JPH1156356A - Lactone hydrolase and its production - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a conventionally unknown lactone hydrolase, and further to provide a method for producing the lactone hydrolase. SOLUTION: This method for producing a lactone hydrolase comprises culturing microorganisms belonging to the genus Schizophyllum, having following physicochemical properties and an ability for producing the lactone hydrolase, and collecting the enzyme from the cultured material: (1) action: acting on lactone and forming a corresponding acid; (2) substrate specificity: specifically hydrolyzing D-pantolactone but not acting on L-pantolactone; (3) optimum pH and pH stability: acting at about pH 7.0 and stable at pH 5.0 or more; (4) optimum temperature and thermal stability: acting about at 30 deg.C and stable to 50 deg.C; ; influence of various metal ion and inhibitor: inhibited by Zn<2+> , Cu<2+> , Ni<2+> , Cd<2+> , Fe<3+> , Al<3+> , Hg<2+> , Pb<2+> , Sn<2+> , DTNB and EDTA. The optical resolution method of a racemic lactone compound comprises using the enzyme, and obtaining an optically active substance from the racemic lactone compound selected from a group of aldonic acid lactones including the pantolactone.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、ラクトン類を立体
選択的に加水分解する新規なラクトン加水分解酵素、そ
の製造法及び該酵素を用いるラクトン類の光学分割法に
関する。The present invention relates to a novel lactone hydrolase which stereoselectively hydrolyzes lactones, a method for producing the same, and a method for optically resolving lactones using the enzyme.

【０００２】[0002]

【従来技術】Ｄ−パントラクトンは、医学上または生理
学上重要なビタミンとして有用なＤ−パントテン酸やパ
ンテチンの製造における中間体として知られている。従
来、Ｄ−パントラクトンは化学的に合成されたＤ，Ｌ−
パントラクトンを光学分割することにより製造されてい
る。しかしながら、こうした化学的な光学分割法では、
キニーネ、ブルシン等の高価な分割剤を用いなければな
らないし、Ｄ−パントラクトンの回収も容易でない等の
欠点を有している。一方、Ｄ，Ｌ−パントラクトンを酵
素的不斉加水分解して光学分割する方法が提案されてき
ている。すなわち、特開昭５７−１５２８９５号及び特
開昭６２−２９４０９２号に開示された方法は、Ｄ，Ｌ
−パントラクトン中のＬ−体を選択的に不斉加水分解
し、Ｄ−パントラクトンに富んだ処理液よりＤ−パント
ラクトンを分離して得るものである。しかしながら、こ
の方法ではＬ−パントラクトンを完全に加水分解させな
いことには、光学純度の高いＤ−パントラクトンを得る
ことができないため、コストがかさみ、更に効率の良い
方法とは言えない。また、基質濃度が低いばかりでな
く、その反応速度も悪いという問題があり、実用的な方
法とは言えない。2. Description of the Related Art D-pantolactone is known as an intermediate in the production of D-pantothenic acid and pantethine which are useful as medically or physiologically important vitamins. Conventionally, D-pantolactone is chemically synthesized D, L-
It is manufactured by optically dividing pantolactone. However, in such a chemical optical resolution method,
It has drawbacks such that expensive resolving agents such as quinine and brucine must be used, and it is not easy to recover D-pantolactone. On the other hand, a method for optical resolution by enzymatic asymmetric hydrolysis of D, L-pantolactone has been proposed. That is, the methods disclosed in JP-A-57-152895 and JP-A-62-294092 are disclosed in D, L
-L-isomer in pantolactone is selectively asymmetrically hydrolyzed, and D-pantolactone is obtained by separating from D-pantolactone-rich treatment liquid. However, in this method, if the L-pantolactone is not completely hydrolyzed, D-pantolactone having high optical purity cannot be obtained, so that the cost increases and the method cannot be said to be more efficient. In addition, there is a problem that not only the substrate concentration is low, but also the reaction speed is low, and it cannot be said that it is a practical method.

【０００３】本発明者等はＤ，Ｌ−パントラクトンの不
斉加水分解につき、鋭意研究をおこなった結果、特定の
微生物を用いることにより、Ｄ，Ｌ−パントラクトン中
のＤ−パントラクトンのみを選択的に不斉加水分解せし
めることにより、Ｄ−パントイン酸を生成せしめ、その
Ｄ−パントイン酸を分離し、Ｄ−パントラクトンに変換
することによって、Ｄ，Ｌ−パントラクトンから効率良
くＤ−パントラクトンを取得し得ることを見出した。す
なわち、フサリウム属、シリンドロカルポン属、ジベレ
ラ属、アスペルジラス属、ペニシリウム属、リゾプス
属、ボルテラ属、グリオクラディウム属、ユーロティウ
ム属、ネクトリア属、シゾフィラム属、ミロセシウム
属、ノイロスポラ属、アクリモニウム属、ツベルクリナ
属、アブシジア属、スポロスリクス属、バーティシリウ
ム属またはアルスロダーマ属に属する微生物より選ばれ
たラクトン加水分解能を有する微生物を用いてＤ，Ｌ−
パントラクトン中のＤ−パントラクトンを選択的に不斉
加水分解せしめることにより、Ｄ−パントイン酸を生成
せしめ、そのＤ−パントイン酸を分離し、Ｄ−パントラ
クトンに変換することを特徴とするＤ−パントラクトン
製造法を提供することに成功したものであり、前述の
Ｄ，Ｌ−パントラクトン中のＬ−パントラクトンを選択
的に不斉加水分解する方法に比べ、基質濃度をかなり高
くできること及び反応時間を短く設定できること、更に
光学純度の極めて高いＤ−パントラクトンを得ることが
できる等多くの長所を有するものである（特開平３−６
５１９８号）。The present inventors have conducted intensive studies on the asymmetric hydrolysis of D, L-pantolactone. As a result, by using a specific microorganism, only D-pantolactone in D, L-pantolactone was converted. By selectively asymmetric hydrolysis, D-pantoic acid is produced, and the D-pantoic acid is separated and converted into D-pantolactone, whereby D-pantolactone is efficiently converted from D, L-pantolactone. It has been found that a lactone can be obtained. That is, Fusarium genus, Cylindrocarpon genus, Gibberella genus, Aspergillus genus, Penicillium genus, Rhizopus genus, Volterra genus, Gliocladium genus, Eurotium genus, Nectria genus, Schizophyllum genus, Myrosesium genus, Neurospora genus, Acrimonium genus , Tuberculina, Abscidia, Sporothrix, Verticillium or Arsloderma using a microorganism having a lactone hydrolytic ability.
D-pantoic acid is selectively asymmetrically hydrolyzed to form D-pantoic acid, and the D-pantoic acid is separated and converted to D-pantolactone. -A method for producing pantolactone has been successfully provided, wherein the substrate concentration can be considerably increased as compared with the above-mentioned method for selectively asymmetrically hydrolyzing L-pantolactone in D, L-pantolactone; It has many advantages, such as being able to set a short reaction time and obtaining D-pantolactone having extremely high optical purity (Japanese Patent Laid-Open No. 3-6).
No. 5198).

【０００４】更に、本発明者らは上記特定の微生物よ
り、Ｄ−パントラクトンを特異的に加水分解する新規な
酵素、すなわち、Ｄ−パントラクトン加水分解酵素を採
取することに成功し、その諸性質を明らかにし、上記し
た属に属する微生物による該酵素の製造法を提供してき
た（特開平４−１４４６８１号）。より効率よいＤ−パ
ントラクトンの光学分割法を開発するためには、ラクト
ン類の酵素的な不斉加水分解の機構などをより詳しく解
析する必要があるが、こうした目的のためには別の種類
のＤ−パントラクトン加水分解酵素の有無を調査するこ
とや、もしそういった加水分解酵素が存在するとしてそ
の性状についての解明が求められる。Further, the present inventors have succeeded in collecting a novel enzyme that specifically hydrolyzes D-pantolactone, ie, D-pantolactone hydrolase, from the above-mentioned specific microorganisms. The nature of the enzyme has been clarified, and a method for producing the enzyme using a microorganism belonging to the genus described above has been provided (JP-A-4-144681). In order to develop a more efficient optical resolution method for D-pantolactone, it is necessary to analyze the mechanism of enzymatic asymmetric hydrolysis of lactones in more detail. It is required to investigate the presence or absence of D-pantolactone hydrolase, and to clarify the properties of such a hydrolase, if any.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者等は、鋭意研究
をおこなった結果、特開平４−１４４６８１号公報に記
載した属に属する微生物のあるものが、既に明らかにし
たＤ−パントラクトン加水分解酵素に加え、さらに別の
種類のＤ−パントラクトン加水分解酵素を産生すること
を見いだした。すなわち、シゾフィラム属のラクトンを
特異的に加水分解する微生物を培養し、その培養体から
新規なラクトン加水分解酵素を得ることに成功した。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies, the present inventors have found that some microorganisms belonging to the genus described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-144681 have been identified as D-pantolactone hydrolyzate. In addition to degrading enzymes, they have been found to produce yet another type of D-pantolactone hydrolase. That is, a microorganism that specifically hydrolyzes a lactone belonging to the genus Schizophyllum was cultured, and a novel lactone hydrolase was successfully obtained from the culture.

【０００６】かくして、本発明は、 〔１〕 以下の理化学的性質を有する新規なラクトン加
水分解酵素； 作用 ラクトンに作用し、対応する酸を生成する： 基質特異性 Ｄ−パントラクトンを特異的に加水分解するが、Ｌ−パ
ントラクトンには作用しない： 至適ｐＨ及びｐＨ安定性 ｐＨ７．０付近で作用し、ｐＨ５．０以上で安定であ
る： 至適温度及び熱安定性 ３０℃付近で作用し、５０℃まで安定である：および 各種金属イオン、阻害剤の影響 Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Fe³⁺, Al³⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Sn
²⁺, DTNB（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香
酸））, EDTA（エチレンジアミン四酢酸）によって阻害
される；Thus, the present invention provides: [1] A novel lactone hydrolase having the following physicochemical properties: Action: Acts on lactone to generate a corresponding acid: Substrate specificity Specificity of D-pantolactone Hydrolyzes but does not act on L-pantolactone: Optimum pH and pH stability Works around pH 7.0 and is stable at pH 5.0 and above: Optimum temperature and thermal stability Works around 30 ° C And stable up to 50 ° C: and the effect of various metal ions and inhibitors Zn ²⁺ , Cu ²⁺ , Ni ²⁺ , Cd ²⁺ , Fe ³⁺ , Al ³⁺ , Hg ²⁺ , Pb ²⁺ , Sn
Inhibited by ²⁺ , DTNB (5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)), EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid);

【０００７】〔２〕 シゾフィラム属に属し、上記
〔１〕記載の酵素生産能を有する微生物を培養して、培
養物より該酵素を採取することを特徴とする新規なラク
トン加水分解酵素の製造法； 〔３〕 上記〔１〕記載の酵素を用い、パントラクトン
を含めたアルドン酸ラクトン類からなる群から選ばれた
ラセミ体ラクトン化合物から、光学活性体を得ることを
特徴とするラセミ体ラクトン化合物の光学分割法； 〔４〕 パントラクトンを含めたアルドン酸ラクトン類
からなる群から選ばれたラセミ体ラクトン化合物に上記
〔１〕記載の酵素を作用させ、立体選択的に加水分解
し、次に未反応ラクトン化合物と水解物である酸とを分
離し、分離された水解物である酸をラクトン化せしめる
ことを特徴とするラセミ体ラクトン化合物の光学分割
法；[2] A method for producing a novel lactone hydrolase, which comprises culturing a microorganism belonging to the genus Schizophyllam and having the enzyme-producing ability described in [1] above, and collecting the enzyme from the culture. [3] a racemic lactone compound obtained from the racemic lactone compound selected from the group consisting of aldonic acid lactones, including pantolactone, using the enzyme of [1]; [4] The enzyme of the above-mentioned [1] is acted on a racemic lactone compound selected from the group consisting of aldonic acid lactones including pantolactone, and the enzyme is stereoselectively hydrolyzed. An optical resolution method for a racemic lactone compound, comprising separating an unreacted lactone compound and an acid as a hydrolyzate, and lactonizing the acid as a hydrolyzate;

【０００８】〔５〕 分子量がゲル濾過法（ＴＳＫ Ｇ
−３０００ ＳＷ）を用いて測定した場合、おおよそ１
５８，０００であることを特徴とする、上記〔１〕記載
の酵素；及び 〔６〕 分子量がＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動法を用いて測定した場合、おおよそ７４，５００であ
ることを特徴とする、上記〔１〕記載の酵素を提供す
る。[5] The molecular weight is determined by gel filtration method (TSK G
-3000 SW), approximately 1
And (6) a molecular weight of about 74,500 as measured by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. And an enzyme according to the above [1].

【０００９】[0009]

【発明の実施の形態】本発明は、例えば、おおよそ１５
８キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有するという点
で、従来のＤ−パントラクトン加水分解酵素とは異なる
理化学的性質を有する新規なラクトン加水分解酵素、シ
ゾフィラム属に属する微生物から該酵素を製造する方
法、さらには該酵素の用途に関する。本発明の酵素の製
造法について説明する。本発明において使用される微生
物としては、シゾフィラム属に属し、前記記載の酵素生
産能を有する微生物であれば、如何なるものであっても
よく、公知の菌株で、例えば、大阪市淀川区十三本町２
丁目１７番８５号（郵便番号５３２）の財団法人発酵研
究所 (IFO)に寄託されている菌株、IFO 6504、IFO 6505
などが挙げられる。本発明においては、上記した菌株と
その変種、変異種が特に好適に用いることができるが、
もちろん他の微生物であっても、前記したラクトン加水
分解酵素の生産能を有するものであれば何れのものも使
用可能である。さらに、上記した菌株の変異の一つに
は、突然変異によるものがあってよく、それは、例えば
放射能や紫外線の照射、ニトロソグアニジン等の薬剤の
適用等によって実現され、また遺伝子の組換えによって
もそのような菌株の変異は可能である。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
A novel lactone hydrolase having physicochemical properties different from conventional D-pantolactone hydrolase in that it has a molecular weight of 8 kilodalton (kDa), a method for producing the enzyme from a microorganism belonging to the genus Schizophyllam And the use of the enzyme. The method for producing the enzyme of the present invention will be described. The microorganism used in the present invention may be any microorganism that belongs to the genus Schizophyllum and has the enzyme-producing ability described above, and may be any known strain, for example, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi 2
Strains deposited at the Institute for Fermentation Research (IFO), 17-17-85 (zip code 532), IFO 6504, IFO 6505
And the like. In the present invention, the above-mentioned strains and their variants and mutants can be used particularly preferably.
Of course, any other microorganism can be used as long as it has the ability to produce the lactone hydrolase described above. Furthermore, one of the mutations in the above-mentioned strains may be due to mutation, which is achieved by, for example, radioactivity or ultraviolet irradiation, application of a drug such as nitrosoguanidine, etc. Mutations in such strains are also possible.

【００１０】こうした微生物を用いて、本発明に従う新
規なラクトン加水分解酵素を製造するに際しては、その
ような微生物を培養し、その培養液中に目的とするラク
トン加水分解酵素を蓄積せしめ、そして、それから分離
採取されることとなる。本発明における微生物の培養
は、一般微生物で採用される培養方法と同じ方法を使用
することができ、好ましくは一般微生物の好気的培養で
採用される培養方法と同じ方法が用いられる。こうした
際の菌株を培養する培地は、液状であっても、固体状で
あってもよい。しかしながら、通常は、液体培地を使用
するのが有利であり、好ましくは液体培地による振盪培
養法あるいは通気攪拌培養法などを用いることができ
る。通常、工業的には一般に撹拌培養を採用する。用い
られる培地としては、資化性を有するものであれば良
く、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類（ミネラル）、
必要に応じて微量栄養素（ビタミン類、アミノ酸、核酸
塩基など）、微量金属及びその他の栄養素・微量金属を
適当量含有する培地であるならば、合成培地及び天然培
地の何れをも使用することができる。好ましくは市販の
培地あるいは培地成分を利用する。In producing a novel lactone hydrolase according to the present invention using such a microorganism, such a microorganism is cultured, and the desired lactone hydrolase is accumulated in the culture solution. Then it will be separated and collected. For culturing the microorganism in the present invention, the same method as that used for general microorganisms can be used, and preferably the same method as the culture method used for aerobic culture of general microorganisms is used. The culture medium for culturing the strain at this time may be liquid or solid. However, usually, it is advantageous to use a liquid medium, and preferably, a shaking culture method or an aeration stirring culture method using a liquid medium can be used. Usually, stirring culture is generally employed industrially. The medium to be used may be any medium having assimilation properties, such as a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts (mineral),
If necessary, either a synthetic medium or a natural medium can be used as long as the medium contains micronutrients (vitamins, amino acids, nucleic acid bases, etc.), trace metals and other nutrients / trace metals in appropriate amounts. it can. Preferably, a commercially available medium or medium components are used.

【００１１】こうした培地に添加される炭素源として
は、菌の生育のためには、炭水化物、例えば、可溶性澱
粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、澱粉、
加工澱粉、澱粉誘導体、麦芽汁、デキストリン、アミロ
ペクチン、アミロース、ショ糖、麦芽糖、グルコース、
乳糖、ガラクトース、廃糖蜜等が用いられる。代表的な
炭素源としては、グルコース、蔗糖（シュクロース）な
どの糖質、エタノール、グリセリンなどのアルコール
類、オレイン酸、ステアリン酸などの脂肪酸およびその
エステル類、菜種油、大豆油などの油類などが挙げられ
る。さらに窒素源としては、コーン・スティープリカ
ー、大豆粉、小麦ふすま、ペプトン、ポリペプトン、バ
クトトリプトンなどのカゼイン分解物、ソイトンなどの
大豆タンパク質分解物、肉汁、肉エキス、カザミノ酸、
魚肉エキス、フィシュミール、尿素、酵母エキス、乾燥
酵母等の動物、植物、微生物由来の有機窒素源、グルタ
ミン酸等のアミノ酸類、そして硫酸アンモニウム、リン
酸アンモニウムなどのアンモニウム塩や硝酸塩等の無機
窒素化合物が、１種又は２種以上選択されて用いられ
る。代表的な窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸
ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーン・スティー
プリカー、ふすま、酵母エキスなどが挙げられる。また
無機塩類としては、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カ
リウム塩、リン酸塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン
塩、亜鉛塩、炭酸塩、酢酸塩などが挙げられ、例えば、
リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化カルシウム、炭酸ナトリウム、塩化第一鉄、塩
化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄などが挙げられる。
それら無機塩の１種又は２種以上が適宜に選択されて用
いられ得る。代表的な無機塩類としては、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸一水素
カリウム、リン酸二水素カリウムなどが挙げられる。そ
の他、代表的な栄養素としては、麦芽エキス、肉エキス
などが挙げられる。培地原料としては、通常上記炭素
源、窒素源、ミネラルなどを含むもの、例えば、肉汁、
肉エキス、ペプトン（例えば、カゼインペプトン、ゼラ
チンペプトン、肉ペプトン、大豆ペプトン、プロテオー
ズペプトン（動物肉分解ペプトン）など）、酵母エキ
ス、魚肉エキス、麦芽汁、麦芽エキス、馬鈴薯、麹汁な
どを用いる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミ
ン、パラアミノ安息香酸などが挙げられ、微量金属とし
ては、鉄、銅、亜鉛などが挙げられる。As a carbon source added to such a medium, carbohydrates such as soluble starch, corn starch, potato starch, sweet potato starch, starch,
Processed starch, starch derivative, wort, dextrin, amylopectin, amylose, sucrose, maltose, glucose,
Lactose, galactose, molasses and the like are used. Representative carbon sources include sugars such as glucose and sucrose (sucrose), alcohols such as ethanol and glycerin, fatty acids and esters thereof such as oleic acid and stearic acid, and oils such as rapeseed oil and soybean oil. Is mentioned. Furthermore, as a nitrogen source, corn steep liquor, soy flour, wheat bran, peptone, polypeptone, casein decomposition products such as bactotripton, soy protein decomposition products such as soyton, gravy, meat extract, casamino acid,
Fish, meat meal, urea, yeast extract, dried yeast and other animals, plants, microorganisms, organic nitrogen sources, amino acids such as glutamic acid, and inorganic nitrogen compounds such as ammonium salts and nitrates such as ammonium sulfate and ammonium phosphate. One or two or more are selected and used. Representative nitrogen sources include ammonium sulfate, sodium nitrate, peptone, casamino acid, corn steep liquor, bran, yeast extract, and the like. Examples of the inorganic salts include sodium salt, magnesium salt, potassium salt, phosphate, calcium salt, iron salt, manganese salt, zinc salt, carbonate, acetate, and the like.
Examples include potassium phosphate, sodium phosphate, magnesium sulfate, calcium chloride, sodium carbonate, ferrous chloride, ferric chloride, ferrous sulfate, and ferric sulfate.
One or more of these inorganic salts can be appropriately selected and used. Representative inorganic salts include magnesium sulfate, sodium chloride, calcium carbonate, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and the like. Other typical nutrients include malt extract and meat extract. As the medium raw material, those usually containing the above-mentioned carbon source, nitrogen source, minerals, etc., for example, gravy,
Use meat extract, peptone (for example, casein peptone, gelatin peptone, meat peptone, soy peptone, proteose peptone (animal meat decomposed peptone), etc.), yeast extract, fish extract, malt juice, malt extract, potato, koji juice, etc. . Examples of vitamins include biotin, thiamine, and paraaminobenzoic acid, and examples of trace metals include iron, copper, and zinc.

【００１２】これら窒素源や無機塩の添加量としては、
それは適宜に決定されることができる。微生物の培養
は、当該微生物が生育するｐＨ領域であればいずれであ
ってもよいが、一般に出発ｐＨ：３．０〜９．０、好ま
しくは５．５〜８．０において行われる。培養は、当該
微生物が良好に生育する温度領域であればいずれであっ
てもよいが、一般に１０〜５０℃程度、好ましくは２０
〜３５℃程度の培養温度に保持して好気性条件下で、１
０時間〜１０日間、好ましくは１〜７日間培養すること
により行われる。上記条件以外であっても、微生物が生
育し、目的とする酵素が生成する条件であれば特に制限
されないのはいうまでもない。こうして培養処理の結
果、菌体内および／または培地中に生産され蓄積された
目的とするラクトン加水分解酵素は、濾過あるいは遠心
分離等の方法にて、菌体を分離し、必要に応じて、菌体
を水あるいは緩衝液で洗浄し、得られた菌体を、必要に
応じて、適量の緩衝液に懸濁し、乳鉢、超音波破砕機、
フレンチプレス、ダイノミルなどによる機械的な破砕処
理を施して菌破砕物とした後、酵素液を得る。こうして
得られた酵素液は、酵素単離の常法にしたがい処理され
ることができる。該酵素液は、必要に応じて、真空濃縮
又は限外濾過膜を用いて濃縮し、液体酵素として、ある
いは、凍結乾燥や噴霧乾燥法により、粉末化して採取す
ることができる。The amounts of these nitrogen sources and inorganic salts added are as follows:
It can be determined accordingly. The culture of the microorganism may be performed in any pH range in which the microorganism can grow, but is generally performed at a starting pH of 3.0 to 9.0, preferably 5.5 to 8.0. The culture may be carried out in any temperature range in which the microorganism can grow well, but generally about 10 to 50 ° C., preferably about 20 ° C.
Under aerobic conditions while maintaining the culture temperature at about
It is carried out by culturing for 0 hours to 10 days, preferably for 1 to 7 days. It goes without saying that the conditions other than those described above are not particularly limited as long as the microorganisms grow and the desired enzyme is produced. As a result of the culturing process, the target lactone hydrolase produced and accumulated in the cells and / or in the medium is separated from the cells by a method such as filtration or centrifugation, and if necessary, the cells are separated. The body is washed with water or a buffer, and the obtained cells are, if necessary, suspended in an appropriate amount of a buffer, a mortar, an ultrasonic crusher,
After a mechanical crushing treatment using a French press, a dyno mill or the like is performed to crush the bacteria, an enzyme solution is obtained. The enzyme solution thus obtained can be treated according to a conventional method for enzyme isolation. The enzyme solution can be concentrated, if necessary, using a vacuum concentration or ultrafiltration membrane, and can be collected as a liquid enzyme or powdered by freeze-drying or spray-drying.

【００１３】また、上記のように培養物から得られた本
発明の酵素は、酵素精製の常法にしたがい処理されるこ
とができる。上記で得られた酵素液を、さらに例えばエ
タノール、アセトン、イソプロピルアルコール等の有機
溶媒による沈殿などの処理、硫安、食塩等による塩析、
減圧濃縮、透析、限外濾過、疎水クロマトグラフィー、
アフィニティー・クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ゲル濾
過などによる吸着・脱離、ゲル分画法、等電点分画法、
電気泳動法等の酵素精製の常法に従って処理することが
できる。それらの方法は単独でも、複数の方法を適宜組
み合わせて用いてもよい。こうした方法により当該酵素
の純化、精製を行うことができる。塩析法では、例え
ば、硫安を使用し、３０％〜１００％飽和画分として、
好ましくは約４５％〜７０％飽和画分として、酵素を沈
殿させて採取する。[0013] The enzyme of the present invention obtained from the culture as described above can be treated according to a conventional method for enzyme purification. The enzyme solution obtained above, for example, ethanol, acetone, treatment such as precipitation with an organic solvent such as isopropyl alcohol, ammonium sulfate, salting out with sodium chloride,
Vacuum concentration, dialysis, ultrafiltration, hydrophobic chromatography,
Affinity chromatography, ion exchange chromatography, high performance liquid chromatography, adsorption / desorption by gel filtration, gel fractionation, isoelectric focusing,
The treatment can be performed according to a conventional method for enzyme purification such as electrophoresis. These methods may be used alone or in combination of a plurality of methods as appropriate. By such a method, the enzyme can be purified and purified. In the salting out method, for example, ammonium sulfate is used, and as a 30% to 100% saturated fraction,
The enzyme is precipitated and collected, preferably as a fraction of about 45% to 70% saturation.

【００１４】また溶媒沈殿法では、例えば、５５％〜９
５％エタノール中で、好ましくは６５％〜８５％エタノ
ール中で、酵素を沈殿させて採取する。酵素の採取は、
例えば、濾過あるいは遠心分離によりなされ、次に脱塩
処理に付される。脱塩は、通常、透析あるいはセファデ
ックス、バイオゲルなどを用いるゲル濾過法などにより
なされうる。得られる酵素は、安定化剤などを加え、あ
るいは加えること無く、限外濾過濃縮、逆浸透濃縮、減
圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥などの処理を加えることが
可能であり、液体あるいは固体状のものとすることも可
能である。本発明では、粗酵素液としてそのまま使用す
ることもできるし、必要に応じてさらに分離・精製し
て、精製酵素としてそれを用いることもできる。菌体外
の培養液中に蓄積する酵素については、菌体分離および
菌体破砕の操作を省略する以外は上記と同様におこな
い、本発明の酵素を得ることができる。本発明の酵素
は、下記実施例で説明されているように容易に精製さ
れ、電気泳動的に均一なものにすることが可能である。In the solvent precipitation method, for example, 55% to 9%
The enzyme is precipitated and collected in 5% ethanol, preferably in 65% to 85% ethanol. The collection of enzymes
For example, it is performed by filtration or centrifugation, and then subjected to desalting treatment. Desalting can be usually performed by dialysis or a gel filtration method using Sephadex, biogel, or the like. The resulting enzyme can be subjected to treatments such as ultrafiltration concentration, reverse osmosis concentration, drying under reduced pressure, freeze-drying, and spray-drying, with or without addition of a stabilizer or the like. It is also possible. In the present invention, a crude enzyme solution can be used as it is, or if necessary, further separated and purified, and used as a purified enzyme. Regarding the enzyme which accumulates in the culture solution outside the cells, the enzyme of the present invention can be obtained in the same manner as described above, except that the operations of cell separation and cell disruption are omitted. The enzymes of the present invention can be readily purified and electrophoretically uniform as described in the examples below.

【００１５】本発明の酵素の理化学的性質は以下の通り
のものである： 作用 ラクトンに作用し、対応する酸を生成する： 基質特異性 Ｄ−パントラクトンを特異的に加水分解するが、Ｌ−パ
ントラクトンには作用しない： 至適ｐＨ及びｐＨ安定性 ｐＨ７．０付近で作用し、ｐＨ５．０以上で安定であ
る： 至適温度及び熱安定性 ３０℃付近で作用し、５０℃まで安定である：および 各種金属イオン、阻害剤の影響 Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Fe³⁺, Al³⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Sn
²⁺, DTNB, EDTAによって阻害される。The physicochemical properties of the enzyme of the present invention are as follows: Action Acts on lactones to produce the corresponding acids: Substrate specificity Hydrolyzes D-pantolactone specifically, -Does not act on pantolactone: Optimum pH and pH stability Works around pH 7.0 and is stable at pH 5.0 or more: Optimum temperature and thermal stability Works around 30 ° C and is stable up to 50 ° C And the effects of various metal ions and inhibitors Zn ²⁺ , Cu ²⁺ , Ni ²⁺ , Cd ²⁺ , Fe ³⁺ , Al ³⁺ , Hg ²⁺ , Pb ²⁺ , Sn
Inhibited by ²⁺ , DTNB and EDTA.

【００１６】さらに、本発明の酵素の理化学的性質につ
いて、より詳しく説明すると以下の通りのデータが得ら
れているものである： 作用 ラクトンに作用し対応する酸を生成するより詳しくは （１）Ｄ−パントラクトンを立体選択的に加水分解し、
Ｄ−パントイン酸を生成する： （２）アルドン酸ラクトン類を立体選択的に加水分解
し、芳香族ラクトン類も基質とする： 基質特異性 Ｄ−パントラクトンを特異的に加水分解するが、Ｌ−パ
ントラクトンには作用しない： ｐＨ安定性 ｐＨ５．０以上で安定である、より詳しくはｐＨ５．０
〜１１．５で安定である （測定法：各ｐＨの０．１Ｍ濃度酵素緩衝溶液３２．５
μｌを３０℃で３０分インキュベート後、Ｄ−パントラ
クトン１９．２μｍｏｌを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）の溶液９２．５μｌ
を加え、３０℃で６０分反応後、活性を測定）：Further, the physicochemical properties of the enzyme of the present invention will be described in more detail. The following data are obtained: Action: Acts on lactone to generate the corresponding acid. (1) Stereoselectively hydrolyze D-pantolactone;
Produces D-pantoic acid: (2) Stereoselectively hydrolyzes aldonic acid lactones and also uses aromatic lactones as substrates: Substrate specificity Hydrolyzes D-pantolactone specifically, but L -Does not act on pantolactone: pH stability Stable above pH 5.0, more specifically pH 5.0
Stable at １11.5 ( Measurement method : 0.1 M concentration of enzyme buffer solution at each pH 32.5
After incubating the μl at 30 ° C. for 30 minutes, 0.1 M Tris-H containing 19.2 μmol of D-pantolactone was used.
92.5 μl of a solution of Cl buffer (pH 7.4)
And reacting at 30 ° C. for 60 minutes, then measure the activity):

【００１７】至適ｐＨ ｐＨ７．０付近で、より好適にはｐＨ７．０である （測定法：Ｄ−パントラクトン１９．２μｍｏｌを含む
各ｐＨの０．１Ｍ濃度酵素緩衝溶液１２５μｌを、３０
℃で６０分反応後、活性を測定）： 温度安定性 ５０℃まで安定である （測定法：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ
（ｐＨ７．４）の酵素溶液を各温度で３０分インキュベ
ート後、Ｄ−パントラクトン１９．２μｍｏｌを含む
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．
４）の溶液１２．５μｌを加え、３０℃で６０分反応
後、活性を測定）： 至適温度 ３０℃付近で作用し、より好適には３０℃である （測定法：Ｄ−パントラクトン１９．２μｍｏｌを含む
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．
４）の酵素溶液１２５μｌを各温度で６０分反応後、活
性を測定）： 各種金属イオン、阻害剤の影響 Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Fe³⁺, Al³⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Sn
²⁺, DTNB, EDTAによって阻害される：および 分子量 おおよそ１５８ｋＤａ、そしておおよそ７４．５ｋＤａ
の同一サブユニットからなるダイマー酵素であると考え
てよい（ゲル濾過法（ＴＳＫ Ｇ−３０００ＳＷ）を用
いて測定した場合はおおよそ１５８，０００であり、Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて測定し
た場合はおおよそ７４，５００で、このことから本酵素
は分子量７４，５００のサブユニット２個からなる二量
体蛋白であると考えられる）。Optimum pH: Around pH 7.0, and more preferably pH 7.0 ( Measurement method : 125 μl of a 0.1 M enzyme buffer solution of each pH containing 19.2 μmol of D-pantolactone was added to 30 parts).
The activity was measured after reaction at 60 ° C. for 60 minutes): Temperature stability Stable up to 50 ° C. ( Assay : 0.1 M Tris-HCl buffer)
After incubating the enzyme solution (pH 7.4) at each temperature for 30 minutes, 0.1 M Tris-HCl buffer containing 19.2 μmol of D-pantolactone (pH 7.4).
4 solution 12.5μl added), after 60 min reaction at 30 ° C., measured activity) act in the vicinity of optimum temperature 30 ° C., and more preferably 30 ° C. (measurement method: D-pantolactone 19 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.
(4) After reacting 125 μl of the enzyme solution at each temperature for 60 minutes, measure the activity): Influence of various metal ions and inhibitors Zn ²⁺ , Cu ²⁺ , Ni ²⁺ , Cd ²⁺ , Fe ³⁺ , Al ^{3 +} , Hg ²⁺ , Pb ²⁺ , Sn
Inhibited by ²⁺ , DTNB, EDTA: and molecular weight approximately 158 kDa, and approximately 74.5 kDa
May be considered to be a dimer enzyme consisting of the same subunit (measured by gel filtration method (TSK G-3000SW), which is approximately 158,000;
When measured using DS polyacrylamide gel electrophoresis, it is approximately 74,500, which suggests that the present enzyme is a dimeric protein consisting of two subunits having a molecular weight of 74,500.)

【００１８】なお、特開平４−１４４６８１号には、Ｄ
−パントラクトンを選択的に加水分解する酵素が開示さ
れているが、該文献に記載の酵素は、ゲル濾過を用いて
測定した場合の分子量は１２５，０００で、ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法を用いて測定した場合の
分子量は６３，０００であることから、その酵素の分子
量は６３，０００のサブユニット２個からなる二量体蛋
白であるとされており、本発明の上記酵素は、特開平４
−１４４６８１号の酵素とは明らかに異なる。また、特
開平４−１４４６８１号の酵素は既に遺伝子配列が解明
されており（ＷＯ９７／１０３４１）、そのアミノ酸組
成は本発明の酵素のアミノ酸組成と明らかに違うことか
らも別種の異なる酵素であることが明らかである。本発
明の酵素を取り扱うにあたっては、例えば、社団法人日
本生化学会編、「生化学実験講座５・酵素研究法（上）
・（下）」、株式会社東京化学同人、1975年："Methods
in Enzymology", Academic press, New York の一連の
シリーズを参考にすることができる。Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-144681 discloses a D
-An enzyme that selectively hydrolyzes pantolactone is disclosed, but the enzyme described in the literature has a molecular weight of 125,000 as measured by gel filtration, and is subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Since the molecular weight of the enzyme measured by using the same is 63,000, the molecular weight of the enzyme is considered to be a dimeric protein composed of two 63,000 subunits. Kaiping 4
It is clearly different from the enzyme of -144681. Further, the gene sequence of the enzyme disclosed in JP-A-4-144681 has already been elucidated (WO97 / 10341), and its amino acid composition is clearly different from the amino acid composition of the enzyme of the present invention. Is evident. In handling the enzyme of the present invention, for example, "Biochemical Experiment Lecture 5, Enzyme Research Method (1), edited by The Biochemical Society of Japan"
・ (Below) ”, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 1975:“ Methods
in Enzymology ", Academic press, New York.

【００１９】[0019]

【実施例】以下実施例を挙げて本発明の酵素の製造例を
具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって
限定されるものではない。実施例１ シゾフィラム コムネ ＩＦＯ ６５０４をグルコース
１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、コ
ーンスティープリカー０．５％の組成（ｐＨ６．０）を
有する培地５００ｍｌを含む２Ｌ振とうフラスコ２０本
に植菌し、２８℃で４日間振とう培養した。培養液を遠
心分離機で処理し、湿菌体５９８ｇを得た。得られた菌
体を０．１ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭ塩化カ
ルシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
４）８００ｍｌに懸濁し、ダイノミルで摩砕後、遠心分
離により無細胞抽出液１０１５ｍｌを得た。この無細胞
抽出液に硫酸アンモニウムを加え、２０％濃度溶液と
し、遠心分離をおこない、上清液１０４７ｍｌを得た。
この上清液を０．１ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍ
Ｍ塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）８０Ｌ中に２０時間透析をおこない、透析液
１６００ｍｌを得た。透析液を８００ｍｌに２分し、各
々をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（３×４５ｃ
ｍ）に負荷し、塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０→
０．６Ｍ）で溶離し、酵素活性画分を各々６００ｍｌ得
た。溶出した酵素活性画分を合わせた１２００ｍｌに塩
化ナトリウム２８０ｇを加えて得られた溶液をＰｈｅｎ
ｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂカラム（３×２
０ｃｍ）に負荷し、塩化ナトリウムの直線濃度勾配（４
→０Ｍ）で溶離し、酵素活性画分３１５ｍｌを得た。EXAMPLES The production examples of the enzyme of the present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. Example 1 A 2 L shake flask 20 containing 500 ml of a medium having a composition of 1% glucose, 0.5% polypeptone, 0.5% yeast extract, and 0.5% corn steep liquor (pH 6.0) was prepared using Schizophyllum komune IFO 6504. The cells were inoculated and cultured with shaking at 28 ° C. for 4 days. The culture was treated with a centrifuge to obtain 598 g of wet cells. The obtained cells were washed with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) containing 0.1 mM dithiothreitol and 1 mM calcium chloride.
4) The suspension was suspended in 800 ml, triturated with a dyno mill, and then centrifuged to obtain 1015 ml of a cell-free extract. Ammonium sulfate was added to the cell-free extract to make a 20% concentration solution, and centrifuged to obtain 1047 ml of a supernatant.
The supernatant was mixed with 0.1 mM dithiothreitol and 1 m
10 mM Tris-HCl buffer containing M calcium chloride (p
H7.4) Dialysis was performed in 80 L for 20 hours to obtain 1600 ml of dialysate. The dialysate was divided into 800 ml for 2 minutes, each of which was placed on a DEAE Sephacel column (3 × 45 c
m) and a linear concentration gradient of sodium chloride (0 →
0.6M) to obtain 600 ml of each enzymatically active fraction. A solution obtained by adding 280 g of sodium chloride to 1200 ml of the combined eluted enzyme active fractions was added to Phen
yl Sepharose CL-4B column (3 × 2
0 cm) and a linear concentration gradient of sodium chloride (4 cm).
→ 0M) to obtain 315 ml of an enzymatically active fraction.

【００２０】得られた酵素活性画分３１５ｍｌをアミコ
ンＹＭ−１０で限外濾過し、得られた酵素濃縮液２ｍｌ
をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００カラム（１．６×６
０ｃｍ）に負荷し、０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶離
し、酵素活性画分３０ｍｌを得た。得られた酵素活性画
分３０ｍｌを０．１ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍ
Ｍ塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）１２Ｌ中に２０時間透析をおこない、透析液
をＭｏｎｏＱ ＨＲ１０／１０カラム（１×１０ｃｍ）
に負荷し、塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０→１Ｍ）
で溶離し、酵素活性画分４０ｍｌを得た。得られた酵素
活性画分４０ｍｌに硫酸アンモニウム１０．６ｇを加え
た溶液をＰｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ１０／
１０（１×１０ｃｍ）カラムに負荷し、硫酸アンモニウ
ムの直線濃度勾配（２→０Ｍ）で溶離し精製酵素溶液１
０．５ｍｌを得た。このものは電気泳動において単一バ
ンドを示し、この精製酵素溶液をゲル濾過による脱塩
後、凍結乾燥し、酵素粉末２．４ｍｇを得た。比活性は
４．５８Ｕ／ｍｇ、活性収率１．５７％であった。Ultrafiltration of 315 ml of the obtained enzyme-active fraction with Amicon YM-10 gave 2 ml of the resulting enzyme concentrate.
On a Sephacryl S-200 column (1.6 × 6).
0 cm) and eluted with a 0.2 M sodium chloride solution to obtain 30 ml of the enzymatically active fraction. 30 ml of the obtained enzymatically active fraction was mixed with 0.1 mM dithiothreitol and 1 ml
10 mM Tris-HCl buffer containing M calcium chloride (p
H7.4) Dialysis was performed in 12 L for 20 hours, and the dialysate was subjected to MonoQ HR 10/10 column (1 × 10 cm).
And a linear concentration gradient of sodium chloride (0 → 1M)
To obtain 40 ml of an enzymatically active fraction. A solution obtained by adding 10.6 g of ammonium sulfate to 40 ml of the obtained enzyme active fraction was added to Phenyl-Superose HR10 /
10 (1 × 10 cm) column and eluted with a linear concentration gradient of ammonium sulfate (2 → 0 M).
0.5 ml was obtained. The product showed a single band in electrophoresis, and the purified enzyme solution was desalted by gel filtration and freeze-dried to obtain 2.4 mg of enzyme powder. The specific activity was 4.58 U / mg, and the activity yield was 1.57%.

【００２１】このようにして精製されたラクトン加水分
解酵素の性質を以下に示す。 （１）酵素活性測定法：酵素活性の測定は下記条件で１
分間に１μｍｏｌのＤ−パントラクトンを加水分解する
酵素活性を１単位（Ｕ）とする。Ｄ−パントラクトン１
９．２μｍｏｌを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂ
ｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）の酵素溶液１２５μｌを、３
０℃で６０分間反応させた後、反応終了液をＨＰＬＣ
（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ５Ｃ１８ ４．６ｘ１５０ｍ
ｍ、溶離液１０％メタノール、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、検
出波長２３０ｎｍ）を用いて加水分解率を求め、酵素活
性を算出する。 （２）精製酵素の比活性：４．５８Ｕ／ｍｇ蛋白質 （３）分子量：ゲル濾過法（ＴＳＫ Ｇ−３０００ Ｓ
Ｗ）を用いて測定した場合は１５８，０００、ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて測定した場合
は７４，５００であった。このことから本酵素は分子量
７４，５００のサブユニット２個からなる二量体蛋白で
あると考えられる。The properties of the lactone hydrolase thus purified are shown below. (1) Enzyme activity measurement method : Enzyme activity is measured under the following conditions.
The enzyme activity for hydrolyzing 1 μmol of D-pantolactone per minute is defined as 1 unit (U). D-Pantolactone 1
0.1 M Tris-HCl b containing 9.2 μmol
buffer (pH 7.4) enzyme solution (125 μl)
After reacting at 0 ° C for 60 minutes,
(Nucleosil 5C18 4.6x150m
m, eluent 10% methanol, flow rate 1 ml / min, detection wavelength 230 nm) to determine the hydrolysis rate and calculate the enzyme activity. (2) Specific activity of purified enzyme : 4.58 U / mg protein (3) Molecular weight : gel filtration method (TSK G-3000 S)
W) was 158,000, and when measured using SDS polyacrylamide gel electrophoresis, it was 74,500. From this, it is considered that this enzyme is a dimeric protein consisting of two subunits having a molecular weight of 74,500.

【００２２】（４）至適ｐＨ：７．０ （５）ｐＨ安定性：５．０〜１１．５ （６）温度安定性：５０℃まで安定 （７）至適温度：３０℃ （８）基質特異性：Ｄ−パントラクトン（Ｋｍ：１５７
ｍＭ）に特異的に作用し、Ｌ−パントラクトンには作用
しない。その他、Ｄ−ガラクトノラクトン（Ｋｍ：１５
ｍＭ）、Ｌ−マンノノラクトン（Ｋｍ：７６．５ｍ
Ｍ）、Ｌ−リボノラクトン（Ｋｍ：５１．８ｍＭ）及び
Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（Ｋｍ：１９１ｍＭ）にも
作用する。さらに、ジヒドロクマリン（Ｋｍ：８．９５
ｍＭ）、２−クマラノン（Ｋｍ：１０．１ｍＭ）及び３
−イソクロマノン（Ｋｍ；４．５７ｍＭ）にも作用す
る。ただし、Ｋｍはミカエリス定数を表す。 （９）阻害剤：本酵素は Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Fe
³⁺, Al³⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Sn²⁺などの重金属イオンによっ
て活性を阻害される。また本酵素は４ｍＭのＤＴＮＢ、
ＥＤＴＡによって完全に阻害される。(4) Optimum pH : 7.0 (5) pH stability : 5.0 to 11.5 (6) Temperature stability : stable up to 50 ° C. (7) Optimum temperature : 30 ° C. (8) Substrate specificity : D-pantolactone (Km: 157
mM) and does not act on L-pantolactone. In addition, D-galactonolactone (Km: 15
mM), L-mannonolactone (Km: 76.5 m
M), L-ribonolactone (Km: 51.8 mM) and D-glucono-δ-lactone (Km: 191 mM). Further, dihydrocoumarin (Km: 8.95)
mM), 2-coumaranone (Km: 10.1 mM) and 3
-It also acts on isochromanone (Km; 4.57 mM). Here, Km represents a Michaelis constant. (9) Inhibitor : This enzyme is composed of Zn ²⁺ , Cu ²⁺ , Ni ²⁺ , Cd ²⁺ , Fe
^Its activity is inhibited by heavy metal ions such as ³⁺ , Al ³⁺ , Hg ²⁺ , Pb ²⁺ and Sn ²⁺ . This enzyme is 4 mM DTNB,
Completely inhibited by EDTA.

【００２３】第１図には、本発明の酵素のＤ−パントラ
クトン加水分解酵素活性における温度およびｐＨとの関
係が示してある。第１図に示してある酵素活性と温度と
の関係のデータは、各温度で０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）中、６０分間酵素反応
をおこなった結果得られたものである。また、第１図に
示してある酵素活性とｐＨとの関係のデータは、各ｐＨ
緩衝液で３０℃、６０分間酵素反応をおこなった結果得
られたものである。第２図には本発明の酵素活性の温度
安定性およびｐＨ安定性についての結果が示してある。
該温度安定性のデータについては、酵素を０．１Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）中各温度
で３０分間処理後、酵素反応をおこなった結果得られた
ものである。また該ｐＨ安定性のデータについては、酵
素を各ｐＨ緩衝液で３０℃、３０分間処理後、酵素反応
をおこなった結果得られたものである。本発明の酵素活
性に対する金属イオンの阻害活性については第３図にそ
の結果が示してある。該阻害活性のデータは、各金属イ
オン４ｍＭの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅ
ｒ（ｐＨ７．４）溶液で３０℃、６０分間処理後、酵素
反応をおこなった結果得られたものである。また本発明
のラクトン加水分解酵素のアミノ酸組成について解析し
た結果を第４図に示す。FIG. 1 shows the relationship between temperature and pH in the D-pantolactone hydrolase activity of the enzyme of the present invention. The data on the relationship between the enzyme activity and the temperature shown in FIG. 1 are 0.1 M Tris-HC at each temperature.
This is obtained as a result of performing an enzyme reaction in l buffer (pH 7.4) for 60 minutes. The data on the relationship between enzyme activity and pH shown in FIG.
This was obtained as a result of performing an enzyme reaction in a buffer at 30 ° C. for 60 minutes. FIG. 2 shows the results regarding the temperature stability and pH stability of the enzyme activity of the present invention.
For the temperature stability data, the enzyme was tested at 0.1 M T
It is obtained as a result of performing an enzyme reaction after treating for 30 minutes at each temperature in ris-HCl buffer (pH 7.4). The pH stability data was obtained by treating the enzyme with each pH buffer at 30 ° C. for 30 minutes and then performing an enzyme reaction. FIG. 3 shows the results of the inhibitory activity of metal ions on the enzyme activity of the present invention. The data of the inhibitory activity was obtained from a 0.1 mM Tris-HCl buffer containing 4 mM of each metal ion.
This was obtained as a result of performing an enzymatic reaction after treating with an r (pH 7.4) solution at 30 ° C. for 60 minutes. FIG. 4 shows the results of analyzing the amino acid composition of the lactone hydrolase of the present invention.

【００２４】実施例2 シゾフィラム コムネ ＩＦＯ ６５０４をグルコース
１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、コ
ーンスティープリカー０．５％の組成（ｐＨ６．０）を
有する培地５００ｍｌを含む２Ｌ振とうフラスコ１０本
に植菌し、２８℃で４日間振とう培養した。培養液を遠
心分離機で処理し、湿菌体２８０ｇを得た。得られた菌
体を実施例１と同様の処理をおこない、すなわち、硫安
分画、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムクロマトグラ
フィー、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４
Ｂカラムクロマトグラフィーをおこない、酵素濃縮液２
ｍｌ（２４Ｕ／ｍｌ）を得た。この酵素濃縮液２ｍｌに
１０％Ｄ，Ｌ−パントラクトン２ｍｌを加え、５％アン
モニア水でｐＨ７に中和しながら、３０℃で４時間反応
をおこなった。反応終了液を酢酸エチル８ｍｌで５回抽
出し、全酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、
濃縮をおこない、Ｌ−パントラクトン１０２ｍｇ（収
率：５１％、〔α〕_D ＋４３．２゜（Ｃ＝２、水））を
得た。一方、抽出後の水層は硫酸でｐＨ１に酸性化後、
１時間煮沸し、冷却後、酢酸エチル８ｍｌで５回抽出し
た。全酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、濃
縮をおこない、Ｄ−パントラクトン８６ｍｇ（収率：４
３％、〔α〕_D −４６．９゜（Ｃ＝２、水））を得た。 Example 2 A 2 L shaker containing 500 ml of a medium having a composition (pH 6.0) of 1% glucose, 0.5% polypeptone, 0.5% yeast extract, and 0.5% corn steep liquor was prepared by mixing Schizophyllum komune IFO 6504. The cells were inoculated into 10 flasks and shake-cultured at 28 ° C. for 4 days. The culture was treated with a centrifuge to obtain 280 g of wet cells. The obtained cells were treated in the same manner as in Example 1, that is, ammonium sulfate fractionation, DEAE Sephacel column chromatography, and Phenyl Sepharose CL-4.
Perform B column chromatography and concentrate enzyme concentrate 2
ml (24 U / ml). To 2 ml of the enzyme concentrate, 2 ml of 10% D, L-pantolactone was added, and the mixture was reacted at 30 ° C. for 4 hours while neutralizing to pH 7 with 5% aqueous ammonia. The reaction-terminated liquid was extracted five times with 8 ml of ethyl acetate, and the whole ethyl acetate layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate.
After concentration, 102 mg of L-pantolactone (yield: 51%, [α] _D +43.2 _D (C = 2, water)) was obtained. On the other hand, the aqueous layer after extraction is acidified to pH 1 with sulfuric acid,
The mixture was boiled for 1 hour, cooled, and extracted five times with 8 ml of ethyl acetate. After dehydrating the entire ethyl acetate layer with anhydrous sodium sulfate, the mixture was concentrated and 86 mg of D-pantolactone (yield: 4 mg / ml).
3%, [α] _D -46.9 ° (C = 2, water)).

【００２５】[0025]

【発明の効果】新規なラクトン加水分解酵素を用いるこ
とにより、ラクトン類を立体選択的に加水分解すること
ができ、特にはＤ−パントラクトンを酵素的に光学分割
して得ることができる。さらにはより効率よいＤ−パン
トラクトンの光学分割法を開発したり、ラクトン類の酵
素的な不斉加水分解の機構などをより詳しく解析する途
が開かれることとなる。EFFECT OF THE INVENTION By using a novel lactone hydrolase, lactones can be hydrolyzed stereoselectively, and in particular, D-pantolactone can be obtained by enzymatic optical resolution. Further, there will be a way to develop a more efficient optical resolution method of D-pantolactone and to analyze the mechanism of enzymatic asymmetric hydrolysis of lactones in more detail.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】第１図は本発明のラクトン加水分解酵素活性の
温度およびｐＨの関係を表す。FIG. 1 shows the relationship between the temperature and pH of the lactone hydrolase activity of the present invention.

【図２】第２図は本発明のラクトン加水分解酵素活性の
温度安定性およびｐＨ安定性について表す。FIG. 2 shows the temperature stability and pH stability of the lactone hydrolase activity of the present invention.

【図３】第３図は本発明のラクトン加水分解酵素活性に
対する金属イオンの阻害活性を表す。FIG. 3 shows the inhibitory activity of metal ions on the lactone hydrolase activity of the present invention.

【図４】第４図はラクトン加水分解酵素のアミノ酸組成
を表す。FIG. 4 shows the amino acid composition of a lactone hydrolase.

Claims (4)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 以下の理化学的性質を有する新規なラク
トン加水分解酵素； 作用 ラクトンに作用し、対応する酸を生成する： 基質特異性 Ｄ−パントラクトンを特異的に加水分解するが、Ｌ−パ
ントラクトンには作用しない： 至適ｐＨ及びｐＨ安定性 ｐＨ７．０付近で作用し、ｐＨ５．０以上で安定であ
る： 至適温度及び熱安定性 ３０℃付近で作用し、５０℃まで安定である：および 各種金属イオン、阻害剤の影響 Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Fe³⁺, Al³⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Sn
²⁺, DTNB, EDTAによって阻害される。1. A novel lactone hydrolase having the following physicochemical properties: Action Acts on lactones to produce the corresponding acids: Substrate specificity Specific hydrolysis of D-pantolactone, Does not act on pantolactone: Optimum pH and pH stability Works around pH 7.0 and is stable at pH 5.0 and above: Optimum temperature and thermal stability Works around 30 ° C and is stable up to 50 ° C Yes: and the effects of various metal ions and inhibitors Zn ²⁺ , Cu ²⁺ , Ni ²⁺ , Cd ²⁺ , Fe ³⁺ , Al ³⁺ , Hg ²⁺ , Pb ²⁺ , Sn
Inhibited by ²⁺ , DTNB and EDTA. 【請求項２】 シゾフィラム属に属し、請求項１記載の
酵素生産能を有する微生物を培養して、培養物より該酵
素を採取することを特徴とする新規なラクトン加水分解
酵素の製造法。2. A method for producing a novel lactone hydrolase, comprising culturing a microorganism belonging to the genus Schizophyllam and having the ability to produce an enzyme according to claim 1, and collecting the enzyme from the culture. 【請求項３】 請求項１記載の酵素を用い、パントラク
トンを含めたアルドン酸ラクトン類からなる群から選ば
れたラセミ体ラクトン化合物から、光学活性体を得るこ
とを特徴とするラセミ体ラクトン化合物の光学分割法。3. A racemic lactone compound obtained by using the enzyme according to claim 1 to obtain an optically active form from a racemic lactone compound selected from the group consisting of aldonic acid lactones including pantolactone. Optical resolution method. 【請求項４】 パントラクトンを含めたアルドン酸ラク
トン類からなる群から選ばれたラセミ体ラクトン化合物
に請求項１記載の酵素を作用させ、立体選択的に加水分
解し、次に未反応ラクトン化合物と水解物である酸とを
分離し、分離された水解物である酸をラクトン化せしめ
ることを特徴とするラセミ体ラクトン化合物の光学分割
法。4. A racemic lactone compound selected from the group consisting of aldonic acid lactones including pantolactone, the enzyme of claim 1 being acted on, and stereoselectively hydrolyzed, followed by unreacted lactone compound An optical resolution method for a racemic lactone compound, comprising separating a hydrolyzate and an acid as a hydrolyzate, and lactonizing the acid as a hydrolyzate.