセイにおいては
、被分析体に結合するかまたは被分析体により結合され
る免疫反応体を、被分析体と反応させるために同相に付
着させることができる。
得られた固相（これに後続の反応によりルミネッセント
標識が付着するであろう）をミクロ濾過により濃縮する
ことができる。このミクロ濾過ののち、結合した被分析
体をルミネッセント標識された物質と化学的に、または
免疫学的に反応させる。
標識が付着するであろう）をミクロ濾過により濃縮する
ことができる。このミクロ濾過ののち、結合した被分析
体をルミネッセント標識された物質と化学的に、または
免疫学的に反応させる。
代替法においては、被分析体を含む同相を濃縮工程の前
にルミネッセント標識物質と化学的にまたは免疫学的に
反応させることもできる。後者の場合、ルミネッセント
標識が付着した固相をミクロ濾過により濃縮する。
にルミネッセント標識物質と化学的にまたは免疫学的に
反応させることもできる。後者の場合、ルミネッセント
標識が付着した固相をミクロ濾過により濃縮する。
他の代替法としてたとえば被分析体に、該被分析体に対
し特異的な第１抗体を結合させることができ、一方ルミ
ネッセント標識は該第１抗体に特異的な標識された第２
抗体である。この場合被分析体は第１抗体と免疫学的に
反応し、被分析体を含有する反応生成物を形成する。被
分析体を含有する反応生成物は、ある種の物質と被分析
体の化学反応によって形成させることもできる。上記の
サント９イツチ型アツセイ工程はいずれの場合も、被分
析体を含有する反応生成物に適用することができるであ
ろう。
し特異的な第１抗体を結合させることができ、一方ルミ
ネッセント標識は該第１抗体に特異的な標識された第２
抗体である。この場合被分析体は第１抗体と免疫学的に
反応し、被分析体を含有する反応生成物を形成する。被
分析体を含有する反応生成物は、ある種の物質と被分析
体の化学反応によって形成させることもできる。上記の
サント９イツチ型アツセイ工程はいずれの場合も、被分
析体を含有する反応生成物に適用することができるであ
ろう。
さらに他の代替法として、被分析体をルミネッセント標
識された物質と反応させて、同相に付着した免疫反応体
と反応させる前に被分析体を含有する反応生成物を形成
させることができる。
識された物質と反応させて、同相に付着した免疫反応体
と反応させる前に被分析体を含有する反応生成物を形成
させることができる。
液体試料中の被分析体である抗原、ハプテンまたは抗体
を定！するための遂次飽和アッセイ（Ｓｅｑｕｅｎｔｉ
ａｌ ５ａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）においては
、免疫反応体を同相に付着させ、過剰量の免疫反応体を
被分析体と反応させる。ルミネッセント標識された物質
を、ミクロ沖過による固相の濃縮の前または後に、残存
する免疫反応体部位と反応させることができる。こうし
て、ルミネッセント標識された物質が付着した、または
後続の反応により付着する同相がミクロ涙過により濃縮
される。あるいは、化学的または免疫化学的に形成され
た、被分析体を含有する反応生成物について遂次飽和ア
ッセイを行うこともできる。この被分析体を含有する生
成物を上記のように免疫反応体と反応させる。
を定！するための遂次飽和アッセイ（Ｓｅｑｕｅｎｔｉ
ａｌ ５ａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）においては
、免疫反応体を同相に付着させ、過剰量の免疫反応体を
被分析体と反応させる。ルミネッセント標識された物質
を、ミクロ沖過による固相の濃縮の前または後に、残存
する免疫反応体部位と反応させることができる。こうし
て、ルミネッセント標識された物質が付着した、または
後続の反応により付着する同相がミクロ涙過により濃縮
される。あるいは、化学的または免疫化学的に形成され
た、被分析体を含有する反応生成物について遂次飽和ア
ッセイを行うこともできる。この被分析体を含有する生
成物を上記のように免疫反応体と反応させる。
液体試料中の被分析体である抗原、ハプテンまたは抗体
を定量するための競合結合アッセイにおいては、免疫反
応体を固相に付着させる。被分析体がルミネッセント標
識された物質に関して免疫反応体と競合して反応するか
、あるいは被分析体が免疫反応体に関してルミネッセン
ト標識された物質と競合して反応するであろう。
を定量するための競合結合アッセイにおいては、免疫反
応体を固相に付着させる。被分析体がルミネッセント標
識された物質に関して免疫反応体と競合して反応するか
、あるいは被分析体が免疫反応体に関してルミネッセン
ト標識された物質と競合して反応するであろう。
ある構成においては、免疫反応体が化学的なまたは免疫
学的な反応生成物からなっていてもよい。
学的な反応生成物からなっていてもよい。
三者のうち後者は、第２抗体に特異的な第１抗体を同相
に付着させることにより具体的に示される。
に付着させることにより具体的に示される。
この第２抗体は被分析体に特異的である。ルミネッセン
ト標識された被分析体、第２抗体、および固相に結合し
た第１抗体を、被分析体を含有する試料に添加すると、
第２抗体と被分析体および標識された被分析体との競合
反応が起こる。第１抗体と第２抗体の結合体を免疫反応
体と考える。
ト標識された被分析体、第２抗体、および固相に結合し
た第１抗体を、被分析体を含有する試料に添加すると、
第２抗体と被分析体および標識された被分析体との競合
反応が起こる。第１抗体と第２抗体の結合体を免疫反応
体と考える。
上記の競合反応は同相をミクロ濾過により濃縮する前に
行うこともできる。この場合、付着したルミネッセント
標識をもつ同相を濃縮する。
行うこともできる。この場合、付着したルミネッセント
標識をもつ同相を濃縮する。
当業者には特定のアッセイ構成が上記構成の一以上に属
し、またはこれらの構成の混成体であってもよいことは
明らかであろう。
し、またはこれらの構成の混成体であってもよいことは
明らかであろう。
液体試料に含有される細胞または粒状物質上に存在する
かまたはこれらに付着した被分析体の定量のための同相
イムノアッセイにおいては、前記と同様な構成によれば
被分析体、または被分析体を含有する反応生成物を免疫
反応体と反応させるか、または免疫反応体と競合的に、
もしくは免疫反応体に対して競合的に反応させることが
できる。
かまたはこれらに付着した被分析体の定量のための同相
イムノアッセイにおいては、前記と同様な構成によれば
被分析体、または被分析体を含有する反応生成物を免疫
反応体と反応させるか、または免疫反応体と競合的に、
もしくは免疫反応体に対して競合的に反応させることが
できる。
特定の非競合反応においては、免疫反応体自身がルミネ
ッセント標識されていてもよい。
ッセント標識されていてもよい。
下記の具体例は、本発明を細胞培養液上清中の単クロー
ン抗体の検出に適用しうろことを示すものである。示さ
れた例はサンドイッチ型アッセイとしての特色をもつが
、これらの例は本発明の用途が広いことおよび感度が高
いことを証明するためのものにすぎず、本発明の利用を
何らかの形で制限するものではない。
ン抗体の検出に適用しうろことを示すものである。示さ
れた例はサンドイッチ型アッセイとしての特色をもつが
、これらの例は本発明の用途が広いことおよび感度が高
いことを証明するためのものにすぎず、本発明の利用を
何らかの形で制限するものではない。
実施例 １
ラテックス粒子懸濁液原液（Ｉ）の調製０．８１μｍの
ポリスチレン ラテックス粒子（ディフコ社、４８２３
２ミシガン州デトロイト、コントｏ −＃ ７０１０
２５） １Ｑ＋＋＋ｌを遠心しく５０００ｒｐｍ、１０
分）、上清を除去した。このビーズを脱イオン水２０ｍ
１に再懸濁させ、この操作を３回繰り返した（すなわち
４回の洗浄）。ビーズを最終的に３ｍｌの脱イオン水に
懸濁した。ラテックス粒子懸濁液（Ｉ）の最終ビーズ濃
度は約１０容量％であった。
ポリスチレン ラテックス粒子（ディフコ社、４８２３
２ミシガン州デトロイト、コントｏ −＃ ７０１０
２５） １Ｑ＋＋＋ｌを遠心しく５０００ｒｐｍ、１０
分）、上清を除去した。このビーズを脱イオン水２０ｍ
１に再懸濁させ、この操作を３回繰り返した（すなわち
４回の洗浄）。ビーズを最終的に３ｍｌの脱イオン水に
懸濁した。ラテックス粒子懸濁液（Ｉ）の最終ビーズ濃
度は約１０容量％であった。
実施例 ２
リゾチーム−ビーズ試薬（ＩＩ）の調製０．０１Ｍ炭酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）中の０、５Ｔｎ９／ｍ
ｅ鶏卵リゾチーム（シグマ社、６３１７８ミズーリ州セ
ントルイス、ロット＃８１Ｆ−８２０１）１Ｑｍｌをラ
テックス粒子懸濁液原液（Ｉ）１ｍＡ！に添加し、十分
に混合した。周囲温度で６時間インキュベートしたのち
、ビーズを５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、０．０１
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ９，５）１０ｍＺで３回
洗浄し、最終的にこの緩衝液３Ｑｍｊ？に再覧濁した。
ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）中の０、５Ｔｎ９／ｍ
ｅ鶏卵リゾチーム（シグマ社、６３１７８ミズーリ州セ
ントルイス、ロット＃８１Ｆ−８２０１）１Ｑｍｌをラ
テックス粒子懸濁液原液（Ｉ）１ｍＡ！に添加し、十分
に混合した。周囲温度で６時間インキュベートしたのち
、ビーズを５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、０．０１
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ９，５）１０ｍＺで３回
洗浄し、最終的にこの緩衝液３Ｑｍｊ？に再覧濁した。
ビーズ試薬（ＩＩ）の最終濃度は約０．３容量％であっ
た。
た。
実施例 ６
フルオレセイン標識したヤギ抗マウスＩ ｇ （Ｉｌ［
）の調製 アフィニティー法により精製したヤギ抗マウス１、？
Ｃノ・イプリド−マ・サイエンシス社；３００８４ジョ
ーシア州アトランタ、カタログ＃７０１、ロット＃１０
Ｄ；リン［９衝化食塩水（，７）Ｈ７，４）中１■々Ａ
］２００μｌを０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９
，５）１００μｌに添加し、次いでフルオレセインイソ
チオシアネート異性体■〔シグマ社、ロツ）＃６１Ｆ−
５０７０、リン酸緩衝化食塩液（ｐＨ７，４）中１ ｍ
９／１ｎｌ〕４０μｌを添加シタ。周囲温度で１．５時
間インキュベートしたのち、反応混合物をセファデック
スＧ−２５カラム（１８Ｘ０．７５鑞、リン酸緩衝化食
塩液（ｐＨ７，４）中）に通すことにより精製した。標
識されたヤギ抗マウス１．！９（Ｉｆｆ）をカラムから
溶離し、全部で１ｍｌ中に回収した。
）の調製 アフィニティー法により精製したヤギ抗マウス１、？
Ｃノ・イプリド−マ・サイエンシス社；３００８４ジョ
ーシア州アトランタ、カタログ＃７０１、ロット＃１０
Ｄ；リン［９衝化食塩水（，７）Ｈ７，４）中１■々Ａ
］２００μｌを０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９
，５）１００μｌに添加し、次いでフルオレセインイソ
チオシアネート異性体■〔シグマ社、ロツ）＃６１Ｆ−
５０７０、リン酸緩衝化食塩液（ｐＨ７，４）中１ ｍ
９／１ｎｌ〕４０μｌを添加シタ。周囲温度で１．５時
間インキュベートしたのち、反応混合物をセファデック
スＧ−２５カラム（１８Ｘ０．７５鑞、リン酸緩衝化食
塩液（ｐＨ７，４）中）に通すことにより精製した。標
識されたヤギ抗マウス１．！９（Ｉｆｆ）をカラムから
溶離し、全部で１ｍｌ中に回収した。
実施例 ４
リゾチームに対するマウス単クローン抗体の一工程アツ
セイ ゛ ＢＲＬ ＃ １０５０ ＭＭ ハイブリートゝット（Ｈ
ｙｂｒｉ−Ｄｏｔ）マニホールド（ハテスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ社、２０７６０メリーラント８州ガイ
ザースプルク）に○Ｅ６６．０．２μｍの酢酸セルロー
スフィルターメンプラン（シュライヘル・アント９・シ
ュニル社、０３４３１ニューハンプシャー州ケ−Ｊ）を
取り付け、各ウェルにビーズ試薬ＣＨ）２０／ｌｌを添
加し、次いで試＃１（ハイプリドーマ増殖培地、ＲＰＭ
■１６４ｏ＋１５容惜％ウシ胎児血清、これに抗すゾチ
ームＩＩＧ分泌マウスハイプリド−マから得たマウス腹
水を希釈したもの）５０１１１を添加した。次いで標識
したヤギ抗マウスＴｇ（Ｉｆｆ）調畢ｖ液〔たとえば１
０容喰％ウシ胎児血清および１０容晴％正常ヒツジ血清
を含有するリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７５）中５１１１
／Ｔｌｅの標識されたヤギ抗マウスＩ ｆｌ （Ｉｌｌ
） ） ５０ Ｉ’ｌｌ ヲ添加シｔ、ニー、、混合物
を周囲温度で３０分間インキュベートした。次いでマニ
ホールドゝ底部から吸引し、各ウェルな空になった時点
で水Ｑ、 ４ ｍｌ、により３回洗浄した。マニホール
ドの外套をはずし、フィルターメンプランをス） ＩＪ
ツブ状に切断し、湿潤戸紙片上に乗せた。
セイ ゛ ＢＲＬ ＃ １０５０ ＭＭ ハイブリートゝット（Ｈ
ｙｂｒｉ−Ｄｏｔ）マニホールド（ハテスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ社、２０７６０メリーラント８州ガイ
ザースプルク）に○Ｅ６６．０．２μｍの酢酸セルロー
スフィルターメンプラン（シュライヘル・アント９・シ
ュニル社、０３４３１ニューハンプシャー州ケ−Ｊ）を
取り付け、各ウェルにビーズ試薬ＣＨ）２０／ｌｌを添
加し、次いで試＃１（ハイプリドーマ増殖培地、ＲＰＭ
■１６４ｏ＋１５容惜％ウシ胎児血清、これに抗すゾチ
ームＩＩＧ分泌マウスハイプリド−マから得たマウス腹
水を希釈したもの）５０１１１を添加した。次いで標識
したヤギ抗マウスＴｇ（Ｉｆｆ）調畢ｖ液〔たとえば１
０容喰％ウシ胎児血清および１０容晴％正常ヒツジ血清
を含有するリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７５）中５１１１
／Ｔｌｅの標識されたヤギ抗マウスＩ ｆｌ （Ｉｌｌ
） ） ５０ Ｉ’ｌｌ ヲ添加シｔ、ニー、、混合物
を周囲温度で３０分間インキュベートした。次いでマニ
ホールドゝ底部から吸引し、各ウェルな空になった時点
で水Ｑ、 ４ ｍｌ、により３回洗浄した。マニホール
ドの外套をはずし、フィルターメンプランをス） ＩＪ
ツブ状に切断し、湿潤戸紙片上に乗せた。
各ドツトを切り取り、その前面螢光を日立６５〇−１０
Ｓ型分光螢光光度計で測定した。励起および放出スリッ
トを２０ｒＬｍに開き、０に調整した（白色光）。バン
ド幅の狭い干渉フィルター（中心波長４８５ｒＬｍ、バ
ンド幅１０ ｎｍ ）を励起ビーム内に置き、バンド幅
の広い干渉フィルター（中心波長５３５ ｎ、ｍ、バン
ド幅２ Ｏｎ、ｍ）を放出ビーム内に置いた。
Ｓ型分光螢光光度計で測定した。励起および放出スリッ
トを２０ｒＬｍに開き、０に調整した（白色光）。バン
ド幅の狭い干渉フィルター（中心波長４８５ｒＬｍ、バ
ンド幅１０ ｎｍ ）を励起ビーム内に置き、バンド幅
の広い干渉フィルター（中心波長５３５ ｎ、ｍ、バン
ド幅２ Ｏｎ、ｍ）を放出ビーム内に置いた。
表１は、マウス単りローン抗リゾチームを含む腹水を１
：６４．ＯＯＯよりも十分高く希釈することができ、抗
体をなおこのアッセイで検出できたことを示す。このア
ッセイのゾロゾーンば１ ： ４，０００よりも低い希
釈率にある。
：６４．ＯＯＯよりも十分高く希釈することができ、抗
体をなおこのアッセイで検出できたことを示す。このア
ッセイのゾロゾーンば１ ： ４，０００よりも低い希
釈率にある。
表 １
単りローンマウス抗リゾチームＴ７Ｇの検出腹水希釈率
相対螢光 １ ３０．５．３ｏ、８２
５３．０．５６．２４ ７４４
．７１．２ ８ ６４４．７６１ １６５０．０．５６．２ ３２ ２９９．３１，８６４
２０．８．１８．３（３）
４，１、 ５．７実施例 ５ リゾチームに対するマウス単クローン抗体の二工程アッ
セイ 以下の点を除いて実施例４と同様にアッセイを行った。
相対螢光 １ ３０．５．３ｏ、８２
５３．０．５６．２４ ７４４
．７１．２ ８ ６４４．７６１ １６５０．０．５６．２ ３２ ２９９．３１，８６４
２０．８．１８．３（３）
４，１、 ５．７実施例 ５ リゾチームに対するマウス単クローン抗体の二工程アッ
セイ 以下の点を除いて実施例４と同様にアッセイを行った。
試料５０μｌおよびビーズ試薬（Ｉｔ）２０μｌを周囲
温度で５分間インキュベートし、沖過し、脱イオン水Ｑ
、 ４ ｍｌで１回洗浄した。実施例４の標識されたヤ
ギ抗マウスｌ９（ＩＩＩ）調製液５０ ／ｌｌを添加し
、次いで周囲温度で１５分間インキュベートした。次い
で溶液を（Ｆ５過し、脱イオン水０．４ ｍｌで３回洗
浄し、各スポットの螢光を測定した。
温度で５分間インキュベートし、沖過し、脱イオン水Ｑ
、 ４ ｍｌで１回洗浄した。実施例４の標識されたヤ
ギ抗マウスｌ９（ＩＩＩ）調製液５０ ／ｌｌを添加し
、次いで周囲温度で１５分間インキュベートした。次い
で溶液を（Ｆ５過し、脱イオン水０．４ ｍｌで３回洗
浄し、各スポットの螢光を測定した。
表２は、一工程アッセイと同等の感度が二工程アッセイ
で得られたことを示す。プロゾーンは存在しなかった。
で得られたことを示す。プロゾーンは存在しなかった。
表 ２
マウス単りローン抗リゾチームＩＩＧのための二工程ア
ッセイ 腹水希釈率 相対螢光 （Ｘ１０００）（二連） □ １ ５５．２．６１．２２
５３．５．６３．７４ ５３
．７，６９４８ ４８．２．５６．７
１６ ３１．８．６３．７３２
２１．０，２１．９６４
１５．７．１６．７００４．１、４９ 実施例 ６ ラテックス粒子） Ｉ、ｙＧ試薬（Ｍｌ）の調製実施例
２の方法によりラテックス粒子をヒトｆｇＧで被覆した
。ただし使用したヒトｉｙＧの濃度は１００μｌ／ｍｌ
！であった。試薬（Ｖｌ）は約０．３容量％の最終粒子
濃度で調製された。
ッセイ 腹水希釈率 相対螢光 （Ｘ１０００）（二連） □ １ ５５．２．６１．２２
５３．５．６３．７４ ５３
．７，６９４８ ４８．２．５６．７
１６ ３１．８．６３．７３２
２１．０，２１．９６４
１５．７．１６．７００４．１、４９ 実施例 ６ ラテックス粒子） Ｉ、ｙＧ試薬（Ｍｌ）の調製実施例
２の方法によりラテックス粒子をヒトｆｇＧで被覆した
。ただし使用したヒトｉｙＧの濃度は１００μｌ／ｍｌ
！であった。試薬（Ｖｌ）は約０．３容量％の最終粒子
濃度で調製された。
実施例 ７
ヒトＩ、７Ｇに対するマウス単クローン抗体の一工程７
９−に４ （２゜ 試薬（Ｖｌ）２０μｌ、試料５０μｌおよび標識したヤ
ギ抗マウス１．ｐ（Ｉｌｌ）（ウシ胎児血清１０容量％
および正常ヤギ血清１０容偕％を含有するリン酸緩衝化
食塩液（７）Ｈ７，５）中に２．５μＩＩ／ｍ１）５０
μｌを用い、実施例４の方法を採用した。試料は抗ヒト
■９Ｇ特異性をもつＩｇＧ産生・・イプリド−マから得
た細胞の培養液上清の希釈液であった。インキュは−シ
ョン時間は周囲温度で３０分であった。
９−に４ （２゜ 試薬（Ｖｌ）２０μｌ、試料５０μｌおよび標識したヤ
ギ抗マウス１．ｐ（Ｉｌｌ）（ウシ胎児血清１０容量％
および正常ヤギ血清１０容偕％を含有するリン酸緩衝化
食塩液（７）Ｈ７，５）中に２．５μＩＩ／ｍ１）５０
μｌを用い、実施例４の方法を採用した。試料は抗ヒト
■９Ｇ特異性をもつＩｇＧ産生・・イプリド−マから得
た細胞の培養液上清の希釈液であった。インキュは−シ
ョン時間は周囲温度で３０分であった。
表３にその結果を示す。アッセイは約１：２５６の感度
をもち、プロゾーンを示さなかった。
をもち、プロゾーンを示さなかった。
表 ３
ヒトＩｇＣに対するマウス単クローン抗体の一工程アツ
セイ 試料希釈率 相対螢光（（ニー・−
１ン ） 希釈せず ６４．５．７０．０
１：２ ５５．２．５５．６１
：４ ４１．０．６８．６１：
８ ２５．０．２１．８１：１
６ １５．２．１４．８Ｃ３２９
，０、８，７ １：／Ｓ４ ６．２、６．５１
：１２８ ４．Ｑ、 ４．０１：
２５６ ３．０、３，１１：５１
２ ２．３、２．６１：１０２４
１．９、２．０１：２０４８
１．６、１．７１：４０９６
２．１、１．９１：８１９２
１．７、１．８１：１６３８４
１．７、１．７■ １．
８、２．０実施例 ８ 細胞培養液上清中のリゾチームに対するマウスＩｙＭ抗
体の一工程アツセイ ビーズ試薬（Ｉ）２０μｌ、試料５０μｌ、およびフル
オレセイン標識され、アフィニティー処理によＦ）ＭＭ
サレタヤキ抗−ｒウスＩＩＩＭ （２，５μＩ！／ｍ１
）５０μｌを用いて実施例４の方法を行なった。試料番
まリゾチームに対する■！１Ｍ抗体を分泌するノ１イノ
リド−マ細胞系列から得た細胞培養液上清の希釈液であ
った。反応混合物を周囲温度で３０分間インキュは一ト
した。
セイ 試料希釈率 相対螢光（（ニー・−
１ン ） 希釈せず ６４．５．７０．０
１：２ ５５．２．５５．６１
：４ ４１．０．６８．６１：
８ ２５．０．２１．８１：１
６ １５．２．１４．８Ｃ３２９
，０、８，７ １：／Ｓ４ ６．２、６．５１
：１２８ ４．Ｑ、 ４．０１：
２５６ ３．０、３，１１：５１
２ ２．３、２．６１：１０２４
１．９、２．０１：２０４８
１．６、１．７１：４０９６
２．１、１．９１：８１９２
１．７、１．８１：１６３８４
１．７、１．７■ １．
８、２．０実施例 ８ 細胞培養液上清中のリゾチームに対するマウスＩｙＭ抗
体の一工程アツセイ ビーズ試薬（Ｉ）２０μｌ、試料５０μｌ、およびフル
オレセイン標識され、アフィニティー処理によＦ）ＭＭ
サレタヤキ抗−ｒウスＩＩＩＭ （２，５μＩ！／ｍ１
）５０μｌを用いて実施例４の方法を行なった。試料番
まリゾチームに対する■！１Ｍ抗体を分泌するノ１イノ
リド−マ細胞系列から得た細胞培養液上清の希釈液であ
った。反応混合物を周囲温度で３０分間インキュは一ト
した。
結果を表４に示す。プロゾーン現象はこの場合明瞭であ
った。
った。
表 ４
ヒトリゾチームに対するマウスＩｇＭ
単クローン抗体の一工程アツセイ□
相対螢光
希釈せず １１．９．１６．２１：２
２０．０．１８．２１：４
１９．０．２５．０１：８
１３．２．１５．１１：１６ １１．０．
１２．６１：３２ １０．０、９０１：
６４ ７．０、４．９１：１２８
３．２、３．５１；２５／ｌ）
２．９、４．０１ ： ５１２
２．０、２．６１：１０２４ ２．０、
２．４ｏｏ １．７、１．８実
施例 ９ ラテックス−抗マウス１７Ｇ試薬（■）の調製実施例６
の方法を採用した。アフィニティー処理により精製した
ヤギ抗マウス１ｙＧ（）蔦イノリビーマ・サイエンシス
社、前記、ロット＃１８Ｃ）を０．０１Ｍ炭酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ９，５）中１００μｇ／ｍｌにおいて使
用した。周囲温度で一夜のインキュベーションを採用し
た。試薬（■）の最終濃度は約０．３容量％であった。
２０．０．１８．２１：４
１９．０．２５．０１：８
１３．２．１５．１１：１６ １１．０．
１２．６１：３２ １０．０、９０１：
６４ ７．０、４．９１：１２８
３．２、３．５１；２５／ｌ）
２．９、４．０１ ： ５１２
２．０、２．６１：１０２４ ２．０、
２．４ｏｏ １．７、１．８実
施例 ９ ラテックス−抗マウス１７Ｇ試薬（■）の調製実施例６
の方法を採用した。アフィニティー処理により精製した
ヤギ抗マウス１ｙＧ（）蔦イノリビーマ・サイエンシス
社、前記、ロット＃１８Ｃ）を０．０１Ｍ炭酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ９，５）中１００μｇ／ｍｌにおいて使
用した。周囲温度で一夜のインキュベーションを採用し
た。試薬（■）の最終濃度は約０．３容量％であった。
実施例 １０
ヒト１７Ｇに対するマウスＩＩＧ単クローンの抗体捕穫
アッセイ 実施例４の方法を採用した。試薬（Ｗ） ２０μｌを試
料（ヒ） Ｉ、ｐＧに対する■ＩＧ抗体を産生ずるマウ
スハイズリド−マ細胞系列から得た細胞培養液上清を増
殖培地で希釈したもの）５０μ１１およびフルオレセイ
ン標識したヒト■ｙ（ｒ ＜ウシ胎児血清１０容量％お
よび正常ヤギ血清１０容量％を含有するリン酸緩衝化食
塩液（ｐＨ７，５）中に３μＥｌ ７ｍ１）５０μｌと
混合した。インキュベーションは周囲温度で３０分であ
った。結果を表５に示す。
アッセイ 実施例４の方法を採用した。試薬（Ｗ） ２０μｌを試
料（ヒ） Ｉ、ｐＧに対する■ＩＧ抗体を産生ずるマウ
スハイズリド−マ細胞系列から得た細胞培養液上清を増
殖培地で希釈したもの）５０μ１１およびフルオレセイ
ン標識したヒト■ｙ（ｒ ＜ウシ胎児血清１０容量％お
よび正常ヤギ血清１０容量％を含有するリン酸緩衝化食
塩液（ｐＨ７，５）中に３μＥｌ ７ｍ１）５０μｌと
混合した。インキュベーションは周囲温度で３０分であ
った。結果を表５に示す。
表 ５
ヒトＩＩＧに対するマウス■ｇＧ単クローン抗体の抗体
捕穫アッセイ 希釈せず ３０．０．３０，９１：２
２６．２．２６．７１：４
１２．７．１７．４１：８
１０．０、９０１：１６ ６．２、
Ｚ３１：３２ ４．９、３．８１：６
４ ４．２、３．２１：１２８
２．６、３．７１：２５６
２．３、３．９１：５１２ ２．４
、４．１１：１０２４ ２．９、２．９
ｏｏ２．７、３．０ 実施例 １１ マウス■Ｉｃ、のためのアッセイ 実施例４の場合と同様にアッセイを行った。試薬（Ｘ）
２０μｌを試料（１ｇＧ産生マウスハイプリド−マ細
胞系列から得た細胞培養液上清の希釈液）５０μｌおよ
び標識されたヤギ抗マウスＩＩ！（ＩＮ）（ウシ胎児血
清１０容量％および正常ヤギ血清１０容量％を含有する
リン酸緩衝食塩液（ＰＨ７，５）中に２．５μ、ｐ／ｍ
／＋）５０μｌと混合した。反応混合物を周囲温度で３
０分間インキュベートした。表６に結果を示す。
捕穫アッセイ 希釈せず ３０．０．３０，９１：２
２６．２．２６．７１：４
１２．７．１７．４１：８
１０．０、９０１：１６ ６．２、
Ｚ３１：３２ ４．９、３．８１：６
４ ４．２、３．２１：１２８
２．６、３．７１：２５６
２．３、３．９１：５１２ ２．４
、４．１１：１０２４ ２．９、２．９
ｏｏ２．７、３．０ 実施例 １１ マウス■Ｉｃ、のためのアッセイ 実施例４の場合と同様にアッセイを行った。試薬（Ｘ）
２０μｌを試料（１ｇＧ産生マウスハイプリド−マ細
胞系列から得た細胞培養液上清の希釈液）５０μｌおよ
び標識されたヤギ抗マウスＩＩ！（ＩＮ）（ウシ胎児血
清１０容量％および正常ヤギ血清１０容量％を含有する
リン酸緩衝食塩液（ＰＨ７，５）中に２．５μ、ｐ／ｍ
／＋）５０μｌと混合した。反応混合物を周囲温度で３
０分間インキュベートした。表６に結果を示す。
表 ６
相対螢光
希釈せず １６．０．１４．１１：
２ １１．６．１４．３１：４
１２．２．１６．２１：８
８．３、９４１：１６
６．３、６．６１：３２
４．１１，５．４１：＜Ｓ４
３．５． ３．８１：１２８ ２
．８． ３．１１：２５６ ３．４、
３，７１：５１２ ２．４、２．６
１：１０２４ ２．８、３．３ｏｏ
２．７、３．２本発明はそ
の精神または本質的特色から逸脱することなく、本明細
書に示されたもの以外の特定の形態で実施することがで
きる。従って上述の実施態様はあらゆる点で説明のため
のものであって限定するものではないと考えるべきであ
る。本発明の範囲は上記の記述よりもむしろ特許請求の
範囲の記載により指示され、従って特許請求の範囲に相
当する意味および範囲内にある変更はすべて本発明に含
まれるものとする。
２ １１．６．１４．３１：４
１２．２．１６．２１：８
８．３、９４１：１６
６．３、６．６１：３２
４．１１，５．４１：＜Ｓ４
３．５． ３．８１：１２８ ２
．８． ３．１１：２５６ ３．４、
３，７１：５１２ ２．４、２．６
１：１０２４ ２．８、３．３ｏｏ
２．７、３．２本発明はそ
の精神または本質的特色から逸脱することなく、本明細
書に示されたもの以外の特定の形態で実施することがで
きる。従って上述の実施態様はあらゆる点で説明のため
のものであって限定するものではないと考えるべきであ
る。本発明の範囲は上記の記述よりもむしろ特許請求の
範囲の記載により指示され、従って特許請求の範囲に相
当する意味および範囲内にある変更はすべて本発明に含
まれるものとする。
特許出願人 バンデツクス・ラボラトリーズ・（３４
）
）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （＋） 一定容積中の液体試料中の抗原、ハシテンま
たは抗体を定量するためのルミネッセント標識を使用す
る固相イムノアッセイ法であって、被分析体、または被
分析体を含有する反応生成物を、実質的に懸濁状態にあ
る（１）寸法約１・０μｍ以下の多数の水不溶性粒子ま
たは（１１）細胞、に付着した免疫反応体と反応させる
か、または免疫反応体と競合的にもしくは免疫反応体へ
の結合に関して競合的に反応させ； ルミネッセント標識が付着した、または後続の反応によ
り付着ｉ＋３４＄上記水不溶性粒子または細胞をミクロ
ｐ過により濃縮して液体試料の堂積よりも実質的に小さ
な溶積となし；そして 濃縮された水不溶性粒子または細胞に付着したルミネッ
セント標識の実質的にすべてのルミネッセンスを測定す
る； ことよりなる方法。 （２）被分析体、または被分析体を含有する反応生成物
をサンドイッチ型、遂次飽和型、または競合的なアッセ
イ構成で免疫反応体と反応させるか、または免疫反応体
と競合的にもしくは免疫反応体への結合に関して競合的
に反応させる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３）被分析体、または被分析体を含有する反応生成物
をサンドイッチアッセイ構成で免疫反応体と反応させる
か、または免疫反応体と競合的にもしくは免疫反応体へ
の結合に関して競合的に反応させる、特許請求の範囲第
２項記載の方法。 （４）被分析体、または被分析体を含有する反応生成物
を遂次飽和型アッセイ構成で免疫反応体と反応させるか
、または免疫反応体と競合的にもしくは免疫反応体への
結合に関して競合的に反応させる、特許請求の範囲第２
項記載の方法。 （５）被分析体、または被分析体を含有する反応生成物
を朗合法アッセイ構成で免疫反応体と反応させるか、ま
たは免疫反応体と競合的にもしくは免疫反応体への結合
に関して競合的に反応させる、特許請求の範囲第２項記
載の方法。 （６）ルミネッセント標識が螢光標識、燐光標識、また
は原子螢光標識である、特許請求の範囲第１項記載の方
法。 （７）螢光標識がフルオレセインイソチオシアネート標
識である、特許請求の範囲第６項記載の方法。 （８）標識の光学的ルミネッセンスを、約１〜５ｍｍの
範囲の横断面寸法をもつ励起ビームを有する装置によっ
て測定する、特許請求の範囲第７項記載の方法。 （９）水不溶性粒子が標識を励起するビームおよび生じ
るルミネッセンス放出ビームに対して実質的に透明であ
る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ００）不溶性粒子が細菌、呻乳動物細胞斬、パ、または
ポリマー性支持体である、特許請求の範囲第１項記載の
方法。 （１１） ４リマ一性支持体がポリスチレンラテック
スである、特許請求の範囲第１０項記載の方法。 （＋２１ 一定容積中の液体試料中に含有される細胞そ
の他の粒状物質上に存在するが、またはこれらに付着し
ている被分析体を宝前するためのルミネッセント標識を
使用する同相イムノアッセイ法であって、 被分析体がその上に存在するがまたは被分析体がそれに
付着している細胞または粒状物質を実質的に懸濁した状
態にして、被分析体、または被分析体を含有する反応生
成物を免疫反応体と反応させるか、または免疫反応体と
競合的にもしくは免疫反応体への結合に関して競合的に
反応させ； ルミネッセント標識が付着した、または後続の反応によ
りルミネッセント標識が付着されるべき細胞または粒状
物質をミクロ濾過により濃縮して液体試料の容積よりも
実質的に小さな容積となし；そして 濃縮された細胞または粒状物質に付着したルミネッセン
ト標識の実質的にすべてのルミネッセンスを測定する； ことよりなる方法。 （１３）被分析体、または被分析体を含有する反応生成
物をサント９イツチ型、遂次飽和型、または読合アッセ
イ構成で免疫反応体と反応させるか、または免疫反応体
と競合的にもしくは免疫反応体への結合に関して競合的
に反応させる、特許請求の範囲第１２項記載の方法。 ０４）被分析体、または被分析体を含有する反応生成物
をサンドイッチアッセイ構成で免疫反応体と反応させる
か、または免疫反応体と競合的にもしくは免疫反応体へ
の結合に関して競合的に反応させる、特許請求の範囲第
１３項記載の方法。 （＋５） 被分析体、または被分析体を含有する反応
生成物を遂次飽和型アッセイ構成で免疫反応体と反応さ
せるか、または免疫反応体と競合的にもしくは免疫反応
体への結合に関して競合的に反応させる、特許請求の範
囲第１３項記載の方法。 （＋６）被分析体、または被分析体を含有する反応生成
物を競合的アッセイ構成で免疫反応体と反応させるか、
または免疫反応体と競合的にもしくは免疫反応体への結
合に関して競合的に反応させる、特許請求の範囲第１３
項記載の方法。 ０７）ルミネッセント標識が螢光標識、燐光標識、また
は原子螢光標識である、特許請求の範囲第１２項記載の
方法。 （１ｇｌ螢光標識がフルオレセイン・インチオシアネー
ト標識である、特許請求の範囲第１７項記載の方法。 ＣＪ９ 標識のルミネッセンスを、約１〜５ｍｍの範
囲の横断面寸法をもつ励起ビームを有する装置によって
測定する、特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ′（２■ 水不溶性粒子が標識を励起するビームおよび
生じるルミネッセンス放出ビームに対して実質的に透明
である、特許請求の範囲第１２項記戦の方法。 （２１）細胞が細菌または哺乳動物細胞である、特許請
求の範囲第１２項記載の方法。 （２粉 粒状物質が細胞断片またはポリマー性支持体
からなる、特許請求の範囲第１２項記載の方法。 （２３）被分析体が表面抗原である、特許請求の範囲第
１２項記載の方法。 （２４）被分析体が可溶性蛋白質、ノーブテンまたはウ
ィルスである、特許請求の範囲第１２項記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| US06/489,519 US4652533A (en) | 1983-04-28 | 1983-04-28 | Method of solid phase immunoassay incorporating a luminescent label |
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Family
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Family Applications (1)
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0124050B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59208463A (ja) |
| AT (1) | ATE37238T1 (ja) |
| DE (1) | DE3474070D1 (ja) |
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