JP3917723B2 - Lactone hydrolase and process for producing the same - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラクトン類を立体選択的に加水分解する新規なラクトン加水分解酵素、その製造法及び該酵素を用いるラクトン類の光学分割法に関する。
【０００２】
【従来技術】
Ｄ−パントラクトンは、医学上または生理学上重要なビタミンとして有用なＤ−パントテン酸やパンテチンの製造における中間体として知られている。従来、Ｄ−パントラクトンは化学的に合成されたＤ，Ｌ−パントラクトンを光学分割することにより製造されている。
しかしながら、こうした化学的な光学分割法では、キニーネ、ブルシン等の高価な分割剤を用いなければならないし、Ｄ−パントラクトンの回収も容易でない等の欠点を有している。
一方、Ｄ，Ｌ−パントラクトンを酵素的不斉加水分解して光学分割する方法が提案されてきている。すなわち、特開昭５７−１５２８９５号及び特開昭６２−２９４０９２号に開示された方法は、Ｄ，Ｌ−パントラクトン中のＬ−体を選択的に不斉加水分解し、Ｄ−パントラクトンに富んだ処理液よりＤ−パントラクトンを分離して得るものである。しかしながら、この方法ではＬ−パントラクトンを完全に加水分解させないことには、光学純度の高いＤ−パントラクトンを得ることができないため、コストがかさみ、更に効率の良い方法とは言えない。また、基質濃度が低いばかりでなく、その反応速度も悪いという問題があり、実用的な方法とは言えない。
【０００３】
本発明者等はＤ，Ｌ−パントラクトンの不斉加水分解につき、鋭意研究をおこなった結果、特定の微生物を用いることにより、Ｄ，Ｌ−パントラクトン中のＤ−パントラクトンのみを選択的に不斉加水分解せしめることにより、Ｄ−パントイン酸を生成せしめ、そのＤ−パントイン酸を分離し、Ｄ−パントラクトンに変換することによって、Ｄ，Ｌ−パントラクトンから効率良くＤ−パントラクトンを取得し得ることを見出した。
すなわち、フサリウム属、シリンドロカルポン属、ジベレラ属、アスペルジラス属、ペニシリウム属、リゾプス属、ボルテラ属、グリオクラディウム属、ユーロティウム属、ネクトリア属、シゾフィラム属、ミロセシウム属、ノイロスポラ属、アクリモニウム属、ツベルクリナ属、アブシジア属、スポロスリクス属、バーティシリウム属またはアルスロダーマ属に属する微生物より選ばれたラクトン加水分解能を有する微生物を用いてＤ，Ｌ−パントラクトン中のＤ−パントラクトンを選択的に不斉加水分解せしめることにより、Ｄ−パントイン酸を生成せしめ、そのＤ−パントイン酸を分離し、Ｄ−パントラクトンに変換することを特徴とするＤ−パントラクトン製造法を提供することに成功したものであり、前述のＤ，Ｌ−パントラクトン中のＬ−パントラクトンを選択的に不斉加水分解する方法に比べ、基質濃度をかなり高くできること及び反応時間を短く設定できること、更に光学純度の極めて高いＤ−パントラクトンを得ることができる等多くの長所を有するものである（特開平３−６５１９８号）。
【０００４】
更に、本発明者らは上記特定の微生物より、Ｄ−パントラクトンを特異的に加水分解する新規な酵素、すなわち、Ｄ−パントラクトン加水分解酵素を採取することに成功し、その諸性質を明らかにし、上記した属に属する微生物による該酵素の製造法を提供してきた（特開平４−１４４６８１号）。
より効率よいＤ−パントラクトンの光学分割法を開発するためには、ラクトン類の酵素的な不斉加水分解の機構などをより詳しく解析する必要があるが、こうした目的のためには別の種類のＤ−パントラクトン加水分解酵素の有無を調査することや、もしそういった加水分解酵素が存在するとしてその性状についての解明が求められる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、鋭意研究をおこなった結果、特開平４−１４４６８１号公報に記載した属に属する微生物のあるものが、既に明らかにしたＤ−パントラクトン加水分解酵素に加え、さらに別の種類のＤ−パントラクトン加水分解酵素を産生することを見いだした。すなわち、シゾフィラム属のラクトンを特異的に加水分解する微生物を培養し、その培養体から新規なラクトン加水分解酵素を得ることに成功した。
【０００６】
かくして、本発明は、
〔１〕 以下の理化学的性質を有する新規なラクトン加水分解酵素；
▲１▼作用
ラクトンに作用し、対応する酸を生成する：
▲２▼基質特異性
Ｄ−パントラクトンを特異的に加水分解するが、Ｌ−パントラクトンには作用しない：
▲３▼至適ｐＨ及びｐＨ安定性
ｐＨ７．０付近で作用し、ｐＨ５．０以上で安定である：
▲４▼至適温度及び熱安定性
３０℃付近で作用し、５０℃まで安定である：
および
▲５▼各種金属イオン、阻害剤の影響
Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Fe³⁺, Al³⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Sn²⁺, DTNB（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））, EDTA（エチレンジアミン四酢酸）によって阻害される；
【０００７】
〔２〕 シゾフィラム属に属し、上記〔１〕記載の酵素生産能を有する微生物を培養して、培養物より該酵素を採取することを特徴とする新規なラクトン加水分解酵素の製造法；
〔３〕 上記〔１〕記載の酵素を用い、パントラクトンを含めたアルドン酸ラクトン類からなる群から選ばれたラセミ体ラクトン化合物から、光学活性体を得ることを特徴とするラセミ体ラクトン化合物の光学分割法；
〔４〕 パントラクトンを含めたアルドン酸ラクトン類からなる群から選ばれたラセミ体ラクトン化合物に上記〔１〕記載の酵素を作用させ、立体選択的に加水分解し、次に未反応ラクトン化合物と水解物である酸とを分離し、分離された水解物である酸をラクトン化せしめることを特徴とするラセミ体ラクトン化合物の光学分割法；
【０００８】
〔５〕 分子量がゲル濾過法（ＴＳＫ Ｇ−３０００ ＳＷ）を用いて測定した場合、おおよそ１５８，０００であることを特徴とする、上記〔１〕記載の酵素；及び
〔６〕 分子量がＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて測定した場合、おおよそ７４，５００であることを特徴とする、上記〔１〕記載の酵素を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、例えば、おおよそ１５８キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有するという点で、従来のＤ−パントラクトン加水分解酵素とは異なる理化学的性質を有する新規なラクトン加水分解酵素、シゾフィラム属に属する微生物から該酵素を製造する方法、さらには該酵素の用途に関する。
本発明の酵素の製造法について説明する。本発明において使用される微生物としては、シゾフィラム属に属し、前記記載の酵素生産能を有する微生物であれば、如何なるものであってもよく、公知の菌株で、例えば、大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２）の財団法人発酵研究所 (IFO)に寄託されている菌株、IFO 6504、IFO 6505などが挙げられる。
本発明においては、上記した菌株とその変種、変異種が特に好適に用いることができるが、もちろん他の微生物であっても、前記したラクトン加水分解酵素の生産能を有するものであれば何れのものも使用可能である。
さらに、上記した菌株の変異の一つには、突然変異によるものがあってよく、それは、例えば放射能や紫外線の照射、ニトロソグアニジン等の薬剤の適用等によって実現され、また遺伝子の組換えによってもそのような菌株の変異は可能である。
【００１０】
こうした微生物を用いて、本発明に従う新規なラクトン加水分解酵素を製造するに際しては、そのような微生物を培養し、その培養液中に目的とするラクトン加水分解酵素を蓄積せしめ、そして、それから分離採取されることとなる。本発明における微生物の培養は、一般微生物で採用される培養方法と同じ方法を使用することができ、好ましくは一般微生物の好気的培養で採用される培養方法と同じ方法が用いられる。こうした際の菌株を培養する培地は、液状であっても、固体状であってもよい。しかしながら、通常は、液体培地を使用するのが有利であり、好ましくは液体培地による振盪培養法あるいは通気攪拌培養法などを用いることができる。通常、工業的には一般に撹拌培養を採用する。用いられる培地としては、資化性を有するものであれば良く、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類（ミネラル）、必要に応じて微量栄養素（ビタミン類、アミノ酸、核酸塩基など）、微量金属及びその他の栄養素・微量金属を適当量含有する培地であるならば、合成培地及び天然培地の何れをも使用することができる。好ましくは市販の培地あるいは培地成分を利用する。
【００１１】
こうした培地に添加される炭素源としては、菌の生育のためには、炭水化物、例えば、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、澱粉、加工澱粉、澱粉誘導体、麦芽汁、デキストリン、アミロペクチン、アミロース、ショ糖、麦芽糖、グルコース、乳糖、ガラクトース、廃糖蜜等が用いられる。代表的な炭素源としては、グルコース、蔗糖（シュクロース）などの糖質、エタノール、グリセリンなどのアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸などの脂肪酸およびそのエステル類、菜種油、大豆油などの油類などが挙げられる。
さらに窒素源としては、コーン・スティープリカー、大豆粉、小麦ふすま、ペプトン、ポリペプトン、バクトトリプトンなどのカゼイン分解物、ソイトンなどの大豆タンパク質分解物、肉汁、肉エキス、カザミノ酸、魚肉エキス、フィシュミール、尿素、酵母エキス、乾燥酵母等の動物、植物、微生物由来の有機窒素源、グルタミン酸等のアミノ酸類、そして硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩や硝酸塩等の無機窒素化合物が、１種又は２種以上選択されて用いられる。代表的な窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーン・スティープリカー、ふすま、酵母エキスなどが挙げられる。また無機塩類としては、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、亜鉛塩、炭酸塩、酢酸塩などが挙げられ、例えば、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、炭酸ナトリウム、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄などが挙げられる。それら無機塩の１種又は２種以上が適宜に選択されて用いられ得る。代表的な無機塩類としては、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウムなどが挙げられる。その他、代表的な栄養素としては、麦芽エキス、肉エキスなどが挙げられる。培地原料としては、通常上記炭素源、窒素源、ミネラルなどを含むもの、例えば、肉汁、肉エキス、ペプトン（例えば、カゼインペプトン、ゼラチンペプトン、肉ペプトン、大豆ペプトン、プロテオーズペプトン（動物肉分解ペプトン）など）、酵母エキス、魚肉エキス、麦芽汁、麦芽エキス、馬鈴薯、麹汁などを用いる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン、パラアミノ安息香酸などが挙げられ、微量金属としては、鉄、銅、亜鉛などが挙げられる。
【００１２】
これら窒素源や無機塩の添加量としては、それは適宜に決定されることができる。微生物の培養は、当該微生物が生育するｐＨ領域であればいずれであってもよいが、一般に出発ｐＨ：３．０〜９．０、好ましくは５．５〜８．０において行われる。培養は、当該微生物が良好に生育する温度領域であればいずれであってもよいが、一般に１０〜５０℃程度、好ましくは２０〜３５℃程度の培養温度に保持して好気性条件下で、１０時間〜１０日間、好ましくは１〜７日間培養することにより行われる。上記条件以外であっても、微生物が生育し、目的とする酵素が生成する条件であれば特に制限されないのはいうまでもない。
こうして培養処理の結果、菌体内および／または培地中に生産され蓄積された目的とするラクトン加水分解酵素は、濾過あるいは遠心分離等の方法にて、菌体を分離し、必要に応じて、菌体を水あるいは緩衝液で洗浄し、得られた菌体を、必要に応じて、適量の緩衝液に懸濁し、乳鉢、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミルなどによる機械的な破砕処理を施して菌破砕物とした後、酵素液を得る。こうして得られた酵素液は、酵素単離の常法にしたがい処理されることができる。該酵素液は、必要に応じて、真空濃縮又は限外濾過膜を用いて濃縮し、液体酵素として、あるいは、凍結乾燥や噴霧乾燥法により、粉末化して採取することができる。
【００１３】
また、上記のように培養物から得られた本発明の酵素は、酵素精製の常法にしたがい処理されることができる。上記で得られた酵素液を、さらに例えばエタノール、アセトン、イソプロピルアルコール等の有機溶媒による沈殿などの処理、硫安、食塩等による塩析、減圧濃縮、透析、限外濾過、疎水クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ゲル濾過などによる吸着・脱離、ゲル分画法、等電点分画法、電気泳動法等の酵素精製の常法に従って処理することができる。それらの方法は単独でも、複数の方法を適宜組み合わせて用いてもよい。こうした方法により当該酵素の純化、精製を行うことができる。塩析法では、例えば、硫安を使用し、３０％〜１００％飽和画分として、好ましくは約４５％〜７０％飽和画分として、酵素を沈殿させて採取する。
【００１４】
また溶媒沈殿法では、例えば、５５％〜９５％エタノール中で、好ましくは６５％〜８５％エタノール中で、酵素を沈殿させて採取する。酵素の採取は、例えば、濾過あるいは遠心分離によりなされ、次に脱塩処理に付される。脱塩は、通常、透析あるいはセファデックス、バイオゲルなどを用いるゲル濾過法などによりなされうる。得られる酵素は、安定化剤などを加え、あるいは加えること無く、限外濾過濃縮、逆浸透濃縮、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥などの処理を加えることが可能であり、液体あるいは固体状のものとすることも可能である。
本発明では、粗酵素液としてそのまま使用することもできるし、必要に応じてさらに分離・精製して、精製酵素としてそれを用いることもできる。
菌体外の培養液中に蓄積する酵素については、菌体分離および菌体破砕の操作を省略する以外は上記と同様におこない、本発明の酵素を得ることができる。
本発明の酵素は、下記実施例で説明されているように容易に精製され、電気泳動的に均一なものにすることが可能である。
【００１５】
本発明の酵素の理化学的性質は以下の通りのものである：
▲１▼作用
ラクトンに作用し、対応する酸を生成する：
▲２▼基質特異性
Ｄ−パントラクトンを特異的に加水分解するが、Ｌ−パントラクトンには作用しない：
▲３▼至適ｐＨ及びｐＨ安定性
ｐＨ７．０付近で作用し、ｐＨ５．０以上で安定である：
▲４▼至適温度及び熱安定性
３０℃付近で作用し、５０℃まで安定である：
および
▲５▼各種金属イオン、阻害剤の影響
Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Fe³⁺, Al³⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Sn²⁺, DTNB, EDTAによって阻害される。
【００１６】
さらに、本発明の酵素の理化学的性質について、より詳しく説明すると以下の通りのデータが得られているものである：
▲１▼作用
ラクトンに作用し対応する酸を生成する
より詳しくは
（１）Ｄ−パントラクトンを立体選択的に加水分解し、Ｄ−パントイン酸を生成する：
（２）アルドン酸ラクトン類を立体選択的に加水分解し、芳香族ラクトン類も基質とする：
▲２▼基質特異性
Ｄ−パントラクトンを特異的に加水分解するが、Ｌ−パントラクトンには作用しない：
▲３▼ｐＨ安定性
ｐＨ５．０以上で安定である、
より詳しくはｐＨ５．０〜１１．５で安定である
（測定法：各ｐＨの０．１Ｍ濃度酵素緩衝溶液３２．５μｌを３０℃で３０分インキュベート後、Ｄ−パントラクトン１９．２μｍｏｌを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）の溶液９２．５μｌを加え、３０℃で６０分反応後、活性を測定）：
【００１７】
▲４▼至適ｐＨ
ｐＨ７．０付近で、より好適にはｐＨ７．０である
（測定法：Ｄ−パントラクトン１９．２μｍｏｌを含む各ｐＨの０．１Ｍ濃度酵素緩衝溶液１２５μｌを、３０℃で６０分反応後、活性を測定）：
▲５▼温度安定性
５０℃まで安定である
（測定法：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）の酵素溶液を各温度で３０分インキュベート後、Ｄ−パントラクトン１９．２μｍｏｌを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）の溶液１２．５μｌを加え、３０℃で６０分反応後、活性を測定）：
▲６▼至適温度
３０℃付近で作用し、より好適には３０℃である
（測定法：Ｄ−パントラクトン１９．２μｍｏｌを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）の酵素溶液１２５μｌを各温度で６０分反応後、活性を測定）：
▲７▼各種金属イオン、阻害剤の影響
Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Fe³⁺, Al³⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Sn²⁺, DTNB, EDTAによって阻害される：
および
▲８▼分子量
おおよそ１５８ｋＤａ、そしておおよそ７４．５ｋＤａの同一サブユニットからなるダイマー酵素であると考えてよい（ゲル濾過法（ＴＳＫ Ｇ−３０００ＳＷ）を用いて測定した場合はおおよそ１５８，０００であり、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて測定した場合はおおよそ７４，５００で、このことから本酵素は分子量７４，５００のサブユニット２個からなる二量体蛋白であると考えられる）。
【００１８】
なお、特開平４−１４４６８１号には、Ｄ−パントラクトンを選択的に加水分解する酵素が開示されているが、該文献に記載の酵素は、ゲル濾過を用いて測定した場合の分子量は１２５，０００で、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて測定した場合の分子量は６３，０００であることから、その酵素の分子量は６３，０００のサブユニット２個からなる二量体蛋白であるとされており、本発明の上記酵素は、特開平４−１４４６８１号の酵素とは明らかに異なる。また、特開平４−１４４６８１号の酵素は既に遺伝子配列が解明されており（ＷＯ９７／１０３４１）、そのアミノ酸組成は本発明の酵素のアミノ酸組成と明らかに違うことからも別種の異なる酵素であることが明らかである。
本発明の酵素を取り扱うにあたっては、例えば、社団法人日本生化学会編、「生化学実験講座５・酵素研究法（上）・（下）」、株式会社東京化学同人、1975年：“Methods in Enzymology", Academic press, New York の一連のシリーズを参考にすることができる。
【００１９】
【実施例】
以下実施例を挙げて本発明の酵素の製造例を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１
シゾフィラム コムネ ＩＦＯ ６５０４をグルコース１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、コーンスティープリカー０．５％の組成（ｐＨ６．０）を有する培地５００ｍｌを含む２Ｌ振とうフラスコ２０本に植菌し、２８℃で４日間振とう培養した。培養液を遠心分離機で処理し、湿菌体５９８ｇを得た。得られた菌体を０．１ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）８００ｍｌに懸濁し、ダイノミルで摩砕後、遠心分離により無細胞抽出液１０１５ｍｌを得た。この無細胞抽出液に硫酸アンモニウムを加え、２０％濃度溶液とし、遠心分離をおこない、上清液１０４７ｍｌを得た。この上清液を０．１ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）８０Ｌ中に２０時間透析をおこない、透析液１６００ｍｌを得た。
透析液を８００ｍｌに２分し、各々をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（３×４５ｃｍ）に負荷し、塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０→０．６Ｍ）で溶離し、酵素活性画分を各々６００ｍｌ得た。溶出した酵素活性画分を合わせた１２００ｍｌに塩化ナトリウム２８０ｇを加えて得られた溶液をＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂカラム（３×２０ｃｍ）に負荷し、塩化ナトリウムの直線濃度勾配（４→０Ｍ）で溶離し、酵素活性画分３１５ｍｌを得た。
【００２０】
得られた酵素活性画分３１５ｍｌをアミコンＹＭ−１０で限外濾過し、得られた酵素濃縮液２ｍｌをＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００カラム（１．６×６０ｃｍ）に負荷し、０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶離し、酵素活性画分３０ｍｌを得た。得られた酵素活性画分３０ｍｌを０．１ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）１２Ｌ中に２０時間透析をおこない、透析液をＭｏｎｏＱ ＨＲ１０／１０カラム（１×１０ｃｍ）に負荷し、塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０→１Ｍ）で溶離し、酵素活性画分４０ｍｌを得た。得られた酵素活性画分４０ｍｌに硫酸アンモニウム１０．６ｇを加えた溶液をＰｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ１０／１０（１×１０ｃｍ）カラムに負荷し、硫酸アンモニウムの直線濃度勾配（２→０Ｍ）で溶離し精製酵素溶液１０．５ｍｌを得た。このものは電気泳動において単一バンドを示し、この精製酵素溶液をゲル濾過による脱塩後、凍結乾燥し、酵素粉末２．４ｍｇを得た。比活性は４．５８Ｕ／ｍｇ、活性収率１．５７％であった。
【００２１】
このようにして精製されたラクトン加水分解酵素の性質を以下に示す。
（１）酵素活性測定法：
酵素活性の測定は下記条件で１分間に１μｍｏｌのＤ−パントラクトンを加水分解する酵素活性を１単位（Ｕ）とする。
Ｄ−パントラクトン１９．２μｍｏｌを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）の酵素溶液１２５μｌを、３０℃で６０分間反応させた後、反応終了液をＨＰＬＣ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ５Ｃ１８ ４．６ｘ１５０ｍｍ、溶離液１０％メタノール、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２３０ｎｍ）を用いて加水分解率を求め、酵素活性を算出する。
（２）精製酵素の比活性：４．５８Ｕ／ｍｇ蛋白質
（３）分子量：
ゲル濾過法（ＴＳＫ Ｇ−３０００ ＳＷ）を用いて測定した場合は１５８，０００、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて測定した場合は７４，５００であった。このことから本酵素は分子量７４，５００のサブユニット２個からなる二量体蛋白であると考えられる。
【００２２】
（４）至適ｐＨ：７．０
（５）ｐＨ安定性：５．０〜１１．５
（６）温度安定性：５０℃まで安定
（７）至適温度：３０℃
（８）基質特異性：
Ｄ−パントラクトン（Ｋｍ：１５７ｍＭ）に特異的に作用し、Ｌ−パントラクトンには作用しない。その他、Ｄ−ガラクトノラクトン（Ｋｍ：１５ｍＭ）、Ｌ−マンノノラクトン（Ｋｍ：７６．５ｍＭ）、Ｌ−リボノラクトン（Ｋｍ：５１．８ｍＭ）及びＤ−グルコノ−δ−ラクトン（Ｋｍ：１９１ｍＭ）にも作用する。さらに、ジヒドロクマリン（Ｋｍ：８．９５ｍＭ）、２−クマラノン（Ｋｍ：１０．１ｍＭ）及び３−イソクロマノン（Ｋｍ；４．５７ｍＭ）にも作用する。ただし、Ｋｍはミカエリス定数を表す。
（９）阻害剤：
本酵素は Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Fe³⁺, Al³⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Sn²⁺などの重金属イオンによって活性を阻害される。また本酵素は４ｍＭのＤＴＮＢ、ＥＤＴＡによって完全に阻害される。
【００２３】
第１図には、本発明の酵素のＤ−パントラクトン加水分解酵素活性における温度およびｐＨとの関係が示してある。第１図に示してある酵素活性と温度との関係のデータは、各温度で０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）中、６０分間酵素反応をおこなった結果得られたものである。また、第１図に示してある酵素活性とｐＨとの関係のデータは、各ｐＨ緩衝液で３０℃、６０分間酵素反応をおこなった結果得られたものである。
第２図には本発明の酵素活性の温度安定性およびｐＨ安定性についての結果が示してある。該温度安定性のデータについては、酵素を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）中各温度で３０分間処理後、酵素反応をおこなった結果得られたものである。また該ｐＨ安定性のデータについては、酵素を各ｐＨ緩衝液で３０℃、３０分間処理後、酵素反応をおこなった結果得られたものである。
本発明の酵素活性に対する金属イオンの阻害活性については第３図にその結果が示してある。該阻害活性のデータは、各金属イオン４ｍＭの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）溶液で３０℃、６０分間処理後、酵素反応をおこなった結果得られたものである。
また本発明のラクトン加水分解酵素のアミノ酸組成について解析した結果を第４図に示す。
【００２４】
実施例 2
シゾフィラム コムネ ＩＦＯ ６５０４をグルコース１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、コーンスティープリカー０．５％の組成（ｐＨ６．０）を有する培地５００ｍｌを含む２Ｌ振とうフラスコ１０本に植菌し、２８℃で４日間振とう培養した。培養液を遠心分離機で処理し、湿菌体２８０ｇを得た。得られた菌体を実施例１と同様の処理をおこない、すなわち、硫安分画、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムクロマトグラフィー、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフィーをおこない、酵素濃縮液２ｍｌ（２４Ｕ／ｍｌ）を得た。
この酵素濃縮液２ｍｌに１０％Ｄ，Ｌ−パントラクトン２ｍｌを加え、５％アンモニア水でｐＨ７に中和しながら、３０℃で４時間反応をおこなった。反応終了液を酢酸エチル８ｍｌで５回抽出し、全酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、濃縮をおこない、Ｌ−パントラクトン１０２ｍｇ（収率：５１％、〔α〕_D ＋４３．２゜（Ｃ＝２、水））を得た。一方、抽出後の水層は硫酸でｐＨ１に酸性化後、１時間煮沸し、冷却後、酢酸エチル８ｍｌで５回抽出した。全酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、濃縮をおこない、Ｄ−パントラクトン８６ｍｇ（収率：４３％、〔α〕_D −４６．９゜（Ｃ＝２、水））を得た。
【００２５】
【発明の効果】
新規なラクトン加水分解酵素を用いることにより、ラクトン類を立体選択的に加水分解することができ、特にはＤ−パントラクトンを酵素的に光学分割して得ることができる。さらにはより効率よいＤ−パントラクトンの光学分割法を開発したり、ラクトン類の酵素的な不斉加水分解の機構などをより詳しく解析する途が開かれることとなる。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１図は本発明のラクトン加水分解酵素活性の温度およびｐＨの関係を表す。
【図２】第２図は本発明のラクトン加水分解酵素活性の温度安定性およびｐＨ安定性について表す。
【図３】第３図は本発明のラクトン加水分解酵素活性に対する金属イオンの阻害活性を表す。
【図４】第４図はラクトン加水分解酵素のアミノ酸組成を表す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel lactone hydrolase that stereoselectively hydrolyzes lactones, a method for producing the same, and a method for optical resolution of lactones using the enzyme.
[0002]
[Prior art]
D-pantolactone is known as an intermediate in the production of D-pantothenic acid and pantethine useful as medically or physiologically important vitamins. Conventionally, D-pantolactone is produced by optical resolution of chemically synthesized D, L-pantolactone.
However, such chemical optical resolution methods have disadvantages such as expensive resolution agents such as quinine and brucine must be used, and recovery of D-pantolactone is not easy.
On the other hand, a method of optical resolution by enzymatic asymmetric hydrolysis of D, L-pantolactone has been proposed. That is, the methods disclosed in JP-A-57-152895 and JP-A-62-294092 selectively asymmetrically hydrolyze the L-form in D, L-pantolactone to give D-pantolactone. It is obtained by separating D-pantolactone from a rich processing solution. However, in this method, since L-pantolactone is not completely hydrolyzed, D-pantolactone with high optical purity cannot be obtained, which is costly and cannot be said to be a more efficient method. In addition to the low substrate concentration, there is a problem that the reaction rate is low, which is not a practical method.
[0003]
As a result of intensive studies on the asymmetric hydrolysis of D, L-pantolactone, the present inventors have selectively used only D-pantolactone in D, L-pantolactone by using a specific microorganism. By asymmetric hydrolysis, D-pantoic acid is produced, and the D-pantoic acid is separated and converted to D-pantolactone, thereby efficiently obtaining D-pantolactone from D, L-pantolactone. I found out that I could do it.
That is, Fusarium genus, Cylindrocarpon genus, Gibberella genus, Aspergillus genus, Penicillium genus, Rhizopus sp. A microorganism having a lactone hydrolyzing ability selected from microorganisms belonging to the genus Tubercina, Absidia, Sporothrix, Verticillium or Arthroderma, and selectively deactivating D-pantolactone in D, L-pantolactone. Successful provision of a method for producing D-pantolactone characterized in that D-pantoic acid is produced by simultaneous hydrolysis, the D-pantoic acid is separated and converted to D-pantolactone And the aforementioned D, L-Panttract Compared with the method of selectively asymmetrically hydrolyzing L-pantolactone, the substrate concentration can be considerably increased, the reaction time can be set short, and D-pantolactone with extremely high optical purity can be obtained. (Japanese Patent Laid-Open No. 3-65198).
[0004]
Furthermore, the present inventors have succeeded in collecting a novel enzyme that specifically hydrolyzes D-pantolactone from the above-mentioned specific microorganisms, that is, D-pantolactone hydrolase, and reveals various properties thereof. And a method for producing the enzyme by a microorganism belonging to the above genus has been provided (Japanese Patent Laid-Open No. 4-144681).
In order to develop a more efficient optical resolution method for D-pantolactone, it is necessary to analyze in more detail the mechanism of enzymatic asymmetric hydrolysis of lactones. It is necessary to investigate the presence or absence of D-pantolactone hydrolase and to elucidate the nature of such hydrolase.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent research, the present inventors have found that some microorganisms belonging to the genus described in JP-A-4-144681 are in addition to the already-clarified D-pantolactone hydrolase. Of D-pantolactone hydrolase was found to be produced. That is, a microorganism that specifically hydrolyzes a lactone belonging to the genus Schizophyllum was cultured, and a novel lactone hydrolase was successfully obtained from the culture.
[0006]
Thus, the present invention
[1] A novel lactone hydrolase having the following physicochemical properties;
(1) Action
Acts on lactones to produce the corresponding acids:
(2) Substrate specificity
Specific hydrolysis of D-pantolactone but no effect on L-pantolactone:
(3) Optimum pH and pH stability
Acts near pH 7.0 and is stable above pH 5.0:
(4) Optimum temperature and thermal stability
Acts around 30 ° C and is stable up to 50 ° C:
and
(5) Effects of various metal ions and inhibitors
Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Fe³⁺, Al³⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Sn²⁺, DTNB (5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)), inhibited by EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid);
[0007]
[2] A novel method for producing a lactone hydrolase, comprising culturing a microorganism belonging to the genus Schizophyllum and having the enzyme-producing ability described in [1] above, and collecting the enzyme from the culture;
[3] A racemic lactone compound characterized in that an optically active substance is obtained from a racemic lactone compound selected from the group consisting of aldonic acid lactones including pantolactone using the enzyme described in [1] above. Optical resolution;
[4] A racemic lactone compound selected from the group consisting of aldonic acid lactones including pantolactone is allowed to act on the enzyme described in [1] above to effect stereoselective hydrolysis, and then an unreacted lactone compound and An optical resolution method for a racemic lactone compound, characterized by separating an acid as a hydrolyzate and lactonizing the acid as a separated hydrolyzate;
[0008]
[5] The enzyme according to [1] above, wherein the molecular weight is approximately 158,000 when measured using a gel filtration method (TSK G-3000 SW);
[6] The enzyme according to the above [1], wherein the molecular weight is approximately 74,500 when measured using SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is, for example, a novel lactone hydrolase, a microorganism belonging to the genus Schizophyllum, having physicochemical properties different from those of conventional D-pantolactone hydrolase in that it has a molecular weight of approximately 158 kilodaltons (kDa). The present invention relates to a method for producing the enzyme from the above, and further to the use of the enzyme.
The method for producing the enzyme of the present invention will be described. The microorganism used in the present invention may be any microorganism as long as it belongs to the genus Schizophyllum and has the above-described enzyme-producing ability, and is a known strain, for example, Jusohoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi. Examples include IFO 6504, IFO 6505, and other strains deposited at the Institute for Fermentation Research (IFO) of 2-chome 17:85 (postal code 532).
In the present invention, the above-mentioned strains and their variants and mutants can be particularly preferably used. Of course, any other microorganism can be used as long as it has the ability to produce the above-mentioned lactone hydrolase. Things can also be used.
Furthermore, one of the above-mentioned strain variations may be caused by mutation, which is realized by, for example, radioactivity, ultraviolet irradiation, application of a drug such as nitrosoguanidine, etc., or by gene recombination. It is possible to mutate such strains.
[0010]
In producing a novel lactone hydrolase according to the present invention using such a microorganism, such a microorganism is cultured, the target lactone hydrolase is accumulated in the culture solution, and then separated and collected. Will be. In the present invention, microorganisms can be cultured using the same method as that employed for general microorganisms, and preferably the same method as used for aerobic culture of general microorganisms. The medium for culturing the strain at this time may be liquid or solid. However, it is usually advantageous to use a liquid medium, and preferably a shaking culture method or an aeration and agitation culture method using a liquid medium can be used. Usually, industrially, stirring culture is generally employed. Any medium may be used as long as it has assimilability. For example, carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts (minerals), trace nutrients (vitamins, amino acids, nucleobases, etc.), trace metals as necessary. As long as the medium contains an appropriate amount of other nutrients and trace metals, either a synthetic medium or a natural medium can be used. A commercially available medium or medium component is preferably used.
[0011]
As a carbon source added to such a medium, for the growth of fungi, carbohydrates such as soluble starch, corn starch, potato starch, sweet potato starch, starch, modified starch, starch derivatives, malt juice, dextrin, amylopectin, Amylose, sucrose, maltose, glucose, lactose, galactose, waste molasses and the like are used. Typical carbon sources include sugars such as glucose and sucrose, alcohols such as ethanol and glycerin, fatty acids such as oleic acid and stearic acid and esters thereof, oils such as rapeseed oil and soybean oil. Is mentioned.
Further, nitrogen sources include corn steep liquor, soy flour, wheat bran, peptone, polypeptone, caseolytic products such as bactotripton, soy protein products such as soyton, gravy, meat extract, casamino acid, fish extract, fish Organic nitrogen sources such as meal, urea, yeast extract, dry yeast, etc., plants, microorganisms-derived organic nitrogen, amino acids such as glutamic acid, and inorganic nitrogen compounds such as ammonium salts and nitrates such as ammonium sulfate and ammonium phosphate, Two or more types are selected and used. Typical nitrogen sources include ammonium sulfate, sodium nitrate, peptone, casamino acid, corn steep liquor, bran, yeast extract and the like. Examples of inorganic salts include sodium salt, magnesium salt, potassium salt, phosphate salt, calcium salt, iron salt, manganese salt, zinc salt, carbonate salt, acetate salt, etc., for example, potassium phosphate, sodium phosphate , Magnesium sulfate, calcium chloride, sodium carbonate, ferrous chloride, ferric chloride, ferrous sulfate, ferric sulfate and the like. One or more of these inorganic salts can be appropriately selected and used. Typical inorganic salts include magnesium sulfate, sodium chloride, calcium carbonate, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and the like. Other typical nutrients include malt extract and meat extract. Examples of the medium raw material include those containing the above carbon source, nitrogen source, mineral, etc., for example, meat juice, meat extract, peptone (eg, casein peptone, gelatin peptone, meat peptone, soybean peptone, proteose peptone (animal meat degrading peptone) ), Etc.), yeast extract, fish meat extract, malt juice, malt extract, potato, soup, etc. are used. Examples of vitamins include biotin, thiamine, paraaminobenzoic acid, and examples of trace metals include iron, copper, and zinc.
[0012]
The addition amount of these nitrogen sources and inorganic salts can be appropriately determined. The microorganism can be cultured in any pH range in which the microorganism grows, but is generally performed at a starting pH of 3.0 to 9.0, preferably 5.5 to 8.0. The culture may be any temperature range in which the microorganism grows well, but is generally maintained at a culture temperature of about 10 to 50 ° C., preferably about 20 to 35 ° C. under aerobic conditions, It is carried out by culturing for 10 hours to 10 days, preferably 1 to 7 days. Needless to say, the conditions are not particularly limited as long as microorganisms grow and the target enzyme is produced.
As a result of the culture treatment, the target lactone hydrolase produced and accumulated in the cells and / or in the medium is separated by a method such as filtration or centrifugation. The body is washed with water or a buffer solution, and the obtained cells are suspended in an appropriate amount of buffer solution as necessary, and subjected to mechanical crushing using a mortar, ultrasonic crusher, French press, dynomill, etc. To obtain an enzyme solution. The enzyme solution thus obtained can be treated according to a conventional method for enzyme isolation. The enzyme solution can be collected by vacuum concentration or ultrafiltration membrane, if necessary, and pulverized as a liquid enzyme or by freeze drying or spray drying.
[0013]
Moreover, the enzyme of the present invention obtained from the culture as described above can be treated according to a conventional method for enzyme purification. The enzyme solution obtained above is further treated with an organic solvent such as ethanol, acetone, isopropyl alcohol, etc., salted out with ammonium sulfate, sodium chloride, vacuum concentration, dialysis, ultrafiltration, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, Can be processed according to conventional methods of enzyme purification such as chromatography, ion exchange chromatography, high performance liquid chromatography, adsorption / desorption by gel filtration, gel fractionation, isoelectric focusing, electrophoresis, etc. . These methods may be used alone or in combination of a plurality of methods as appropriate. By such a method, the enzyme can be purified and purified. In the salting-out method, for example, ammonium sulfate is used, and the enzyme is precipitated and collected as a 30% to 100% saturated fraction, preferably about 45% to 70% saturated fraction.
[0014]
In the solvent precipitation method, for example, the enzyme is precipitated and collected in 55% to 95% ethanol, preferably in 65% to 85% ethanol. The enzyme is collected, for example, by filtration or centrifugation, and then subjected to a desalting treatment. Desalting can be usually performed by dialysis or gel filtration using Sephadex, biogel, or the like. The resulting enzyme can be subjected to treatments such as ultrafiltration concentration, reverse osmosis concentration, reduced pressure drying, freeze drying, spray drying, etc., with or without the addition of stabilizers. It is also possible.
In the present invention, it can be used as a crude enzyme solution as it is, or it can be further separated and purified as necessary and used as a purified enzyme.
With respect to the enzyme accumulated in the culture solution outside the microbial cells, the enzyme of the present invention can be obtained in the same manner as described above except that the operation of microbial cell separation and microbial cell disruption is omitted.
The enzymes of the present invention can be easily purified and electrophoretically uniform as described in the examples below.
[0015]
The physicochemical properties of the enzyme of the present invention are as follows:
(1) Action
Acts on lactones to produce the corresponding acids:
(2) Substrate specificity
Specific hydrolysis of D-pantolactone but no effect on L-pantolactone:
(3) Optimum pH and pH stability
Acts near pH 7.0 and is stable above pH 5.0:
(4) Optimum temperature and thermal stability
Acts around 30 ° C and is stable up to 50 ° C:
and
(5) Effects of various metal ions and inhibitors
Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Fe³⁺, Al³⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Sn²⁺It is inhibited by DTNB and EDTA.
[0016]
Further, the physicochemical properties of the enzyme of the present invention will be described in more detail. The following data has been obtained:
(1) Action
Acts on lactone to produce corresponding acid
More details
(1) Stereoselective hydrolysis of D-pantolactone to produce D-pantoic acid:
(2) Stereoselective hydrolysis of aldonic acid lactones and aromatic lactones as substrates:
(2) Substrate specificity
Specific hydrolysis of D-pantolactone but no effect on L-pantolactone:
(3) pH stability
stable at pH 5.0 or higher,
More specifically, it is stable at pH 5.0 to 11.5.
(Measuring method: After incubating 32.5 μl of 0.1 M enzyme buffer solution of each pH at 30 ° C. for 30 minutes, 92.5 μl of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 19.2 μmol of D-pantolactone was added. In addition, the activity was measured after 60 minutes of reaction at 30 ° C):
[0017]
(4) Optimum pH
Near pH 7.0, more preferably pH 7.0
(Measuring method: Activity measured after reacting 125 μl of 0.1M enzyme buffer solution containing 19.2 μmol of D-pantolactone at 30 ° C. for 60 minutes):
(5) Temperature stability
Stable up to 50 ° C
(Measuring method: 0.1M Tris-HCl buffer (pH 7.4) enzyme solution was incubated at each temperature for 30 minutes, and then 0.1-M Tris-HCl buffer (pH 7.4) solution containing 19.2 μmol of D-pantolactone 12. 5 μl was added, and after 60 minutes of reaction at 30 ° C., the activity was measured):
(6) Optimum temperature
Acts near 30 ° C, more preferably 30 ° C
(Measuring method: Activity was measured after reacting 125 μl of an enzyme solution of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 19.2 μmol of D-pantolactone at each temperature for 60 minutes):
(7) Effects of various metal ions and inhibitors
Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Fe³⁺, Al³⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Sn²⁺, DTNB, inhibited by EDTA:
and
(8) Molecular weight
It may be considered a dimer enzyme consisting of approximately 158 kDa and approximately 74.5 kDa of the same subunit (approximately 158,000 when measured using gel filtration (TSK G-3000SW), SDS polyacrylamide gel) When measured using electrophoresis, it is approximately 74,500, which indicates that this enzyme is a dimeric protein consisting of two subunits having a molecular weight of 74,500).
[0018]
JP-A-4-144683 discloses an enzyme that selectively hydrolyzes D-pantolactone, but the enzyme described in this document has a molecular weight of 125 when measured using gel filtration. The molecular weight of the enzyme measured by SDS polyacrylamide gel electrophoresis is 63,000, and the molecular weight of the enzyme is a dimeric protein consisting of two subunits of 63,000. Thus, the enzyme of the present invention is clearly different from the enzyme disclosed in JP-A-4-144683. Moreover, the gene sequence of the enzyme disclosed in JP-A-4-144683 has already been elucidated (WO 97/10341), and its amino acid composition is clearly different from the amino acid composition of the enzyme of the present invention. Is clear.
In handling the enzyme of the present invention, for example, the Japan Biochemical Society, edited by “Biochemistry Experiment Course 5, Enzyme Research Method (top), (bottom)”, Tokyo Chemical Co., Ltd., 1975: “Methods in Enzymology” ", A series of Academic press, New York series.
[0019]
【Example】
EXAMPLES Examples of the production of the enzyme of the present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1
Schizophyllum commune IFO 6504 was planted in 20 2L shake flasks containing 500 ml of medium with 1% glucose, 0.5% polypeptone, 0.5% yeast extract and 0.5% corn steep liquor (pH 6.0). And cultured with shaking at 28 ° C. for 4 days. The culture solution was treated with a centrifuge to obtain 598 g of wet cells. The obtained bacterial cells were suspended in 800 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.1 mM dithiothreitol and 1 mM calcium chloride, ground with dynomill, and centrifuged to obtain 1015 ml of cell-free extract. . Ammonium sulfate was added to the cell-free extract to obtain a 20% concentration solution, and centrifuged to obtain 1047 ml of the supernatant. The supernatant was dialyzed for 20 hours in 80 L of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.1 mM dithiothreitol and 1 mM calcium chloride to obtain 1600 ml of dialysate.
The dialysate was divided into 800 ml for 2 minutes, each was loaded onto a DEAE Sephacel column (3 × 45 cm) and eluted with a linear concentration gradient of sodium chloride (0 → 0.6 M) to obtain 600 ml of enzyme activity fractions each. A solution obtained by adding 280 g of sodium chloride to 1200 ml of the combined enzyme activity fraction was loaded onto a Phenyl Sepharose CL-4B column (3 × 20 cm) and eluted with a linear concentration gradient of sodium chloride (4 → 0M). As a result, 315 ml of enzyme active fraction was obtained.
[0020]
315 ml of the obtained enzyme activity fraction was ultrafiltered with Amicon YM-10, and 2 ml of the resulting enzyme concentrate was loaded onto a Sephacryl S-200 column (1.6 × 60 cm) and washed with 0.2 M sodium chloride solution. Elution gave 30 ml of enzyme activity fraction. The obtained enzyme activity fraction (30 ml) was dialyzed for 20 hours in 12 L of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.1 mM dithiothreitol and 1 mM calcium chloride, and the dialyzed solution was added to a MonoQ HR10 / 10 column (1 × 10 cm) and eluted with a linear concentration gradient of sodium chloride (0 → 1 M) to obtain 40 ml of an enzyme activity fraction. A solution obtained by adding 10.6 g of ammonium sulfate to 40 ml of the obtained enzyme activity fraction was loaded on a Phenyl-Superose HR10 / 10 (1 × 10 cm) column, and eluted with a linear concentration gradient (2 → 0 M) of ammonium sulfate to obtain a purified enzyme solution 10.5 ml was obtained. This showed a single band in electrophoresis, and this purified enzyme solution was desalted by gel filtration and then lyophilized to obtain 2.4 mg of enzyme powder. The specific activity was 4.58 U / mg, and the activity yield was 1.57%.
[0021]
The properties of the lactone hydrolase thus purified are shown below.
(1)Enzyme activity measurement method:
Enzyme activity is measured with 1 unit (U) of enzyme activity that hydrolyzes 1 μmol of D-pantolactone per minute under the following conditions.
125 μl of an enzyme solution of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 19.2 μmol of D-pantolactone was reacted at 30 ° C. for 60 minutes, and then the reaction mixture was subjected to HPLC (Nucleosil 5C18 4.6 × 150 mm, elution) The hydrolysis rate is determined using a 10% methanol solution, a flow rate of 1 ml / min, and a detection wavelength of 230 nm, and the enzyme activity is calculated.
(2)Specific activity of purified enzyme: 4.58 U / mg protein
(3)Molecular weight:
When measured using gel filtration (TSK G-3000 SW), it was 158,000, and when measured using SDS polyacrylamide gel electrophoresis, it was 74,500. From this, this enzyme is considered to be a dimeric protein consisting of two subunits having a molecular weight of 74,500.
[0022]
(4)PH optimum: 7.0
(5)pH stability: 5.0 to 11.5
(6)Temperature stability: Stable up to 50 ° C
(7)Optimal temperature: 30 ° C
(8)Substrate specificity:
It specifically acts on D-pantolactone (Km: 157 mM) and does not act on L-pantolactone. In addition, D-galactonolactone (Km: 15 mM), L-mannonolactone (Km: 76.5 mM), L-ribonolactone (Km: 51.8 mM) and D-glucono-δ-lactone (Km: 191 mM) Also works. It also acts on dihydrocoumarin (Km: 8.95 mM), 2-coumaranone (Km: 10.1 mM) and 3-isochromanone (Km; 4.57 mM). Here, Km represents the Michaelis constant.
(9)Inhibitor:
This enzyme is Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Fe³⁺, Al³⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Sn²⁺The activity is inhibited by heavy metal ions such as This enzyme is completely inhibited by 4 mM DTNB and EDTA.
[0023]
FIG. 1 shows the relationship between temperature and pH in the D-pantolactone hydrolase activity of the enzyme of the present invention. The data on the relationship between enzyme activity and temperature shown in FIG. 1 is obtained as a result of carrying out an enzyme reaction for 60 minutes in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) at each temperature. The data on the relationship between enzyme activity and pH shown in FIG. 1 is obtained as a result of carrying out an enzyme reaction at 30 ° C. for 60 minutes with each pH buffer solution.
FIG. 2 shows the results of temperature stability and pH stability of the enzyme activity of the present invention. The temperature stability data was obtained as a result of enzyme reaction after treating the enzyme in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) at each temperature for 30 minutes. The pH stability data are obtained as a result of enzyme reaction after treating the enzyme with each pH buffer solution at 30 ° C. for 30 minutes.
The results of the inhibitory activity of metal ions on the enzyme activity of the present invention are shown in FIG. The inhibitory activity data is obtained as a result of carrying out an enzyme reaction after treatment with a 0.1 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) solution of 4 mM of each metal ion at 30 ° C. for 60 minutes.
Moreover, the result of having analyzed about the amino acid composition of the lactone hydrolase of this invention is shown in FIG.
[0024]
Example 2
Schizophyllum commune IFO 6504 was planted in 10 2L shake flasks containing 500 ml of medium with 1% glucose, 0.5% polypeptone, 0.5% yeast extract and 0.5% corn steep liquor (pH 6.0). And cultured with shaking at 28 ° C. for 4 days. The culture solution was treated with a centrifuge to obtain 280 g of wet cells. The obtained bacterial cells were treated in the same manner as in Example 1, that is, ammonium sulfate fractionation, DEAE Sephacel column chromatography, and Phenyl Sepharose CL-4B column chromatography to obtain 2 ml of enzyme concentrate (24 U / ml). It was.
2 ml of 10% D, L-pantolactone was added to 2 ml of this enzyme concentrate, and the reaction was carried out at 30 ° C. for 4 hours while neutralizing to pH 7 with 5% aqueous ammonia. The reaction-terminated liquid was extracted 5 times with 8 ml of ethyl acetate, and the entire ethyl acetate layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate and concentrated to give 102 mg of L-pantolactone (yield: 51%, [α])._D+ 43.2 ° (C = 2, water)). On the other hand, the aqueous layer after extraction was acidified to pH 1 with sulfuric acid, boiled for 1 hour, cooled, and extracted 5 times with 8 ml of ethyl acetate. The whole ethyl acetate layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate and concentrated, and 86 mg of D-pantolactone (yield: 43%, [α])._D-46.9 ° (C = 2, water)).
[0025]
【The invention's effect】
By using a novel lactone hydrolase, lactones can be stereoselectively hydrolyzed, and in particular, D-pantolactone can be obtained by enzymatic optical resolution. Furthermore, the development of a more efficient optical resolution method for D-pantolactone and the analysis of the mechanism of enzymatic asymmetric hydrolysis of lactones will be opened.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the relationship between temperature and pH of lactone hydrolase activity of the present invention.
FIG. 2 represents the temperature stability and pH stability of the lactone hydrolase activity of the present invention.
FIG. 3 shows the inhibitory activity of metal ions on the lactone hydrolase activity of the present invention.
FIG. 4 represents the amino acid composition of lactone hydrolase.

Claims (4)

以下の理化学的性質を有する新規なラクトン加水分解酵素；
(1)作用
ラクトンに作用し、対応する酸を生成する：
(2)基質特異性
Ｄ−パントラクトンを特異的に加水分解するが、Ｌ−パントラクトンには作用しない：
(3)至適pH及びpH安定性
至適pHは7.0で、pH5.0〜11.5で安定である：
(4)至適温度及び熱安定性
至適温度は３０℃で、５０℃まで安定である：
(5)各種金属イオン、阻害剤の影響
Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Fe³⁺, Al³⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Sn²⁺, DTNB, EDTAによって阻害される：および
(6)酵素の分子量
ゲル濾過法による分子量がおおよそ158,000である。A novel lactone hydrolase with the following physicochemical properties:
(1) Action Acts on lactone to produce the corresponding acid:
(2) Substrate specificity It specifically hydrolyzes D-pantolactone but does not act on L-pantolactone:
(3) Optimum pH and pH stability The optimum pH is 7.0 and is stable at pH 5.0 to 11.5:
(4) Optimal temperature and thermal stability The optimal temperature is 30 ° C and is stable up to 50 ° C:
(5) Effects of various metal ions and inhibitors
Inhibited by Zn ²⁺ , Cu ²⁺ , Ni ²⁺ , Cd ²⁺ , Fe ³⁺ , Al ³⁺ , Hg ²⁺ , Pb ²⁺ , Sn ²⁺ , DTNB, EDTA: and
(6) Molecular weight of the enzyme
The molecular weight by gel filtration is approximately 158,000. シゾフィラム属に属し、請求項１記載の酵素生産能を有する微生物を培養して、培養物より該酵素を採取することを特徴とする新規なラクトン加水分解酵素の製造法。  A method for producing a novel lactone hydrolase, comprising culturing a microorganism belonging to the genus Schizophyllum and capable of producing an enzyme according to claim 1, and collecting the enzyme from the culture. 請求項１記載の酵素を用い、パントラクトンを含めたアルドン酸ラクトン類からなる群から選ばれたラセミ体ラクトン化合物から、光学活性体を得ることを特徴とするラセミ体ラクトン化合物の光学分割法。  An optical resolution method for a racemic lactone compound, wherein an optically active substance is obtained from a racemic lactone compound selected from the group consisting of aldonic acid lactones including pantolactone using the enzyme according to claim 1. パントラクトンを含めたアルドン酸ラクトン類からなる群から選ばれたラセミ体ラクトン化合物に請求項１記載の酵素を作用させ、立体選択的に加水分解し、次に未反応ラクトン化合物と水解物である酸とを分離し、分離された水解物である酸をラクトン化せしめることを特徴とするラセミ体ラクトン化合物の光学分割法。  A racemic lactone compound selected from the group consisting of aldonic acid lactones including pantolactone is allowed to act on the racemic lactone compound according to claim 1 for stereoselective hydrolysis and then hydrolyzed with unreacted lactone compound. An optical resolution method for a racemic lactone compound, wherein the acid is separated from the acid and the acid, which is the separated hydrolyzate, is lactonized.

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