JPH11511977A

JPH11511977A - 洗剤酵素活性についてのファージ・ディスプレー

Info

Publication number: JPH11511977A
Application number: JP9510783A
Authority: JP
Inventors: マークバルセン，ペーター; エスコランドビヨルバド，マズ; ミッケルセン，フランク; ディデリシェン，ビヨルエ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1995-09-07
Filing date: 1996-09-04
Publication date: 1999-10-19
Also published as: EP0854933B1; WO1997009446A1; DK0854933T3; DE69628026D1; DE69628026T2; US20020058246A1; CN1196094A; US6506566B2; EP0854933A1; AU6785496A; ATE239799T1; US6194183B1

Abstract

(57)【要約】本発明は洗剤において利用するのに適当な酵素を同定するための方法、特にランダム突然変異誘発を介して作り上げた大量の酵素変異体の中からの特定の酵素変異体を選別する方法に関連する。本法において選別すべき前記酵素変異体は細胞又はファージ粒子の表層上でそれぞれがディスプレーされる酵素変異体の混合物の中にあり、そして当該方法はｉ）前記混合物を洗剤組成物の中に、前記酵素変異体の活性に対してネガティブな影響を与える又はそのほとんどを失活させるであろう条件下で導入する、ii）前記混合物を、要望する特性を発揮する酵素変異体にのみ特異的に結合するキャッチャー分子と反応させる、iii）前記複合体を前記混合物の残部から分離する、iv）前記複合体を解離して、キャッチャー分子のない前記酵素変異体をディスプレーする細胞又はファージを単離する、ｖ）前記ファージをそれが中で増幅するであろう宿主の中に導入する、又はｖａ）前記細胞をその増幅を誘導する条件下で培養する、vi）前記細胞又はファージのゲノムから前記酵素変異体をコードするDNA 分子を単離する、工程を含んで成る。本発明は更に前記方法において利用する特異的な材料、この方法の利用により選別された酵素、及び前記酵素を含んで成る洗浄組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】洗剤酵素活性についてのファージ・ディスプレー発明の分野本発明は洗剤における使用に適する酵素同定方法、特にランダム突然変異誘発を通じて作成された多種多様な酵素変移体からの特異的な変異体の選別に関する。本発明は更に前記方法において使用する特異的な材料、この方法の利用により選別された酵素、及び補助酵素を含んで成る洗浄組成物に関する。発明の背景酵素及び非酵素的タンパク質を含む数多くのポリペプチドが様々な産業、家庭、食品／飼料、化粧品、医薬品等において利用するために工業的に製造されている。これらのタンパク質の主たる起源は天然において見い出させる微生物であった。しかしながら、科学はタンパク質工学を通じて様々なポリペプチドを作り出す数多くの新しい技術を進歩させているため、タンパク質変異体の多大な集団を作る、スクリーニングする、そして新たな特性を選別することをできるようにすることが増々重要となってきている。新たな及び特別な特性を有するポリペプチドを見つける伝統的なアプローチは天然において存在する野生型生物をスクリーニングすることであった。これは上記の産業の如き多彩な分野において利用すべきポリペプチドを作成する非常に有効な手段であった。更に、微生物の伝統的な突然変異により新たなタンパク質変異体を作成することが可能である。しかし、このアプローチは非常にめんどうで時間のかかる工程であるため、研究者はこの20年間でより特異的、それ故より迅速な技術、例えばタンパク質及び遺伝子工学を利用して人工的多彩性を作り上げることにより現在のポリペプチドに対する改良を発展させてきた。かかる人工的多彩性は組換DNA 技術、例えば部位特異的又はランダム突然変異誘発を利用することにより作り上げることができる。このアプローチは実験のために利用される所定の生物の新たに獲得された表現型に従って選別できうるポリペプチド変異体の集団を作成する。かかる表現型のスクリーニングはスクリーニング可能である変異体の数に応じるという制約を有する。第一に、ポリペプチドの所定の新たな特性が検出でき、そして所定の突然変異体が単離し得るスクリーニングアッセイを準備する。次いでポリペプチドをコードするDNA を単離し、そして特性決定する。これらの技術は向上した特性、例えば高めの比活性、高又は低pH下での高めの安定性、温度安定性、酸化条件下での安定性等を示す新たな重要な酵素を有効に作成するのに利用されている。このアプローチがいかに有効であろうと、これらの技術を利用することによりスクリーニング及び試験可能なポリペプチドの数における制約があり続ける。従って、新規な方式であって、スクリーニングと選別とを一の手順の中に組合せることの可能なものを作成することに関心がもたらされている。更に、かかる手順は所定の条件下で最良の特性を有する変異体のみを拾い上げることができるようにすべきであり、そしてこれらの変異体は10⁸以上の構成員より成る変異体集団から拾い上げられるべきである。かかる人工的多彩性及び新たな又は向上した特異的ポリペプチド特性を作成するための一の有望なアプローチは「ファージ・ディスプレー」として知られる技術である。この技術はゲノタイプと表現型とを組合せ、２通りの特徴を一緒に選別することを可能にする。これにより、上記のアプローチに存在する複数の工程を省くことができる。ファージ・ディスプレー（表示）はGeorge P．Smith によりはじめて利用及び 1988年に発表されたかなり新しい技術である（最初の試みは1985年になされた）。初期の特許は「新規DNA 結合性タンパク質及びポリペプチドの作製及び選別」並びに「新規結合性タンパク質の誘導式進化」のそれぞれに関してR．C．Ladner （米国特許第 5,096,815及び同 5,223,409号）に付与されている。これらの２つの特許は当該技術についての背景を示す多大な文献を含んでいる。注目のポリペプチド又はペプチドをそれをコードするDNA に連結するバクテリオファージ・ディスプレー系が開発されている。かかるディスプレー系は選定の標的分子に結合するペプチドライブラリーをスクリーニングし、そして所望の特性についてこれらのタンパク質をスクリーニングする能力を有する機能性タンパク質をディスプレーするように利用されている（文献12〜15参照のこと）。近年、ディスプレーアプローチの改良はバクテリオファージの表層上で酵素及び抗体フラグメントを発現せしめることを可能にし、それ故特異的なリガンドで選別することによる特異的な特性の選別を可能にする（文献２〜６及び16〜18参照）。抗体のディスプレーに関してこの有効なアプローチの記載された数多くの文献がある。酵素のディスプレーとなると、それはあまり発展した分野ではないが、このアプローチのいくつかの例がある（文献１，８及び10参照）。特に、酵素ファージの選別原理は評価及び開発中である。所定の酵素の酵素メカニズムは自殺インヒビターの利用により結合原理手段として利用できうることが示されている（文献１及び９参照）。発明の概要本発明は洗剤において利用するのに適当な酵素又は酵素変異体を選別する方法に関連し、ここで選別すべき前記酵素変異体は細胞又はファージ粒子の表層上でそれぞれがディスプレーされる酵素変異体の混合物の中にあり、そして当該方法はｉ）前記混合物を流動状態の洗剤組成物の中に、前記酵素変異体の活性に対してネガティブな影響を与える又はそのほとんどを失活させるであろう条件下で導入する、 ii）前記混合物を、要望する特性を発揮する酵素変異体にのみ特異的に結合するキャッチャー分子と反応させ、要望の特性を示す前記細胞又はファージ・ディスプレーされた酵素と前記キャッチャーとの複合体を形成する、 iii）前記複合体を前記混合物の残部から分離する、 iv）前記複合体を解離して、キャッチャー分子のない選別すべき前記酵素変異体をディスプレーする細胞又はファージを単離する、ｖ）前記ファージをそれが中で増幅するであろう宿主の中に導入する、又はｖａ）前記細胞をその増幅を誘導する条件下で培養する、そして vi）前記細胞又はファージのゲノムから前記酵素変異体をコードするDNA 分子を単離する、工程を含んで成る。本発明の別の観点は上記方法の利用により選別された酵素に関する。本発明の更なる観点は上記方法における洗剤の利用に関する。本発明に更に本発明の第一の観点の方法において有用ないくつかのキャッチャー分子、例えば自殺インヒビター及び遷移状態類似体にも関する。最後に、本発明は本発明の方法により製造された酵素及びかかる酵素を含んで成る洗剤組成物に関する。表及び図面の簡単な説明本発明を実施例及び図面を参考に以下に更に説明する。ここで図１はSavinase （商標）遺伝子ら融合体の構造、Savinase（商標）遺伝子のPCR のために用いたプライマーの配列、及び最終構造とのその関係を示し、クローニング部位には下線を付した。参考のため、Savinase（商標）によりコードされるアミノ酸及びPC R Sav-N のセンス鎖をプライマーの上に小文字で示す。PCR Sav-C プライマー自体は３’−５’で示す。発明の詳細な説明前述の通り、本発明の第一の観点は洗剤において利用するのに適当な酵素又は酵素変異体を選別する方法に関連し、ここで選別すべき前記酵素変異体は細胞又はファージ粒子の表層上でそれぞれがディスプレーされる酵素変異体の混合物の中にあり、そして当該方法はｉ）前記混合物を流動状態の洗剤組成物の中に、前記酵素変異体の活性に対してネガティブな影響を与える又はそのほとんどを失活させるであろう条件下で導入する、 ii）前記混合物を、要望する特性を発揮する酵素変異体にのみ特異的に結合するキャッチャー分子と反応させ、要望の特性を示す前記細胞又はファージ・ディスプレーされた酵素と前記キャッチャーとの複合体を形成する、 iii）前記複合体を前記混合物の残部から分離する、 iv）前記複合体を解離して、キャッチャー分子のない選別すべき前記酵素変異体をディスプレーする細胞又はファージを単離する、ｖ）前記ファージをそれが中で増幅するであろう宿主の中に導入する、又はｖａ）前記細胞をその増幅を誘導する条件下で培養する、そして vi）前記細胞又はファージのゲノムから前記酵素変異体をコードするDNA 分子を単離する、工程を含んで成る。本発明の方法の実施前に、調べるべき酵素を細胞又はファージの表層上で発現させる必要がある。これは注目の酵素をコードするDNA 分子をランダム突然変異誘発によりまず突然変異させ、それぞれが親酵素とは若干異なる酵素をコードする突然変異DNA 分子の大集団又はライブラリーを作成することにより好適に行われる。これにより作り上げられた種々のDNA 分子の数は非常に多く、10⁹個より多くの突然変異体でさえもある。そのための方法は当業界において周知であり、そしてかかる方法の記載されたSpeeら（21）を参照されたい。前記ライブラリーを占めているDNA フラグメントそれぞれを細胞のベクター又はファージの中に、前記突然変異DNA が前記細胞又はファージの表層タンパク質をコードするDNA に隣接する位置において、且つ前記突然変異DNA が注目の細胞に導入されたときに発現して対応の酵素変異体が細胞又はファージの表層上でディスプレーされるように挿入する。かかる表層タンパク質の例はＥ．コリ（E．coli）細胞表層のペプチドグリカン結合リポタンパク質、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aure us)のプロテインＡ、又はfdもしくはＭ13 線維状ファージのｇIIIタンパク質である。これらの技術も周知であり、そしてかかる方法の説明については文献２，３，11及び22を参照されたい。次に形質転換細胞を増幅させ、細胞又はファージの大集団又はライブラリーを作成し（ここで各細胞又はファージは一の酵素変異体をディスプレーし、そしてこれらの細胞又はファージはそれぞれそのゲノム内に特異的な酵素変異体をコードするDNA を担持する）、これにより細胞又はファージの表現型とゲノタイプとの連結を樹立する。発現される酵素変異体の数は遺伝子コードの縮重性によりDN A 突然変異体のそれよりも少ないが、それでも非常に大量の数が作られるであろう。本発明によれば、このライブラリーを洗剤の中に、前記酵素変異体のほとんどが失活するであろう条件、そして特に親酵素の活性に有害であることが知られている条件下で、及び／又は試験パラメーターに関して向上した特性を示す酵素変異体を選別することが所望されるとき、試験する特性に対してネガティブな影響を与える条件下で、入れる。酵素を失活させることができる又はその特性に対してネガティブな影響を与えることができる条件として、酸化剤（漂白剤）、様々な界面活性剤、ビルダー等の試薬の影響に対して（一層）耐性である酵素変異体を見い出すことが所望される場合には洗浄がそれらを含んで成ってよく、又はこの混合物を親酵素を失活させる又はそれにネガティブな影響を及ぼす高温及び低温の双方で処理する、又は pH値もしくはイオン強度で処理してよく；又はもし親酵素がプロテアーゼなら、自己タンパク質分解に耐性な酵素を選別するための長い時間の間この混合物を放置してよく；又はその洗剤がプロテアーゼのタンパク質分解活性に耐性なリパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ等を選別するためにそのプロテアーゼを含んで成ってよい。試験できうるその他のパラメーターには疎水性及び親水性相互作用、溶媒和、並びに基質、補酵素及びアロステリック因子のための結合ポケットが含まれる。構造に微妙な変化を及ぼす全てのパラメーターが変化を担いうる。その他の観点において、本発明の方法において利用すべき洗剤は公知の組成物であり、そしてかかる組成物及びその成分の説明については米国特許第 4,663,0 71，4,652,392，4,507,219，4,405,483，4,285,841，4,284,532，4,146,495，4, 144,226，3,933,672，3,929,678，3,364,103，3,308,067，2,477,383，2,220,09 9，1,739,942号及びドイツ国特許出願 DOS 2,124,526号を参照されたい。その後、このライブラリーを、要望の特性を保持するディスプレーされた酵素変異体のみに特異的に結合するキャッチャー分子と反応させる。かかるキャッチャー分子の例は注目の酵素活性に対する自殺インヒビター又は遷移状態類似体である。尚、「自殺インヒビター」とは不可逆性インヒビターを意味し、そのインヒビターはインキュベーションを経て酵素に共有結合する。活性部位特異的不可逆性インヒビター及びメカニズム式酵素インヒビターがこのインヒビタータイプの特異的な例である。文献１及び９にかかるインヒビターが記載されている。また、「遷移状態類似体」とは酵素反応の不安定な遷移状態の基質部分を構造的に擬態する競合インヒビターを意味する。このタイプのインヒビターは酵素に対して非常に高親和性である。文献23及び24にかかる類似体が記載されている。ライブラリー中の細胞又はファージによりディスプレーされる酵素変異体の多くはここで完全又は部分的に失活しているため、キャッチャーは要望の特性を示し続け、且つそれと複合体を形成するディスプレーされた酵素変異体とのみ反応するであろう。この複合体は残りの細胞又はファージ（要望の特性を示さないもの、例えば不活性酵素変異体）並びに当該インヒビターと一緒に添加されたその他の洗剤成分及び試薬から分離させなければならない。このための方法、例えば様々なイムノアッセイ方法は当業界において周知であり、そしてかかる方法については文献１及び７を参照されたい。この分離を実施する一の手段は複合体を表層、例えば試験管、タイタープレートのウェルの表層、又は粒子に結合させることになる。一のタイプの態様において、この結合は表層に対する吸着又は吸収であってよい。別の態様において、この結合は共有結合を介する。尚、インヒビターを表層に結合できるように様々な態様で修飾してよく、又は表層を活性化させて複合体を結合させてよい。一の特定の態様は表層をストレプトアビジンで処理し、そしてキャッチャーをビオチニル化させてそのキャッチャーをライブラリーに反応させることによる。複合体が表層に結合したら、連結因子を解離するであろう試薬を用いて前記ファージを遊離させる、又はもし吸着が利用されたなら、単に複合体を脱離させればよく、その後キャッチャーは消化又は解離により除去される。好都合な試薬はディスプレーされた酵素変異体を消化するであろう特異的なプロテアーゼである。この目的のために利用する試薬は注目のファージを害さないことが重要である。特定の態様において、前記消化はプロテアーゼ、例えば第IX因子で行う。次に酵素変異体をディスプレーするファージを、それを宿主に感染させることにより増幅させる。前記宿主は前記ファージがその中で大量に増幅するものとし、これにより配列決定に十分足りる量のDNA が供される。本発明の一の態様において、前記宿主はＥ．コリ株 DH12Sである。もし酵素変異体が細胞の表層上にディスプレーされるなら、細胞をその増幅を誘導する条件下で増殖させる。ファージ又は細胞ゲノム上の酵素変異体DNA の位置がわかっているなら、配列決定のために関連のDNA を単離することはた易い。 DNA の配列決定から得られる情報は当業者に、洗剤の中に使用できうる選定の酵素変異体の実際の製造に適当な宿主への導入のためのその他のDNA 構築体の設計を可能にする。適当な宿主は往々にして微生物、例えば細菌、酵母、又は菌類であって親酵素を産生するのと同タイプ又は同株のものであろう。かかる宿主、その中にDNA を導入する技術、並びに酵素の培養及び単離は全て公知である。本発明の方法は洗浄製剤において利用するための酵素変異体を選別するためにデザインされ、そしてこの方法は往々にして、自殺インヒビター及び遷移状態類似体を含んで成る群から選ばれるキャッチャーを利用してプロテアーゼ、例えばスブチリシン、好ましくは高アルカリ性スブチリシンの変異体の選別のために利用されるであろう。注目の更なる酵素群はプロテアーゼ（金属、酸性、中性又はアルカリ性）、セルラーゼ、アミラーゼ、リアーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシドリダクターゼ、トランスグルタミナーゼ、ガラクトシダーゼ、フィターゼ又はペルオキシダーゼである。材料と方法Ｅ．コリ株： DH12S ：Life Technologies A/S，Roskilde Denmark より入手可能。ベクター： fd-tet-DOG1 ：このベクターの構造は文献16に記載。 pSX222：このプラスミドの構造はWO91/00345（NOVO NORDISK A/S）に記載。pS X222はSavinase（商標）プロテアーゼをコードする遺伝子を含む。 pSX222（M222A）：酸化安定性変異体M222A（EP 396.608 B1に記載）をコードするSavinase（商標）突然変異遺伝子を有するpSX222。 pSX581：このプラスミドの構造はWO96/17943（NOVO NORDISK A/S）に記載。pS X581はLipolase（商標）リパーゼをコードする遺伝子を含む。 pSX581（D96L）：Lipolase（商標）D96L Dobanol 25-7 安定変異体（WO92/052 49に記載）をコードする突然変異遺伝子を有するpSX581。制限酵素：何らかのことわりのない限り、全ての制限酵素はNew England Biolabs，Berve rly，MA，USAに由来する。キャッチャー：「suicide-Sav-1」と称される自殺インヒビターを使用する。このインヒビターは下記の式を有する：「suicide-Lip-1」と称される別の自殺インヒビターも利用される。このsuici de-Lip-1 インヒビターはホスホネート不可逆性イン sphonates」Bioorganic & Medicinal Chemistry 2：697-705（1994））であり、そして下記の式を有する：ここで、Ｌは離核基、例えばハロゲン、例えばCl、又はｐ−ニトロフェニルであり、Ｒは１〜20個の炭素原子を有する直鎖又は枝分れアルキル基、例えばエチル、又はジグリセリド様基である。ラベルは選択的な認識／同定及び固定化のために利用できうる基又は化合物、例えばビオチン又はジゴキシゲニンであり、ここでビオチンは親水性ラベルであり、そしてジゴキシゲニンは疎水性ラベルである。オリゴヌクレオチド合成：全てのオリゴヌクレオチドプライマーをABI 394 DNA/RNA シンセサイザー（Ap plied Biosystems，Foster City，CA，USA）で合成した。DNA 配列決定： DNA 配列決定は全てABI モデル 373 DNAシーケンサーでTaq Dye Deoxy(商標) ターミネーターサイクルシーケンシングキットについてのABI 2x Taqプロトコールに従って行った。fd-Sav ファージの特性決定： ELISA ：標準のELISA 技術を利用して酵素ファージの縮合を検定。簡潔には、マイクロタイタープレート（Maxisorp，Nune）のウェルに 100mlのキャッチャー溶液（ｐストレプトアビジン、又はNovo Nordisk A/Sにおいて調製されたSavinase（商標）に対してウサギで生起させたポリクローナル抗体のいづれか10mg／mlのPBS 溶液）を４℃で一夜かけてコーティングし、次いで２％の脱脂粉乳(Difco）を含むPBS で37℃で２hrブロッキングした。ファージ調製品（キャッチャーとしてのポリクローナル抗体によるELISA において使用）から直接、又はビオチニル化自殺インヒビターに結合し、そして上記の通りにして洗浄したファージ（キャッチャーとしてのストレプトアビジンによるELISA において使用）から得たファージのブロッキング溶液中の系列希釈品をウェルに添加し、そして室温で１〜２時間ゆらしながらインキュベーションした。種々の工程間の洗浄は0.05％のTween-20を含むPBS で行った。結合はペルオキシダーゼコンジュゲーション化ウサギ抗−Ｍ13ポリクローナル抗体(Pharmacia)を用い、オルト−フェニレン−ジアミン（DAKO）によるその製造者の仕様に従う検出によりアッセイした。検出反応体を10〜30分放置し、次いで50mlの２ＭのH₂SO₄を添加することによって停止させた。プレートはOD₄₉₀に設定したマイクロタイタープレートリーダーで測定した。fd-Lip ファージの特性決定： fd-Lip酵素ファージは下記のELISA アッセイでそのリパーゼ活性を発揮させることにより特性決定した。 ELISA マイクロタイタープレートアッセイ：原理：トリグリセリドとｐ−ニトロフェニル脂肪酸（pNP-FA）との混合物を ELI SA−プレートウェルの壁にコーティングする。この方法はpNP-FAの中のエステル結合の加水分解がｐ−ニトロフェノール（黄色）の上清液への遊離をもたらすこと及び発色がELISA リーダーで追跡できることに基づく。装置：UV_max.Kineticマイクロプレートリーダー（Molecular Device）基質溶液： 0.5mM のトリオレイン（Sigma T-7140） 0.5mM のｐ−ニトロフェニルパルミテート（Sigma N-2572）ヘキサン溶液 0.5mM のオリーブ油 0.5mM のｐ−ニトロフェニルカプリレート 96％エタノール溶液バッファー：0.16Ｍのトリス、pH9 手順： 100 μｌの基質混合物を各ウェルに移し、そして有機含有物をエバポレーションする。125μｌのバッファー及び75μｌのfd-Lipファージ酵素（実施例５に記載の通りにして調製）をウェルに加える。このマイクロタイタープレートを ELI SA−リーダーに入れ、そして発色を記録する。このELISA リパーゼマイクロタイターアッセイにおいて、fd-Lip及びfd-Lip（ D96L）酵素ファージは共にfdファージのバックグランドレベルよりも十分に高いリパーゼ活性を示した。このことはfd-L ipファージがリパーゼ活性を有することを示す。実施例実施例１ fd-Sav及びfd-SavM22Aの構築：成熟前Savinase（商標）遺伝子をベクターfd-tet-DOG１のApaLＩ及び NotＩ部位にクローニングした。このインサートは図１に示すプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により調製し、そしてpSX222に由来する。オリゴヌクレオチドプライマーは遺伝子の５’末端にApaLＩ制限部位そして３’末端に NotＩ制限部位を有するPCR 生成物を作るためにデザインした。このオリゴヌクレオチドプライマーの配列は下記の通りである： PCRSav-N： 5'-GTC ACA GAT CCT CGC GAA TGT GCA CAG GCT GAA GAA GCA AAA GAA AAA TAT T TA ATT GGC-3' PCRSav-C： 5'-CAG ATC CTC GCG AAT TGG TGC GGC CGC ACG CCC CTC AAT CCC ACG CGT TGC C GC TTC TGC GTT AAC-3' PCR は 250mMづつのdNTP，50mMのKCl，2.5mMの MgCl₂，0.01％のゼラチン、0. 25単位／mlのTaq ポリメラーゼ（Cetus/Perkin Elmer）及び 0.5ng／mlのpSX222 鋳型を含む 100mlの10mMのトリス−HCl，pH8.3の中で、Perkin Elmer Cetus DNA サーマルサイクラー480 を用い、92℃で１分、50℃で２分及び72℃で３分より成るサイクル30回を利用して実施した。このようにして誘導した構築体をfd-Savと呼ぶ。fd-Savの中のインサートを配列決定により確認した。 fd-SavM222A の構築はfd-Savと同じようにして行った。ただし、pSX222(M222A )を鋳型として前記PCR 反応において用いた。実施例２ fd-Savファージ酵素の調製： fd-Sav又はfd-Sav(M222A)を含むエッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）D H12S 細胞を15mg／mlのテトラサイクリンを有する2XのTYの中で37℃で16ｈ増殖させた。濃厚ファージは文献10に本質的に記載の通りにして調製した。簡単には、ファージ酵素培養物を遠心分離により清澄化した(10,000rpmで15〜 20min，８×50mlのローター、Sorval RC-5B遠心器)。ファージを１／５容量の20％のポリエチレングリコール、2.5ＭのNaClの添加により沈殿し、４℃で１ｈ放置し、そして遠心分離した（上記の通り）。ファージペレットを10mMのトリス−HCl，pH8.0の中でもとの容量の 100分の１の容量に再懸濁し、そして残留細菌及び凝集ファージを５〜10min づつ、12,000rpm でマイクロ遠心器において４℃で２回遠心分離することにより除去した。実施例３ fd-SavM222A ファージの選別：反応条件を確立するため、250mlの培養物由来のfd-SavファージのPEG ペレットを 1.5mlの50mMの酢酸バッファーの中にpH５において再懸濁して約10¹¹TU／ml し、そしてMillex-GV(0.22mm)で濾過する。この溶液 500mlに25mlのDSMO中の 0. 3mgのインヒビターを添加する。Savinase活性の損失はインキュベーション中にサンプルを採取し、そして基質Suc-ala-ala-pro-phe-pNA(SIGMA，St．Louis，MO USA)に対するプロテアーゼ活性を測定することによって追跡した。 fd-Savファージの阻害のための最少条件が設定された後、上記の通りにして調製した数種のファージ（fd-tet-DOG１，fd-SavM22A，fd-Sav）を用いて事前規定した混合物を作った。 450ml のファージ混合物（10¹¹〜１0¹²TU／ml）を漂白剤含有洗剤の中で30分インキュベーションする（漂白剤含有洗剤は酸化性化学品を含んで成る。より詳細には、EP 396.608号を参照のこと）。ファージ混合物に50mlの10％（ｗ／ｖ）の牛血清アルブミン(BSA)溶液を添加し、次いでビオチニル化自殺インヒビターを 0.5mMにまで添加する。反応を30分進行させる。ファージを 200mlのPEG-NaCl 溶液により沈殿させ、そして遠心する。このペレットを 500mlの50mMの酢酸バッファーpH5.0 に再懸濁し、そして再びPEG 沈殿させる。この工程を繰り返し、そしてペレットを最後に２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含む 1.1mlのPBS バッファー（MPBS）の中に再懸濁する。キャッチャーとしてストレプトアビジンを利用する実際の結合選別はイムノチューブ（Nunc，3.5ml の容量）又はマイクロタイターウェルプレート（Nunc 140 mlの容量）のいづれかを用いて実施する。選別の前に、チューブ又はウェルをPB S 中の 100mg／mlの濃度ストレプトアビジンと４℃で一夜インキュベーションし、そして２％の脱脂粉乳及び0.05％のTween-20(Merck)を含むPBS(リン酸緩衝液食塩水 137mMのNaCl，2.7mM のKCl，4.3mMのNa₂HPO₄×７H₂O，1.4mMのKH₂PO₄，p H7.4)で２ｈブロッキングする。ビオチニル化インヒビターに結合したファージの結合を１〜２時間行い、次いで10容量のPBS 及び10容量の0.05％のTween-20含有PBS で強く洗浄する（10回以上）。溶出のため、結合ファージを１mlの50mMのトリスHCl，100mMのNaCl，１mMのCa Cl₂バッファーpH８（TCNB）の中に再懸濁する。このファージを10mgの第Ｘａ因子で３〜18時間静かに振盪させながら室温でインキュベーションすることによりイムノチューブ及びマイクロタイターウェルのそれぞれから溶出させる。溶出したファージをＥ．コリ株DH12S を感染するために用い、更なる選別ラウンドのためのファージを調製する（50mlの対数増殖ファージをファージ生産のために30〜37℃で一夜静置する）。数回の選別ラウンドを経て、fd-SavM222A ファージについての有意義な選別を獲得することが可能であり、それはfd-Savファージと比べて酸化安定性である(E P 396.608 B1)。好ましくは、選別比 fdSavM222A/fd-Savは８より高く、より好ましくは10より高く、そして更に好ましくは20より高い。一般に、多めの選別ラウンド数は通常より厳格な選別（高選別回数）を供するであろう。実施例４ fd-Lip及びfd-Lip（D96L）ファージの構築：成熟Lipolase（商標）遺伝子をベクターfd-tet-DOG１のApaL１及び NotＩ部位に、本質的にfd-Savについて記載した通りにクローニングしたが（実施例１）、ただしPCR プライマーはPCRLip-N及びPCRLip-Cとし（下記参照）、そしてPCR 反応はpSX581（fd-Lipの構築のため）又はpSX581（D96L）（fd-Lip（D96L）の構築のため）で実施した。 PCRLip-N： 5'-GTC ACA GAT CCT CGC GAA TGT GCA CAG GAG GTC TCG CAG GAT CTG TTT AAC C AG TTC-3' PCRLip-C： 5'-CAG ATC CTC GCG AAT TGG TGC GGC CGC ACG CCC CTC AAT CCC AAG ACA TGT C CC AAT TAA CCC GAA GTA CC-3' 実施例５ fd-Lipファージ酵素の調製：これはfd-Sav（実施例２）について記載の通りに行ったが、但しここではエッシェリヒア・コリDH12S 細胞はfd-Lip又はfd-Lip（D9 6L）を含んでいた。実施例６ fd-LipD96Lファージの選別：反応条件を確立するため、250mlの培養物由来のfd-LipファージのPEG ペレットを 1.5mlの50mMの酢酸バッファーの中にpH５において再懸濁して約10¹¹TU／ml にし、そしてMillex-GV(0.22mm)で濾過する。この溶液 500mlに様々な量のDoban ol 25-7（Dobanol 25-7は非イオン界面活性剤）を添加する。リパーゼ活性の損失はインキュベーション中にサンプルを採取し、そして下記のＣ−12脂肪酸ラウレート基質に対するプロテアーゼ活性を測定することによって追跡する。 fd-Lipファージの阻害のための最少条件が設定された後、上記の通りにして調製した数種のファージ（fd-tet-DOG１，fd-LipD96L，fd-Lip）を用いて事前規定した混合物を作る。 450ml のファージ混合物（10¹¹〜10¹²TU／ml）をfd-Lipファージを失活するのにちょうど必要な量のDobanol 25-7含有洗剤の中で30分インキュベーションする（上記参照）。ファージ混合物に50mlの10％（ｗ／ｖ）の牛血清アルブミン(BSA )溶液を添加し、次いでビオチニル化自殺インヒビターを 0.5mMにまで添加する。反応を30分進行させる。ファージを 200mlのPEG-NaCl溶液により沈殿させ、そして遠心する。このペレットを 500mlの50mMの酢酸バッファーpH5.0 に再懸濁し、そして再びPEG 沈殿させる。この工程を繰り返し、そしてペレットを最後に２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含む 1.1mlのPBS バッファー（MPBS）の中に再懸濁する。キャッチャーとしてストレプトアビジンを利用する実際の結合選別はイムノチューブ（Nunc，3.5ml の容量）又はマイクロタイターウェルプレート（Nunc 140 mlの容量）のいづれかを用いて実施する。選別の前に、チューブ又はウェルをPBS 中の 100mg／mlの濃度ストレプトアビジンと４℃で一夜インキュベーションし、そして２％の脱脂粉乳及び0.05％のTw een-20(Merck)を含むPBS(リン酸緩衝液食塩水 137mMのNaCl，2.7mM のKCl，4.3m MのNa₂HPO₄×７H₂O，1.4mMのKH₂PO₄，pH7.4)で２ｈブロッキングする。ビオチニル化インヒビターに結合したファージの結合を１〜２時間行い、次いで10容量のPBS 及び10容量の0.05％のTween-20含有PBS で強く洗浄する（10回以上）。溶出のため、結合ファージを１mlの50mMのトリスHCl，100mMのNaCl，１mMのCa Cl₂バッファーpH８（TCNB）の中に再懸濁する。このファージを10mgの第Ｘａ因子で３〜18時間静かに振盪させながら室温でインキュベーションすることによりイムノチューブ及びマイクロタイターウェルのそれぞれから溶出させる。溶出したファージをＥ．コリ株DH12S を感染するために用い、更なる選別ラウンドのためのファージを調製する（50mlの対数増殖ファージをファージ生産のために30〜37℃で一夜静置する）。数回の選別ラウンドを経て、fd-LipD96Lファージ（WO92/05249）についての有意義な選別を獲得することが可能であり、それはfd-Iip Dobanol 25-7 と比べて酸化安定性である。好ましくは、選別比 fdIipD96L/fd-Iip は８より高く、より好ましくは10より高く、そして更に好ましくは20より高い。一般に、多めの選別ラウンド数は通常より厳格な選別（高選別回数）を供するであろう。明細書において引用した文献１．Soumillion，P.，Jespers，L.，Bouchet，M.，Marchandbrynaert，J.，Wi nter，G．and Fastrez，J．(1994)Joumal Of Molecular Biology，237，415-422 。２．Hoogenboom，H．R.，Marks，J．D．and Winter，G．(1992)Immunological Reviews，130，41-68 。３．Griffiths，A．D.，Malmqvist，M.，Marks，J．D.，Bye，J．M.，Embleto n，M．J.，Mccafferty，J.，Baier，M.，Holliger，K．P.，Gorick，B．D.，Hug hesjones，N．C．and Winter，G．(1993)Embo joumal，12，725-734。４．Orum，H.，Andersen，P．S.，Oster，A.，Johansen，L．K.，Riise，E.， Bjornvad，M．and Engberg，J．(1993)Nucleic Acids Research，21，4491-4498 。５．Barbas，C．F.，Amberg，W.，Simoncsits，A．and Lerner，R．A．(1993) Gene，137，57-62 。６．Hoogenboom，H．R．and Winter，G．(1992)Joumal Of Molecular Biology ，227，381-388 。７．Hawkins，R．E..，Russell，S．J．and Winter，G．(1992)Joumal Of Mol ecular Biology，226，889-896 。８．Corey，D．R.，Shiau，A．K.，Yang，Q.，Janowski，B．A．and Craik，C ．S．(1993)Gene，128，129-134。９．Soumillion，P.，Jespers，L.，Bouchet，M.，Marchandbrynaert，J.，Sa rtiaux，P．and Fastrez，J．(1994)Applied Biochemistry And Biotechnology ，47，175-190 。 10．Mccafferty，J.，Jackson，R．H．and Chiswell，D．J．(1991)Protein E ngineering，8，no 4，955-961 。 11．Samuelson，P.，Hansson，M.，Ahlborg，N.，Andreoni，C.， Gotz，F.，Bachi，T.，Nguyen，T．N.，Binz，H.，Uhlen，M．and Stahl，S．(1 995)Joumal Of Bacteriology，177，1470-１476。 12．Smith，G．P．(1985)Science，228，1315-1317 。 13．Parmley，S．F．and Smith，G．P．(1988)Gene，73，305-318。 14．Scott，J．K．and Smith，G．P．(1990)Science，249，386-390。 15．Devlin，J．J.，Panganiban，L．C．and Devlin，E．P．(1990)Science， 249，404-406 。 16．Clackson，T.，Hoogenboom，H．R.，Griffiths，A．D．and Winter，G．( 1991)Nature，352，624-628。 17．Kang，A．K.，Barbas，C．F.，Janda，K．D.，Benkovic，S．J．and Lern er，R．A．(1991)Proceedings Of The Natinal Academy Of Sciences Of The Un ited States Of America，88，4363-4366。 and Little，M．(1991)Gene，104，147-153 。 19．Bryan，P．N.，Rollence，M．L.，Pantoliano，M．W.，Wood，J.，Finzel ，B．C.，Gilliland，G．L.，Howard，A．J．and Poulos，T．L．(1986)Protein Struct．Funct．Genet.，1，326-334。 20．Strausberg，S．L.，Alexander，P．A.，Gallagher，D．T.，Gilliliand ，G．L.，Barnett，B．L．and Bryan，P．N．(1995)Bio-Technology，13，669-6 73。 21．Spee，J．H.，Willem，M．and Kuipers，O．P．(1993)Nucleic Acids Res earch，21，777-778 。 ittle，M．(1991)Bio-Technology，9，1369-1372 。 23．Smith，R．M.，Yuan，P.，Weiner，D．P.，Dutton，C．R．and Hansen，D ．E．(1994)Applied Biochemistry And Biotechnology，47，329-343 。 24．Moree，W．J.，Vangent，L．C.，Vandermarel，G．A．and Liskamp，R．M ．J．(1993)Tetrahedron，49，1133-1150。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/44 Ｃ１２Ｑ 1/44 // Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ミッケルセン，フランクデンマーク国，デーコー−2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ (72)発明者ディデリシェン，ビヨルエデンマーク国，デーコー−2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ

Claims

【特許請求の範囲】１．洗剤において利用するのに適当な酵素又は酵素変異体を選別する方法であって、ここで選別すべき前記酵素変異体は細胞又はファージ粒子の表層上でそれぞれがディスプレーされる酵素変異体の混合物の中にあるものであり、そしてｉ）前記混合物を流動状態の洗剤組成物の中に、前記酵素変異体の活性に対してネガティブな影響を与える又はそのほとんどを失活させるであろう条件下で導入する、 ii）前記混合物を、要望する特性を発揮する酵素変異体にのみ特異的に結合するキャッチャー分子と反応させ、要望の特性を示す前記細胞又はファージ・ディスプレーされた酵素と前記キャッチャーとの複合体を形成する、 iii）前記複合体を前記混合物の残部から分離する、 iv）前記複合体を解離して、キャッチャー分子のない選別すべき前記酵素変異体をディスプレーする細胞又はファージを単離する、ｖ）前記ファージをそれが中で増幅するであろう宿主の中に導入する、又はｖａ）前記細胞をその増幅を誘導する条件下で培養する、そして vi）前記細胞又はファージのゲノムから前記酵素変異体をコードするDNA 分子を単離する、工程を含んで成る方法。２．前記洗剤が漂白系を含んで成る、請求項１記載の方法。３．工程（ii）における前記条件が高温又は低温での処理を含んで成る、請求項１又は２記載の方法。４．工程（iii）における前記分離を表層に対する前記複合体の結合により実施する、請求項１〜３のいづれか１項記載の方法。５．前記結合が吸着である、請求項４記載の方法。６．前記結合が共有的である、請求項４記載の方法。７．前記インヒビターが前記表層に結合できるように修飾されている、請求項４記載の方法。８．前記表面が前記複合体の結合のために活性化されている、請求項４〜７記載の方法。９．前記表面がストレプトアビジンにより処理されており、そして前記インヒビターがビオチニル化されている、請求項８記載の方法。 10．工程（iv）における前記消化をプロテアーゼ、例えば第IX因子で実施する、請求項１〜９のいづれか１項記載の方法。 11．工程（ｖ）の前記宿主が細菌、例えばＥ．コリ、特に株DH12S である、請求項１〜10のいづれか１項記載の方法。 12．前記酵素がプロテアーゼ、例えばスブチリシン、好ましくは高アルカリ性スブチリシンである、請求項１〜11のいづれか１項記載の方法。 13．工程（ii）における前記キャッチャーが自殺インヒビター及び遷移状態類似体を含んで成る群から選ばれる、請求項12記載の方法。 14．前記酵素がリパーゼである、請求項１〜11のいづれか１項記載の方法。 15．工程（ii）における前記キャッチャーが自殺インヒビター及び遷移状態類似体を含んで成る群から選ばれる、請求項14記載の方法。 16．前記酵素がセルラーゼである、請求項１〜１１のいづれか１項記載の方法。 17．工程（ii）における前記キャッチャーが自殺インヒビター及び遷移状態類似体を含んで成る群から選ばれる、請求項16記載の方法。 18．前記酵素がオキシドリダクターゼである、請求項１〜11のいづれか１項記載の方法。 19．工程（ii）における前記キャッチャーが自殺インヒビター及び遷移状態類似体を含んで成る群から選ばれる、請求項18記載の方法。 20．前記酵素がアミラーゼである、請求項１〜11のいづれか１項記載の方法。 21．工程（ii）における前記キャッチャーが自殺インヒビター及び遷移状態類似体を含んで成る群から選ばれる、請求項20記載の方法。 22．前記酵素がリアーゼ、キシラナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、トランスグルタミナーゼ、ガラクトシダーゼ、フィターゼ又はペルオキシダーゼである、請求項１〜11のいづれか１項記載の方法。 23．工程（ii）における前記キャッチャーが自殺インヒビター及び遷移状態類似体を含んで成る群から選ばれる、請求項22記載の方法。 24．先の請求項のいづれか１項記載の方法の利用により選別された酵素。 25．請求項24記載の酵素を含んで成る洗浄組成物。