JPS5821403A - 低ピルヴウ−ト含量キサンタン及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は低ピ、ルヴ工−ト含量を有するキサントモナス
（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　）属のいろいろな種から得
られるバイオポリマーであるキサンタンの製造方法に関
する。

キサンタン、特にキサントモナス・カンへストリス（、
ＸａｎｔＭｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　）菌
株から製造されるガムの構造は、ジャンソン（Ｊａｎｓ
ｓｏｎ　）等によってβ（１−４）ｆ−結合したグルコ
ース骨格よりなりその互換性残渣が２＝１の比率のマン
ノース及びグルクロン酸よりなるトリサツカライドの側
鎖で置換されていることが提案されたＣ　Ｃａｒｂｏｈ
ｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ　４５．’　２７５−２
８２．　（１９７５）　）。これらの側鎖は末端にＤ−
マンノース残基を有し９．その一部はピルビン酸で置換
されて。

４．６−○−（１−カルボキシエチリデン）−Ｄ−マン
ノースを形成する。その他いくつかのキサントモナス（
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　）種は置換基ピルビン酸を１
重量係より長門含有するグ！しコース、マンノース及び
グルクロン酸よりなるエキソポリサッカライド類を生成
することが示された（　Ｏｒ、ｅｎｔａｓ　ｅｔ　ａｌ
　、　　Ｃａｎ　。

Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　９．　４２７’、　　４
３０．　（１９６３））。

キサンタン中のピルビン酸で置換されているＤ−マンノ
シルの割合は変化し得るものであり２通常２゜５〜５．
０重量係の範囲にある、ことが認識されている。総括的
な研究においキ。

カドマス（Ｃａｄｍｕｓ　）等は培地組成キサントモナ
ス・カンペストリス（Ｘ、　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　）
の菌株及び培養温度が全てポリマーのピルビン酸含量に
影響を及ぼすことを見出した （　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｂｉｏｅｎｇ、２０　、
　１００３〜１００１４．１９７８）。１．３　％のピ
ルビン酸含量が得られたものの最小値である。

英国特許出願第ＧＢ２００８　＋５０ＯＡ（出願人Ｐｆ
ｉｚｅｒ　Ｉｎｃ、　）はピルビン酸エステルのないキ
サンタンガムの製法を記載する。これらのガムはキサン
トモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　）の新しい菌株即
ちキサントモナス；カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏ
ｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　）　ＡＴ　ＣＣ！＋１
３１りによって製造されている。

キサンタンの相当に興味ある一つの用途は。

部分的に減損した油田からの油置換用の水添加剤として
である。この技術において、最初の加圧オイルが回収さ
れた後の油含有岩の細孔内になお存在する油は岩累層を
水びたしにして水で置換される。この水はその置換特性
を改良するために、ポリアクリルアミド或いはキサンタ
ンのような高分子水溶性物質を添加することにより、よ
り粘−稠にされる。Ｇｉｒ２００８６００Ａによれば、
完全（ニピルビン酸エステルのな、いキサンタンは油含
有岩の細孔の目詰りを引き起こす析出を行う傾向が少な
いので、浸水方法において有利であるということである
。しかしながら、　　（）Ｂ　２００８６０ＯＡのピル
ビン酸エステルのないキサンタンは７０℃において見か
け粘度に鋭い減少を示す。

上述の如く、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
　）の通常の菌株は通常の培養条件下において。

１係を越えるビルヴ工−ト含量を有するキサンタンを生
成マる。確かに１食料用途については、キサンタンが少
なくとも１．５係のビルヴ工−ト含量を有することが要
求され、従って、工業的キサレタン製造方法は比較的高
いピルヴ工−ト含量を有するキサンタンの製造に集中し
ている。

本発明者等は、牛サントモナス・カンペストリＸ　（’
Ｘ、　Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　）を連＼続培養において
成る種の条件下において培養することにより、ビルヴエ
ート含量・が１係未満を有するキサンタンガムが製造さ
れることを見出した。

場合によっては、約０．１係即ち殆んどＤのビルヴ工−
ト含量カミ、この方法によって得ることができる。本発
明者等は、ビルヴ工−ト含量のコントロールが多くの要
因に関連シ、その全てが得られるべき低ピルヴ工−ト製
品に対して適切でなけ武ばならないことを見出した。

本発明によれば、１．０重量係未満のビルヴ工−ト含量
を有するキサンタンの製法が提供され、同法は栄養源と
して窒素、イオウ、炭素、カリウム、リン、マグネシウ
ム、カルシウム及び任意成分として鉄のみを含み、実質
的にコバルト、銅、マ・ンガン、亜鉛及びホウ素は含ま
ない培地であって、更に、複合有機物質を含む化学的に
規定された単純な塩類培地中においてキサントモナス（
、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　）属のキサンタン製造菌株
を連続的に採用して。

全析出可能物質濃度（ＴＰＭ）が少なくとも１５９１”
’Ｃ即ち、４４チ転換効率より大）及びキサンタン対細
胞重量比が少なくとも４：１となるまで培養した後生成
ゞしたキサンタンを培地から単離することを特徴とする
。

前興の如く、連続発酵に用いられる培地は。

単純塩培地即ちＮ、Ｓ、Ｐ、に０．Ｃａ、及びＦｅの・
源として公知式の無機塩類及び炭素源として公知式の炭
水化物を含有するものである。この基礎培、地中には窒
素源として作用する複合有機物質も含まれる。この複合
窒素源としては、′例えば、゛酵母エキス或いは大豆粉
のようなマメ科製品が含まれる。酵母エキスが好ましい
。この複合窒素源は、培地中においてリットル当り０．
０１〜ｏ、　ｏ　ｓ　ｇの利用可能Ｎの量にて、好まし
くは０．０２９７７３の割合で添加される。低塩分酵母
エキスを用いた場合には、０．０２ｇ利用可能Ｎ　／　
７は約０．・・２ｇ酵母エキス／ｌの量に相当する。こ
の複合窒素源は、培地からの微量元素の不存在と共に本
発明の必須的な特徴である。正常な単純塩の化学的に規
定された培地を変性して微量成分を含まないようにする
と、細胞育成が相当に抑制され、生成されるポリサッカ
ライドがむしろ低いピルビン酸エステル含量を有するこ
とが見出された。その様な培地の使用はキサンタンの収
量が余りにも低いであろうから、工業的には明らかに有
用でないようである。しかしながら１本発明者等は、微
量元素（恐らくは鉄を例外として）が排除されても培地
に酵母エキスのような複合源に富む場合（＝は生成物は
極めて低いピルヴ工−ト物質であり。

且つ良好な収量で生成することが見出された。

即ち１例えばデイステイラーズ（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ
）。

社から販売されている低塩酵母エキスはＺｎ６０　ｐｐ
ｍ、　　Ｃｕ　１０ｐｐｍ、　Ｍｎ　１５ｐｐｍ、　Ｃ
ｏ５ｐｐｒｒ４Ｆｅ１ＱＯｐｐｍを含有する。培地中２
００　ｐｐｍの濃度においては、従って酵母エキスはＺ
ｎ。

Ｍｎ　、　Ｃｏ及びｃｕは０．０１２　ｐｐｍ以下を供
給するにすぎず、鉄は０．０２　ｐｐｍ以下を供給する
（＝すぎない。これに対して通常の培地は００５〜０．
５’　ｐｐｍのＺｎ　、　Ｍｎ　、　Ｃｏ及びＣｕを含
有し。

５〜１０　ｐｐｍの　Ｆｅを含有する。

−炭水化物源はシロップの形状であってもよい単糖類が
便利であり、−それは又、高級サツカライド類を含有し
てもよい。例えば、デン粉の酸及び／又は酵素分解より
得られたグルコースシロップが挙げられる。

全てのこれらの要件は必須であり、これより如何に枳離
しても、Ｘ、カンペストリス（Ｘ。

ｃａｍｐｅｓｔ、ｒｉｓ　）の特殊な菌株２例えばＡＴ
ＣＣ５１３１３が使われない限り、必要以上のビルヴ工
−ト含量を有するキサンタンの製造に導く傾、向を有す
る。本明細書中で一般的にい、うピルヴエート含量はＦ
、、Ｃ，Ｃ０，７−ドケミカルズコーデツクス（Ｆ、Ｃ
，Ｃ，ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃｏｄ−ｅｘ　、
第二版、　ＮａｔｉδｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５
ｃｉｅｎｃｅｓ　、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ１９
７１８５６頁）の方法により測定され、これは現在まで
のところ殆んど全ての現存するキサンタン技術（；おい
て用いられているものである。

典型的には０．２〜０．４　％　ｗ　／　ｖのポリサッ
カライドを含有する培養液酸−いはキサンタン溶液がｊ
　Ｎ　ＨＣｌ中において３時間加水分解すも２４のアリ
コートを取出し、１−の２，４−ジニトロフェニルヒド
ラジン試薬（０，５％　ｗ／ｖ２ＮＨＣｌ溶液）と５分
間混合する。この反応液を５艷の酢酸エチルで抽出し、
水層を廃棄する。酢酸エチル抽出液を５−ずつの１０％
Ｖ７炭酸ナトリウム水溶液で三回抽出し９次いで抽出液
を合わせて追加の１０　％　ｗ／ｖ炭酸ナトリウム水溶
液で２５−に稀釈する。この溶液の光学密度を次いで３
７５ｎｍで測定し。

ピルビン酸エステル含量を予め知られた標準試料に対比
して決定する。この方法を用いて本発明の方法のｉ品は
１俤未満のピルヴ工−ト量、典型的には０．２５〜０．
６５　％のビルヴ工−ト量を有する。しかしながら、ビ
ルヴ工−トには別の検定法、即ちＵ　、　Ｓ　、　Ｄ　
、　Ａ　、　ＡＲ８−ＮＣ，−５１，１９７６年１１月
に記載の方法もある。この検定法はより信頼性があ゛す
、より正確であると思われているがＦＣＣ試験よりも低
い数値を与える。典型的には１本発明の方法の製品はこ
の酵素検定法によれば０．０８〜約０．２５１のビルヴ
工−トを含有することが判明した。

本発明による条件を用いることにより、低ピルヴエート
含量のキサンタンが得られ、それは又前記英国出願２０
０８６０．ＯＡの方法によりＸ、カンペストリス（Ｃａ
ｍｐｅｓｔｒｉｓ　）　ＡＴＣＣ３１３１３号により得
られたものと同一用途において有・用とされる粘度特性
を有するものである。

本発明により得られる低ピルヴエートキサンタンは培地
から常法により単離することができる。通常、このポリ
サッカライドはイソプロパツールのような有機溶媒を添
加して析出される。必要に応じて１例えば酸又はアルカ
リ及び／又は酵素で処理することにより。

このポリサッカライドを更Ｃ；精製及び清澄化すること
もできる。

Ｔ、ＰｏＭ、濃度が少なくとも１−５ｇ１−１であり、
ポリマ一対細胞比率が少なくとも４：１であるべきとい
う要件は、この技術分野において公知の方法により達成
することが可能である。即ち、栄養濃度が十分に高い（
但し。

正確な量は使用される床置の種類に応じて異る）という
ことを確実にすることによって達成することができる。

代表例として、窒素−制限発酵においては、少なくとも
０．２ｇの窒素量が必要である。好ましくは、少な′く
とも１５９１３−１　　の実際のキサンタン量を与える
Ｔ、Ｐ、Ｍ、量が達成される。

連続発酵の速度は定常条件下において必然的に培地中の
栄養の一つの濃度によって制限される。この制限栄養は
１例えば窒素或いはイオウであることもあり、或いは培
地にはない微量元素のこともある。好ましい培地は。

例えば４０〜７０９／ｌのグルコース（シロップとして
）、２〜４９／ｌのアンモニウム塩９例えば硫酸アンモ
ニウム或いはリン酸水素ニアンモニウム、約０．０２〜
０．１９／ｌのマグネシウム化合物、約０．２５〜０．
７５９／ｌのカリウム塩−〇、０５９／１１までの鉄塩
及び０．１〜０．・５９／ｌの低塩分酵母エキスを脱−
イオン水中に含有する。

酸素添加も又十分に行われるべきであり。

例えばファーメンタ一槽の効率のよい攪拌と共に良好な
通気を与えることによって行われるべきである。

以下実施例により本発明を更に説明する。

実施例　１ 手サントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔ、ｈｏｍｏ
ｎａｓｃａｍｐｅｒｉｔｒｉｓ　）　（ＡＴＣＣ１３９
５１（微生物受託番号微工研菌寄第４９１４号）より得
られた実験室ストック〕を連続的に５１容量の攪拌され
たタンクファーメンタ−中で生育した。

発酵パラメーターはｐＨ７，Ｏを温度３０℃１羽根車速
度１０００　ｒｅｖ、　ｍｉｎ”、羽根車直径８、４　
ｃｍ　（翼が回転方向から傾斜した湾曲翼羽根車）、空
気流１．４７　ｌ、　ｍ１ｎ−’、であった。

この培地の組成は表１に示されている。グルコース（全
容積の１１５）を塩成分（全容積の４１５）、とは別に
１２１℃及び１バールの圧力で１５分間殺菌し、冷却し
て溶液を混合してｐＨ６，８の完全培地を得た。運転容
量は堰により２１に設定した。攪拌は６．０ＣＭ離れた
二つの湾曲翼を有する羽根車を用いて行った。一番下の
羽根車は羽根車軸の最下点に配置した。

空気は最下部の羽根車の下から導入した。混合は培養容
器の周囲に縦方向（＝配置した四枚の邪魔板によって補
助された。ファーメンタ−は　ｐ）（をＺＯに保つため
にＩ　Ｍ　ＮａＯＨを計量する自動　ｐＨコントロール
を付属していた。

このファーメンタ−及び添加ラインは培地に添加前に常
法により殺菌した。

培養容器内の培地中に振盪フラスコ中のＭＹＧＰ培養液
（ｆ！／ｌ　：麦芽エキス３．０；酵母エキス３．０；
グルコース１０．０；ペプトン５、０　；　ｐＨ未調整
）において生育した培養液１００−を添加した。培養液
はバッチ法により、記載した条件下において３６時間生
育させた。次いで、連続的培地供給がり、　０５　ｈ−
１（１００ｔｄ／ｂ　）の稀釈速度で行われた＝培養液
は（ａ）　ｐＨ；　（ｂ）酸素分析器及び赤外二酸化炭
素分析器を用いた０２の吸収及びＣｏ２の発生の“測炬
；　（Ｃ＞全イソプロパツール析出可能物質（ＴＰＭ）
−（培養液対イソプロパツール混合物（１：　２　ｗ／
ｖ　）からの析出物を濾過により集め、赤外ランプ下で
乾燥）　；　（ｄ）　５４０　ｎｍにおける細胞密度の
光学的測定、につぃて検査を行った。

培養液は「定常状態」に到達させた。全析出可能物質（
キサンタンガム）のビルヴエート含量を米国農務省公報
ＡＲ３−ＮＣ−５１。

１９７６年１１月の記載の酵素的方法により分析した。

キサンタンガムの１チ蒸留水溶液及び１チ塩化ナトリウ
ム溶液中の゛粘度をコントラベスレオマット（Ｃｏｎｔ
ｒａｖｅｓ　Ｒｈｅｏｍａｔ　）３０円錐平板粘度計で
測定した。

表２に示す如＜ｔＯ，６％のビルヴ工−ト含・量を有す
るキサンタンガムが得られた。

、実施例　２ キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎ
ａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　）　（実施例１の菌株）を
空気流速を２．０１　ｍ１ｎ−’、及び羽根車速度５５
０．ｒｅｖ。

ｍｉｎ”、　　２個のＭｅ羽根車を１４３ｃＩＩＬ直径
とし。

１０ｃＩｒＬ離し各々６個の湾曲した翼を有するものを
用いた他は実施例１と同様の条件下に培養を行った。使
用され光培地はイオウ制限であり、窒素はアンモニウム
として供給されたが２表１に示されている。得られた生
成物の特性は表２にまとめて示されている。

実施例゛　６ 運転容積を２．５１　、空気流速を４．ＯＡ’ｍ期−・
。

羽根車速度を６５　”Ｏｒｅｖ、ｍ１ｎ−１及び稀釈速
度を０．０４６　ｈ−’とした他は実施例２と同様にし
てキサントモナス・カンペストリス ＣＸａｎｔ￥１ｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　
）　（実施例１の菌株）を連続的Ｃ二培養した。゛使用
した培地は窒素制限をするように設定された（表１）が
。

取り出された培養液中には少量の窒素が検知され、制限
、要因が恐らくは窒素よりも微量元素であることを示し
た。定常状態は約２３０時間達成された。これらの定常
状態条件下で得られたキサンタンガムのピルビン酸エス
テル含量は０．０９±０．０２　、（ｗ／ｗ　）　（酵
素法）であった。

実施例　４ 実施例１と同様にしてキサントモナス・カンペストリス
（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｓｓｔｒｉｓ　）
（実施例１の菌株）を連続的に培養した。空気流速は１
．７５１１　ｍ１ｎ−’　、　’羽根車速度は１２００
　ｒｅｖ、ｍｉｎ″′１．稀釈速度はｏ、ｏｓｓｈ−’
であった。培地０表１）は実施例３と同一であった。定
常状態条件下において得られしキサンタンガムのビルヴ
エート含量は０．３係（ｗ／ｗ　）であった。

比較例１〜４ キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎ
ａｓｃａｍｐｅｒｉｔ、ｒｉｓ　）　（実施例の菌株）
を実施例１で説明したのと同様にして培養した。表１に
示される培地は微量元素と酵母エキスを含有せず（比較
例１）、微量元素は含有するが酵母エキスは含有せず（
比較例２及び４）或いは微量元素久び酵母エキスを含有
するもの（比較例３）であった。比較例２においては。

、微量元素の量が比較例４のそれに比べて５０係減少さ
れた。結果をまとめて表２に示す。

本発明Ａ二より得られた製品をより高いビルヴエート生
成物と比較すると共に同様なりをを、することがわかる
。

本発明によつ１調製される低ピルヴ工−ト物質の特徴は
、しかしながら、その明らかな高温（一対する安定性で
ある。その溶液を数時間還流させた場合も、粘度の著し
い低下は見られない。この性質は油含有貯槽における温
度はしばしば１００℃より高いことを想起するとき重要
である。第１図は実施例４．の生成物、比較例４の生成
物及び二つの市販のキサンタンガム、ロドポール（Ｒｈ
ｏｄｏｐｏｌ　）　（Ｔ　、　Ｍ　）（Ｒｈｏｎｅ　Ｐ
ｏｕｌｅｎｃ　）及びケルトロール（Ｋｅｌｔｒｏｌ　
）（ＴｏＭ）　（Ｋｅｌｃｏ　Ｄｉｖ、　ｏｆ　Ｍｅｒ
ｃｋ　＆　Ｃｏ、、　Ｉｎｃ、）について行った各種還
流時間後の粘度の比較である。この安定性が単に溶液中
の微量元素の不存在によるものでないことを示すために
。

全てが生成物に添加された場合に通常の培地と同等な生
成物＋微量元素を含有する溶液の曲線も掲示した。曲線
（５）の生成物の熱処理は１２５℃において２分間行っ
た。

凰　４、図面の簡単な説明 第１図は各種のへ品の還流時間と粘度の関膠　係を示す
グラフである。

出　願　人　　：　　ケルコ　バイオスペシャルティズ
リミテツド 還流時間ＩＨＲ８１ ■７施例４　　　　　　　■比較例４ Ｃ熱処理なし） 手続補正書 昭和５７年８月１５日 特許庁長官若杉和夫　殿 １、事件の表示昭和５７年　特許願第８５６９５　　号
３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ヘシ　　　ケルコ　バイオスペシャルテイズ　リミテッ
ド４、代理人 ５、補正の対象　（ｌ）「願　書」 （２）「委任状」 （３１「明細書」 （１）　　別紙の通り、委任状及翻訳文各１通を提出致
します。

（２１別紙の通り、出願時提出の願書第４項出願人の欄
の代表者名を記載した訂正願書１通を提出致します。

（３）別紙の通り、明細書１通を提出致します。

上申：出願当初手書せる明細書を提出致しましたが、こ
の度タイプ印、書せる明細書と差し替えて頂きたく上申
致します。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. １．０．１〜１重量係のビルヴ工−ト（ＦＣＣ法）を含
   んでなることを特徴とする低ビルヴ工−トキサンタンガ
   ム。
2. ２．０．３〜０．６重量係のビルヴ工−トを含有してな
   る特許請求の範囲第１項記載のキサンタンガム。 ６、約０．１重量係のビルヴエートを含有してなる特許
   請求の範囲第１項記載のキサンタンガム。 ４、下記成分を含有してなる培養液中でキサントモナス
   （Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　’）属の生物を好気的に発
   酵させることを特徴とする低ピルヴ工−トキサンタンガ
   ムの製造方法： １）窒素源、イオウ源、カルシウム源、及び（任意成分
   とじて）鉄源よりなる化学的に規定される単純な塩類の
   培地であり。 該単純な塩類培地が実質的にコバルト。 銅、マンガン、亜鉛及びホウ素を含まない。 ２）資化性炭素源、及び ３）窒素源である複合有機物質。 ５、連続方法であり、４４％より大きい転換効率を有し
   、且つキサンタンガム対細胞の重量比率が少なくとも４
   ：１を有する培養液を生成する特許請求の範囲第４項記
   載の　゛・方法。 ６、複合有機物質が酵母エキス或いはマメ科製品である
   特許請求の範囲第５項記載の方法。 ２　複合有機物質が培地中に０．０１２　ｐｐｍ以下の
   、Ｚｎ、　Ｍｎ、　ＣＯ及びＣｕ及び０．０２　ｐｐｍ
   Ｌ７１ｎＦ　ｅを培地に供給するにすぎない特許請求の
   範囲第６１項記載の方′法。 ８、生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘ、　ｅ
   ａｍｐｅｓ、ｔｒｉ８　）である特許請求の範囲第４項
   記載の方法。　　゛ ９　微星物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘ、　
   Ｃａｍｐｅｓｔｒｆｓ’、）　Ａ　Ｔ　ＣＣ１ｇ　９５
   １（、微工研菌寄”！１１ｇ４９’１．４号）の同定特
   性を有する特許請求の範囲ｉ８項記載の方法。 １０、′更に、低゛ピルヴエートキサンタンガムを単離
   した１該ガムを酸又はアルカリ及び／又は酵素で精製及
   び清澄化する特許請求の範囲第４項記載の゛方法。 １１、′油含有地下累層がら原油を回収する方法におい
   て、該累層中に一個以上の注入井戸を通して有効量の低
   ピルヴエートキサンタンガムを含有する移動度コントロ
   ール溶液を注入することを特徴とする方法。