DE3751066T2

DE3751066T2 - Herstellungsverfahren von zuckernukleotiden mittels rekombinantverfahrens.

Info

Publication number: DE3751066T2
Application number: DE3751066T
Authority: DE
Inventors: Michael Betlach; Daniel Doherty; Rebecca Vanderslice
Original assignee: Getty Scientific Development Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1986-03-24
Filing date: 1987-03-24
Publication date: 1995-06-08
Anticipated expiration: 2007-03-25
Also published as: DE3751066D1; NO874879D0; EP0380470B1; ATE118548T1; NO179875C; US5824472A; WO1987005937A1; EP0380470A1; JP3074629B2; NO874879L; NO179875B; CA1340411C; JP2000032982A; EP0380470A4

Description

Hintergrund der Erfindund

Die vorliegende Erfindung betrifft durch rekombinante DNA verinittelte Verfahren zur Herstellung verschiedener Zuckernukleotide, wobei die Zuckeranteile nachfolgend in mikrobiell hergestellte Polysaccharide - ebenso unter Verwendung von durch rekombinate DNA vermittelte Verfahren - eingebaut werden können.
Es ist seit langem bekannt gewesen, daß gewisse Mikroorganismen verschiedene industriell verwendbare Polysaccharide herstellen können. Als Voraussetzung für die Polysaccharid-Biosynthese inüssen diese Mikroorganismen eine Quelle der Zuckernukleotide besitzen, um die Polysaccharide konstruieren zu können. Im Fall von Xanthomonas campestris, einem Mikroorganismus, der Xanthan-Gummi herstellen kann, ist gefunden worden, daß die Zuckernukleotide UDP-Glucose, GDP-Mannose und UDP-Glucuronsäure jeweils direkte Vorläufermoleküle in dein biosynthetischen Stoffwechselweg sind. Folglich haben die Erfinder bei der Aufklärung des Stoffwechselwegs für die xanthan-Biosynthese die DNA-Sequenzen, die für die Zuckernukleotidsynthese in X. campestris verantwortlich sind, entdeckt und durch rekombinate DNA vermittelte Verfahren zur Herstellung dieser Zuckernukleotide in sowohl Xanthomonas sp. und alternativen Wirten entwickelt.
Die Entwicklung dieser Verfahren zum Steigern der Zuckernukleotidproduktion in Xanthomonas sp., welcher auf natürliche Weise Xanthan-Gummi herstellen kann, sollte eine gesteigerte Produktion dieses Polysaccharids durch diese Organismen ermöglichen. Es ist gefunden worden, daß, obwohl es nachweisbare Mengen der Zuckernukleotid-Vorläufermoleküle in diesen Organismen gibt, diese Mengen gering sind. Es ist auch festgestellt worden, daß in Xanthomonas-Organismen, die eine Mutation in dem Teil des biosynthetischen Stoffwechselwegs besitzen, der für den Polysaccharidzusammenbau verantwortlich ist, die intrazellulären Mengen dieser Zuckernukleotid-Vorläufermoleküle 2- bis 7-fach ansteigen. Folglich wird geglaubt, daß ein rnengenbegrenzender Schritt bei der natürlichen Xanthan-Produktion die Konzentration der Zuckernukleotid-Vorläufermoleküle sein könnte, und daß die intrazelluläre Zuckernukleotid-Konzentration durch Einführen zusätzlicher DNA-Sequenzen, die die Zuckernukleotid-Produktion lenken können, gesteigert werden kann.
Es ist auch gefunden worden, daß gewisse Mikroorganismen, die als alternative Wirte für die Verwendung in durch rekombinante DNA vermittelten Verfahren zur Herstellung von Xanthan-Gummi angesehen werden können, gewöhnlich entweder die benötigten Zuckernukleotid-Vorläufermoleküle nicht herstellen oder diese nicht in ausreichenden Mengen herstellen, um eine Xanthan-Produktion zu erlauben. In diesen Verfahren ist es daher notwendig, den alternativen Wirt zur Herstellung der benötigten Zuckernukleotid-Vorläufermoleküle zusätzlich zur Expression der Xanthan-Biosynthesegene zu induzieren. Die vorliegende Erfindung stellt zum Teil ein solches Verfahren zur Verfügung.
Das vorliegende Verfahren kann weiterhin dazu verwendet werden, um eine Zuckernukleotid-Produktion dann zu induzieren, wenn die Zuckermoleküle in andere Polysaccharide als Xanthan eingebaut werden sollen. Beispielsweise sind verschiedene weitere Gummen identifiziert worden, die veränderte Versionen von Xanthan sind, welche einige oder alle der vorliegenden Zuckernukleotide als biosynthetische Vorläufermoleküle benötigen. Diese Gummen umfassen den im US-Patent US-A- 4713449 von Vanderslice et al., das den Titel "Ein durch Xanthomonas hergestelltes Polysaccharidpolymer", trägt und am 6. August 1985 eingereicht wurde, beschriebene Polytrimer- Gummi.
Zusätzlich wird beansprucht, daß die hierin offenbarten durch rekombinante DNA vermittelte Verfahren zum Herstellen von Zuckernukleotiden für die Herstellung gewisser Polysaccharide verwendet werden können, die zum Teil als medizinische oder pharmazeutische Präparationen von Interesse sind. Zum Beispiel wird das Polysaccharid Colonsäure (colonic acid), das durch E. coli hergestellt wird, als ein für Impfungszwecke verwendbares, wirksames synthetisches Antigen betrachtet. Es wird geglaubt, daß die Produktion von Colonsäure durch die gesteigerte mikrobielle Produktion der Vorläufer-Zuckernukleotide initiiert oder verstärkt werden würde.
Das Einbringen der DNA-Sequenzen in andere mikrobielle Arten kann ebenso die durch solche Sequenzen gelenkte Produktion der Zuckernukleotide verstärken, da die normalen regulatorischen Mechanismen, die die Expression und Aktivität kontrollieren, in Verbindung mit fremder DNA oder fremden Enzymen nicht wirksam sein könnten. Weiterhin besitzen viele Antibiotika, z. B. die allgemeine Klasse der Makrolid-Antibiotika, die durch Streptomyces-Arten hergestellt werden, Zuckeranteile, die von Zuckernukleotid-Vorläufermolekülen abstammen. Die durch rekombinante DNA vermittelten Verfahren zum Herstellen der Zuckernukleotide könnten auf solche Organismen angewendet werden, wodurch die Verfügbarkeit der für die Biosynthese der Antibiotika essentiellen Vorläufermoleküle gesteigert wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur durch rekombinante DNA vermittelten Herstellung von Zuckernukleotiden bereitzustellen. Es wird beansprucht, daß diese Zuckernukleotide für die in vivo-Synthese verschiedener Polysaccharide, insbesondere für die Synthese von Xanthan und neuen Polysacchariden, die strukturell zu Xanthan verwandt sind und in WO-A-8705939 von Doherty et al. mit dem Titel "Familie auf Xanthan-basierender Polysaccharidpolymere einschließlich nicht-acetylierter und/oder nicht-pyruvylierter Gummi und acetylierter oder nicht-acetylierter Polytetramer-Gummi" ausführlicher beschrieben sind, verwendet werden, Nur komplementäre DNA eines UDP-Glucose- Enzyms ist in Fischel et al. Developmental Biol. Vol. 110, 1985, Seiten 369 bis 381, gezeigt.
Um die durch rekombinante DNA vermittelte Synthese dieser Zuckernukleotide zu erleichtern, ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Vektoren, die diese übertragbaren Sequenzen enthalten, bereitzustellen. Diese Vektoren können in den rekombinanten Systemen verwendet werden, um solche Mengen der Zuckernukleotide herzustellen, die ausreichend sind, um mikrobiell hergestellte Polysaccharide zu erzeugen.
Zusätzliche Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden zum Teil in der Beschreibung dargelegt werden oder können aus der Anwendung der Erfindung ersehen werden. Die Aufgaben und Vorteile können mittels der Anweisungen und Kombinationen, die insbesondere in den anhängenden Ansprüchen hervorgehoben werden, realisiert und erreicht werden.
Um die Aufgaben zu lösen und in Übereinstimmung mit den Zwecken der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Herstellung von Zuckernukleotiden dargestellt. Die Zuckeranteile solcher Zuckernukleotide können eingebaut werden.
Die übertragbaren DNA-Sequenzen können entweder synthetische Sequenzen oder Restriktionsfragmente ("natürliche" DNA-Sequenzen) sein. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die übertragbaren DNA-Sequenzen aus einer X. campestris-Bank isoliert und sind dazu fähig, wenn sie in einen alternativen Wirt überführt werden, die Herstellung wenigstens eines Zuckernukleotids zu lenken.
Zusätzlich wird, um die Aufgaben zu lösen und in Übereinstimmung mit den Zwecken der vorliegenden Erfindung, ein durch rekombinante DNA vermitteltes Verfahren offenbart, welches zu einer mikrobiellen Herstellung der Zuckernukleotide führt, die dazu verwendet werden können, um Xanthan- Gummi oder weitere Polysaccharide unter Verwendung der vorstehend erwähnten übertragbaren DNA-Sequenzen herzustellen. Dieses durch rekombinante DNA vermittelte Verfahren umfaßt:
a) Herstellen mindestens einer übertragbaren DNA-Sequenz, welche dazu fähig ist, einen alternativen Wirtsmikroorganismus dahingehend zu lenken, daß dieser mindestens ein Zuckernukleotid herstellt;
b) Klonieren der übertragbaren DNA-Sequenz in einen Vektor, welcher in einen Wirtsmikroorganismus transferiert und darin repliziert werden kann, wobei ein solcher Vektor Elemente für die Expression der übertragbaren DNA-Sequenz, die für die Biosynthese-Enzyme kodiert, enthält;
c) Transferieren des Vektors, welcher die übertragbare DNA- Sequenz enthält, in einen Wirtsmikroorganismus, welcher dazu fähig ist, die Biosynthese-Enzyme für die Zuckernukleotid-Synthese unter der Anweisung der übertragbaren DNA-Sequenz herzustellen;
d) Kultivieren des Wirtsmikroorganismus unter Bedingungen, welche für die Erhaltung des Vektors und die Synthese der Zuckernukleotide geeignet sind; und wahlweise
e) Gewinnen der Zuckernukleotide.
Um weiterhin die Aufgaben zu lösen und in weiterer Übereinstimmung mit den Zwecken der vorliegenden Erfindung, wird eine Serie von Plasmiden bereitgestellt, wobei jedes wenigstens eine der vorstehend diskutierten übertragbaren DNA-Sequenzen enthält. Insbesondere werden die Plasmide pAS7, pAS9 und pTS13 offenbart. Zusätzlich wird ein Mutanten-Stamm von X. campestris ,Stamm X872, bereitgestellt, welcher defizient für Phosphoglucomutase ist. Der Xanthomonas campestris-Stamm X872 ist am 21. März 1986 bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, unter der Hinterlegungsnummer 53471 hinterlegt worden. E. coli LE392(pAS9), welcher das Plasmid pAS9 trägt, E. coli LE392(pAS7), welcher das Plasmid pAS7 trägt und E. coli LE392(pTS13), welcher das Plasmid pTS13 trägt, sind am 21. Mai 1986 bei der ATCC unter den Hinterlegungsnummern 67050, 67048 bzw. 67047 hinterlegt worden.
Es ist so zu verstehen, daß sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung und die folgende genaue Beschreibung nur beispielhaft und erläuternd und nicht für die Erfindung, wie sie beansprucht wird, beschränkend sind. Die begleitenden Zeichnungen, welche in diese Beschreibung eingebracht sind und einen Teil davon ausmachen, stellen verschiedene erfindungsgemäße Äusführungsformeln dar und dienen zusammen mit der Beschreibung dazu, die erfindungsgemäßen Prinzipien zu erklären.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Die Figur 1 ist eine Darstellung des Biosynthesewegs für die Synthese von UDP-Glucose, UDP-Glucuronat und GDP-Mannose.
Die Figur 2 stellt die Trennung von UDP-Glucose, GDP-Mannose, UDP-Galakturonsäure und UDP-Glucuronsäure in einer Standardmischung durch Hochleistungsflüssigchromatographie dar. UDP-N-Acetylglucosamin diente als interner Standard. Ultraviolett-Spektren von 240 bis 300 nm sind für jede Verbindung gezeigt.
Die Figur 3 stellt ein Chromatogramm eines Zellextrakts vom Stamm X872, der repräsentativ für Mutanten ist, denen UDP- Glucose, UDP-Glucuronsäure und UDP-Galakturonsäure (Klasse 1) fehlt, dar. Die Spektren der Peaks, die in interessierenden Bereichen eluieren, sind zum Vergleich mit denjenigen der Figur 2 gezeigt.
Die Figur 4 stellt ein Chromatogramm eines Zellextrakts vom Stamm X869, der repräsentativ für Mutanten ist, denen GDP- Mannose (Klasse 2) fehlt, dar. Die Spektren der Peaks, die in den interessierenden Bereichen eluieren, sind zum Vergleich mit denjenigen in der Figur 2 gezeigt.
Die Figur 5 stellt ein Chromatogramm eines Zellextrakts vom Stamm X871, der repräsentativ für Mutanten ist, denen UDP- Glucuronsäure und UDP-Galakturonsäure (Klasse 3) fehlt, dar. Die Spektren der Peaks, die in den interessierenden Bereichen eluieren, sind zum Vergleich mit denjenigen in der Figur 2 gezeigt.
Die Figur 6 stellt ein Chromatogramm des Zellexrakts X866, welcher repräsentativ für Mutanten ist, denen UDP-Glucose, UDP-Mannose, UDP-Glucuronsäure und UDP-Galakturonsäure (Klasse 4) fehlt, dar. Die Spektren der Peaks, die in den interessierenden Bereichen eluieren, sind zum Vergleich mit denjenigen in der Figur 2 gezeigt.
Die Figur 7 zeigt die Schritte für die Konstruktion des Plasmids pTS13, welches den Defekt, der die Synthese von UDP-Glucose und UDP-Glucuronsäure in der Mutante X649 (Klasse 1) verhindert, komplementiert.
Die Figur 8 zeigt die Schritte für die Konstruktion des Plasmids pAS9, welches den Defekt, der die Synthese von UDP- Glucuronsäure in der Mutante X736 (Klasse 3) verhindert, komplementiert.
Die Figur 9 zeigt die Schritte für die Konstruktion des Plasmids pAS7, welches die Defekte, die die Synthese von UDP-Glucose, GDP-Mannose und UDP-Glucuronsäure in der Mutante X652 (Klasse 4) verhindert und die Defekte, die die Synthese von GDP-Mannose in den Mutanten X711 und X712 (Klasse 2) verhindern, komplementiert.
Die Figur 10 stellt ein Chromatogramm eines Zellextrakts von Paracoccus denitrificans dar, wobei das Vorhandensein von UDP-Glucose und GDP-Mannose, jedoch nicht UDP-Glucuronsäure gezeigt ist.
Die Figur 11 stellt Spektren dar, die die Identifizierung von UDP-Glucose und weiterer Uridin-enthaltender Verbindungen in dem in der Figur 10 gezeigten Zellextrakt von Paracoccus denitrificans verifizieren.
Die Figur 12 stellt Spektren dar, die die Identifizierung von GDP-Mannose in dem in der Figur 10 gezeigten Zellextrakt von Paracoccus denitrificans verifizieren und andeuten, daß spät-eluierende Verbindungen, die in der Figur beobachtet werden, Adenosin-enthaltende Verbindungen sind.

Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Synthese verschiedener Zuckernukleotide unter Verwendung von durch rekombinante DNA vermittelte Verfahren. Die folgende genaue Beschreibung verwendet beispielhaft eine Beschreibung der Herstellung von UDP-Glucose, GDP-Mannose und UDP-Glucuronsäure, die z. T. für die Herstellung von Xanthan-Gummi und Varianten davon verwendbar sind.
Die Zuckernukleotide UDP-Glucose, GDP-Mannose und UDP-Glucuronsäure sind direkte Vorläufermoleküle in dem Biosyntheseweg für Xanthan-Gummi. Die Zugabe aller dieser Verbindungen wird benötigt, um eine in vitro-Xanthanbiosynthese nachweisen zu können, wie beschrieben von Vanderslice et al. (s.o.), durch Bezugnahme hierin ausdrücklich eingeführt. Aufgrund der Spezifität der Zuckertransferasen können andere Zuckernukleotide, wie z. B. ADP-Glucose, nicht als Vorläufermoleküle für Xanthan dienen. Die Synthesewege der drei benötigten Zuckernukleotide in X. campestris werden in der Figur 1 dargestellt. Xanthomonas campestris besitzt keine nachweisbaren Konzentrationen an UDP-Galaktose, so daß die Glucose-1-phosphat-UDP-Galaktose-Uridyl-Transferase-Reaktion, die in anderen Bakterien, wie z. B. E. coli beobachtet wird, nicht stattfindet.
Mutanten-Stämme von X. campestris, die Xanthan-Gummi in vivo nicht herstellen können (Gum- Stämme), können auf der Grundlage der Fähigkeit der Zellysate, Xanthan in vitro zu synthetisieren, wenn diese mit UDP-Glucose, GDP-Mannose und UDP-Glucuronsäure ergänzt werden, in zwei Klassen unterteilt werden. Die Mutanten, die Xanthan in vitro nicht herstellen können, besitzen einen Defekt in der Xanthan-Biosynthesemaschinerie (Zuckertransferasen und Polymerase) . Diejenigen, die Xanthan in vitro herstellen können, wenn sie mit exogenen Substraten versorgt werden, sind defizient hinsichtlich der Fähigkeit, die benötigten Vorläufermoleküle in vivo herstellen zu können. Einige dieser zweiten Klasse von Mutanten umfassen solche, die einen Defekt beim Glucosetransport und -Metabolismus selbst besitzen, wobei die Rate der Xanthan- Synthese sehr gering ist. Andere, die nachstehend beschrieben werden, besitzen die normale Ausstattung an katabolischen Enzymen, wobei ihnen jedoch die Enzyme fehlen, die benötigt werden, um ein oder mehrere Zuckernukleotid(e) selbst zu synthetisieren.
Solche Mutanten sind durch Aufnehmen von Gum- Kolonien nach Transposon-Mutagenese von X. campestris und durch Analysieren der in vitro-Xanthanbiosynthese in der Gegenwart von zugefügter UDP-Glucose, GDP-Mannose und UDP-Glucuronsäure erhalten worden. Die spezifischen Zuckernukleotid-Defekte sind in vivo durch Extraktion der Zuckernukleotide und Analyse der Extrakte unter Verwendung von Hochleistungsflüssigchromatographieverfahren identifiziert worden. Vier Mutanten-Klassen sind identifiziert worden. Diese umfassen solche, die einen Defekt hinsichtlich der Synthese von UDP- Glucose, UDP-Glucuronsäure und weiteren Zuckernukleotiden, die von diesen Verbindungen abstammen, besitzen; 2) solche, die Defekte hinsichtlich der Synthese von GDP-Mannose und verwandten Verbindungen besitzen; 3) solche, die Defekte hinsichtlich der Synthese von UDP-Glucuronat und verwandten Verbindungen, jedoch nicht von UDP-Glucose besitzen; und 4) solche, die Defekte hinsichtlich der Synthese von UDP- Glucose, UDP-Glucuronsäure, GDP-Mannose und verwandten Verbindungen besitzen. Die Mutanten-Klasse 3 besitzt einen deutlichen Defekt hinsichtlich der UDP-Glucose-Dehydrogenase, da die Umwandlung von UDP-Glucose in UDP-Glucuronsäure ein Einzelschritt-Prozeß ist. Die anderen Mutanten-Klassen sind durch Analyse der in vitro-Enzymaktivitäten, die für die Zuckernukleotid-Biosynthese benötigt werden, charakterisiert worden.
Glucose-6-phosphat und Fructose-6-phosphat sind Schlüssel- Zwischenverbindungen im mikrobiellen Stoffwechsel. Der Stoffwechselweg von Fructose-6-phosphat zu UDP-N-Acetylglucosamin ist Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien gemeinsam. UDP-N-Acetylglucosamin ist ein essentielles Vorläufermolekül des Peptidoglycans in der Zellwand. Die zwei als 4 und 12 in der Figur 1 bezeichneten Pyrophosphorylasen sind die festgelegten Schritte in der Biosynthese von UDP- Glucose und GDP-Mannose; in anderen Organismen kann Glucose- 1-phosphat mit weiteren Nukleotidtriphosphaten zur Bildung anderer Zuckernukleotide, wie z. B. ADP-Glucose und TDP- Glucose reagieren. In dem UDP-Glucose-Weg ist das Gen für UDP-Glucose-Pyrophosphorylase, wie in Beispiel 4 beschrieben, isoliert worden. Mutationen in diesem Gen verhindern die Synthese von nicht nur UDP-Glucose sondern auch von anderen davon abstammenden Zuckernukleotiden, nämlich UDP- Glucuronsäure und UDP-Galakturonsäure. Das Gen für UDP- Glucose-Dehydrogenase (Enzym 5) ist ebenso isoliert worden, wie in Beispiel 5 dargestellt. Mutationen in diesem Gen verhindern die Synthese von UDP-Glucuronsäure und davon abstammenden Zuckernukleotiden, nämlich UDP-Galakturonsäure. Solche polaren Effekte unterbrechen folglich nicht nur die Xanthan-Biosynthese sondern auch die Lipopolysaccharid-Synthese in X. campestris dadurch, daß der Nachschub an Zuckernukleotiden für diesen Prozeß unterbrochen wird.
Zusätzlich sind Mutanten, die hinsichtlich der Synthese von GDP-Mannose defizient sind, gefunden worden. Diese Mutanten wachsen normal auf Mannose und besitzen daher das Enzym 2, Phosphomannose-Isomerase, ein Enzym, das gewöhnlich in Bakterien gefunden wird. Folglich müssen sie hinsichtlich der Enzyme 11 und/oder 12 defizient sein, wie in Beispiel 9 beschrieben ist. Die Kartierung durch Kreuzhybridisierung und Restriktionskarten deuten an, daß diese Mutationen an wenigstens 2 trennbaren Stellen innerhalb des X. campestris-Chromosoms auftreten. Ein Plasmid ist entwickelt worden, das die Synthese von GDP-Mannose fördert, wenn dieses in diese Mutanten eingebracht wird. Die Details dieses Plasmids sind in Beispiel 6 dargestellt. Zusätzlich komplementiert dieses Plasmid den Gum- Defekt einer Mutante, die weder Phosphoglucomutase (pgm) noch GDP-Mannose herstellen kann. Diese Mutation könnte in einem regulatorischen Gen sein, das die Expression von pgm kontrolliert, oder sie könnte in dem pgm- Strukturgen selbst sein.
Eine weitere Mutante, X872, die nur hinsichtlich der Phosphoglucomutase defekt ist, ist gefunden worden. Durch die hierin beschriebenen Verfahren kann ein Durchschnittsfachmann in Kenntnis des gegenwärtigen Stands der Technik ein Plasmid konstruieren, das eine Wildtyp-Kopie dieses Gens trägt.
Folglich sind von den Erfindern die Gene für die Synthese der unmittelbaren Xanthan-Vorläufermoleküle identifiziert worden. Diese Gene umfassen die Gene für Enzyme, die für die Synthese von UDP-Glucose, GDP-Mannose und UDP-Glucuronsäure benötigt werden. Plasmide, die Wildtyp-Kopien der für die Enzyme kodierenden Gene enthalten, sind aus einer genomischen Bank, die im Phagen Lambda konstruiert worden ist, erhalten. ³²P-markierte Plasmid-DNA rekombinanter Plasmide, die aus dem Vektor RSF1010 bestehen, welcher ein kloniertes DNA-Segment chromosomaler DNA von einer Transposon-induzierten Zuckernukleotid-defekten Mutante trägt, ist identifiziert worden. Das klonierte Fragment enthält das Transposon und flankierende chromosomale DNA. Solche Rekombinanten werden auf einfache Weise wie von Capage et al., s.o., isoliert. Drei Multicopy-Plasmide mit breitem Wirtsspektrum sind unter Verwendung von Standardverfahren, wie genauer in den nachstehenden Beispielen beschrieben, konstruiert worden. Diese Plasmide, pTS13, pAS7 und pAS9, enthalten DNA, die Stämme der Mutanten-Klassen 1, 2 bzw. 3, wie vorstehend beschrieben, komplementiert. Zusätzlich komplementiert das Plasmid pAS7 eine Mutante der Klasse 4. Keines dieser plasmide kreuzhybridisiert mit DNA, welche innerhalb der Region liegt oder diese flankiert, die die Xanthan-Biosynthesegene selbst enthält. Zwei verschiedene Mutanten-Loci sind durch Kreuzhybridisierung der Lambda-Phagen, Restriktionsfragmentanalyse und genetische Komplementation im Plasmid pAS7 identifiziert worden. Die Konstruktion der Plasmide und zusätzliche Information sind in den Figuren 7 bis 9 dar- bzw. bereitgestellt, die genauer in den nachstehenden Beispielen diskutiert werden.
Jedes Plasmid stellt, wenn es in Mutanten der geeigneten Komplementationsgruppe eingebracht wird, die Fähigkeit der Mutanten, Xanthan-Gummi zu produzieren, wieder her, was durch den Mucoid-Anschein der entstehenden Kolonien festgestellt wurde. Zusätzlich sind die Zuckernukleotide in Extrakten von den komplementierten Stämmen untersucht worden, um sicherzustellen, daß die Plasmide die fehlende biosynthetische Fähigkeit wieder hergestellt haben. Das Plasmid pTS13 trägt mit höchster Wahrscheinlichkeit das Gen für die UDP- Glucose-Pyrophosphorylase, da die Mutante X649 keine UDP- Glucose herstellen kann, jedoch Wildtyp-Mengen an Phosphoglucomutase besitzt. Weiterhin vermittelt das Plasmid pTS13, wenn dieses in von X649 abstammenden Mutanten eingebracht wird, die Fähigkeit, UDP-Glucose-Pyrophosphorylase (Beispiel 8) herzustellen. Der Stamm wächst normal auf Glucose, so daß er nicht hinsichtlich der Synthese von Glucose-6-phosphat, einer Schlüssel-Zwischenverbindung bei der Verwendung von Glucose zum Wachstum, defekt ist.
Wie vorstehend bemerkt, wird UDP-Glucose, GDP-Mannose und UDP-Glucuronsäure unbedingt benötigt, damit Bakterien Xanthan-Gummi synthetisieren können. Obwohl eine Modifizierung des Xanthans durch Acetylierung und Pyruvylierung, wozu Acetylcoenzym A bzw. Phosphoenolpyruvat als Vorläufermoleküle benötigt werden, die rheologischen Eigenschaften des Gummis beeinflussen, wird eine Acetylierung oder Pyruvylierung für dessen Biosynthese nicht benötigt. Zusätzlich sind beide dieser letztgenannten Vorläufermoleküle essentielle Bestandteile des bakteriellen Stoffwechsels. UDP-Glucose, GDP-Mannose und UDP-Glucuronsäure sind in gewissen Bakterien gewöhnliche Zuckernukleotide, jedoch besitzen nicht alle Bakterien alle davon oder besitzen diese in ausreichenden Mengen, damit eine Xanthan-Synthese ablaufen kann. Die Expression des Xanthan-Biosynthesewegs in anderen Organismen als X. campestris setzt voraus, daß die Zuckernukleotid-Vorläufermoleküle in solchen alternativen Wirten vorzugsweise in Raten, die zu einer Unterstützung einer ökonomischen produktion von Xanthan-Gummi ausreichend sind, synthetisiert werden. Mehrere alternative Wirte sind identifiziert worden, die nur wenig oder keine UDP-Glucuronsäure besitzen (siehe Beispiel 7). Das Einbringen von DNA, die das Gen für die UDP-Glucose-Dehydrogenase trägt, in einen solchen Stamm würde essentiell sein, um Xanthan-Synthese in einer hohen Rate zu erhalten.
Die Grundvoraussetzungen für eine Expression der Zuckernukleotid-Biosynthesegene in alternativen Wirten sind ähnlich zu denjenigen in X. campestris-Mutanten. Das benötigte Gen oder die benötigten Gene müssen in den Wirt in einer Weise eingebracht werden, daß sie, egal, ob durch Integration in das Chromosom oder Beibehaltung auf einem Plasmid, stabil beibehalten werden. Das Genkonstrukt muß so sein, daß der Wirt die entsprechende mRNA synthetisieren und diese in ein funktionelles Protein translatieren wird, welches vorzugsweise relativ stabil in dem neuen Wirt sein sollte. Zusätzlich muß der Wirt die Substrate und Cofaktoren, die für die Synthese der Zuckernukleotide selbst benötigt werden, bereitstellen können.
Es gibt sowohl Plasmide mit hoher als auch solche mit niedriger Kopienzahl, die ein breites Wirtsspektrum besitzen. Das Einbringen geeigneter Zuckernukleotid-Biosynthesegene auf Plasmiden ist bereits durchgeführt worden. Transformation oder Konjugation kann verwendet werden, um solche Plasmide in alternative Wirte in einer Weise, die ähnlich zu derjenigen ist, durch die die Plasmide von E. coli in X. campestris-Mutantenstämme überführt wurden, einzuführen. Diese Plasmide mit breitem Wirtsspektrum werden gewöhnlich Gram-negative Bakterien infizieren. Es gibt Shuttle-Vektoren, durch die die X. campestris-Gene, wenn dies gewünscht wird, in Gram-positive Bakterien überführt werden können. Das Einbringen der Plasmide und die Beibehaltung können durch Standardverfahren verifiziert werden.
Die Expression der Gene in alternativen Wirten kann auf mehrere Art und Weisen überwacht werden: die von dem Gen transkribierte mRNA kann durch Hybridisierung nachgewiesen werden; das Protein selbst kann durch Immunoassay oder einen funktionellen Assay nachgewiesen werden; und das vorher fehlende Zuckernukleotid kann durch etablierte chromatographische Verfahren identifiziert werden. Die Analyse durch eine oder mehrere dieser Techniken, wie benötigt, sollte Anpassungen in dem Genkonstrukt erlauben, um die Expression zu optimieren.
Die intrazelluläre Umgebung alternativer Wirte wird wahrscheinlich ähnlich zu derjenigen von X. campestris sein, insbesondere wenn ähnliche äußere Umweltbedingungen beibehalten werden, wie z. B. pH und Temperatur. Es ist aus in vivo-Untersuchungen mit X. campestris bekannt, daß die Xanthan-Biosynthese über einen breiten Temperaturbereich, d. h. 12º bis 37ºC, stattfindet, obwohl die Rate zwischen 27º und 30ºC maximal ist. Die Enzyme, die für die Synthese der Zuckernukleotid-Vorläufermoleküle verantwortlich sind, müssen innerhalb dieses Bereichs natürlich funktionell sein.
Anfängliche Analysen würden bei 27º bis 30ºC durchgeführt werden.
Es ist klar, daß eine breite Anwendung der erfindungsgemäßen Lehren auf die Herstellung spezifischer Zuckernukleotide in verschiedenen Wirten innerhalb der Fähigkeiten eines Durchschnittsfachmanns mit der Kenntnis der hierin enthaltenen Lehren möglich ist. Folglich sind die folgenden Beispiele nur darstellend und beschränken nicht die Erfindung, wie sie beansprucht wird.

Beispiel 1

Dieses Beispiel diskutiert die spezifischen Zuckernukleotid-Defekte, die in verschiedenen X. campestris-Stämmen, welche Gum- in vivo sind, identifiziert wurden.
Die anfängliche Sammlung von Mutanten, die hinsichtlich der Zuckernukleotid-Synthese defekt sind, wurde von X. campestris-Stämmen erhalten, die nach Transposon-Mutagense, wie in Capage et al., s.o., beschrieben, in vivo kein Xanthan herstellen können. Mehrere Gum- Stämme konnten Xanthan in vitro herstellen, wenn diese mit den Zuckernukleotiden UDP- Glucose, GDP-Mannose und UDP-Glucuronsäure versorgt wurden. Diese Mutanten waren hinsichtlich der Zuckernukleotid-Synthese und nicht hinsichtlich der Biosynthese von Xanthan selbst defekt. Nachfolgend wurde gefunden, daß solche Mutanten empfindlich gegenüber dem Färbungsmittel Toluidinblau waren. Zusätzliche Zuckernukleotid-Mutanten wurden durch Screenen weiterer Gum- Stämme auf Toluidinblau-Sensitivität erhalten. Diese Stämme erwiesen sich als resistent gegenüber einigen virulenten Phagen, die Wildtyp-X. campestris und Gum- Mutanten, die hinsichtlich der Xanthan-Biosynthese selbst defekt sind, töteten.
Das folgende Verfahren wurde angewendet, um die spezifischen Zuckernukleotid-Defekte in Stämmen, die Gum+ in vitro, jedoch Gum- in vivo waren, zu identifizieren. Eine isolierte Kolonie von jedem Stamm wurde abgenommen und in 10ml YM-Kulturmedium (3g Hefeextrakt, 3g Malzextrakt und 5g Pepton pro Liter) mit 2% Glucose in einem 125ml-Erlenmeyerkolben eingeimpft. Die Kulturen wurden bei 30ºC, 250UpM für 24 Stunden oder bis sie trüb wurden inkubiert. Fünf Prozent Inocula wurden vom YM-Kulturmedium in modifiziertes PACE-Medium (5g KH&sub2;PO&sub4;, 5g K&sub2;HPO&sub4;, 0,2g MgSO&sub4; x 7H&sub2;O, 0,53g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,006g H&sub3;BO&sub3;, 0,006g ZnCl&sub2;, 0,003g FeCl&sub3; x 6H&sub2;O und 0,02g CaCl&sub2; pro Liter, pH 7,0) mit Glucose als Kohlenstoffquelle überführt und bei 30ºC für 24 Stunden wachsen gelassen. Die Kulturen wurden durch Zentrifugation geerntet, zweimal mit PACE-Salzen gewaschen und in einem Volumen an PACE resuspendiert, welches ausreichend war, um eine Absorption von 100 bei 600nm zu ergeben. Die Proben, 1,5ml, wurden in 50ml-Erlenmeyerkolben gegeben, die genügend Glucose enthielten, um die Konzentration auf 20mM zu bringen. Jede Probe wurde in einem 30ºC-Wasserbad bei 400UpM für 10 Minuten inkubiert, danach wurde 1ml entnommen und zu 0,1ml 11N Ameisensäure in einem Eppendorf-Zentrifugenröhrchen zugefügt. Das Röhrchen wurde verschlossen, die Inhalte für 5 Sekunden auf einem Vortex-Mixer gemischt, und danach wurde das Röhrchen in ein Trockeneis-Alkohol-Bad gestellt. Nachdem alle Proben verarbeitet worden waren, wurden die Röhrchen aus dem Trockeneis-Bad entnommen, bei Raumtemperatur aufgetaut und für 5 Minuten zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Die Überstände wurden in vorgekühlte 15ml konische Zentrifugenröhrchen eingefüllt und nochmals in einem Trockeneis-Alkohol-Bad eingefroren. Die gefrorenen Proben wurden in einen Gefriertrocknungsapparat gestellt und bis zur Trockenheit stehengelassen. Die Inhalte eines jeden Röhrchens wurden in 0,2ml HpLC-Puffer gelöst, der aus 40mM Phosphorsäure, eingestellt auf pH 6,5 mit Triethylamin (Aldrich> , bestand. Die Proben wurden durch 0,45um-Filter in Mikroproben-Fläschchen filtriert, danach durch Injektion auf eine 4,6mm x 250mm C18 Umkehrphasen-Ionenpaar-Säule, 40ºC Fließrate von 0,8ml pro Minute, analysiert. Die Zuckernukleotide wurden durch Vergleichen der Retentionszeiten mit denjenigen von Standardläufen unter denselben Bedingungen (Figur 2) und durch Untersuchen der Spektren der Verbindungen, die im interessierenden Bereich eluierten, identifiziert.
Vier Klassen von Zuckernukleotid-Mutanten wurden unter Verwendung dieses Verfahrens identifiziert:
(1) Mutanten, die unfähig sind, UDP-Glucose und UDP-Glucuronsäure zu synthetisieren;
(2) Mutanten, die unfähig sind, GDP-Mannose zu synthetisieren;
(3) Mutanten, die fähig sind, UDP-Glucose, jedoch unfähig sind, UDP-Glucuronsäure zu synthetisieren; und
(4) Mutanten, die unfähig sind, UDP-Glucose, GDP-Mannose und UDP-Glucuronsäure zu synthetisieren.
Repräsentative Chromatogramme und Spektren von Standards für jede Mutantenklasse sind in den Figuren 2 bis 6 gezeigt. Die Mutanten in den Klassen 1, 3 und 4 synthetisierten auch keine UDP-Galakturonsäure, ein X. campestris-Lipopolysaccharid-Vorläufermolekül. Auf der Grundlage dieser Daten muß X. campestris UDP-Galakturonsäure aus UDP-Glucuronsäure herstellen.
Extrakte von Wildtyp-Stämmen von X. campestris besaßen alle Zuckernukleotide, die für die Xanthan-Biosynthese benötigt werden. Gum- Mutanten, die hinsichtlich des Xanthan-Biosynthesewegs selbst defekt waren, besaßen höhere Konzentrationen an Vorläufer-Zuckernukleotiden als Wildtyp-Zellen, wie in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Relative Mengen an UDP-Glucose, GDP-Mannose und UDP-Glucuronsäure in Wildtyp-X. campestris und Mutanten, die hinsichtlich der Xanthan-Biosyntheseenzyme selbst defizient sind. UDP-Glucose GDP-Mannose UDP-Glucuronsäure X. campetris
Diese Daten zeigen, daß die Rate der Xanthan-Synthese in Wildtyp-Kulturen durch die Versorgung an Vorläufer-Zuckernukleotiden begrenzt sein kann.

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt die Phosphoglucomutase-Aktivität in Transposon-induzierten X. campestris-Mutanten, die hinsichtlich der Zuckernukleotid-Synthese defekt sind.
Cytoplasmatische und Membran-Fraktionen wurden von den Transposon-Mutanten, für die vorher nachgewiesen wurde, daß sie hinsichtlich der Zuckernukleotid-Synthese defekt sind, hergestellt. Extrakte von X. campestris S4-L, NRRL, B1459 wurden ebenso als positive Kontrollen hergestellt. Die Kulturen wurden von isolierten Kolonien auf Platten in 5ml YM- Kulturmedium mit 1% Glucose überführt und auf einem Röhrchenroller bis zur stationären Phase wachsen gelassen. Zwei 500ml-Kolben, enthaltend 100ml YT-Kulturmedium (8g Trypton, 5g Hefeextrakt und 5g NaCl pro Liter) mit 1% Glucose wurden mit 2ml der Kultur angeimpft und auf einen Schüttler bei 300UpM in einem 30ºC-Inkubator gestellt. Nach 24 Stunden wurden die Kulturen vereinigt und zentrifugiert. Die Zellpellets wurden zweimal in 100ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2, gewaschen und danach zu 20% Naßgewicht zu Volumen in 50mM MOPS-Puffer, pH 7,2, enthaltend 10mM MgCl&sub2;, resuspendiert. Dieses Verfahren wurde verwendet, um restliches Kulturmedium von den Zellen zu entfernen. Die suspendierten Zellen wurden durch zweimalige Passage durch eine French-Presszelle, die bei 15.000psi betrieben wurde, aufgebrochen. Die Lysate wurden mit DNAase behandelt, um die Viskosität zu vermindern, und danach bei 2500 x g zentrifugiert, um nicht-aufgebrochene Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Die Überstände wurden sorgfältig mit einer Pasteur-Pipette entfernt und danach durch Zentrifugation in einem Schwingbecherrotor bei einer durchschnittlichen Zentrifugalkraft von 130.000 x g in cytoplasmatische und Membran-Fraktionen aufgetrennt. Die die cytoplasmatischen Bestandteile enthaltenden Überstände wurden dekantiert und bei -70ºC eingefroren. Alle Membran-enthaltenden Pellets wurden in 1,0ml MOPS-MgCl&sub2;-Puffer resuspendiert und danach ebenfalls bei -70ºC eingefroren. Die Enzyme, die für die Zuckernukleotid-Synthese benötigt werden, werden normalerweise in den cytoplasmatischen Bestandteilen gefunden. Die Trennung der cytoplasmatischen Bestandteile von den Zellmembranen erleichtert die an eine Reduktion von NADP gekoppelten enzymatischen Assays. NADPH-Oxidase ist ein Membran-gebundenes Enzym und reoxidiert, wenn es nicht entfernt oder inaktiviert wird, schnell die reduzierten Pyridin-Nukleotide, deren Anhäufung verwendet wird, um die Reaktionen zu verfolgen.
Die proteinkonzentration in jedem cytoplasmatischen Extrakt wurde unter Verwendung des Verfahrens von Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951), durch Bezugnahme hierin ausdrücklich eingeführt, mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Die Aktivität der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase in jedem Extrakt wurde durch Verfolgen des Anstiegs der Absorption bei 340nm aufgrund der Anhäufung von NADPH, das während der Oxidation von Glucose-6-phosphat zu 6-Phosphogluconat produziert wird, gemessen. Dieses Enzym ist ein Schlüsselenzym im Stoffwechsel von Glucose durch X. camestris und diente als interne Kontrolle. Die Reaktionsbedingungen sind in einer Legende zu Tabelle 2 beschrieben.
Phosphoglucomutase, die Glucose-6-phosphat zu Glucose-1- phosphat, dem direkten Vorläufermolekül von UDP-Glucose, umwandelt, wurde ebenfalls in den cytoplasmatischen Fraktionen untersucht. Die Mutase-Aktivität ist reversibel, so daß Glucose-1-phosphat als Substrat verwendet wurde. Zusätzlich wurde von Sigma Chemical Co. bezogene, gereinigte Glucose-6- phosphat-Dehydrogenase im Überschuß zu der Reaktionsmischung zugefügt. Die Bildungsrate von NADPH ist ein Maß für die Rate, mit welcher Glucose-6-phosphat durch die in den Extrakten vorhandene Phosphoglucomutase gebildet wurde. Die Reaktionsbedingungen und Ergebnisse des Assays sind in der Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2 Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PD) - und Phosphoglucomutase(PGM)-Aktivität in cytoplasmatischen Extrakten der Transposon-induzierten Zuckernukleotid-Mutanten von X. camestris. Die Enzymaktivitäten sind als nmol/min/mg Protein ausgedrückt. Stamm UPDglc GDPman UDPglcA G6PDa PGMb
a Die Reaktion wurde durch Zufügen von 0,05ml cytoplasmatischer Fraktion, ungefähr 10mg/ml Protein, gestartet. Die Reaktionsmischung enthielt 40mM Tris HCl, pH 8,6, 5mM Glucose-6-phosphat, 1,6mM NADP und 15mM MgCl&sub2; in 1, 0ml Gesamtvolumen.
b Reaktionsbedingungen wie für G6PD, jedoch wurde Glucose- 1-phosphat anstelle von Glucose-6-phosphat verwendet. Die Reaktionsmischung enthielt weiterhin 1mM Dithiothreitol, 0, 2mM Glucose-1,6-diphosphat und ungefähr 10 Einheiten G6PD von Sigma Chemical Company.
c Hinterlegt unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 53471
Alle Extrakte wiesen signifikante Aktivitäten der Glucose-6- phosphat-Dehydrogenase in einem Bereich von 97 bis 268nmol/min/mg Protein auf. Die Phosphoglucomutase-Aktivität betrug 191nmol/min/mg Protein oder lag darüber in allen Extrakten, die ausgehend von Mutanten hergestellt wurden, die UDP-Glucose synthetisieren konnten. Extrakte von allen Mutanten, außer X649, die UDP-Glucose synthetisieren konnte, (X828, X652, X866 und X872) wiesen nur geringe oder keine Phosphoglucomutase-Aktivität auf. Ein solcher Defekt ist ausreichend, um die Synthese von UDP-Glucose zu verhindern.
Der Stamm X649 ist nicht zur Herstellung der UDP-Glucose- Zuckernukleotidfamilie fähig. Phänotypisch besitzt er Ähnlichkeiten zu der Tn903-Mutante, Stamm X872. Jedoch besitzt X649 normale Phosphoglucomutase-Aktivität, wohingegen der Stamm X872 hinsichtlich dieses Enzyms defekt ist. Der Stamm X649 muß hinsichtlich der UDP-Glucosepyrophophorylase an sich defekt sein.
Der Stamm X652 ist zur Herstellung der UDP-Glucose- und GDP- Mannose-Zuckernukleotidfamilie unfähig. Wie die Tn903-Mutanten X828 und X866, denen diese Zuckernukleotide fehlen, weist X652 nur eine geringe oder keine Phosphoglucomutase-Aktivität auf. Mutanten, die hinsichtlich der CDP-Mannose-Synthese allein (Stämme X657, X711, X712 und X869) defekt sind, weisen normale Phosphoglucomutase-Aktivität auf. Die Stämme X736, X826 und X87l sind zur Herstellung von UDP- Glucuronsäure unfähig. Sie besitzen ebenfalls normale Phosphoglucomutase-Aktivität.

Beispiel 3

Dieses Beispiel beschreibt das Verfahren zum Kartieren der Zuckernukleotid-Defekte in Tn10-induzierten Mutanten.
Plasmidproben wurden durch Klonieren von Tn10 plus flankierenden chromosomalen Sequenzen jeder Mutante für alle Tn10- induzierten Mutanten, die hinsichtlich des Zuckernukleotid-Stoffwechsels defekt sind, erhalten. Eine Lambda-Bank wurde getestet, um Lambda-Rekombinanten zu erhalten, die an jede Probe hybridisieren, jedoch Segmente der Wildtyp-DNA von X. campestris trugen. Diese Phagen wurden Plaque-gereinigt und verwendet, um durch Kreuzhybridisierung gegen die Tn10 und flankierende DNA enthaltenden Plasmid-Proben die Zuckernukleotid-Mutationen zu kartieren.
Keine der Zuckernukleotid-Proben kartierten innerhalb der DNA-Region, die die Gene für den Xanthan-Biosyntheseweg selbst enthält. Der Phage, der Wildtyp-DNA der Mutante X649 enthält, hybridisierte nicht an irgendeine andere Zuckernukleotid-Probe. In ähnlicher Weise hybridisierte der Phage, der Wildtyp-DNA aus der Region der Tn10-Insertion in der X736 Mutanten-DNA enthielt, nicht an andere Zuckernukleotid-Proben. Die defekten Gene in diesen Stämmen sind folglich nicht an die anderen Zuckernukleotid-Gene gekoppelt.
Die Plasmide pTX652, pTX657, pTx711 und pTx712 hybridisierten an eine überlappende Serie rekombinanter Lambda-Phagen, die klonierte X. campestris-DNA enthielten. Das Plasmid pTX711 hybridisierte an einige, jedoch nicht alle Lambda-Phagen, die an pTX652, pTX657 und pTX712 hybridisierten.
Eine Assoziation der Mutation im Stamm X652 mit Mutationen, die die Synthese von GDP-Mannose verhindern, war unerwartet, da X652 ebenfalls nicht UDP-Glucose oder UDP-Glucuronsäure herstellen kann. Die Mutation in X652 könnte in einem in trans-wirkenden regulatrischen Gen liegen, das die Synthese von UDP-Glucose und GDP-Mannose beeinflußt, oder in einem Strukturgen, das für ein Enzym kodiert, welches für die UDP- Glucose-Synthese essentiell ist, jedoch einen polaren Effekt auf die Expression der GDP-Mannose-Gene ausübt.

Beispiel 4

Dieses Beispiel stellt die Komplementation der Mutation im Stamm X649 durch das Plasmid pTS13 dar.
Alle Zuckernukelotid-Mutanten wurden durch Transposon-Mutagenese erhalten. Eine Lambda-Bank genomischer X. campestris- DNA wurde mit dem Plasmid pTX649 durchsucht, welches von der Klonierung des Transposons Tn10 plus flankierender chromosomaler Sequenzen der Mutante X649 (wie beschrieben in Capage et al., s.o.), die hinsichtlich der Synthese von UDP-Glucose und UDP-Glucuronsäure defekt ist, stammte. Zehn Lambda-Rekombinanten wurden identifiziert, die an die pTX649-Probe hybridisierten. Diese Phagen wurden Plaque-gereinigt.
Restriktionsverdaus und Gelelektrophorese wurden mit der DNA aller Lambda-Klone durchgeführt. In diesen Verdau-Mustern wurde das Wildtyp-Fragment der X. campestris-DNA, welches im Stamm X649 mutiert ist, identifiziert. Dieses 6,5kb PstI- Fragment ist durch Elektroelution ausgehend von präparativen Agarosegelen gereinigt worden. Dieses PstI-Fragment wurde in die PstI-Stelle von pBR322 kloniert, um das Plasmid pTf6,5 herzustellen. Ein weiteres Plasmid wurde durch Schneiden von pTf6,5 und des Plasmids RSF1010 mit EcoRI und nachfolgendem Zusammenligieren beider Plasmide konstruiert. Hybridplasmide wurden durch deren Fähigkeit selektiert, E. coli nach Transformation Streptomycin- und Tetracyclin-Resistenz zu vermitteln. Dieses chimäre Plasmid, pTS13, enthält das 6,5kb PstI- Fragment (Figur 7).
Das Plasmid wurde danach durch einen triparentalen durch pRK2013 vermittelten Konjugationstransfer in den X. campestris-Stamm X649 überführt.
Das klonierte 6,5kb-Fragment, welches von pST13 getragen wird, komplementiert die Mutante X649. Nachdem die Mating-Mischung des pTS13-Transfers in X649 auf rif und strep ausplattiert worden war, waren alle Kolonien Gum+ und nicht unterscheidbar vom Wildtyp. Drei Gum+ Exokonjuganten wurden analysiert und zeigten, daß sie das Plasmid enthielten. Weiterhin wurde ein Plasmid-"Heilungs"-Experiment durchgeführt. In diesem Experiment wurde X649 (pTS13) unter Bedingungen aufgezogen, die den Verlust der Plasmide beschleunigen und danach in der Abwesenheit jeglicher Antibiotika, die auf das plasmid selektieren würden, ausplattiert. In mehreren Experimenten wurden in solchen Ausplattierungen signifikante Häufigkeiten (10-50%) an Gum- Kolonien beobachtet. Drei solche Gum- Isolate wurden untersucht und zeigten, daß das Plasmid pTS13 verloren worden war. Jedoch wurde gefunden, daß drei Gum+ Isolate aus einem solchen Experiment pTS13 noch enthielten. Die Korrelation zwischen dem Vorhandensein des Plasmids und dem Gum+ Phänotyp läßt darauf schließen, daß die anfängliche Gum+ Eigenschaft nicht auf eine Rekombination sondern auf die Expression des Plasmid-getragenen Gens zurückzuführen ist.
Extrakte wurden ausgehend von den Stämmen X649 und X649, welcher pTS13 enthält, hergestellt. Der Extrakt von X649 mit dem Plasmid besaß UDP-Glucose, wie durch Spektralanalyse und Retentionszeit bestimmt wurde. Die Extrakte von X649 allein enthielten diese nicht.
Da Extrakte von X649 normale Mengen an Phosphoglucomutase (Beispiel 1) aufwiesen, muß der Enzymdefekt, welcher die Synthese von UDP-Glucose verhindert, in dem für UDP-Glucose- Pyrophosphorylase codierenden Gen liegen, das auf dem Plasmid pTS13 enthalten ist. Da dieses Plasmid eine Chimäre von RSF1010 ist, kann es in andere Gram-negative Bakterien als X. campestris überführt werden und vermittelt diesen die Fähigkeit, UDP-Glucose herzustellen, wenn sie die Fähigkeit besitzen, Glucose-1-phosphat herzustellen.

Beispiel 5

Dieses Beispiel stellt die Komplementation der Mutation im Stamm X736 durch das Plasmid pAS9 dar.
Eine Serie von fünf rekombinanten Lambda-Phagen wurde isoliert, die chromosomale X. campestris-DNA aus der Region der Tn10-Insertion in X736 enthielten. Diese Phagen wurden durch Screenen auf rekombinante Phagen, die an das Plasmid pTX736 hybridisieren, aus der Lambda-Genbank isoliert. Das Plasmid pTX736 besteht aus dem PstI-Fragment der chromosomalen DNA aus der Mutante X736, welche die Tn10-Insertion, die den Mutanten-Phänotyp verursacht, enthält, kloniert in den Plasmidvektor RSF1010.
Diese Lambda736(+)-Phagen wurden durch Southern-Blot-Hybridisierung aufgesucht, um relativ große DNA-Segmente zu identifizieren, die das interessierende Wildtyp-PstI-Fragment enthält. Die DNAs der Lambda-Rekombinanten wurden mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen geschnitten und zusammen mit einer Kontrolle chromosomaler Wildtyp-DNA, welche mit demselben Set an Enzymen geschnitten wurde, auf Agarosegelen laufengelassen. Die Verdaus wurden danach mit radioaktiv markierter pTX736 Plasmid-DNA als Probe getestet. Sall-Verdaus mehrerer verschiedener Lambda736(+)-Isolate erzeugten ein Fragment von 9kb, das an die Probe hybridisierte. Der Sall-Verdau der chromosomalen Wildtyp-DNA produzierte ebenfalls eine Bande von 9kb, die an die Probe hybridisierte. Da die Lambda736-Rekombinanten relativ wenige SalI- Fragmente produzierten, wurde eine Shotgun-Klonierung, ausgehend von Lambda in pMW79 durchgeführt. Der Plasmidvektor pMW79 enthält eine einzelne SalI-Stelle, die innerhalb des Tetracyclinresistenzgens liegt. Daher wurden sowohl pMW79 als auch Lambda736(+)-DNA mit SalI geschnitten und die Verdauprodukte zusammenligiert. Die Ligierungsreaktion wurde verwendet, um E. coli zu transformieren, Ampicillin-resistente Transformanten wurden selektiert und 650 davon danach auf die Empfindlichkeit gegenüber Tetracyclin hin getestet, um rekombinante Plasmide zu identifizieren. Zehn Ampr Tets- Isolate wurden gefunden. Plasmid-DNA wurde ausgehend von diesen Transformanten extrahiert und durch Restriktionsendonuklease-Verdau und Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die interessierende Rekombinante wurde gefunden. Dieses Plasmid, welches das klonierte 9kb Sall-Fragment enthält, wurde als pAS9 bezeichnet (Figur 8).
Dieses Plasmid wurde in X. campestris überführt, um eine eventuelle Komplementation des X736 Gum- Defekts zu überprüfen. Das Plasmid pAS9 wurde in einen Rifampicin-resistenten Abkömmling von X736, bezeichnet als X1017, mobilisiert, und der Rifr Wildtyp(Gum+)-Stamm X77 wurde erhalten. Diese Mobilisierungen wurden als triparentale durch pRK2013 vermittelte Standard-Konjugationstransfers durchgeführt. X. camestris-Konjuganten, die das interessierende Plasmid trugen, wurden durch Ausplattieren auf Rifampicin (um gegen den E. coli-Donor und Mobilisierungsstämme zu selektieren) und Streptomycin (um auf das Vorhandensein von pAS9 zu selektieren), selektiert. Die Rifr und Strepr-Nachkommen des Matings von pAS9 in X1017 waren ausnahmslos Gum+. Drei Gum+ Abkömmlinge wurden ausgewählt und auf das Plasmid hin untersucht. Es wurde gefunden, daß alle drei das Plasmid pAS9 klar enthielten, und daß das Plasmid keinerlei offensichtlichen Rekombinationen unterworfen war, was durch Restriktionsendonuklease-Verdaus nachgewiesen wurde. Weiterhin wurde ein Plasmid-"Heilungs"-Experiment durchgeführt. In diesem Experiment wurde X1017 pAS9 unter Bedingungen aufgezogen, die einen Verlust der Plasmide beschleunigen und danach in Abwesenheit jeglicher Antibiotika, die auf das Plasmid selektieren würden, ausplattiert. Signifikante Häufigkeiten an Gum- Kolonien wurden in solchen Ausplattierungen beobachtet. Drei solcher Gum- Isolate wurden getestet, und es wurde gefunden, daß das Plasmid pAS9 verloren worden war. Jedoch wurde gefunden, daß drei Gum+ Isolate aus einem solchen Experiment pAS9 noch enthielten. Die Korrelation zwischen dem Vorhandensein des Plasmids und dem Gum+ Phänotyp läßt darauf schließen, daß die Gum+ Eigenschaft nicht auf eine Rekombination sondern auf die Expression des Plasmidgetragenen Gens zurückzuführen ist.
Da die Mutante X736 UDP-Glucose, jedoch nicht UDP-Glucuronsäure herstellen kann, ist sie mit größter Gewißheit hinsichtlich des einzelnen Enzyms UDP-Glucose-Dehydrogenase, welches für die Umwandlung von UDP-Glucose in UDP-Glucuronsäure verantwortlich ist, defekt. Das Gen für dieses Enzym ist auf dem Plasmid pAS9 enthalten.

Beispiel 6

Dieses Beispiel stellt die Komplementation der Mutationen in den Stämmen X652, X711 und X712 durch das Plasmid pAS7 dar.
Eine Lambda-Bank genomischer x. campestris-DNA wurde mit dem Plasmid pTX652, das durch Klonieren des Transposons Tn10 plus flankierender chromosomaler Sequenzen der Zuckernukleotid-Mutante X652 in das Plasmid RSF1010 erhalten wurde, durchsucht. Die Mutante X652 stellt keine UDP-Glucose, GDP- Mannose oder UDP-Glucuronsäure her. Rekombinante Phagen, die an pTX652 hybridisierten, wurden Plaque-gereinigt. Southern- Blots von Restriktionsverdaus dieser Phagen wurden mit pTX652 getestet und identifizierten ein 9kb BamHI-Fragment, welches eine Wildtyp-Sequenz enthielt, die der Stelle der Transposon-Insertion entsprach.
Dieses 9kb BamHI-Fragment wurde gereinigt und in die BamHI- Stelle des Plasmids pMW79 ligiert. Die Ligierungsmischung wurde verwendet, um E. coli zu transformieren, und Ampicillin-resistente Transformanten wurden selektiert. Diese wurden auf Empfindlichkeit gegenüber Tetracyclin hin getestet; die Insertion fremder DNA in die BamHI-Stelle von pMW79 inaktiviert das für die Resistenz gegenüber Tetracyclin codierende Gen. Das Plasmid pAS7, welches das 9kb BamHI-Fragment enthält, wurde durch dieses Verfahren erhalten (Figur 9).
Das Plasmid wurde danach von E. coli in den x. campestris-Stamm X1043 durch einen triparentalen durch pRK2013 vermittelten Konjugationstransfer überführt. x. campestris X1043 wurde durch Mating von pTX652 in den X. campestris-Stamm X77 (einer Rifampicin-resistenten Mutante, die ausgehend von X. campestris NRRL B1459 S4-L erhalten wurde) und dadurch, daß eine homologe Rekombination durch Aussetzen einer Tetracyclin-Selektion forciert wurde, erhalten. Die verschiedene Antibiotikaresistenz von X1043 gegenüber X652 erleichtert die Gegenselektion gegen den E. coli-Donor in nachfolgenden Kreuzungen. Nach Überführung des Plasmids pAS7 wurde ein Gum+ Phänotyp von Xl043 wiederhergestellt. Dieser Phänotyp wandelte sich in Gum- um, wenn dieser Stamm von pAS7 "geheilt" wurde, was darauf hindeutet, daß der Gum+ Phänotyp auf die Expression der Plasmid-getragenen Kopie des chromosomalen Gens, das durch Transposon-Insertion im Stamm X652 inaktiviert worden war, zurückzuführen ist.
Wie in Beispiel 3 gezeigt, sind die Mutationen in den Stämmen X652, X711 und X712 auf dem X. campestris-Chromosom in einem bestimmten Bereich angehäuft (Cluster). Das Plasmid pAS7 stellte den Gum+ Phänotyp nach Überführung in die Mutanten X711 und X712 durch Konjugation in einer triparentalen Kreuzung wieder her. Komplementierte Stämme, die das Plasmid verloren, wurden Gum-.
Die Stämme X711 und X712 können wie der Stamm X652 keine GDP-Mannose synthetisieren. Das Plasmid pAS7 stellt diese Fähigkeit wieder her und enthält somit das Gen bzw. die Gene, das bzw. die für das Enzym bzw. die Enzyme codieren, die für die Synthese von GDP-Mannose benötigt werden.
Der Stamm X652 ist auch hinsichtlich UDP-Glucose defizient. Dieser Defekt läßt sich mit dem Fehlen der Phosphoglucomutase im Stamm X652 vereinbaren (Beispiel 2). Dieselbe Kopplungsgruppe, die die Gene enthält, welche für die Enzyme codieren, die für GDP-Mannose-Biosynthese benötigt werden, enthält auch das Strukturgen für Phosphoglucomutase oder ein regulatorisches Gen, das die Expression von Phosphoglucomutase kontrolliert.

Beispiel 7

Dieses Beispiel beschreibt die Zuckernukleotid-Pools in den alternativen Wirten
Die Zuckernukleotide in Paracoccus denitrificans (ATCC 17741), Pseudomonas stutzeri (ATCC 17588) und Pseudomonas perfectomarina (ATCC 14405) wurden unter Verwendung der für x. campestris entwickelten Verfahren analysiert. Alle Organismen wurden für zwölf Stunden mit zwei Prozent Glucose als Kohlenstoffquelle wachsengelassen. Die Zellen wurden gesammelt, gewaschen und zu einer Absorption von 100 bei 600nm resuspendiert. Die Zellpellets wiesen einen pinkfarbenen Farbton auf, der für denitrifizierende Bakterien typisch ist, welche die Synthese der Cytochrome, welche für anaerobes Wachstum benötigt werden, dereprimiert haben (eine typische Antwort auf einen Sauerstoffmangel während des Wachstums). Folglich wurde 25mM Nitrat als zusätzlicher Elektronen-Akzeptor in die Inkubationsmischungen zugefügt. Die Zellsuspensionen wurden mit 20mM Glucose für fünf Minuten mit und ohne Nitrat inkubiert und danach mit Ameisensäure, wie in Beispiel 1 beschrieben, extrahiert. Die Extrakte wurden lyophilisiert, in TEA-Phosphatpuffer gelöst und mittels HPLC analysiert. Paracoccus denitrificans besaß UDP-Glucose und GDP-Mannose, jedoch nicht-nachweisbare Mengen an UDP- Glucuronsäure, wie durch Peak-Spektren in den interessierenden Regionen verifiziert wurde (Figuren 10-12).
In ähnlicher Weise besaßen Pseudomonas perfectomarina und Pseudomonas stutzeri UDP-Glucose und GDP-Mannose. UDP-Glucuronsäure wurde in keinem Extrakt dieser Organismen nachgewiesen.
Es ist beabsichtigt, das im Beispiel 5 beschriebene Plasmid pAS9 durch Konjugation ausgehend von einem E. coli-Donor in einer triparentalen Kreuzung in alle drei Bakterien-Arten einzuführen, um die Unfähigkeit dieser Stämme, UDP-Glucuronsäure zu synthetisieren, zu korrigieren.

Beispiel 8

Dieses Beispiel beschreibt die UDP-Glucose-Pyrophosphorylase-Aktivität in Transposon-induzierten X. campestris-Mutanten, die hisichtlich der Zuckernukleotid-Synthese defekt sind.
Der Stamm X649 konnte keine UDP-Glucose herstellen (Beispiel 1), wies jedoch Phosphoglucomutase-Aktivität auf (Beispiel 2). Die nachstehend beschriebenen Experimente zeigen, daß die Mutation in diesem Stamm die UDP-Glucose-Pyrophosphorylase-Aktivität beeinflußt, und daß das Gen für UDP-Glucose- Pyrophosphorylase auf dem Plasmid pTS13 enthalten ist.
Um die Analyse der UDP-Glucose-Pyrophosphorylase-Aktivität zu erleichtern, wurden drei Streptomycin-empfindliche, Rifampicin-resistente Stämme, die die Tn10-Insertion des Stamms X649 trugen, konstruiert. Ein solcher Stamm, X1023, wurde durch das von Capage et al, s.o., beschriebene Genaustauschverfahren konstruiert. Zwei weitere Stämme, X1024 und X1025, wurden durch Chromosommobilisierung konstruiert. Das Plasmid pTS13, welches den Zuckernukleotid-Defekt des Stamms X649 (Beispiel 4) komplementiert, wurde in X1023, X1024 und X1025 eingebracht, um die Stämme X1041, X1039 bzw. X1040 zu erhalten. Weiterhin wurde das Plasmid pTS13 in den Gum&spplus; Rifampicin-resistenten Stamm X77 eingebracht, um den Stamm X1052 zu erzeugen.
Cytoplasmatische Fraktionen wurden wie in Beispiel 2 beschrieben ausgehend von diesen Stämmen und X. campestris X77, welcher als positive Kontrolle diente, hergestellt. Die UDP-Glucose-Pyrophophorylase wandelt Glucose-1-phosphat und UTP in UDP-Glucose und Pyrophosphat um. Die Reaktion ist reversibel. Die UDP-Glucose-Pyrophosphorylase-Aktivität wurde durch das Verknüpfen der Bildung von Glucose-1-phosphat ausgehend von UDP-Glucose an die Reduktion von NAD oder NADP durch Zufügen von Phosphoglucomutase und Glucose-6-phosphat- Dehydrogenase gemessen, wie beschrieben von Lieberman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65: 625-632 (1970), durch Bezugnahme hierin ausdrücklich eingeführt. In diesen Assays wurde HEPES-Puffer anstelle von Tris verwendet, und Natriumphosphat wurde aus der Reaktionsmischung weggelassen. Natriumfluorid (5mM) wurde zugefügt, um die Pyrophosphatase- Aktivität zu hemmen.
In einem Experiment, worin NAD verwendet wurde, wies der Stamm X1023 eine UDP-Glucose-Pyrophosphorylase-Aktivität von 5,4nmol pro mg Protein pro Minute auf, weniger als 10% der UDP-Glucose-Pyrophosphorylase-Aktivität des Wildtyp-Stamms X77, die 72,2nmol pro mg pro Minute beträgt. Fast der gesamte Anstieg der Absorption bei 340nm in der X1023-Reaktionsmischung war auf kompetierende Reaktionen anstatt auf die UDP-Glucose-Pyrophosphorylase-Aktivität selbst zurückzuführen. Der Stamm X1039 wies eine UDPG-Pyrophosphorylase-Aktivität von 18,7nmol pro mg pro Minute auf, vierfach höher als die Aktivität in X1023. Dieses Ergebnis zeigt, daß das Plasmid pTSl3 das UDP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gen trägt.
Um zu verifizieren, daß pTS13 das UDP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gen trägt, wurden zusätzliche Experimente mit den anderen Mutanten unter Verwendung von NADP als Elektronenakzeptor durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Ergebnisse mehrfacher Bestimmungen bei verschiedenen Extraktkonzentrationen sind dargestellt. Tabelle 3 UDP-Glucose-Pyrophosphorylase-Aktivität in cytoplasmatischen Fraktionen von X. campestris, ausgedrückt als nmol NADPH&sub2;, das pro Minute pro mg Protein gebildet wird. Stamm UDP-Glucose-Pyrophosphorylase
Die Stämme X1023, X1024 und X1025 wiesen nur eine geringe oder keine Pyrophosphorylase-Aktivität auf. Die Stämme X1040 und X1041, die das Plasmid enthalten, welches den Defekt in den Stämmen X1025 und X1023 komplementiert, wiesen eine hohe Aktivität auf. In ähnlicher Weise wies der Stamm X1052 eine viel höhere Aktivität als der Wildtyp-Elternstamm, X77, ohne dem Plasmid pTS13 auf. Da pTS13 vom Plasmid RSF1010, einem Plasmid mit hoher Kopienanzahl, abstammt, könnte dieser Unterschied hinsichtlich der Aktivität einen Gendosiseffekt reflektieren. Cytoplasmatische Extrakte der Stämme X77 und X1040 wurden nochmals hergestellt und sofort auf Pyrophosphorylase-Aktivität hin untersucht, dieses Mal in einem mit einem Probenraum mit konstanter Temperatur ausgerüstetem Spektrophotometer. Die spezifischen Aktivitäten betrugen 149 und 53,4nmol pro mg Protein pro Minute für X77 bzw. X1040.
Diese Ergebnisse bestätigen, daß die Mutation in X649 die UDP-Glucose-Synthese durch Beseitigen der UDP-Glucose-Pyrophosphorylase-Aktivität verhindert. Diese Aktivität kann durch das Plasmid pTS13 wieder hergestellt werden, welches das Gen für die UDP-Glucose-Pyrophosphorylase tragen muß.
UDP-Glucose-Pyrophosphorylase-Aktivität wurde auch in cytoplasmatischen Extrakten der Tn903-Serie an Zuckernukleotid- Mutanten gemessen. Die Reaktionsmischungen enthielten nicht NaF. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 UDP-Glucose-Pyrophosphorylase-Aktivität (UDPG-PPase, ausgedrückt als nmol pro Minute pro mg Protein) in Extrakten der Tn903-Zuckernukleotid-Mutanten, die vorher auf Phosphoglucomutase-Aktivität (PGM) hin getestet worden waren. Stamm Fehlende Zuckernukleotide UDPG Ppase
Alle Stämme wiesen meßbare Pyrophosphorylase-Aktivität auf. Die Abwesenheit der Phosphoglucomutase-Aktivität ist ausreichend, um auf die Unfähigkeit der Stämme X828, X866 und X872, UDP-Glucose zu synthetisieren, schließen zu können.

Beispiel 9

Dieses Beispiel beschreibt die Phosphomannomutase-Aktivität in Transposon-induzierten x. campestris-Mutanten, die hinsichtlich der Zuckernukleotid-Synthese defekt sind.
Cytoplasmatische Extrakte ausgehend von zuvor identifizierten Zuckernukleotid-Mutanten (Beispiel 1) wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Diese Extrakte wurden auf Phosphomannomutase (PMM) hin untersucht, das Enzym, das Mannose-6-phosphat in Mannose-1-phosphat, einem Substrat für die GDP-Mannose-Pyrophosphorylase, umwandelt. Die Enzamaktivität ist reversibel. Der Assay (Tabelle 5) wurde ausgehend von demjenigen von Pindar und Bucke, Biochem. J. 152: 617- 622 (1975), durch Bezugnahme hierin ausdrücklich eingeführt, in dem die Bildung von Mannose-6-phosphat an die NADP-Reduktion durch Zufügung der Enzyme Phosphomannose-lsomerase (PMI), Phosphoglucose-Isomerase (PGI) und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PD) geknüpft ist, angepaßt. Tabelle 5 Reaktionsmischung für die Messung der Phosphomannomutase- Aktivität in Xanthomonas campestris. Lösung ml 10 mM NADP 10 inM Mannose-1-phosphat 1 mM Glucose-1,6-diphosphat Kopplungsenzyme¹ 100 mM Cystein HCl 100 mM HEPES Puffer, pH 7,9 Wasser und Extrakt
¹Aus einer Mischung von 0,10ml PMI (380 Einheiten/ml), 0,05ml PGI (2000 Einheiten/ml) und 0,05ml G6PD (1000 Einheiten/ml), wobei eine Einheit 1,0 umol pro Minute Substrat in Produkt umwandelt.
Die Reaktionsraten wurden nach mehreren Minuten linear, die Zeit, die für die phosphorylierten Zucker-Zwischenverbindungen benötigt wird, um Gleichgewichtskonzentrationen zu erreichen. Die linearen Raten sind proportional zu der Menge des in die Reaktionsmischung zugefügten cytoplasmatischen Extrakts. Aus Einfachheitsgründen wurde die PMM-Aktivität durch Vergleichen der NADPH&sub2;-Bildung im Vorhandensein von Mannose-1-phosphat mit derjenigen in dessen Abwesenheit nach einer 30-minütigen Inkubation bestimmt anstatt durch Bestimmen der tatsächlichen Reaktionsraten. Die Absorption bei 340nm wurde nach 30-minütigen Inkubationen ohne und mit Mannose-1-phosphat (M1P) gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 zusammengefaßt. Tabelle 6 Phosphomannomutase-Aktivität in cytoplasmatischen Extrakten von Zuckernukleotid-Mutanten, die keine GDP-Mannose synthetisieren können. Die Absorption bei 340nm wurde nach 30-minütiger Inkubation mit und ohne Mannose-1-phosphat (MIP) gemessen. Stamm Zuckernukleotid-Defekt MIP-abhängiger Anstieg der Absorption bei 340 nm
Anfänglich zeigten X866-Extrakte einen Anstieg der Absorption bei 340 nm nach Zugabe von Mannose-1-phosphat. Jedoch konnte dieser Anstieg nicht einer Phosphomannomutase-Aktivität zugerechnet werden; die Reaktionsrate war nicht linear, und ein Plateau wurde weit unter der maximal erhältlichen Absorption erreicht. Der Extrakt von X866 war noch aktiv, wenn auf Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Aktivität (0,77 mol pro ml pro Minute) hin untersucht wurde. Der Stamm X866 ist hinsichtlich einer PMM-Aktivität klar defekt.
Alle weiteren GDP-Mannose-Mutanten wiesen Phosphomannomutase-Aktivität auf. Das defekte Enzym, das die Synthese von GDP-Mannose in diesen Mutanten verhindert, muß GDP-Mannose- Pyrophosphorylase sein. Da der Defekt in den Mutanten X652, X711 und X712, der die GDP-Mannose-Synthese verhindert, durch das Plasmid pAS7 korrigiert wird, muß dieses plasmid das Gen für die GDP-Mannose-Pyrophosphorylase tragen.
Es wird für Durchschnittsfachleute offensichtlich sein, daß verschiedene Modifizierungen und Variationen in den erfindungsgemäßen Verfahren und Produkten eingeführt werden können.

Claims

1. Durch rekombinante DNA vermitteltes Verfahren zur Herstellung von Zuckernukleotiden für die Herstellung von Xanthan-Gummi, umfassend:

a) Herstellen mindestens einer DNA-Sequenz, welche dazu fähig ist, einen alternativen Wirtsmikroorganismus dahingehend zu lenken, daß dieser mindestens ein Zuckernukleotid herstellt, worin die DNA-Sequenz mindestens einen kodierenden Bereich von DNA-Sequenzen umfaßt, die aus den DNA-Inserts von pAS7, pAS9 und pTS13 ausgewählt sind, welche in E. coli LE392 enthalten und unter den ATCC-Hinterlegungsnummern 67 048, 67 050 bzw. 67 047 hinterlegt sind, oder DNA-Sequenzen, welche an die besagten DNA-Inserts hybridisieren und für Enzyme mit derselben Aktivität kodieren;

b) Klonieren der DNA-Sequenz in mindestens einen Vektor, welcher in einen Wirtsmikroorganismus transferiert und darin repliziert werden kann, wobei solche Vektoren Elemente für die Expression der Biosynthese- Enzyme enthalten, die durch die DNA-Sequenzen kodiert sind;

c) Transferieren der Vektoren, welche die DNA-Sequenzen enthalten, in einen Wirtsmikroorganismus, welcher dazu fähig ist, mindestens ein Zuckernukleotid unter der Anweisung der DNA-Sequenzen herzustellen;

d) Kultivieren des Wirtsmikroorganismus unter Bedingungen, welche für die Erhaltung der Vektoren und die Synthese der Zuckernukleotide geeignet sind; und wahlweise;

e) Gewinnen der Zuckernukleotide.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das herzustellende Zuckernukleotid UDP-Glukose ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das herzustellende Zucke rnukleotid UDP-Glucuronsäure ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das herzustellende Zuckernukleotid GDP-Mannose ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Vektor im Schritt (c) ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus pAS7, pAS9 und pTS13, enthalten in E. coli LE292 und hinterlegt unter den ATCC-Hinterlegungsnummern 67048, 67050 bzw. 67047.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin der besagte Wirt ein denitrifizierendes Bakterium umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin der besagte Wirt ausgewählt wird aus Bakterien der Gattung Clostridium.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin der besagte Wirt ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Pseudomonas pu- tida, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzeri, Escherichia coli und Enterobacter cloacae.

9. Gegenstand, umfassend mindestens ein Plasmid, welches dazu fähig ist, eine mikrobielle Zelle dahingehend zu lenken, daß diese mindestens eines der Enzyme synthetisiert, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus UDP-Glucosepyrophosphorylase, UDp-Glucosedehydrogenase, Phosphoglucomutase, Phosphomannosemutase und GDP-Mannosepyrophosphorylase, worin das Insert bzw. die Inserts des besagten Plasmids bzw. der besagten Plasmide mindestens einen kodierenden Bereich der DNA-Sequenzen umfaßt bzw. umfassen, die ausgewählt sind aus den DNA-Inserts von pAS7, pAS9 und pTS13, welche in E. coli LE392 enthalten und unter den ATCC-Hinterlegungsnummern 67 048, 67 050 bzw. 67 047 hinterlegt sind, oder DNA-Sequenzen, welche an die besagten DNA-Inserts hybridisieren und für Enzyme mit derselben Aktivität kodieren.

10. Plasmid pAS7, enthaltend in E. coli LE392 und hinterlegt unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 67048.

11. Plasmid pAS9, enthalten in E. coli LE392 und hinterlegt unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 67050.

12. Plasmid pTS13, enthalten in E. coli LE392 und hinterlegt unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 67047.

13. Plasmid, welches dazu fähig ist, die mikrobielle Synthese von einem oder mehreren Zuckernukleotid(en) zu lenken, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus UDP-Glucose, UDP-Glucuronsäure und GDP-Mannose, worin das Insert des besagten Plasmids mindestens einen kodierenden Bereich der DNA-Sequenzen umfaßt, die ausgewählt sind aus den DNA-Inserts der Plasmide nach einem der Ansprüche 10 bis 12 oder DNA-Sequenzen, welche an die besagten DNA-Inserts hybridisieren und für Enzyme mit derselben Aktivität kodieren.

14. Mikroorganismus des Stammes X. campestris X872, hinterlegt unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 53471.

15. Mikroorganismus des Stammes E. coli LE392 (pAS7) hinterlegt unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 67048.

16. Mikroorganismus des Stammes E. coli LE392 (pAS9) hinterlegt unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 67050.

17. Mikroorganismus des Stammes E. coli LE392 (pTSI3) hinterlegt unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 67047.

18. Mikroorganismus, umfassend ein Plasmid gemäß dem Gegenstand nach Anspruch 9.

19. Mikroorganismus, umfassend ein Plasmid nach Anspruch 13.

20. Mikroorganismus nach Anspruch 18 oder 19, worin der besagte Mikroorganismus ein denitrifizierendes Bakterium umfaßt.

21. Mikroorganismus nach Anspruch 18 oder 19, worin der besagte Mikroorganismus ausgewählt ist aus Bakterien der Gattung Clostridium.

22. Mikroorganismus nach Anspruch 18 oder 19, worin der besagte Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzeri, Escherichia coli und Enterobacter cloacae.