JPS588837B2 - Humarsankara L- Asparaginsano Tsukuruhouhou - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はフマル酸の生物学的転化によるアスパラギン
酸の改良製法に関し、更に、フマル酸をＬ−アスパラギ
７酸に転化できる酵素であるアミノ基転移酵素の製法に
関し、これら製法においてはＰＯ７１１１菌株と命名さ
れ、プソイドモナス科に属する新規微生物（微工研委託
受理第２２６９号）を使用する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to an improved method for producing aspartic acid by biological conversion of fumaric acid, and further relates to a method for producing aminotransferase, an enzyme capable of converting fumaric acid to L-aspartic heptaic acid. The production method uses a new microorganism named strain PO7111 and belonging to the Pseudomonataceae family (Feikoken Commission Acceptance No. 2269).

天然産物からアスパラギン酸を製造し、あるいは単離す
るための多くの方法が文献に記載されている。Many methods have been described in the literature for producing or isolating aspartic acid from natural products.

これらの方法の大部分は製造が不確実なそして／または
余りに高価な原刺を使い、あるｂは複雑な工程を用いる
。Most of these methods use raw materials that are unreliable and/or too expensive to manufacture, and some use complex processes.

生物学的転化を利用する方法が工業的に適用できる唯一
の方法である。A method using biological conversion is the only method that can be applied industrially.

しかし今まで開示されている方法では全て（転化）反応
率は低く、最終製品は高価なものになる。However, in all the methods disclosed so far, the (conversion) reaction rate is low and the final product is expensive.

このため従来法は薬学的用途のみにその適用が限定され
ている。For this reason, the application of conventional methods is limited to pharmaceutical uses only.

最近様々なペプチドの合成用原料としてアスパラギ／酸
が利用されるようになり、このアミノ酸に対する需要が
高まっている。Recently, asparagine/acid has come to be used as a raw material for the synthesis of various peptides, and the demand for this amino acid is increasing.

しかし工業的規模でアスパラギン酸を利用するためには
高純度のアスパラギ／酸を低コストで得なければならな
い。However, in order to utilize aspartic acid on an industrial scale, it is necessary to obtain highly pure asparagic acid/acid at low cost.

フマｋｅをＬ−アスパラギノ酸に転化するのに必要なア
ミノ基転移酵素を産生ずるのに最も良いと考えられてい
る従来の微生物はその発育のため、炭素供給材刺、有機
窒素源（貫用的には様々な組成物の原刺であり比較的高
価な蛋白加水分解物である。Conventional microorganisms, which are thought to be best suited to produce the transaminase necessary to convert Fumake to L-aspartic acid, rely on carbon feedstocks, organic nitrogen sources, and It is a relatively expensive protein hydrolyzate that is the base material for various compositions.

）を含む複雑な培地を必要とする。この結果これら微生
物を使う公知方法は大規模生産用としては複雑であり、
かつ不便であるとみなすことができる。) requires a complex medium containing As a result, known methods using these microorganisms are complex for large-scale production;
and can be considered inconvenient.

この種の微生物を使い、前述の欠点を持つ１公知方法は
フランス特許第４３９４７２２号明細書に記載されてお
り、その方法ではフマル酸の生物学的転化はグルコース
ーペプトンブイヨン培地（ＭＩＥＫＩ）で発育させたプ
ソイドモナストリホリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｒ
ｉｆｏｌｉｉ）を使い実施されており、さらにその転化
は３７℃で行なわれ、発育用中性媒地の温度はこれより
幾分低い。One known method using microorganisms of this type and having the above-mentioned drawbacks is described in French Patent No. 4,394,722, in which the biological conversion of fumaric acid is grown in glucose-peptone broth medium (MIEKI). Pseudomonas tricholi (Pseudomonas tr)
ifolii), and the conversion is carried out at 37° C., with the temperature of the neutral growth medium being somewhat lower.

この発明の発明者はプソイドモナス属に属し、前述の欠
点を与えない新規微生物を発見した。The inventors of this invention have discovered a new microorganism belonging to the genus Pseudomonas and not presenting the above-mentioned disadvantages.

実際の所この微生物は簡単な手段を構することにより、
今迄知られていた方法の場合よりもかなり高い（転化）
反応率でフマル酸のような不飽和有機酸をＬ−アスパラ
ギン酸へ生物学的に転化できる．得られる収率は非常に
高く、生成物を抽出して非常に高純度なグンードにする
のは簡単である。In fact, this microorganism uses simple means to
Significantly higher (conversion) than with previously known methods
It is possible to biologically convert an unsaturated organic acid such as fumaric acid to L-aspartic acid at a reaction rate. The yields obtained are very high and the product is easy to extract into very pure Gund.

この発明で用いる微生物はてんさい糖製造工場の流出液
よりフランスのネッスル社（Ｓｏｍｍｅ）で単離された
。The microorganism used in this invention was isolated from the effluent of a sugar beet manufacturing factory at Nessle (Somme) in France.

この微生物はプソイゾモナス属菌の一種ではあるが、１
９６７年発行された「ベルゲイスマヌアル」（Ｂｅｒｇ
ｅｙｓ Ｍａｎｎｕｅｌ）に定められた基準によれば１
つないしは数個の増殖特性・恒常特性がブソイドモナス
属菌タイプのバクテリアと異なるので当然新規と考えら
れる。This microorganism is a type of Pseuzomonas, but 1
``Bergeis Manual'' published in 967
According to the standards set by the eys Manuel)
Naturally, it is considered to be novel because it has some growth and homeostasis characteristics that are different from those of the Busoidomonas type bacteria.

特性は次の通りである。The characteristics are as follows.

桿状菌：短い。Rod-shaped bacteria: short.

１個ずつ離れているかまたは２個ずつ対をなしている。They are separated by one or form a pair of two.

固有運動に乏しいか固有運動がない。Poor or no proper motion.

グラム染色：陰性 集落： （ａ）ゲロース培地：丸い。Gram staining: negative Village: (a) Gelose medium: round.

白みがかったかもしか色から明るいかもしか色。From a whitish color to a light color.

透明で輪郭は半透明。３０℃で４日培養後直径３ｍｍ。Transparent with semi-transparent outline. After 4 days of culture at 30°C, the diameter was 3 mm.

（ｂ）ゼラチン培地：丸い。(b) Gelatin medium: round.

白みがかった黄色から黄色。whitish-yellow to yellow.

透明ででこぼこのないふくらみ方をしている。It is transparent and bulges without any bumps.

（ｃ）パープルプロモクレゾールを加えたラクトース含
有ゲロース培地で３０℃で２４時間後：直径が０．３ｍ
ｍの透明集落が微量。(c) After 24 hours at 30°C in lactose-containing gelose medium supplemented with purple promocresol: 0.3 m in diameter.
There are only a few transparent settlements of m.

（ｄ）デソキシコレート・クエン酸・ラクトースで３０
℃で２４時間後：直径が１ｍｍの非常に微細なな培養菌
。(d) 30 with desoxycholate, citric acid, and lactose
After 24 hours at °C: Very fine culture with a diameter of 1 mm.

４日以内に無色。・多形性なし ・中程度の運動。Colorless within 4 days.・No polymorphism ・Moderate exercise.

極性鞭毛あり。・胞子なし ・ダラム陰性 生育： ・寒天平板培地：良好な生育。Has polar flagella.・No spores ・Durham negative growth: ・Agar plate medium: Good growth.

白色〜緑色の集落。A white to green village.

明るい。・寒天傾斜培地：同 上 ・液体培地：培地を攪拌すると良好な生育。bright.・Agar slant medium: Same as above ・Liquid medium: Good growth occurs when the medium is stirred.

混濁状培地。Turbid medium.

・セラチン穿刺培地：生育なし。- Seratin puncture medium: No growth.

生理的性質： 硝酸塩還元： − ＶＰテスト： ＋ インドール形成：− 硫化水素形成： − 殿粉水解： − クエン酸資化： ＋ 色素形成：キング培地以外では− ウレアーセ： − オキシダーセ： ＋ カタラーセ： ＋ ・生育条件：６．５＜ｐＨ＜９，４℃＜Ｔ°＜３７℃厳
格に好気性 Ｈｕｇｈ ＆ Ｌｅｉｆｓｏｎグルコース二酸化性（ｏ
ｘｙｄｅｎｔ） Ｌ−アラビノース：＋ Ｄ−キシロース：＋ Ｄ−グルコース：＋ ラクトース：＋ Ｄ−マンノース：− Ｄ−フルクトース：− Ｄ−ガラクトース： − マルトース： − シュクロース： − トレハロース： − Ｄ−マンニット： ＋ イノシトール： − グリセリン： ＋ 澱 粉： − レブロース： ＋ チロシン − 他特性： 糖分解生成物： 酸 （アルギニンデイミナーセによる）アルギニン分 解：
＋ 溶血性： 一 温度耐性： なし ミルク ： アルカリ性にならず 他プソイドモナス菌との比較： ＡＴＣＣ １４５３７−エルビニア ハービコラ（引
例１に記載） ＡＴＣＣ １２２８７＝キサントモナストリホリＡＴ
ＣＣ ８０６２＝プソイドモナス オレオポランス ＡＴＣＣ ８０２９＝プソイドモナス オバリスＡＴ
ＣＣ ４９７３＝ブソイドモナス フラジＡＴＣＣ
１５９１５＝プソイドモナス ｓｐ（引例５に記載） ＩＦＯ ３４５５＝プンイドモナス オーレギノー
サ なお、使用した培地の組成は次の通りである。Physiological properties: Nitrate reduction: - VP test: + Indole formation: - Hydrogen sulfide formation: - Starch hydrolysis: - Citric acid utilization: + Pigment formation: except in King's medium - Urease: - Oxidase: + Catalase: + ・Growth conditions: 6.5 < pH < 9, 4°C < T° < 37°C strictly aerobic Hugh & Leifson glucose dioxide (o
xydent) L-arabinose: + D-xylose: + D-glucose: + Lactose: + D-mannose: - D-fructose: - D-galactose: - Maltose: - Sucrose: - Trehalose: - D-Mannit: + Inositol: - Glycerin: + Starch: - Lebulose: + Tyrosine - Other properties: Glycolysis products: Acid (by arginine deiminase) Arginine degradation:
+ Hemolysis: One temperature tolerance: None Milk: Does not become alkaline Comparison with other pseudomonas bacteria: ATCC 14537 - Erwinia herbicola (described in reference 1) ATCC 12287 = Xanthomonas trifolii AT
CC 8062 = Pseudomonas oleoporans ATCC 8029 = Pseudomonas obalis AT
CC 4973 = Busoidomonas flagi ATCC
15915 = Pseudomonas sp (described in Reference 5) IFO 3455 = Pseudomonas aureginosa The composition of the medium used is as follows.

培地 Ｇ．０． 肉を離解して２回濃縮した物 ５００ｍｌペブトン
１０ｍｌＮａＣｔ
５ｇセラチン １５０
ｇ蒸留水 ５００ｍｌ培地 Ｌ．
Ｇ．ＰＢＣ： ペプト７ ２０ｇ ゲロース（寒天） ２０ｇ 蒸留水 １０００ｍｌ（ｐＨを７．
３に調整し、１２０℃で３０分沈澱させ沢過した後に次
成分を添加） ラクトース １０ｇパープルブロ
モクＶゾール １０００ｍｌ培地 ＤＣＬ： ペプトン １０ｇラクトース
１０ｇナトリウム デソキシコン
ート ０．５ｇＮａＣｌ
５ｇクエン酸ナトリウム ２ｇ寒 天
１５ｇニュートラルレッド
０．０３ｇ培地キングＮ： ペプトン ２０ｇ グリセリン １０ｇ 無水（乾燥）硫酸カリウム １０ｇ 無水（乾燥）ＭｇＣｌ２ １．４ｇゲロース
１５ｇ 蒸留水 １０００ｍｌ （ｐＨを７．２に調整） 培地キングＢ： すい臓ペプトン ２０ｇグリセリン
１０ｇ無水（乾燥）一酸性リン酸
カリウム １．５ｇ硫酸マグネシウム（７Ｈ２Ｏ）
１・５ｇゲロース １５ｇ蒸留
水 １０００ｍｌ（ｐＨを７，２
に調整） ＊培地キングＡ、キングＢは例えば、Ｍａｒｃｈａｌ＆
Ｂｏｕｒｄｏｎ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｄｏｉｎ社のフラ
ンス語文献“Ｍｉｌ ｉｅｕｘ ｄｅ ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓ ｅｔ ｄ′ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｈｉ′
ｍｉｑｕｅ ｄｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｅｓ”に記載され
ており、当業界ではよく知られている。Medium G. 0. 500ml Pebton, which is made by mincing meat and concentrating it twice
10mlNaCt
5g Seratin 150
g Distilled water 500ml medium L.
G. PBC: Pepto 7 20g Gelose (agar) 20g Distilled water 1000ml (pH 7.
3, precipitated at 120℃ for 30 minutes, filtered, and then added the following ingredients) Lactose 10g Purple Bromox Vsol 1000ml medium DCL: Peptone 10g Lactose
10g Sodium Desoxyconte 0.5g NaCl
5g sodium citrate 2g agar
15g neutral red
0.03g Medium King N: Peptone 20g Glycerin 10g Anhydrous (dry) Potassium Sulfate 10g Anhydrous (Dry) MgCl2 1.4g Gelose
15g distilled water 1000ml (pH adjusted to 7.2) Medium King B: Pancreatic peptone 20g glycerin
10g anhydrous (dry) monoacidic potassium phosphate 1.5g magnesium sulfate (7H2O)
1.5g gelose 15g distilled water 1000ml (pH 7.2
*Medium King A and King B are, for example, Marchal &
Bourdon edition Doin's French literature “Mil ieux de culture”
s et d'identificationchi'
mique des bacteria” and are well known in the art.

この微生物の単離は次の条件下で通常の単離・精製法に
より行うことができる。Isolation of this microorganism can be performed by conventional isolation and purification methods under the following conditions.

てんさいから糖を作る工場から得た０．１ｍｌの流出液
のサンプルを幾つか、通常次の組成：ビーフエキス
２０ｇ／ｌ ベプトン ２０ 〃 グルコース ４ 〃 ＮａＣｌｔ ５ 〃 ゲロース １５ 〃 を持つ固体ゲロース培地Ａを含むペ する。Several samples of 0.1 ml of effluent from sugar beet factories were collected, usually with the following composition: Beef extract.
A pellet containing solid gelose medium A with 20 g/l Beptone 20 Glucose 4 NaClt 5 Gelose 15.

培養は約３０℃で実施する。Cultivation is carried out at approximately 30°C.

２４〜３０時間培養後多くの細菌集落が観察される。Many bacterial colonies are observed after 24-30 hours of culture.

これら集落の１つ１つを連続的に上記と同じ組成を持つ
培地に移し、前述の条件により処理して精製する。Each of these colonies is successively transferred to a medium having the same composition as above, treated and purified under the conditions described above.

顕微鏡で観察すれば単離し精製したプソイドモナス属菌
集落の各々のバクテリアの形態的同一性が十分チェック
できる。By observing under a microscope, the morphological identity of each bacteria in the isolated and purified Pseudomonas bacteria colony can be sufficiently checked.

このようにして純粋な培養菌の形で得た菌株は上述の培
地Ａに斜面培養して保持する。The strain thus obtained in the form of a pure culture is maintained by slant culture on the above-mentioned medium A.

菌株はその培養菌をフマル酸を含む基質中に使用するこ
とによりそのＬ−アスパラギン酸産生能力を測定するた
めさらにテストする。The strain is further tested to determine its ability to produce L-aspartate by using the culture in a substrate containing fumaric acid.

次の比較表は上記スクリーニング中単離したプソイドモ
ナス属の三菌株の産生能を示す。The following comparative table shows the productivity of the three Pseudomonas strains isolated during the above screening.

プソイドモナスＰＯ ７１１１菌株が群をぬいて最も産
生能が高いことが確認された。It was confirmed that Pseudomonas PO 7111 strain had the highest productivity by far.

この菌株のサンプルは寄託受託番号微工研第２２６９号
として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。A sample of this strain has been deposited with the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology under the depository accession number FEIKEN No. 2269.

従来知られており、アミノ基転移酵素産生のために使用
された他の微生物と異なり、この菌株は主として例えば
糖の抽出残渣、すなわちてんさい、またはさとうきびの
シロップ状残渣からなる普通の培地中で発育でき、この
残渣には無機リン補充物（例えばリン酸塩、リン酸の形
の）、窒素補充物（例えば尿素、またはアンモニアの形
の）、および微量要素をいくらか加える。Unlike other microorganisms previously known and used for the production of aminotransferases, this strain can be grown in a common medium consisting mainly of sugar extraction residues, e.g. sugar beet or sugar cane syrupy residues. This residue can be supplemented with inorganic phosphorus supplements (eg, in the form of phosphate, phosphoric acid), nitrogen supplements (eg, in the form of urea, or ammonia), and some trace elements.

この発明の発明者は上記シロップ状残渣を含む前記培地
がこの発明の微生物によるアミノ基転移酵素の産生を著
しく高めたことを証明できたが、その機構は未だわから
ない。Although the inventors of the present invention were able to demonstrate that the medium containing the syrupy residue described above significantly enhanced the production of transaminase by the microorganism of the present invention, the mechanism is still unknown.

以下の実験はそのような培地に対するこの発明の菌株の
特性を示すものである。The following experiments demonstrate the properties of the strains of this invention on such media.

測定は一方で培地中の特定酵素の定量測定により行ない
、他方でフマル酸→Ｌ−アスパラギン酸の転化率の測定
に５より行なった。Measurements were carried out, on the one hand, by quantitative measurement of specific enzymes in the medium, and on the other hand, by measurement of the conversion rate of fumaric acid to L-aspartic acid.

実験 １ 次の特性を持つ培地を製造した。Experiment 1 A medium with the following characteristics was produced.

人工培地（培地１） グルコース ６０ｇ／ｌとうもろ
こし浸出液 ４０ 〃ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
Ｏ ０．５ 〃リン酸二水素カリウム
５ 〃フマル酸 １
〃シロップ状材刺（培地２） シロップ状残渣（使用全糖量に換算して）６０ｇ／ｌリ
ン酸二水素カリウム ５ 〃ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ ０．５ 〃尿 素
８ 〃この培地を１２１℃で２０分加熱し
て滅菌後、滅菌状態を保ちながらアンモニアガスでその
田を７〜７．２に調整した。Artificial medium (medium 1) Glucose 60g/l Corn infusion solution 40 〃MgSO4・7H2
O 0.5 Potassium dihydrogen phosphate
5 Fumaric acid 1
〃Syrup-like lumber (medium 2) Syrup-like residue (converted to total amount of sugar used) 60g/l Potassium dihydrogen phosphate 5 〃MgSO4・
7H2O 0.5 Urea
8. After sterilizing this medium by heating it at 121° C. for 20 minutes, the temperature of the medium was adjusted to 7 to 7.2 with ammonia gas while maintaining the sterilized state.

ＰＯ ７１１１菌株を食塩水に浮遊させ、個々の培地に
接種した。The PO 7111 strain was suspended in saline and inoculated into individual media.

培養は１ｔの培地を含む６ｔのフラスコ中で回転攪拌機
を使って実施した。Cultivation was carried out in a 6 t flask containing 1 t of medium using a rotary stirrer.

細菌の発育は培地を２０分の１に希釈後光学的密度の測
定により評価し、アミン基転移酵素活性は「メソツズ
イン エンザイモロジー」（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｊｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）に開示されている方法により測定
した。Bacterial growth was evaluated by measuring optical density after diluting the medium to 1/20, and aminotransferase activity was determined by
In Enzymology” (Methods jn E
zymology).

上記表より細菌発育が両培地でほとんど同一の場合でも
、微生物を培地２で培養した時は産生じたアミノ基転移
酵素の活性は培地１で培養した時より５０〜６０％大き
いことが観察される。From the table above, it is observed that even when bacterial growth is almost the same in both media, when microorganisms are cultured in medium 2, the activity of the aminotransferase produced is 50-60% higher than when cultured in medium 1. Ru.

更に一般的にはアミノ基転移酵素産生のための、したが
ってフマル酸の転化のための最も適当な栄養豊富な培地
はこの発明によれば実質上次の組成２を持つ培地である
。More generally, the most suitable nutrient-rich medium for the production of aminotransferases and therefore for the conversion of fumaric acid is, according to the invention, a medium having substantially the following composition 2:

使用全糖量に換算して１５〜６０ｇ／ｌ、好ましくは４
０ｇ／ｌのシロップ状の糖抽出残渣：り／酸量で表わし
て１〜４ｇ／ｌ、好ましくは２〜２．６ｇ／ｌのリン酸
、または無機リン酸塩； 二ＭｇＳＯ４量で表わして
０．１〜１ｇ／ｌ，好ましくは０．４〜０．６ｇ／ｌの
ＭｇＳＯ４：０．５〜１０ｇ／ｌ、好ましくは０．９〜
１．１ｇ／ｌのフマ泣酸。15 to 60 g/l in terms of total sugar used, preferably 4
0 g/l syrupy sugar extraction residue: 1 to 4 g/l, preferably 2 to 2.6 g/l phosphoric acid, or inorganic phosphate, expressed as phosphoric acid; 0 expressed as diMgSO4 .1 to 1 g/l, preferably 0.4 to 0.6 g/l MgSO4: 0.5 to 10 g/l, preferably 0.9 to
1.1 g/l of humacic acid.

得た水性培地のｐＨを７〜８．５、好ましくは約７に調
整する。The pH of the obtained aqueous medium is adjusted to 7-8.5, preferably about 7.

９〜１５時間、好ましくは１０〜１２時間の培養中培地
温度は３８℃より高くしてはいけない。During the 9-15 hours, preferably 10-12 hours of culture, the medium temperature should not be higher than 38°C.

同様に、培地温度が２５℃より低くなると微生物の発育
は妨げられる。Similarly, microbial growth is inhibited when the culture medium temperature is lower than 25°C.

細菌の最適個体数密度は３０℃で得られる。Optimal population density of bacteria is obtained at 30°C.

０〜１０ｐｐｍの範囲内で痕跡量の微量元素を無機塩の
形で培地に加えるか、あるいは脱ミネラルしてない普通
の水を使用することにより培地に加え、培地の容積を１
ｌに調整できる。Trace amounts of trace elements in the range 0-10 ppm are added to the medium in the form of inorganic salts or by using plain, non-demineralized water, reducing the volume of the medium to 1
It can be adjusted to l.

従来使用されていた微生物には、それにより分泌された
酵素が熱に弱く、生物学的転化用培地の物理−化学条件
、特にｐＨと温度、に対して非常に感受性が強いという
特徴があった。Previously used microorganisms were characterized by the fact that the enzymes secreted by them were heat sensitive and very sensitive to the physico-chemical conditions of the biological conversion medium, especially pH and temperature. .

いまやこの発明のＰＯ ７１１１菌株の組織的研究によ
りこの微生物が主としてシロップ状の糖抽出残渣を含む
培地中に、フマル酸の生物学的転化のための操作条件、
特に温度とｐＨについての操作条件を広範囲にわたって
変えても転化能を保持する酵素を凝集できたことが示さ
れた。The systematic study of the PO 7111 strain of the present invention has now shown that this microorganism was found in a medium containing mainly syrupy sugar extraction residues, operating conditions for the biological conversion of fumaric acid,
It was shown that it was possible to aggregate enzymes that retained their conversion ability over a wide range of operating conditions, especially with respect to temperature and pH.

このように、シロップ状残渣でＰＯ ７１１１菌株を培
養した場合は、２０〜６０℃の広温度域で転化温度を上
げるにしたがってその酵素活性が上がるような条件でフ
マル酸をアミノ化してＬ−アスパラギン酸にする酵素を
含む培地を得られたことが行なった様々な測定により示
された。In this way, when the PO 7111 strain is cultured in syrup-like residue, fumaric acid is aminated to L-asparagine under conditions such that the enzymatic activity increases as the conversion temperature increases over a wide temperature range of 20 to 60°C. Various measurements performed showed that a medium containing the acidifying enzymes was obtained.

同様にして生物学的転化ｐＨの上昇が６〜１２のｐＨ域
では転化率に好ましい影響を持つことが観察された。Similarly, it was observed that increasing the biological conversion pH had a positive effect on the conversion rate in the pH range of 6-12.

生物学的転化率に対するこれら２つのパラメーターの影
響を研究するためにＰＯ ７１１１菌株を前述の実験１
に記載したシロップ状の糖抽出残渣培地で培養した。The PO 7111 strain was used in Experiment 1 as described above to study the influence of these two parameters on biological conversion.
The cells were cultured in the syrup-like sugar extraction residue medium described in .

この培地１０ｌを以下に記載する２つの実験の各々のた
めに製造した。10 liters of this medium were produced for each of the two experiments described below.

実験 ２ 生物学的転化率に対する培地温度の影響 前もって製造した１０ｌ培地のｐＨを８に、温度を選ん
だ値に調整後２ｋｇのフマル酸アンモニウムを加えた。Experiment 2 Effect of medium temperature on biological conversion 2 kg of ammonium fumarate were added to the previously prepared 10 l medium after adjusting the pH to 8 and the temperature to the selected value.

転化操業中、培地ｐＨはＮＨ３ガスの添加により８に保
った。During the conversion run, the medium pH was maintained at 8 by addition of NH3 gas.

酵素活性は「メソッドインエ／ザイヱロジー」（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ−１ｏｚｙ）第１３巻に
記載されている方法により、攪拌しながら１時間反応さ
せた後と、その後４時間の間各１時間毎に定量分析によ
り測定した。Enzyme activity is determined by “Method Ine/Zyology” (Met
It was measured by quantitative analysis after reacting for 1 hour with stirring and every hour for 4 hours thereafter, according to the method described in Vol. 13 of Hods in Enzymo-1ozy.

次の表に示したデータは以上のように行なって得た５つ
の測定値の平均値である。The data shown in the following table are the average values of the five measurements obtained as described above.

酵素活性は生物学的転化温度が２０℃から５０℃に上昇
する間はほとんど一次直線的に上昇し、５０°〜６０℃
ではゆっくりとなるが６０℃で０になることはないこと
が観察された。Enzyme activity increases almost linearly as the biological conversion temperature increases from 20°C to 50°C, and from 50° to 60°C.
However, it was observed that the temperature did not reach 0 at 60°C, although it became slower.

この発明によりフマル酸のＬ−アスパラギン酸へのＰＯ
７１１１菌株による生物学的転化は３０〜６０℃、好ま
しくは５０〜６０℃、更に特定すれば５５〜５７℃で達
成されるだろう。According to this invention, the PO of fumaric acid to L-aspartic acid
Biological conversion by the 7111 strain will be achieved at 30-60<0>C, preferably 50-60<0>C, more particularly 55-57<0>C.

なぜならば最適温度は約５５〜５７℃と思われるからで
ある。This is because the optimum temperature seems to be about 55-57°C.

実験 ３ 生物学的転化率に対する培地ｐＨの影響 実験２と同一のシロップ状材刺のフラクションを用いて
行なった。Experiment 3 Effect of medium pH on biological conversion rate. It was carried out using the same syrupy thorn fraction as in Experiment 2.

攪拌機のついたタンクに１０ｌフラクションを注ぎ入れ
、５７℃に維持した。The 10 l fraction was poured into a tank equipped with a stirrer and maintained at 57°C.

２Ｋ９のフマル酸にアンモニウムを添加後生物学的転化
率を実験２と同一の方法で追行した。After adding ammonium to 2K9 fumaric acid, the biological conversion rate was followed in the same manner as in Experiment 2.

次の表に示したデータは実験２で説明したようにして行
って得た５つの測定値の平均値を示す。The data presented in the following table represents the average of five measurements made as described in Experiment 2.

培地ｐＨが８．７５より大きいと培地よりアンモニアガ
スが発生する傾向があり、損害を避けるためにはタンク
を低圧下に保つことが好ましいということに注意すべき
である。It should be noted that when the medium pH is greater than 8.75, the medium tends to generate ammonia gas and it is preferable to keep the tank under low pressure to avoid damage.

上の結果は培地ｐＨが７から８．５に上昇する間は転化
率もそれに応じて上昇し、８．７５〜９．５０ではゆっ
くりとなり、そしてｐＨが９．５を越えると最終的に一
定になることを示している。The above results show that as the medium pH increases from 7 to 8.5, the conversion rate increases accordingly, becomes slow from 8.75 to 9.50, and finally becomes constant when the pH exceeds 9.5. It shows that it will become.

この発明により、フマル酸からし−アスパラギン酸への
ｐＯ７１１１菌株を使っての生物学的転化は従って８５
〜１０、好ましくは９〜９．５のｐＨで行なわれる。According to this invention, the biological conversion of fumaric acid to mustard-aspartic acid using the pO7111 strain is therefore 85
It is carried out at a pH of ~10, preferably 9-9.5.

さらに転化しようとする基質、すなわちフマル酸の濃度
の影響の研究により、転化率はフマル酸含量が培地中約
１０％である時最も良く、この転化率は形成されるＬ−
アスパラギン酸含量（培地溶液の飽和限界以内）により
影響されないことが示された。Further studies of the influence of the concentration of the substrate to be converted, namely fumaric acid, have shown that the conversion rate is best when the fumaric acid content is approximately 10% in the medium;
It was shown to be unaffected by aspartate content (within the saturation limit of the medium solution).

それゆえ、フマル酸濃度をできるだけ約１０％に維持す
るために基質を小量ずつ連続して加えることによりこの
発明の方法を行うことが望ましい。It is therefore desirable to carry out the process of this invention by adding substrate in small continuous portions to maintain the fumaric acid concentration as close as possible to about 10%.

しかしＬ−アスパラギン酸抽出に用いる溶液中に余りに
多量の未転化フマル酸を残すことがないようにするため
にフマル酸供給は転化操作の終りの数時間は止める。However, in order to avoid leaving too much unconverted fumaric acid in the solution used for L-aspartic acid extraction, the fumaric acid feed is stopped for several hours at the end of the conversion operation.

この発明の好ましい具体化により、この発明の生物学的
転化に必要なアミノ酸転移酵素の産生は、ＰＯ７１１１
菌株の好気的培養を、唯一の炭素供給材狛としての、て
んさい、またはさとうきびのシロップ状抽出残渣と、こ
の微生物によるアミノ酸転移酵素凝集に有効な一定量の
フマル酸とを含む培地中で行うことにより実施する。According to a preferred embodiment of this invention, the production of the amino acid transferase necessary for the biological conversion of this invention is performed using PO7111
Aerobic cultivation of the bacterial strain is carried out in a medium containing sugar beet or sugar cane syrupy extraction residue as the sole carbon source and a certain amount of fumaric acid effective for amino acid transferase aggregation by this microorganism. Implemented by

最適割合が得られる時培養を止め、それから基質と接触
させ、この基質をアスパラギン酸に転化する。When the optimum ratio is obtained, the culture is stopped and then contacted with the substrate, which is converted to aspartic acid.

ＰＯ７１１１菌株より産生される酵素の活性は他の微生
物の存在により損なわれることはなく、したがってこの
発明によるフマル酸のＬ−アスパラギン酸への生物学的
転化は滅菌培地中で行なう必要はない。The activity of the enzyme produced by the PO7111 strain is not impaired by the presence of other microorganisms, so the biological conversion of fumaric acid to L-aspartic acid according to the invention does not need to be carried out in a sterile medium.

それゆえ特別に処理してない基質、特に市場に見られる
ような精製結晶体フマル酸を使用することが可能であり
、フマル酸塩もまた用いることができる。It is therefore possible to use unspecially treated substrates, in particular purified crystalline fumaric acid as found on the market; fumarate salts can also be used.

固体フマル酸を前もって滅菌することなく生物学的転化
用培地に加え、培地中約１０％の濃度を維持する。Solid fumaric acid is added to the biological conversion medium without prior sterilization and maintained at a concentration of approximately 10% in the medium.

この生物学的転化段階は望ましくない副生物、特にエチ
レン酸の酸化生成物、の形成を避けるために通気なしで
実施する。This biological conversion step is carried out without aeration to avoid the formation of undesirable by-products, especially oxidation products of ethylene acid.

副生物形成の恐れがあるのはフマル酸ジアンモニウムを
使った場合であり、フマル酸を用いた場合はアンモニア
を含むシロップ状残渣培地に注いでも安全である。There is a risk of by-product formation when diammonium fumarate is used, and when fumaric acid is used, it is safe to pour it into a syrupy residue medium containing ammonia.

（転化）反応は窒素のような不活性ガスの存在下で行な
う。The (conversion) reaction is carried out in the presence of an inert gas such as nitrogen.

転化中培地温度は好ましくは５５〜５７℃に保ち、培地
ｐＨはアスモニアガスの添加により９〜９．５に調整す
る。During the conversion, the medium temperature is preferably maintained at 55-57°C, and the medium pH is adjusted to 9-9.5 by addition of asmonia gas.

反応の終点、すなわち残留フマル酸の割合がＬ−アスパ
ラギン酸の収率が最高になるような値に低下した時この
反応混合物より微生物および他の全ての不溶性化合物を
除くためにこの混合物を通常の公知手段、例えば遠心分
離、涙過等により分離する。At the end of the reaction, when the proportion of residual fumaric acid has fallen to such a value that the yield of L-aspartic acid is the highest, the reaction mixture is subjected to conventional treatment in order to remove microorganisms and all other insoluble compounds. Separation is performed by known means such as centrifugation, lacrimation, etc.

このようにしてアスパラギ７酸の濃厚溶液を得、この溶
液から、例えば培地ｐＨをアスパラギン酸の等電点ｐＨ
に等しい値にしてアスパラギン酸を不溶化にするなどの
常とう手段を使うことによりアスパラギン酸を抽出する
。In this way, a concentrated solution of aspartic heptaic acid is obtained, and from this solution, for example, the culture medium pH is adjusted to the isoelectric point pH of aspartic acid.
Aspartic acid is extracted by using conventional means, such as making the aspartic acid insolubilized to a value equal to .

この発明の条件を用いて得られる結晶体生成物は工業的
用途に対しては十分な純度を持っているが、脱色後単に
再結晶処理により更に精製し、薬学的規準を満足する製
品を得ることができる。The crystalline product obtained using the conditions of this invention has sufficient purity for industrial use, but after decolorization it can be further purified simply by a recrystallization process to obtain a product that meets pharmaceutical standards. be able to.

この発明の実施例を以下に与えるが、これらはこの発明
を限定するものではない。Examples of the invention are given below, but they are not intended to limit the invention.

実施例Ｉ ＰＯ７１１１菌株に特異的な生物学的転化最適・条件を
適用し、装置中で工業的規模で操作し、高濃度のアミノ
基転移酵素を含む１ｍ３の培地を得た。Example I Biological conversion optima and conditions specific for the PO7111 strain were applied and operated on an industrial scale in a device to obtain 1 m3 of medium containing a high concentration of aminotransferase.

培地の製造 攪拌後と加熱手段とが備わった発酵装置中で、次の組成
を持つ１０００ｌの培地を製造した。Preparation of medium In a fermentation apparatus equipped with stirring and heating means, 1000 liters of medium having the following composition was prepared.

培地ｐＨを滅菌前にアンモニアを使い７に調整した。The medium pH was adjusted to 7 using ammonia before sterilization.

滅菌は１２３℃で３０分加熱することにより行なった。Sterilization was performed by heating at 123°C for 30 minutes.

製造した培地に２０ｌのプソイドモナス属菌（ＰＯ７１
１１菌株）液を接種した。Add 20 liters of Pseudomonas bacteria (PO71) to the prepared medium.
11 strains) was inoculated.

この培養菌を滅菌培地中、温度条件を調節しながら、攪
拌・通気しながら発育させた。This culture was grown in a sterile medium with stirring and aeration while controlling the temperature conditions.

操作条件は次の通りだった。The operating conditions were as follows.

温度３０℃ 攪拌１００ｒ．ｐ．ｍ 通気速度０．８ｖ／ｖ／分 １１時間培養後菌体数は１０１０個／ｍｌに達し、培地
ｐＨは８．９５になった。Temperature 30°C Stirring 100r. p. After culturing for 11 hours at an aeration rate of 0.8 v/v/min, the number of bacterial cells reached 1010 cells/ml, and the medium pH became 8.95.

この時酵素活性は最大であった。At this time the enzyme activity was at its maximum.

生物学的転化 培養期間の終点で発酵装置を開き空気にさらし通気を止
めた。At the end of the biological conversion culture period, the fermenter was opened to air and ventilation was stopped.

攪拌しながら温度を少しずつ上げて５５〜５７℃とし、
それからタンク中に結晶体フマル酸を直接注ぎ入れるこ
とにより基質を少しずつ加え、１００ｇ／ｌのフマル酸
濃度を得た。While stirring, gradually raise the temperature to 55-57℃,
The substrate was then added in portions by pouring the crystalline fumaric acid directly into the tank to obtain a fumaric acid concentration of 100 g/l.

培地ｐＨはアンモニアガスの添加により８．９〜９．１
の間に維持した。The pH of the medium is 8.9-9.1 by adding ammonia gas.
maintained between.

転化は形成されたＬ−アスパラギン酸を測定することに
より観察した。Conversion was monitored by measuring the L-aspartic acid formed.

フマル酸添加は培地中の濃度を約１０％に保つよう調整
した。The addition of fumaric acid was adjusted to maintain the concentration in the medium at approximately 10%.

操作は１２時間続け、その後は温度とｐＨをそのままの
値に維持しなからフマル酸の添加量を減少した。The operation continued for 12 hours, after which time the fumaric acid addition was reduced while maintaining the temperature and pH at the same values.

このようにして１５時間目までフマル酸含量を下げてい
き、この時点で培地は１８０ｇ／ｌのし一アスパラギン
酸と３０ｇ／ｌの未転化フマル酸を含んでいた。The fumaric acid content was reduced in this way until the 15th hour, at which point the medium contained 180 g/l of aspartic acid and 30 g/l of unconverted fumaric acid.

それからフマル酸添加を止めた。加えた基質全量は１６
０ｋｇだった。Then fumaric acid addition was stopped. The total amount of substrate added was 16
It was 0kg.

温度とｐＨをそのままの値に維持したまま攪拌を２０時
間目まで続けた。Stirring was continued until the 20th hour while maintaining the temperature and pH at the same values.

この時点で培地中のＬ−アスパラギン酸含量は２１，１
％に増加しており、残留フマル酸含量は０．７％になっ
た。At this point, the L-aspartic acid content in the medium was 21.1
%, and the residual fumaric acid content was 0.7%.

したがって約１５５ｋｇのフマル酸が収率１０９％で転
化され、これは９５％のモル収率に対応した。Approximately 155 kg of fumaric acid were thus converted with a yield of 109%, which corresponded to a molar yield of 95%.

得たアスパラギン酸を実施例２、また畔実施例３の方法
により抽出した。The obtained aspartic acid was extracted by the method of Example 2 and Example 3.

実施例２ 実施例１で得た溶液を、結晶体Ｌ−アスパラギン酸抽出
に備え処理した。Example 2 The solution obtained in Example 1 was processed in preparation for extraction of crystalline L-aspartic acid.

この目的のため濃塩酸によりその溶液を酸性にし、その
ｐＨを５．８に調整した。For this purpose, the solution was acidified with concentrated hydrochloric acid and its pH was adjusted to 5.8.

それから温度を約５３〜５５℃に上げ、ポリスチレンス
ルホ／酸型凝集剤の１０ｇ／ｌ溶液を加えた。The temperature was then raised to approximately 53-55°C and a 10 g/l solution of polystyrene sulfo/acid-type flocculant was added.

１５分接触後、不溶性部分と凝集物とを、伸展した真珠
岩〔商標名「デカライト」（Ｄ′ｅｃａｌｉｔｅ）〕の
一層で被覆したドラムフィルターを使い真空炉過して取
り除いた。After 15 minutes of contact, the insoluble parts and aggregates were removed by vacuum filtration using a drum filter coated with a single layer of expanded nacre (trade name "D'ecalite").

沢過速度ぱ５００ｌ／ｍ２／時であった。The flow overspeed was 500 l/m2/hour.

Ｐ液は十分澄明だった。P liquid was sufficiently clear.

それから冷却して３０℃の温度にし、攪拌下、濃塩酸を
注ぎ入れて酸性しｐＨ２．８〜３とした。It was then cooled to a temperature of 30 DEG C. and acidified to pH 2.8-3 by pouring concentrated hydrochloric acid under stirring.

８時間後、結晶を母液から抽出し、遠心分離により脱水
した。After 8 hours, the crystals were extracted from the mother liquor and dehydrated by centrifugation.

得た結晶の洗水後の純度は９９％より良かった。The purity of the obtained crystals after washing with water was better than 99%.

以上のようにして１８３ｋｇのＬ−アスパラギン酸を得
た。In the above manner, 183 kg of L-aspartic acid was obtained.

実施例 ３ 実施例１の方法により、フマル酸のＬ−アスパラギン酸
への生物学的転化工程より得た１０ｍ８の溶液をＬ−ア
スパラギン酸抽出のため処理した。Example 3 According to the method of Example 1, 10 m8 of the solution obtained from the biological conversion process of fumaric acid to L-aspartic acid was treated for L-aspartic acid extraction.

この目的のために６０重量％の硫酸を加えてそのｐＨを
５．８に調整した。For this purpose, the pH was adjusted to 5.8 by adding 60% by weight sulfuric acid.

同時にその温度を約５５℃に上げた。At the same time, the temperature was raised to about 55°C.

それからポリスチレンスルホン酸型凝集剤を１０ｇ／ｌ
水溶液の形で加えた。Then add 10g/l of polystyrene sulfonic acid type flocculant.
It was added in the form of an aqueous solution.

ここで用いた凝集剤は商標名「プリフロック（Ｐｕｒｉ
ｆｌｏｃ）Ａ−２１」として知られている。The flocculant used here has the trade name “Puri Floc”.
floc)A-21''.

処理しようとする溶液にこの製品を溶液１ｌ当り０．５
ｇの割合で使用した。Add this product to the solution to be treated at a rate of 0.5 per liter of solution.
g.

１５分接触後、微生物、細胞破片、凝集コロイドその他
の不溶性不純物をスキマー（Ｓｋｉｍｍｅｒ，液体の上
皮をすくう道具）型の平板分離機（ｐｌａｔｅｓｅｐａ
ｒａｔｏｒ）を使い分離した。After 15 minutes of contact, microorganisms, cell debris, aggregated colloids, and other insoluble impurities are removed using a skimmer-type plate separator.
rator).

この分離法は秀れていた。This separation method was excellent.

なぜなら分離処理前のカオリン濁度は５０００度であっ
たが、得た澄明相の濁度はカオリン濁度２５度であった
から。This is because the kaolin turbidity before separation treatment was 5000 degrees, but the turbidity of the obtained clear phase was 25 degrees.

カオリン濁度１度とは水１ｌ当たりｌｍｇのカオリンを
含む懸濁液に対応する濁度である。A kaolin turbidity of 1 degree is a turbidity corresponding to a suspension containing 1 mg of kaolin per 1 liter of water.

それから０．５重量％のフラクションを、非常に低い割
合のアスパラギン酸を含む泥として取り除いた。A fraction of 0.5% by weight was then removed as a slurry containing a very low proportion of aspartic acid.

得た澄明溶液に活性炭と炉過用添加剤を加え更に精製し
た。Activated carbon and filtering additives were added to the resulting clear solution for further purification.

２００ｇ／ｌのアスパラギン酸を含む１０ｍ８の溶液に
３０Ｋ９の活性炭（商標名：ＳＡ１６３５）と５０ｋｇ
のデイカライト（Ｄｉｃａｌｉｔｅ）を加えた。30K9 activated carbon (trade name: SA1635) and 50 kg in 10 m8 of a solution containing 200 g/l aspartic acid.
of Dicalite was added.

ゆっくり攪拌しながら３０分接触後、得た懸濁液を温度
を一定に保ちながらプレスフィルター、またはドラムフ
ィルターを使い真空炉過した。After 30 minutes of contact with slow stirring, the resulting suspension was passed through a vacuum oven using a press filter or drum filter while keeping the temperature constant.

テ過は非常に早く、平均涙過速度は１ｍ８／ｍ２／時で
あった。Tear flow was very rapid, with an average tear flow rate of 1 m8/m2/hour.

このようにして得た溶液はまったく澄明でありわずかに
薄黄色をしていた。The solution thus obtained was quite clear and had a slightly pale yellow color.

得たＬ−アスパラギン酸は６０％硫酸の添加により結晶
させた。The L-aspartic acid obtained was crystallized by addition of 60% sulfuric acid.

この操作は一続きに配置した１群の攪拌用夕７クの中で
連続的に行ない、１つのタンクからあふれ出た結晶含有
スラリーを次のタンクに導入した。This operation was carried out continuously in a group of stirring tanks arranged in series, and the crystal-containing slurry overflowing from one tank was introduced into the next tank.

少量の硫酸を絶え間なく個々のタンクに加え、これによ
り１番目のタンクから最後のタンクに至るｐＨ変化を一
次直線とした。Small amounts of sulfuric acid were continuously added to each tank, thereby making the pH change linear from the first tank to the last tank.

最後のタンクではそのｐＨを２，８〜３に調整した。In the last tank its pH was adjusted to 2.8-3.

結晶化中はタンクを冷却し、その温度を約４２〜４５℃
に保った。During crystallization, the tank is cooled and its temperature is approximately 42-45℃.
I kept it.

澄明な溶液からの完全な結晶の採取は、その溶液を攪拌
・冷却装置の備わった特別なタンクに入れ２０℃で８時
間混合することによりバッチ方式で行なった。Collection of complete crystals from the clear solution was carried out in batch mode by placing the solution in a special tank equipped with stirring and cooling equipment and mixing at 20° C. for 8 hours.

このよりにして得た混合物をバスケット型遠心炉過装置
を使い液体一固体乾燥分離器にかけた。The resulting mixture was passed through a liquid-solid dry separator using a basket type centrifugal filtration device.

得た結晶を軟水で洗い乾燥した。The obtained crystals were washed with soft water and dried.

純度９７．５〜９８％のＬ−アスパラギン酸結晶１８０
ｋｇを得た。L-aspartic acid crystal 180 with purity 97.5-98%
I got kg.

この生成物はフマル酸は全く含まなかったがわずかに少
量の無機塩、特に硫酸アンモニウムを含んでいた。The product contained no fumaric acid but only small amounts of inorganic salts, especially ammonium sulfate.

この硫酸アンモニウムは生成物を酸性水に再度懸濁し、
結晶化したＬ−アスパラギン酸を分離することにより簡
単に除去できた。This ammonium sulfate resuspends the product in acidic water and
It could be easily removed by separating the crystallized L-aspartic acid.

このようにして得た生成物はさらに洗水しなくてもペプ
チド一般、特に甘味刺ジペプチドの合成に用いることが
できるほど十分純度が高かった。The product thus obtained was sufficiently pure that it could be used for the synthesis of peptides in general, and sweet-tasting dipeptides in particular, without further washing.

もちろんこの発明は以上に記載し例示した具体例に決し
て限定されることはなく、それら具体例は単に実施例と
してのみ与えられたものである。Of course, the invention is in no way limited to the embodiments described and illustrated above, which are given by way of example only.

特にこの発明は以上に記載した手段と技術的に均等な全
ての手段およびそれらの組み合わせを含み、これら均等
手段は当然この発明の精神により実施できる。In particular, the invention includes all means and combinations thereof which are technically equivalent to the means described above, and these equivalent means can of course be implemented in accordance with the spirit of the invention.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １ フマル酸含有培地からＬ−アスパラギン酸を製造す
る方法において、 プソイゾモナス属に属するＰＯ７１１１菌株（微工研菌
寄第２２６９号菌株）を好気条件下で，炭素源、リン源
、窒素源（好ましくは尿素とアンモニアから選択される
）及び微量元素を含め栄養培地中で培養してアミノ基転
移酵素に富む被発酵培地を得： フマル酸を該被発酵培地に導入することにより生物学的
転化を実施し、該生物学的転化は所要時間中通気するこ
となく、６〜１２、好ましくは８．５〜１０のｐＨで、
３０〜６０℃の、好ましくは５５〜５７℃の温度で、好
ましくは１５〜２０時間実施し； ついで、該生物学的転化で形成されたＬ−アスパラギン
酸を抽出する： ことからなり、該生物学的転化は前記培地で微生物を１
２〜１６時間発育させた後に行なうことが好ましい、方
法。 ２ 栄養培地が（イ）全糖量で表わして１５〜６０ｇ／
ｌ、好ましくは３５〜４０ｇ／ｌの糖蜜：（ロ）リン酸
に換算して１〜４ｇ／ｌのリン酸、または無機リン酸塩
：（ハ）硫酸塩に換算して０．１〜１ｇ／ｌのマグネシ
ウム：および（ニ）０〜１０ｐｐｍの微量元素からなる
組成を持ち、そのｐＨが７〜８．５に調整されている、
特許請求の範囲第１項の製法。 ３ 転化しようとするフマル酸を生物学的転化中に発酵
培地に徐々に導入する、特許請求の範囲第１項の製法。[Scope of Claims] 1. A method for producing L-aspartic acid from a fumaric acid-containing medium, in which the PO7111 strain (Feikoken Bacterial Serial No. 2269 strain) belonging to the genus Pseuzomonas is grown under aerobic conditions in the presence of a carbon source and phosphorus. a nitrogen source (preferably selected from urea and ammonia) and trace elements to obtain a fermented medium rich in aminotransferases: introducing fumaric acid into the fermented medium; carrying out the biological conversion at a pH of 6 to 12, preferably 8.5 to 10, without aeration during the required time,
carried out at a temperature of 30-60°C, preferably 55-57°C, preferably for 15-20 hours; and then extracting the L-aspartic acid formed in the biological conversion; Scientific conversion involves microorganisms in the above-mentioned medium.
The method is preferably carried out after 2 to 16 hours of growth. 2. The nutrient medium contains (a) 15 to 60 g of total sugar/
1, preferably 35 to 40 g/l of molasses: (b) 1 to 4 g/l of phosphoric acid in terms of phosphoric acid, or inorganic phosphates: (c) 0.1 to 1 g in terms of sulfate. /l of magnesium: and (d) has a composition consisting of 0 to 10 ppm of trace elements, and its pH is adjusted to 7 to 8.5.
The manufacturing method according to claim 1. 3. Process according to claim 1, in which the fumaric acid to be converted is gradually introduced into the fermentation medium during the biological conversion.