JPH05328972A - Novel aminoacylase and its production - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide the novel aminoacylase excellent in its hydrolytic ability and synthetic ability, and to provide the method for producing the same. CONSTITUTION:Penicillium.funiculosum is cultured, and the new aminoacylase excellent in hydrolytic ability and in synthetic ability is separated and recovered from the culture product. The employment of the new aminoacylase permits the production of N-long chain acyl-amino acids, N-long chain acyl-peptides and N-long chain acyl-proteins at low costs.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、微生物由来の新規なア
ミノアシラーゼおよびその製造方法に関するものであ
る。詳しく述べると、本発明は、ペニシリウム (Penici
llium)属に属する微生物を培養して得られる新規なアミ
ノアシラーゼおよびその製造方法に関するものである。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a novel aminoacylase derived from a microorganism and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to Penicillium (Penicinium).
The present invention relates to a novel aminoacylase obtained by culturing a microorganism belonging to the genus llium) and a method for producing the same.

【０００２】[0002]

【従来の技術】一般にアミノアシラーゼとは、Ｎ−アシ
ルアミノ酸を有機酸とアミノ酸に加水分解する酵素であ
り、動物組織、植物、微生物に広く存在している。ま
た、アミノアシラーゼは、光学特異性が高く、Ｌ−アミ
ノ酸にのみ作用するので、従来はアミノ酸の光学分割な
どを目的としてＮ−アセチル−アミノ酸などの短鎖のＮ
−アシル−アミノ酸を光学特異的に加水分解するアミノ
アシラーゼについて多く報告されてきた。2. Description of the Related Art Generally, aminoacylase is an enzyme that hydrolyzes N-acyl amino acids into organic acids and amino acids, and is widely present in animal tissues, plants and microorganisms. Further, since aminoacylase has a high optical specificity and acts only on L-amino acids, conventionally, N-acetyl-amino acids and other short-chain N-amino acids have been used for the purpose of optical resolution of amino acids.
Many reports have been made on aminoacylases that optically hydrolyze -acyl-amino acids.

【０００３】また、近年、Ｎ−長鎖アシル−アミノ酸の
安全性や優れた生化学的分解性が確認され、さらにＮ−
長鎖アシル−アミノ酸は界面活性作用や殺菌作用等を有
しているため、石鹸、シャンプー、洗剤、乳化剤、抗菌
剤など幅広く用いられるようになり、様々な応用が注目
されている。これにともない、アミノアシラーゼを用い
たＮ−長鎖アシル−アミノ酸の加水分解およびその逆反
応のアミノアシラーゼを用いたＮ−長鎖アシル−アミノ
酸の合成等への応用が期待されている。In recent years, the safety and excellent biochemical degradability of N-long chain acyl-amino acids have been confirmed.
Since long-chain acyl-amino acids have a surface active action and a bactericidal action, they have been widely used in soaps, shampoos, detergents, emulsifiers, antibacterial agents, and various applications have been attracting attention. Accordingly, hydrolysis of N-long-chain acyl-amino acids using aminoacylase and its reverse reaction are expected to be applied to the synthesis of N-long-chain acyl-amino acids using aminoacylase.

【０００４】しかし、ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー (Journal of Biochemistry)、第９１巻１７３１
〜１７３８頁（１９８２年）にＮ−長鎖アシル−アミノ
酸を加水分解するアミノアシラーゼに関する報告が、ま
た、特開昭５７−１２９，６９６号にＮ−長鎖アシル−
アミノ酸の合成酵素であるアミノアシラーゼに関する報
告があるが、その数は非常に少なく、Ｎ−長鎖アシル−
アミノ酸を効率良く加水分解および合成できるアミノア
シラーゼは知られていない。However, Journal of Biochemistry, Vol. 91, 1731.
~ 1738 (1982) on aminoacylases that hydrolyze N-long chain acyl-amino acids, and JP-A-57-129,696 discloses N-long chain acyl-amino acids.
There are reports on aminoacylase, which is an amino acid synthase, but the number is very small, and N-long-chain acyl-
There is no known aminoacylase capable of efficiently hydrolyzing and synthesizing amino acids.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】従来、Ｎ−長鎖アシル
−アミノ酸を合成することができるアミノアシラーゼに
関する報告は少なく、特開昭５７−１２９，６９６にグ
ルタミン酸と各種脂肪酸の合成が報告されているが、３
日間の反応における合成率が５％以下と低く、また、他
のアミノ酸を用いた場合の報告はされていない。Heretofore, there have been few reports on aminoacylases capable of synthesizing N-long chain acyl-amino acids, and JP-A-57-129,696 reports synthesis of glutamic acid and various fatty acids. But 3
The synthesis rate in the reaction for a day was as low as 5% or less, and no case was reported when other amino acids were used.

【０００６】したがって、本発明の目的は、加水分解能
及び合成能の優れた新規なアミノアシラーゼおよびその
製造方法を提供することにある。Therefore, an object of the present invention is to provide a novel aminoacylase excellent in hydrolyzing ability and synthesizing ability and a method for producing the same.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、加水分解
能及び合成能の優れたアミノアシラーゼを生産する微生
物を求め、鋭意検討した。その結果、従来まで糸状菌で
は発見されていない長鎖アシル基に特異的に作用するア
ミノアシラーゼをペニシリウム (Penicillium)属に属す
る微生物が生産することを見出し、本発明を完成するに
至った。Means for Solving the Problems The present inventors have eagerly studied for a microorganism which produces an aminoacylase excellent in hydrolyzing ability and synthetic ability. As a result, they have found that a microorganism belonging to the genus Penicillium produces an aminoacylase that specifically acts on a long-chain acyl group, which has not been found in filamentous fungi until now, and completed the present invention.

【０００８】本発明のアミノアシラーゼは、次の理化学
的性質を有している。The aminoacylase of the present invention has the following physicochemical properties.

【０００９】１）作用 Ｎ−長鎖アシル−アミノ酸に作用し、Ｌ−アミノ酸を遊
離させる。1) Action It acts on N-long chain acyl-amino acids to liberate L-amino acids.

【００１０】２）基質特異性 炭素数４以上のアシル基を有するＮ−アシル−アミノ酸
のＬ体に作用し、Ｄ体には作用しない。アシル基に対す
る特異性は広く、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、芳香族カ
ルボン酸からなるＮ−アシル化合物に作用する。2) Substrate specificity It acts on the L-form of N-acyl-amino acid having an acyl group having 4 or more carbon atoms and does not act on the D-form. It has a wide range of specificity for acyl groups and acts on N-acyl compounds composed of saturated fatty acids, unsaturated fatty acids, and aromatic carboxylic acids.

【００１１】３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性 Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を基質としたときの
至適ｐＨは、３０℃、各種緩衝液（ｐＨ５．５〜６．
０：酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜８．０：リン酸緩衝液，
ｐＨ８．０〜９．５：ホウ酸−塩酸緩衝液、ｐＨ９．５
〜１１．０：炭酸緩衝液）中で約８．５である。同緩衝
液中、３０℃、５時間処理においてｐＨ６〜９まで安定
である。3) Optimum pH and pH stability When N-oleoyl-L-glutamic acid is used as a substrate, the optimum pH is 30 ° C. and various buffers (pH 5.5-6.
0: Acetate buffer, pH 6.0-8.0: Phosphate buffer,
pH 8.0-9.5: boric acid-hydrochloric acid buffer, pH 9.5
.About.11.0 in carbonate buffer). It is stable up to pH 6-9 in the same buffer solution at 30 ° C. for 5 hours.

【００１２】４）至適温度および熱安定性 Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を基質としたときの
至適温度は、リン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いて測定した
ところ、２５〜３５℃である。２０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８）中、４０℃、１５分処理において全く失
活せず、４５℃、１５分処理後の残存活性は約８０％で
ある。4) Optimum temperature and thermal stability The optimum temperature when N-oleoyl-L-glutamic acid was used as a substrate was 25 to 35 ° C. when measured using a phosphate buffer (pH 7). is there. It is not inactivated at all in 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8) at 40 ° C. for 15 minutes, and the residual activity after treatment at 45 ° C. for 15 minutes is about 80%.

【００１３】５）阻害剤の影響 パラクロロマーキュリーベンゾエートまたはジチオスレ
イトールにより阻害を受ける。5) Effect of inhibitors Parachloromercury benzoate or dithiothreitol inhibits the reaction.

【００１４】６）金属イオンの影響 Ｎｉ²⁺、Ｃｕ²⁺、Ｍｇ²⁺などによって活性化され、Ｈｇ
²⁺により阻害を受ける。6) Effect of metal ions Hg activated by Ni ²⁺ , Cu ²⁺ , Mg ^2+, etc.
^Inhibited by ²⁺ .

【００１５】７）サブユニットの分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動では分子量約４
８，０００。7) Molecular weight of subunit Molecular weight of about 4 by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
8,000.

【００１６】８）分子量 ゲル瀘過法では約１９２，０００。8) Molecular weight: Approximately 192,000 by gel filtration method.

【００１７】本発明はまた、ペニシリウム (Penicilliu
m)属に属する前記性質を有するアミノアシラーゼの生産
菌を培養し、該培養物から前記アミノアシラーゼを分
離、回収することを特徴とするアミノアシラーゼの製造
方法である。The present invention also relates to Penicillium (Penicilliu).
m) A method for producing aminoacylase, which comprises culturing an aminoacylase-producing bacterium belonging to the genus and having the above-mentioned properties, and separating and recovering the aminoacylase from the culture.

【００１８】さらに、本発明は、ペニシリウム (Penici
llium)属に属する前記アミノアシラーゼの生産能を有す
る菌株がペニシリウム・フニコロサム (penicillium fu
niculosum)であるアミノアシラーゼの製造方法である。Further, the present invention provides a Penicillium (Penicinium)
Lactobacillus sp., which has the ability to produce the above aminoacylase, is a penicillium funicolosam.
niculosum) aminoacylase.

【００１９】[0019]

【作用】本発明において使用される新規なアミノアシラ
ーゼは、微生物を用いて生産され、その生産菌としては
ペニシリウム (Penicillium)属に属し、上記性質を有す
る酵素を生産する能力を有していればよい。The novel aminoacylase used in the present invention is produced by using a microorganism, belongs to the genus Penicillium as a producing bacterium, and has the ability to produce an enzyme having the above properties. Good.

【００２０】本菌株は微工研条寄第３１７６号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３１７６）として寄託されており、その菌学
的性質は以下のとおりである。This strain is called Micro Engineering Kenjoyori No. 3176 (FER
It has been deposited as MBP-3176) and its mycological properties are as follows.

【００２１】（Ａ）各種培地における生育状態 （ａ）ツアペック培地 速やかに生育し、２５℃、７日間で直径３０〜４０ｍｍ
に達する。コロニーは、黄色の栄養菌糸体と灰色から黄
緑色の分生子柄の混在した緻密な菌糸層からなる。ま
た、コロニーの裏面は、ピンクから深紅色である。ま
た、形態学的性質は以下の通りである。(A) Growth state in various media (a) Tuapeck's medium Rapidly grows and has a diameter of 30 to 40 mm at 25 ° C. for 7 days.
Reach A colony consists of a dense mycelium layer in which yellow vegetative mycelium and gray to yellow-green conidiophore are mixed. The back side of the colony is pink to crimson. The morphological properties are as follows.

【００２２】分生子柄：気生菌糸から分枝している ２５〜４０×２．０〜３．０μｍ メトレ：５〜８本が輪生状となる １０〜１３×２．０〜３．０μｍ フィアライド：３〜６本が輪生状となる ほこ先形 １０〜１２×１．５〜２．５μｍ 分生子：亜球形〜楕円形で小さい 表面は滑面〜微細な粗面 ２．５〜３．５×２〜２．５μｍConidia peduncle: 25-40 × 2.0-3.0 μm branched from aerial hyphae Methre: 5-8 turns into a ring-shaped 10-13 × 2.0-3.0 μm Phialide: 3 to 6 are ring-shaped. Tip-shaped 10 to 12 × 1.5 to 2.5 μm Conidia: Subspherical to elliptical and small Surface is smooth to finely rough 2.5 to 3 0.5 × 2-2.5 μm

【００２３】（ｂ）麦芽エキス寒天培地 生育状態および形態学的性質は、ツアペック寒天培地の
ものとほぼ同様である。ただし、分生糸形成がツアペッ
ク寒天培地のものに比べて優れている。(B) Malt Extract Agar Medium The growth state and morphological properties are almost the same as those of Tuapeck agar medium. However, the silk formation is superior to that of Tuapec agar medium.

【００２４】（Ｂ）各生理的、生態的性質 ｐＨ：約６付近で、最良好な生育を示す 温度：５℃では生育はほとんど認められない 約２５〜３７℃で最適な生育が認められる。(B) Physiological and ecological properties pH: Approximately 6 shows the best growth. Temperature: Almost no growth is observed at 5 ° C. Optimal growth is observed at approximately 25 to 37 ° C.

【００２５】以上の菌学的性質を有する菌について同定
を行った結果、本菌株はペニシリウム (Penicillium)属
に属する菌株と同定された。また、本菌株を同属中の菌
株と比較すると、ペニシリウム・フニコロサム (penici
llium funiculosum)に近似していることがわかった。As a result of identification of a bacterium having the above-mentioned mycological properties, this strain was identified as a strain belonging to the genus Penicillium. In addition, comparing this strain with strains of the same genus, Penicillium funiculosum
llium funiculosum).

【００２６】本発明に用いる微生物としては、本菌株と
その変種、変異株に限定されるものではなく、上記性質
の酵素を有するものであればよい。The microorganism used in the present invention is not limited to the strain of the present invention and its variants and mutants as long as it has an enzyme having the above-mentioned properties.

【００２７】本発明の新規なアミノアシラーゼ生産菌
は、発酵学の分野で公知の情報に従って培養することが
できる。使用する培地としては炭素源、窒素源、無機物
およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成
培地または天然培地のいずれでも使用可能であり、液体
培地または固体培地を用いて培養することができる。具
体的には炭素源として、グルコース、フラクトース、マ
ルトース、ガラクトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖
蜜、廃糖蜜等の糖類、麦、米などの天然炭水化物、グリ
セロール、メタノール、エタノール等のアルコール類、
酢酸、グルコン酸、ピルビン酸、クエン酸等の脂肪酸
類、ノルマルパラフィン等の炭化水素類、グリシン、グ
ルタミン、アスパラギン等のアミノ酸類等の一般的な炭
素源より使用する微生物の資化性を考慮して、一種また
は二種以上選択して使用すればよい。窒素源としては、
肉エキス、ペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、ミ
ルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンステ
ィープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解
物等の有機窒素化合物、アンモニア、硝酸アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等のアンモニ
ウム塩、硝酸ナトリウム等の硝酸塩、尿素等の無機窒素
化合物より使用微生物の資化性を考慮して、一種または
二種以上選択して使用する。The novel aminoacylase-producing bacterium of the present invention can be cultured according to the information known in the field of fermentation. As a medium to be used, either a synthetic medium or a natural medium can be used as long as it contains an appropriate amount of carbon source, nitrogen source, inorganic substance and other nutrients, and can be cultured using a liquid medium or a solid medium. . Specifically, as a carbon source, glucose, fructose, maltose, galactose, starch, starch hydrolyzate, sugars such as molasses, molasses, natural carbohydrates such as wheat and rice, alcohols such as glycerol, methanol and ethanol,
Considering the assimilability of microorganisms to be used from common carbon sources such as fatty acids such as acetic acid, gluconic acid, pyruvic acid and citric acid, hydrocarbons such as normal paraffin, amino acids such as glycine, glutamine and asparagine. Then, one kind or two or more kinds may be selected and used. As a nitrogen source,
Organic nitrogen compounds such as meat extract, peptone, yeast extract, soy hydrolyzate, milk casein, casamino acid, various amino acids, corn steep liquor, other animal, plant, microbial hydrolysates, ammonia, ammonium nitrate, ammonium sulfate, chloride One or more of ammonium salts such as ammonium, nitrates such as sodium nitrate, and inorganic nitrogen compounds such as urea are selected in consideration of the assimilation of the microorganism used.

【００２８】また、本アミノアシラーゼを効率的に生産
させるために、誘導物質として、Ｎ−長鎖アシル−アミ
ノ酸であるアミソフトＣＳ−１１、ＬＳ−１１、ＧＳ−
１１、ＨＳ−１１（味の素（株））およびその類似物質
を一種または二種以上選択して使用することができる。In order to efficiently produce the present aminoacylase, N-long chain acyl-amino acids, Amisoft CS-11, LS-11 and GS-, are used as inducers.
11, HS-11 (Ajinomoto Co., Inc.) and similar substances can be used alone or in combination of two or more.

【００２９】さらに、無機塩として微量のマグネシウ
ム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、
銅、亜鉛等のリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩等より
一種または二種以上を選択して使用することができる。
また、必要に応じて植物油、界面活性剤等の消泡剤を添
加してもよい。Further, as inorganic salts, trace amounts of magnesium, manganese, calcium, sodium, potassium,
One or more selected from phosphates such as copper and zinc, hydrochlorides, sulfates and acetates can be used.
Moreover, you may add a defoaming agent, such as vegetable oil and surfactant, as needed.

【００３０】培養は前記培地成分を含有する液体培地中
で振盪培養、通気撹拌培養、連続培養などの通常の培養
法を用いて行うことができる。Culturing can be carried out in a liquid medium containing the above-mentioned medium components by using a usual culturing method such as shaking culture, aeration stirring culture, continuous culture and the like.

【００３１】培養条件は、培地の種類、培養法により適
宜選択すればよく、本菌株が増殖し、アミノアシラーゼ
を産生できる条件であれば特に問題はない。通常は、培
養開始時のｐＨを６ぐらいに調節し、２５〜３５℃の温
度条件下で培養することが望ましい。培養日数は５リッ
トルの三角フラスコを用いて培養を行う場合、４〜６日
が適当である。The culture conditions may be appropriately selected depending on the type of medium and the culture method, and there is no particular problem as long as the strain can grow and produce aminoacylase. Usually, it is desirable to adjust the pH at the start of culture to about 6 and culture under the temperature condition of 25 to 35 ° C. When culturing is carried out using a 5 liter Erlenmeyer flask, 4 to 6 days are suitable for culturing.

【００３２】以上のようにして、培養物中に生産蓄積さ
れたアミノアシラーゼは、次のような方法で採取、分取
することができる。The aminoacylase produced and accumulated in the culture as described above can be collected and fractionated by the following method.

【００３３】本アミノアシラーゼは菌体内に蓄積される
ので、培養終了後、菌体を瀘過、遠心分離等の方法で集
め、緩衝液等で菌体を洗浄後、例えば凍結融解処理、超
音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理等の物理
的手段、もしくはリゾチーム等の細胞壁溶解酵素処理の
ような生化学的処理もしくは界面活性剤との接触処理等
の化学的処理を単独または組み合わせて行うことにより
菌体を破砕し、アミノアシラーゼを抽出することができ
る。こうして得られた粗アミノアシラーゼは塩析、有機
溶媒による分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル瀘過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、色素クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
等のクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）および電気泳動等の手段を単独もしくは組
み合わせて用いて精製することができる。Since the aminoacylase of the present invention is accumulated in the cells, the cells are collected by a method such as filtration or centrifugation after the culture is completed, and the cells are washed with a buffer solution or the like, for example, freeze-thaw treatment or ultrasonic wave treatment. Physical treatment such as treatment, pressure treatment, osmotic pressure difference treatment, grinding treatment, etc., or biochemical treatment such as cell wall lysing enzyme treatment such as lysozyme or chemical treatment such as contact treatment with a surfactant alone or By carrying out in combination, the cells can be crushed and aminoacylase can be extracted. The crude aminoacylase thus obtained is subjected to salting out, fractional precipitation with an organic solvent, ion exchange chromatography,
Purification using gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography, dye chromatography, hydroxyapatite chromatography, affinity chromatography, etc., and high performance liquid chromatography (HPLC), etc., alone or in combination. You can

【００３４】その一例を挙げれば次の通りである。すな
わち、瀘過で集めた菌体をビード・ビーター (Bead-Bea
ter)（バイオスペック プロダクト (BIOSPEC PRODUCT
S) 社製）を用いて磨砕処理し、アミノアシラーゼ抽出
液を得、その後、硫安を用いた塩析処理、ＤＥＡＥ−ト
ヨパール６５０Ｍイオン交換クロマトグラフィー、トヨ
パールＨＷ５５Ｆゲル瀘過クロマトグラフィー、ブチル
（ＢＵＴＨＹＬ）−トヨパール６５０Ｍ疎水クロマトグ
ラフィー、トヨパールＨＷ５５Ｆゲル瀘過クロマトグラ
フィーを行うことによって、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動的に単一に精製することができる。An example thereof is as follows. That is, the bacterial cells collected by filtration are bead beater (Bead-Bea
ter) (Biospec product (BIOSPEC PRODUCT
S)) to obtain an aminoacylase extract, and then salting out with ammonium sulfate, DEAE-Toyopearl 650M ion exchange chromatography, Toyopearl HW55F gel filtration chromatography, butyl (BUTHYL). ) -Toyopearl 650M hydrophobic chromatography and Toyopearl HW55F gel filtration chromatography can be used to perform a single purification by polyacrylamide gel electrophoresis.

【００３５】なお、本アミノアシラーゼの活性測定法
は、１０ｍＭ Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を含
んだ１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）２５０μｌに蒸
留水２００μｌを加え、３０℃において５分間インキュ
ベートした後、酵素液５０μｌを加え、１５分間反応さ
せ、生成したＬ−グルタミン酸をニンヒドリン−ヒドリ
ンダンチン法（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー (Journal ofBiological Chemistry)、第２
１１巻、９０７頁（１９５７））に従って測定した。な
お、１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＬ−グルタミン酸の
生成を触媒する酵素量とした。The aminoacylase activity was measured by adding 200 μl of distilled water to 250 μl of 100 mM phosphate buffer (pH 7) containing 10 mM N-oleoyl-L-glutamic acid and incubating at 30 ° C. for 5 minutes. Then, 50 μl of enzyme solution was added and reacted for 15 minutes, and the produced L-glutamic acid was treated with the ninhydrin-hydrindantine method (Journal of Biological Chemistry, No. 2).
Vol. 11, p. 907 (1957)). Note that 1 U was the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 μmol of L-glutamic acid in 1 minute.

【００３６】[0036]

【実施例】つぎに、実施例により本発明を説明するが、
これらにより本発明の範囲がなんら制限されるものでな
いことはいうまでもない。なお、下記実施例におけるパ
ーセンテージは、特にことわらない限り「重量％」を意
味する。EXAMPLES Next, the present invention will be explained with reference to examples.
It goes without saying that the scope of the present invention is not limited by these. In addition, the percentage in the following examples means "wt%" unless otherwise specified.

【００３７】実施例１ 培養組成ペプトン２．０％、グルコース ０．５％、Ｎ
Ｈ₄ ＮＯ₃ ０．３％、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．４％、Ｋ₂
ＨＰＯ₄ ０．１％、ＮａＣｌ ０．１％、ＭｇＳＯ₄
０．０２％からなるｐＨ６の培地６０ｍｌを５００ｍ
ｌ容量の坂口フラスコに入れ、ペニシリウム・フニコロ
サム (penicillium funiculosum)の一白金耳を接種し、
３０℃で４８時間培養し、種培養液を得た。上記の培養
組成のものに０．５％アミソフトＧＳ−１１（味の素
（株））を加え、ｐＨ６に調製した培地１リットルを５
リットル容量の三角フラスコに入れ、これに種培養液６
０ｍｌを加え、約１２０時間培養した。計９リットルの
本培養を行い、培養終了後、吸引瀘過により得た菌体約
５７０ｇ（湿重量）を０．８５％ＮａＣｌ水溶液で洗浄
後、菌体の湿重量に対して５倍量の５０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８）に菌体を懸濁させ、４分間の磨砕処
理（ビード・ビーター (Bead-Beater)、バイオスペック
プロダクト (BIOSPEC PRODUCTS) 社製）により菌体を
破砕した。得られた菌体処理液を遠心分離（２０，００
０×ｇ、３０分間）し、アミノアシラーゼ抽出液を得
た。その結果、該アミノアシラーゼの総活性は、２０，
８１７Ｕ、比活性１．５Ｕ／ｍｇであった。なお、タン
パクの定量は、色素結合法に準じて行った。Example 1 Culture composition Peptone 2.0%, glucose 0.5%, N
H ₄ NO ₃ 0.3%, KH ₂ PO ₄ 0.4%, K ₂
HPO ₄ 0.1%, NaCl 0.1%, MgSO ₄
500 ml of 60 ml of 0.02% pH 6 medium
Place in a 1-volume Sakaguchi flask and inoculate with one platinum loop of penicillium funiculosum.
It was cultured at 30 ° C. for 48 hours to obtain a seed culture solution. 0.5% Amisoft GS-11 (Ajinomoto Co., Inc.) was added to the above culture composition to prepare 5 liters of a medium adjusted to pH 6.
Place in a liter Erlenmeyer flask and add seed culture 6
0 ml was added and the cells were cultured for about 120 hours. After a total of 9 liters of main culture was completed, about 570 g (wet weight) of the bacterial cells obtained by suction filtration were washed with 0.85% NaCl aqueous solution, and then 5 times the wet weight of the bacterial cells was added. The cells were suspended in 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8), and the cells were disrupted by a grinding treatment for 4 minutes (Bead-Beater, manufactured by Biopec Products). The obtained bacterial cell treatment liquid was centrifuged (20000).
(0 × g, 30 minutes) to obtain an aminoacylase extract. As a result, the total activity of the aminoacylase was 20,
The specific activity was 817 U and the specific activity was 1.5 U / mg. The protein was quantified according to the dye binding method.

【００３８】実施例２ 実施例１に準じて得られた粗アミノアシラーゼ抽出液を
硫安３０％飽和にし、セライトを用いて沈殿を除去し
た。得られた上澄み液を硫安８０％飽和にし、遠心分離
（１２，０００×ｇ、３０分間）により沈殿を回収し
た。該沈殿を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）に
溶解後、同緩衝液に対して透析した。その結果、該アミ
ノアシラーゼの総活性は２１，２８５Ｕ、比活性１０．
７Ｕ／ｍｇであった。Example 2 The crude aminoacylase extract obtained according to Example 1 was saturated with 30% ammonium sulfate and the precipitate was removed using Celite. The obtained supernatant was saturated with ammonium sulfate 80%, and the precipitate was recovered by centrifugation (12,000 × g, 30 minutes). The precipitate was dissolved in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8) and dialyzed against the same buffer. As a result, the total activity of the aminoacylase was 21,285 U and the specific activity was 10.
It was 7 U / mg.

【００３９】このアミノアシラーゼ溶液を同緩衝液で平
衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍに通過させ、ア
ミノアシラーゼを吸着させた後、同緩衝液で充分に洗浄
し、非吸着物質を除き、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの直線
的濃度勾配溶出法によりアミノアシラーゼを溶出した。
このアミノアシラーゼ活性画分を限外瀘過膜で濃縮後、
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）＋０．１ＭＮａ
Ｃｌで平衡化したトヨパールＨＷ５５Ｆを用いてゲル瀘
過を行った。得られたアミノアシラーゼ活性画分を硫安
２５％飽和にし、硫安２５％飽和の２０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したブチル（ＢＵＴＨＹ
Ｌ）−トヨパール６５０Ｍに通過させ、アミノアシラー
ゼを吸着させた後、同緩衝液で充分に洗浄し、非吸着物
質を除き、硫安２５〜０％飽和の直線的濃度勾配溶出法
によりアミノアシラーゼを溶出した。得られたアミノア
シラーゼ活性画分を限外瀘過膜で濃縮後、上記のトヨパ
ールＨＷ５５Ｆを用いて同様の操作でゲル瀘過を行っ
た。得られたアミノアシラーゼ活性画分を集めたとこ
ろ、総活性３，４９７Ｕ、比活性６２４．５Ｕ／ｍｇで
あった。また、この活性画分をポリアクリルアミドゲル
電気泳動に供したところ、該アミノアシラーゼは単一の
バンドを示したことより、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動的に単一に精製されたことが分かった。精製の結果
を表１に示す。This aminoacylase solution was passed through DEAE-Toyopearl 650M equilibrated with the same buffer solution to adsorb aminoacylase, and then thoroughly washed with the same buffer solution to remove non-adsorbed substances, and then 0 to 0. Aminoacylase was eluted by a linear gradient elution method with 5 M NaCl.
After concentrating this aminoacylase active fraction with an ultrafiltration membrane,
20 mM Tris-HCl buffer (pH 8) + 0.1 M Na
Gel filtration was performed using Toyopearl HW55F equilibrated with Cl. The obtained aminoacylase active fraction was saturated with 25% ammonium sulfate and equilibrated with 20 mM tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8) saturated with 25% ammonium sulfate (BUTHY).
L) -After passing through Toyopearl 650M to adsorb aminoacylase, it was thoroughly washed with the same buffer solution to remove non-adsorbed substances, and aminoacylase was eluted by a linear concentration gradient elution method of 25 to 0% ammonium sulfate saturation. did. The obtained aminoacylase active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane, and then gel filtration was performed by the same operation using the above Toyopearl HW55F. When the obtained aminoacylase active fractions were collected, the total activity was 3,497 U and the specific activity was 624.5 U / mg. Further, when this active fraction was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis, the aminoacylase showed a single band, indicating that it was purified to a single polyacrylamide gel electrophoresis. The results of purification are shown in Table 1.

【００４０】[0040]

【表１】 [Table 1]

【００４１】実施例３ 実施例２に準じて得られた精製アミノアシラーゼを用
い、前述した活性測定法（但し、１００ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７）の代わりに１００ｍＭホウ酸−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．５）を用いた）に従い、分解活性を比較し
た。Example 3 Using the purified aminoacylase obtained according to Example 2, a 100 mM boric acid-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.00) was used in place of the 100 mM phosphate buffer solution (pH 7) described above. 5) was used) and the decomposition activity was compared.

【００４２】その結果の例を表２、表３に示す。表２、
表３中の酵素活性は、Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン
酸に対する分解活性を１００とした相対活性（％）で表
した。Tables 2 and 3 show examples of the results. Table 2,
The enzyme activity in Table 3 was expressed as a relative activity (%) with the decomposition activity for N-oleoyl-L-glutamic acid as 100.

【００４３】[0043]

【表２】 [Table 2]

【００４４】[0044]

【表３】 [Table 3]

【００４５】実施例４ 実施例２に準じて得られた精製アミノアシラーゼを用
い、前述した活性測定法（但し、１００ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７）の代わりに１００ｍＭトリシン−塩酸緩衝
液（ｐＨ８．５）を用いた。また、反応時間を３０分と
した）に従い、各種金属イオン及び阻害剤の存在下で分
解活性を比較した。Example 4 Using the purified aminoacylase obtained according to Example 2, a 100 mM tricine-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.5) was used in place of the 100 mM phosphate buffer solution (pH 7) described above for the activity measurement method. ) Was used, and the reaction time was set to 30 minutes), and the decomposition activity was compared in the presence of various metal ions and an inhibitor.

【００４６】その結果の一例を表４に示す。表４中の酵
素活性は、無添加の分解活性を１００とした相対活性
（％）で表した。Table 4 shows an example of the result. The enzyme activity in Table 4 was expressed as a relative activity (%) with the degradation activity without addition as 100.

【００４７】[0047]

【表４】 [Table 4]

【００４８】実施例５ ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供したところ、
単一のバンドを示し、その分子量は約４８，０００であ
った。ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷを用いたゲル瀘過法
（移動層：０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７））では、分
子量は１９２，０００であった。但し、ホスホリラーゼ
ｂ（分子量９７，４００）、血清アルブミン（６５，４
００）、卵白アルブミン（４２，７００）、炭酸脱水酵
素（２９，０００）、トリプトファンインヒビター（２
０，１００）、α−ラクトアルブミン（１４，４００）
をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によるアミノア
シラーゼの分子量決定の標準物質とし、グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ（２９０，０００）、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ（１４２，０００）、エノラーゼ（６７，００
０）、アデニル酸キナーゼ（３２，０００）、チトクロ
ムＣ（１２，４００）をゲル瀘過によるアミノアシラー
ゼの分子量決定の標準物質とした。Example 5 When subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis,
It showed a single band with a molecular weight of about 48,000. According to the gel filtration method using TSK gel G3000SW (moving layer: 0.2 M phosphate buffer (pH 7)), the molecular weight was 192,000. However, phosphorylase b (molecular weight 97,400), serum albumin (65,4)
00), ovalbumin (42,700), carbonic anhydrase (29,000), tryptophan inhibitor (2)
0,100), α-lactalbumin (14,400)
Was used as a standard substance for determining the molecular weight of aminoacylase by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and glutamate dehydrogenase (290,000), lactate dehydrogenase (142,000), and enolase (67,00).
0), adenylate kinase (32,000), and cytochrome C (12,400) were used as standard substances for determining the molecular weight of aminoacylase by gel filtration.

【００４９】実施例６ 実施例２に準じて得られた精製アミノアシラーゼを用い
て、Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を基質をしたと
きの酵素の至適ｐＨ及びｐＨ安定範囲を測定した。Example 6 The purified aminoacylase obtained according to Example 2 was used to measure the optimum pH and pH stable range of the enzyme when N-oleoyl-L-glutamic acid was used as a substrate.

【００５０】その結果を図１及び図２に示す。図１にお
いて、活性測定は、３０℃で各種緩衝液（ｐＨ５．５〜
６．０：酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜８．０：リン酸緩衝
液，ｐＨ８．０〜９．５：ホウ酸−塩酸緩衝液、ｐＨ
９．５〜１１．０：炭酸緩衝液）を用いて行った。ま
た、活性は最高値における活性値を１００としたときの
相対活性（％）で表した。図２において、酵素液はｐＨ
３〜１１の各種緩衝液中においてインキュベートし、５
時間後に残存活性を測定した。活性はインキュベート前
の酵素の活性値を１００としたときの活性残存率（％）
で表した。The results are shown in FIGS. 1 and 2. In FIG. 1, activity is measured at 30 ° C. in various buffer solutions (pH 5.5-5.5).
6.0: Acetate buffer, pH 6.0 to 8.0: Phosphate buffer, pH 8.0 to 9.5: Boric acid-hydrochloric acid buffer, pH
9.5 to 11.0: carbonate buffer). The activity was expressed as a relative activity (%) when the activity value at the maximum value was 100. In Figure 2, the enzyme solution is pH
Incubate in various buffers 3-11 and
The residual activity was measured after a lapse of time. The activity is the residual activity rate (%) when the activity value of the enzyme before incubation is 100.
Expressed as

【００５１】また、前記精製アミノアシラーゼを用い
て、Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を基質としたと
きの酵素の至適温度と熱安定性を測定した。Using the purified aminoacylase, the optimum temperature and thermostability of the enzyme when N-oleoyl-L-glutamic acid was used as a substrate were measured.

【００５２】その結果を図３及び図４に示す。図３にお
いて活性測定は各温度において行った。また、活性は最
高値における活性値を１００としたときの相対活性
（％）で表した。図４において、横軸に示された各温度
で酵素液（２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８））を
１５分間処理した後、氷冷し、残存活性を測定した。活
性は、未処理の酵素の活性値を１００としたときの活性
残存率（％）で表した。The results are shown in FIGS. 3 and 4. In FIG. 3, the activity measurement was performed at each temperature. The activity was expressed as a relative activity (%) when the activity value at the maximum value was 100. In FIG. 4, the enzyme solution (20 mM Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8)) was treated for 15 minutes at each temperature shown on the horizontal axis, followed by cooling with ice and measuring the residual activity. The activity was represented by the residual activity rate (%) when the activity value of the untreated enzyme was 100.

【００５３】実施例７ 本アミノアシラーゼの合成能の一例を示す。８ｍｌ容量
のバイアルビンに、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．５）に溶かした３Ｍグリシン溶液：１ｍｌ、オレイ
ン酸：１００ｍｇ、酵素液：２０μｌ（２０Ｕ）を入
れ、４０℃、１２０ｒｐｍ（往復振盪）の条件下で１５
時間反応させた。反応終了後、塩酸で反応を止め、ホル
ヒ法によりＮ−オレオイル−グリシンを抽出し、ＨＰＬ
Ｃ（カラム：ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＦＬＣ−ＮＨ₂ 、移
動層：ヘキサン／２−プロパノール／１０％リン酸，９
５：５：０．１ｖ／ｖ／ｖ、検出：２０８ｎｍ）で定量
したところ、約３０ｍｇのＮ−オレオイル−グリシンの
合成が確認できた。Example 7 An example of the synthetic ability of the present aminoacylase will be shown. 0.1M Tris-HCl buffer (pH
8.5M) 3M glycine solution: 1 ml, oleic acid: 100 mg, enzyme solution: 20 μl (20 U) were added, and the mixture was placed under conditions of 40 ° C. and 120 rpm (reciprocal shaking).
Reacted for hours. After completion of the reaction, the reaction was stopped with hydrochloric acid, and N-oleoyl-glycine was extracted by the Horch method to obtain HPL.
C _{(Column: shim-pack FLC-NH 2} , mobile phase: hexane / 2-propanol / 10% phosphoric acid, 9
5: 5: 0.1 v / v / v, detection: 208 nm), the synthesis of about 30 mg of N-oleoyl-glycine was confirmed.

【００５４】[0054]

【発明の効果】以上述べたように、本発明は、前記のご
とき理化学的性質を有する新規のアミノアシラーゼ及び
ペニシリウム属の微生物によるアミノアシラーゼの製造
方法であるから、該アミノアシラーゼを用いることによ
り、Ｎ−長鎖アシル−アミノ酸、Ｎ−長鎖アシル−ペプ
チド、Ｎ−長鎖アシル−タンパク質の低コストでの生産
が可能となる。As described above, the present invention is a novel aminoacylase having the physicochemical properties as described above and a method for producing aminoacylase using a microorganism of the genus Penicillium. Therefore, by using the aminoacylase, It enables low-cost production of N-long-chain acyl-amino acids, N-long-chain acyl-peptides, and N-long-chain acyl-proteins.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 図１は、本発明で使用されるアミノアシラー
ゼの至適ｐＨを示すものである。FIG. 1 shows the optimum pH of aminoacylase used in the present invention.

【図２】 図２は、本発明で使用されるアミノアシラー
ゼのｐＨ安定性を示すものである。FIG. 2 shows pH stability of aminoacylase used in the present invention.

【図３】 図３は、本発明で使用されるアミノアシラー
ゼの至適温度を示すものである。FIG. 3 shows the optimum temperature of aminoacylase used in the present invention.

【図４】 図４は、本発明で使用されるアミノアシラー
ゼの熱安定性を示すものである。FIG. 4 shows the thermostability of aminoacylase used in the present invention.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 寺尾 純二 茨城県つくば市吾妻２丁目810−103 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Junji Terao 2-810-103 Azuma Tsukuba, Ibaraki

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 以下の理化学的性質を有するアミノアシ
ラーゼ １）作用 Ｎ−長鎖アシル−アミノ酸に作用し、Ｌ−アミノ酸を遊
離させる。 ２）基質特異性 炭素数４以上のアシル基を有するＮ−アシル−アミノ酸
のＬ体に作用し、Ｄ体には作用しない。アシル基に対す
る特異性は広く、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、芳香族カ
ルボン酸からなるＮ−アシル化合物に作用する。 ３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性 Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を基質としたときの
至適ｐＨは、３０℃、各種緩衝液（ｐＨ５．５〜６．
０：酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜８．０：リン酸緩衝液，
ｐＨ８．０〜９．５：ホウ酸−塩酸緩衝液、ｐＨ９．５
〜１１．０：炭酸緩衝液）中で約８．５である。同緩衝
液中、３０℃、５時間処理においてｐＨ６〜９まで安定
である。 ４）至適温度および熱安定性 Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を基質としたときの
至適温度は、リン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いて測定した
ところ、２５〜３５℃である。２０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８）中、４０℃、１５分処理において全く失
活せず、４５℃、１５分処理後の残存活性は約８０％で
ある。 ５）阻害剤の影響 パラクロロマーキュリーベンゾエートまたはジチオスレ
イトールにより阻害を受ける。 ６）金属イオンの影響 Ｎｉ²⁺、Ｃｕ²⁺、Ｍｇ²⁺などによって活性化され、Ｈｇ
²⁺により阻害を受ける。 ７）サブユニットの分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動では分子量約４
８，０００。 ８）分子量 ゲル瀘過法では約１９２，０００。1. An aminoacylase having the following physicochemical properties: 1) Action It acts on an N-long chain acyl-amino acid to liberate an L-amino acid. 2) Substrate specificity It acts on the L-form of N-acyl-amino acid having an acyl group having 4 or more carbon atoms and does not act on the D-form. It has a wide range of specificity for acyl groups and acts on N-acyl compounds composed of saturated fatty acids, unsaturated fatty acids, and aromatic carboxylic acids. 3) Optimum pH and pH stability When N-oleoyl-L-glutamic acid is used as a substrate, the optimum pH is 30 ° C and various buffer solutions (pH 5.5 to 6.
0: Acetate buffer, pH 6.0-8.0: Phosphate buffer,
pH 8.0-9.5: boric acid-hydrochloric acid buffer, pH 9.5
.About.11.0 in carbonate buffer). It is stable up to pH 6-9 in the same buffer solution at 30 ° C. for 5 hours. 4) Optimum temperature and thermal stability The optimum temperature when N-oleoyl-L-glutamic acid is used as a substrate is 25 to 35 ° C when measured using a phosphate buffer (pH 7). It is not inactivated at all in 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8) at 40 ° C. for 15 minutes, and the residual activity after treatment at 45 ° C. for 15 minutes is about 80%. 5) Effects of inhibitors Parachloromercury benzoate or dithiothreitol inhibits the reaction. 6) Effect of metal ions Hg activated by Ni ²⁺ , Cu ²⁺ , Mg ^2+, etc.
^Inhibited by ²⁺ . 7) Molecular weight of subunits Molecular weight of about 4 by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
8,000. 8) Molecular weight: about 192,000 by gel filtration method. 【請求項２】 ペニシリウム (Penicillium)属に属する
請求項１記載のアミノアシラーゼの生産菌を培養し、該
培養物から前記アミノアシラーゼを分離、回収すること
を特徴とするアミノアシラーゼの製造方法。2. A method for producing aminoacylase, which comprises culturing the aminoacylase-producing bacterium according to claim 1 belonging to the genus Penicillium, and separating and recovering the aminoacylase from the culture. 【請求項３】 ペニシリウム (Penicillium)属に属する
請求項１記載のアミノアシラーゼの生産能を有する菌株
がペニシリウム・フニコロサム (penicillium funiculo
sum)である請求項２記載のアミノアシラーゼの製造方
法。3. The strain having aminoacylase-producing ability according to claim 1, which belongs to the genus Penicillium, is a penicillium funiculo.
Sum), The method for producing an aminoacylase according to claim 2.