JPH04363662A - 固定化担体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、流体試料中の微量成分
、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を測定するに
際して用いられる固定化担体の製造方法に関するもので
ある。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。

【０００３】すなわち、１９５８年にＢｅｒｓｏｎとＹ
ａｌｌｏｗが、放射性同位元素Ｉで標識した牛インシュ
リンと糖尿病患者血清中の抗インシュリン抗体を用いて
、血清中のインシュリンを測定することに成功して以来
、ラジオアイソトープを用いた免疫測定法が広く用いら
れて来た。そして、これ以後、標識物質として放射性同
位元素以外のものも種々開発されて来た。例えば、酵素
、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオファー
ジ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠分
子族、化学発光性反応体及び螢光性分子等が挙げられる
。

【０００４】ところで、免疫測定が行われるに際しては
、抗体（又は抗原）が固定化された担体が用いられる。 この固定化担体は、抗体（又は抗原）溶液中に担体及び
攪拌子などを入れ、攪拌子に攪拌力を印加することによ
って攪拌し、担体に抗体（又は抗原）を吸着させること
で製造されている。しかしながら、このようにして得ら
れた固定化担体を用いての免疫測定では、その測定値に
変動が大きく、再現性が低い問題点の有ることが判って
来た。

【０００５】

【発明の開示】本発明の目的は、流体試料中の特定成分
を正確に、精度及び再現性良く定量できる技術を提供す
ることである。この本発明の目的は、抗体（又は抗原）
溶液に担体を浸す工程と、担体を実質上静置させると共
に、抗体（又は抗原）溶液に流動力を作用させる工程と
を有することを特徴とする固定化担体の製造方法によっ
て達成される。

【０００６】抗体（又は抗原）が物理的及び／又は化学
的に結合される担体は多孔質なものであることが好まし
く、このような担体の材料としてはケイ藻土、二酸化チ
タン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セルロ
ース、ケイ砂、ガラス、シリカゲル、架橋デキストリン
、架橋ポリアクリルアミド、アガロース、架橋アガロー
ス、ポリスチレン等の各種の合成樹脂が挙げられる。 そして、このような素材の多孔質担体であれば、抗体（
又は抗原）が固定化される一次的な形状は粒子（ビーズ
）状、棒状あるいはプレート状のものであっても差し支
えないが、粒子（ビーズ）状のものが好ましい。

【０００７】抗体又は抗原は、これら多孔質の不溶化担
体に、化学的及び／又は物理的に直接、あるいは間接的
に結合させることができる。例えば、図１に示す如く、
抗体または抗原の溶液が入れられた容器１内に、ポリス
チレンビーズ２が粗く入れられたメッシュ状（バスケッ
ト状）の脚付き容器３を入れ、ポリスチレンビーズ２を
抗体または抗原溶液に浸し、又、容器１の底部にマグネ
チック攪拌子４を置いておき、そしてこの状態において
マグネチック攪拌子４を回転させ、ポリスチレンビーズ
２に回転力を付与しない静止状態で抗体（又は抗原）溶
液を流動させることにより、ポリスチレンビーズ２に均
一に抗体（又は抗原）を結合させることが出来る。尚、
抗体（又は抗原）溶液の流動は攪拌子による攪拌手段の
みではなく、例えば噴流力を印加するようにしても良く
、あるいは熱による対流といった手段でも良く、どのよ
うな手段が用いられても良い。その他の点に関する結合
技術については、１９７６年、講談社発行、千畑一郎ほ
か２名編「実験と応用　　アフィニティクロマトグラフ
ィー」（第１刷）、１９７５年、講談社発行、山崎誠ほ
か２名編「アフィニティクロマトグラフィー」（第１版
）を参考にできる。尚、結合反応後、標識抗体（又は抗
原）の非特異反応を排除する目的で、測定すべき特異的
反応に関与しない蛋白質を担持させることができる。 それらの代表的な例としては、哺乳動物及び鳥類の正常
血清蛋白質、アルブミン、スキムミルク、乳酸醗酵物、
コラーゲン及びそれらの分解物質等が挙げられる。

【０００８】そして、上記のようにして得られた抗体（
又は抗原）が物理的及び／又は化学的に結合した不溶化
微粒子抗体（又は不溶化微粒子抗原）と酵素などで標識
された抗体（又は抗原）及び試料とを接触、免疫反応さ
せ、Ｂ／Ｆ分離した後、不溶化微粒子抗体（又は不溶化
微粒子抗原）に結合しないで遊離の状態で存在する酵素
標識体の酵素活性を例えば乾式分析素子で測定すること
で、試料中の抗原（又は抗体）が簡便な操作で、感度、
正確度、精度及び再現性良く、正確な測定が行われるの
である。

【０００９】免疫測定においては、試料としてあらゆる
形態の溶液、コロイド溶液などが使用しうるが、好まし
くは生物由来の流体試料、例えば血液、血漿、血清、脳
脊髄液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる
。測定しうる流体試料中での特定成分は、その特定成分
に特異的に結合する物質が存在しうる物質（物質群）で
ある。すなわち、ポリペプチド、蛋白質、複合蛋白質、
多糖類、脂質、複合脂質、核酸、ホルモン類、ビタミン
類、薬剤、抗生物質、農薬等が挙げられる。具体的には
、特開昭６２−９０５３９号公報や特開昭６３−１３１
０６２号公報に記載の物質（物質群）を挙げることがで
きるが、これらに限定されるものではない。

【００１０】免疫測定において用いられる標識物質とし
ては、例えば、酵素、酵素基質、酵素及び酵素前駆体の
活性を変化させる物質（酵素阻害物質、補欠分子族、補
酵素）、酵素前駆体、アポ酵素、螢光物質などが挙げら
れる。具体的な物質としては、特開昭６２−９０５３９
号公報などに記載のものが挙げられるが、好ましくは酵
素、又は螢光物質であり、さらに好ましくはβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ、アルカリホスフォダーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタメートデヒド
ロゲナーゼ、アミラーゼなどの酵素である。これらの酵
素を標識物質とする場合、酵素反応系、発色系は公知の
ものを使用できる。具体的には、特開昭６１−２９２０
６０号公報、特開昭６２−９０５３９号公報、特開昭６
３−１３１０６２号公報、特開昭６３−４５５６２号公
報、特願昭６３−２１９８９３号明細書に記載の物質（
物質群）が挙げられるが、これらに限定されるものでは
ない。そして、これら標識物質の抗体（抗原）への結合
は、当業者間で知られている公知の試薬と方法で行うこ
とができ、例えば石川　　栄治、河合　　忠、宮井潔編
「酵素免疫測定法（第２版）、医学書院、１９７８年」
や日本臨床病理学会編「臨床病理」臨時増刊特集第５３
号「臨床検査の為のイムノアッセイ−技術と応用−、臨
床病理刊行会、１９８３年」などに記載された方法を参
考にすることができる。

【００１１】本発明で使用される抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸ア
ンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等（右田俊介偏「免疫化学」中山書店ｐｐ７４ない
し８８参照）で精製して用いることができる。あるいは
、抗原で感染した哺乳動物など（例えばマウス）の脾臓
細胞や骨髄腫細胞（ミエローマ）から雑種細胞（ハイブ
リドーマ）を得てモノクローナル抗体を作成し、これを
特定成分と特異的に結合しうる物質として使用すると特
異性が向上し、好ましい。又、これらの抗体はＩｇＧ、
ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画を用いることが
でき、或いはこれらの抗体を酵素処理してＦａｂ、Ｆａ
ｂ’又はＦ（ａｂ’）２　といった活性抗体フラグメン
トにして使用しても良い。さらに、これらの抗体は単一
で使用しても、複数の抗体を組み合わせて使用しても良
い。

【００１２】本発明で使用する抗原は特異抗体と反応す
るものであり、ハプテン及びその誘導体を含有する。免
疫測定方法による反応型式としては、競合法、２抗体法
、サンドイッチ法などが挙げられるが、特に限定はされ
ない。又、他の生物活性物質（例えば、ビオチン、アビ
ジン）を利用した免疫測定方法も適用できる。本明細書
においては、流体試料中の特定成分を測定するのに反応
型式として免疫反応を挙げているが、免疫反応に準ずる
生物活性を示す物質の特異反応（本明細書では、この特
異反応も免疫反応に包含）を利用することも可能である
。

【００１３】標識に起因した信号は、吸光度法（比色法
）　、螢光法または発光法で検出することができ、測定
法としては信号の経時的変化を測定するレート測定法ま
たは一定時間後の信号を測定するエンドポイント測定法
で測定することができる。好ましくは吸光度法であり、
吸光度法（比色法）　では紫外線、可視光、近赤外光を
利用することができ、例えば流体試料として血清及び血
漿を用いる場合には、血清及び血漿による吸光の影響を
小さくするために緑色光、赤色光または近赤外光を利用
するのが好ましい。

【００１４】

〔実施例１〕

〔スターラーによる攪拌をした固定化ビーズの作製〕癌
関連ガラクトース移転酵素（ＧＡＴ）に対するモノクロ
ーナル抗体を１ＭのＮａＣｌを溶解した０．１Ｍの炭酸
バッファー（ｐＨ９．５）に１０μｇ／ｍｌになるよう
溶解し、この抗体溶液１０００ｍｌを図１に示すような
プラスチック容器１に入れた。

【００１５】次に、バスケット状の脚付き容器３にポリ
スチレンビーズ（積水化学＃８０）２を入れ、この脚付
き容器３を抗体溶液に浸し、ポリスチレンビーズ２を抗
体溶液に浸した。そして、プラスチック容器１の底部に
置かれた攪拌子（スターラーバー）４による攪拌を行い
（尚、この攪拌では、ポリスチレンビーズ２は静止した
ままであり、抗体溶液のみが攪拌流動）、４℃下におい
て一昼夜かけて抗体を固定化した。

【００１６】この後、リン酸バッファー（ＰＢＳ）で洗
浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液に浸し、上記攪拌工
程と同様にして３７℃で２４時間攪拌しつつインキュベ
ートし、その後４℃で保存した。 〔実施例２〕 〔熱対流を利用した固定化ビーズの作製〕癌関連ガラク
トース移転酵素（ＧＡＴ）に対するモノクローナル抗体
を１ＭのＮａＣｌを溶解した０．１Ｍの炭酸バッファー
（ｐＨ９．５）に１０μｇ／ｍｌになるよう溶解し、こ
の抗体溶液１０００ｍｌをプラスチック容器に入れた。

【００１７】次に、ドーナツ型のバスケット状脚付き容
器にポリスチレンビーズ（積水化学＃８０）を入れ、こ
の容器を抗体溶液に浸し、ポリスチレンビーズを抗体溶
液に浸した。尚、この容器は、中心部に熱源を具備して
おり、電源スイッチをオンにして例えば１０℃にセット
すると、前記プラスチック容器内の溶液には上下方向に
流動する対流、つまり中心側では上昇流が、プラスチッ
ク容器の外周壁側では下降流が引き起こされるように構
成されている。

【００１８】そして、電源スイッチをオンにし、プラス
チック容器内の抗体溶液に流動する対流を起こさせた状
態で、４℃下において一昼夜かけて抗体を固定化した。 尚、この状態では、ポリスチレンビーズは静止したまま
であり、抗体溶液のみが流動している。この後、リン酸
バッファー（ＰＢＳ）で洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ溶液に浸し、３７℃で２４時間攪拌しつつインキュベ
ートし、その後４℃で保存した。

【００１９】〔比較例１〕 〔静置による固定化ビーズの作製〕実施例１のような攪
拌を行わず、すなわち静置し、抗体溶液及びＢＳＡ溶液
にポリスチレンビーズ（積水化学＃８０）を浸して作製
した。 〔比較例２〕 〔容器全体を回転させることによる固定化ビーズの作製
〕ポリスチレンビーズ（積水化学＃８０）と抗体溶液及
びＢＳＡ溶液とのインキュベートを密栓可能な容器を用
いて全体を回転させることによって攪拌（尚、この攪拌
では、ポリスチレンビーズ及び抗体溶液共に流動）し、
作製した。

【００２０】〔免疫測定〕前記各例で作製した抗体固定
化ビーズを、１０Ｕ／ｍｌ、３０Ｕ／ｍｌ、９０Ｕ／ｍ
ｌのＧＡＴ標準液０．０５ｍｌと１Ｍの塩化ナトリウム
を溶解した５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．
２ｍｌとを混合した液の中に入れ、３７℃で２時間イン
キュベートした。

【００２１】ＰＢＳで洗浄後、固定化抗体とは異なる部
位を認識するペルオキシダーゼ標識抗ＧＡＴモノクロー
ナル抗体の１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液（０．５μｇ／ｍｌ
）を０．２５ｍｌ加え、室温で１時間インキュベートし
た。ＰＢＳで洗浄後、０．０２％のＨ２　Ｏ２　を３ｍ
ｇ／ｍｌとｏ−フェニレンジアミン溶液０．３ｍｌとを
加え、室温で３０分間発色させた。そして、１Ｎの硫酸
１ｍｌで発色反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度を測定
した。

【００２２】各々の濃度の標準液についてｎ＝２５で測
定し、変動係数ＣＶを求めたので、その結果を下記の表
に示す。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　表　　　　　　　　　　　　　　　　１０Ｕ／ｍ
ｌ　　　　３０Ｕ／ｍｌ　　　　９０Ｕ／ｍｌ　　　　
実施例１　　　　　　３．２％　　　　　　　　３．０
％　　　　　　　　２．６％　　　　　　実施例２　　
　　　　３．９％　　　　　　　　２．８％　　　　　
　　　３．０％　　　　　　比較例１　　　　１０．７
％　　　　　　　　８．３％　　　　　　　　６．４％
　　　　　　比較例２　　　　　　８．６％　　　　　
　　　５．０％　　　　　　　　４．７％　　これによ
れば、本発明により得られる抗体（又は抗原）が固定化
された担体を用いての免疫測定法は、変動係数が格段に
小さく、流体試料中の特定成分を正確に、精度及び再現
性良く定量できることが判る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の固定化担体の製造方法に用いられる装
置の概略図である。

【符号の説明】

１　　容器 ２　　ポリスチレンビーズ ３　　脚付き容器 ４　　マグネチック攪拌子

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　抗体（又は抗原）溶液に担体を浸す工
   程と、担体を実質上静置させると共に、抗体（又は抗原
   ）溶液に流動力を作用させる工程とを有することを特徴
   とする固定化担体の製造方法。