JP2003199587A - New nkt cell - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は新規なＮＫＴ細胞お
よび該ＮＫＴ細胞が有するＴ細胞レセプターα鎖をコー
ドするＤＮＡがＴ細胞特異的に発現するように導入され
ていることを特徴とする非ヒト哺乳動物に関する。具体
的には、該細胞が有するＴ細胞レセプターが特有のアミ
ノ酸配列を有しており、かつＴ細胞の刺激によりＴｈ２
タイプのサイトカインを産生するＮＫＴ細胞、該ＮＫＴ
細胞を抗原とする抗体、該抗体を有効成分として含有す
る免疫調節剤、該ＮＫＴ細胞を利用した免疫調節活性を
有する物質のスクリーニング方法、該ＮＫＴ細胞が有す
るＴ細胞レセプターα鎖をコードするＤＮＡがＴ細胞特
異的に発現するように導入されている非ヒト哺乳動物、
及びその利用等に関する。TECHNICAL FIELD The present invention is characterized in that a novel NKT cell and a DNA encoding a T cell receptor α chain possessed by the NKT cell are introduced so as to be expressed specifically in a T cell. Regarding mammals. Specifically, the T cell receptor possessed by the cell has a unique amino acid sequence, and Th2 is stimulated by T cells.
Type NKT cells producing cytokines, said NKTs
An antibody having a cell as an antigen, an immunomodulator containing the antibody as an active ingredient, a screening method for a substance having an immunomodulatory activity using the NKT cell, and a DNA encoding a T cell receptor α chain possessed by the NKT cell are provided. A non-human mammal introduced so as to specifically express T cells,
And the use thereof.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ＮＫＴ細胞はナチュラルキラーマーカー
であるＮＫ１．１、及びＴ細胞抗原レセプターを併せて
発現するユニークなリンパ球である。従来、ＮＫＴ細胞
ではそのＴ細胞レセプター（以下、「ＴＣＲ」と称する
ことがある）α鎖としてマウスではＶα１４−Ｊα２８
１、ヒトではＶα２４−ＪαＱでいずれも均一なサブセ
ットを有するもの（以下、「Ｖα１４ＮＫＴ細胞」と称
することがある）が知られており、さらにそのβ鎖も、
Ｖβ８、７、及び２の特定のβ鎖と対を組むことでＴ細
胞レセプターとして非常に均一な構造を有することが知
られている（非特許文献１を参照。）。さらに、ＮＫＴ
細胞はこの均一なＴ細胞レセプターにより、非古典的Ｍ
ＨＣクラスＩ分子に属するＣＤ１ｄに提示される特殊な
糖脂質（α−ガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ））
を抗原として認識し、活性化される（非特許文献２を参
照。）ことも知られている。BACKGROUND OF THE INVENTION NKT cells are unique lymphocytes that together express NK1.1, a natural killer marker, and T cell antigen receptors. Conventionally, as a T cell receptor (hereinafter sometimes referred to as “TCR”) α chain in NKT cells, Vα14-Jα28 in mice.
1. In humans, it is known that Vα24-JαQ has a uniform subset (hereinafter sometimes referred to as “Vα14NKT cells”), and its β chain also
It is known that it has a very uniform structure as a T cell receptor by pairing with specific β chains of Vβ8, 7, and 2 (see Non-Patent Document 1). Furthermore, NKT
Due to this uniform T cell receptor, cells
Special glycolipid presented on CD1d belonging to HC class I molecule (α-galactosylceramide (GalCer))
Is also known to be recognized as an antigen and activated (see Non-Patent Document 2).
【０００３】このＮＫＴ細胞は、上記のＴ細胞レセプタ
ーを介した刺激に応答して、インターロイキン−４（以
下、「ＩＬ−４」と称することがある）、やインターフ
ェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と称することがあ
る）等のサイトカインを分泌し、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞分
化の方向付け等免疫系制御に重要な役割を果たしている
ことが示唆されている（非特許文献３および４を参
照。）。このことは、実際に免疫系制御の破綻した自己
免疫疾患の体内においては、Ｖα１４ＮＫＴ細胞が減少
していることによっても示唆される（非特許文献５およ
び６を参照。）。The NKT cells respond to the stimulation via the T cell receptor as described above, and interleukin-4 (hereinafter sometimes referred to as "IL-4") or interferon-γ (hereinafter "IFN"). It is suggested that it secretes cytokines such as "-γ") and plays an important role in controlling the immune system such as directing Th1 / Th2 cell differentiation (see Non-Patent Documents 3 and 4). .). This is also suggested by the fact that Vα14NKT cells are decreased in the body of an autoimmune disease in which the immune system control is actually compromised (see Non-Patent Documents 5 and 6).
【０００４】また、Ｖα１４ＮＫＴ細胞については、生
体内で上記した糖脂質によってＴＣＲを介して特異的に
活性化された場合、抗腫瘍活性があることが知られてお
り（非特許文献７を参照。）、その抗腫瘍性はヒトの同
型ＮＫＴ細胞においても同様である。このような機能に
おいてＮＫＴ細胞は注目され研究が進められていた。Further, Vα14NKT cells are known to have antitumor activity when they are specifically activated in vivo by the above-mentioned glycolipids via TCR (see Non-Patent Document 7). ), Its antitumor properties are similar in human homologous NKT cells. NKT cells have been attracting attention and research has been advanced in these functions.
【０００５】一方、Ｖα１４ＮＫＴ細胞の発生が抑制さ
れるＣＤ１ｄ遺伝子欠損（ＣＤ１ｄ−／−）マウスにお
いてはＩ型アレルギー誘導物質投与に伴うＩｇＥの産生
が野生型マウスと有意な差が見られないとの報告があり
（非特許文献８〜１０を参照。）、特にＴｈ２細胞への
分化誘導に対してのＶα１４ＮＫＴ細胞の役割には疑問
が投げかけられていた。また、このＣＤ１ｄ遺伝子欠損
マウスにおいて、ＮＫ１．１、Ｔ細胞レセプター共陽性
のＮＫＴ細胞の表現型を有する細胞が依然として存在
し、Ｖα１４ＮＫＴ細胞とは異なるＮＫＴ細胞サブセッ
トの存在が示唆された（非特許文献１１を参照。）。On the other hand, in CD1d gene-deficient (CD1d-/-) mice in which the development of Vα14NKT cells is suppressed, IgE production accompanying administration of type I allergens is not significantly different from that of wild type mice. There have been reports (see Non-Patent Documents 8 to 10), and in particular, the role of Vα14NKT cells in inducing differentiation into Th2 cells has been questioned. Further, in this CD1d gene-deficient mouse, cells having the NK1.1 and T cell receptor co-positive NKT cell phenotype still existed, suggesting the presence of an NKT cell subset different from Vα14NKT cells (Non-Patent Document 1). See 11).
【０００６】これらの事実に基づき、ＮＫＴ細胞集団の
異種混合性に注目し、Ｖα１４ＮＫＴ細胞とは異なるＮ
ＫＴ細胞サブセット、あるいはそれに由来する細胞を取
得し、解析することにより、該細胞によるＶα１４ＮＫ
Ｔ細胞とは異なる免疫系制御方法の開発が期待された。
一方、哺乳動物末梢血についてのｒｔＰＣＲ分析から、
均一なＴＣＲα鎖としてＶα１９．１を発現する細胞の
存在が示された。さらに、このＴＣＲを発現するマウス
細胞に由来する融合細胞株が作成され、該融合細胞が有
するＴＣＲα鎖、及びβ鎖の塩基配列が決定された（非
特許文献１２を参照。）。しかし、ここで均一なＴＣＲ
α鎖、及びβ鎖を有する細胞がＮＫＴ細胞に属する細胞
由来であるかについては調べられておらず、また該細胞
のその他の性質、及び機能等については解析が行われて
いない。従ってこれがＶα１４以外の均一なＴＣＲを発
現するＮＫＴ細胞サブセットであるかについては依然と
して不明であった。Based on these facts, attention is paid to the heterogeneity of the NKT cell population, and the N
By obtaining and analyzing the KT cell subset or cells derived therefrom, Vα14NK by the cells is obtained.
Development of an immune system control method different from T cells was expected.
On the other hand, from rtPCR analysis on mammalian peripheral blood,
The presence of cells expressing Vα19.1 as a homogeneous TCRα chain was shown. Furthermore, a fused cell line derived from this TCR-expressing mouse cell was prepared, and the nucleotide sequences of the TCR α chain and β chain possessed by the fused cell were determined (see Non-Patent Document 12). But here the uniform TCR
It has not been investigated whether the cells having the α chain and the β chain are derived from cells belonging to NKT cells, and other properties and functions of the cells have not been analyzed. Therefore, it was still unclear whether this is a NKT cell subset expressing a uniform TCR other than Vα14.
【０００７】[0007]
【非特許文献１】Ｍａｋｉｎｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，１１５７−１１６１
（１９９５）；Ｏｈｔｅｋｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３，１２７７−１２８２
（１９９６）[Non-Patent Document 1] Makino, Y. , Et al. ，
Int. Immunol. , 7, 1157-1161
(1995); Ohteki, T .; , Et al. ，
J. Exp. Med. , 183, 1277-1282
(1996)
【非特許文献２】Ｋａｗａｎｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，１６２６−１６２９（１９９
７）[Non-Patent Document 2] Kawano, T .; , Et al. ，
Science, 278, 1626-1629 (199
7)
【非特許文献３】Ａｒａｓｅ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３，２３９１−２３９６
（１９９６）[Non-Patent Document 3] Arase, H .; , Et al. ，
J. Exp. Med. , 183, 2391-2396
(1996)
【非特許文献４】Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０，１８４５−１８４７
（１９９５）[Non-Patent Document 4] Yoshimoto, T. et al. , Et a
l. , Science, 270, 1845-1847.
(1995)
【非特許文献５】Ｍｉｅｚａ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６，４０３５−４０
４０（１９９６）[Non-Patent Document 5] Mieza, M. et al. A. , Et a
l. J. Immunol. , 156, 4035-40
40 (1996)
【非特許文献６】Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓ．Ｂ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，１７７−１８１（１９９
８）[Non-Patent Document 6] Wilson, S. et al. B. , Et a
l. , Nature, 391, 177-181 (199
8)
【非特許文献７】Ｋａｗａｎｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９
５，５６９０−５６９３（１９９８）[Non-Patent Document 7] Kawano, T. et al. , Et al. ，
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9
5, 5690-5693 (1998)
【非特許文献８】Ｓｍｉｌｅｙ，Ｓ．Ｔ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２７５，９７７−９７９（１
９９７）[Non-Patent Document 8] Smiley, S. et al. T, et a
l. , Science. , 275, 977-979 (1
997)
【非特許文献９】Ｃｈｅｎ，Ｙ．−Ｈ， ｅｔ ａ
ｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６，４５９−４６７（１９９
７）[Non-Patent Document 9] Chen, Y. -H, et a
l. , Immunity, 6, 459-467 (199
7)
【非特許文献１０】Ｍｅｎｄｉｒａｔｔａ，Ｓ．Ｋ，
ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６，４６９−４７７
（１９９７）[Non-Patent Document 10] Mendiratta, S. et al. K,
et al. , Immunity, 6, 469-477.
(1997)
【非特許文献１１】Ｅｂｅｒｌ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２，６４１０−６４１９
（１９９９）[Non-Patent Document 11] Eberl, G. et al. , Et al. ，
J. Immunol. , 162, 6410-6419
(1999)
【非特許文献１２】Ｔｉｌｌｏｙ，Ｆ，ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９，１９０７−１９２１
（１９９９）[Non-Patent Document 12] Tilley, F, et al. ，
J. Exp. Med. , 189, 1907-1921
(1999)
【０００８】[0008]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＮＫＴ細胞
集団の異種混合性に注目し、Ｖα１４とは異なる均一な
ＴＣＲを発現するＮＫＴ細胞（以下、これを「非Ｖα１
４ＮＫＴ細胞」と称することがある）を取得、解析する
ことの必要性を考え、非Ｖα１４ＮＫＴ細胞の取得、該
細胞由来の融合細胞株の樹立、及び該細胞による免疫系
制御方法を開発すること、並びに該ＮＫＴ細胞が有する
Ｔ細胞レセプターα鎖をコードするＤＮＡがＴ細胞特異
的に発現するように導入された非ヒト哺乳動物を取得す
ること等を目的としてなされたものである。The present invention focuses on the heterogeneity of NKT cell populations, and expresses a uniform TCR different from Vα14 (hereinafter referred to as "non-Vα1").
4NKT cell "), and the need to analyze, to obtain a non-Vα14NKT cell, establish a fused cell line derived from the cell, and develop a method for controlling the immune system by the cell. In addition, the purpose of the present invention is to obtain a non-human mammal into which the DNA encoding the T cell receptor α chain possessed by the NKT cells has been introduced so as to express specifically in T cells.
【０００９】[0009]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を達成すべく鋭意検討した結果、ＣＤ１ｄ欠損マウス中
のＮＫＴ細胞様細胞集団中から、Ｖα１４とは異なる均
一なＶα鎖を発現する細胞を取得した。また、該細胞に
由来する融合細胞株を樹立し、当該細胞が有するＶα
鎖、及びβ鎖の構造を解析したところ、均一なＶα１
９．１−Ｊα２６を発現していることを見出した。さら
に、取得した融合細胞についてそのＴＣＲを介した刺激
に応答したサイトカインの分泌を解析したところＩＬ−
４／ＩＦＮ−γの分泌量の比率が、同様の方法で作成し
たＶα１４ＮＫＴ細胞由来の融合細胞株と比較して大き
いことを見出した。また、上記のＶα１９．１−Ｊα２
６を有するＴ細胞レセプターα鎖をコードするＤＮＡを
取得し、これをＣ５７ＢＬ／６マウスの受精卵に注入し
てトランスジェニックマウスを得たところ、Ｔｈ２タイ
プのサイトカインを産生するＮＫＴ細胞が多く発現して
いる動物が取得された。また、該動物のイムノグロブリ
ンＥの産生量は、野生型に比べて多く、逆にヤギ抗マウ
スイムノグロブリンＤ抗体の刺激によるイムノグロブリ
ンＥ産生の上昇が野生型に比べて抑制されていることを
見出した。本発明はこられの知見に基づいて成し遂げら
れたものである。[Means for Solving the Problems] As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors express a uniform Vα chain different from Vα14 from the NKT cell-like cell population in CD1d-deficient mice. The cells were obtained. In addition, a fused cell line derived from the cell was established, and Vα possessed by the cell was established.
The structure of the chain and β chain was analyzed and found to be uniform Vα1.
It was found that 9.1-Jα26 was expressed. Furthermore, when the secretion of cytokines in response to the TCR-mediated stimulation of the obtained fused cells was analyzed, IL-
It was found that the ratio of 4 / IFN-γ secretion amount was larger than that of the Vα14NKT cell-derived fused cell line prepared by the same method. In addition, the above Vα19.1-Jα2
A DNA encoding a T cell receptor α chain having 6 was obtained, and this was injected into fertilized eggs of C57BL / 6 mice to obtain transgenic mice. As a result, many NKT cells that produce Th2 type cytokines were expressed. The animals that have been acquired. In addition, the production amount of immunoglobulin E in the animal is higher than that in the wild type, and conversely, the increase in immunoglobulin E production due to the stimulation of goat anti-mouse immunoglobulin D antibody is suppressed as compared with the wild type. I found it. The present invention has been accomplished based on these findings.
【００１０】即ち、本発明によれば、（１）以下の
（ａ）または（ｂ）の性質を有するＮＫＴ細胞、（ａ）
配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＴ細胞レセプター
を有し、かつＴ細胞レセプターを介した刺激に応答して
Ｔｈ２タイプのサイトカインを産生する、（ｂ）配列番
号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から
なるＴ細胞レセプターを有し、かつＴ細胞レセプターを
介した刺激に応答してＴｈ２タイプのサイトカインを産
生する、（２）上記（１）に記載のＮＫＴ細胞を特異的
に認識する抗体、（３）抗原が、少なくとも配列番号１
のアミノ酸番号１１０〜１１６で表されるアミノ酸配列
を含むポリペプチドである上記（２）に記載の抗体、
（４）上記（２）または（３）に記載の抗体を有効成分
として含有する免疫調節剤、（５）血液または骨髄液の
細胞群に上記（２）または（３）に記載の抗体を接触さ
せ、該抗体への結合度を指標として細胞を選抜すること
を特徴とするＮＫＴ細胞の取得方法、（６）血液中の細
胞群に、上記（２）または（３）に記載の抗体を接触さ
せ、該抗体への結合する細胞数を測定することを特徴と
する血液中のＮＫＴ細胞の測定方法、（７）少なくとも
上記（２）または（３）に記載の抗体を含む、上記
（６）に記載の方法に用いるための試薬キット、（８）
被検物質と上記（１）に記載のＮＫＴ細胞とを共培養
し、該ＮＫＴ細胞の表現型の変化を指標として被検物質
を選抜することを特徴とする免疫調節活性を有する物質
のスクリーニング方法、（９）被検物質が抗原提示細胞
に提示されていることを特徴とする上記（８）に記載の
方法、（１０）被検物質と上記（１）に記載のＮＫＴ細
胞とを、上記（２）または（３）に記載の抗体の存在下
で共培養し、被検物質による該ＮＫＴ細胞と該抗体との
結合性の阻害度を指標として被検物質を選抜することを
特徴とする免疫調節活性を有する物質のスクリーニング
方法、（１１）上記（８）〜（１０）のいずれかに記載
のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分と
する免疫調節剤、（１２）上記（８）〜（１０）のいず
れかに記載のスクリーニング方法により選抜された物質
を製剤化することを特徴とする免疫調節剤の製剤化方
法、（１３）以下の（ａ）または（ｂ）のＴ細胞レセプ
ターα鎖をコードするＤＮＡがＴ細胞特異的に発現する
ように導入されていることを特徴とする非ヒト哺乳動
物、（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＴ細胞
レセプターα鎖、（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列
において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しく
は付加されたアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターα
鎖であって、ＮＫＴ細胞に発現させたとき、該ＮＫＴ細
胞がＴ細胞レセプターを介した刺激に応答してＴｈ２タ
イプのサイトカインを産生するもの、（１４）ＤＮＡが
配列番号８に示す塩基配列を有することを特徴とする上
記（１３）に記載の動物、（１５）上記（１３）または
（１４）に記載の動物に被検物質を投与し、該動物体内
のイムノグロブリンＥの発現量の変化を解析し、該発現
量を調節する作用を指標として被検物質を選抜すること
を特徴とする抗アレルギー作用を有する物質のスクリー
ニング方法、（１６）保有するＮＫＴ細胞の全てが上記
（１）に記載のＮＫＴ細胞である非ヒト哺乳動物、が、
提供される。That is, according to the present invention, (1) an NKT cell having the following properties (a) or (b), (a)
(B) 1 or a number in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, which has a T cell receptor containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and produces a Th2 type cytokine in response to stimulation through the T cell receptor Having a T cell receptor consisting of an amino acid sequence in which one amino acid has been deleted, substituted or added, and produces a Th2-type cytokine in response to stimulation through the T cell receptor (2) (1) above The antibody specifically recognizing NKT cells according to 1., (3) antigen is at least SEQ ID NO: 1.
The antibody according to (2) above, which is a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 110 to 116 of
(4) An immunomodulator containing the antibody according to (2) or (3) above as an active ingredient, (5) a cell group of blood or bone marrow fluid contacted with the antibody according to (2) or (3) above And a method for obtaining NKT cells, characterized by selecting cells using the degree of binding to the antibody as an index, (6) contacting the cell group in blood with the antibody according to (2) or (3) above And measuring the number of cells bound to the antibody, (7) at least the antibody according to (2) or (3) above, (6) A reagent kit for use in the method described in (8).
A method for screening a substance having an immunomodulatory activity, which comprises co-culturing a test substance and the NKT cell according to the above (1), and selecting the test substance using the phenotype change of the NKT cell as an index. (9) The method according to (8) above, wherein the test substance is presented to an antigen-presenting cell, (10) the test substance and the NKT cell according to (1) above, It is characterized in that it is co-cultured in the presence of the antibody according to (2) or (3), and the test substance is selected by using the degree of inhibition of the binding property between the NKT cell and the antibody by the test substance as an index. (11) A method for screening a substance having an immunomodulatory activity, (11) An immunomodulator comprising the substance obtained by the screening method according to any one of (8) to (10) as an active ingredient, (12) above (8) to The screen according to any one of (10). (13) A method for formulating an immunomodulator, which comprises formulating a substance selected by the method of (a) or (b) below, wherein the DNA encoding the α chain of the T cell receptor is T cell specific. A non-human mammal characterized in that it is introduced so that it expresses specifically, (a) a T cell receptor α chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (b) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 Alternatively, T cell receptor α consisting of an amino acid sequence in which several amino acids have been deleted, substituted or added
A chain which, when expressed in NKT cells, produces Th2 type cytokines in response to stimulation through the T cell receptor, (14) DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 (15) The test substance is administered to the animal according to (13) above, (15) the animal according to (13) or (14) above, and the expression level of immunoglobulin E in the animal body is changed. And a screening method for a substance having an anti-allergic effect, which comprises selecting a test substance using the action of regulating the expression level as an index, (16) All of the NKT cells possessed are as described in (1) above. A non-human mammal that is the NKT cell described,
Provided.
【００１１】[0011]
【発明の実施の形態】以下、発明の内容を詳細に説明す
る。
（１）非Ｖα１４ＮＫＴ細胞の取得
本発明のＮＫＴ細胞の供給源としては、従来知られてい
るＶα１４ＮＫＴ細胞と異なるサブセットを有するＮＫ
Ｔ細胞を有しているものであれば如何なるものであって
もよいが、ＮＫＴ細胞のマーカとして現在入手可能であ
るものがＮＫ１．１のみであることから、該マーカーを
発現しているＮＫＴ細胞を有するものが特に好ましく用
いられる。具体的には、Ｖα１４ＮＫＴ細胞が認識する
ＣＤ１ｄが欠損しておりＶα１４ＮＫＴ細胞の発生が抑
制されているＣＤ１ｄ欠損動物で、かつＮＫＴ細胞マー
カーであるＮＫ１．１を発現する動物等が挙げられる。
このＣＤ１ｄ欠損動物は、上記性質を有する動物であれ
ば特に制限されないが、具体的には、例えば、ハーバー
ド大学医学部のＭ．Ｊ．Ｇｒｕｓｂｙ博士によって樹立
されたＣＤ１ｄ−／−マウス（Ｓｍｉｌｅｙ，Ｓ．Ｔ，
ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２７５，９７７−
９７９（１９９７））等（以下、これを「ＣＤ１ｄ−／
−マウス」と称することがある）が好ましく用いられ
る。ここで、ＣＤ１ｄ−／−マウスは、ターゲッティン
グベクターを導入した１２９系統マウスＥＳ細胞をＢＡ
ＬＢ／ｃマウスに移植して作成したものであり、ＮＫ
１．１を発現していないため、これを発現するＣ５７Ｂ
Ｌ／６マウスと交配を繰り返すことにより得られるＮＫ
１．１陽性、Ｈ−２ハプロタイプがｂのＣＤ１ｄ−／−
マウスが特に好ましく用いられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The contents of the invention will be described in detail below. (1) Acquisition of non-Vα14NKT cells As a source of the NKT cells of the present invention, NK having a subset different from the conventionally known Vα14NKT cells
Any T cell may be used as long as it has T cells, but since the only marker currently available for NKT cells is NK1.1, NKT cells expressing the marker are available. Those having are particularly preferably used. Specific examples thereof include a CD1d-deficient animal in which CD1d recognized by Vα14NKT cells is deficient and the development of Vα14NKT cells is suppressed, and which expresses the NKT cell marker NK1.1.
The CD1d-deficient animal is not particularly limited as long as it has the above-mentioned properties, and specifically, for example, M.D. of Harvard Medical School can be used. J. CD1d − / − mice established by Dr. Grusby (Smiley, ST,
et al. , Science. , 275,977-
979 (1997)), etc. (hereinafter referred to as "CD1d- /
-Sometimes referred to as "mouse") is preferably used. Here, the CD1d − / − mouse was obtained by transfecting a targeting vector-introduced 129 strain mouse ES cell with BA
It was created by transplanting into LB / c mice, and NK
C57B that expresses 1.1 because it does not express 1.1
NK obtained by repeated mating with L / 6 mice
1.1 positive, CD-2d-/-with H-2 haplotype b
Mouse is particularly preferably used.
【００１２】このような動物から肝臓等の適当な臓器、
あるいは血液等を採取し、それ自体既知の通常用いられ
る方法によりこれらに含有される細胞を分離した後、適
当な標識物質を結合させたＮＫＴ細胞のマーカー分子と
接触させ、該マーカー分子に結合させた標識から発せら
れるシグナルを指標としてＮＫＴ細胞を選抜し取得する
ことができる。採取する臓器としては、ＮＫＴ細胞がよ
り多く存在する肝臓が特に好ましい。ＮＫＴ細胞のマー
カー分子としては、ＮＫＴ細胞特異的に発現しているタ
ンパク質に結合する物質であれば如何なるものであって
もよいが、具体的には、例えば、ナチュラルキラー細胞
レセプターの一つであるＮＫ１の特異的抗体等と、Ｔ細
胞レセプターの特異的抗体の組み合わせ等が好ましく用
いられる。ここで、上記ＮＫ１のうち、そのアロタイプ
の一つであるＮＫ１．１の特異的抗体が現在唯一入手可
能なナチュラルキラー細胞のマーカー分子である。From such animals, suitable organs such as the liver,
Alternatively, blood or the like is collected, and cells contained therein are separated by a commonly known method known per se, and then contacted with a marker molecule of NKT cells to which an appropriate labeling substance is bound to bind to the marker molecule. The NKT cells can be selected and obtained using the signal emitted from the label as an index. As the organ to be collected, the liver having more NKT cells is particularly preferable. The NKT cell marker molecule may be any substance as long as it is a substance that binds to a protein specifically expressed in NKT cells. Specifically, it is one of natural killer cell receptors, for example. A combination of NK1 specific antibody and T cell receptor specific antibody is preferably used. Here, among the above-mentioned NK1, the specific antibody of NK1.1, which is one of the allotypes, is the only currently available marker molecule for natural killer cells.
【００１３】マーカー分子に結合させる標識物質として
は、これが発するシグナルを検出する検出機器に適した
ものを選択して用いることができるが、例えば、標識物
質としてＦＩＴＣ等の蛍光物質を用いる場合にはフロー
サイトメーター等により蛍光を感知して分離する方法が
用いられ、また標識物質がビオチンのような特定の物質
に結合する性質を有するものであれば、これと結合する
ストレプトアビジン等を結合したマグネティックビーズ
等を用いて分離する方法を用いることができる。 かく
して得られた、Ｖα１４とは異なる均一なＶα鎖を有す
るＮＫＴ細胞を、非Ｖα１４ＮＫＴ細胞とした。As the labeling substance to be bound to the marker molecule, a substance suitable for a detection device for detecting the signal emitted by the marker molecule can be selected and used. A method in which fluorescence is detected by a flow cytometer or the like is used for separation, and if the labeling substance has a property of binding to a specific substance such as biotin, a magnetic substance to which streptavidin or the like that binds to this is bound is used. A method of separating using beads can be used. The NKT cells thus obtained having a uniform Vα chain different from Vα14 were designated as non-Vα14 NKT cells.
【００１４】（２）非Ｖα１４ＮＫＴ細胞のＴ細胞レセ
プターの構造解析
上記で得られた非Ｖα１４ＮＫＴ細胞については、これ
が有するＴ細胞レセプターのサブセットの構造を解析す
ることにより、均一なＶα鎖、及びβ鎖を有するＮＫＴ
細胞であること、及びそのアミノ酸配列を確認すること
ができる。しかし、上記した取得方法によった場合、最
もＮＫＴ細胞の含有率の高い肝臓を供給源とした場合に
も非Ｖα１４ＮＫＴ細胞は有核細胞全体の１〜２％程度
しか回収できず、取得できる細胞は極少ない。従って、
これらの細胞が有するＴ細胞レセプターの構造解析を行
う場合、これらの細胞とＴ細胞腫瘍細胞との融合細胞を
作成し、該融合細胞を増殖させ、これを用いてＴ細胞レ
セプターのサブセットの構造を解析するのが好ましい。(2) Structural analysis of T cell receptor of non-Vα14NKT cells With respect to the non-Vα14NKT cells obtained above, by analyzing the structure of a subset of the T cell receptor possessed by them, a uniform Vα chain and β chain can be obtained. With NKT
It can be confirmed that it is a cell and its amino acid sequence. However, according to the above-mentioned acquisition method, non-Vα14NKT cells can collect only about 1 to 2% of all nucleated cells even when the liver having the highest content rate of NKT cells is used as a supply source, and thus can be acquired. Is very few. Therefore,
When the structural analysis of the T cell receptor possessed by these cells is carried out, fused cells of these cells and T cell tumor cells are prepared, the fused cells are proliferated, and this is used to determine the structure of a subset of T cell receptors. It is preferable to analyze.
【００１５】用いられるＴ細胞腫瘍細胞は、特に限定さ
れないが、上記非Ｖα１４ＮＫＴ細胞を取得した動物と
同種の動物の細胞株を用いるのが好ましい。非Ｖα１４
ＮＫＴ細胞がマウスから取得された場合には、マウスの
Ｔ細胞腫瘍細胞、具体的には、ＢＷ５１４７のＴＣＲ陰
性の変異株（Ｂｏｒｎ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，７，２７９−２９１（１９８８））等
が好ましく用いられる。細胞の融合は、齋藤隆ら、新生
化学実験講座１２、分子免疫学Ｉ、ｐ．１４１−１４７
（１９８９）、東京化学同人等に記載の常法を用いるこ
とができる。具体的には、例えば、まず、非Ｖα１４Ｎ
ＫＴ細胞を、Ｘ照射等により細胞***能を消失させたバ
ックグラウンドが同一の動物の脾臓単核細胞の存在下で
前培養する。この際、ＴＣＲを発現する細胞を選択的に
増殖させるために抗ＴＣＲαβ抗体や、ＩＬ−７等を添
加することが好ましい。前培養後、非Ｖα１４ＮＫＴ細
胞とＴ細胞腫瘍細胞を適当な割合で混合し、適当な細胞
融合培地、例えばＲＰＭＩ１６４０やＭＥＭ培地等に、
５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を溶解した培
地等で培養することにより行うことができる。また、上
記細胞融合は、電気融合法（Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ
ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆ
ｔｅｎ，６８，５７７（１９８１））によっても行うこ
とができる。The T cell tumor cell used is not particularly limited, but it is preferable to use a cell line of an animal of the same species as the animal from which the non-Vα14NKT cell was obtained. Non-Vα14
When NKT cells are obtained from mice, they are mouse T cell tumor cells, specifically, a TCR-negative mutant strain of BW5147 (Born, W. et al., Res. I).
mmunol. , 7, 279-291 (1988)) and the like are preferably used. The fusion of cells is described in Takashi Saito et al., Laboratory for New Chemistry 12, Molecular Immunology I, p. 141-147
(1989), Tokyo Kagaku Dojin, etc. can be used. Specifically, for example, first, non-Vα14N
KT cells are precultured in the presence of splenic mononuclear cells of the same background in which the cell division ability has been eliminated by X irradiation or the like. At this time, it is preferable to add anti-TCRαβ antibody, IL-7 or the like in order to selectively proliferate cells expressing TCR. After pre-culturing, non-Vα14NKT cells and T cell tumor cells are mixed at an appropriate ratio, and then added to an appropriate cell fusion medium such as RPMI1640 or MEM medium.
It can be performed by culturing in a medium in which 50% polyethylene glycol (PEG) is dissolved. In addition, the above-mentioned cell fusion is performed by an electrofusion method (U. Zimmerman).
n. et al. , Naturewissenschaf
ten, 68, 577 (1981)).
【００１６】上記培養細胞群から融合細胞を選択する方
法としては、融合させるＴ細胞腫瘍細胞として８−アザ
グアニン耐性株を用いた場合には、適量のヒポキサンチ
ン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液を溶解した
ＨＡＴ培地で培養することにより融合細胞のみ生育させ
て行うことができる。選択培地において増殖してきた細
胞に対し、限界希釈法等を用いてこれをクローン化し、
さらに各細胞株についてＮＫＴ細胞であることを確認し
て、本発明の融合細胞を取得することができる。ＮＫＴ
細胞であることの確認は、上記と同様の方法で行うこと
ができる。かくして得られる非Ｖα１４ＮＫＴ細胞由来
融合細胞として、ＮＢ１０２、ＮＢ１０３、ＮＢ１０
４、ＮＢ１１０、ＮＢ１１５、ＮＢ１１６、ＮＢ２０
１、ＮＢ２０２、ＮＢ２０４、ＮＢ２０６、ＮＢ２０
８、ＮＢ２０９、ＮＢ２１１、ＮＢ２１２、ＮＢ２１
３、ＮＢ２１５、ＮＢ３０８、ＮＢ４０３、ＮＢ４０
４、ＮＢ４０５、ＮＢ４０８等が挙げられる。As a method for selecting fused cells from the above-mentioned cultured cell group, when an 8-azaguanine resistant strain is used as the T cell tumor cells to be fused, an appropriate amount of hypoxanthine / aminopterin / thymidine (HAT) solution is used. It is possible to grow only the fused cells by culturing in a dissolved HAT medium. For cells that have grown in the selective medium, clone it using the limiting dilution method or the like,
Furthermore, by confirming that each cell line is an NKT cell, the fused cell of the present invention can be obtained. NKT
The cells can be confirmed by the same method as above. The non-Vα14NKT cell-derived fused cells thus obtained are NB102, NB103, and NB10.
4, NB110, NB115, NB116, NB20
1, NB202, NB204, NB206, NB20
8, NB209, NB211, NB212, NB21
3, NB215, NB308, NB403, NB40
4, NB405, NB408 and the like.
【００１７】（３）非Ｖα１４ＮＫＴ細胞のＴＣＲの構
造解析
非Ｖα１４ＮＫＴ細胞が有するＴＣＲの構造解析は、上
記動物肝細胞より得られた細胞でも、該細胞由来の融合
細胞のＴＣＲを解析することによっても行うことができ
る。ＮＫＴ細胞のＴＣＲはα鎖とβ鎖のヘテロダイマー
で構成され、α鎖は可変（Ｖ）領域、結合（Ｊ）領域、
定常（Ｃ）領域からなり、β鎖はＶ領域、Ｊ領域、Ｃ領
域、及び多様性（Ｄ）領域からなる。通常、ＴＣＲは抗
原特異的な認識ができるよう遺伝子レベルで再構成が行
われサブセットが多様性を有するが、従来知られている
ＮＫＴ細胞であるＶα１４ＮＫＴ細胞はこのＶα、Ｊ
α、Ｖβ鎖を構成するサブセットが均一であり、これに
特異的に結合する抗原（ＣＤ１ｄ上に提示された糖脂
質）を認識する。本発明のＮＫＴ細胞も同様に特殊な抗
原を認識するための均一なＶ、及びＪ領域を有すること
が予想されるため、このＴＣＲの遺伝子レベルでの解析
を行うものである。(3) Structural analysis of TCR of non-Vα14NKT cells Structural analysis of TCR of non-Vα14NKT cells can be performed by analyzing TCR of cells obtained from the above-mentioned animal hepatocytes or fused cells derived from the cells. It can be carried out. The TCR of NKT cells is composed of a heterodimer of an α chain and a β chain, and the α chain has a variable (V) region, a binding (J) region,
It consists of a constant (C) region, and the β chain consists of a V region, a J region, a C region, and a diversity (D) region. Usually, the TCR is rearranged at the gene level so that it can be recognized specifically in the antigen, and the subset has diversity.
The subsets that make up the α and Vβ chains are uniform and recognize an antigen (glycolipid presented on CD1d) that specifically binds to it. Since the NKT cells of the present invention are also expected to have uniform V and J regions for recognizing special antigens, this TCR is analyzed at the gene level.
【００１８】上記で取得した非Ｖα１４ＮＫＴ細胞のＶ
α、Ｊα、Ｖβ、あるいはＪβの遺伝子レベルでの構造
解析の方法としては、非Ｖα１４ＮＫＴ細胞、または該
細胞由来の融合細胞からそれ自体既知の通常用いられる
方法によりＲＮＡを調製し、これを鋳型としてｃＤＮＡ
を合成し、配列決定を行う方法が好ましい。ＲＮＡは、
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡでもｍＲＮＡでもよく、その抽出法
も常法を用いることができ、その後のｃＤＮＡ合成に適
したものを選択して用いることができる。具体的には、
ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）等の市販のキットを
用いる方法や、Ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｕｍ ｔｈｉ
ｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒ
ｍ（ＡＧＰＣ）法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．，ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１
５６−１５９（１９８７））等が挙げられる。V of the non-Vα14NKT cells obtained above
As a method for structural analysis at the gene level of α, Jα, Vβ, or Jβ, RNA is prepared from a non-Vα14NKT cell or a fused cell derived from the cell by a commonly used method known per se, and this is used as a template. cDNA
Is preferred and the sequence is determined. RNA is
Either total RNA or mRNA may be used, and the extraction method thereof may be a conventional method, and a suitable one for subsequent cDNA synthesis may be selected and used. In particular,
Methods using commercially available kits such as ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd.) and Acid guanidium thi
ocyanate-phenol-chloroform
m (AGPC) method (Chomczynski, P., e
t al. , Anal. Biochem. , 162, 1
56-159 (1987)) and the like.
【００１９】ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡの合成法も、
それ自体既知の適当な方法を用いることができるが、本
発明のＮＫＴ細胞が有するＴＣＲα鎖はその５’側に位
置するＶ、Ｊ領域の配列は未知であるが、３’側に位置
するＣ領域についてはその配列が保存されており、既知
であるため、該領域の配列に相補的なプライマーを用い
た５’ＲＡＣＥ法を用いて行うことが好ましい。５’Ｒ
ＡＣＥ法については特に制限はないが、市販のキットを
用いて行うのが簡便である。具体的には、例えば、５’
−Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ（ＴＡＫＡＲ
Ａ社製）等が好ましく用いられる。A method for synthesizing cDNA using RNA as a template is also
Although an appropriate method known per se can be used, the TCRα chain of the NKT cell of the present invention has a V and J region located at the 5'side thereof, but the sequence of the V region and J region thereof is unknown, but C located at the 3'side thereof is unknown. Since the sequence of the region is conserved and known, it is preferable to use the 5'RACE method using a primer complementary to the sequence of the region. 5'R
The ACE method is not particularly limited, but it is convenient to perform it using a commercially available kit. Specifically, for example, 5 '
-Full RACE Core Set (TAKAR
(Manufactured by Company A) and the like are preferably used.
【００２０】このようにして取得した非Ｖα１４ＮＫＴ
細胞のＶα鎖、及びＪα鎖を解析したところ、均一なＶ
α１９．１−Ｊα２６鎖で構成されるＴＣＲを有するＮ
ＫＴ細胞が最も多かったため、このサブセットを有する
ＮＫＴ細胞を本発明のＮＫＴ細胞（以下「Ｖα１９ＮＫ
Ｔ細胞」と称することがある）とした。ここで、Ｖα１
９．１−Ｊα２６鎖を構成するアミノ酸配列としては、
例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するものが
挙げられる。Ｖα１９．１―Ｊα２６はマウスのＴＣＲ
サブセットであるが、他種の動物においてこれと相同性
の高いＤＮＡ配列によりコードされるＴＣＲを有するＮ
ＫＴ細胞も、下述のサイトカイン産生解析によってＴｈ
２タイプのサイトカインを産生する機能を有することが
確認されれば、本発明のＶα１９ＮＫＴ細胞に含有され
るものである。このようなＮＫＴ細胞として具体的に
は、均一なＴＣＲα鎖としてヒトＶα７Ｓ２−Ｊα３３
のサブセット（配列番号２）を有するＮＫＴ細胞が挙げ
られる。本明細書中では、配列番号１に記載のアミノ酸
配列または、これらのアミノ酸配列において１若しくは
数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
酸配列を含むＴＣＲα鎖を、全て「Ｖα１９−ＴＣＲα
鎖」と称することがある。The non-Vα14NKT thus obtained
When the Vα chain and Jα chain of the cell were analyzed, a uniform V
N having TCR composed of α19.1-Jα26 chain
Since KT cells were the most abundant, NKT cells having this subset were used as NKT cells of the present invention (hereinafter referred to as “Vα19NK”).
Sometimes referred to as "T cell"). Where Vα1
As the amino acid sequence constituting the 9.1-Jα26 chain,
Examples include those having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Vα19.1-Jα26 is the mouse TCR
N with a TCR encoded by a DNA sequence that is a subset but highly homologous to it in other species of animals
KT cells were also detected in Th by the cytokine production analysis described below.
If it is confirmed that it has a function of producing two types of cytokines, it is contained in the Vα19NKT cells of the present invention. As such an NKT cell, specifically, as a uniform TCR α chain, human Vα7S2-Jα33
NKT cells having a subset of (SEQ ID NO: 2). In the present specification, all TCRα chains containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in these amino acid sequences are referred to as “Vα19-TCRα”.
Sometimes referred to as "chain".
【００２１】すなわち、本発明のＮＫＴ細胞は、ａ）配
列番号１に示すアミノ酸配列を含むＴ細胞レセプターを
有し、かつＴ細胞レセプターを介した刺激に応答してＴ
ｈ２タイプのサイトカインを産生する性質を有するもの
のみならず、ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列におい
て１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
されたアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターを有し、
かつＴ細胞レセプターを介した刺激に応答してＴｈ２タ
イプのサイトカインを産生する性質を有するものも含有
する。ここで、配列番号１において１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列の
具体例として、図１に示すとおり、配列番号１において
アミノ酸番号１１０のＡｒｇがＬｅｕ、ＧｌｙまたはＩ
ｌｅに置換された配列、アミノ酸番号１１２のＳｅｒが
Ａｒｇに置換された配列等を挙げることができる。That is, the NKT cell of the present invention has a) a T cell receptor containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and responds to stimulation via the T cell receptor.
Not only those having the property of producing h2-type cytokines, but also b) having a T cell receptor consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. ,
In addition, those having the property of producing Th2-type cytokines in response to stimulation via the T cell receptor are also included. Here, as a specific example of the amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 1, as shown in FIG. 1, Arg of amino acid number 110 in SEQ ID NO: 1 is Leu, Gly or I.
Examples thereof include a sequence substituted with le and a sequence substituted with Arg at Ser of amino acid number 112.
【００２２】（４）ＮＫＴ細胞のサイトカイン産生解析
本発明のＮＫＴ細胞がその均一なＶα鎖、及びβ鎖を有
するＴＣＲへの刺激に応答して発現するサイトカインの
種類、及びその量を解析する方法としては、それ自体既
知の通常用いられる方法を適宜選択して用いることがで
きる。ＴＣＲへの刺激の誘導法としては、例えば、Ｖα
１９ＮＫＴ細胞、あるいは該細胞由来の融合細胞の細胞
膜上に点在するＴＣＲを、抗ＣＤ３ε抗体等により集合
させる方法が挙げられる。抗ＣＤ３ε抗体等によるＮＫ
Ｔ細胞のＴＣＲの集合は、例えばＮＫＴ細胞を該抗体を
コートした培養皿において培養する方法や、ＮＫＴ細胞
と該抗体を共培養して接触させた後に、抗ＣＤ３ε抗体
に特異的に結合する２次抗体を添加する方法等が挙げら
れる。ＴＣＲへの刺激を誘導後、該ＮＫＴ細胞をさらに
培養し、該培養液の上清に対して、各種サイトカインの
抗体を用いたＥｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎ
ｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｇｖ
ａｌｌ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，８（９），８７１−８７４（１９７２））を
用いて測定すること等により、ＴＣＲへの刺激に応答し
て本発明のＮＫＴ細胞が産生するサイトカインの種類、
及びその量を解析することができる。上記の解析によ
り、本発明のＶα１９ＮＫＴ細胞はいずれもＩＬ−４／
ＩＦＮ−γ分泌のバランスがＶα１４ＮＫＴ細胞株と比
較してＩＬ−４側に偏っており、Ｔｈ２タイプのサイト
カイン産生能があることが判明した。(4) Analysis of cytokine production by NKT cells A method for analyzing the type and amount of cytokines expressed by the NKT cells of the present invention in response to stimulation of TCR having the uniform Vα chain and β chain. As the above, a commonly used method known per se can be appropriately selected and used. As a method of inducing stimulation to TCR, for example, Vα
Examples include a method of assembling TCRs scattered on the cell membrane of 19NKT cells or fused cells derived from the cells with an anti-CD3ε antibody or the like. NK by anti-CD3ε antibody etc.
The aggregation of TCRs of T cells can be obtained by, for example, culturing NKT cells in a culture dish coated with the antibody, or by co-culturing the NKT cells with the antibody and bringing them into contact with each other, and then specifically binding to the anti-CD3ε antibody 2 Examples include a method of adding a secondary antibody. After inducing TCR stimulation, the NKT cells were further cultured, and the supernatant of the culture medium was subjected to Enzyme-linked immunization using antibodies of various cytokines.
sorbent assay (ELISA: Engv
all, E.I. , Et al. , Immunochemi
Stry, 8 (9), 871-874 (1972)) and the like to determine the type of cytokine produced by the NKT cells of the present invention in response to stimulation of TCR,
And its amount can be analyzed. Based on the above analysis, all of the Vα19NKT cells of the present invention were IL-4 /
The balance of IFN-γ secretion was biased toward the IL-4 side as compared with the Vα14NKT cell line, and it was revealed that it has the ability to produce Th2 type cytokines.
【００２３】（５）Ｖα１９−ＴＣＲα鎖をコードする
ＤＮＡが導入された動物の作製
上記（３）で特定されたＶα１９ＮＫＴ細胞が有するＴ
ＣＲα鎖をコードするＤＮＡを、ヒト以外の哺乳類動物
にＴ細胞特異的に発現するように導入することによれ
ば、Ｖα１９−ＴＣＲα鎖を発現しているＮＫＴ細胞
が、野生型に比べて多い特徴を有する動物を取得するこ
とができる。
（i）導入ＤＮＡの構築
本発明において、導入するＤＮＡ（以下、これを「導入
ＤＮＡ」と称することがある）としては、Ｖα１９−Ｔ
ＣＲα鎖をコードしており、かつ該ＴＣＲα鎖がＴ細胞
特異的に発現するような構成を有するものであれば如何
なるものでもよい。具体的には、ＴＣＲα鎖のＬ、Ｖ、
Ｊ、Ｃ領域をコードするＤＮＡ（以下、これを「コーデ
ィング領域ＤＮＡ」と称することがある）と、発現制御
領域からなるものが用いられる。このうち、ＴＣＲα鎖
のＶ、Ｊ領域としては、配列番号１に示されるアミノ酸
配列からなるものか、あるいは、配列番号１に示される
アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、か
つ該Ｖ、Ｊ領域を含むＴ細胞レセプターα鎖をＮＫＴ細
胞に発現させたとき、該ＮＫＴ細胞がＴ細胞レセプター
を介した刺激に応答してＴｈ２タイプのサイトカインを
産生するものが挙げられる。また、Ｌ領域およびＣ領域
は、用いるＶ、Ｊ領域のＤＮＡと同種の動物由来のもの
であれば特に制限はない。具体的には、マウスのＬ領域
およびＣ領域はＳｈａ，Ｗ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ，３３５，２７１−２７４（１９８８）に記載の
ものが用いられる。(5) Preparation of Animal Introduced with DNA Encoding Vα19-TCRα Chain The T possessed by the Vα19NKT cells specified in (3) above
When the DNA encoding the CRα chain is introduced into a mammal other than human so as to be specifically expressed in T cells, the number of NKT cells expressing the Vα19-TCRα chain is higher than that of the wild type. Can be obtained. (I) Construction of introduced DNA In the present invention, the DNA to be introduced (hereinafter, this may be referred to as “introduced DNA”) is Vα19-T.
Any one may be used as long as it encodes a CRα chain and has a constitution that the TCRα chain is expressed specifically in T cells. Specifically, L, V of the TCR α chain,
A DNA comprising J and C regions (hereinafter sometimes referred to as "coding region DNA") and an expression control region is used. Among these, the V and J regions of the TCR α chain consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or have one or several amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. When a T cell receptor α chain consisting of the amino acid sequence and containing the V and J regions is expressed in NKT cells, the NKT cells produce Th2-type cytokines in response to stimulation through the T cell receptors. There are things to do. The L region and C region are not particularly limited as long as they are derived from the same animal species as the V and J region DNAs used. Specifically, the mouse L region and C region are described in Sha, W. et al. C. , Et al. , Nat
Ure, 335, 271-274 (1988) are used.
【００２４】コーディング領域ＤＮＡは、Ｌ、Ｖ、Ｊ、
Ｃ領域がスプライシングして隣接しているものでもよい
し、ゲノムＤＮＡ等を用いる場合のようにそれぞれの領
域が隣接していない場合には、各々がスプライシングし
てＬ、Ｖ、Ｊ、Ｃ領域が隣接したＤＮＡとなり得る構造
を有していれば何れのものでもよい。The coding region DNA is L, V, J,
The C regions may be spliced to be adjacent to each other, or if the regions are not adjacent to each other as in the case of using genomic DNA or the like, the L regions, V, J and C regions are spliced to each other. Any structure may be used as long as it has a structure capable of forming adjacent DNA.
【００２５】Ｌ、Ｖ、Ｊ、Ｃ領域が隣接しているＤＮＡ
の取得の方法としては、Ｖα１９ＮＫＴ細胞を含む細胞
群からそれ自体既知の方法によりｃＤＮＡライブラリー
等を調製し、上記（３）で得られたＶα１９−ＴＣＲα
鎖のＶ、Ｊ領域の塩基配列を有するプローブ等を用いて
スクリーニングして取得するか、あるいは、該ｃＤＮＡ
ライブラリーを鋳型として、Ｌ領域の５’末端の塩基配
列を有するプライマーと、Ｃ領域の３’末端の塩基配列
を有するプライマーを用いたポリメラーゼチェインリア
クション（ＰＣＲ）により取得する方法等が挙げられ
る。Ｌ、Ｖ、Ｊ、Ｃ領域が隣接していないＤＮＡの構造
の例を以下に説明する。ＶおよびＪ領域は、上記のアミ
ノ酸配列を有するものをコードするＤＮＡであることが
必須であるので、既にＶα１９．１−Ｊα２６がリアレ
ンジしたＤＮＡを用いることが好ましい。このようなＤ
ＮＡとしては、本発明のＮＫＴ細胞のｃＤＮＡとして上
記と同様に取得するか、または、本発明のＮＫＴ細胞等
からゲノムＤＮＡを抽出した後に上記と同様のスクリー
ニングまたはＰＣＲ等によりゲノムＤＮＡとして取得す
ることもできる。DNA in which L, V, J and C regions are adjacent
As a method for obtaining Vα19-TCRα obtained in (3) above, a cDNA library or the like was prepared from a cell group containing Vα19NKT cells by a method known per se.
Obtained by screening using a probe having a nucleotide sequence of the V or J region of the chain, or the cDNA
Examples include a method in which the library is used as a template and a polymerase chain reaction (PCR) is performed using a primer having a base sequence at the 5 ′ end of the L region and a primer having a base sequence at the 3 ′ end of the C region. An example of the structure of DNA in which the L, V, J, and C regions are not adjacent will be described below. Since it is essential that the V and J regions are DNAs encoding the above-mentioned amino acid sequences, it is preferable to use DNA in which Vα19.1-Jα26 has been rearranged. D like this
As NA, the same as above is obtained as the cDNA of the NKT cell of the present invention, or the genomic DNA is extracted from the NKT cell of the present invention or the like and then obtained as the genomic DNA by the same screening or PCR as the above. You can also
【００２６】上記のようにＴＣＲα鎖のＶ、Ｊ領域とし
て、単独でコーディング領域ＤＮＡを取得した場合は、
ＬおよびＣ領域とスプライシングするためのシグナル配
列を付加する。スプライシングシグナルを有するＤＮＡ
としては、該Ｖ、Ｊ領域が、Ｌ及びＣ領域とスプライシ
ングし得るものであれば何れのものでもよい。具体的に
は、上記ＴＣＲα鎖のＶ、Ｊ領域のゲノム上の５’上流
側、あるいは３’下流側のイントロンを用いることが好
ましい。イントロンＤＮＡの長さは、スプライシングシ
グナルを含む限り特に制限はない。取得方法としては、
Ｖα１９ＮＫＴ細胞等からゲノムＤＮＡを調製し、これ
を鋳型としたＰＣＲ等により取得することができる。取
得したイントロンＤＮＡがスプライシングシグナルを有
し、導入ＤＮＡにおいてこれが有効であることの確認
は、導入ＤＮＡをＢＷ５１４７（ATCC:CRL-1588）等の
Ｔ細胞株に通常の方法で導入し、導入細胞からｃＤＮＡ
を抽出してこの塩基配列を解析すること等により行うこ
とができる。When the coding region DNA is independently obtained as the V and J regions of the TCR α chain as described above,
A signal sequence for splicing with the L and C regions is added. DNA with splicing signal
As the V and J regions, any region may be used as long as it can be spliced with the L and C regions. Specifically, it is preferable to use an intron on the 5'upstream side or 3'downstream side of the genome of the V and J regions of the TCRα chain. The length of the intron DNA is not particularly limited as long as it contains a splicing signal. The acquisition method is
Genomic DNA can be prepared from Vα19NKT cells and the like and obtained by PCR using this as a template. To confirm that the obtained intron DNA has a splicing signal and is effective in the introduced DNA, the introduced DNA was introduced into a T cell line such as BW5147 (ATCC: CRL-1588) by an ordinary method, and cDNA
Can be extracted and the base sequence can be analyzed.
【００２７】Ｌ領域およびＣ領域のＤＮＡとしては、ゲ
ノムＤＮＡでもｃＤＮＡでもよい。取得方法としては、
ＴＣＲα鎖を発現している細胞からｃＤＮＡを取得して
上記と同様にスクリーニングまたはＰＣＲにより取得す
るか、ゲノムＤＮＡから同様にして取得することもでき
る。ＴＣＲα鎖をコードするゲノムＤＮＡとしては、例
えば、マウスの場合、Ｓｈａ，Ｗ．Ｃ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３５，２７１−２７４（１９８
８）に記載のもの等が挙げられる。かくして取得された
Ｌ、Ｖ、Ｊ、Ｃ領域ＤＮＡを隣接することによりコーデ
ィング領域ＤＮＡを調製することができる。The DNA for the L and C regions may be genomic DNA or cDNA. The acquisition method is
It is also possible to obtain cDNA from cells expressing the TCR α chain and obtain it by screening or PCR in the same manner as described above, or obtain it from genomic DNA in the same manner. The genomic DNA encoding the TCR α chain is, for example, in the case of mouse, Sha, W. et al. C. , Et a
l. , Nature, 335, 271-274 (198).
Examples include those described in 8). The coding region DNA can be prepared by flanking the L, V, J and C region DNAs thus obtained.
【００２８】導入ＤＮＡに含まれる発現制御領域として
は、転写調節領域、プロモーター、エンハンサー、サイ
レンサー領域等を適宜選択して用いることができる。転
写調節領域としては、転写開始点又はキャップ構造等を
含むｍＲＮＡの５’−非翻訳領域や、転写終止点やｐｏ
ｌｙ−Ａシグナル等を含むｍＲＮＡの３’−非翻訳領域
等が挙げられる。転写調節領域としては、これが制御す
る遺伝子をＴ細胞特異的に発現させる活性を有するもの
が用いられる。具体的には、適当なＴ細胞α鎖をコード
するゲノムＤＮＡの５’上流領域等が用いられる。これ
らの転写調節領域は、Ｖα１９ＮＫＴ細胞のＴＣＲα鎖
をコードするゲノムＤＮＡの５’領域や、ｃＤＮＡの
３’−非翻訳領域等をそれ自体既知の方法により取得し
て用いることもできるし、他のＴＣＲα鎖の転写調節領
域を用いることもできる。他のＴＣＲα鎖の転写調節領
域としては、ゲノムＤＮＡのＶα８．４のコード領域の
５’上流約１．８ｋｂのＤＮＡ断片（Asada, A., et a
l., Immunology, 101, 309-315(2000)）が用いられる。
このＤＮＡ断片には、リーダー配列も含むのでこれらを
共に用いることが好ましい。As the expression control region contained in the introduced DNA, a transcription control region, a promoter, an enhancer, a silencer region and the like can be appropriately selected and used. The transcriptional regulatory region includes a 5'-untranslated region of mRNA including a transcription initiation point or a cap structure, a transcription termination point, and po.
Examples include the 3'-untranslated region of mRNA containing the ly-A signal and the like. As the transcriptional regulatory region, one having an activity of specifically expressing a gene regulated by the T regulatory region is used. Specifically, the 5'upstream region of genomic DNA encoding an appropriate T cell α chain is used. These transcriptional regulatory regions can be obtained by using the 5'region of genomic DNA encoding the TCRα chain of Vα19NKT cells, the 3'-untranslated region of cDNA, etc., by a method known per se, and used. A transcriptional regulatory region of the TCRα chain can also be used. As another transcriptional regulatory region of the TCR α chain, a DNA fragment of about 1.8 kb 5'upstream of the Vα 8.4 coding region of genomic DNA (Asada, A., et a.
l., Immunology, 101, 309-315 (2000)) is used.
Since this DNA fragment also contains a leader sequence, it is preferable to use these together.
【００２９】また、エンハンサー及びサイレンサーは、
遺伝子の転写開始部の５’上流やゲノムのイントロン中
に存在するもののうち、本発明のＴＣＲα鎖の発現に用
いるプロモーターの活性制御に有効であるものを選択し
て用いることができる。エンハンサーとしては、ＴＣＲ
α鎖に特異的なエンハンサーを用いることが好ましい。
このようなエンハンサーとしては、ゲノムＤＮＡのＴＣ
Ｒα鎖のＣ領域の下流に存在する領域が挙げられ、上記
Ｃ領域とともに取得することが好ましい。The enhancer and silencer are
Among those existing 5'upstream of the transcription start site of the gene or in the intron of the genome, those effective for controlling the activity of the promoter used for expressing the TCRα chain of the present invention can be selected and used. As an enhancer, TCR
It is preferable to use an enhancer specific to the α chain.
Such enhancers include TC of genomic DNA
A region existing downstream of the C region of the Rα chain can be mentioned, and it is preferable to obtain it together with the C region.
【００３０】これらの適当な発現制御領域とＴＣＲα鎖
をコードするＤＮＡを連結して構築される導入ＤＮＡの
具体例としては、例えば、図3に示される、Ｖα８．４
プロモーター−Ｌ−イントロン−Ｖα１９．１−Ｊα２
６ ｃＤＮＡ−イントロン−ＣαゲノムＤＮＡ−αエン
ハンサーをを直列に連結したもの等が挙げられる。この
ようなＤＮＡの塩基配列としては、配列番号８に示すも
の等が挙げられる。Specific examples of the introduced DNA constructed by linking these appropriate expression control regions with the DNA encoding the TCR α chain include, for example, Vα8.4 shown in FIG.
Promoter-L-Intron-Vα19.1-Jα2
6 cDNA-intron-Cα genomic DNA-α enhancer is connected in series. Examples of such a DNA base sequence include those shown in SEQ ID NO: 8.
【００３１】（ii）ヒト以外の遺伝子改変動物の作製
かくして調製される導入ＤＮＡを、ヒト以外の哺乳動物
生殖細胞に導入して遺伝子改変動物細胞を作製し、さら
にこれを発生させることによりヒト以外の遺伝子改変動
物を作製することができる。(Ii) Preparation of non-human gene-modified animal The introduced DNA thus prepared is introduced into a non-human mammalian germ cell to prepare a gene-modified animal cell, and then the gene-modified animal cell is generated to generate a non-human gene. Can be produced.
【００３２】本発明で用いるヒト以外の動物生殖細胞
は、これらに前記導入ＤＮＡを導入して発生させること
により、Ｖα１９−ＴＣＲα鎖をＴ細胞特異的に発現し
たヒト以外の遺伝子改変動物を作製できるものであれ
ば、如何なるものでもよい。ここで、ヒト以外の哺乳動
物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハ
ムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げら
れる。これらの中で、マウス、ラット、モルモット等の
齧歯類が好ましく、マウスがより好ましい。The non-human animal germ cells used in the present invention can be produced by introducing the above-mentioned introduced DNA into them to produce a non-human genetically modified animal in which the Vα19-TCRα chain is specifically expressed in T cells. Anything may be used as long as it is one. Here, examples of mammals other than humans include mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, goats, pigs, dogs, cats, and the like. Among these, rodents such as mouse, rat and guinea pig are preferable, and mouse is more preferable.
【００３３】動物生殖細胞としては、卵割前の受精卵が
好ましく用いられる。このような受精卵は、ヒト以外の
動物の雄と雌を交配させることによって得られる。受精
卵は、自然交配によっても得られるが、動物の雌の性周
期を人工的に調節した後、雄と交配させる方法が好まし
い。動物の雌の性周期を人工的に調節する方法として
は、例えば、初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺
刺激ホルモン；ＰＭＳＧ）、次いで黄体形成ホルモン
（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン；ｈＣＧ）を、例えば腹
腔注射等により投与する方法が挙げられる。これらホル
モンの投与量、投与間隔等は、該動物の種類により適宜
決定すればよい。上記の通り動物の雌にホルモン投与を
行って過剰***させ、交配後１日目の卵管から摘出する
こと等によって受精卵を得ることができる。得られた受
精卵は、上記（５）（i）に記載した導入ＤＮＡをマイ
クロインジェクション法等により注入して、動物の雌の
輸卵管に人工的に移植・着床させて出産させることによ
り、遺伝子改変動物（トランスジェニック動物）を得る
ことができる。また、動物の雌に黄体形成ホルモン放出
ホルモン（ＬＨＲＨ）あるいはその類縁体を投与した後
に、動物の雄と交配させて、受精能を誘起された偽妊娠
雌動物を作製し、得られた偽妊娠雌動物に受精卵を人工
的に移植・着床する方法も好ましい。ＬＨＲＨあるいは
その類縁体の投与量等は、ヒト以外の動物の種類により
それぞれ異なる。さらに、上記のヒト以外の動物の雌の
性周期を人工的に調節して受精卵を取得する方法と、受
精能を誘起された偽妊娠雌動物にこの受精卵を人工的に
移植・着床させる方法とを、組み合わせて用いるのが好
ましい。As animal germ cells, fertilized eggs before cleavage are preferably used. Such fertilized eggs are obtained by mating male and female non-human animals. Fertilized eggs can be obtained by natural mating, but a method in which the female sexual cycle of an animal is artificially adjusted and then mated with a male is preferable. As a method for artificially controlling the female sexual cycle of an animal, for example, first, follicle-stimulating hormone (maternal serum gonadotropin; PMSG), and then luteinizing hormone (human chorionic gonadotropin; hCG) are used. For example, a method of administering by intraperitoneal injection and the like can be mentioned. The doses and intervals of administration of these hormones may be appropriately determined depending on the type of the animal. As described above, a fertilized egg can be obtained by administering a hormone to a female animal to cause superovulation, and removing from the oviduct on the first day after mating. The fertilized egg thus obtained is injected with the introduced DNA described in the above (5) (i) by the microinjection method or the like, and artificially transplanted / implanted into the oviduct of a female animal to give birth. Modified animals (transgenic animals) can be obtained. In addition, after administering luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) or its analogs to female animals, they were mated with male animals to produce fertility-induced pseudopregnant female animals. A method of artificially transplanting and implanting a fertilized egg in a female animal is also preferable. The dose and the like of LHRH or its analogs differ depending on the type of animal other than human. Furthermore, a method for artificially regulating the female sexual cycle of the above-mentioned non-human animal to obtain a fertilized egg, and artificially transplanting / implanting this fertilized egg into a pseudopregnant female animal in which fertility was induced. It is preferable to use the above method in combination.
【００３４】上記したＶα１９−ＴＣＲα鎖をＴ細胞特
異的に発現するように導入されたヒト以外の哺乳動物生
殖細胞を用いて本発明のヒト以外の遺伝子改変動物を作
製する方法を、マウス受精卵を用いてトランスジェニッ
クマウス（以下、これを「Ｖα１９トランスジェニック
マウス」と称することがある）を作製する場合を例に挙
げてより具体的に説明する。A method for producing a non-human genetically modified animal of the present invention using the above-mentioned Vα19-TCRα chain-introduced T cell-specifically expressed non-human mammalian germ cells This will be described more specifically by taking as an example the case of producing a transgenic mouse (hereinafter, sometimes referred to as "Vα19 transgenic mouse") by using.
【００３５】まず、採卵用の雌マウスに卵胞刺激ホルモ
ン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン；ＰＭＳＧ）及び黄体
形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン；ｈＣＧ）
を投与して過剰***させ、雄マウスと交配して、膣栓確
認後に卵管から受精卵を採取する。得られた受精卵の雄
性前核に前記導入ＤＮＡをマイクロインジェクション法
等により導入して、得られる卵細胞をWhitten'sの培地
等で培養した後、偽妊娠させた雌マウスの輸卵管に移植
して被移植動物を飼育し、出産させる。生まれた仔マウ
スからＶα１９−ＴＣＲα鎖をコードするＤＮＡ（以
下、これを「Ｖα１９遺伝子」と称することがある）を
発現した仔マウスを選択することにより、Ｖα１９トラ
ンスジェニックマウスを得ることができる。上記マウス
の受精卵としては、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９／
ｓｖ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ、ＳＪＬ／Ｗｔ等に由来す
るマウスの交配により得られるものを用いることができ
るが、前核段階で細胞質内において雄性前核と雌性前核
が独立したときに識別が可能であること、受精卵を多く
採取できること、また、マイクロインジェクション操作
に好適で産仔の発生率が高いことなどから、Ｃ５７ＢＬ
／６（Ｂ６）系マウス同士の交配によって得られるマウ
スの受精卵を用いるのが好ましい。また、導入ＤＮＡの
量は１００〜３０００コピーが適当であり、導入ＤＮＡ
の導入方法としては、マイクロインジェクション法やエ
レクトロポレーション法等の通常用いられる方法を挙げ
ることができる。First, in female mice for egg collection, follicle-stimulating hormone (pregnant horse serum gonadotropin; PMSG) and luteinizing hormone (human chorionic gonadotropin; hCG).
Is administered to cause superovulation, a male mouse is mated, and a fertilized egg is collected from the oviduct after confirmation of vaginal plug. The introduced DNA is introduced into the male pronucleus of the obtained fertilized egg by the microinjection method or the like, and the obtained egg cells are cultured in Whitten's medium or the like, and then transplanted into the oviduct of a pseudopregnant female mouse to be transplanted. Raise the animal and give birth. A Vα19 transgenic mouse can be obtained by selecting a pup mouse expressing a Vα19-TCRα chain-encoding DNA (hereinafter, sometimes referred to as “Vα19 gene”) from the born offspring mouse. Examples of the fertilized egg of the mouse include C57BL / 6,129 /
Those obtained by mating mice derived from sv, BALB / c, C3H, SJL / Wt and the like can be used, but when the pronucleus is independent of the male pronucleus and the female pronucleus in the cytoplasm at the pronuclear stage, C57BL is possible, it is possible to collect a lot of fertilized eggs, and it is suitable for microinjection operation and the incidence of offspring is high.
It is preferable to use fertilized eggs of mice obtained by mating / 6 (B6) mice. Further, the amount of the introduced DNA is appropriately 100 to 3000 copies.
Examples of the method for introducing the include a method commonly used such as a microinjection method and an electroporation method.
【００３６】ここで、Ｖα１９遺伝子が導入された仔マ
ウスの選択は、マウスの尾の先を切り取って、高分子Ｄ
ＮＡ抽出法（発生工学実験マニュアル、野村達次監修・
勝木元也編、講談社（１９８７））又はDNAeasy Tissue
Kit（QIAGEN社製）等の市販のキットを用いることによ
りゲノムＤＮＡを抽出し、サザンブロット法やＰＣＲ法
等の通常用いられる方法により該ＤＮＡ中のＶα１９遺
伝子の存在を確認することによって行うことができる。
また、実際にその個体内で導入されたＶα１９遺伝子が
発現され、Ｖα１９−ＴＣＲα鎖がＴ細胞において生成
されていることは、ノザンブロット法やウエスタンブロ
ット法等の通常用いられる方法により確認することがで
きる。あるいは、Ｖα１４ＮＫＴ細胞は、ＣＤ４陽性で
あるので、ＮＫ１．１及びＣＤ８陽性細胞が、野生型に
比べて多いことを後述の免疫染色法によって解析するこ
とによっても確認することができる。Here, the selection of the pup mouse into which the Vα19 gene has been introduced is carried out by cutting off the tip of the mouse tail to obtain the polymer D.
NA extraction method (Development engineering experiment manual, supervised by Tatsuji Nomura
Edited by Motoya Katsuki, Kodansha (1987)) or DNAeasy Tissue
Genomic DNA is extracted by using a commercially available kit such as Kit (manufactured by QIAGEN), and the presence of the Vα19 gene in the DNA is confirmed by a commonly used method such as Southern blotting or PCR. it can.
In addition, the fact that the Vα19 gene introduced in the individual is actually expressed and the Vα19-TCRα chain is produced in T cells can be confirmed by a commonly used method such as Northern blotting or Western blotting. . Alternatively, since Vα14NKT cells are CD4 positive, it can be confirmed by analyzing the immunostaining method described later that the number of NK1.1 and CD8 positive cells is higher than that of the wild type.
【００３７】本発明のヒト以外の遺伝子改変動物は、か
くして得られる個体を交配し、導入されたＶα１９遺伝
子が安定に保持されることを確認して通常の飼育環境で
継代飼育することによりその子孫を得ることもできる
し、体外受精を繰り返すことによりその子孫を得て、系
統を維持することもできる。本発明の動物には、かくし
て得られるＶα１９遺伝子を有するその子孫等も含まれ
る。また、上記で得られたＶα１９トランスジェニック
動物を、ＴＣＲα鎖ノックアウト動物（Monbaerts, P.,
et al., Nature, 360, 225-231(1992)）と交配するこ
とによれば、該動物が有するＴ細胞およびＮＫＴ細胞の
ＴＣＲα鎖が、全てＶα１９−ＴＣＲα鎖である系統を
取得することができる。The non-human genetically modified animal of the present invention is obtained by mating the individuals thus obtained, confirming that the introduced Vα19 gene is stably retained, and subculturing the animal in a normal breeding environment. The offspring can be obtained, or the offspring can be obtained by repeating in vitro fertilization to maintain the lineage. The animal of the present invention also includes the progeny and the like of the thus obtained Vα19 gene. In addition, the Vα19 transgenic animal obtained above was used as a TCRα chain knockout animal (Monbaerts, P.,
et al., Nature, 360, 225-231 (1992)), it is possible to obtain a line in which the TCRα chains of T cells and NKT cells possessed by the animal are all Vα19-TCRα chains. it can.
【００３８】また、かかる動物から得られるその一部も
本発明の範囲に含まれる。該動物の一部としては、例え
ば、頭部、指、手、足、腹部、尾等の他、臓器、組織、
細胞、細胞内小器官等が挙げられる。中でも該動物から
得られるＶα１９−ＴＣＲα鎖を有するＮＫＴ細胞は特
に有用であって、組織培養の細胞源として機能解析やス
クリーニングに用いたり、蛋白質や遺伝子を抽出して直
接解析する等、種々の目的に好適に用いることができ
る。例えば、このような細胞中のＤＮＡもしくはＲＮＡ
を直接分析したり、あるいは遺伝子により発現された蛋
白質を分析することにより、Ｖα１９ＮＫＴ細胞の機能
等を解析することができる。また、該細胞をそれ自体既
知の組織培養技術により培養して細胞の機能解析等に用
いることもできるし、高発現細胞株があれば、そこか
ら、抗体を作製する等への利用も可能である。かくして
取得されるＶα１９ＮＫＴ細胞も、上記（１）〜（４）
に記載の細胞とともに後述の方法に用いることができ、
これらをまとめて「本発明のＮＫＴ細胞」と称すること
がある。Further, a part thereof obtained from such an animal is also included in the scope of the present invention. The part of the animal includes, for example, the head, fingers, hands, feet, abdomen, tail, etc., organs, tissues,
Examples include cells and subcellular organelles. Among them, NKT cells having a Vα19-TCRα chain obtained from the animal are particularly useful, and are used for various purposes such as functional analysis and screening as a cell source of tissue culture, and direct analysis by extracting proteins or genes. Can be suitably used. For example, DNA or RNA in such cells
Can be directly analyzed or the protein expressed by the gene can be analyzed to analyze the function and the like of Vα19NKT cells. Further, the cells can be cultivated by a tissue culture technique known per se and used for functional analysis of the cells, etc., and if there is a high-expressing cell line, it can be used for producing an antibody, etc. is there. The Vα19NKT cells thus obtained also have the above (1) to (4).
It can be used in the method described below together with the cells described in,
These may be collectively referred to as the “NKT cell of the present invention”.
【００３９】（６）ＮＫＴ細胞または該細胞を構成する
ポリペプチドを抗原とする抗体
本発明のＮＫＴ細胞を抗原とする抗体は、本発明のＮＫ
Ｔ細胞が有するポリペプチドを抗原として調製すること
ができる。抗体の調製方法としては通常用いられる公知
の方法を用いることができ、抗原として用いられるポリ
ペプチドについても、公知の方法に従って抗原性が高く
エピトープ（抗原決定基）として適した配列を選択して
用いることができる。また、細胞そのものを抗原として
免疫することによっても抗体を得ることができる。抗原
ペプチドとして、好ましくは、配列番号１に記載のアミ
ノ酸配列のアミノ酸番号１０９〜１１７で表されるアミ
ノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号２に記載
のアミノ酸配列のアミノ酸番号９１〜９９に示すものが
挙げられる。上記ポリペプチドは、マウスＶα１９．１
−Ｊα２６、およびヒトＶα７Ｓ２−Ｊα３３で表され
るＴＣＲα鎖に含まれるものであり、本発明のＮＫＴ細
胞に特徴的な部分であるので、本発明のＮＫＴ細胞特異
的抗体を得るための抗原としては特に好ましく用いられ
るものである。(6) Antibodies with NKT cells or polypeptides constituting the cells as antigens The antibodies with NKT cells of the present invention as antigens are the NK of the present invention.
The polypeptide possessed by T cells can be prepared as an antigen. As a method for preparing an antibody, a commonly used known method can be used. Regarding a polypeptide used as an antigen, a sequence having high antigenicity and suitable as an epitope (antigenic determinant) is selected and used according to the known method. be able to. The antibody can also be obtained by immunizing the cell itself as an antigen. The antigenic peptide is preferably a polypeptide containing the amino acid sequence represented by amino acid numbers 109 to 117 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or the one shown in amino acid numbers 91 to 99 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. Is mentioned. The above polypeptide is mouse Vα19.1.
-Jα26 and those contained in the TCRα chain represented by human Vα7S2-Jα33, which is a characteristic part of the NKT cell of the present invention, the antigen for obtaining the NKT cell-specific antibody of the present invention is It is particularly preferably used.
【００４０】抗原として用いるポリペプチドは、本発明
のＮＫＴ細胞から抽出精製したものでもよいし、公知の
方法に従って合成した合成ペプチドを用いることもでき
る。抗原となるポリペプチド、または本発明のＮＫＴ細
胞は、公知の方法に従って適当な溶液等に調製して、哺
乳動物、例えばウサギやラット等に免疫を行えばよい
が、安定的な免疫を行ったり抗体価を高めるために抗原
ペプチドの他にアジュバント等を加えて免疫を行うのが
好ましい。The polypeptide used as an antigen may be one extracted and purified from the NKT cells of the present invention, or a synthetic peptide synthesized according to a known method may be used. The polypeptide serving as an antigen or the NKT cell of the present invention may be prepared in an appropriate solution or the like according to a known method to immunize a mammal such as rabbit or rat, but stable immunization may be performed. Immunization is preferably performed by adding an adjuvant or the like in addition to the antigen peptide in order to increase the antibody titer.
【００４１】免疫に際しての抗原の投与経路は特に限定
されず、例えば皮下、腹腔内、静脈内、あるいは筋肉内
等のいずれの経路を用いてもよい。具体的には、例えば
ラット等に本発明のＮＫＴ細胞、あるいはそのホモジネ
ート、またはポリペプチドを数日〜数週間おきに数回接
種する方法等が用いられる。また、抗原の摂取量として
は、抗原がポリペプチドの場合０．１〜０．５ｍｇ／１
回、また細胞の場合には１０5〜１０7個／１回が好まし
いが、ポリペプチドの種類、また免疫する動物種によっ
ては適宜調節される。The route of administration of the antigen for immunization is not particularly limited, and any route such as subcutaneous, intraperitoneal, intravenous, or intramuscular route may be used. Specifically, for example, a method of inoculating a rat or the like with the NKT cell of the present invention, a homogenate thereof, or a polypeptide several times every several days to several weeks is used. When the antigen is a polypeptide, the intake amount of the antigen is 0.1 to 0.5 mg / 1.
In the case of cells, 10 5 to 10 7 cells / time are preferable, but they are appropriately adjusted depending on the type of polypeptide and the animal species to be immunized.
【００４２】免疫後、適宜試験的に採血を行ってＥＬＩ
ＳＡ法やウエスタンブロッティング等の方法で抗体価の
上昇を確認し、十分に抗体価の上昇した動物から採血を
行う。採取した血液に対し、抗体の調製に用いられる適
当な処理を行うことによればポリクローナル抗体を得る
ことができる。また、必要に応じて公知の方法に従い血
清から抗体成分を精製した精製抗体を取得することもで
きる。さらに、該動物の脾臓細胞等とミエローマ細胞等
を公知の方法に従って融合させた融合細胞を用いる（Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５
６，４９５（１９７５））ことによりモノクローナル抗
体を作製することもできる。モノクローナル抗体は例え
ば次に述べる方法により取得することができる。After immunization, blood is appropriately sampled for ELI.
An increase in antibody titer is confirmed by a method such as SA method or Western blotting, and blood is collected from an animal having a sufficiently increased antibody titer. A polyclonal antibody can be obtained by subjecting the collected blood to an appropriate treatment used for antibody preparation. Further, if necessary, a purified antibody obtained by purifying antibody components from serum can be obtained by a known method. Furthermore, fused cells obtained by fusing spleen cells and the like of the animal with myeloma cells and the like according to a known method are used (M
ilstein, et al. , Nature, 25
6, 495 (1975)) to produce a monoclonal antibody. The monoclonal antibody can be obtained, for example, by the method described below.
【００４３】まず、上記した抗原の免疫により抗体価の
高まった動物から抗体産生細胞を取得する。抗体産生細
胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であ
り、これは個体の何れから取得してもよいが、好ましく
は脾臓、リンパ節、末梢血等から取得する。これらの細
胞と融合させるミエローマとしては、一般的にはマウス
から得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マ
ウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来等）ミエローマ細胞株が挙げら
れる。具体的には、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴ
ＣＣ：ＣＲＬ−１５８０）、Ｐ３−ＮＳ１／１Ａｇ４．
１（理研セルバンク：ＲＣＢ００９５）等が好ましく用
いられる。細胞の融合は、抗体産生細胞とミエローマ細
胞を適当な割合で混合し、適当な細胞融合培地、例えば
ＲＰＭＩ１６４０やイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭ
ＤＭ）、あるいはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）等に、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を
溶解したもの等を用いることにより行うことができる。
また電気融合法（Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ，６
８， ５７７（１９８１））によっても行うことができ
る。First, antibody-producing cells are obtained from an animal whose antibody titer has been increased by immunization with the above-mentioned antigen. Antibody-producing cells are plasma cells and lymphocytes that are their precursor cells, which may be obtained from any individual, but are preferably obtained from the spleen, lymph nodes, peripheral blood and the like. The myeloma to be fused with these cells generally includes cell lines obtained from mice, for example, 8-azaguanine-resistant mouse (BALB / c-derived etc.) myeloma cell line. Specifically, P3X63-Ag8.653 (AT
CC: CRL-1580), P3-NS1 / 1Ag4.
1 (RIKEN Cell Bank: RCB0095) and the like are preferably used. For cell fusion, antibody-producing cells and myeloma cells are mixed at an appropriate ratio, and an appropriate cell fusion medium such as RPMI1640 or Iscove's modified Dulbecco's medium (IM
DM) or Dulbecco's modified Eagle medium (DME
It can be carried out by using a solution in which 50% polyethylene glycol (PEG) is dissolved in M) or the like.
In addition, the electrofusion method (U. Zimmermann. Et a
l. , Naturwissenschaften, 6
8, 577 (1981)).
【００４４】融合細胞は、用いたミエローマ細胞株が８
−アザグアニン耐性株であることを利用して適量のヒポ
キサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液、
及びマウスインターロイキン−６（ＩＬ−６）等を含む
正常培地（ＨＡＴ培地）中で５％ＣＯ2、３７℃で適当
時間培養することにより選択することができる。この選
択方法は用いるミエローマ細胞株によって適宜選択して
用いることができる。選択された融合細胞が産生する抗
体の抗体価を上記した方法により解析し、抗体価の高い
抗体を産生する融合細胞を限界希釈法等により分離す
る。分離した融合細胞をさらに適当な培地で培養し、得
られる培養上清から硫安分画、アフィニティクロマトグ
グラフィー等の適当な方法により精製してモノクローナ
ル抗体を得ることができる。また精製には市販のモノク
ローナル抗体精製キットを用いることもできる。さらに
は、免疫した動物と同系統の動物、またはヌードマウス
等の腹腔内で上記で得られた抗体産生融合細胞を増殖さ
せることにより、本発明の抗ＮＫＴ細胞モノクローナル
抗体を大量に含む腹水を得ることもできる。The myeloma cell line used was 8 fused cells.
-A suitable amount of hypoxanthine / aminopterin / thymidine (HAT) solution utilizing the fact that it is an azaguanine resistant strain,
And mouse interleukin-6 (IL-6) and the like in a normal medium (HAT medium) containing 5% CO 2 and culturing at 37 ° C. for an appropriate time. This selection method can be appropriately selected and used depending on the myeloma cell line to be used. The antibody titer of the antibody produced by the selected fused cells is analyzed by the above-mentioned method, and the fused cells producing the antibody having a high antibody titer are separated by the limiting dilution method or the like. The separated fused cells can be further cultured in an appropriate medium, and the obtained culture supernatant can be purified by an appropriate method such as ammonium sulfate fractionation or affinity chromatography to obtain a monoclonal antibody. A commercially available monoclonal antibody purification kit can also be used for purification. Furthermore, the ascites containing a large amount of the anti-NKT cell monoclonal antibody of the present invention is obtained by proliferating the antibody-producing fused cells obtained above in the abdominal cavity of an animal of the same strain as the immunized animal or a nude mouse. You can also
【００４５】かくして得られた本発明の抗ＮＫＴ細胞抗
体は、ウエスタンブロッティングや組織免疫染色等に用
いることができる。一方、本発明のＮＫＴ細胞が有する
ＴＣＲ（例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有
するポリペプチド）を抗原とする抗体は、該ＴＣＲに特
異的に結合することにより、これを介して誘導されるサ
イトカイン産生等の活性を抑制、あるいは活性化するこ
とができる。従って、本発明の抗体を抗体医薬として投
与することにより本発明のＮＫＴ細胞のＴＣＲへの刺激
特異的な活性を制御することができるため、本発明の抗
体は免疫調節剤として用いることができる。The anti-NKT cell antibody of the present invention thus obtained can be used for Western blotting, tissue immunostaining and the like. On the other hand, an antibody whose antigen is the TCR (for example, the polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1) possessed by the NKT cells of the present invention is induced through specific binding to the TCR. It is possible to suppress or activate the activity such as cytokine production. Therefore, the antibody of the present invention can be used as an immunomodulator since the activity of the NKT cell of the present invention specific to stimulation with respect to TCR can be controlled by administering the antibody of the present invention as an antibody drug.
【００４６】（７）抗ＮＫＴ細胞抗体を有効成分とする
免疫調節剤
本発明の抗体を抗体医薬とする場合、該抗体がマウス等
の異種の動物由来であるために、異種動物免疫グロブリ
ンに対する抗体ができやすく、このため血中半減期も短
い。そこで、この点を回避するためにキメラ抗体（ヒト
化抗体）、あるいは一価抗体の作製を行う必要がある。
キメラ抗体の作製方法として具体的には、（１）本発明
の抗体を産生する融合細胞より免疫グロブリンの重鎖
（Ｈ鎖）、及び軽鎖（Ｌ鎖）の各可変領域（Ｖ領域）が
有するアミノ酸配列の一部を解析し、その配列を基にこ
れをコードする遺伝子をクローニングし、該ＤＮＡ断片
を天然のアミノ酸配列を有する公知のヒトの定常領域を
コードする遺伝子ＤＮＡと結合させて適当なベクターに
挿入し、これを適当な宿主に導入して作製する方法、あ
るいは（２）ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ
−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）のみを保存
し、他の全ての領域をヒト由来のものに置き換える方法
（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ抗体：Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅ
ｄ．，３１，１０７７（１９９０）；Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３（１
９９１））等が挙げられる。(7) Immunomodulator containing an anti-NKT cell antibody as an active ingredient When the antibody of the present invention is used as an antibody drug, the antibody is derived from a different animal such as a mouse, and therefore an antibody against immunoglobulin of a different animal. Can easily occur, and therefore has a short blood half-life. Therefore, in order to avoid this point, it is necessary to prepare a chimeric antibody (humanized antibody) or a monovalent antibody.
Specifically, as a method for producing a chimeric antibody, (1) each variable region (V region) of the immunoglobulin heavy chain (H chain) and light chain (L chain) from the fused cells producing the antibody of the present invention is A part of the amino acid sequence possessed is analyzed, a gene encoding the same is cloned based on the sequence, and the DNA fragment is ligated to a gene DNA encoding a known human constant region having a natural amino acid sequence, which is suitable. A vector, which is inserted into an appropriate vector, and introduced into an appropriate host, or (2) CDR (complementarity)
-Determining region) and replacing all other regions with those of human origin (CDR-grafted antibody: J. Nucl. Me)
d. , 31, 1077 (1990); Milstei.
n, et al. , Nature, 349, 293 (1
991)) and the like.
【００４７】また、本発明のＮＫＴ細胞としてヒトの細
胞を取得した場合には、かかる細胞のＴＣＲを構成する
ポリペプチド、あるいは細胞そのものを抗原として、ヒ
ト末梢血リンパ球を移植したＳｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉ
ｎｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩ
Ｄ）マウスに上記した方法と同様にして免疫し、該免疫
動物の抗体産生細胞とヒトのミエローマ細胞との融合細
胞を作製することによってもヒト型抗体を作製すること
ができる（Ｍｏｓｉｅｒ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔｕｒｅ，３３５，２５６−２５９（１９８８）；Ｄ
ｕｃｈｏｓａｌ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，３５５，２５８−２６２（１９９２）。また、取得
したヒト型抗体を産生する融合細胞からＲＮＡを抽出
し、目的のヒト型抗体をコードする遺伝子をクローニン
グして、この遺伝子を適当なベクターに挿入し、これを
適当な宿主に導入して発現させることにより、さらに大
量に本発明のヒト型ＮＫＴ細胞抗体を作製することがで
きる。ここで、抗原との結合性の低い抗体は、それ自体
既知の進化工学的手法を用いることによりさらに結合性
の高い抗体として取得することもできる。一価性抗体
は、例えばパパイン等を用いてＦａｂ部分とＦｃ部分を
切断し、アフィニティカラム等を用いてＦａｂ部分を回
収することによって作製することができる。When human cells are obtained as the NKT cells of the present invention, the Severe combi transplanted with human peripheral blood lymphocytes using the polypeptide constituting the TCR of such cells or the cells themselves as an antigen.
Need Immunity Deficiency (SCI
D) A human antibody can also be prepared by immunizing a mouse in the same manner as described above and preparing a fused cell of the antibody-producing cell of the immunized animal and a human myeloma cell (Mosier, D. et al. E., et al., N
ature, 335, 256-259 (1988); D
uchosal, M .; A. , Et al. , Nature
e, 355, 258-262 (1992). In addition, RNA is extracted from the obtained fused cells producing the human antibody, the gene encoding the desired human antibody is cloned, this gene is inserted into an appropriate vector, and this is introduced into an appropriate host. By expressing it in a larger amount, the human NKT cell antibody of the present invention can be produced in a larger amount. Here, an antibody having a low antigen-binding property can also be obtained as an antibody having a higher binding property by using an evolutionary engineering method known per se. The monovalent antibody can be produced, for example, by cleaving the Fab portion and the Fc portion using papain or the like and recovering the Fab portion using an affinity column or the like.
【００４８】かかる免疫調節剤は、臨床へ応用するに際
し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、
薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物とし
て用いることもできる。この時の有効成分の担体に対す
る割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、
かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それら
の投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散
剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射
剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与
を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年
齢、体重等によって適宜選択することができる。In the clinical application of such an immunomodulator, the above active ingredients can be used alone,
It can also be used as a pharmaceutical composition by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier. The ratio of the active ingredient to the carrier at this time may be varied between 1 and 90% by weight. Also,
Such a drug can be administered in various forms, and those dosage forms include oral administration by tablets, capsules, granules, powders, syrups, etc., or injections, infusions, liposomes, suppositories. Parenteral administration such as Further, the dose can be appropriately selected depending on the symptoms, age, body weight and the like.
【００４９】（８）抗ＮＫＴ細胞抗体を利用したＮＫＴ
細胞の取得法
上記（６）で取得した本発明の抗体は、これを適当な動
物種の血液、または骨髄細胞等の細胞群と接触させるこ
とにより、本発明の前記した性質を有するＮＫＴ細胞を
取得することができる。具体的には、例えば、本発明の
抗体を適当な磁気ビーズ、あるいはマイクロプレート等
の固相と結合させ、これに上記細胞群を接触させ、洗浄
した後、該固相に本発明の抗体を介して結合している細
胞を回収することにより行うことができる。あるいは、
本発明の抗体に蛍光物質等の標識分子を結合させ、これ
に同様に細胞群を接触させた後に、ソーター等を利用し
て細胞が有する蛍光強度を指標として選択し、分離する
ことにより取得することもできる。(8) NKT using anti-NKT cell antibody
Method of Obtaining Cells The antibody of the present invention obtained in the above (6) is treated with blood of a suitable animal species, or a group of cells such as bone marrow cells to obtain NKT cells having the above-mentioned properties of the present invention. Can be obtained. Specifically, for example, the antibody of the present invention is bound to a suitable magnetic bead or a solid phase such as a microplate, the above-mentioned cell group is contacted with this, and after washing, the antibody of the present invention is applied to the solid phase. This can be done by collecting the cells that are bound via. Alternatively,
After binding a labeling molecule such as a fluorescent substance to the antibody of the present invention and contacting a cell group in the same manner as this, the fluorescence intensity of the cells is selected as an index using a sorter or the like, and obtained by separation. You can also
【００５０】また、同様にして血液中の本発明のＮＫＴ
細胞の数を測定することもできるため、本発明の抗ＮＫ
Ｔ細胞抗体は、血液中で本発明のＮＫＴ細胞数が変動す
る疾患の診断試薬としても用いることができる。このよ
うな診断を行うためのキットとしては、上記したように
標識、または固相に結合した本発明の抗体、バッファー
等の試薬類等が少なくとも含まれるが、上記した方法に
用いられるキットであれば如何なる試薬等の組み合わせ
であってもよい。Similarly, the NKT of the present invention in blood is also obtained.
Since the number of cells can be measured, the anti-NK of the present invention
The T cell antibody can also be used as a diagnostic reagent for diseases in which the number of NKT cells of the present invention varies in blood. The kit for performing such a diagnosis includes at least the label or the antibody of the present invention bound to a solid phase as described above, reagents such as a buffer, and the like. Any combination of reagents may be used.
【００５１】（９）ＮＫＴ細胞活性を調節する物質（免
疫調節活性を有する物質）のスクリーニング
本発明の前記性質を有するＮＫＴ細胞は、該細胞と被検
物質とを共培養し、該ＮＫＴ細胞の生物活性に変化を誘
発する物質のスクリーニングに用いることができる。本
発明のＮＫＴ細胞の生物活性は、該細胞が有するＴＣＲ
を介した刺激に応答した活性と、それ以外の活性に分け
られる。この２つの活性を増強、または抑制する物質の
スクリーニングは、例えば、次のとおり行うことができ
る。
（ａ）ＴＣＲを介した刺激非依存的な活性の調節物質の
スクリーニング
本発明のＮＫＴ細胞の生物活性を調節する物質は、該細
胞と被検物質を適当な培地中で培養した後、該細胞に現
れる表現型の変化を指標として選択することができる。
被検物質としては、本発明のＮＫＴ細胞の生物活性に影
響を及ぼす可能性のある物質であれば如何なるものであ
ってもいが、具体的には例えば、ペプチド、タンパク
質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、
発酵生産物、細胞抽出液、動物組織抽出液等が挙げられ
る。これらの物質は新規な物質であってもよいし、公知
の物質であってもよい。低分子化合物のさらに具体的な
例としては、ホルモン、あるいはホルモン様物質等が挙
げられ、タンパク質としては転写因子等が挙げられる。
これらの該細胞培養液への添加の順序、及び添加量等は
被検物質の種類によって適宜選択することができる。ま
た、該細胞に現れる表現型としては、形状等の目に見え
るものと、サイトカイン等の産生物質の量の変化等の生
化学的解析法によって解析し得るもののどちらでもよ
く、その表現型によってそれ自体既知の通常用いられる
方法を適宜選択して解析することができる。(9) Screening for Substances Regulating NKT Cell Activity (Substances Having Immunomodulatory Activity) NKT cells having the above-mentioned properties of the present invention are obtained by co-culturing the NKT cells with a test substance. It can be used to screen for substances that induce changes in biological activity. The biological activity of the NKT cell of the present invention is the TCR possessed by the cell.
It is divided into activities that respond to stimuli mediated by and other activities. The screening of substances that enhance or suppress these two activities can be performed, for example, as follows. (A) Screening for TCR-Mediated Stimulation-Independent Activity Modulator A substance that regulates the biological activity of NKT cells of the present invention is obtained by culturing the cells and a test substance in an appropriate medium, and then culturing the cells. The phenotypic change appearing in can be selected as an index.
The test substance may be any substance as long as it may affect the biological activity of the NKT cells of the present invention. Specifically, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, low Molecular compound, synthetic compound,
Examples include fermentation products, cell extracts, animal tissue extracts, and the like. These substances may be new substances or known substances. More specific examples of low molecular weight compounds include hormones and hormone-like substances, and examples of proteins include transcription factors.
The order of addition of these to the cell culture medium, the amount to be added, and the like can be appropriately selected depending on the type of the test substance. In addition, the phenotype that appears in the cells may be either a visible one such as a shape or one that can be analyzed by a biochemical analysis method such as a change in the amount of a production substance such as a cytokine, depending on the phenotype. A commonly used method known per se can be appropriately selected and analyzed.
【００５２】（ｂ）ＴＣＲを介した刺激依存的な活性の
調節物質のスクリーニング
本発明のＮＫＴ細胞と、被検物質を提示させた抗原提示
細胞とを共培養し、該細胞の表現型の変化を指標とし
て、本発明のＮＫＴ細胞のＴＣＲを介した刺激依存的な
活性の調節物質をスクリーニングすることができる。被
検物質としては、上記（ａ）に記載したものが挙げられ
るが、例えばＶα１４ＮＫＴ細胞のＴＣＲに特異的に結
合する物質がα−ＧａｌＣｅｒであり、Ｖα１９ＮＫＴ
細胞の抗原認識部位の一部の構造はＶα１４のそれと近
似のものであること等から、本発明のスクリーングに用
いる被検物質のライブラリーとして特に好ましくは糖脂
質ライブラリーが用いられる。(B) Screening for TCR-mediated stimulus-dependent activity modulator NKT cells of the present invention are co-cultured with a test substance-presenting antigen-presenting cell, and the phenotype of the cell is changed. Can be used as an index to screen for a regulatory substance of TCR-mediated stimulation-dependent activity of NKT cells of the present invention. Examples of the test substance include those described in (a) above. For example, the substance that specifically binds to the TCR of Vα14NKT cells is α-GalCer, and Vα19NKT.
Since the structure of part of the antigen recognition site of cells is similar to that of Vα14, etc., a glycolipid library is particularly preferably used as the library of the test substance used in the screening of the present invention.
【００５３】これら被検物質をＴＣＲに認識させるため
には、該物質を抗原提示細胞に提示させる必要がある。
抗原提示細胞としては、ＴＣＲを有さず、かつＭＨＣク
ラス１様分子を有するものであれば特に制限はない。こ
のような細胞としては、例えばＲＡＧ２欠損動物等のＴ
細胞欠損動物の脾臓細胞からＣｌｏｗｌｅｙ，Ｍ．ｅｔ
ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１８，１２
５（１９８９）に従って粗精製した樹状細胞等が好まし
く用いられる。これらの抗原提示細胞への被検物質の取
り込みは、それ自体既知の通常用いられる方法によるこ
とができるが、具体的には、被検物質を適当な緩衝液に
溶解し、これと上記抗原提示細胞を適当な培地内で培養
すること等により行う。また、被検物質が水溶性でない
場合には少量のＤＭＳＯやエタノールを加えて可溶化し
た後に、これを例えば培養ディッシュの底部で乾燥させ
ること等により添加したＤＭＳＯやエタノールを除いた
後に、抗原提示細胞を添加して培養する方法等が好まし
く用いられる。被検物質の量や、抗原提示細胞培養液へ
の添加の順序、及び添加量等は被検物質、及び抗原提示
細胞の種類によって適宜選択することができる。In order for the TCR to recognize these test substances, it is necessary to present the substances to the antigen presenting cells.
The antigen presenting cell is not particularly limited as long as it has no TCR and has an MHC class 1-like molecule. Examples of such cells include T of RAG2-deficient animals and the like.
From spleen cells of cell-deficient animals, Clowley, M. et al. et
al. , Cell Immunol. , 118, 12
5 (1989), dendritic cells and the like, which are roughly purified, are preferably used. Incorporation of the test substance into these antigen-presenting cells can be carried out by a commonly used method known per se. It is performed by culturing the cells in an appropriate medium. When the test substance is not water-soluble, a small amount of DMSO or ethanol is added to solubilize it, and then the added DMSO or ethanol is removed by, for example, drying it at the bottom of the culture dish. The method of culturing by adding cells is preferably used. The amount of the test substance, the order of addition to the culture medium for antigen-presenting cells, the amount to be added, and the like can be appropriately selected depending on the type of the test substance and the antigen-presenting cells.
【００５４】被検物質を提示した抗原提示細胞、本発明
のＮＫＴ細胞の反応は、これらを適当な培地中で適当時
間培養することにより行うことができる。具体的には、
例えば、１〜５×１０5個のＶα１９ＮＫＴ細胞に対
し、被検物質を提示した細胞をその０．１〜２０倍加
え、１〜５日間培養する方法等が好ましく用いられる。
また、解析するべき該細胞に現れる表現型としては、産
生されるサイトカインの種類、及び量が挙げられる。こ
れらの解析は上記した方法と同様に行うことができる。The reaction of the antigen-presenting cells presenting the test substance and the NKT cells of the present invention can be carried out by culturing these in an appropriate medium for an appropriate time. In particular,
For example, a method in which cells presenting the test substance are added 0.1 to 20 times to 1 to 5 × 10 5 Vα19NKT cells and the cells are cultured for 1 to 5 days is preferably used.
In addition, examples of the phenotype that appears in the cells to be analyzed include the type and amount of cytokines produced. These analyzes can be performed in the same manner as the method described above.
【００５５】また、ＴＣＲを介した刺激依存的な活性の
調節物質のスクリーニングは、例えば上記（６）で作製
したＶα１９ＮＫＴ細胞のＴＣＲに対する抗体と被検物
質を競合させ、被検物質による該抗体とＴＣＲとの結合
性の阻害度を指標として行うことができる。かくして本
発明のＮＫＴ細胞の生物活性を調節する物質はこれが本
発明のVα１９ＮＫＴ細胞の生物活性を制御する性質を
有することを利用して、免疫調節剤の有効成分として用
いることができる。さらに本スクリーニング法により選
抜した物質を調製し、これを上記（７）に記載した方法
と同様の方法により製剤化することにより、上記免疫調
節剤を製造することができる。この免疫調節剤の投与量
については、症状、年齢、体重等によって適宜選択する
ことができる。Further, the screening of the TCR-mediated stimulus-dependent activity regulatory substance is carried out, for example, by allowing the test substance to compete with the antibody against the TCR of the Vα19NKT cells prepared in (6) above, and The degree of inhibition of binding to TCR can be used as an index. Thus, the substance that regulates the biological activity of NKT cells of the present invention can be used as an active ingredient of an immunomodulator by utilizing the property that it regulates the biological activity of Vα19NKT cells of the present invention. Furthermore, the above immunomodulator can be produced by preparing a substance selected by this screening method and formulating it by a method similar to the method described in (7) above. The dose of the immunomodulator can be appropriately selected depending on the symptoms, age, body weight and the like.
【００５６】（１０）Ｖα１９トランスジェニック動物
を用いた抗アレルギー薬のスクリーニング方法
上記（５）で得られたＶα１９トランスジェニック動物
は、このイムノグロブリンＥの発現量が野生型に比べて
増大している。そこで、該動物に被検物質を投与し、該
動物体内のイムノグロブリンＥの発現量の変化を解析
し、該発現量を調節する作用を有する物質を選択するこ
とによれば、この物質を抗アレルギー薬として用いるこ
とができる。被検物質としては、上記（９）に記載のも
のが挙げられ、これらのＶα１９トランスジェニック動
物への投与量、および方法等は、動物種、年齢、体重、
あるいは被検物質の種類等によって適宜選択される。ま
た、イムノグロブリンＥの発現量の測定方法としては、
ELISA法、ELISPOT法、プラーク法（免疫研究法ハンドブ
ック、藤原大美、淀井淳司 編著、中外医学社）等が挙
げられる。ここで、該動物のイムノグロブリンＥの発現
量を抑制する活性のあるものは抗アレルギー薬の有効性
分として用いることができる。さらに本スクリーニング
法により選抜した物質を調製し、これを上記（７）に記
載した方法と同様の方法により製剤化することにより、
上記抗アレルギー薬を製造することができる。この抗ア
レルギー薬の投与量については、症状、年齢、体重等に
よって適宜選択することができる。(10) Method for Screening Antiallergic Drug Using Vα19 Transgenic Animal The Vα19 transgenic animal obtained in (5) above has an increased expression level of immunoglobulin E as compared with the wild type. . Therefore, by administering a test substance to the animal, analyzing the change in the expression level of the immunoglobulin E in the animal body, and selecting a substance having an action of regulating the expression level, the It can be used as an allergic drug. Examples of the test substance include those described in (9) above. The dose, method, and the like of these Vα19 transgenic animals include animal species, age, weight,
Alternatively, it is appropriately selected depending on the type of test substance. Further, as a method for measuring the expression level of immunoglobulin E,
ELISA method, ELISPOT method, plaque method (Immunology Research Method Handbook, edited by Daimi Fujiwara, Atsushi Yodoi, Chugai Medical Co., Ltd.) and the like can be mentioned. Here, a substance having an activity of suppressing the expression level of immunoglobulin E in the animal can be used as an effective component of the antiallergic drug. Furthermore, by preparing a substance selected by this screening method and formulating this by a method similar to the method described in (7) above,
The above antiallergic drug can be manufactured. The dose of this anti-allergic drug can be appropriately selected depending on the symptoms, age, weight and the like.
【００５７】[0057]
【実施例】実施例１ 非Ｖα１４ＮＫＴ細胞を含む細胞
分画の取得
ＣＤ１ｄ−／−マウス（Ｓｍｉｌｅｙ，Ｓ．Ｔ，ｅｔ
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２７５，９７７−９７９
（１９９７）；ハーバード大学医学部のＭ．Ｊ．Ｇｒｕ
ｓｂｙ博士より供与された）とＣ５７ＢＬ／６マウスと
の交配をくり返して得られたＮＫ１．１+ ／Ｈ−２b マ
ウスの肝臓を取り出し、金属メッシュでこし、細胞懸濁
液を調製した。これをＤＭＥ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ
社製）で希釈して肝臓一つあたり１０ｍｌとし、７００
×ｇで５分間遠心した。上清を吸引除去し、沈殿を４０
％パーコール液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に懸濁した。 Example 1 Cells containing non-Vα14NKT cells
Acquisition of fractions CD1d − / − mouse (Smiley, ST, et.
al. , Science. , 275, 977-979
(1997); Harvard University School of Medicine, M.M. J. Gru
The livers of NK1.1 + / H-2b mice obtained by repeated crosses of C57BL / 6 mice (provided by Dr. Sby) were taken out and rubbed with a metal mesh to prepare a cell suspension. DME medium (GIBCO BRL
(Manufactured by the company) to make 10 ml per liver, 700
It was centrifuged at xg for 5 minutes. Aspirate the supernatant and remove the precipitate by 40
% Percoll solution (Pharmacia).
【００５８】これを８０％パーコール液（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ社）に重層し、９００×ｇで１５分間遠心分離し
た。ここで４０％−８０％パーコール液の界面にある細
胞をパスツールピペットを用いて回収した。これをｐｈ
ｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）結合抗ＮＫ１．１抗体
（ＰＫ１６９；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）及びｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（Ｆ
ＩＴＣ）結合抗ＴＣＲαβ抗体（Ｈ５７−５９７；Ｐｈ
ａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で２重免疫染色し、ＮＫ１．１
+、ＴＣＲαβ+細胞をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ
ｃａｎ：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）にて
分離、取得した。80% Percoll solution (Pharma)
Cia) and centrifuged at 900 × g for 15 minutes. Here, cells at the interface of 40% -80% Percoll solution were collected using a Pasteur pipette. This is ph
ycoerythrin (PE) -conjugated anti-NK1.1 antibody (PK169; Pharmingen) and flu
orescein isothiocyanate (F
ITC) -conjugated anti-TCRαβ antibody (H57-597; Ph
double immunostaining with Armingen) and NK1.1
+, TCRαβ + cells in flow cytometer (FACS
can: manufactured by Becton Dickinson).
【００５９】これらの細胞群のＣＤ４、及び８コレセプ
ターの発現を、フローサイトメーターを用いて解析した
ところ、ＮＫＴ細胞について既に報告（Ｄａｎｇ，
Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６，
３６４１−３７４４（２００１））のあるとおり、ＣＤ
８陽性、ＣＤ４、及びＣＤ８共陰性のものがほぼ同数存
在し、それらが大勢を占めていた。The expression of CD4 and 8 coreceptors in these cell groups was analyzed using a flow cytometer, and was already reported for NKT cells (Dang,
Y. , Et al. J. Immunol. , 166
3642-3744 (2001)), CD
There were almost the same number of 8 positive, CD4, and CD8 co-negative, and they were predominant.
【００６０】実施例２ 非Ｖα１４ＮＫＴ細胞由来の融
合細胞の作製
上記実施例１で用いたものと同様のマウス（ＣＤ１−／
−；ＮＫ１．１+，Ｈ−２b）の肝臓から実施例１の方法
と同様にして５×１０6個のＮＫ１．１+，ＴＣＲαβ+
細胞を得た。これらを１μｇ／ｍｌ抗ＴＣＲαβ抗体
（抗体名；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、２０ｎｇ／ｍ
ｌリコンビナントＩＬ−７（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含むＤＭＥＭ培地５ｍｌ中で２
０００ＲのＸ線を照射したＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓単
核細胞、５×１０6個と共に３７℃、１０％ＣＯ2条件下
で２日間培養した。その後２５ユニット／ｍｌリコンビ
ナントＩＬ−２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ社製）を加え、同条件下でさらに２日間培養した。
これらの細胞をＳｈｉｍａｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１５７６
−１５７９（１９９７）に記載されている常法にしたが
ってＴ細胞腫瘍株ＢＷ５１４７のＴＣＲｍＲＮＡ発現の
ない変異株（Ｂｏｒｎ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，２７９−２９１（１９８８））
と細胞融合させた。ＨＡＴ選択の後、さらに培養し、増
殖した細胞株についてｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏ
ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）結合抗ＴＣＲαβ
抗体（Ｈ５７−５９７；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を
用いて染色し、ＴＣＲαβ陽性細胞をフローサイトメー
ター（ＦＡＣＳｔａｒ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ社）を使用して選択した。選択した陽性細胞を限界
希釈法にてクローニングした。 Example 2 Melting derived from non-Vα14NKT cells
Preparation of Synthetic Cells Mice similar to those used in Example 1 (CD1- /
-; NK1.1 +, H-2b) from the liver in the same manner as in Example 1 with 5 × 10 6 NK1.1 +, TCRαβ +
Cells were obtained. These are 1 μg / ml anti-TCRαβ antibody (antibody name; Pharmingen), 20 ng / m
Recombinant IL-7 (Upstate Biot
2 in 5 ml of DMEM medium containing
C57BL / 6 mouse spleen mononuclear cells irradiated with 000R X-rays were cultured with 5 × 10 6 cells at 37 ° C. under 10% CO 2 for 2 days. Then 25 units / ml recombinant IL-2 (Boehringer Mannhe
(manufactured by Im Co.) was added, and the cells were further cultured for 2 days under the same conditions.
These cells were prepared as described in Shimamura, M .; , Et a
l. , Eur. J. Immunol. , 27,1576
-1579 (1997), a mutant strain of T cell tumor strain BW5147 without TCR mRNA expression (Born, W., et al., Res.
Immunol. , 7, 279-291 (1988)).
And fused the cells. After the HAT selection, the cell line which was further cultured and expanded was subjected to fluorescein iso.
Thiocyanate (FITC) conjugated anti-TCR αβ
An antibody (H57-597; manufactured by Pharmingen) was used for staining, and TCRαβ-positive cells were analyzed by a flow cytometer (FACStar, Becton Dickins).
on). Selected positive cells were cloned by the limiting dilution method.
【００６１】実施例３ 非Ｖα１４ＮＫＴ細胞由来融合
細胞の解析
（１）ＴＣＲα鎖の構造解析
上記実施例２で作成した融合細胞株からＩＳＯＧＥＮ
（ニッポンジーン社製）を用いて添付の説明書に記載さ
れている方法に準じてＴｏｔａｌ ＲＮＡを取得し、さ
らにこれらを鋳型として作成したｃＤＮＡを環状化した
後、５’−ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ（ＴＡＫＡＲＡ
社製）を用いて５’−ＲＡＣＥを行った。具体的な操作
は以下の通りであるが、詳細な条件等は上記キットに添
付されたマニュアルに記載されたものに準じて行った。 Example 3 Non-Vα14 NKT cell derived fusion
Cell analysis (1) Structural analysis of TCR α chain From the fused cell line prepared in Example 2 above, ISOGEN
(Manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) was used to obtain Total RNA according to the method described in the attached instruction manual, and the cDNA prepared using these as a template was circularized, and then 5′-RACE Core Set (TAKARA).
5'-RACE was performed by using (manufactured by the company). The specific operation is as follows, but the detailed conditions and the like were performed according to those described in the manual attached to the above kit.
【００６２】上記各融合細胞株から得られたｔｏｔａｌ
ＲＮＡを鋳型として、Ｃα鎖をコードするＤＮＡ配列
に相補的な配列番号３に記載のリン酸化プライマーを用
いてＤＮＡ合成を行った。さらにこのＲＮＡ−ＤＮＡハ
イブリッド鎖のＲＮＡ部分をＲＮａｓｅＨ（上記キット
に添付）を用いて分解し、残った１本鎖のｃＤＮＡ鎖を
Ｔ４ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（上記キットに添付）を用い
て環状化した。この環状ＤＮＡを鋳型として、Ｃαをコ
ードするＤＮＡの５’末端から５’側（Ｊα側）へ向か
うプライマーとして配列番号４に記載のもの、またＣα
をコードするＤＮＡの３’末端から３’側（Ｖαの５’
側）へ向かうプライマーとして配列番号５に記載のもの
を用いてＰＣＲを行った。Total obtained from each of the above fused cell lines
DNA synthesis was performed using RNA as a template and the phosphorylation primer of SEQ ID NO: 3 complementary to the DNA sequence encoding the Cα chain. Furthermore, the RNA part of this RNA-DNA hybrid chain was decomposed using RNaseH (attached to the above kit), and the remaining single-stranded cDNA strand was circularized using T4RNA Ligase (attached to the above kit). Using this circular DNA as a template, a primer described in SEQ ID NO: 4 as a primer directed from the 5 ′ end to the 5 ′ side (Jα side) of Cα-encoding DNA, and Cα
3'from the 3'end of the DNA encoding
PCR was carried out using the primer described in SEQ ID NO: 5 as a primer directed to the side).
【００６３】さらに増幅されたＤＮＡを鋳型として、上
記で用いたプライマーより内側にずらした配列を有する
プライマー（５’側：配列番号６、３’側：配列番号
７）を用いてＰＣＲを行った。ここで増幅されたＤＮＡ
断片をアガロースゲルによる電気泳動で分離し、ゲル中
からＱＩＡＥＸ（Ｑｉａｇｅｎｅ社製）を用いて抽出
し、Ｔ−ｅａｓｙクローニングベクター（Ｐｒｏｍｒｇ
ａ社製）にクローニングした。これをＭ１３、及びＭ１
３Ｒｅｖプライマー（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いてＴｈ
ｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｔ ｌａｂｅｌｌｅｄ ｐｒｉｍｅｒ ｃｙｃｌｅ ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ ｋｉｔ（ＡｍｅｒｃｈａｍＰｈｅｒｍ
ａｃｉａ社製）により反応させ、オートＤＮＡシーケン
サー（ＨＩＴＡＣＨＩ：ＳＱ３０００）を用いて塩基配
列を決定した。Further, PCR was carried out using the amplified DNA as a template and a primer (5 ′ side: SEQ ID NO: 6, 3 ′ side: SEQ ID NO: 7) having a sequence displaced inward from the primer used above. . DNA amplified here
The fragments were separated by electrophoresis on an agarose gel, extracted from the gel using QIAEX (manufactured by Qiagene), and the T-easy cloning vector (Promrg) was extracted.
a company). This is M13 and M1
Th using 3Rev primer (manufactured by TAKARA)
ermo Sequenase Fluorescen
t labeled prime cycles
Sequence kit (AmerchamPherm
The reaction was carried out by Acia) and the base sequence was determined using an auto DNA sequencer (HITACHI: SQ3000).
【００６４】解析した融合細胞２１株のうち１１株で均
一なＶα１９．１−Ｊα２６鎖を発現していることが判
明した（表１）。またＶα１９．１−Ｊα２６鎖発現株
におけるＶ−Ｊ結合部位の塩基配列、及びアミノ酸配列
を図１にまとめた。生殖細胞型の配列をそのまま使用し
た株（ＮＢ１０３、ＮＢ２０１、ＮＢ２０４、ＮＢ２０
６、ＮＢ２１３、ＮＢ４０３）に加え、Ｖ−Ｊ遺伝子再
構成部位にアミノ酸の変異を起こした株も存在した。し
かしアミノ酸変異は１残基に限定され、しかも配列の長
さはすべて一定であり、この系譜の細胞発生時の正の選
択が極めて厳密に起こっていることが示唆された。これ
らのＶα１９．１−Ｊα２６鎖発現株を、以下「Ｖα１
９ＮＫＴ細胞」と総称する。It was found that 11 out of 21 fused cell lines analyzed expressed a uniform Vα19.1-Jα26 chain (Table 1). The nucleotide sequence and amino acid sequence of the VJ binding site in the Vα19.1-Jα26 chain expression strain are summarized in FIG. Strains using the germline sequence as they are (NB103, NB201, NB204, NB20
6, NB213, NB403), and a strain having an amino acid mutation at the VJ gene rearrangement site was also present. However, the amino acid mutation was limited to one residue, and the sequence lengths were all constant, suggesting that the positive selection during cell development of this lineage occurs extremely strictly. These Vα19.1-Jα26 chain expression strains are referred to as “Vα1
9NKT cells ”.
【００６５】（２）ＴＣＲβ鎖の構造解析
Ｖβに対する１５種類のＦＩＴＣ化された特異抗体（Ｍ
ｏｕｓｅ ＶβＴＣＲｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐａｎｅ
ｌ：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて、上記（１）で
Ｖα１９．１−Ｊα２６鎖を発現していることが確認さ
れた融合細胞株を免疫染色し、フローサイトメトリー
（ＦＡＣＳｔａｒ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
社を用いた）によりＶα１９．１α鎖と対をなすβ鎖の
Ｖβ使用を決定した（表１）。その結果Ｖβ８及び６の
使用頻度が高いことがわかった。α鎖と併せ、この細胞
種のＴＣＲの構造は極めて特殊であり、認識する抗原も
特定の物質に限定されることが示唆された。(2) Structural analysis of TCR β chain 15 kinds of FITC-specific antibodies against Vβ (M
use Vβ TCRscreening panel
l: Pharmingen) was used to immunostain the fused cell line confirmed to express the Vα19.1-Jα26 chain in the above (1), and flow cytometry (FACStar, Becton Dickinson).
The use of Vβ for the β chain paired with the Vα19.1 α chain was determined (Table 1). As a result, it was found that Vβ8 and V6 were used frequently. Together with the α chain, the structure of the TCR of this cell type is extremely unique, suggesting that the antigens it recognizes are limited to specific substances.
【００６６】[0066]
【表１】
表中ａ）は、Ｖβ２、３、４、５、６、７、８、９、１
０、１１、１２，１３，及び１４以外のＶβ鎖を有する
ことを示す。[Table 1] In the table, a) indicates Vβ2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1
It has a Vβ chain other than 0, 11, 12, 13, and 14.
【００６７】実施例４ Ｖα１９ＮＫＴ細胞株のＴＣＲ
ヘの刺激に応答したサイトカイン産生能
Ｖα１９ＮＫＴ細胞の性質の一端を明らかにする目的
で、上記実施例３（１）でＶα１９．１鎖を発現してい
ることが確認された融合細胞細胞株を利用しそのｉｎｖ
ａｒｉａｎｔ ＴＣＲへの刺激に応答したサイトカイン
の分泌パターンを調べた。各融合細胞を９６穴平底培養
プレートにＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈した抗ＣＤ３
ε抗体（１４５−２Ｃ１１：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社
製）を加え、４℃で１８時間培養した。ＰＢＳで２回洗
浄したのち１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度とした細胞株
浮遊液を１００μｌずつ加え（１０4個／ｗｅｌｌ）、
２日間培養した。この培養上清１００μｌに分泌された
ＩＬ−４、及びＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡ法により定
量した。３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ
−Ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）Ｌｉｑｕｉｄ ｓｕｂ
ｓｔｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＥＬＩＳＡ（Ｓ
ＩＧＭＡ社製）法で定量した。測定にはＢＤ Ｏｐｔ
ＥＩＡ ｓｅｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いて
行い、条件等も該キットに添付のマニュアルに従って行
った。また、対照としてＶα１４ＮＫＴ細胞から実施例
２と同様にして作成した融合細胞株（Ｓｈｉｍａｍｕｒ
ａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，２７，１５７６−１５７９（１９９７））、及び
ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして実施例２で使
用したＴＣＲ陰性のＴ細胞腫株ＢＷ５１４７を使用し
た。その結果を図２に示した。Ｖα１９ＮＫＴ細胞株で
はいずれもＩＬ−４／ＩＦＮ−γ分泌のバランスがＶα
１４ＮＫＴ細胞株と比較してＩＬ−４側に偏っているこ
とが判明した。 Example 4 TCR of Vα19NKT Cell Line
In order to clarify some of the properties of the Vα19NKT cells capable of producing cytokines in response to stimulation with F, a fused cell line confirmed to express the Vα19.1 chain in Example 3 (1) above was used. Shiso inv
The secretion pattern of cytokines in response to stimulation of the ariant TCR was examined. Each fused cell was diluted to 10 μg / ml with PBS in a 96-well flat bottom culture plate to obtain anti-CD3.
ε antibody (145-2C11: manufactured by Pharmingen) was added, and the mixture was cultured at 4 ° C. for 18 hours. After washing twice with PBS, 100 μl of cell line suspension at a concentration of 10 5 cells / ml was added (10 4 cells / well),
Cultured for 2 days. The amounts of IL-4 and IFN-γ secreted in 100 μl of this culture supernatant were quantified by the ELISA method. 3,3 ', 5,5'-Tetramethyl
-Benzidine (TMB) Liquid sub
Strate system for ELISA (S
IGMA). BD Opt for measurement
The EIA set (manufactured by Pharmingen) was used, and the conditions and the like were also according to the manual attached to the kit. As a control, a fused cell line (Shimamur) prepared from Vα14NKT cells in the same manner as in Example 2 was used.
a, M. et al. , Eur. J. Immuno
l. , 27,1576-1579 (1997)), and the TCR-negative T-cell tumor line BW5147 used in Example 2 was used as a negative control. The results are shown in Fig. 2. In all Vα19NKT cell lines, the balance of IL-4 / IFN-γ secretion was Vα.
It was found to be biased toward the IL-4 side as compared to the 14NKT cell line.
【００６８】実施例５ Ｖα１９−Ｊα２６導入ＤＮＡ
の調製
Shimamura and Huang, FEBS Letters 516:97-100 (200
2)に記載の方法に従って樹立したVα19-Jα26再構成遺
伝子発現ハイブリドーマ株(NB403)からVα19-Jα26を含
むＴＣＲα鎖の作製に必要な cＤＮＡ断片を単離し、こ
れにVα8.4のプロモーター領域及びCα、α遺伝子エン
ハンサー領域をライゲーションして配列番号８に示す導
入ＤＮＡを作成した。その模式図を図３に示した。以下
に詳細に説明する。 Example 5 Vα19-Jα26-introduced DNA
Preparation of Shimamura and Huang, FEBS Letters 516: 97-100 (200
The cDNA fragment necessary for the production of TCRα chain containing Vα19-Jα26 from the Vα19-Jα26 reconstituted gene expression hybridoma strain (NB403) established according to the method described in 2) was isolated, and the promoter region of Vα8.4 and Cα The α gene enhancer region was ligated to prepare the introduced DNA shown in SEQ ID NO: 8. The schematic diagram is shown in FIG. The details will be described below.
【００６９】NB403からISOGEN（ニッポンジーン社）に
より単離したＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成キット（Time S
aver cDNA Synthesis Kit； Amersham Pharmacia Biote
chnology社製）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成し、Ｅｃ
ｏＲＩによる消化と脱リン酸化処理を行ったλZAPII ve
ctor（Stratagene社製）に挿入してパッケイジング後、
大腸菌XL-1 blue MeF'(Stratagene社製）に感染させ
て、phage cDNAライブラリーを作製した。次に、作製さ
れた独立クローンを含むphage cDNAライブラリーを、V
α19-Jα26-Cαを含むDNA断片（配列番号：９）を用い
てスクリーニングした。陽性クローンに含まれるｃＤＮ
Ａを、ペルパーファージに感染させてpBluescript II S
K(-)（Stratagene社製）にクローニングした株(pGLα)
を得てオートDNAシーケンサー(HITACHI:SQ3000)を用い
て塩基配列を決定した。その結果、リーダー配列(L)とV
α19-Jα26がスプライシングしているmRNAに基づくｃＤ
ＮＡクローンが得られたことが確認されたので、これを
基に以下の導入ＤＮＡを調製することとした。From the RNA isolated from NB403 by ISOGEN (Nippon Gene), a cDNA synthesis kit (Time S
aver cDNA Synthesis Kit; Amersham Pharmacia Biote
chnology) to synthesize double-stranded cDNA, and Ec
λZAPII ve digested with oRI and dephosphorylated
After inserting into ctor (Stratagene) and packaging,
Escherichia coli XL-1 blue MeF '(Stratagene) was infected to prepare a phage cDNA library. Next, the phage cDNA library containing the prepared independent clones was
Screening was performed using a DNA fragment containing α19-Jα26-Cα (SEQ ID NO: 9). CDNA contained in positive clones
PBluescript II S by infecting A with perperphage
Strain (pGLα) cloned into K (-) (Stratagene)
Then, the nucleotide sequence was determined using an automatic DNA sequencer (HITACHI: SQ3000). As a result, the leader sequence (L) and V
cDNA based on mRNA with α19-Jα26 splicing
Since it was confirmed that an NA clone was obtained, it was decided to prepare the following introduced DNA based on this.
【００７０】次にLとVα19間のイントロンをクローニン
グするため、イントロン上の配列番号１０およびVα19
上の配列番号１１のプライマーを用い、NB403ゲノムDNA
を鋳型にPCRを行い、増幅されたＤＮＡ断片はpGEMT-eas
yプラスミド（Promega社製）にライゲーションしてクロ
ーニングした(pLVα)。上記で取得されたＶ−Ｊ領域のc
DNAクローン（pGLα）とこのゲノムクローンをVα19上
とプラスミド上のPstIサイトを利用して組み換え、Vα1
9-Jα26の両端をgerm-line配列のイントロンで挟んだゲ
ノムがpBluescript II SK(-)に組み込まれたクローン(p
VJα)を得た。Next, to clone the intron between L and Vα19, SEQ ID NO: 10 and Vα19 on the intron were cloned.
Using the primer of SEQ ID NO: 11 above, NB403 genomic DNA
PCR was performed using as a template and the amplified DNA fragment was pGEMT-eas.
It was ligated to the y plasmid (Promega) and cloned (pLVα). C of VJ area obtained above
A DNA clone (pGLα) and this genomic clone were recombined using Vα19 and the PstI site on the plasmid to generate Vα1.
A clone in which the ends of 9-Jα26 were flanked by introns of germ-line sequence and integrated into pBluescript II SK (-) (p
VJα) was obtained.
【００７１】次にリーダー配列を含むプロモーター領域
はAsada, A., Immunology, 101, 309-315(2000)に記載
のとおり、BOG8株から作成したVα8.4を含むゲノムDNA
クローン（pGα１）から調製した。pGα１のLとV-J間イ
ントロン上のAatIIサイトとプラスミドpBluescript SK
(-)上のNotIサイトの間を切り出し、代わって上記Vα19
-Jα26部分ゲノムクローン(pVJα)からインサートをEco
RIで切り出したものをブラントエンドライゲーションし
て置き換えた。このinsertをSmaI,SacIIで切り出しpBlu
escript KS(+)に再度組み込んだ(pLVJα)。次にTCR C
α、エンハンサー領域のゲノムクローン（pCαE, Sha,
W.C. et al. Nature, 335: 271-274(1988)）をpBluescr
ipt SK(-)からSmaI, NotIで切り出し、これをEcoRV, N
otIで切り開いておいたpLVJαに組み込み最終的に配列
番号８に示す導入ＤＮＡを作成した。Next, the promoter region containing the leader sequence is a genomic DNA containing Vα8.4 prepared from the BOG8 strain as described in Asada, A., Immunology, 101, 309-315 (2000).
It was prepared from the clone (pGα1). AatII site on the intron between L and VJ of pGα1 and plasmid pBluescript SK
(-) Cut out the NotI site above and replace it with Vα19 above.
-Eco insert from Jα26 partial genomic clone (pVJα)
The one cut out by RI was replaced by blunt end ligation. Cut out this insert with SmaI and SacII pBlu
It was incorporated into escript KS (+) again (pLVJα). Then TCR C
α, enhancer region genomic clone (pCαE, Sha,
WC et al. Nature, 335: 271-274 (1988)) pBluescr
Cut out ipt SK (-) with SmaI, NotI, and cut this with EcoRV, N
It was incorporated into pLVJα that had been cut open with otI, and finally the introduced DNA shown in SEQ ID NO: 8 was prepared.
【００７２】実施例６ invariant Vα19-Jα26 TCRト
ランスジェニック(Tg)マウスの作成
得られたベクターからSalI、NotIで切り出した導入ＤＮ
Ａとして用いるインサートは低融点アガロースゲル電気
泳動に供して該当するバンドを切り出した。抽出後エタ
ノール沈澱によって精製したものをDulbecco's PBSで２
μg/mlの濃度に再溶解し、さらに遠心分離を行った上清
をマウス受精卵へのマイクロインジェクションに用いる
こととした。採卵用のＣ５７ＢＬ／６系統雌マウスに卵
胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン；ＰＭＳ
Ｇ）及び黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモ
ン；ｈＣＧ）をそれぞれ個体あたり約５単位、４８時間
間隔で腹腔内投与して過剰***させ、Ｃ５７ＢＬ／６系
統雄マウスと交配させた。膣栓確認後、交配後１日目の
卵管からマウス受精卵（初期胚）を採取し、上記実施例
５で得られた導入ＤＮＡDNA溶液を、該受精卵の雄性前
核に2 plずつマイクロインジェクションした。これを２
細胞期までWhitten'sの培地中にて３７℃で培養し、偽
妊娠の雌ＩＣＲ系マウスの輸卵管に戻して個体を発生さ
せ、帝王切開により仔マウスを取り出した。得られた仔
マウスは、すぐに仮親につけて離乳期まで育てた。Tgマ
ウスのスクリーニングはサザンブロット法を用いた。上
記の方法で作製されたTgマウスは、出生後１〜３週経過
したところで尾の先を切り取って、高分子ＤＮＡ抽出法
によりゲノムＤＮＡを抽出し、各ＤＮＡ 10μｇを1mM
spermidine存在下で一晩ＥｃｏＲＩで消化した後、エタ
ノール沈澱を行って濃縮した。沈澱として得られたＤＮ
Ａは、ＴＥバッファー（10 mM Tris-HCl(pH8), 1 mM ED
TA)に再溶解し、アガロースゲル電気泳動法を用いて分
離精製してサザンブロットに用いた。サザンブロットに
用いる分析用プローブは上記配列番号８に示す塩基配列
の塩基番号２４７７〜２７０９番のDNA断片を用いた。
これをランダムプライマー法（Random Primer DNA Labe
ling Kit Ver.2; 宝酒造社製）により32Ｐ-標識して分
析用プローブとした。その結果の一部を図４に示した
が、計５系統のFounderを得た。交配によりＦ１個体を
得ることができた３系統のうちサザン分析の結果から予
測される導入ＤＮＡのコピー数および後記するFACSによ
るリンパ球分析の結果から最もVα19NKT細胞の発生頻度
の高いラインを以下の実験に使用することにした。 Example 6 invariant Vα19-Jα26 TCR
Preparation of transgenic (Tg) mouse Transduced DN excised with SalI and NotI from the obtained vector
The insert used as A was subjected to low melting point agarose gel electrophoresis and the corresponding band was cut out. After extraction, refine the product by ethanol precipitation and use 2 with Dulbecco's PBS.
The supernatant re-dissolved at a concentration of μg / ml and further centrifuged was used for microinjection into fertilized mouse eggs. Follicle-stimulating hormone (pregnant horse serum gonadotropin; PMS) was added to C57BL / 6 strain female mice for egg collection.
G) and luteinizing hormone (human chorionic gonadotropin; hCG) were intraperitoneally administered at about 5 units per individual at 48-hour intervals for superovulation, and mated with C57BL / 6 strain male mice. After confirmation of the vaginal plug, fertilized mouse eggs (early embryos) were collected from the oviduct on the first day after mating, and the introduced DNA DNA solution obtained in Example 5 was micro-applied to each male pronucleus of the fertilized egg in an amount of 2 pl. Injected. This 2
The cells were cultured in the Whitten's medium at 37 ° C. until the cell stage, returned to the oviduct of a pseudopregnant female ICR mouse to develop an individual, and a pup mouse was removed by caesarean section. The obtained offspring mouse was immediately attached to a foster mother and raised until the weaning period. Southern blotting was used to screen Tg mice. The Tg mouse produced by the above method was cut off at the end of its tail at 1 to 3 weeks after birth, and genomic DNA was extracted by a high molecular weight DNA extraction method to obtain 10 μg of each DNA at 1 mM.
After digestion with EcoRI overnight in the presence of spermidine, ethanol precipitation was performed and the mixture was concentrated. DN obtained as a precipitate
A is TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH8), 1 mM ED
It was redissolved in TA), separated and purified using agarose gel electrophoresis, and used for Southern blotting. As a probe for analysis used for Southern blotting, a DNA fragment having base numbers 2477 to 2709 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 was used.
This is a random primer method (Random Primer DNA Labe
ling Kit Ver.2; manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and labeled with 32 P- to give an analytical probe. A part of the result is shown in Fig. 4, and a total of 5 founders were obtained. Among the 3 lines that were able to obtain F1 individuals by mating, the copy number of the introduced DNA predicted from the results of Southern analysis and the result of lymphocyte analysis by FACS described below indicate the line with the highest occurrence frequency of Vα19NKT cells as follows. I decided to use it for the experiment.
【００７３】実施例７ invariant Vα19-Jα26 TCRト
ランスジェニックマウスにおけるVα19 NKT細胞の発生
実施例６で得られたトランスジェニックマウスにおける
導入ＤＮＡに含まれるＴＣＲα鎖の発現はプロモータ
ー、エンハンサーにTCRα遺伝子それ自身のものを使用
したためにＴ、ＮＫＴ細胞系列に限定される。先ず肝臓
リンパ球における導入ＤＮＡの発現をRT-PCR法により解
析した（図５）。実施例６で取得されたトランジーンプ
ラスおよびマイナスのマウスより単核球細胞を肝臓、胸
腺、脾臓、骨髄から調製した。肝臓からの単核球細胞の
調製は文献にしたがって（Shimamura and Huang, FEBS
Letters 516:97-100 (2002)）Percoll密度勾配遠心法に
よった。その他は常法によった。これらの細胞より、IS
OGEN（ニッポンジーン社製）により単離したＲＮＡか
ら、RNA PCRキット(RNA PCRKit(AMV)Ver2.1:Takara社
製）を用いてＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド鎖を合成
し、これを鋳型としてVα8.4リーダー配列（配列番号１
２）とJα26配列上（配列番号１３）のプライマーによ
りRT-PCRを行った。また、コントロールとして、TCRα
鎖定常領域(Cα)の５’端（配列番号１４）と３’端
（配列番号１５）の塩基配列を有するプライマーを用い
て同様にPCRを行った。これらの反応液をアガロースゲ
ル電気泳動により分離した結果を図５に示す。図中、Ｔ
ｇ+は、トランスジェニックマウス由来のＲＮＡの結果
を、またＴｇ-はトランスジーンネガティブのマウス由
来のＲＮＡの結果を示す。レーン上の数字は、鋳型の量
（μｇ）を示す。Cαの分析結果よりＴｇ+およびＴｇ-
マウスから調製した試料のＴ細胞の数はほぼ対応してい
ることが示されたが、このときに、導入ＤＮＡの一部は
トランスジェニックマウス由来のＲＮＡから合成したｃ
ＤＮＡを鋳型とした場合にのみＤＮＡ断片が増幅され、
導入ＤＮＡに含まれる遺伝子の強い発現がみられた。 Example 7 invariant Vα19-Jα26 TCR
Generation of Vα19 NKT cells in transgenic mice The expression of the TCRα chain contained in the introduced DNA in the transgenic mouse obtained in Example 6 was observed in T and NKT cell lines because the TCRα gene itself was used as the promoter and enhancer. Limited. First, the expression of the introduced DNA in liver lymphocytes was analyzed by the RT-PCR method (FIG. 5). Mononuclear cells were prepared from the transgene plus and minus mice obtained in Example 6 from liver, thymus, spleen and bone marrow. Preparation of mononuclear cells from liver was performed according to literature (Shimamura and Huang, FEBS
Letters 516: 97-100 (2002)) Percoll density gradient centrifugation. Others were in accordance with the usual method. From these cells, IS
From RNA isolated by OGEN (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.), a hybrid chain of DNA and RNA was synthesized using an RNA PCR kit (RNA PCR Kit (AMV) Ver2.1: manufactured by Takara), and Vα8.4 was used as a template. Leader sequence (SEQ ID NO: 1
2) and RT-PCR was performed using the primer on the Jα26 sequence (SEQ ID NO: 13). As a control, TCRα
PCR was carried out in the same manner using primers having the nucleotide sequences at the 5'end (SEQ ID NO: 14) and 3'end (SEQ ID NO: 15) of the chain constant region (Cα). The results of separating these reaction solutions by agarose gel electrophoresis are shown in FIG. T in the figure
g + indicates the result of RNA derived from the transgenic mouse, and Tg − indicates the result of RNA derived from the transgene negative mouse. The numbers on the lanes indicate the amount of template (μg). From the analysis results of Cα, Tg + and Tg −
It was shown that the numbers of T cells in the samples prepared from the mice were almost the same, but at this time, a part of the introduced DNA was c synthesized from RNA derived from the transgenic mouse.
DNA fragments are amplified only when DNA is used as a template,
Strong expression of the gene contained in the introduced DNA was observed.
【００７４】次にVα19 NKT細胞の発生をFACSで調べ
た。Ｖα１９トランスジェニックマウスおよびB６マウ
スより単核球細胞を肝臓、胸腺、脾臓、骨髄から調製し
た。肝臓からの単核球細胞の調製は文献にしたがって
（Shimamura and Huang, FEBS Letters 516:97-100 (20
02)）Percoll密度勾配遠心法によった。その他は常法に
よった。得られた単核球細胞は抗Fcレセプター抗体（2.
4G2：ファーミンジェン社製）で処理後、FITC標識抗TCR
αβ（ファーミンジェン社製）、PE標識抗NK1.1抗体
（ファーミンジェン社製）で2重蛍光染色後FACScanフロ
ーサイトメーター（Becton Dickinson社製）を用いて
分析した（図６）。図中、グラフの縦軸はＮＫ１．１の
発現量を、横軸はTCRαβ鎖の発現量を示す。また、上
段のグラフは、トランスジェニックマウス由来の細胞の
解析結果を示し、下段のグラフは野生型マウス由来の細
胞の解析結果を示す。また、左端から順に肝臓、胸腺、
脾臓、骨髄由来の細胞の解析結果を示す。いずれの臓器
においてもTCRαβ、NK1.1共陽性のNKT細胞の割合は上
記トランスジェニックマウスでも増加はみられなかっ
た。しかし上記トランスジェニックマウスにおいては、
導入ＤＮＡが発現しているVα19NKT細胞と考えられるTC
Rαβの発現強度の増強された細胞が数多く発現してい
たが、これは野生型B6マウスには少数しか存在しない。Next, the development of Vα19 NKT cells was examined by FACS. Mononuclear cells were prepared from Vα19 transgenic mouse and B6 mouse from liver, thymus, spleen and bone marrow. Preparation of mononuclear cells from liver was performed according to the literature (Shimamura and Huang, FEBS Letters 516: 97-100 (20
02)) Percoll density gradient centrifugation. Others were in accordance with the usual method. The obtained mononuclear cells were anti-Fc receptor antibody (2.
4G2: made by Pharmingen), and then treated with FITC-labeled anti-TCR
After double fluorescence staining with αβ (Pharmingen) and PE-labeled anti-NK1.1 antibody (Pharmingen), analysis was performed using a FACScan flow cytometer (Becton Dickinson) (FIG. 6). In the figure, the vertical axis of the graph shows the expression level of NK1.1, and the horizontal axis shows the expression level of TCRαβ chain. Further, the upper graph shows the analysis result of the cells derived from the transgenic mouse, and the lower graph shows the analysis result of the cells derived from the wild-type mouse. The liver, thymus, and
The analysis results of cells derived from spleen and bone marrow are shown. The proportion of TCRαβ and NK1.1 co-positive NKT cells in any of the organs was not increased in the transgenic mice. However, in the transgenic mouse,
TC considered to be Vα19NKT cells expressing the introduced DNA
A large number of cells with enhanced expression of Rαβ were expressed, but this was only present in a small number in wild-type B6 mice.
【００７５】次にトランスジェニックマウス、B６マウ
ス、CD１遺伝子欠損マウスの肝臓単核球を同様の方法で
FITC標識した抗CD４あるいはCD８とPE標識した抗NK1.1
抗体で2重蛍光染色後FACS分析した（図７）。その結
果、トランスジェニックマウスではCD８発現NKT細胞
（Ｖα１４ＮＫＴ細胞は、ＣＤ８陰性である）としてV
α19NKT細胞が多数発生していることが明確となった。
これに対して野生型B６マウスではVα14 NKT細胞が主と
してCD４発現細胞として発生し、これはCD１遺伝子欠損
マウスでは消失していることは文献（Bendelac,A., et
al.、 Science, 268:863-865 (1995)）の示すごとくで
あった。Next, liver mononuclear cells of transgenic mice, B6 mice, and CD1 gene-deficient mice were treated in the same manner.
FITC-labeled anti-CD4 or CD8 and PE-labeled anti-NK1.1
After double fluorescence staining with antibody, FACS analysis was performed (Fig. 7). As a result, in transgenic mice, V8 was detected as CD8-expressing NKT cells (Vα14NKT cells are CD8-negative).
It became clear that a large number of α19 NKT cells were generated.
On the other hand, in wild type B6 mice, Vα14 NKT cells mainly develop as CD4 expressing cells, which disappears in CD1 gene-deficient mice (Bendelac, A., et al.
al., Science, 268: 863-865 (1995)).
【００７６】実施例８ トランスジェニックマウスNKT
細胞のサイトカイン分泌の解析
Vα19NKT細胞の機能を知るうえで、invariant TCRから
の刺激に応答したサイトカインの分泌を調べることは有
力な情報となる。野生型マウスでの発生数の少ないVα1
9NKT細胞の解析は困難を伴う。このTgマウスでは肝臓の
NKT細胞の約５０％がVα19NKT細胞であることからこれ
を材料とした。対照としてVα14 NKT細胞が大半を占め
るB6マウス肝臓NKT細胞を用いた。両マウス肝臓単核球
をPercoll密度遠心法で調製し、ビオチン標識した抗NK
1.1抗体（Pharmingen社製）で染色後、磁気ビーズを結
合させた抗ビオチン抗体（Pharmingen社製）で標識し、
MACS法（Miltenyi Biotec GmbH, Germany）にてNK1.1発
現細胞を調製し、以下の実験に供した。９６穴プレート
に抗CD3抗体（2C１１、Pharmingen社製： 100マイクロ
グラム／ml）をコートし、その上で2×105個の細胞を培
養してTCRからの刺激を与え、そのとき培養上清に分泌
されたIL-4、IFN-γを実施例４に記載の方法と同様にEL
ISA法で定量した。抗体はPharmingen社製のものを使用
した。トランスジェニックマウスNKT細胞では培養１日
目、2日目のサイトカイン濃度は、IL-4の濃度が１．
１、１．５ ng/mlであり、IFN-γの濃度が８．２、４
５．０ng/mlであった。 一方、B6マウスNKT細胞ではIL-
4の濃度は培養１日目が０．８６、２日目が０．５９ng/
mlであり、また IFN-γ濃度は培養１日目で６．９、２
日目で４２．０ ng/mlであった。おのおののNKT細胞の
培養１日目、2日目におけるIL-4とIFN-γの比を図８に
示した。図中Ｄａｙ０−１で示すレーンは培養１日目の
結果を示し、Ｄａｙ１−２で示すレーンは培養２日目の
結果を示す。図から明らかなように、トランスジェニッ
クマウスから得られたＮＫＴ細胞ではＢ６マウスのNKT
細胞と比較してIL-4に分泌が偏っていることが示唆さ
れ、トランスジェニックマウスのＮＫＴ細胞はＶα１９
ＮＫＴ細胞が多いことが示された。これはそれぞれのハ
イブリドーマ株を用いた私達の分析結果（実施例４）か
ら予測されたとおりであった。 Example 8 Transgenic Mouse NKT
Analysis of Cell Cytokine Secretion In order to know the function of Vα19NKT cells, investigating the secretion of cytokines in response to stimulation from invariant TCR is a powerful information. Vα1 rarely occurs in wild-type mice
Analysis of 9NKT cells is difficult. In this Tg mouse
Since approximately 50% of NKT cells are Vα19NKT cells, this was used as the material. As a control, B6 mouse liver NKT cells dominated by Vα14 NKT cells were used. Both mouse liver mononuclear cells were prepared by Percoll density centrifugation and labeled with biotin.
1.1 After staining with antibody (Pharmingen), labeled with anti-biotin antibody (Pharmingen) with magnetic beads attached,
NK1.1-expressing cells were prepared by the MACS method (Miltenyi Biotec GmbH, Germany) and subjected to the following experiments. 96-well plate was coated with anti-CD3 antibody (2C11, manufactured by Pharmingen: 100 microgram / ml), and 2 × 10 5 cells were cultured on the plate to give stimulation from TCR. At that time, culture supernatant IL-4 and IFN-γ secreted by Escherichia coli were treated with EL in the same manner as in Example 4.
It was quantified by the ISA method. The antibody used was manufactured by Pharmingen. In the transgenic mouse NKT cells, the cytokine concentration on the 1st and 2nd day of the culture was IL-4 at 1.
1, 1.5 ng / ml, IFN-γ concentration of 8.2, 4
It was 5.0 ng / ml. On the other hand, IL-in B6 mouse NKT cells
The concentration of 4 was 0.86 on the first day of culture and 0.59 ng / on the second day of culture.
and the IFN-γ concentration was 6.9, 2 on the first day of culture.
It was 42.0 ng / ml on the day. FIG. 8 shows the ratio of IL-4 to IFN-γ on the first and second days of culture of each NKT cell. In the figure, the lane indicated by Day 0-1 shows the result on the first day of culture, and the lane indicated by Day 1-2 shows the result on the second day of culture. As is clear from the figure, in the NKT cells obtained from the transgenic mouse, the NKT of the B6 mouse was
It was suggested that the secretion was biased toward IL-4 as compared with the cells, and that NKT cells of transgenic mice were Vα19.
It was shown that there are many NKT cells. This was as expected from our analysis results (Example 4) using each hybridoma strain.
【００７７】実施例９ Vα１９トランスジェニックマ
ウスにおける抗体産生
実施例６で取得されたVα19 NKT細胞が過剰発生するＶ
α１９トランスジェニックマウスの免疫応答を解析し
た。ポリクローナルに抗体産生を誘導する抗原として特
にイムノグロブリンＥ（IgE）産生誘導抗原として常用
されるヤギ抗マウスIgD抗血清（Finkerlman, F. D., et
al., J. Immunol., 126, 686(1981)）２００μｌをマ
ウスの腹腔内に投与して、７日後の抗体産生を調べた。
この結果を図９に示した。図中、縦軸は血清中のＩｇＥ
量を示し、グラフ左の目盛りは、抗ＩｇＤ抗原による刺
激前の値を示し、右側の目盛りは抗原刺激後の値を示
す。また、白丸で示すグラフは。トランスジェニックマ
ウスの結果を示し、黒丸は野生型マウスの結果を示す。 Example 9 Vα19 transgenic mice
Antibody Production in Usus Vα19 NKT cells obtained in Example 6 overproduce V
The immune response of α19 transgenic mice was analyzed. Goat anti-mouse IgD antiserum (Finkerlman, FD, et al.) Which is commonly used as an antigen for inducing polyclonal antibody production, particularly as an antigen for inducing immunoglobulin E (IgE) production
Al., J. Immunol., 126, 686 (1981)) 200 μl was intraperitoneally administered to mice, and antibody production was examined 7 days later.
The result is shown in FIG. In the figure, the vertical axis represents IgE in serum
The amount on the left side of the graph shows the value before stimulation with the anti-IgD antigen, and the right side shows the value after antigen stimulation. Also, the graphs shown with white circles are. The results for transgenic mice are shown, and the black circles indicate the results for wild-type mice.
【００７８】図から明らかなように免疫前の血清IgEレ
ベルは上記トランスジェニックマウスにおいて野生型マ
ウスのレベルより高くなっていることが判明した。一方
抗原を免疫後１週間でのIgEレベルは逆にTgマウスでは
野生型に比べ著しく低下していることがわかった。この
ことからVα19 NKT細胞は通常は図８に示したサイトカ
イン分泌パターンからも予測されるとおりTh２環境への
偏移に寄与しIgE産生レベルを上昇させるのに寄与する
が、ひとたび抗原にさらされた時には逆にTh２環境を抑
えてTh１／Th２バランスのhomeostasisに寄与すること
が示唆された。このことからVα19 NKT細胞のI型アレル
ギー抑制効果が期待される。As is clear from the figure, the serum IgE level before immunization was found to be higher in the transgenic mouse than in the wild-type mouse. On the other hand, it was found that the IgE level one week after the immunization with the antigen was remarkably lower in the Tg mouse than in the wild type. This suggests that Vα19 NKT cells normally contribute to the shift to the Th2 environment and increase the IgE production level, as predicted from the cytokine secretion pattern shown in FIG. 8, but were once exposed to the antigen. On the contrary, it was suggested that it suppresses Th2 environment and contributes to homeostasis of Th1 / Th2 balance. From this, Vα19 NKT cells are expected to have type I allergy suppressing effect.
【００７９】[0079]
【発明の効果】本発明により、それまでにＮＫＴ細胞と
して知られていたＶα１４ＮＫＴ細胞とサイトカインの
産生パターンの異なる新規なＮＫＴ細胞、該細胞由来の
融合細胞が提供される。該細胞は保存された構造のＴＣ
Ｒを有していることから、特定の抗原（リガンド）を有
することが予想される。本発明の細胞はこのリガンドの
スクリーニング方法を提供することにより新たな免疫調
節剤の提供も可能とするものである。また、本発明によ
れば、上記ＮＫＴ細胞が有するＴ細胞レセプターα鎖を
コードするＤＮＡをＴ細胞特異的に発現するように導入
した非ヒト哺乳動物が提供される。該動物は、野生型に
比べて血清中のＩｇＥ濃度が高いため、抗アレルギー薬
のスクリーニングに有用である。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides novel NKT cells having different cytokine production patterns from Vα14NKT cells known as NKT cells, and fused cells derived from the cells. The cells have a conserved structure of TC
Since it has R, it is expected to have a specific antigen (ligand). The cells of the present invention can provide a new immunomodulator by providing the screening method for this ligand. Further, according to the present invention, there is provided a non-human mammal into which the DNA encoding the T cell receptor α chain possessed by the NKT cells has been introduced so as to specifically express T cells. The animal has a high IgE concentration in serum as compared with the wild type, and thus is useful for screening anti-allergic drugs.
【００８０】[0080]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Chemical Corporation <120> Novel NKT cells <130> J09279 <160> 15 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Leu Gln Met Trp Gly Phe Val Leu Tyr Leu Phe Leu Thr Val Gly 1 5 10 15 Gly Ala Ala Gly Gln Gly Val Glu Gln Pro Ala Lys Leu Met Ser Val 20 25 30 Glu Gly Thr Phe Ala Arg Val Asn Cys Thr Tyr Ser Thr Ser Gly Phe 35 40 45 Asn Gly Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Glu Gly Gln Ala Pro Val Phe 50 55 60 Leu Ser Tyr Val Val Leu Asp Gly Leu Lys Asp Ser Gly His Phe Ser 65 70 75 80 Thr Phe Leu Ser Arg Ser Asn Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Thr Glu 85 90 95 Leu Gln Ile Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Asp Ser 100 105 110 Asn Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ser Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys Pro 115 120 125 <210> 2 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <303> J. Exp. Med. <304> 189 <305> 12 <306> 1907-1921 <307> 1999/6/21 <400> 2 Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Thr Phe Asn Gly 20 25 30 Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser 35 40 45 Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe 50 55 60 Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln 65 70 75 80 Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Lys Asp Ser Asn Tyr 85 90 95 Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys Pro 100 105 110 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 3 atcttggcag gt 12 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 4 aagtcggtga acaggcagag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 5 ctggaacgtt catcactgac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 6 ctggtacaca gcaggttctg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 7 gctatggatt ccaagagcaa 20 <210> 8 <211> 12035 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 tctagagcta gaattgttaa taagaaagaa caatagtctg atagctgtag tcaccatgat 60 ctacattgga ttttaattta attgggcaga acaatgaagc cttctttccc actttattga 120 tatttctgtg gctgtatttg gatggtgagt taatattttg ggccacagaa tggtcagtgt 180 gtatttgaga catctagggg tgtgccatct tactcagatt ttctctagtt accataaaaa 240 aggagaaact tggaaagtga tggcctcaca gcctttctcc tttctttcca tctttctgca 300 tagagatgag ccaaggcaag caggtggagc agcttccttc catcctgaga ttcaaagaag 360 ggaccaacac tctcaaaaac tgcatttatg taaacaatgc ctcactctgc ttcctttggt 420 ataagcaaga acctggaaaa catcctacat tcgttattga cattcgttga aatatggaaa 480 gaaagcagag ccaaagattt atagttttac tgaataagaa atccaaacat ttctccctgc 540 acaacacaga caatcagcct caagactaag ccatgtactt ctgtgctgaa agtgcacagt 600 gttccatggc tctagtagcc tgtcctcaaa cctgccgtga ggcctggatc cccatctaca 660 tcctgcattg caggccttcc agtgcaacat ttgtcagggg ttagttttaa gagccatctc 720 tactgtagac ataaaaacac aaaattagaa tgttagcttc aactcactcc actccattta 780 ggacaattct ctccatcctt cttttttttt aaattagttt taaaattgaa atataatttt 840 aatactttcc ttcttgtagc acatagaggt tatgagagaa cagaactcat tatgctgcaa 900 agaagaaaag actgtagctg actcagcccc atatgggaca tctgtatccc acaccctcct 960 ccctagccat tcagtgactc agaggtcatt gaagaagagg gcatggaaaa ctataagagc 1020 tgtagggggt ggatgacttc aaagaagcag tgttttctgg acatagaaga acagctgcac 1080 atgtgaattc agagaggttg acagtacaca taagtattgc aaaggatcaa gccagaaaaa 1140 ttccatcaca gagaaggaag gtggacattc ccaccctttt tctttaaagt tgaagctcat 1200 ggtacaaaga ctaccctcca atgaaggcca cacatccaag agtatatgtg cactgcgacc 1260 tataacacaa aacttgatga gttttatttt aaatggaaga atgggacata caaactgggt 1320 ttgtatgaaa cactgaatct ttcaaagact ggaaagaaca gatgagtata accaaaattc 1380 attgcataat attttgtaaa agctaagaaa aatttaaaag tatataaatt atatcagagg 1440 tctaattgtg tgtgtatatt cttttatgtt cattcagcaa gctaaatacc agaggataca 1500 catagttcag taacacaagt gatttcaggc atccactgga gacttgagac ctgactcctt 1560 tgggtgaggt tccaagttta tttatctgat gctgtgcaga catctgtggt gcaggttgaa 1620 gggaaaccag cagagggcgc tgccccttca gatgtggtta acatctcatt ctggggggtg 1680 acttaacatg agagactctg tgcagacaga ggtccttgtc tgtgagtgag gagtgtgagg 1740 agatcctgca ggaggattgc cctgtgagaa tggtgcactc agggaccaag tgtcatttct 1800 tccatgaaca tgcatcctgt cacctgctca gttcttgtgc tcctcctaat gctcagtaag 1860 tcacattgta ctctagggtt aatgaattca ctagtgattc atagagaaca tggctaggag 1920 ttttcaaaat aatttttctc cagctaaata attgcaactt ttataatgaa aaaagccttt 1980 gctattagat attttccttt ctttcttaat tttctattta tttatttatt tatttattta 2040 tttatttatt tatttatcta tctatctatt taatgtcttt tgagacaggg tttctctgta 2100 tagccctggc tgtcctggaa ctcactctgt agaccaggct ggccttgaac tcagagatcc 2160 tcctgcctct gacctcctga gtgttgggat caaaggcgtg caccatcatc tcctgtggat 2220 agatgctttc ttatgatgta cccactgtta tgggctttct tgtaatgagc agctgtcatt 2280 gttaccactg tttctgacac tcattgttga tcttgaaaac tccctgttac tctaagtttt 2340 cctggaccac atggaagcat ggcatttttt aaaattaatt tttaaacaat tcaacgtggg 2400 aataatctat ctacagcatt tccacgctcc ctttccccct gctaatcttt cctgtgtctc 2460 gtaggtgctg caggacaggg tgtggagcag cctgccaaat tgatgtctgt ggagggaacc 2520 tttgctcggg tcaactgcac atacagcacc tcagggttca acgggttatc ctggtaccag 2580 caacgtgaag gccaagcccc tgtatttctt tcttatgttg ttttggatgg tttgaaggac 2640 agtgggcatt tctccacttt cctgagccgc tcgaatgggt acagttacct gcttctgaca 2700 gagctccaga tcaaagactc tgcctcatac ctctgtgctg tgagggatag caactatcag 2760 ttgatctggg gctctgggac caagctaatt ataaagccag gtaagtcttc gatatatgac 2820 agtaagaaag aaggcactgg ctgaataatg catgaagtgt agcatgcaaa ttgtattttg 2880 aagaacaatc cggcctgctg gagacaatgc actcagccga tggggtcttc gctcccagag 2940 aaaggcgatg tcagccacca actctcttgt ttaatatagc tgcttccaga atgaataatg 3000 cttgactggc cttctaaaat agcagagcca agtggtgtgg ggatgtctaa ttccctctgg 3060 tatgtttaga attggccgcc accgggctgc aggaattcga tgggggatcc ggatccagct 3120 gggagtcggc attgccaagg ccaccctggt tggctcctgt gatcagttaa ggactgtggg 3180 agacccacgg gggaaggagc tttggatcac agccctgctg gaaactctct aggtggtccg 3240 ctgtgttaat ccctccagcc ggcctcctca gaccgtggag ggcgtgggga aatagtctga 3300 gagagtcaca ttaaaaacaa aatcccttgg agaaaggaaa gaattgtcct caggtagcac 3360 ccgctttcct ggaataaaga gacagtgtga ttggtttgct aagtggtatg ttttcatggt 3420 gaaagccagg cacgtttgtt cagtgcccgg tgtgtggttt actcggttat ttttatttga 3480 agaaatagtc atttctcaga acagcctggt gtccctctta caggtgaaaa ttctgcgact 3540 tcagctgcct gttgatttaa tccaggccga ccagagtaaa ttgtagagac agggctctgg 3600 tgtgagtgct attcaaaaca tttatcaacg agagaggaaa aatggcccgg tagtgtgaga 3660 gactttccaa cttaatgtta aaatatcaca cgccttcgtt tctcaccaac gtccagccta 3720 cctgggggag agtactctag agaagacatc taagtctctg ttttctaagc ttgtttttgt 3780 cctgccaaaa caaaattgtt tgactggacc cactggggtt ctgaagatcc tgttaagtag 3840 aaaaatgaca agatggttta gtggttccac cttcctttct ggttttccca gatgccagaa 3900 aggaccccgt ggagagggac tactgaaagc tagagatctt ggctggcact catgacttgt 3960 gcctgtccct aagcctgtgt ccatcatggg cagctagatc ctaggctgtc atttccaatg 4020 tgaagtctgt gaacaagact ggctagtcca gagagttccg ctcttgcctg tcactggcat 4080 ctgagttctg acctaagtta ggacccccaa aaaatcttct aacatcagtc ctcttggccc 4140 acagacatcc agaacccaga acctgctgtg taccagttaa aagatcctcg gtctcaggac 4200 agcaccctct gcctgttcac cgactttgac tcccaaatca atgtgccgaa aaccatggaa 4260 tctggaacgt tcatcactga caaaactgtg ctggacatga aagctatgga ttccaagagc 4320 aatggggcca ttgcctggag caaccagaca agcttcacct gccaagatat cttcaaagag 4380 accaacgcca cctaccccag ttcaggtgag tggtgcccca gaagtctcct cctggctcaa 4440 atctatggtt tccaaaagct gctttgggtc atctcaccct catcattagg cagcaaaatc 4500 cacatcctgt gtcactaagg agtctaacgg gtcaccaaag cagacaagag aacatgacag 4560 aggacattgg cccagcattg gtctcacaat tctgaggctc accttcctgt cttctcttga 4620 gccaagtgcc ttctctgttc tcccaggcac agtttccatt cccttcctgc ccatcccacc 4680 cccacccacc cccagccgcc tgccctgact tctatgtctg ccaagtagtg tgagtacaga 4740 agtcagatga ggaggaggga gtgccactct aatccgggag gaccatccgt cagcagaggg 4800 acatgtaaat gacaccaggc tgcaattaat atatgcaata actcagagtt aaggcaagaa 4860 cagctcagag aaaggctcag agaaaatgct atcacactac aagttaatag ataagaaggg 4920 accagccctg cctggggcca gagaggagcc tgtcagaagc taagaaagga gaatccgaga 4980 ataaggagaa gctgcaggaa atggattgta agccatagac aggggggtca gatcacaggt 5040 agaggcaaga gaagcagacg ttcaaagtca tcatcaccta cacagaaagt tcaaggccag 5100 cctggactac ccgagaccct gtctcccaaa acaactaaat aaacataagg ttgagtggtg 5160 tgtagaaggc agactgtaga tccagcagaa gacagagaac atagagagat gaaggaagcc 5220 ccaccaggtg atggcgggac tccagcggcc aacagcactt aggtttcaca gatagaacca 5280 cacagagatt ggtcagtggg catcaaggga agtggcagag catctcggtc gatgggacct 5340 tatactaagc aagagataat aaaggagcaa atttgggtat caacactatt gtggggaggt 5400 gtacatgaaa atacatggcc ctggtcactg tgaatatgtc ttgctgtctt tacgggactc 5460 tagactgaaa cctccaggtc ttgacttttt ggcccacgtc atacagcacg tactttgcac 5520 agcccgtagt tgttgaaaga ataaaagagt gcccataagc cagggtgttg ggcctttgct 5580 ccagcagata cccttggtaa tcatggcccc cagctctctc ccagaggatc acagaaaagc 5640 tgtgatatgt tttcctgacc aacaacctgt ggtgggacag ttaacacgct tcagaatcta 5700 aggaaatgtc tttgttttcc cttttagacg ttccctgtga tgccacgttg actgagaaaa 5760 gctttgaaac aggtaagaga agggtctgac caacactgag tgatgctggg gggtggggag 5820 gggccagtaa tgacctttag tgcacagggg aggggagggg gtggatctgg aggtgggaac 5880 agcatttcca gtcctgccca agcttcgcag ggtctgtctt gaatccccag cacggttaac 5940 gtcattttcc attctaagta cttaacaagc ggtgcctcca gtttcacaag gccagtgagt 6000 cactctcggg ccttggtgtc tcttgtattg gctcctctgt gagaatagcc aaagaaaacc 6060 acttcatatg ccactgtgga acttgtgagt cccttcagag gcagccttga actaaccttg 6120 tcactctatg gacactggcc ctctctgtat ctcaggggaa ttcctttcta gaaaggaagt 6180 agaactcaca tagcctcagg caaaggtctt gtctcaacgc cacctcgatt ccacgtgact 6240 agttactgag tcatcacatc tgtggtttca ctgagaggcc caggtctaga ccattatgac 6300 aagttctgaa catctaccac caccaccccc acccgcacca ccacccctct ctgtacaggg 6360 cctcagaata ttatatgact aagtcctttt ggtggttttt gtcttaaaac acaatgctct 6420 taccctggag ggatatacaa atacctttgc cttggggtgt 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aggaattcga tgggggatcc ggatccagct 3120 gggagtcggc attgccaagg ccaccctggt tggctcctgt gatcagttaa ggactgtggg 3180 agacccacgg gggaaggagc tttggatcac agccctgctg gaaactctct aggtggtccg 3240 ctgtgttaat ccctccagcc ggcctcctca gaccgtggag ggcgtgggga aatagtctga 3300 gagagtcaca ttaaaaacaa aatcccttgg agaaaggaaa gaattgtcct caggtagcac 3360 ccgctttcct ggaataaaga gacagtgtga ttggtttgct aagtggtatg ttttcatggt 3420 gaaagccagg cacgtttgtt cagtgcccgg tgtgtggttt actcggttat ttttatttga 3480 agaaatagtc atttctcaga acagcctggt gtccctctta caggtgaaaa ttctgcgact 3540 tcagctgcct gttgatttaa tccaggccga ccagagtaaa ttgtagagac agggctctgg 3600 tgtgagtgct attcaaaaca tttatcaacg agagaggaaa aatggcccgg tagtgtgaga 3660 gactttccaa cttaatgtta aaatatcaca cgccttcgtt tctcaccaac gtccagccta 3720 cctgggggag agtactctag agaagacatc taagtctctg ttttctaagc ttgtttttgt 3780 cctgccaaaa caaaattgtt tgactggacc cactggggtt ctgaagatcc tgttaagtag 3840 aaaaatgaca agatggttta gtggttccac cttcctttct ggttttccca gatgccagaa 3900 aggaccccgt ggagagggac tactgaaagc tagagatctt ggctggcact catgacttgt 3960 gcctgtccct aagcctgtgt ccatcatggg cagctagatc ctaggctgtc atttccaatg 4020 tgaagtctgt gaacaagact ggctagtcca gagagttccg ctcttgcctg tcactggcat 4080 ctgagttctg acctaagtta ggacccccaa aaaatcttct aacatcagtc ctcttggccc 4140 acagacatcc agaacccaga acctgctgtg taccagttaa aagatcctcg gtctcaggac 4200 agcaccctct gcctgttcac cgactttgac tcccaaatca atgtgccgaa aaccatggaa 4260 tctggaacgt tcatcactga caaaactgtg ctggacatga aagctatgga ttccaagagc 4320 aatggggcca ttgcctggag caaccagaca agcttcacct gccaagatat cttcaaagag 4380 accaacgcca cctaccccag ttcaggtgag tggtgcccca gaagtctcct cctggctcaa 4440 atctatggtt tccaaaagct gctttgggtc atctcaccct catcattagg cagcaaaatc 4500 cacatcctgt gtcactaagg agtctaacgg gtcaccaaag cagacaagag aacatgacag 4560 aggacattgg cccagcattg gtctcacaat tctgaggctc accttcctgt cttctcttga 4620 gccaagtgcc ttctctgttc tcccaggcac agtttccatt cccttcctgc ccatcccacc 4680 cccacccacc cccagccgcc tgccctgact tctatgtctg ccaagtagtg tgagtacaga 4740 agtcagatga ggaggaggga gtgccactct aatccgggag gaccatccgt cagcagaggg 4800 acatgtaaat gacaccaggc tgcaattaat atatgcaata actcagagtt aaggcaagaa 4860 cagctcagag aaaggctcag agaaaatgct atcacactac aagttaatag ataagaaggg 4920 accagccctg cctggggcca gagaggagcc tgtcagaagc taagaaagga gaatccgaga 4980 ataaggagaa gctgcaggaa atggattgta agccatagac aggggggtca gatcacaggt 5040 agaggcaaga gaagcagacg ttcaaagtca tcatcaccta cacagaaagt tcaaggccag 5100 cctggactac ccgagaccct gtctcccaaa acaactaaat aaacataagg ttgagtggtg 5160 tgtagaaggc agactgtaga tccagcagaa gacagagaac atagagagat gaaggaagcc 5220 ccaccaggtg atggcgggac tccagcggcc aacagcactt aggtttcaca gatagaacca 5280 cacagagatt ggtcagtggg catcaaggga agtggcagag catctcggtc gatgggacct 5340 tatactaagc aagagataat aaaggagcaa atttgggtat caacactatt gtggggaggt 5400 gtacatgaaa atacatggcc ctggtcactg tgaatatgtc ttgctgtctt tacgggactc 5460 tagactgaaa cctccaggtc ttgacttttt ggcccacgtc atacagcacg tactttgcac 5520 agcccgtagt tgttgaaaga ataaaagagt gcccataagc cagggtgttg ggcctttgct 5580 ccagcagata cccttggtaa tcatggcccc cagctctctc ccagaggatc acagaaaagc 5640 tgtgatatgt tttcctgacc aacaacctgt ggtgggacag ttaacacgct tcagaatcta 5700 aggaaatgtc tttgttttcc cttttagacg ttccctgtga tgccacgttg actgagaaaa 5760 gctttgaaac aggtaagaga agggtctgac caacactgag tgatgctggg gggtggggag 5820 gggccagtaa tgacctttag tgcacagggg aggggagggg gtggatctgg aggtgggaac 5880 agcatttcca gtcctgccca agcttcgcag ggtctgtctt gaatccccag cacggttaac 5940 gtcattttcc attctaagta cttaacaagc ggtgcctcca gtttcacaag gccagtgagt 6000 cactctcggg ccttggtgtc tcttgtattg gctcctctgt gagaatagcc aaagaaaacc 6060 acttcatatg ccactgtgga acttgtgagt cccttcagag gcagccttga actaaccttg 6120 tcactctatg gacactggcc ctctctgtat ctcaggggaa ttcctttcta gaaaggaagt 6180 agaactcaca tagcctcagg caaaggtctt gtctcaacgc cacctcgatt ccacgtgact 6240 agttactgag tcatcacatc tgtggtttca ctgagaggcc caggtctaga ccattatgac 6300 aagttctgaa catctaccac caccacccc ac acggcacca ccacccctct ctgtacaggg 6360 cctcagaata ttatatgact aagtcctttt ggtggttttt gtcttaaaac acaatgctct 6420 taccctggag ggatatacaa atacctttgc cttggggtgt gtgcagaagc tcaaagaagc 6480 aacctgggag ttgaagttac ccacacccaa gcatgcctaa ccagctcttg ggaaagtcca 6540 cagtgtcttg agttgctgta ccgccctctc atgcacatac cgttaatggc taccacctct 6600 tggttttaca gatatgaacc taaactttca aaacctgtca gttatgggac tccgaatcct 6660 cctgctgaaa gtagccggat ttaacctgct catgacgctg aggctgtggt ccagttgagg 6720 taagaaggca tgaaagcctg gagaagactt agaggtgtgg attcagggca agacccaacc 6780 ctgagcgcaa atcgccctgg gatttaaaat ttgcttttaa gtcctaagac tggacccaca 6840 gaacttttct accccctacc cgttacaagt tgtaacactg ttgcaacagt gccctgaaac 6900 acctgggctg cagaacacaa tcctttcagc gaccttgatc cagcagcgac tctcctaaga 6960 tactcaggtc atgctcattt agaaatgatg gaagtgaggc caagtcacat caaggctcac 7020 acagccaaag aacagaggag gagaaaactc cggaccctga tgcacacgta ccacgtgtct 7080 ctggccctgc cttctggagt gtacactccc ttcctgtgtg ccttctccct agcaagctct 7140 ctctgcttga tattcaatga tgctatactc attagccctc cacctggcta gagtcatcat 7200 gcttccgtgg tcaccttgca cagcccctaa gaaattcatc ctcatcacac ccctgagggt 7260 cctagtcctc catgccaagc ctgacctctg tacttcctca ctccaggtct gcaagactga 7320 cagagcctga ctcccaagct ccatcctcct cacccctccg ctccttcttc aagccaaaag 7380 gagccctccc acctcgtcaa gacggctgtc tggggtctgg ttggccctga ttcacaatcc 7440 cacctggatc tcccagattt gtgaggaagg ttgctggaga gctaagcact gctgccgcac 7500 ccactcagct ccctcactgc tgctgaccat tcacaaaaaa cggcaggggc ggggcttctc 7560 ctggatctga agacccctcc cccatggcag actcccctgt aaaatctctt ggagaatgtt 7620 gtaaaaaaaa tatcggttgt tttttgtttt tttttttttt gcgggtttat ttttttaagc 7680 atccatgaag aaatgcatat tactctttca tcaaggtgta gaaattatct cattgtctag 7740 accctcctgc tactgtgtgt attgagccac attgtatatt attctgctgt ccatgacatc 7800 attaaaggtg attcagaaaa accaaaactg tgatcttatt tgactgtgtt tgggtggggg 7860 catttacatg cagagagaaa ccgaagtacg tgcctatcac acctgcccag ttacctcaac 7920 aaaccctctc cattcaacct cttggaatga cctcttaaaa attccactaa gtggccgggc 7980 gagtgatggg cgcacacctt taatcccagc acttgagagg cagaggcagg tggatttctg 8040 agttcgaggc cagcctggtc tacagaatga gttccaggtc agccagggct acacagagaa 8100 accctgtctt ggggggggtg tggggggatt ccactaagca agctgtacca agggccagga 8160 agctcctttt acaggggaga gtccccgctc atgccgcacc cattaagagg ctgaccgcag 8220 ggggctgatg ggcaggctct gacctgtagc tgaactttac cagtcaagga tgaggaatgt 8280 cctccaggtt ctcacccact ggctcctgcc tccagggaca cccttgctct cccatcagac 8340 tgccttgcta ctgaacctgt gttctgcctt acaaatctac tgtctgggac ttggccaagg 8400 acagcaggca ttctcagctc ttcctagcca tgagagtctc tgccttcaca gcccactgtt 8460 cttggcagag agggagcctc tcctatcagt ctcctttccc caagggcagg cagggattct 8520 gatggaaaca cacttcagag accaactgct cacaccaaac gggagtactt actagttccc 8580 aggactcccc cacccccacc cactgccacc acccagcttt tccctggttc aactgtgtgt 8640 ctatgaccac actagccaga aatatgctaa tcctcccagc tgtgactccc aggcctgctt 8700 cttctcatag agatggggct gaccagcttt cgagtgtgat cgagggcatg tccctccctc 8760 ctgtgagctt cagggtcacc agccatgaaa tgtcagtttc gactggagac tacagcaaaa 8820 acccatgttc cctctcccgg ccacccctga ttagagtgac cgcagaaccc cgtcatttct 8880 aaactgcctc atctctagcc cacaatgaag ccttctgaga ccagtgacgg ggacggcctc 8940 aggaaacacc accatgacag ggccaccctc acacacacac aggggaggag gggcgaagag 9000 cctcaatccc acgcccctcc tcgagtgtct gacacgatgc caaagactac cactggggat 9060 ttcttttaat taaaccattc tcttccctgt attagatgaa agtgcccatg ggaaggttag 9120 tgcagcaagc ctttatcaac cattaagaac ttagggcaaa ttagtttgtc tttttttttt 9180 tttccttgct cctaaagtgg taattcactt tgttctatta aaaaaaaaaa aaaaaaatcc 9240 aggcaaagaa agcgtgggtg gctgaggaga tgccgggctc ctaaaaactg gctgccataa 9300 tgcagaggct gaagggggac cttgtgggaa tggaacagag taagaagcct agaaggcagt 9360 ataggaatca aagacagacc tcctcactaa acgtgaaaga ggcccagcct cggttgaacc 9420 atgctagccc agtgtcccca gagagcaaca tccagaggtc acaagaaccc taacgtcacc 9480 tgaggaccag agtgaggtga cgtggcaggg atttgaaggg cctcccacag cggtgaagtg 9540 aatatagata cgttccagcc ccaactcaag cgaggccggg acaaggcaga caggaggcca 9600 ctgatagatc aaagtcaact tcatcgccat ccaatcagaa caagaacttt ctcccacagc 9660 tgaggctaaa tctccacagg agctgaacaa gtgtggggggaa caggcagaga ctcttcgacg 9720 tcggactctg ggtctctcac tgcttagtct ggaagaggct actgaggaaa cctgaagaca 9780 tgacaatggt cacaaggctg ccactgctcc cagaccagtc tggaccaact cccgaagaga 9840 aggcacccat agcccagcaa actccttgcc agggccagct gtaaaatggg tatctctaga 9900 gtctagataa atgcccttac tccctaaggg gttttctgca ggccagctct gaaggcagaa 9960 aaaaaaacgg acccttcacg ttccaaggct agaactgtgg aaagtgttct gcaacgttgt 10020 ccggtgcagc tggagtcaca gttcagtcca gaaacaggca ggctggacag gtgtgtgctc 10080 tgaccactca ggccaccccc tgaggcttca agggtttagt tttgtctcat ttttgtttgg 10140 ggtataccat aaaatccaac tcccaaagct catgtctaat atcaaatcta atagtgtttt 10200 attaccaggt gacatgttgg caagggacta tagatgaccc ttcggatagg aggaatacct 10260 tgctcaccag tagctcctcc atacctagtg cagtaccttg cacccaacag ataccaacag 10320 atgacatcat gacggtcaac acagtcactg ggagggacct gagctggaga gggaacgtag 10380 tggcgttaac agaggccagg tgagccactg tctcggtttt gcaaggaata gagtagcttg 10440 gcaaaaacta ttagaataat cagagcttga gtggtgcgcc cttgaagagt tcagactcac 10500 attagcttca tgactgttga ctgaatcctg caggacagtt accaggaaac actggcttct 10560 aaaagtctaa agactctggt cctacatgag aaccagcatc cagggccaaa ggtcacttaa 10620 tgtccatttc agtttcccca gtgacccaca caaacccact gaaacctagt tcctcgagca 10680 acatgtggga agaagggctt ccggtttaca aagcaggaag tctatatcca gcccaccccg 10740 ccctggacaa gattgaagtc tgggtccccg agggatattt cccagaggtg agtgtgagag 10800 acctgtcaaa tactgtaact cttgcatgta ctggctacgg gtgggggtgg ggtggggtgg 10860 ggggcagtct gaaggatcgc cagccctgct ttgggtaaaa gccacatggg taacacagct 10920 gtctcctttc atacagacac acaaggcata ggatttcctc caagaatcac acagacagct 10980 gcaccctgaa atgggtaagc tggtcagata gtgaatcaat agccagaagt agaacaggaa 11040 atggaaaaag tttcccactt ccctccaggt gtttgggtct gaacagcctc ccacttccat 11100 gacgtcacgg ctgctgacat gggcaaacag gtcccccttt gaagctctcc cgcagaagcc 11160 acatcctctg gaaagaggag ttaaaaatac agagttagag ataagatctc tccgggccac 11220 gtgcccagaa gaggtaggct gggccgttac accgcagccc aaccacaggt gcagaaaaga 11280 aggccacgga gagcacattg ggtggggctt gcaggtcttg gtggtaacac ccattcacag 11340 cagccggctg gggaggcact gcggctccac tcccaagaag tccccctccc ctgacctcta 11400 ttgccctcaa attagacaag tctatatact tagttcaagg gagaaagtct atgtccagtc 11460 cagcttgtgc tggacaggtt gtgaaagagg cagctgccta cacacacagc taaggctcgt 11520 tccccaacag ataccttcca caagaagccc cattcgctct catttccact ccaggaggaa 11580 atttaagtgt caagagataa ccctagtgga catctgtctc tcagggtcct aggaagtcgc 11640 agaacctgaa acctgaaaaa ctttcgtctt gggagtccca ctctgttgta gtgtcttaag 11700 gtagccacac gggggcagca gtactccacc aaaaggcttt ctccctcggc gtgtttattc 11760 gggataaaga aaatccctgc atcctacgga aaaactcttt ccaaaggaaa ataaaatgac 11820 aagtggcttc tgtttcacag ggtcctgccc tgtgccagtc actggactcc agacttgtgt 11880 gatcctctct gcctgcaaag agtctagggt caggccttca ggcagcaggg gcactgccta 11940 cccaggttta ggagacctag ctacaagaga aacccagaaa gaaactaccc tgttggaagc 12000 caggagatgg aatatggccc gcaggcccag gatcc 12035 <210> 9 <211> 364 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 ggacagggcg tggagcagcc tgacaacttg atgtctgtag agggaacctt tgctcgggtc 60 aactgcacat acagcacctc agggttcaat gggttatcct ggtaccagca acgtgaagcc 120 acgcccccgt atttctttct tatgttgttt tggatggttt gaaggacagt gggcatttct 180 ccacattcct gagccgctcg aatgggtaca gttacctgct tctgacagag ctccagatca 240 aagactctgc ctcatacctc tgtgctgtga gggatagcaa ctatcagttg atctggggct 300 ctgggaccaa gctaattata aagccagaca tccagaaccc agaacctgct gtgtaccaga 360 atcg 364 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic <400> 10 catagagaac atggctagga gt 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic <400> 11 acatcaattt ggcaggctgc 20 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic <400> 12 ccatgaacat gcatcctgtc acct 24 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic <400> 13 cttggtccca gagcccc 17 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic <400> 14 catccagaac ccagaacctg c 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic <400> 15 tggcgttggt ctctttgaag 20
【図１】Ｖα１９ＮＫＴ細胞由来融合細胞細胞株のＶα
１９．１−Ｊα２６遺伝子再構成部位の塩基配列を示す
図である。Ｖα１９．１遺伝子の３’端及びＪα２６遺
伝子の５’端の配列を対照として示す。生殖細胞遺伝子
と同様の配列は−で示す。FIG. 1 Vα of Vα19NKT cell-derived fused cell line
It is a figure which shows the base sequence of 19.1-J (alpha) 26 gene rearrangement site | part. The sequences at the 3'end of the Vα19.1 gene and the 5'end of the Jα26 gene are shown as controls. Sequences similar to germline genes are indicated by-.
【図２】Ｖα１９ＮＫＴ細胞由来融合細胞細胞株のＴＣ
Ｒへの刺激に伴うサイトカイン分泌量を示す図である。
ＮＢシリーズはＶα１９ＮＫＴ細胞融合細胞株、ＲＴシ
リーズはＶα１４ＮＫＴ細胞融合細胞株を示す。FIG. 2 TC of Vα19NKT cell-derived fused cell line
It is a figure which shows the cytokine secretion amount accompanying the stimulation to R.
The NB series indicates the Vα19NKT cell fusion cell line, and the RT series indicates the Vα14NKT cell fusion cell line.
【図３】Ｖα１９．１−Ｊα２６を含むＴ細胞レセプタ
ーα鎖をコードする導入ＤＮＡの構造を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing the structure of introduced DNA encoding a T cell receptor α chain containing Vα19.1-Jα26.
【図４】Ｖα１９トランスジェニックマウスのゲノムＤ
ＮＡのサザンブロット解析結果を示す電気泳動写真であ
る。FIG. 4 Genome D of Vα19 transgenic mice
It is an electrophoresis photograph which shows the Southern blot analysis result of NA.
【図５】Ｖα１９トランスジェニックマウスおよび野生
型マウスにおけるＲＴ−ＰＣＲの結果を示す電気泳動写
真である。FIG. 5 is an electrophoretic photograph showing the results of RT-PCR in Vα19 transgenic mice and wild-type mice.
【図６】Ｖα１９トランスジェニックマウスおよび野生
型マウスの各臓器におけるＮＫＴ細胞の数を示すＦＡＣ
Ｓの図である。FIG. 6 FAC showing the number of NKT cells in each organ of Vα19 transgenic mice and wild-type mice.
It is a figure of S.
【図７】Ｖα１９トランスジェニックマウス、野生型マ
ウス、およびＣＤ１ｄノックアウトマウスのＮＫＴ細胞
の表現型を示すＦＡＣＳの図である。FIG. 7 is a FACS diagram showing the phenotype of NKT cells of Vα19 transgenic mice, wild-type mice, and CD1d knockout mice.
【図８】Ｖα１９トランスジェニックマウスおよび野生
型マウスのＮＫＴ細胞のサイトカイン産生量を示すグラ
フである。FIG. 8 is a graph showing the cytokine production of NKT cells of Vα19 transgenic mice and wild type mice.
【図９】Ｖα１９トランスジェニックマウスおよび野生
型マウスのＩｇＥ産生量、および該マウスに抗ＩｇＤ抗
体刺激を与えた後のＩｇＥ量の変化を示すグラフであ
る。FIG. 9 is a graph showing the amount of IgE production in Vα19 transgenic mice and wild-type mice, and the change in the amount of IgE after stimulating the mice with anti-IgD antibody.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｙ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ｂ Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 CA18 CA25 CB17 DA37 FB03 4B024 AA01 AA11 BA21 BA63 CA04 DA02 EA04 GA03 GA11 HA01 4B063 QA05 QA18 QQ08 QQ70 QQ79 QQ91 QR69 QR77 QS24 4B065 AA92X AA92Y AB01 AB05 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA17 ZB022 ZB072 ZB132 4H045 AA11 BA10 CA40 DA75 EA22 EA50 FA72 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) C07K 16/28 C12Q 1/02 4H045 C12N 5/10 G01N 33/15 Z C12Q 1/02 33/50 Z G01N 33/15 33/53 Y 33/50 C12N 15/00 ZNAA 33/53 5/00 BF term (reference) 2G045 AA29 AA40 CA18 CA25 CB17 DA37 FB03 4B024 AA01 AA11 BA21 BA63 CA04 DA02 EA04 GA03 GA11 HA01 4B063 QA05 QA18 QQ08 QQ70 QQ79 QQ91 QR69 QR77 QS24 4B065 AA92X AA92Y AB01 AB05 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA17 ZB022 ZB072 ZB132 4H045 AA11 BA10 CA40 DA75 EA22 EA50 FA72
Claims (16)
るＮＫＴ細胞。 （ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＴ細胞レセ
プターを有し、かつＴ細胞レセプターを介した刺激に応
答してＴｈ２タイプのサイトカインを産生する。 （ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列からなるＴ細胞レセプターを有し、かつＴ細胞
レセプターを介した刺激に応答してＴｈ２タイプのサイ
トカインを産生する。1. An NKT cell having the following properties (a) or (b): (A) It has a T cell receptor containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and produces a Th2 type cytokine in response to stimulation via the T cell receptor. (B) having a T cell receptor consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and Th2 in response to stimulation via the T cell receptor Produces types of cytokines.
認識する抗体。2. An antibody that specifically recognizes the NKT cell according to claim 1.
酸番号１１０〜１１６で表されるアミノ酸配列を含むポ
リペプチドである請求項２に記載の抗体。3. The antibody according to claim 2, wherein the antigen is a polypeptide containing at least an amino acid sequence represented by amino acid numbers 110 to 116 of SEQ ID NO: 1.
分として含有する免疫調節剤。4. An immunomodulator containing the antibody according to claim 2 or 3 as an active ingredient.
たは３に記載の抗体を接触させ、該抗体への結合度を指
標として細胞を選抜することを特徴とするＮＫＴ細胞の
取得方法。5. A method for obtaining NKT cells, which comprises contacting the cell group of blood or bone marrow fluid with the antibody of claim 2 or 3 and selecting cells by using the degree of binding to the antibody as an index.
記載の抗体を接触させ、該抗体への結合する細胞数を測
定することを特徴とする血液中のＮＫＴ細胞の測定方
法。6. A method for measuring NKT cells in blood, which comprises contacting a cell group in blood with the antibody according to claim 2 or 3 and measuring the number of cells bound to the antibody.
体を含む、請求項６に記載の方法に用いるための試薬キ
ット。7. A reagent kit for use in the method according to claim 6, comprising at least the antibody according to claim 2 or 3.
とを共培養し、該ＮＫＴ細胞の表現型の変化を指標とし
て被検物質を選抜することを特徴とする免疫調節活性を
有する物質のスクリーニング方法。8. An immunomodulatory activity characterized by co-culturing a test substance with the NKT cell according to claim 1, and selecting the test substance by using a phenotypic change of the NKT cell as an index. Method of screening substances.
ることを特徴とする請求項８に記載の方法。9. The method according to claim 8, wherein the test substance is presented to antigen-presenting cells.
胞とを、請求項２または３に記載の抗体の存在下で共培
養し、被検物質による該ＮＫＴ細胞と該抗体との結合性
の阻害度を指標として被検物質を選抜することを特徴と
する免疫調節活性を有する物質のスクリーニング方法。10. A test substance and the NKT cell according to claim 1 are co-cultured in the presence of the antibody according to claim 2 or 3, and the test substance binds to the NKT cell and the antibody. A method for screening a substance having an immunomodulatory activity, which comprises selecting a test substance using the degree of sex inhibition as an index.
クリーニング方法により得られる物質を有効成分とする
免疫調節剤。11. An immunomodulator comprising a substance obtained by the screening method according to claim 8 as an active ingredient.
クリーニング方法により選抜された物質を製剤化するこ
とを特徴とする免疫調節剤の製剤化方法。12. A method for formulating an immunomodulator, which comprises formulating a substance selected by the screening method according to any one of claims 8 to 10.
セプターα鎖をコードするＤＮＡがＴ細胞特異的に発現
するように導入されていることを特徴とする非ヒト哺乳
動物。 （ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＴ細胞レセ
プターα鎖。 （ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列からなるＴ細胞レセプターα鎖であって、ＮＫ
Ｔ細胞に発現させたとき、該ＮＫＴ細胞がＴ細胞レセプ
ターを介した刺激に応答してＴｈ２タイプのサイトカイ
ンを産生するもの。13. A non-human mammal, wherein the following DNA (a) or (b) encoding a T cell receptor α chain is introduced so as to be expressed in a T cell-specific manner. (A) A T cell receptor α chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. (B) a T cell receptor α chain consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, wherein NK
When expressed in T cells, the NKT cells produce Th2-type cytokines in response to stimulation via T cell receptors.
有することを特徴とする請求項１３に記載の動物。14. The animal according to claim 13, wherein the DNA has the base sequence shown in SEQ ID NO: 8.
被検物質を投与し、該動物体内のイムノグロブリンＥの
発現量の変化を解析し、該発現量を調節する作用を指標
として被検物質を選抜することを特徴とする抗アレルギ
ー作用を有する物質のスクリーニング方法。15. A test substance is administered to the animal according to claim 13 or 14, changes in the expression level of immunoglobulin E in the animal body are analyzed, and a test is performed by using the action of regulating the expression level as an index. A method for screening a substance having an anti-allergic effect, which comprises selecting a substance.
に記載のＮＫＴ細胞である非ヒト哺乳動物。16. All of the NKT cells possessed by claim 1.
A non-human mammal which is the NKT cell according to 1.
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-
2002
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| WO2005079813A1 (en) * | 2004-02-19 | 2005-09-01 | Kibun Food Chemifa Co., Ltd. | Composition for nkt cell activation |
| WO2015172147A1 (en) | 2014-05-09 | 2015-11-12 | Research Foundation Of The City University Of New York | Tcr(alpha)-lcr-derived gene regulatory cassettes |
| EP3140407A4 (en) * | 2014-05-09 | 2017-11-08 | Research Foundation Of The City University Of New York | Tcr(alpha)-lcr-derived gene regulatory cassettes |
| US10053708B2 (en) | 2014-05-09 | 2018-08-21 | Research Foundation Of The City University Of New York | TCR(alpha)-LCR-derived gene regulatory cassettes |
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