JPH11501801A - 耐熱性が向上し、かつ、プライマーエクステンションの長さと効率が向上したｄｎａポリメラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸残基、または、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２７９アミノ酸残基を除いて、実質的にＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓまたはＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼと同じアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼと、上記ＤＮＡポリメラーゼをコード化する組換えＤＮＡ配列と、上記ＤＮＡ配列からなるベクターとこのようなベクターを含む宿主細胞。また、少なくとも１つの耐熱性又はその他の上記型のＤＮＡポリメラーゼであって３’−エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼからなる主成分と、３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈する少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼからなる少量成分とからなる耐熱性またはその他のＤＮＡポリメラーゼの配合と、限定はされないが、特に、この配合がなされプライマーエクステンションを触媒するのに使用されるポリメラーゼ連鎖反応によって核酸配列を増幅する間にＤＮＡ鎖の酵素伸長を行うための改善された方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】耐熱性が向上し、かつ、プライマーエクステンションの長さと効率が向上したＤ ＮＡポリメラーゼ この発明は、ＤＮＡポリメラーゼに、より詳細には、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕ ａｔｉｃｕｓ 及びＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼの新規の突 然変異であって現在知られるあらゆる形のこれらの酵素よりも向上した耐熱性（ 熱安定性）を呈するものに関するものである。また、この発明は、このようなＤ ＮＡポリメラーゼをコード化する組換えＤＮＡ配列と、これら組換えＤＮＡ配列 の発現に適したベクタープラスミド及び宿主細胞とに関するものである。さらに 、この発明は、本願発明のＤＮＡポリメラーゼ及び他のＤＮＡポリメラーゼの新 規の配合（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に関するものである。この酵素配合は、非 常に長くかつ信頼性の高い生成物のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による増幅 に対して効果的に触媒作用を及ぼすことが出来る。 温泉細菌のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓから得られるＤＮＡポリメラ ーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）は、耐熱性であるため、ＤＮＡの増幅、ＤＮ Ａ配列決定及び関連するＤＮＡプライマーエクステンション技術において、かな り有用であることが立証されている。ここで、耐熱性であるとは、不可逆的に変 性せずに長時間９５℃に達する温度に耐えうる能力、及びＤＮＡを高温（６０〜 ７５℃）で重合（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅ）する能力を備えていることと定義する 。ローヤー（Ｌａｗｙｅｒ）氏他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７ （１９８９年）に記載された、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０４６３９の、ＤＮＡ 及びアミノ酸配列は、遺伝子コード化Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮ Ａポリメラーゼ及び酵素Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラー ゼを、本願でそれらの用語を使用しているように定義している。これと密接に関 連する細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓにより発現する、非常によく似たＤＮ Ａポリメラーゼ（ＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ）は、アクメチヤノフ（Ａｋｈｍｅ ｔｚｊａｎｏｖ，Ａ．Ａ．）氏及びヴァクヒトフ（Ｖａｋｈｉｔｏｖ，Ｖ．Ａ． ）氏、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：５８３９（ １９９２年）に記載された、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ６６１０５の、ＤＮＡ及 びアミノ酸配列により定義されている。これらの酵素も、耐熱性である、Ｔｈｅ ｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼをも含む１種のＤＮＡ ポリメラーゼ族を表している。これらの酵素には、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラ ーゼＩ、及びファージＴ７、Ｔ３、及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡポリ メラーゼにおける校正（ｅｄｉｔｔｉｎｇ）を行う目的に対して有効であるよう な３’−エキソヌクレアーゼ活性が欠けている。 ゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）氏他による米国特許第４８８９８１８号には 、野生型（ここではＷＴの略号を用いる）の自然のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔ ｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼが記載されている。ゲルファンド氏他による米国特 許第５０７９３５２号には、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメ ラーゼのＮ−末端２８９アミノ酸が消去されたＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃ ｕｓ ＤＮＡポリメラーゼの突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）をコード化する 組換えＤＮＡ配列（米国特許第５０７９３５２号のクレーム３、商品名Ｓｔｏｆ ｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、ここではＳＴの略号を用いる）と、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端３アミノ酸が消去されたＴ ｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼの突然変異タンパク質を コード化する組換えＤＮＡ配列（米国特許第５０７９３５２号のクレーム４、商 標名ＡｍｐｌｉＴａｑ、ここではＡＴの略号を用いる）とが記載されている。こ れらの突然変異タンパク質はＤＮＡポリメラーゼの検定において「十分に活性」 であることがゲルファンド氏他により報告されているが、その最大耐熱性に関す るデータは示されていない。 しかし、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼの他の酵素 活性の突然変異タンパク質誘導体の開発については、何らかの特殊な修飾がこの タンパク質の構造的及び機能的特性に対して及ぼす影響を予測できないため進ん でいない。発現を行うためにＤＮＡ及び酵素を修飾する場合には、折り畳みパタ ン（ｆｏｌｄｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎ）及び臨界結合（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｂｏ ｎｄｉｎｇ）の起こりうる***（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ） を含む多くの因子を考慮しなくてはならない。高温Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔ ｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端欠失突然変異タンパク質の発生に関する 重大な問題として、高温度範囲において新しいタンパク質のアミノ末端が著しく 不秩序となり、そのためにタンパク質の（１又は複数の）触媒領域との好ましく ない相互作用が生じて変性が起こるという予測がある。実際、ＤＮＡポリメラー ゼの識別可能領域が損なわれずに残っていると思われる幾つかの欠失体（ｄｅｌ ｅｔｉｏｎ）が構成されたが、これらの欠失体はいずれも９９℃もの高温度にお ける耐熱性を持たない。Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラー ゼは、他のＤＮＡポリメラーゼが呈するよりもずっと高い温度での顕著な耐熱性 を示すが、９５〜９７℃よりも高い温度にさらされると酵素活性を失う。更に、 その７２℃（ＤＮＡ合成を行うに好ましい温度）における忠実度（ｆｉｄｅｌｉ ｔｙ）は、約１／９０００ｂｐの有効エラー率に限定される。ゲルファンド氏他 のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼの突然変異タンパク 質ＳＴ（Ｎ−末端２８９ａ．ａ．欠失を有するもの）はＡＴよりもずっと安定で あるが、ＰＣＲサイクルの変性段階期間中に、９８℃にサイクルするとＳＴが呈 する活性は非常に低下し、９９℃にサイクルすると活性があったとしてもさらに 小さなものとなる。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡスパンの増幅は、触媒用に耐熱 性ＴａｑＤＮＡポリメラーゼが導入されて以来遺伝分析の重要な手法として普及 した。ＰＣＲの先行技術の方法には、最終生成物の忠実度と増幅することができ る生成物スパンのサイズという２つの制限要素がある。忠実度の問題は、突然変 異／ｂｐ／サイクルを約１０^-4から約１０^-5に減少させることが明らかである一 体型（ｉｎｔｅｇｒａｌ）３’−（校正）エキソヌクレアーゼを与えるＰｆｕ（ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼをＴａｑＤＮＡ ポリメラーゼの代わりに使うことによって部分的に処理されている。しかし、実 験によれば、この酵素は、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８（Ｋｌｅｎｔａｑ１としても 知られている）（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端欠失体、ＷＭＢ未公開） 又はＡｍｐｌｉＴａｑ（無欠損（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）ＴａｑＤＮＡポリメ ラーゼ、参考文献３）が容易に増幅できる１．５〜２ｋｂのサイズの範囲の所定 のＤＮＡ配列を増幅することができず、また、Ｐｆｕは、あらゆる形体のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼと同様にしか５〜７ｋｂを超えるＤＮＡ生成物スパンを増幅 することが出来ない（即ち増幅不可能である）ということが分かっている。無欠 損ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及びＮ−末端切断変異体Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８、 Ｋｌｅｎｔａｑ５及びＳｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔについて、標的のスパ ンの長さが５〜６ｋｂを超えると、ＰＣＲ増幅が急速に効果を失ったり、存在し なくなったりすることが明らかである。このことは、各サイクルの伸長（エクス テンション）ステップ期間に３０分が費やされても起こった。 非能率的ではあるが検出可能である、９〜１０ｋｂの標的の長さでの増幅及び １５ｋｂのものでの増幅の報告が幾つかあるが、殆どの一般利用は５ｋｂのもの に限定されている。 カインツェ（Ｋａｉｎｚｅ）氏他（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０２：４６−４９（１９９２年））によれば、未公開の生物源の酵素（「Ｈ ｏｔ Ｔｕｂ」ＤＮＡポリメラーゼとして市販されている）を利用した、１０ｋ ｂよりも大きい、即ち、１０．９ｋｂ及び１５．６ｋｂの生成物のＰＣＲ増幅が 報告されている。カインツェ氏他は、反応容量１００ｕｌにつき１ｎｇのλＤＮ Ａ鋳型で開始して３０サイクル後、１５．６ｋｂにかろうじて見えるバンドを得 たことを報告している。この増幅効率の量的な計算は示されていないが、増幅効 率は比較的低かったことが示されている。カインツェ氏他によるＷＴＴｈｅｒｍ ｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼを１０〜１５ｋｂのサイズ範囲で 機能させるという試みは成功ではなかったし、他の誰かによってもこのサイズ範 囲のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのいずれかの形体 に関する成功の結果は報告されていない。ＰＣＲにより増幅可能な長いＤＮＡ生 成物についての報告は全く無いのである。 ９８°又は９９℃での耐熱性を保持するＤＮＡポリメラーゼが存在すれば、「 コロニーＰＣＲ」（図５参照）を含む幾つかの状況においてより効率的で便利な ＤＮＡ分析を行うことが出来、及び／又は、酵素活性の不活化なしに熱サイクラ ー（ｃｙｃｌｅｒ）のオーバーシュートを許容することが出来るであろう。合成 に最適な温度に於けるＡＴ又はＷＴＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡ ポリメラーゼに対する忠実度を向上させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡ ポリメラーゼ配合は、標的及び生成物のＤＮＡが単に検出されるのではなくこれ を発現させる使用分野において非常に望ましいものである。 ６ｋｂを超えたＤＮＡスパンの効率的な増幅を行うことが出来るＤＮＡポリメ ラーゼ配合は、ＰＣＲの使用分野の範囲を大きく広げるものとなろう。例えば、 全プラスミド及び全プラスミドのサイズの構成体は、問題とするＤＮＡの一部がＥ．ｃｏｌｉ に導入されるとき毒性であったり、プラスミド複製と両立しない場 合に特に有用なこの方法で調製することができる。同時にこの耐熱性ＤＮＡポリ メラーゼの調製によってＰＣＲ増幅に対して忠実度が増加するならば、その結果 得られる大きな生成物は非常に正確、活性であり、及び／または研究および種々 の利用において、特に、増幅された配列の発現に関する状況において有用なもの となろう。さらに、この耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの調製によって非常に高い濃 度の収率の純生成物が得られるならば、このことによって、ＰＣＲの方法を、所 望のＤＮＡフラグメントを大量に生成する手法として、プラスミド複製に換えて より効率的に使用するところまで向上させることが出来るであろう。発明の概要 そのため、この発明の幾つかの目的のうち、有意味的に９９℃の温度に繰り返 しさらしても耐えることが出来るＤＮＡポリメラーゼを提供すること、標準的なＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応温度において 利用する際にＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼよりも高 い忠実度を呈する高耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを提供すること、ＤＮＡ鋳型から の及びＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉ一本鎖（線形）増幅の単コロニーからのＰＣＲ増幅 技術、核酸の配列決定、ＤＮＡ制限消化フィリング（ｄｉｇｅｓｔ ｆｉｌｌｉ ｎｇ）、ＤＮＡの標識化、ｉｎ ｖｉｖｏフットプリント法（ｆｏｏｔｐｒｉｎ ｔｉｎｇ）、及びプライマー指向性（ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変 異誘発に有用であるようなＤＮＡポリメラーゼの提供について述べる。この発明 のさらに別の目的には、上記ＤＮＡポリメラーゼの発現用の組換えＤＮＡ配列、 ベクター及び宿主細胞の提供がある。 さらなる目的としては、フレキシビリティ、特異性及び効率性をあまり犠牲に することなく、特に先行技術のＤＮＡポリメラーゼに比べて、かつ、いかなる標 的の長さについてもＰＣＲプロセスにより生じる突然変異原性を減少させ、ＰＣ Ｒの標的フラグメントの収率をできるだけ高くすると同時にＰＣＲ生成物バンド の強度と鮮鋭度を高める、少なくとも３５キロベースまでの長さを含む、従来の 配合で可能なものよりも長い長さをもつプライマーエクステンション生成物に効 率的に触媒作用を及ぼすことができるＤＮＡポリメラーゼの配合の提供と、より 長い長さの核酸配列を信頼性を持って合成するために利用され、かつ、プライマ ーとしてＰＣＲ生成物を効果的に利用することが出来るＰＣＲによる増幅のため の改良型プロセスの提供がある。 従って、簡単に言えば、本願発明は、ＷＴＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕ ｓ のＮ−末端２８０アミノ酸残基あるいはＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓＤＮＡ ポリメラーゼのＮ−末端２７９アミノ酸を除いて、実質的にＴｈｅｒｍｕｓ ａ ｑｕａｔｉｃｕｓ 又はＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼと同じ アミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼをコード化する 新規の組換えＤＮＡ配列に関するものである。 さらに言えば、この発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ又はＴｈｅ ｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と実質的に同じであ るが、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２８ ０アミノ酸残基あるいはＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ −末端２７９アミノ酸が欠けたものからなるアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメ ラーゼに関するものである。 さらに実施例において、本願発明は、３’−エキソヌクレアーゼ活性を持たな い少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼからなる主成分と、３’−（校正 ）エキソヌクレアーゼ活性を呈する少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ からなる少量成分とを含む耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの新規の配合に関係してい る。 また、本願発明は、野生型形体において３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈し かつ温度サイクル型ポリメラーゼ連鎖反応に触媒作用を及ぼすことが出来る少な くとも１つのＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼの配合であって、こ の少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼ活性が、そ の野生型形体における少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼの３’−エキソヌク レアーゼ活性の約０．２％〜７％の範囲にまで低減された配合に関するものであ る。 別の点では、Ｅ１及びＥ２からなるＤＮＡポリメラーゼの配合が提供されてい る。Ｅ１は有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を全く持たない１つ又はそ れ以上のＤＮＡポリメラーゼであり、Ｅ２は有意味的な３’−エキソヌクレアー ゼ活性を呈する１つ又はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼである。この与えられた 混合物については、Ｅ１のＥ２に対する相対ＤＮＡポリメラーゼ単位比が少なく とも約４：１である。 さらに、この発明は、上記した型のＤＮＡポリメラーゼを配合することを含む 、ＰＣＲによる核酸配列の増幅を行うためのプロセスにおける改良に関するもの である。これにより生じた配合は、ＰＣＲプロセス中のプライマーエクステンシ ョンに触媒作用を及ぼすために使用されるものであり、従って、効率的なＰＣＲ 増幅に使用できるサイズの範囲を拡大するものである。 本願で検討されているようなＤＮＡポリメラーゼは、通常、５’−エキソヌク レアーゼ、３’−エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端からＣ−末 端までの物理的順序において、酵素活性の３つまでの識別可能及び分離可能領域 から構成される。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、３’−エキソヌクレアーゼを全 く有していなかったものであるが、この発明の最初の部分は、その５’−エキソ ヌクレアーゼの欠失に関するものである。ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ等の他の上 記したＤＮＡポリメラーゼは、５’−エキソヌクレアーゼを有していないが、そ れらの３’−エキソヌクレアーゼ機能は、ＤＮＡポリメラーゼＥ１（有意味的な ３’−エキソヌクレアーゼを持たないもの）及びＥ２（３’−エキソヌクレアー ゼを有するもの）の混合物に関するこの発明の特徴について中核をなすものであ る。５’−エキソヌクレアーゼの存在がこれらの混合物のＥ１またはＥ２のいず れにおいてもこの発明の主要な利点にとって不可欠であることは示されていない 。 他の目的及び特徴については、一部は明らかであり、一部は以下に示す略号一覧 次に列挙した、本願明細書で使用する略号を以下のように定義する。略号 ｂｐ ＝ 塩基対 ｋｂ ＝ キロベース、１０００塩基対 ｎｔ ＝ ヌクレオチド ＢＭＥ ＝ ベーターメルカプトエタノール ＰＰ_i ＝ ピロリン酸ナトリウム Ｐｆｕ ＝ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ Ｔａｑ ＝ Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ Ｔｆｌ ＝ Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ Ｔｌｉ ＝ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ Ｋｌｅｎｔａｑ−ｎｎｎ＝ コドンｎｎｎ＋１で開始される、Ｎ−末端が欠失 したＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ。但し、開始コド ン及びその次のコドンは適当な制限サイト（ｓｉｔｅ）を生成するためのＤＮＡ 配列の改変のためＷＴ配列に適合しない場合がある。 ＷＴ ＝ 野生型（無欠損）または３ａａのみ欠失。 ａａ ＝ アミノ酸 ＳＴ ＝ Ｓｔｏｆｆｅｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｋｌｅｎｔａｑ−２８８と 呼ばれることもあるＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼの Ｎ−末端欠失体 −ＬＡ ＝ Ｌｏｎｇ ａｎｄ Ａｃｃｕｒａｔｅ；少なくとも１つは有意味 的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を持たず、少なくとも１つは有意味的な３’ −エキソヌクレアーゼ活性を呈する２つのＤＮＡポリメラーゼの不均衡な混合物 ＰＣＲ ＝（名詞） １． ポリメラーゼ連鎖反応 ２． １つの上記反応／増幅実験 （動詞） ３． ポリメラーゼ連鎖反応を介して増幅すること ｕｌ ＝ マイクロリッター ＡＴＣＣ ＝ アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉ ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ） メガプライマー（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ） ＝ 複数ステップ処理の後続ＰＣ Ｒ段においてプライマーとして使用される二本鎖ＤＮＡ・ＰＣＲ生成物 Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＝ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−ＤからのＤＮＡポリ メラーゼ； 精製酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から入手で きる。 Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ^- ＝ ３’（校正）−エキソヌクレアーゼを持 たない、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼの突然変異体形体 Ｖｅｎｔ ＝ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓからのＤＮＡ ポリメラーゼ； 精製酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から入 手できる。 Ｖｅｎｔ ｅｘｏ^- ＝ ３’（校正）−エキソヌクレアーゼを持たない、Ｖ ｅｎｔＤＮＡポリメラーゼの突然変異体形体 Ｐｆｕ ＝ ３’（校正）−エキソヌクレアーゼを持たない、Ｐｙｒｏｃｏｃ ｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓからのＤＮＡポリメラーゼ； 精製酵素はＳｔｒａｔ ａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手できる。 Ｐｆｕ ｅｘｏ^- ＝ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの突然変異体形体； 精製 酵素はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手でき る。 シークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ） ＝ ファージＴ７又はＴ３ＤＮＡポ リメラーゼの、化学的に修飾された、あるいは、突然変異した形体であって、そ の修飾あるいは突然変異によって３’−エキソヌクレアーゼ活性が消失したもの 。図面の簡単な説明 図１は、この発明のＤＮＡポリメラーゼの推奨実施例に関する遺伝子の増幅に 使用できるプライマーのヌクレオチド配列を示す図である。（プライマー間の） 遺伝子に対するＤＮＡ配列及び結果として得られる酵素のアミノ酸配列のバルク 部分は、上記したＧｅｎＢａｎｋ登録によって定義されている。 図２は、図１と同じプライマーのヌクレオチド配列を示す図であり、これらの 同じプライマーがＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓからの類似する遺伝子の増幅に 使用できることが示されている。 図３は、従来技術の酵素Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラ ーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ；ＡＴ）及びこの発明の推奨実施例のＤＮＡポリメラー ゼを使用して行い、２０サイクルに対して各々２分間完全に持続させるピーク変 性温度を変えて試験したＰＣＲ増幅反応を示すアガロースゲルの写真である。こ の発明の推奨実施例については、９８°において完全な活性を呈しており、９９ °においては不完全ではあるが有用な活性を呈している。一方ＡＴはこれらの温 度に耐えられない。図３は、本願発明の酵素が、実地試験即ちＰＣＲ増幅におい て、ＡＴよりも高い耐熱性を有することを明示している。 図４は、４つの酵素を使用して行ったＰＣＲ増幅反応を示すアガロースゲルの 写真である。４つの酵素とは、先行技術の酵素Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃ ｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ；ＡＴ）、この発明のＤＮＡポリメ ラーゼ（ＫｌｅｎＴａｑ−２７８）、先行技術の酵素ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｓｔｏ ｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＳＴ）、及びＫｌｅｎＴａｑ−２９１である。こ れら全てを、ＰＣＲ変性ステップを９５℃（制御標準温度）及び９８℃で行って 試験した。全てについて、酵素のレベルを２つにして試験した。低い方のレベル は、制御温度での反応を維持するために必要な最小値に、実際に使用できる程度 まで近づけている。 ＫｌｅｎＴａｑ−２９１及びＳＴの双方は、９８℃にて使用した際、同様に挙 動し、全部ではないが殆どの活性を失うが、ＫｌｅｎＴａｑ−２７８は高い変性 温度の使用に対して少なくとも２倍の耐性があることに注意されたい。ＡＴは９ ８℃の温度にさらされると有効性が激烈に低減することがわかる。これらの酵素 の挙動は、ＳＴを除いて再現できる。ＳＴは、提示した実験においては最もよい 結果を示すが、製造者により推奨された量を使用した場合の作用はそれよりも劣 る。 図５は、この発明の酵素により使用できるようにされた９８℃の新しい実施可 能温度と９５℃の標準ピーク変性温度とで比較して行われたコロニーＰＣＲの生 成物のアガロースゲル分析の写真である。図５によって、新しく実施可能となっ たピーク変性温度を使用するについての応用的な利点が明示されている。 図６（Ａ−Ｃ）は、各々に、試験したＰＣＲ実験の一部がローディングされた アガロースゲルの３枚の写真である。図６は、この発明の推奨実施例の酵素配合 を様々に変えることによって得られる高ＤＮＡスパンＰＣＲの効率が大幅に増大 することを明示している。ＫｌｅｎＴａｑ−２７８あるいはＰｆｕＤＮＡポリメ ラーゼを単独で使用すると、６．６ｋｂＰＣＲ生成物形成に及ぼす触媒作用が低 レベルであることが示されているが、これら２つを種々に組み合わせると、非常 に効率が増大することがわかる。ＫｌｅｎＴａｑ−２７８と組み合わせるＰｆｕ の量を徐々に少なくして図示の最小値１／６４０まで低減すると、効果的である ことがわかる。図示したもののうち、ＫｌｅｎＴａｑ−２７８及びＰｆｕの組合 せのみが６．６ｋｂの効率的な増幅に触媒作用を及ぼすことが出来る。１００ｕ ｌに対して表示レベルの各酵素（単位濃度については、例８の方法を参照）を使 用して、１９ｎｇのλｐｌａｃ５ＤＮＡ及びプライマーＭＢＬ及びＭＢＲで鋳型 処理（ｔｅｍｐｌａｔｅ）されたＰＣＲ反応に触媒作用を与えた。９４°で２分 、６０°で２分、７２°で１０分の２０サイクルである。 図７は、６．６ｋｂよりもさらに長いフラグメントの増幅に触媒作用を及ぼす 場合において、ＰＣＲ実験の生成物を分析してこの発明の実施例の性能を調査し たアガロースゲルの写真である。図７は、この発明の酵素配合の比率１／６４０ の実施例を利用した場合、８．４ｋｂ、１２．５ｋｂ、１５ｋｂ及び１８ｋｂの 増幅能力に高い効率性と高い収率が付与されていることを示している。標的生成 物のサイズは、各レーンに対しｋｂとして上記に表示している。１００ｕｌに対 する鋳型のレベルは、ｎｇλとして示されている。即ち、ＰＣＲは、各々、９４ °で２秒、７０°で１１分の２０又は３０サイクルである。これらの早期の増幅 は、現在の最適手法（例８の方法を参照）に比べて幾つかの点で、最適とは言え ないものであった。従って、薄壁の管ではなく厚い壁の管を使用し、触媒として １ｕｌのＫｌｅｎｔａｑＬＡ−６４（６３：１のＫｌｅｎｔａｑ−２７８：Ｐｆ ｕ）をＫｌｅｎｔａｑＬＡ−１６の代わりに使用し、２７ｍｅｒ（２７量体）の プライマーを長いプライマーの代わりに使用し（表１参照）、伸長／アニーリン グ温度を６８°ではなく７０°にし、オムニゲン（Ｏｍｎｉｇｅｎｅ）熱サイク ラーを使用した。 図８は、ほぼ無損失の先行技術の−３欠失のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃ ｕｓ ＤＮＡポリメラーゼによってＰＣＲ生成物であるｌａｃＺ遺伝子に導入され た突然変異の数とＫｌｅｎｔａｑ−２７８によって導入された突然変異の数とを 比較して、差を計数している棒グラフである。 図９は、４３ｍｅｒオリゴヌクレオチドプライマーＢｔＶ５と対にされた３８ ４ｂｐメガプライマー（二本鎖ＰＣＲ生成物）を用いて行われたＰＣＲ増幅を示 すアガロースゲルの写真である。１００ｕｌの反応容量に対して、以下の酵素（ 単位濃度については例８の方法を参照）を使用して増幅に対して触媒作用を与え た。レーン１、１ｕｌのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ；レーン２、１／１６ｕｌの Ｐｆｕ；レーン３、１ｕｌのＫｌｅｎｔａｑ−２７８；レーン４、両酵素を同時 使用（１ｕｌのＫｌｅｎｔａｑ−２７８＋１／１６ｕｌのＰｆｕ）。ゲルの底部 付近の３８４ｂｐのバンドはメガプライマーであり、最初にＫｌｅｎｔａｑ−２ ７８を使用して増幅されたものである。λＨ３＝ＨｉｎｄIIIで消化されたラム ダＤＮＡ。２つの酵素の組合せ（レーン４）によってのみ良好な増幅が得られた 。ＰｆｕのかわりにＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼを使用した場合も同じ結果が得 られた（データは示していない）。 図１０は、３３ｍｅｒの方が２７ｍｅｒよりも良好な結果を得られることを示 すアガロースゲルの写真である。２７ｍｅｒプライマー（レーン１〜３、７〜９ ）又は３３ｍｅｒプライマー（レーン４〜６、１０〜１２）を使用して、１００ ｕｌの反応容量に対して、２ｎｇ（レーン１〜６）または１０ｎｇ（レーン７〜 １２）のラムダ導入ファージ鋳型を増幅した。３３ｍｅｒラムダプライマー配列 は、長いだけでなく、ラムダゲノムにおいて、プライマーＭＢＬの左側に１００ ｂｐで、また、プライマーＭＢＲの右側に２００ｂｐで配置されている。１．２ 、１．４及び１．６ｕｌの量のＫｌｅｎｔａｑＬＡ−１６を使用して、１２．５ 、１５及び１８ｋｂのそれぞれの増幅に触媒作用を与えた。１５ｕｌのアリコー ト（０．３又は１．５ｎｇのλ鋳型と等価）を０．８％のアガロースの電気泳動 で分析した。 図１１は、ｐＨ（ＰＣ２バッファをそのまま使用）及び熱サイクラー（オムニ ゲン）に関して最適次善の条件下でＫｌｅｎｔａｑＬＡ−１６（１．２ｕｌ）に よって増幅された高ＰＣＲ生成物のＣＨＥＦパルスフィールド分析（参考文献１ １、４秒の切換時間）を示すアガロースゲルの写真である。開始鋳型（表１参照 ）は０．１ｎｇ／ｕｌであり、各サイクルにおける６８°での時間は、２０ｋｂ を超える生成物については２１分、レーン４及び５については１３分、及びレー ン１１〜１４については１１分であった。ローディングされたＰＣＲ反応生成物 の体積は、ほぼ等しい強度を示すように調整されており、ｕｌ単位で１２、１２ 、４、２；１０、１０、１０；２、２、４、１である。標準のサイズのレーン（ Ｓ）は、λＤＮＡのＨｉｎｄIII消化物と混合された無欠損λｐｌａｃ５ＤＮＡ （４８６４５ｂｐ）を示している。表１については、５桁のサイズが、λｐｌａ ｃ５ＤＮＡの配列についてプライマーの位置から予測された塩基対で示されてお り 、小数点の付いたサイズは、このゲルから求めたｋｂで示されている。 図１２は、制限酵素ＨｉｎｄIIIによる消化が行われていない（レーン２、３ ）及び消化が行われた（レーン５、６）２８ｋｂと３５ｋｂの生成物を示すアガ ロースゲルの写真である。ＨｉｎｄIII消化の前に、２８ｋｂ生成物は１サイク ルにつき２１分の伸長時間で、及び、３５ｋｂ生成物は２４分の伸長時間で増幅 され、かつ、双方ともに最適なｐＨ（例８の方法を参照）にてロボサイクラー（ Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ）で増幅された。レーンＳ（１、４、７）は、未消化のλ ｐｌａｃ５及びＨｉｎｄIII消化がなされたλｐｌａｃ５ＤＮＡのマーカーを含 んでいる。 図１３は、Ｐｆｕ ｅｘｏ^-突然変異体の試験結果を示すアガロースゲルの写 真である。３０単位（０．７ｕｇ）のＫｌｅｎｔａｑ−２７８を単独で用いて（ レーン１、７）、また、これを古細菌Ｐｆｕ野生型ｅｘｏ⁺ＤＮＡポリメラーゼ （＋；レーン２、３）又はその３’−エキソヌクレアーゼ活性を持たない突然変 異体（−；レーン４、５）の非常に少量の混合物（１／１６ｕｌ又は１／６４ｕ ｌ、１／６又は１／２５単位と等価）と組み合わせて、８．４ｋｂのＰＣＲ増幅 を行った。レーン６は、１ｕｌ（２．５単位）の単独のＰｆｕＤＮＡポリメラー ゼ（ｗｔ、ｅｘｏ⁺）が使用された場合の結果である。 使用されている。推奨実施例の説明 図１を参照すると、この発明の推奨実施例のＤＮＡポリメラーゼ（ここではＫ ｌｅｎｔａｑ−２７８と称する）をコード化する組換えＤＮＡ配列のＰＣＲによ る増幅についてのプライマーと論理が示されている。図１に示すように、開始メ チオニン及びグリシン残基が、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８の最初の２つのＮ−末端 位置を占めているが、それは、その前にＷＴＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕ ｓ ＤＮＡポリメラーゼの残基２７８及び２８０が占めていた位置である。そのあ とに、ローヤー氏他の記載のように、位置２８１のアミノ酸残基から始まって、 野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列 が続いている。そのため、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラ ーゼの１から２８０のアミノ酸残基をコード化するコドンが欠失しており、１〜 ２８０のアミノ酸は、結果として得られる遺伝子生成物中に存在しない。この発 明の別の推奨実施例のＤＮＡポリメラーゼを図２に示す。この推奨実施例では、 上記したと同じ欠失突然変異が、非常に類似した酵素Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖ ｕｓ ＤＮＡポリメラーゼに生じている。 アミノ酸配列を実質的に上記したように保持し、かつ、ポリメラーゼの耐熱性 にあまり影響しない、ここに記載するアミノ酸配列に対するＤＮＡコード化又は アミノ酸配列になされる些細な改変は、この発明の範囲内に含まれることを理解 されたい。 突然変異体ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｔａｑ−２７８が、それ以前のＴｈｅ ｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼのあらゆる変異型に関して報 告された温度よりも高い温度において耐熱性を呈し、ＤＮＡ合成に適した７２℃ の温度で使用する場合に、最終的なＰＣＲ生成物において、ＷＴＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼよりも高い忠実度を示すことは驚くべ きことである。さらに、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８には（Ｎ−末端欠失の結果とし て除去された）Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼに関連 する５’−エキソヌクレアーゼ活性がないため、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８はＤＮ Ａ配列決定について野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラ ーゼに比して非常に優れたものである。突然変異誘発の結果及びミスマッチ化プ ライマーの調査によって、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８が、野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼよりも進行的でなく、誤対合した塩基を 伸長させにくいことが分かる。 Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８、Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＳＴ、別名称 Ｋｌｅｎｔａｑ−２８８）及びＫｌｅｎｔａｑ−２９１について耐熱性試験を行 った。行った試験は、９７℃、９８℃又は９９℃等のピーク試験温度において各 々完全に２分を有する２０ＰＣＲサイクルを含んでおり、得られる増幅バンドの 強度を９７℃で又は９５℃等の低い制御変性温度（この温度では、これら全ての 変異型が安定である）で２分間のものと比較する。これらのデータは、ＳＴとＫ ｌｅｎｔａｑ−２９１が同様の挙動を示し、これらの試験において９８℃で検出 可能な熱不安定性を殆ど呈することのなかったＫｌｅｎｔａｑ−２７８とは異な って、互いに同様の９８℃での不安定性を有していることを示している。これら のデータによれば、Ｎ−末端アミノ酸の数はこの発明のＤＮＡポリメラーゼが呈 する耐熱性の増強にとって重要であることがわかる。欠失ＳＴ及びＫｌｅｎｔａ ｑ−２９１が、この発明のＫｌｅｎｔａｑ−２７８が示す最適の安定性に対して 過剰のアミノ酸（１０過剰及び１３過剰）を除去したクラスであることは明らか である。 Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓと表示されることがある（及びＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ であることもある、ＡＴＣＣのカタログ参照）細菌から得 たＤＮＡポリメラーゼは、ＷＴＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリ メラーゼに対して非常に相同である。ここで検討する欠失の領域においては、酵 素及び遺伝子が正確に相同であり、類似の欠失が構成された場合、対のＳＴ、Ｋ ｌｅｎｔａｑ−２９１及び優れているＫｌｅｎｔａｑ−２７８の違いはそのまま となると思われる。実際に、図２のプライマーをＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ ＤＮＡに使用して、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８の構成及び単離のために正確にここ で記載する態様でＫｌｅｎＴｆ１−２７７を構成することができよう。Ｔｈｅｒ ｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ−２７７酵素及び同様の耐熱性を呈す るその改変体もこの発明の範囲内である。 また、この発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ又はＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラーゼ をコード化する組換えＤＮＡ配列を含むベクターを特徴として有する。但し、こ れがＮ−末端にメチオニン及びグリシン残基を付加すること及び野生型Ｔｈｅｒ ｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸を排 除すること（ローヤー氏他、上記参照）を除く。 推奨実施例において、ベクターはＡＴＣＣ第６９２４４号として供託されたプ ラスミドｐＷＢ２５４ｂ（配列番号５）として存在する核酸あるいはそのような ベクターを含む宿主細胞である。 関連する点では、この発明は、上記したようなアミノ酸配列を有する精製ＤＮ Ａポリメラーゼを特徴としている。ここで使用されているとおり、「精製」とは この発明のポリメラーゼを、通常それに関連する大多数の宿主細胞タンパク質か ら単離することを意味する。このポリメラーゼは調製物中のタンパク質の少なく とも１０％（ｗ／ｗ）であることが好ましい。それが均一系調製物、例えば、均 一系溶液とされていれば更に好ましい。 概略的には、この発明の組換えＤＮＡ配列は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉ ｃｕｓゲノムＤＮＡから、あるいは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮ Ａポリメラーゼ遺伝子の所望のスパンよりも大きい部分のクローンから、ポリメ ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、サイキ（Ｓａｉｋｉ）氏他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９ 、４８７（１９８８年））によって、後続の消化のために適切な制限サイトが含 まれている図２に示すようなプライマーを用いて増幅される。 その後、組換えＤＮＡ配列は、当業者に周知の手法によって発現ベクターにク ローニングされる。ベクターの特定のヌクレオチド配列は、ＮｃｏＩ及びＨｉｎ ｄIII等のサイト特異的制限酵素により切断される。次いで、ベクターを任意に アルカリ性ホスファターゼ処理した後、ベクター及び標的フラグメントの配位子 結合が、結果としてなされる、所望の対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）及び発現配列に隣 接した位置への標的コドンの挿入とともになされる。使用される特定のベクター は、遺伝子発現に使用されるために選択される宿主細胞の型にある程度依存する こととなる。代表的には、アンピシリン又はテトラサイクリン耐性等のマーカー 用遺伝子を含み、かつ、適切なプロモーター及びターミネーター配列を含む宿主 親和性（ｈｏｓｔ−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）プラスミドが使用される。 推奨実施例において、この発明の組換えＤＮＡ発現配列は、バックボーンがｐ ＴＡＣ２（ワシントン大学メージャーズ（Ｊ．Ｍａｊｏｒｓ）氏）、ｐＢＲ３２ ２誘導体である、プラスミドｐＷＢ２５０（ルシフェラーゼ／ＮＰＴII融合を発 現させる）あるいはｐＷＢ２５３（ＡＴＣＣ第６８４３１号として供託されたＫ ｌｅｎＴａｑ−２３５を発現させる）についてクローニングされる。その結果得 られる、ｐＷＢ２５４ｂと呼ばれるプラスミドの特定の配列は、配列番号５であ る。 Ｅ．ｃｏｌｉの種々の菌株等の細菌及びパン酵母等の酵母菌は、ＤＮＡポリメ ラーゼの発現用宿主細胞として非常によく用いられるが、さらに複雑な細胞を使 用する技術も知られている。例えば、デピッカー（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，Ａ．）氏 他による、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ． １、５６１（１９８２年）に記載 の植物細胞を使用する手法を参照されたい。この発明の推奨実施例においては、ｌａｃ オペロンをカバーする欠失Ｘ７４を有するＥ．ｃｏｌｉ宿主菌株Ｘ７０２ ９、野生型Ｆが使用されている。 宿主細胞は、所定の宿主細胞に対して特定的に作られたプロトコル（ｐｒｏｔ ｏｃｏｌ）を用いて形質転換される。Ｅ．ｃｏｌｉについては、コーエン（Ｃｏ ｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．）氏によるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９、２ １１０（１９７２年）記載のカルシウム処理によって形質転換が生じる。あるい は、より効果的であるのは、ドワー（Ｄｏｗｅｒ）氏他によるＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６、６１２７−６１４５（１９８８年）に記 載の方法を行った後、無塩（ｓａｌｔ−ｆｒｅｅ）Ｅ．ｃｏｌｉのエレクトロポ レーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を行うことである。形質転換後 、形質転換宿主を、アンピシリン耐性等の発現ベクターから得られる特性に基づ いて他の細菌から選択して、細菌の形質転換コロニーを、高レベルのイソプロピ ルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導化耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を生じさ せる能力に関してさらにスクリーニングする。次いで、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉの コロニーを大量に生長させて、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８ＤＮＡポリメラーゼの発 現を誘導し、単離及び精製を行う。 精製技術は様々なものが知られているが、それら全ては、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の 破壊、自然タンパク質の不活性化及び除去、及び核酸の沈殿のステップを含んで いる。ＤＮＡポリメラーゼの分離は、その重量（遠心分離）、サイズ（透析、ゲ ル濾過クロマトグラフィ）または電荷（イオン交換クロマトグラフィ）のような 特性を利用することによってなされる。一般的には、精製プロセスにおいて、こ れらの技法は一緒に組み合わせて使用される。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８を精製す るための推奨プロセスでは、リゾチームを用いてＥ．ｃｏｌｉ細胞を弱め、この 細胞を溶解させ、また、細胞懸濁液を８０℃に急速加熱して８０〜８１℃で２０ 分間インキュベートすることによって殆ど全ての自然タンパク質を変性させる。 次いでこの懸濁液を冷却し遠心分離して変性タンパク質を沈殿させる。その後、 この上澄み液（Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８が含まれている）を高塩（ｈｉｇｈ−ｓ ａｌｔ）ポリエチレン−イミン処理して核酸を沈殿させる。抽出物の遠心分離に よって核酸が除去される。好ましくは、ヘパリン−アガロースカラムでのクロマ トグラフィによってほぼ純粋な酵素が得られる。この単離についての詳細は例３ に後述する。 この発明の新規のＤＮＡポリメラーゼは、このような酵素を有利に使用できる あらゆるプロセスに使用できる。具体的には、この酵素は、ＰＣＲ増幅技術、核 酸の配列決定、サイクル配列決定、ＤＮＡ制限消化の標識化及び平滑末端化（Ｄ ＮＡ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｉｇｅｓｔ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｂｕｌｕｎｔｉｎｇ）、ＤＮＡの標識化、ｉｎ ｖｉｖｏＤＮＡフットプリント 法、及びプライマー指向性突然変異誘発に有用である。増幅 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、幾何進行において、１００万以上の折り 畳みにまでＤＮＡの特定のセグメントを急速に増幅するための方法である。例え ば、参考文献として本願明細書の一部とするミュリス（Ｍｕｌｌｉｓ）氏による 米国特許第４６８３２０２号を参照されたい。この技法は、増幅されるべきＤＮ Ａセグメントの５’末端と及び３’末端の補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）と相同 関係を有する一対のプライマーからの、ＤＮＡポリメラーゼで触媒作用を与えら れた伸長の繰り返しサイクルに基づくものである。このプロセスの主要なステッ プは、別の増幅ラウンドが得られるようにＤＮＡプライマーエクステンション生 成物をその鋳型から熱変性することである。この変性ステップの実施可能温度範 囲は、通常、約９３℃から約９５℃の範囲である。この範囲では殆どのＤＮＡポ リメラーゼが不可逆的に変性してしまうので、各変性サイクル後にさらに別のポ リメラーゼを付加することが必要とある。しかし、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔ ｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、 二本鎖核酸を変性させる温度での活性を保持することが出来るため、更にＤＮＡ ポリメラーゼを付加する必要はない。例４に後述するように、Ｋｌｅｎｔａｑ− ２７８は、以前に知られていたあらゆるＤＮＡポリメラーゼに対するものよりも 高い９９℃の温度に有意味的に繰り返しさらしてもそれに耐え得る能力を示して いる。 また、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、推奨合成温度である７２℃において、野生 型Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼよりも高い忠実度を 有することが分かっている。これに関するデータは、２つの選択可能なマーカー が横に配置されたｌａｃＺ ＤＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅に関する方法（バーネス （Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．）氏、Ｇｅｎｅ １１２、２９−３５（１９９２年） ）で収集された。この発明の推奨実施例Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８とＡＴ及び類似 した別のＮ−末端欠失であるＫｌｅｎｔａｑ−２３５とを比較する代表的なデー タが図８に示されており、これにより、相異なるＮ−末端欠失が、最終ＰＣＲ生 成物において測定されたような異なる忠実度を再現可能に呈することがわかって いる。 酵素ＳＴについては、この酵素の市販の調剤で、この検定に用いられる長い試 験フラグメント（４．８ｋｂ）のＰＣＲに触媒作用を及ぼすことが難しいため、 同様の忠実度のデータが得られない。しかし、ＳＴに関するこれらの実験の難点 が単に配合（２ｋｂＰＣＲ増幅に必要な容積が１０〜１５倍も多い容積となるほ どその濃度が低く、これらの欠失について、長い標的ＤＮＡを得るのに必要な酵 素がもっと必要である）によるものなのか、ＳＴがこのような長い標的のＰＣＲ 増幅に触媒作用を及ぼすことが本質的に出来ないのかということについては分か っていない。ＤＮＡ配列決定 所定のＤＮＡ配列は、ジデオキシ類似体を用いて、サンガー法（サンガー（Ｓ ａｎｇｅｒ，Ｆ．）氏、ニクレン（Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ）氏及びクールソン（Ｃ ｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．）氏による鎖終結阻害剤を用いたＤＮＡ配列決定、Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４、５４６３−５４６７（１９７ ７年））によって解明することが出来る。これらの方法では、ＤＮＡポリメラー ゼを使用して核酸連鎖の伸長に触媒作用を及ぼす。しかし、その自然形体におい て、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼは（多くの他のポ リメラーゼと同様に）５’−エキソヌクレアーゼ活性に関する領域を有している 。この関連するエキソヌクレアーゼ活性は、僅かに過剰の酵素が存在することや インキュベートの時間が過剰にされた場合を含む所定の条件下で、１〜３のヌク レオチドを配列決定プライマーの５’末端から取り除くことができ、それによっ て、アルファ標識化配列決定用ゲルにおける各バンドが多かれ少なかれ多重線と して現れるようにすることができる。配列決定用ゲルの標識が５’である場合に は、エキソヌクレアーゼによって多重線を生じさせることは出来ないが、そのか わりにシグナルを減少させる。Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリ メラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸残基の欠失の結果として、Ｋｌｅｎｔａｑ− ２７８にはエキソヌクレアーゼ活性がなく、５’−エキソヌクレアーゼ活 性により生じる配列決定の危険性が回避される。 Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ配列決定に効 果的に使用することが出来る。基本的には、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８を使用する に適したジデオキシＤＮＡ配列決定には２種類ある。即ち、元来のジデオキシ配 列決定（上述のサンガー氏他；イニス（Ｉｎｎｉｓ）氏他によるＰｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５、９４３６（１９８８年））及びサイク ル配列決定である。 イニス氏他によりジデオキシ配列決定に適した手法が記載されているが、ＷＴＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼを使用すると、この手 法は、審査官には入手可能でありかつ参考文献として本願明細書の一部とする特 許出願第０７／５９４６３７号に明示されているように、配列決定用ゲル上で二 重又は三重のバンドを示す傾向がある。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、この問題の 解決において、上記特許出願の主題であるＫｌｅｎｔａｑ−２３５，ａ．ｋ．ａ ． ＤｅｌｔａＴａｑと同じ効果をもつ。 Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８による元来型（非サイクル型、イニス氏他）のジデオ キシ配列決定を行うに好ましい手法は、ＵＳＢのＴａｑｕｅｎｃｅ２．０ジデオ キシ配列決定キットにおけるものである。この手法の表題紙を本願に添付し（付 録１）、その記述全体を参考文献として本願明細書の一部とする。 サイクル配列決定に好ましい手法は、ＵＳＢサイクル配列決定キットにおける ものである。この手法の表題紙を本願に添付し（付録２）、その記述全体を参考 文献として本願明細書の一部とする。その他の用途 Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、プライマー指向性突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｖｏ フットプリント法、ＤＮＡの標識化及び非スティッキー・ラムダＤＮＡフラグメ ントのサイズ標準の調製にも有効に利用されたものである。これらの手法につい ては以下に述べる。 Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、特に配合Ｋｌｅｎｔａｑ−ＬＡ（後述）において 、一本鎖鋳型になるようにアニーリングされるサイト特異的突然変異原生プライ マーを伸長させるために使用することが出来る。それは、このプロセスではクレ ノウ酵素（Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグメント）及びＴ７ ＤＮＡポリメラーゼと置き換わるが、３７℃におけるクレノウ酵素よりも高いプ ライマー選択性を６０〜６５℃で示し、クレノウ酵素に必要な時間が１時間以上 であるのに比べて１２分で完全あるいは十分な取り込みの状態になる。 また、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、リガーゼ仲介ＰＣＲ補助ｉｎ ｖｉｖｏフ ットプリント法における第３（第２ネスト（ｓｅｃｏｎｄ−ｎｅｓｔｅｄ））プ ライマーでのＰＣＲ後の標識化ステップに対して有用（及び野生型Ｔｈｅｒｍｕ ｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼよりも優れたもの）である。この情 報がえられたのは、ミズーリ州セントルイスのワシントン大学のガッタス（Ｉ． Ｇｈａｔｔａｓ）氏のおかげである。これらの研究は、ガリッティ氏及びウォル ド氏にの研究（Ｇａｒｒｉｔｙ，Ｐ．Ａ．及びＷｏｌｄ，Ｂ．Ｊ．（１９９２年 ）、連結反応仲介ＰＣＲ増強遺伝子配列決定及びｉｎ ｖｉｖｏフットプリント 法における種々のＤＮＡポリメラーゼの効果、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９、１０２１−１０２５）と同様である。 さらに、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８はＤＮＡ標識化に有用である。ランダムプラ イマーについては、少なくとも９ｎｔの長さが推奨され、反応を３７℃から６５ ℃にゆっくりと（２０〜３０分かけて）温めて行うことが好ましい。最も好まし いのは、当業者に周知である手法を用いて、プログラム可能な熱ブロックをＤＮ Ａ標識化に利用することである。 Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８の別の用途は、部分的に付着末端（スティッキーエン ド）が付着し合っていないラムダＤＮＡ制限消化物の調製に使用することである 。５５℃で反応が行われるＨｉｎｄIII消化物にＫｌｅｎｔａｑ−２７８及び４ つのＤＮＡｄＮＴＰが含まれていると、その結果として、バンド１及び４が部分 的に相互に結びつかない。供託 菌株ｐＷＢ２５４ｂ／Ｘ７０２９は、１９９３年２月１８日にメリーランドの アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに供託されており、ＡＴＣＣ６ ９２４４号の番号が付与されている。出願人は、これについて付与された特許の 存続期間の終了前、培養に対する最後の請求をしてから５年、或いは、３０年の いずれか長い方の期間の経過前にこの培養が死んでしまった場合にこの培養を取 り替える責任、及び、供託物が公に入手できるようになる特許付与の時点に、こ のような特許の付与の受託者を告知する責任のあることを認めるものである。そ の時まで、供託物は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション１〜１４及び３５Ｕ．Ｓ．Ｃ ．§１１２の条件のもとに特許局の長に対して入手可能となろう。 この発明のさらに別の特徴については、標的長さがＤＮＡのＰＣＲ増幅に制限 されることが確認され、取り扱われている。それに付随して、塩基対の忠実度、 ＰＣＲ生成物をプライマーとして使用する能力、及び標的フラグメントの最大収 率が増加した。これらの向上は、有意的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を持た ないＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＫｌｅｎｔａｑ−２７８と、低レベルの、 有意的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、 Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、又はＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ）とを組み合わせることによって得 られた。驚くべきことに、この系で、例えば１ｎｇのラムダＤＮＡ鋳型から少な くとも３５ｋｂの標的フラグメントが、高い収率になるまで増幅可能である。 更に、少なくとも１つの３’−エキソヌクレアーゼ活性を持たない耐熱性ＤＮ Ａポリメラーゼからなる主成分と、少なくとも１つの３’−エキソヌクレアーゼ 活性を呈する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼからなる少量成分とから構成される耐熱 性ＤＮＡポリメラーゼの配合によって、６．６〜８．８ｋｂの範囲の生成物を効 果的 に増幅することが出来る。 先行技術の方法では、このサイズの範囲のフラグメントはあまり効力のない形 でかつ散発的にしか増幅されず、比較的弱い生成物バンドが生じたり、検出可能 な生成物が全く生じなかったりした。本願の開示をみると、先願技術の無効性の 理由が（何らかの特殊な理論に制限されることなく）理解されるものと思われる 。Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ及びその変異型は、 （それらに３’−エキソヌクレアーゼがないため除去できない）誤対合した塩基 対を容易に伸長させないものと思われる。誤対合した塩基の除去によって伸長を 有効にし、かつ、より正確にコピーされた生成物を生成させることが出来るであ ろうと思われる、３’−（校正）エキソヌクレアーゼを呈する耐熱性酵素は、２ 社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）によ って導入された。実際には、これら２つの酵素（Ｖｅｎｔ及びＰｆｕＤＮＡポリ メラーゼ）は信頼性がなく、期待されていた程の効果はあまり得られていない。 ＰＣＲに関しこれらの酵素に信頼性がないことに対して考えられる説明の１つと して、３’−エキソヌクレアーゼが見かけ上プライマーを攻撃してこれを劣化さ せることがよくあり、ＰＣＲが殆ど或いは全く起こりえないということがある。 このプライマー攻撃の問題は、あるプライマーに対しては他のものよりもさらに 悪いものとなる。ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼが５’１５ｎｔに影響を及ぼさな いようにして、アニーリング条件によってその１５ｎｔをプライマー化（ｐｒｉ ｍｅ）させる場合にＰＣＲをおそらく進行させることが出来るようにすることが 報告されている（作者不明、ＮＥＢ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、（１９９１年３月）４頁）。勿論、この場合、アニー リングはより低い、非選択的な温度でしか行われないものとなり、プライマーの ５’１５ｎｔは鋳型に対して正確に相同でなければならない。 出願人は、３’−エキソヌクレアーゼの有益な効果が、ある古細菌ＤＮＡポリ メラーゼ等の、有意味的な（この定義は生化学的に分析可能ということである） ３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈する１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ（ここで はＥ２と呼ぶ）が意外にも微小に存在することによって得られる一方、有効な伸 長が、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８或いはＡＴ等の、有意味的な３’−エキソヌクレ アーゼ活性をなんら持たない１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ（ここではＥ１と呼 ぶ）が大量に存在することによって触媒作用を受けることを発見した。ＤＮＡポ リメラーゼの配合又は混合物の少量成分としては、上述した、３’−エキソヌク レアーゼＤＮＡポリメラーゼの信頼性に欠ける点及び無効力な点が、実質的に緩 和されていたり、無くなっていたりする。更に、３’−エキソヌクレアーゼが誤 対合を除去して誤対合での一時減衰（ｐａｕｓｉｎｇ）を無くすと考えられるた め、結果として生成したＤＮＡが呈する塩基対の変化はより少なくなり、それに よって、忠実度、特異性及び効率を犠牲にすることなくＰＣＲの突然変異誘発が 減少して有用なものとなる。実際には、２０００もの高いＫｌｅｎｔａｑ−２７ ８／Ｐｆｕ単位比についてさえ、組合せが呈する増幅の効率は非常に増加する。 大抵の使用分野については、ＤＮＡポリメラーゼの混合物は、増強された生成物 長さ及び収率が得られるまでは少なくとも約４：１のＥ１のＥ２に対する相対Ｄ ＮＡポリメラーゼ単位比でなければならない。ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを配合 に使用した場合、その比は、プライマー−鋳型の組合せにある程度左右されるが 、Ｐｆｕ１部（単位）につき８０〜１００部のＫｌｅｎｔａｑ−２７８の範囲に あることが好ましく、さらに好ましくは、約１５０〜約１７０：１であり、最も 好ましいのは、約１６０：１である。同様の比は、ＰｆｕとＫｌｅｎｔａｑ−２ ９１の混合物についても好ましい。 Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８又は２９１と組み合わせて使用する際にＰｆｕの代わ りにＤｅｅｐ Ｖｅｎｔを使う場合では、殆どの使用分野において最も好ましい Ｅ１のＥ２に対する比は、約４５０〜約５００：１に増大する。また、Ｅ１とし て無損失（ＷＴ）Ｔａｑ又はＡｍｐｌｉｔａｑが含まれている場合、その最も好 ましいＰｆｕ又は他のＥ２成分に対する比は、Ｅ１のＥ２に対する比が約１０〜 約１５：１の範囲にある場合である。 この発明のＥ２には、Ｐｆｕ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｔ７コリファージ、Ｔｍ ａ又はその組合せからの遺伝子によってコード化されたＤＮＡポリメラーゼが含 まれるが、これに限定されるものではない。この発明のＥ１には、突然変異体、 Ｅ２ ＤＮＡポリメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼ陰性形体、或いは、Ｔａ ｑ、Ｔｆｌ又はＴｔｈ或いはその組合せからの遺伝子によってコード化されたＤ ＮＡポリメラーゼ等の、突然変異していない形体の中で有意味的な３’−エキソ ヌクレアーゼ活性を示さないＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これに限定され るものではない。 以下に述べるように、この発明のＤＮＡポリメラーゼ配合も、Ｅ１がシークエ ナーゼ等の逆転写酵素からなるＤＮＡポリメラーゼの配合を含んでいる。 この発明の配合の更なる例として、Ｅ１がＴ７又はＴ３ ＤＮＡポリメラーゼ の突然変異体或いは化学的な修飾を含み又はそれから構成され、Ｅ２が野生型Ｔ ７又はＴ３ ＤＮＡポリメラーゼを含み又はそれから構成されている混合物、或 いは、別の変形として、Ｅ１が、何ら有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性 を持たないＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｅｘｏ^-としてＮｅｗ Ｅ ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから販売されている）を含み又はそれから構成さ れ、また、Ｅ２がＶｅｎｔを含み又はそれから構成されているものがある。 ここで発見された原理、即ち、３’エキソヌクレアーゼを持たないＤＮＡポリ メラーゼによりプライマーの伸長を行う間に低レベルの３’エキソヌクレアーゼ を使用するということは、標準温度インキュベーション（即ち、非耐熱性ＤＮＡ ポリメラーゼを使用すること）、及び、３’−（校正）エキソヌクレアーゼを持 たないことが知られている逆転写酵素（Ｂａｔｔｕｌａ及びＬｏｅｂ、１９７６ 年）を含む、一般的なＤＮＡポリメラーゼのプライマーエクステンション法に適 用できる。前者の例は、主成分の酵素としてシークエナーゼ（ｅｘｏ^-）を使用 し、少量成分として野生型Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ｅｘｏ⁺）又はクレノウ・ フラグメントを使用することである。後者の例は、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｏ ｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）又はＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉ ａ Ｖｉｒｕｓ）の逆転写酵素を主成分とし、クレノウ・フラグメント、Ｔ７Ｄ ＮＡポリメラーゼ、あるいは、Ｐｆｕ又はＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ等の耐熱性ＤＮＡ ポリメラーゼを少量成分として使用することである。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ はこれらの逆転写酵素によって使用される３７度及び４２度の温度では活性がよ り低くなるため、ＰＣＲにおいて使用する場合よりも必要と思われるレベルは高 くなりやすい。クレノウ・フラグメントＤＮＡポリメラーゼは、鋳型としてＲＮ Ａを使用する際には好ましいＤＮＡポリメラーゼではないが、特に、付加したＭ ｎイオンの存在下で、この鋳型（Ｋａｒｋａｓ、１９７３年；Ｇｕｌａｔｉ，Ｋ ａｃｉａｎ 及びＳｐｉｅｇｅｌｍａｎ、１９７４年）を認識する作用を行う。 付加したＭｎイオンは、（先行技術では）残念ながらｅｘｏ⁺成分の恩恵を受け ることなく、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＴｔｈによって逆転写を行うために型通 りに使用される。逆転写酵素反応にｅｘｏ⁺成分を使用するについては、ｅｘｏ⁺ 成分がＲＮＡｓｅに完全に汚染されていない状態にするように特別な注意が必要 であることを強調しておかなければならない。 次の参考文献には、逆転写酵素を使用する技術分野において周知である方法が 記載されており、これらを参考文献として本願明細書の一部とする。 バッツラ（Ｂａｔｔｕｌａ Ｎ．）氏、ロエブ（Ｌｏｅｂ ＬＡ．）氏 ＤＮ Ａ複製の忠実度について。トリ骨髄芽球症ウィルス（ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂ ｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼにおけるエキソデオキシリ ボヌクレアーゼ活性及びエラー補正機能の欠如。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５１（４）、９８２−６、１９７６年 ２月２５日。 グラチ（Ｇｕｌａｔｉ ＳＣ）氏、スピーゲルマン（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ Ｓ．）氏 ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとしてＤＮＡポリメラーゼＩを使用 するための条件。Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔ ａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ７１（４）、１０３５−９、１９７４年４月 。 カーカス（Ｋａｒｋａｓ ＪＤ．）氏 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ ｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩによる逆転写。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ７０（１２）、３８３４−８、１９７３年１２月。 ポリメラーゼ活性がなく３’−エキソヌクレアーゼ活性しか持たないＤＮＡポリ メラーゼ： 出願人は、特殊な理論に限定するわけではないが、少量（Ｅ２）成分の酵素活 性は、３’−エキソヌクレアーゼ活性であってＤＮＡポリメラーゼ活性ではない と考える。実際、このＤＮＡポリメラーゼ活性は、少量成分ではなく主要（Ｅ１ ）成分に最適な条件下で望ましくない合成あるいはあまり正確ではない合成を生 じさせる厄介なものとなりえるとも考えられる。Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ の「領域Ｉ」ＤＮＡ変換ＤＮＡポリメラーゼのモチーフを突然変異させたバーナ ード（Ｂｅｒｎａｄ）氏、ブランコ（Ｂｌａｎｃｏ）氏及びサラス（Ｓａｌａｓ ）氏のＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのＹＣＤＴＤＳアミノ酸モチーフのサイト 指向性突然変異誘発（Ｇｅｎｅ ９４、４５−５１（１９９０年））に教示され ている様に、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の領域III又は領域Ｉのいずれか に突然変異が起こり、それらは、ウエモリ（Ｕｅｍｏｒｉ，Ｔ．）氏、イシノ（ Ｉｓｈｉｎｏ，Ｙ）氏、トウ（Ｔｏｈ，Ｈ．）氏、アサダ（Ａｓａｄａ，Ｆ）氏 及びカトウ（Ｋａｔｏ，Ｉ．）氏によって（古（ａｒｃｈａｅｏｎ）Ｐｙｒｏｃ ｏｃｃｕｓ ＦｕｒｉｏｓｕｓからのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の機構とヌクレ オチド配列、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１、２５９−２６５（ １９９３年））配列決定された。 この発明の更に別の実施例では、野生型形体において３’−エキソヌクレアー ゼ活性を呈し、かつ、上記した１以上のＤＮＡポリメラーゼの３’−エキソヌク レアーゼ活性を無くしてはいないが実質的に低減させた温度サイクル型ポリメラ ーゼ連鎖反応に触媒作用を与えることが出来る、少なくとも１つのＤＮＡポリメ ラーゼを含み或いはこれから構成されているＤＮＡポリメラーゼの配合が提供さ れている。低減した３’−エキソヌクレアーゼ活性は、突然変異によって、又は 、当業者には周知である化学的又はその他の手段によって得られる。その際、Ｄ ＮＡポリメラーゼの配合を、ＰＣＲ増幅においてプライマーエクステンションに 触媒作用を与えるために使用してもよい。また、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ及びＤｅｅｐ ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼを含むアルファ類の遠縁のＤＮＡポリメラーゼを 研究しているスペインの研究者（ソエンガス（Ｓｏｅｎｇａｓ，Ｍ．Ｓ．）氏、 エステバン（Ｅｓｔｅｂａｎ，Ｊ．Ａ．）氏、ラザロ（Ｌａｚａｒｏ，Ｊ．Ｍ． ）氏、ベルナッド（Ｂｅｒｎａｄ，Ｓ．）氏、ブラスコ（Ｂｌａｓｃｏ，Ｍ．Ａ ．）氏、ルサラス（．ｌ Ｓａｌａｓ，Ｍ．）氏及びブランコ（Ｂｌａｎｃｏ， Ｌ．）氏、Ｅｍｂｏ Ｊｏｕｒａｎｌ １１、４２２７−４２３７（１９９２年 ））も、３’−エキソヌクレアーゼ領域の突然変異を識別及び立証し、さらに、 （１又は複数の）ＤＮＡポリメラーゼモチーフが突然変異している間に分離し容 易に回避した。この同じ報告において、彼らは、保存Ｔｙｒ残基をＰｈｅ又はＣ ｙｓに変えることによってエキソヌクレアーゼを４〜７％の活性に低減すること が出来る一方、保存ＡｓｐをＡｌａで置換することによって０．１％だけの活性 に低減することが出来ることを立証している。長く正確なＰＣＲについては、Ｐ ｆｕ、Ｖｅｎｔ又はＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで生じる に最適なｅｘｏ^-（３’−エキソヌクレアーゼ陰性）突然変異は、エキソヌクレ アーゼを消去はしないが低減するものであり、例えば、野生型ＤＮＡポリメラー ゼの３’−エキソヌクレアーゼ活性の、０．２〜７％、好ましくは０．５〜７％ 、最も好ましくは１〜７％までの低減となる。 突然変異を導入する別の方法として（及び上記のＢｔ Ｃｒｙ Ｖ遺伝子例に ついて実証するように）、Ｋｌｅｎｔａｑ−ＬＡ、この発明が２つの相同ＲＥＧ ＩＯＮ III及びＲＥＧＩＯＮ Ｉに対するＤＮＡ配列コード化に及ぶ小さなＰ ＣＲ生成物に変化を導入するために使用される。この変化は、ＭＡＣＡＷコンピ ュータ・プログラムの助けを借りて以下に示す保存モチーフをガイドとして使用 して、ＲＥＧＩＯＮ III及び／又はＲＥＧＩＯＮ Ｉの保存アミノ酸を変化さ せるように選択される。 出願人は、（表示しないが、上記のように例１に相似であり、当業者によって 容易に実行されるデータの詳細）ガイドとしてウエモリ（Ｕｅｍｏｒｉ）氏他に よって公表された配列を用いて、ＰｆｕＤＮＡからのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ 遺伝子のＯＲＦをＰＣＲ増幅した。上記例２に相似的に、このＯＲＦを、Ｋｌｅ ｎｔａｑ−２７８の発現に使用したように同じ発現ベクターにクローニングし、 また、ＤＮＡポリメラーゼが上記例３にてＫｌｅｎｔａｑ−２７８に対してここ に述べたと同じ手法で精製可能であることを示した。 突然変異を導入する別の（上記ソエンガス氏他によるものに代わる）方法とし て（及び上記のＢｔ Ｃｒｙ Ｖ遺伝子例について実証するように）、Ｋｌｅｎ ｔａｑ−ＬＡ、この発明が２つの相同ＲＥＧＩＯＮ III及びＲＥＧＩＯＮ Ｉ に対するＤＮＡ配列コード化に及ぶ小さなＰＣＲ精製物に変化を導入するために 使用される。この変化は、ＭＡＣＡＷコンピュータ・プログラムの助けを借りて 以下に示す保存モチーフをガイドとして使用して、ＲＥＧＩＯＮ III及び／又 はＲＥＧＩＯＮ Ｉの保存アミノ酸を変化させるように選択される。 以下は、ＤＮＡポリメラーゼ保存モチーフの２つを実行する、コンピュータ・ プログラムＭＡＣＡＷからの番号を付された出力である。また、これら及び他の ＤＮＡポリメラーゼモチーフの有用な発表はパーラー（Ｐｅｒｌｅｒ）氏他によ るＰ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８９、５５７７−５５８１（１９９２年）にも見られる。 次の例によってこの発明を説明する。実施例１ Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８として表される遺伝子の構築 図１にヌクレオチド配列として示す組換えＤＮＡ配列を有するＫｌｅｎｔａｑ −２７８ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み立てる（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）ために 、次の手順に従った。 変異遺伝子は図１の２つの合成ＤＮＡプライマーから用意した（ｐｒｉｍｅｄ ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７，１９８８）を用いて全Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡの０．２５ｕｇから増幅した。 プライマーＫＴ１，配列番号：１は、コドン２８０でスタートする野生型ＤＮ Ａと異体同形であり、このプライマーは生成ａｍｐｌｉｆｉｅｄしたＤＮＡ中に ＮｃｏＩサイトに組込むことを意図している。 プライマーＫｌｅｎｔａｑ３２，配列番号：３，３３ｍｅｒはＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼをコード化する野生型遺伝子の他の鎖 上で停止コドンに及びＨｉｎｄIIIサイトと生成ＤＮＡ中で二重停止コドンに組 込まれる。 ＰＣＲ反応の緩衝剤は２０ｍＭのトリスＨＣｌ ｐＨ８．５５、２．５ｍＭの ＭｇＣＬ₂、１６ｍＭの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１５０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２００ｕＭ のｄＮＴＰよりなる。サイクルパラメーター（ｃｙｃｌｅ ｐａｒａｍｅｔｅ ｒｓ）は２′９５°、２′６５°、５′７２°である。 ＰＣＲ（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，上記）によって導入される突然変異を最 少とするために、ＰＣＲの１６サイクルだけ（ｏｎｌｙ）はフェノール抽出、エ タノール沈殿前に制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄIIIで消化を行った。実施例２ 発現ベクターの調製 生成物ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄIIIフラグメントは、ＮｃｏＩ，ＨｉｎｄIII， そして子牛腸内のアルカリ性フォスファターゼで加水分解（ｄｉｇｅｓｔｅｄ） したプラスミドｐＷＢ２５４ｂ中に分枝した。このプラスミドのバックボーンは 、予め命名されたｐＴＡＣ２で、Ｊ．Ｍａｊｏｒｓによって得られたものであり 、ｐＢＲ３２２（発現の方向が時計の針と反対方向でなく、時計の針方向である も のはアポストロフィー ’を付す）のＰｖｕIIサイトから時計の針と反対方向に 次の元素を導く：１部分のｌａｃＺ’配列、ｌａｃＩ’、ｌａｃＰＵＶ５（配向 は知られていない）、ＰＬ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｐｈａｒｍａｃｉａ− ＬＫＢ；カタログｎｏ．２７−４８８３）からのｔａｃプロモーターの２つの複 写、Ｔ７遺伝子１０プロモーターそしてＮｃｏＩサイト、ＨｉｎｄIIIサイトか らなる修飾した開始コドン、ｔｒｐＡターミネータ（ＰＬｎｏ．２７−４８８４ −０１）、複製のＭ１３オリジン、ｐＢＲ３２２のＡｍｐ ^R遺伝子である。 クローン化遺伝子の発現は０．１ｍＭ ＩＰＴＧによって誘発されるべきである と予想される。 クローニングから起こるアンピシリン耐性コロニーズは、Ｓａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）〔ＧＥＮＥ９７：１１９−２３〕のシングル コロニー耐 熱性ＤＮＡポリメラーゼ測定によって測定した。そして、４ｓｔｒｏｎｇ ｐｏ ｓｉｔｉｖｅｓはトゥースピック（ｔｏｏｔｈｐｉｃｋ）分析（Ｂａｒｎｅｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９５：３９３、１９７７）によって分画（ｓｉｚｅｄ）した 。 これらの１つで、ナンバー２５４．７は二重挿入の小部分を除いて期待した大 きさであった。このプラスミドは、さらにＥ．ｃｏｌｉ Ｘ７０２９中でエレク トロポレーションによって精製され、トゥースピック分析によってサイズを揃え るためにスクリーニングし、そして、二重挿入不純物のない期待したサイズの１ つのプラスミドはｐＷＢ２５４ｂと命名された。このプラスミドはここに述べた Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８の製造に使用されるものである。実施例３ 大量のＫｌｅｎｔａｑ−２７８の精製 プラスミドｐＷＢ２５４ｂは二重（直列反復）のｔａｃプロモーターとＴ７遺 伝子１０リーダー配列、ＡＴＧ開始コドン、グリシンコドン、そしてＴｈｅｒｍ ｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼの２８０−８３２のコドンを持 っていて、停止コドンの直列対はｔｒｐ転写末端に続いている。 このｐＢＲ３２２−ベースプラスミドベクター（Ｊｏｈｎ Ｍａｊｏｒｓから のｐＴａｃ２）はアンピシリン耐性がある。細胞は非常にリッチな培地（下記参 照）の上で成長する。細菌性宿主Ｘ７０２９はラクトースオペロンのＸ７４欠失 を除いて野生型Ｆ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。 培地（Ｍｅｄｉｕｍ）： 水１リッター当り、１００ｍｇのｔｉｃａｒｃｉｌ ｌｉｎ（冷やして加える）、１０ｇのＹ．Ｅ．、２５ｇのトリプトン、１０ｇの グルコース、ＮａＣｌではない１０ＸＭ９塩（４２ｍＭのＮａ₂ＰＯ₄、２２ｍＭ のＫＨ₂ＰＯ₄、１９ｍＭのＮＨ₄Ｃｌ）からなる。 グルコースと１０ＸＭ９を一緒にしオートクレーブに入れないで、それらを１ つづつ分けてオートクレーブに入れ、後で混合する。 ５ＭのＮａＯＨ（約１ｍｌ）でｐＨ８に調節する。ＯＤ₅₅₀＝１または２で０ ．１ｍＭのＩＰＴＧを加え、３０℃で充分に振とうする。ＯＤ＝２から８〜１０ に達してから半時間毎に次のことを行う。 １．ｐＨ ｓｔｉｃｋｓ５〜１０でｐＨを読み取る。５ＭのＮａＯＨでｐＨ８ ．５に調節し、ｐＨが８以下に下がったときはいつでも（リッター当り２〜５ｍ ｌで）ｓｗｉｒｌｉｎｇする。 ２．ＯＤ₅₅₀を通常１／１０あるいは１／５０希釈液として読み取り、記録す る。 ３．このグルコースの付加は、任意であり、必ずしも何らかの価値のあるもの ではない（この時期にこの問題の評価は不十分である）。グルコースｓｔｉｃｋ でグルコースレベルを読み、もしレベルが０．２％以下に落ちていたら付加物０ ．５％（５０％の１０ｍｌ）を加える。 もし、その添加が遅れるなら、細胞は最後のｐＨ調節後一晩中３０℃で振とう することができる。 代わりに、もしそれらが数時間で充分に成長しないならば、冷たい室内それら を置いておく。 細胞は、例えばＧＳ３ローターにて８ｋｒｐｍで８分間遠心分離することで濃 縮する。上澄みを洗い流し、同じペレット上にゆっくりした回転で培養液を加え る。 細胞の破壊と溶解（Ｌｙｓｉｓ）： パックした細胞のｇ重量の２倍に等しいＴＭＮバッファー（５０ｍＭのトリス −ＨＣｌ ｐＨ８．５５、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１６ｍＭの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄） のミリリッターに細胞を再懸濁する。 細胞懸濁液の各３００ｍｌに６０ｍｇのリソチームを加え、１５分間時々ｓｗ ｉｒｌｉｎｇしながら５〜１０℃で細胞を培養する。それから、ＮＰ４０あるい はＴｒｉｔｏｎＸ１００を０．１％、Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％、各々に１０％ 溶液の１／１００容積付加の形で加える。それから細胞懸濁液を煮沸水浴中でｓ ｗｉｒｌｉｎｇしながら急速に８０℃まで加熱し、細胞（素早く抽出物となる） を２０分間、８０〜８１℃に維持する。 温度を測定するために細胞内にきれいな温度計を用いる。フラスコの口縁まで 一様に十分な熱処理が得られるようにするために、フラスコや浴は確実に覆うべ きである。この処理の後、少量の酵素を除いた殆どを不活性とすることを期待し て、抽出物を３７℃あるいはそれ以下に氷浴で冷却し、それから２ｍｌのプロテ アーゼ阻害剤（イソプロパノールに溶かした１００ｍＭのＰＭＳＦ）を加える。 この点に進んでから、フラスコや撹拌棒や他のものでの混合、もしくはオート クレーブに入れられていない溶剤を接触させようとしてはいけない。 （デタージェントとＢＭＥはオートクレーブ処理できない。ＰＥＩと硫酸アンモ ニウムもまたオートクレーブ処理されない。）オートクレーブする目的は、微生 物汚染を避けるだけでなく、ＤＮＡあるいはヌクレアーゼによる汚染を避けるた めである。 遠心分離機の容器に分配し２℃で遠心分離する（例えば、Ｓｏｒｖａｌ ＳＳ −３４ローターでは１５ｋｒｐｍで３０分、あるいはＧＳ３ローターでは４ｋｒ ｐｍで１４時間である）。上澄みはフラクションＩと呼び、ＤＮＡポリメラーゼ 活性度に対する測定ができる。 高−塩ＰＥＩ沈殿 フラクションＩを０．２５ＭのＮａＣｌ（リッター当り１４．６ｇ加える）に 溶かしたのち、５％のポリミン−Ｐ（ＰＥＩ，ポリエチレン−イミン，Ｓｉｇｍ ａ）を核酸を沈殿させるために氷上で撹拌しながら滴状に加える。 十分なポリミン−Ｐが加えられたことを確認するために、そして必要最少量以 上の添加を避けるために、ポリミン−Ｐの一滴の添加によって遠心分離した抽出 物１／２ｍｌをテストし、多量の沈殿物が生ずる時は、大部分の抽出物に多くの ポリミン−Ｐを加え、よく混合して再テストする。抽出物の試験結果を汚すこと なく容器に戻す。 十分にＰＥＩが加えられたことを確認するために、遠心分離物３ｍｌと１／２ ｍｌアリコート中に上澄みをアリコートする。５％のＰＥＩを０、２、４、６あ るいは１０ｕｌ加える。氷の上において振とうし、そして冷たい中で遠心分離し た。これらのアリコート上澄みの１５ｕｌを臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を含むアガロースゲル上に載せ、青色素が２ｃｍに及ぶまで 電気泳動する。上澄みにＤＮＡあるいはＲＮＡを検出するためにＵＶ光ボックス 上でゲルを詳しく調べる。大部分の抽出物に対しては、アガロースゲルテストに よる全てのＤＮＡを除去するために最少必要量以上の過剰の５％ＰＥＩを約１／ １００容積（即ち、３００ｍｌの抽出物に対して２〜３ｍｌ）使用する。 少なくとも１５分冷中で撹拌する。それから抽出物の遠心分離を行って大部分 の核酸を除去する。上澄みはペレットの少しの痕跡も避けるように保つ。 伝導度が下がるまでＫＴＡバッファーでＰＥＩ上澄みを希釈する、あるいは２ ２ｍＭの硫酸アンモニウムを加えることでＫＴＡバッファーの伝導度を低下させ る。（ＫＴＡに純正の２２ｍＭ Ａ．Ｓ．の類似の希釈液に比べて１／４０の希 釈液を加えて伝導度をチェックする）。通常これは約５倍の希釈液である。 Ｂｉｏ−Ｒｅｘ７０（Ｊｏｙｃｅ＆Ｇｒｉｎｄｌｅｙで用いた）（Ｊｏｙｃｅ ，Ｃ．Ｍ．＆Ｇｒｉｎｄｌｅｙ，Ｎ．Ｄ．Ｅ．（１９８３）Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮ Ａポリメラーゼの多くのタンパク質分解フラグメントを過剰に生産するプラスミ ド構築、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０，１８３０ −１８３４）によるクロマトグラフィーは不成功（結合しない）であるが、それ なしでは次のカラム（ヘパリンアガロース）が効率的に作用しないであろうから 止むを得ない。我々はＢｉｏ−ＲＥＸ７０ステップの重要な作用が幾つかのタン パク質をよく除去することができるけれども、過剰のＰＥＩを全て除去すること であると信じている。ＣＭ−セルロースはＢｉｏ−Ｒｅｘ７０に対する代用物で はない。 希釈したＰＥＩ上澄みにそれに釣り合うＢｉｏ−Ｒｅｘ７０を通す（１００ｇ 細胞当り１０ｍｌ）。ポリメラーゼ活性は流れ通ってしまう。２カラム容積の２ ２ｍＭ Ａ．Ｓ．／ＫＴＡでカラムを濯ぐ。我々の手順は、Ｂｉｏ−ＲＥＸ７０ をカラムに直接流すようにして次のようなヘパリンアガロースカラムをセットア ップする。 ヘパリンアガロースクロマトグラフィー（室温、フラクションをそれらが離れ るように氷上に置く）。 ヘパリンアガロース（シグマ；細胞の１００ｇ当り１０ｍｌ〔これはヘパリン アガロースを非常に少なくできる〕。）の上にＢｉｏ−Ｒｅｘをゆっくり流し入 れて充填する。ＫＴＡ＋２２ｍＭ Ａ．Ｓ．の数カラム容積分、それからＫＴＡ ＋６３％グリセロール＋１１ｍＭ Ａ．Ｓ．の３カラム容積分で洗浄する、それ からＫＴＡ＋６３％グリセロール＋２２２ｍＭ Ａ．Ｓ．＋０．５％Ｔｈｅｓｉ ｔ（これは最終溶離のためのＴｈｅｓｉｔである）で純粋な酵素を溶離する。 ポリメラーゼ活性あるいはＯＤ₂₈₀／（２２２ｍＭでスタート後１つのカラム 容積の２／３でスタートする、それはおよそ２カラム容積分の広さである）のピ ークをプールする。−２０℃でプールを貯蔵する。 貯蔵バッファーは混成物であり、僅かな変異体である、即ち、Ｐｅｒｋｉｎ− Ｆｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓにより推薦されるＡｍｐｌｉＴａｑ貯蔵バッファー、Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍが用いたＴａｇ貯蔵バッファー：５０％ グリセロール（ｖ／ｖ；６３％ｗ／ｖ），２２２ｍＭ硫酸アンモニウム（ベンチ 強さサンプルに対して約５０ｍＭに希釈）、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８ ．５５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ メルカプトエタノール、０．５％Ｔ ｈｅｓｉｔ）である。 このＴｈｅｓｉｔは幾つかの厚さと曇りを−１０℃以下で引き起こす。これは 害を引き起こすことはないと思われるが、我々は使用に当たってアリコーティン グする前に氷の上で０℃で酵素を温めることを提案する。 Ｔｈｅｓｉｔは２者択一として考えられ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００， ０．５％Ｔｗｅｅｎ２０の化合物に置き換える。 凍結は酵素の活動を阻止することを我々は折々に報告した。問題はこの点にあ る。この問題は現在研究されている。−８０℃での貯蔵（液体窒素で急冷後）は テストされつつあり、そして見込みのあるように思われるが、１回より多い凍結 融解サイクルは数回の酵素調製で有害であった。 ７リッター（１００ｇ細胞）からの酵素の最終収率は、ｍｌ当り（４ｘベンチ 強さ）１２０，０００ユニットの濃度で２８ｍｌであった。 １／４ｕｌのベンチ強さの酵素は１００μｌ反応において２ｋｂスパンのＤＮ ＡのＰＣＲを支持する。鋳型は５〜１０ｎｇのプラスミドＤＮＡである。各サイ クルは１ｍｉｎ９８℃、１ｍｉｎ６５℃、６ｍｉｎ７２℃である。サイクル数は １６〜２０である。より小さい酵素はより小径の生成物（５００ｂｐに対して１ ／８ｕｌ）のために必要であり、より大きい酵素はより大きな生成物（５ｋｂに 対して１ｕｌ）に必要である。 ＫＴＡバッファー １リッター当り ２０ｍＭ トリス８．５５ １０ｍｌの２Ｍ １０ｍＭ ＢＭＥ ０．７ｍｌ ニート １０％ ｗ／ｖグリセロール １００ｇ ０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ０．２ｍｌの０．５Ｍ ０．１％ ｗ／ｖ Ｔｈｅｓｉｔ １０ｍｌの１０％ ラフなＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ分析 １Ｘ ＰＣ２ バッファー（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．５５、２． ５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１００ｕｇ／ｍｌ ＢＳＡ） ２００〜２５０ｕｇ／ｍｌ活性化したサーモン（ｓａｌｍｏｎ）スペルム（ｓ ｐｅｒｍ）ＤＮＡ ４０ｕＭの各ｄＮＴＰ＋ｍｌ当り１０〜５０ｕＣｉα−³²Ｐ−ｄＡＴＰ 氷の上の２５ｕｌの分析混合物に未希釈のあるいは８ｕｌの１ＸＰＣ２バッフ ァー（あるいはその１／５または１／２５希釈物）で希釈した０．２ｕｌの酵素 断片を加える。標準ＫｌｅｎｔａｑあるいはＡｍｐｌｉｔａｑ、ゼロ酵素とイン プットする全試料を準備する。７２℃で１０分インキュベートし、それから冷や す。濾紙上に５あるいは８ｕｌスポットし、５〜１０分で２回５％ＴＣＡ，１％ ＰＰで洗う。 若し、数枚の紙を用いる時は、セレンコフ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ）放射線あるい はハンドモニターでそれぞれカウントする。若し、１枚の三ＭＭ紙を使用したと きは、６０′でオートラジオグラフする。 ２ｋｂ生成物を得るためのＰＣＲ分析 ５０ｎｇのプラスミドｐＬｃ（とうもろこし（ｍａｉｚｅ）からのＲ色対照ｃ ＤＮＡのクローン（ｃｌｏｎｅ）ＰＮＡＳ ８６：７０９２；サイエンス（Ｓｃ ｉｅｎｃｅ）２４７：４４９））を含む１ｍｌのＰＣＲ反応物を調合し、プライ マーＬｃ５（配列番号：１１）およびＬｃ３（配列番号：１２）、ＰＣ２ バッ ファーと２００ｕＭのｄＮＴＰのそれぞれ２００ｐモルを加える、しかし酵素は 加えない。 チューブの１つのなかに１００ｕｌを、そして残りの８〜１０のチューブのな かに５０ｕｌを分配する。チューブの１つにＫｒｅｎＴａｑのファイナルプール （ｆｉｎａｌ ｐｏｏｌ）１ｕｌを加え混合する。それから、５０ｕｌの２つの チューブを切り離し、それを混合し、２段階で減少しつつある量の酵素を加える 。各５０ｕｌの反応物に鉱油、スピンの１滴を加えて蓋をし、そして２′９５° 、２′６５°、５′７２°でＰＣＲ１６をサイクルする。 最終的なＫｌｅｎｔａｑ−２７８酵素のベンチ長さ ２２２ｍＭの硫酸アンモニウムを含む６３％グリセロール／ＫＴＡ（．５％Ｔ ｈｅｓｉｔ）バッファーを用いながら、ＰＣＲによる２ｋｂスパンの増幅をその １／４ｕｌを触媒として用いてプールを慎重に希釈する。硫酸アンモニウム濃度 は５０ｍＭ以下に減少させない。貯蔵は−２０℃である。実施例４ ＤＮＡ増幅 図３にレポートしたように、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリ メラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ）（先行技術、ＤＮＡポリメラーゼ）とＫｌｅｎｔ ａｑ−２７８を用いて導かれた２ｋｂのＤＮＡ生成物を作るためにＰＣＲ増幅を 測定する。ポリメラーゼの耐熱性をテストするために、温度を上げ、ＰＣＲ増幅 反応のＤＮＡ変性段階を等級別にした濃度のＤＮＡポリメラーゼを用いながら、 それぞれ２分で９７℃、９８℃、９９℃で導いた。 増幅手段は、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７， １９８８によって概要が述べられた増幅する核酸配列のための、おおよそ次のよ うなプロトコルを用いた。１００ｎｇのプラスミドｐＬＣ，プライマーＬｃ５（ 配列番号：１１）とＬｃ３（配列番号：１２）の夫々２００ｐモル、反応バッフ ァー（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．５５、１６ｍＭの硫酸アンモニウム 、２．５ｍＭのＭｇＣｌ₂および１５０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ）、２００ｕＭのｄ ＮＴＰを含有する１ｍｌの反応混合物を準備した。酵素は用いない。反応混合物 の１００ｕｌはチューブの中においた。それから、ＡｍｐｌｉＴａｑとＫｌｅｎ ｔａｑ−２７８の割り切れる数を加え、そしてＰＣＲの２０サイクルを行った（ ｕｎｄｅｒｔａｋｅｎ）。 図３は実用の耐熱性限界を比較するために行った実験の結果を示すものである 。３枚のパネルの間で示される唯一の違いは、２分、変性段階：９７℃、９８℃ 、９９℃の温度である。酵素濃度の範囲は効果的なＰＣＲ触媒活性度の上に小さ な効果を検出するために用いた。 鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）は１０ｎｇのｐＬｃ（とうもろこしからのＲ色対照 ｃＤＮＡのクローン）。ＰＮＡＳ ８６：７０９２，サイエンス２４７：４４９ ））である。プライマーはＬｃ５（配列番号：１１）とＬｃ３（配列番号：１２ ）である。この反応の他の詳細は実施例３の測定の項に与えられている。 この実験において、９８℃がＫｌｅｎＴａｑ−２７８に対して損害が検出され ず、なおかつＡＴはこの温度で殆ど完全に不活性になるということを見ることが できる。 図４に示す実験において、４つの酵素（ＡＴ，ＫｌｅｎＴａｑ−２７８，ＳＴ ，ＫｌｅｎＴａｑ−２９１）のそれぞれの９８℃での耐熱性のテストを行った。 それぞれを２つのファクターによって異なる２つの濃度の対（ペア）にしてテス トした。現実の酵素調製の容量はｕｌにて上記各レーンに示した。使用した量は 、活性度において２倍のドロップオフ（ｄｒｏｐ−ｏｆｆ）を検出したように、 前以て滴定で調節した（実施例３と図３における凡例で２ｋｂのＰＣＲ測定のた めに記述したようにして導いた。）９５℃で対照ＰＣＲを機能させるために多量 のＳＴを必要とする。前述のこの実験の試み（データは示していない）は、ＳＴ の１／４量のみを用いた（ＳＴはＫＴ−２９１とＫＴ−２７８を比較した同等標 準ＤＮＡポリメラーゼ導入ユニットである）が、生成物は得られなかった。実施例５ 単コロニーＰＣＲ ＰＣＲによるシングルＥ．ｃｏｌｉの分析は、クローニングあるいはリクロー ニング中に所望するＤＮＡフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の存在および／ま たは配向を決定するための都合のよいスクリーン（ｓｃｒｅｅｎ）である。先行 技術において、細菌はそれらがＰＣＲにとって鋳型となるべきプラスミドＤＮＡ を解放するために十分に有効なリーゼ（ｌｙｓｅ）でないことが明らかなので、 完全なＰＣＲ反応に対して容易に加えることはできない。その代わりとして、そ して厄介な全く余分のラベル付きテストチューブを必要とするので、細菌は最初 に水で懸濁し、バッファーなしで任意に、しかし推薦された（Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ ）キレート樹脂の存在下で数分間（１０のような）１００℃に加熱する。 それから加熱した細菌懸濁液の１〜１０ｕｌを別の反応容器に加える。それから このＰＣＲ反応を循環し、普通に分析する。 ここに改良は、各ＰＣＲサイクルの変性段階中、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は９ ８〜９９℃を凌ぐことがあるので、細菌は直接加えることができ、そして完全な （Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８酵素を含んでいる）ＰＣＲ反応にとって都合がよく、 それからさらに予備処理することなくＰＣＲサイクリングを開始することができ いるということである。普通のＰＣＲサイクリングと唯一異なるのは十分な９８ ℃（２分）あるいは９９℃（１分）の温度がＰＣＲの各変性段階（あるいは少な くとも最初の５〜１０段階）中で用いられることである。図５における実験では 全２５サイクルに対して９８℃で２分を使用し、そしてこの方法では１０′１０ ０℃の分離処理を利用するこれまでの方法よりもっと強靭で確実に区別した生成 物バンドが与えられることを示している。この改良はＡＴ酵素が９８℃（図３お よび４に示すように）で不活性化されるので、ＡＴ酵素と一緒には行うことはで きない。 図５はコロニーＰＣＲの標準９５℃の温度と比較した９８℃での変性段階の利 益の実例を示すアガロースゲルの写真である。レーン１と３はＰＣＲ反応への付 加の前に１００℃で１０分間、蒸留した水で細菌の先行技術の予備処理を行った ものである。レーン２と４は、都合よくこの段階を免除して同じ量の細菌懸濁液 （約２〜４Ｘ１０⁶細胞、しかし同一容量の同じ細菌懸濁液）を完全なＰＣＲ反 応（バッファー、トリ燐酸塩、プライマーそして酵素ＫｌｅｎＴａｑ−２７８） に単に導入したものである。レーン１と２は標準９５℃で使用し、レーン３と４ は新たに可能な９８℃変性／細胞破壊温度を用いた。サイクル条件は２５サイク ルに対して９８℃あるいは９５℃で２分、６５℃で２分、７２℃で５′である。 プライマーはＫＴ２（３７ｍｅｒＧＡＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣＡ ＡＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＴＧ ＡＧＧ ＧＧＧ Ａ）とＫｌｅｎＴ ａｑ−３２（図１参照）を使用した。細菌細胞はプラスミドｐＷＢ３１９を含む Ｘ７０２９、ＫｌｅｎＴａｑ−２７８に対する遺伝子のコーディング域を含む広 い宿主範囲のプラスミドを用いた。 レーン４は最も都合のよい、最も効率のよい方法であって、ＫｌｅｎＴａｑ− ２７８の新しい安定性を利用するものである。実施例６ 長いＤＮＡターゲットの効率的で適格なＰＣＲ増幅：（ＰａｒｔＡ） 上式（ＫｌｅｎＴａｑ−ＬＡ）の好ましい具体例： 貯蔵したバッファーに精製した酵素、２．５ｕ．／ｕｌで１ｕｌのＰｆｕ Ｄ ＮＡポリメラーゼ、２５ｕ．／ｕｌで６４ｕｌのＫｌｅｎＴａｑ−２７８を入れ てスタートする。貯蔵は−２０℃である。 大量のＰｆｕは幾らかのＰＣＲ増幅に対して損害を生じ、幾らかに対しては同 等であり、そして幾らかに対しては有益である。Ｐｆｕの最適レベルのテストに ついて、ＫｌｅｎＴａｑ−２７８とともに幾つかの反応を果たすには、左から右 へ７５ｕｌ、２５ｕｌ、２５ｕｌの量の割り切れる数のＰｆｕが必要である。そ して多くの付加において所望されるのは２５ｕｌの割り切れる数である。それか ら、３／８ｕｌのＰｆｕ（１００ｕｌ当り０．５ｕｌで当量−これは要望される ところのほぼ最大である）が最も左の７５ｕｌ反応物に加えられ、混合される。 引き続き、２倍の希釈液がチューブの列に沿って左から右に２５ｕｌ＋２５ｕｌ のように作られ、ＫｌｅｎＴａｑ−２７８のみの対照とする最後のものにはＰｆ ｕは加えない。また、Ｐｆｕのみの１／２あるいは１ｕｌ（１００ｕｌ当り）も 行う。 反応バッファーは上記のようなＰＣ２であって、各２００ｕＭのｄＮＴＰで補 足され、そして８００ｕＭのＭｇＣｌ₂（トータルＭ⁺⁺３．３ｍＭ）、反応容量 の１００ｕｌ当り各プライマーＭＢＬ（配列番号：７）とＭＢＲ（配列番号：８ ）の２０ｐモルと損なわれていないファージλｐｌａｃ５の３０ｎｇを加える。 反応容量の１００ｕｌ当り、１あるいは１／２ｕｌのＫＴＬＡが酵素の効率的な レベルである。 適当なＰＣＲサイクリング条件は２つの温度である：それは２０サイクルに対 し、９４℃で２０秒、７０℃で１１分である。２つの温度を含む交互のサイクリ ング条件９８℃で１分と６５℃で１０分をＰＣＲに適用した。臭化エチジウムで 着色することによって生成物分析のためにアガロースゲルの上に１０〜１６ｕｌ を入れた。他の詳細と変異は図６を参照されたい。鋳型はλｐｌａｃ５であり、 これはＥ．ｃｏｌｉゲノムのｌａｃオペロン領域の部分に運ばれる。３０ｎｇの ＤＮＡは反応容量の各１００ｕｌに含まれていて、そっくりファージ粒子として 導入される。プライマーは野生型ラムダＤＮＡと同族体であり、ｌａｃＤＮＡで はなくλＤＮＡを拡大する。プライマーＭＢＬＮｏ．８７５７（５’ヌクレオチ ド組合わせ塩基対２７９１４のλＤＮＡ）はＧＣＴ ＴＡＴ ＣＴＧ ＣＴＴ ＣＴＣ ＡＴＡ ＧＡＧ ＴＣＴ ＴＧＣ（配列番号：７）である。 プライマーＭＢＲＮｏ．８８３５（５’ヌクレオチド組合わせｂｐ３４５７０ のλＤＮＡ）はＡＴＡ ＡＣＧ ＡＴＣ ＡＴＡ ＴＡＣ ＡＴＧ ＧＴＴ Ｃ ＴＣ ＴＣＣ（配列番号：８）である。従って増幅した生成物の大きさは６６５ ７ｂｐであると断定される。 図６Ａと６Ｂに示すように、各ＤＮＡポリメラーゼ酵素（ＫｌｅｎＴａｑ−２ ７８あるいはＰｆｕ）のみは弱い生成物バンド（幾つかの反応を除いて、Ｐｆｕ のきは少しも作用しない時）に対してのみ生ずるが、それ自身触媒の働きをする ことができる酵素より２０〜５０倍強い生成物バンドに対しては全て結合を生ず る。 図６Ｃの右から２番目のレーンは１ｕｌのＫｌｅｎＴａｑ−２７８（１ユニッ トに対する割合１／６４０）に対して１／６４ｕｌのＰｆｕの少量を加えること で驚くべき結果を示している。データは示されていないが、１／２００ｕｌ（ユ ニットに対し１／２０００）のＰｆｕ少量がこの増幅テストの効率の改良に顕著 に寄与する。 ベント（Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼは類似の機能性のために１０倍以上の 量（しかしまだ少量）が要求される。 加うるに、ＰＣＲ反応における有利なそして期待しない特性はＫｌｅｎＴａｑ −ＬＡによる触媒作用が驚くべきことで、決してＰＣＲ生成物バンドに対する前 もって観察した強烈で鋭いというほどではない。ある程度までこの増加した収量 は撮影した写真の中央のバンド部に暗い領域として明らかにされている。エチジ ウム蛍光によるこの暗い領域はバンドの外側部分におけるＵＶ吸収によるものと 思われ、ポテンシャルＵＶ−活性の蛍光で減少する。このシステムは先行技術か らした時、生成物の大きな収量の増加を明白に認めており、そしてこれは生成物 の広い汚れを作りだす傾向にあり、そして増幅がこの評価を続けた時、副生物の 量を増加させる。実施例７ 長いＤＮＡターゲットの効率的で適格なＰＣＲ増幅：（ＰａｒｔＢ） ８．４ｋｂ、１２．５ｋｂ、１８ｋｂの有効な増幅が図７に描かれた実験によ って示された。この実験は、発明の１／６４０ＫｌｅｎＴａｑ−ＬＡ、さらに同 等の好ましい具体例の性能表示を拡大したものである。この増幅は８．４〜１５ ｋｂの大きさの範囲における大いなる成功であり、１８ｋｂにおいても上首尾を 確かめたが１９．７ｋｂの試みに対しては不成功であった。 ８つの異なるＰＣＲ反応が、この実験において行われた。図７に凡例で示すよ うに、鋳型あるいは鋳型の量あるいはプライマーの対におけるお互いの差異が用 いられた。各反応は３つの方法に分けられ、パートＡ，Ｂ，Ｃに別々に循環した 。パートＡとＢの間では、この実験は変性相を９４°で３０サイクルに対して２ ０サイクルの比較を行った。パートＢとＣにおいては、この実験は３０サイクル における９３°と９４°の比較を行った。 この実験は、反応の１００ｕｌ当り１．３ｕｌのＫｌｅｎｔａｑ−ＬＡ（Ｋｌ ｅｎｔａｑ−２７８／Ｐｆｕの比は６４０）を用いた。高酵素が前以ての実験に おいてゲルを入れることができない大異変の生成物合成が想起されたことから、 チャンネル２Ｂと６Ｃにおいてはここで反応生成物が生じるので、ありにも多い 酵素を少量とした。発明で用いている長い（ｌｏｎｇ）ＰＣＲの成長の一般に知 られている段階では約１０％の時間ではこれは僅かな結果が生じている。 条件ＢとＣを比較すると、多少低い変性温度が必要であることは明らかである 。これは９４℃で同じような実験で比較した時間と一致しており、長いＰＣＲ生 成物の収量は、各サイクルの変性段階で９４℃で２、２０、６０、そして１８０ 秒において変性時間の増加につれて減少することがわかっている。これらのデー タはそれが少なくとも１つの弱点であることを示しており、即ち、反応において 最少の耐熱性成分は９４°で不活性となるのである。９４°がＤＮＡポリメラー ゼ活性度とこのＤＮＡに損害を与える低い温度であることが知られているので、 それは不耐熱性の成分ではないと信じられている。本発明でこの点の別の具体例 において、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼは少量の成分として多くの耐熱性ＤＮＡポ リメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼと置き換えられるが、制限はなく、それ は古代細菌株ＥＳ４で知られ、１１４℃以上の温度で成長できるものであり（Ｐ ｌｅｄｇｅｒ，Ｒ．ＪおよびＢａｒｏｓｓ，Ｊ．Ａ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ．１３７（１９９１）、その最大成長温度はＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ （１０３℃；Ｂｌｕｍｅｎｔａｌｓ，Ｉ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｎｎ ａｌｓ ｏｆ ｔｈｅＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５８９：３０１−３１４．） のそれを越えるものである。 図７の実験において、１５ｋｂバンドの最終の強さは、類似サイズのバンドで ３０サイクルにおいてＫａｉｎｚｅ ｅｔ ａｌ上記が得た収量および類似のλ ＤＮＡ鋳型量に２０サイクルのみにおけるものを組み合わせたものである。これ は発明で用意した改良した効率の物差しであり、そしてさらなる結果は、３０サ イクルで発明が触媒とした収量が３０サイクルでこれらの人達が報告した収量を 大きく越えるものである。この２つの方法の効率を測定しての正確な量はまだわ からないが、図７の検査はＫａｉｎｚｅ ｅｔ ａｉが公にした数量に比べると 、１５ｋｂフラグメントの収量は約１００倍高いと見積もられることを示してい る。これはＰＣＲ拡張のおよそ２倍の効率に対応する。実施例８ 長いＤＮＡターゲットの効率的で適格なＰＣＲ増幅：（ＰａｒｔＣ） 材料と方法 ＤＮＡポリメラーゼ。ＤＮＡポリメラーゼ開口（Ｖｅｎｔ）と深部開口（Ｄｅｅ ｐ Ｖｅｎｔ）は新しい英国の生化学研究所から供給されている。ＰｆｕＤＮＡ ポリメラーゼとそのエキソ突然変異体はＳｔｒａｔａｇｅｎｅから２．５ユニッ ト／ｕｌで供給されている。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８はＴａｑＤＮＡポリメラー ゼ（ＷＭＢ，未公開）のＮ−末端欠失変異型である。この欠失終点はＫｌｅｎｔ ａｑ５（１０）とＳｔｏｆｆｅｌフラグメント（３）のそれとの間である。精製 したＫｌｅｎｔａｑ−２７８は２５〜３５ユニット／ｕｌ（約０．７ｕｇ／ｕｌ のタンパク質濃度）で抗体ペプタイド、セントルイス、ＭＯ，ＵＳＡから供給さ れている。１ユニットのＤＮＡポリメラーゼ活性度は７２℃で３０分で１０ｎモ ルのヌクレオチドに導入され、鋳型として活性化した（部分的に退化した）子牛 の胸腺ＤＮＡが利用されている。活性化した子牛の胸腺ＤＮＡは多少はっきりし ない基質であり、構造上ＰＣＲ反応基質とは異なっている。この分析は上のＫｌ ｅｎｔａｑ−２７８の貯蔵濃度にセットしてＰＣＲ−塩基対を測定する一定した 手順を避けた：６５℃で７分のアニーリング／伸長を含むサイクリング条件で、 １０ｎｇのプラスミド基質から２ｋｂ標的スパンの増幅を触媒する（しかし、１ ２ｕｌより少ないことが効率的）のに０．２５ｕｌが効率的であるので、貯蔵し ているＫｌｅｎｔａｑ−２７８の濃度を調節した。 １５／１６ｕｌのＫｌｅｎｔａｑ−２７８＋１／１６ｕｌのＰｆｕＤＮＡポリ メラーゼの混合物はＫｌｅｎｔａｑＬＡ−１６と呼ばれている。 アガロースゲルの電気泳動は装填する色素中にグリセロールに代えて３％のフ ィコルと２〜３ｖ／ｃｍの１ＸＧＧＢ（ＴＥＡ）バッファー〔４０ｍＭのトリス 酢酸塩ｐＨ８．３、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．２ｍＭのＥＤＴＡ〕に０． ７％〜１％のアガロースが使用される。図１１は４秒のスイッチング時間で１％ のアガロースパルス型ＣＨＥＦ（１１）を使用した。各図における標準ＤＮＡフ ラグメントサイズはキロベース（ｋｂ）において２３．１、９．４、６．６、４ ．４ ２．３、２．０、そして０．５６である。また、図１１と１２はλｐｌａ ｃ５標準バンドの全長は４８６４５ｂｐであった。 全アガロースゲルを注ぎあるいは０．５ｕｇ／ｍｌの臭化エチジウムにて着色 し、そしてＵＶ光の下で写真（３５ｍｍＡＳＡ４００，白黒フィルム）かビデオ グラフ（アルファＩｎｎｏｔｅｃｈあるいはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｅａｇｌｅ Ｅｙｅ）に撮った。ゲル写真を印刷したところ、図７と１０の左半分は右半分よ り５０％露光が少なかった。 表１と配列表に載せたＤＮＡプライマー。 λＤＮＡ鋳型。Ｓ．Ｐｈａｄｎｉｓからの贈り物であるλｖａｃＡは蝸牛状のｐ ｙｌｏｒｉ ＤＮＡの細胞傷害遺伝子領域のλＥＭＢＬ４−ベクトルクローンであ る。このＤＮＡは抽出して凍結貯蔵される。他のファージ鋳型ＤＮＡｓλｐｌａ ｃ５（１２）とλＫ１３８（１３）はＣｓＣｌの平衡遠心分離によって精製され たそのままのファージ粒子として加えられ、透析され、そして１ＸＰＣ２バッフ ァーにて希釈される。 長くそして正確なＰＣＲ。２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ２５℃のｐＨ８．５５、 １５０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、１６ｍＭの硫酸アンモニウム、３．５ｍＭのＭｇＣ ｌ₂各ｄＮＴＰよりなるＰＣ２反応バッファー（１０）。上記の２８ｋｂ（ａｔ ３５ｋｂ）を成功させるために、２５℃で水に２０ｍＭのみのトリス−ＨＣｌ成 分を加えて測定したｐＨ９．１に対応させるべく、１．５ｕｌの２Ｍのトリスベ ースを各々の反応液に加えた。反応に有害であるものはｐＨ探査で接触させ、そ こでｐＨを分離アリコートのみについて測定し、２５℃で最終反応物はｐＨ８． ７６であった。反応容量の各１００ｕｌには各プライマー２０ｐモルを含んでお り、そして０．１〜１０ｎｇのファージＤＮＡ鋳型を含んでいる。夫々に２０ｋ ｂ下または２０ｋｂ以上で０．８あるいは１．２ｕｌのＫｌｅｎｔａｑＬＡ−１ ６を加えた。チューブ当りの反応容量は３３〜５０ｕｌであり、プラスチックテ ストチューブの薄壁（ＰＧＣあるいはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）に４０ｕｌの鉱油 を加えた。 ＰＣＲ反応はファージ粒子を引き裂くために、そしてプライマー同族体を完成 するためのλ付着末端の充満を認めるために６８〜７２℃で５分の前保温（ｐｒ ｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）を必要とする末端λのプライマーを利用している。最 適のサイクリング条件は、複合のブロック器具（ロボサイクラー、Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ）で表１に示す範囲を越えて標的長さに依存しながら、サイクル当り９ ９°で３０秒、６７°で３０秒そして６８°で１１〜２４分で段取りした。第２ の最良サイクラーはオムニゲン（ＨｙｂＡｉｄ）で類似のアニーリング／拡張時 間に対してサイクル当り９５°で２秒でチューブ管理の下で段取りした。別の状 態がなければ、ここでの実験の全ては２４サイクルを用いて記録した。 サイクリング温度と時間、熱サイクラー機、厚くそして薄い壁を有するチュー ブ等のような条件の比較結果を記録するために、反応物を１００ｕｌとして調合 し、それからＰＣＲサイクリングに委ねる前に同一の３３ｕｌのアリコート中で 分離した。 表１に対する凡例 整数ベース対で生成物の大きさはＧｅｎｂａｎｋ受入番号Ｊ０２４５９と参考 文献（２１）に記録された配列とλとλｐｌａｃ５の構造から予示されたもので ある。ｋｂの小数点による生成物サイズは、それらの生成物とλＨ３を標準標識 とするλ＋ＨｉｎｄIIIとの比較によって決定される。プライマーの配列は配列 表に与えられている。 メガプライマーはＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（１４）の ＣｒｙＶＩＣＰとしてコーディングされる遺伝子のＥｃｏＲＩサイトとＢａｍＨ １との間の領域に対する同類のゲルー純化した３８４ｂｐＰＣＲ生成物ＤＮＡか らなり、そしてこれらの制限サイトを除去するためにプライマー修飾した。図１ ０おけるＰＣＲ反応は、メガプライマー（３９９ｎｇ）、プライマーＢｔＶ５そ してＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株ＮＲＤ１２（１５）か らの２０ｎｇのゲノミック（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡそして上記図９の記載に 示されている酵素を夫々使用している。サイクリング条件は２０サイクルで９５ °で３０秒、６０°で７分である。 ＨｉｎｄIII消化作用。未分別、全ＰＣＲ反応は１／１０容量の１０ＸＮａＴＭ Ｓ（１Ｘ＝５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭのトリスーＨＣｌ ｐＨ７．７，１０ ｍＭのＭｇＣｌ₂，１０ｍＭのメルカプトエタノール）と２ｕｌ（１０ユニット ）の制限酵素ＨｉｎｄIII，そして５５℃で９０分のインキュベートを行った。 エキソー（ｅｘｏ−）Ｐｆｕのテスト。各１００ｕｌの反応（４０ｕｌのオイル の下で３３ｕｌとしてインキュベートした）は、１ｕｌのＰｆｕＤＮＡポリメラ ーゼ（２．５ｕ．）のみを含む反応６を除いて、純化したファージ粒子として２ ｎｇのλｐｌａｃ５ＤＮＡ、プライマーＭＢＬ−１．７そしてＭＢＲの各２０ｐ モル、反応バッファーＰＣ２および１ｕｌのＫｌｅｎｔａｑ−２７８（０．７ｕ ｇ）を含んでいる。他の詳細は図１２の記述にある。温度条件は９４°で２秒、 ７０°で１１分の２４サイクルである。 本発明のＤＮＡポリメラーゼ混合物を導く発見は、ＰＣＲに不適当な組み合わ せであるＡ−Ａ塩基対でその３’末端を持つプライマーを利用する試みの中から 作られたものである。事実プライマーはそれ自身ＰＣＲ生成物”メガプライマー ”の３８４ｂｐであり、そして不適当な組み合わせＡはＤＮＡポリメラーゼ（１ ６）にふつう非−鋳型末端トランスフェラーゼ活性度を有するＫｌｅｎｔａｑ− ２７８が加えられる。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８（図９、レーン３）もＰｆｕＤＮ Ａポリメラーゼ（図９、レーン１および２、そして他の酵素のレベルは示してい ない）もＰＣＲ−生成物メガプライマーと４２ｍｅｒオリゴヌクレオチドプライ マーの間に横たわっている１５００ｂｐ標的の増幅を触媒することはできない。 しかしながら、２つの酵素の結合は所望する標的フラグメント（図９、レーン４ ）の増幅を十分に触媒することはできる。明らかに、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ は敢えて３’Ａ−Ａを除去し、ＰＣＲの各段階を効率的に続行するために、Ｋ１ ｅｎｔａｑ−２７８を触媒とすることができる。同じ結果はＰｆｕをベントＤＮ Ａポリメラーゼで置き換えることで得られた（データは示していない）。 私は一般に不適当な組み合わせの３’−末端が少数のｋｂより大きな標的のＰ ＣＲ中で能率的でないプライマーを延長させられるという仮説をたてた。テスト システムとして私は、種々の標準状況でＡｍｐｌｉｔａｑ，Ｋｌｅｎｔａｑ−２ ７８あるいはＰｆｕＤＮＡポリメラーゼによって貧弱にではあるが、拡大して検 出しうる６．６ｋｂのλＤＮＡ標的を用いた。１００ｕｌの反応容量当り、１ｕ ｌのＫｌｅｎｔａｑ−２７８を種々の量のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼと結合し、 １／２ｕｌからＰｆｕの１／２００ｕｌまでさげる。Ｐｆｕ群（ｓｔｏｃｋ）（ ２．５ユニット／ｕｌ）はＫｌｅｎｔａｑ−２７８群（２５〜３０ユニット／ｕ ｌ）より少なくとも１０倍少ない濃度であるので、実際のテスト比はＤＮＡポリ メラーゼユニットに対して１／２０〜１／２０００である。 これらのテストの明らかな結果は図６Ｂに示されている。高収量の標的バンド は２つの酵素の結合を全てテストして観察されるが、各酵素の幾つかのレベルは それ自身弱い検出増幅より多く触媒するため失敗することがある。最も低いレベ ルのＰｆｕテストでは１／２００ｕｌで僅かな有益な効果を示す。Ｋｌｅｎｔａ ｑ−２７８対Ｐｆｕ１の外見の最適の割合は容積にして１６あるいは６４であり 、これはＤＮＡポリメラーゼ導入ユニットを基準として約１６０あるいは６４０ である。 ６〜８ｋｂでテストしたとき（データは示していない）、３’−ｅｘｏ^-およ び３’−ｅｘｏ⁺耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの他の結合もまたＡｍｐｌｉｔａｑ ／Ｐｆｕ，Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８／Ｖｅｎｔ，Ｋｌｅｎｔａｑ５（デルタＴａ ｑ，ＵＳＢ）／Ｐｆｕ，Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ／Ｐｆｕ，Ｋｌｅｎ ｔａｑ−２７８／Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（我々の第２の選択）、そしてＰｆｕ ｅ ｘｏ^-／Ｐｆｕ ｅｘｏ⁺を含むとき、効果を示した。たとえ、比較的に少ない試 験で楽観的に実施したとはいえ、他の結合試験はＫｌｅｎｔａｑ−２７８／Ｐｆ ｕと同じ効果はなかった。 非常に短い加熱段階が好適である。次に私はλ導入ファージ鋳型で８．４〜１ ８ｋｂのサイズ範囲でＤＮＡ増幅を企てた。我々の早期のサイクリング原案は９ ５°あるいは９８°で１あるいは２分の変性段階を用いたが、この加熱段階のパ ラメーターを９３°あるいは９４°で２秒あるいは２０秒に減ずるまで過剰の８ ．４ｋｂで有用な生成物は得られなかった。９４°で２０、６０、あるいは１８ ０秒の実験において、８．４ｋｂ生成物はこの加熱段階（データは示していない ）の長さを増すことで減少した収量を示した。明らかに、反応の構成成分が耐熱 性の限界である。図７は短い２秒を用いての結果を示している。 ８．４〜１８ｋｂの範囲内において全サイズで幾つかの反応で得られる標的フ ラグメントは、変性段階でもし３０ＰＣＲサイクルを用いるならば、１５ｋｂで 非常に高い生成物収量で得ることができる。また、図７は私が説明できない幾つ かの失敗した反応を示している。塊状のエチジウムで試料を汚す（３０サイクル 、レーン２）ことで引き起こす失敗モードは特に高酵素レベルでは普通のことで ある。 より長いプライマー。プライマーの長さを２７〜３３に変えると、失敗反応の 頻度を非常に減少させることができる。図１０は２７ｍｅｒのプライマーで所望 の標的生成物に対して引き起こした失敗において、別に最適の高酵素の条件下で より長い３３ｍｅｒで１２．５、１５および１８ｋｂで増幅すると、信頼度を改 良できることを示している。この結果はプライマー長さの広範な調査を示すもの ではなく、そして以下の改良で繰り返されるものでもない。そのため、長いＰＣ Ｒとして留まるプライマー長さの最適条件を決めるべきである。図１１に分析し た増幅の幾つかは、真の末端λから３６ｍｅｒのプライマーを利用したものであ る。６８〜７２°（２２）で２〜５分の前保温はファージ粒子から鋳型ＤＮＡを 解放するため、そして鋳型同族体を完成するために接着端部のλにプライマーλ Ｌ３６とλＲ３６を満たすために必要である。 急速サイクリング。薄い壁面のチューブに対する変化は、より低い熱容量とより 多い熱伝導効率を持たせることで更に反応を改良できる。図１１はＤＮＡスパン ６−２６サイズの増幅を成功させるＣＨＥＦ ｐｕｌｓｅ−ｆｉｅｌｄアガロー スゲル分析を示す。２８ｋｂの標的はオムニゲン熱サイクラー（データは示して いない）で増幅しないが、ロボサイクラーを用いたときは増幅が現れる（図１２ 、レーン２）。 熱的サイクラーの幾つかの型を用いたところ、すべては最適化できないが、幾 つかは長いＰＣＲとして好ましい。熱サイクラーの様々なモデルが使用されてお り、そして全てが楽観的ではないが、幾つかは長いＰＣＲに対して好ましい。上 記に記した薄壁チューブの有用性から断定できるように、成功は熱サイクラーの デザインで決まる温度変化の高いスピードと積極的に相互関係があると思われる 。ロボサイクラーは塊から塊へチューブを運動することによって急速な温度変化 をなし遂げるのであり、そしてサーミスター温度探針の指示で観察するもので、 僅か５秒で反応温度は９３〜９５°まで上がり、変性条件下で（９９°ブロック で３０秒）、急速前（３０秒以内）６８°反応を返す、のように使用した。 より高いｐＨ。現在の記録３５ｋｂ（図１２、レーン３）はｐＨが上がると増 幅性のみである。より高いｐＨの予備調査を実施し（データは示していない）、 ｐＨ８．８〜９．２で３５ｋｂバンドの外見でみたところ、（上記）方法で述べ たように９．１が最適であるという結果を得た。さらに３５ｋｂ生成物の高収量 に対する改良では２４分まで延長時間を長くすることで達成された。より高いｐ Ｈであるほかに、長いＰＣＲ手順はこれらの楽観的な８．４ｋｂからバッファー 条件の変化からは未だ何らの潜在利益も実現していない。２０ｋｂｓ以上の標的 にとって延長時間は２０分を越えることが好ましく、そして延長温度は６０℃以 下が好ましい。 ＰＣＲ生成物の同一性。図７、１０そして１１でわかるように、大きなＤＮＡ 生成物の成功の流動性は表１に予言した使用したプライマーの既知のマップポジ ションに一致している。 未純化の２８そして３５ｋｂ生成物（図１２、レーン６と７）のＨｉｎｄIII 制限消化酵素はλ（２３ｋｂ）の左腕と２．３ｋｂバンドの両方から期待された 結果で、そして右ＰＣＲプライマーで末端化した予想されるバンドである：２８ ｋｂから４４７ｂｐ（やっと目で見える）の生成物と２８ｋｂから７３３１ｂＰ の生成物。 エキソヌクレアーゼ突然変異体。３’−エキソヌクレアーゼ活性度において欠 陥のあるＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの有用な突然変異体をテストした。図１３は ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの３’−ｅｘｏ^-突然変異体が長いＤＮＡ標的の効果 的な増幅を増進することに失敗したことを示している。これはこのサイズ範囲内 で３’−エキソヌクレアーゼ活性度がＰＣＲ増幅の効率化のために重要であると いう我々の仮説を支持している。 忠実度テスト。３’−エキソヌクレアーゼの生物学的目的から、忠実に高複製 するためのミスマッチ塩基対が編集されており、、２つの選択的マーカー（１０ ）が側面を接する完全なｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子の増幅と分子 クローニングを含むアッセイを用いて我々はＰＣＲ生成物の忠実度をテストした 。これまでにＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（２）で触媒されたＰＣＲ増幅の最高の 忠実度を報告した。表２はＫｌｅｎｔａｑ−２７８とＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ の６４０：１混合物で増幅した生成物の忠実度が、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの みが得られるという、各々が１６サイクルのＰＣＲを用いた時、少なくとも釣り 合っていることを示している。我々のＫｌｅｎｔａｑ−ＬＡ（長くて正確なＫｌ ｅｎＴａｑ）のような酵素混合物の指摘は、高い忠実度の性能を跳ね返すもので ある。 （ａ）Ｋｌｅｎｔａｑ⁵は参考文献１０に述べられたＴａｑＤＮＡポリメラーゼ のＮ−末端欠失 である。（ｂ）参考文献１０の式１はｂｐ当りの誤差を解きあ かすために次のように再配列したものであって： Ｘ＝−（１ｎ（２Ｆ^(1/m-1)−１））／１０００、でここでＸはｂｐ当り組み 込まれる誤差、１０００はｌａｃＺ遺伝子（１０）における有効標的サイズであ り、Ｆは青コロニーの分別、そしてｍは有効サイクル数である。（ｃ）参考文献 １０におけるように有効サイクル数は現実の反応効率に反映するマシンサイクル より少なく算出されるが、しかし組合わせ増幅から計算した最小値より高い。生 成物鎖の不完全合成によるべき鎖ロスは理想的な増幅効率より低い予想される。 このため、成功（失敗なし）生成物分子は計算した最少複製数より少ないと判断 される。ＫＴＬＡ−６４（容量でＫｌｅｎｔａｑ−２７８：Ｐｆｕ：：６４：１ ）はその反応が生成物の比較レベルで計算して１０倍の欠失ＤＮＡ（１．５ｎｇ ｖｓ．１５ｎｇプラスミドｐＷＢ３０５）で開始されるので、より高い有効サ イクル数が課されている。 討議 ＰＣＲ増幅のための先の長さ制限はミスマッチド塩基対の結合サイトで延長の 低効率によって生じると主張されている。けれどもそれはこれらのミスマッチの ためのキュアーが３’−（校正）−エキソヌクレアーゼとともに酵素に用いられ ると思われている。私はＰｆｕとベントＤＮＡポリメラーゼが触媒として用いら れるとき、それらの失敗は、特に要求される長い合成時間の間中、そして最適な 高いＤＮＡポリメラーゼレベルでそれらの３’−エキソヌクレアーゼによるＰＣ Ｒプライマーの減成によるものであると信じている。明らかに、低レベルの３’ −エキソヌクレアーゼはＫｌｅｎｔａｑ−２７８と増幅を進めるミスマッチの除 去のために十分で最適である。それは最適な低いレベルの３’−エキソヌクレア ーゼが有効に、便利にそして柔軟に混合と希釈によってセットすることができる ことを表している。 好ましくはｅｘｏ^-／ｅｘｏ⁺酵素の割合が高いことである。もし、等レベルの ２つのタイプの酵素が用いられるならば、（あるいはＥ２構成成分が過剰にある ところの）あるいはもしｅｘｏ^-／ｅｘｏ⁺が４あるいはそれ以下であるならば、 たとえ下記で討議する最適のサイクリング状況であっても、長いＰＣＲの有効性 は全く存在しないかあるいは大いに減少する。 ある応用のために、ＰＣＲの熱変性段階の長さと温度を最小に保つことが重要 である。さらに、増加するｐＨによって得られる改良は僅かに鋳型の除プリンの 減少に対応することができる。もし除プリンを減少することができるなら、ある いはもし除プリン位置を迂回するこができるような大多数のＤＮＡポリメラーゼ 成分をみつけることができるなら、さらなる改良を得ることができる。 短い変性時間が最適であることは分かっており、好ましくは２０秒以下、最も 好ましくは５秒あるいはそれ以下で、９５°で反応それ自身３５ｋｂの増幅にと って驚くべき効果である。そうであるから長いＰＣＲ標的が完全に変性するため に長い変性時間を要するのである。もしＰＣＲにとって完全な変性が要求され、 そしてもしより長いＤＮＡを９５°でほどくためにもっと時間を必要とするなら 、要求したほどくための時間は結局、５秒より以上重要となるのである。これは 長い変性時間によって生じた増えた除プリンのために増幅性生成物のサイズを限 定することができる。 これらの増幅は幾つかの異なった標的配列、幾つかのプライマー結合で出来上 がったものであり、生成物サイズでλ中にクローンした挿入物の最大サイズの２ 倍近くである。 全ウィルスとプラスミドが長さにおいて３５ｋｂまでアップし、このシステム とともに増幅性となる。この方法はλより非常に複雑なＤＮＡに適用できること が証明され、ゲノミック製図や次にくる応用、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅が都合よく 、そしてＤＮＡ再配列を避け、そしてｉｎ ｖｉｖｏクローニングの遺伝子毒性 誘惑のために恩恵を証明することができる。 上記の見解において、この発明の幾つかの目的が達成され、そして他の有利な 結果に達することがわかった。 この発明の範囲からはずれることなく、上記の方法と生成物から種々の変化を 作り出すことができるので、上記記述に含まれる全ての事柄が例証として説明さ れ、制限を受けるものではない。

【手続補正書】 【提出日】１９９８年３月４日 【補正内容】 (1) 請求の範囲を別紙のとおり訂正する。 (2) 明細書第８頁２４〜２５行目 「後続ＰＣＲ段において」を「後続ＰＣＲ段階において」と訂正する。 (3) 同第１６頁１７〜１８行目 「バックボーンがｐＴＡＣ２（ワシントン大学メージャーズ（Ｊ．Ｍａｊｏ ｒｓ）氏）、」を 「バックボーンがｐＴＡＣ２（ワシントン大学のメージャーズ（Ｊ．Ｍａｊ ｏｒｓ）氏による）、」と訂正する。 (4) 同第２２頁１６行目 「６．６〜８．８ｋｂ」を「６．６〜８．４ｋｂ」と訂正する。 (5) 同第２３頁３０行目 「８０〜１００部」を「８０〜１０００部」と訂正する。 (6) 同第２４頁１０行目 「Ｐｆｕ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、」を 「Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、」と訂正する。 (7) 同第３１頁２２行目 「冷たい室内それら」を「冷たい室内にそれら」と訂正する。 (8) 同第３６頁６行目 「ＫｒｅｎＴａｑ」を「ＫｌｅｎＴａｑ」と訂正する。 (9) 同第４０頁１６〜１７行目 「Ｐｆｕのきは」を「Ｐｆｕのみは」と訂正する。 (10)同第４１頁２２行目 「ありにも多い」を「あまりにも多い」と訂正する。 (11)同第４２頁１７行目 「Ｋａｉｎｚｅ ｅｔ ａｉ」を「Ｋａｉｎｚｅ ｅｔ ａｌ」と訂正する 。 (12)同第４２頁２３〜２４行目 「ＤＮＡポリメラーゼ開口（Ｖｅｎｔ）と深部開口（Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ） は」を「Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼとＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラ ーゼは」と訂正する。 (13)同第４５頁下から３行目 「メガプライマー（３９９ｎｇ）」を「メガプライマー（３００ｎｇ）」と 訂正する。 (14)同第５７頁４行目 「（Ａ） 長さ： ３６塩基対」を 「（Ａ） 長さ： ３５塩基対」と訂正する。 (15)添付図面のうち、図３乃至図７を別紙の通り訂正する。 (16)添付図面のうち、図９乃至図１３を別紙の通り訂正する。 請求の範囲 １．実質的にＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼと同 じアミノ酸配列からなるが、前記ＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸 残基を欠くアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼをコード化する組換えＤＮ Ａ配列。 ２．実質的にＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼのそ れと同じアミノ酸配列からなり、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡ ポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸残基を除くアミノ酸配列を有するＤＮＡ ポリメラーゼ。 ３．配列番号：６のアミノ酸配列を有する請求項２に記載のＤＮＡポリメラー ゼ。 ４．プラスミドｐＷＢ２５４ｂに含まれるＤＮＡ配列によってコード化されて いる請求項２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。 ５．実質的にＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸 ２８０−８３１からなるアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼ。 ６．３′−エキソヌクレアーゼ活性を欠く少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリ メラーゼと、３′−エキソヌクレアーゼ活性を示す少なくとも１つの耐熱性ＤＮ Ａポリメラーゼとからなる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配合であって、上記３’ −エキソヌクレアーゼ活性を欠く耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの上記３’エキソヌ クレアーゼ活性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ単位比が １対１よりも大きい、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配合。 ７．３′−エキソヌクレアーゼ活性を欠く少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリ メラーゼがＫｌｅｎｔａｑ−２７８である請求項６に記載の耐熱性ＤＮＡポリメ ラーゼの配合。 ８．３′−エキソヌクレアーゼ活性を示す少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリ メラーゼがＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓからのＰｆｕ ＤＮＡポリ メラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｌｓからのＴｌｉ ＤＮ Ａポリメラーゼ、あるいは前記ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を 減少させるか、不活性化させる種々のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼあるいはＴｌ ｉ ＤＮＡポリメラーゼからなるグループから選ばれる請求項７に記載の耐熱性 ＤＮＡポリメラーゼの配合。 ９．上記配合の上記３’−エキソヌクレアーゼ活性を欠く耐熱性ＤＮＡポリメ ラーゼと３’−エキソヌクレアーゼ活性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、上 記３’−エキソヌクレアーゼ活性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの１単位に対 して上記３’−エキソヌクレアーゼ活性を欠く耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを約１ ０単位から２０００単位の割合で存在させる請求項６に記載の耐熱性ＤＮＡポリ メラーゼの配合。 １０．上記配合の上記３’−エキソヌクレアーゼ活性を欠く耐熱性ＤＮＡポリ メラーゼと３’−エキソヌクレアーゼ活性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、 上記３’−エキソヌクレアーゼ活性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの１単位に 対して上記３’−エキソヌクレアーゼ活性を欠く耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを約 １００単位から６００単位の割合で存在させる請求項９に記載の耐熱性ＤＮＡポ リメラーゼの配合。 １１．少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼからなるＤＮＡポリメラーゼの配 合であって、野生型形体において、３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈し、かつ 、上記少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼの上記３’−エキソヌクレアーゼ活 性が上記少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼのその野生型形体における３’− エキソヌクレアーゼ活性の約０．２％から約７％の範囲に低減された温度サイク ル型ポリメラーゼ連鎖反応に触媒作用を及ぼすことが出来る少なくとも１つのＤ ＮＡポリメラーゼからなるＤＮＡポリメラーゼの配合。 １２．有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を何ら持たない１またはそれ 以上のＤＮＡポリメラーゼをＥ１とし、有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活 性を呈する１又はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼがＥ２とした場合に、Ｅ１とＥ ２からなり、Ｅ１のＥ２に対する量の比がＤＮＡポリメラーゼ単位にして少なく とも約４：１、または、（ｂ）タンパク質の重量にして少なくとも約４：１であ るＤＮＡポリメラーゼの配合。 １３．Ｅ２がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃ ｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−Ｄ、Ｔ７コリ ファージ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａあるいはそれらの組み合わ せからの遺伝子によってコード化されたＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択 され、Ｅ１が、突然変異体、Ｅ２の３’−エキソヌクレアーゼ陰性形体、又は、 Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓまたはＴ ｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの遺伝子によってコード化された ＤＮＡポリメラーゼ等の有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を突然変異し ていない形体では呈さないＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求 項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。 １４．Ｅ２がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓからのＰｆｕＤＮＡポ リメラーゼからなり、Ｅ１のＥ２に対する単位比が約１５０から１７０：１の範 囲である請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。 １５．Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓＤ ＮＡポリメラーゼに対する単位比が約１５０から約１７０：１であることを含む 請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。 １６．Ｋｌｅｎｔａｑ−２９１のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｌｏｓｕｓＤ ＮＡポリメラーゼに対する単位比が約１５０から約１７０：１であることを含む 請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。 １７．Ｅ２がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−ＤからのＰｆｕＤＮＡポリメラー ゼからなり、Ｅ１のＥ２に対する単位比が約４５０から５００の範囲である請求 項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。 １８．野生型又はほぼ無損失のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポ リメラーゼのＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓＤＮＡポリメラーゼに対 する単位比が約１０から約１５：１であることを含む請求項１２に記載のＤＮＡ ポリメラーゼの配合。 １９．Ｅ１が逆転写酵素からなる、請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの 配合。 ２０．Ｅ１がＴ７又はＴ３ＤＮＡポリメラーゼの突然変異体或いは化学的修飾 からなり、Ｅ２が野生型のＴ７又はＴ３ＤＮＡポリメラーゼからなる、請求項１ ２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。 ２１．Ｅ１がＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ又はＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍ ｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼからなる請求項１２に記載のＤＮＡポリメラ ーゼの配合。 ２２．Ｅ１が有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を何ら持たないＴｈｅ ｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ変異型からなり、 Ｅ２が野生型のＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓＤＮＡポリメラ ーゼからなる、請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。 ２３．各々について異なる特定の配列が増幅される２つの相補鎖を、１つの、 １対の、又は、対の混合物をなすオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ＤＮ ＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を、合成に効果的な条件下で 各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの伸長（エクステンション）生成物の合 成に触媒作用を与えるために使用し、また、上記プライマーを各特定配列の異な る鎖に対して十分に相補的になるように選択してそれとハイブリッド形成し、１ つのプライマーから合成された伸長生成物が、その補体から分離される際に、同 じ又は別に含まれるプライマーを伸長させることによって伸長生成物の相補的な 鎖の合成用の鋳型として作用することが出来るようにし、プライマー伸長生成物 は、それらが合成されて一本鎖分子を生じた鋳型から分離されて、このようにし て生じた一本鎖分子をプライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポ リメラーゼの混合物を使用してプライマー伸長生成物の合成に有効な条件下で各 プライマーの伸長生成物の合成に触媒作用を与え、また、改善点がこのＤＮＡポ リメラーゼを請求項６に記載のように配合すること及び上記ＤＮＡポリメラーゼ の配合でプライマーエクステンションに触媒作用を及ぼすことを含む、繰り返し サイクル型のポリメラーゼ連鎖反応によって核酸配列を増幅するための方法。 ２４．各々について異なる特定の配列が増幅される２つの相補鎖を、１つの、 １対の、又は、対の混合物をなすオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ＤＮ ＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を、合成に効果的な条件下で 各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの伸長生成物の合成に触媒作用を与える ために使用し、また、上記プライマーを各特定配列の異なる鎖に対して十分に相 補的になるように選択してそれとハイブリッド形成し、１つのプライマーから合 成された伸長生成物が、その補体から分離される際に、同じ又は別に含まれるプ ライマーを伸長させることによって伸長生成物の相補的な鎖の合成用の鋳型とし て作用することが出来るようにし、プライマー伸長生成物は、それらが合成され て一本鎖分子を生じた鋳型から分離されて、このようにして生じた一本鎖分子を プライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を 使用してプライマー伸長生成物の合成に有効な条件下で各プライマーの伸長生成 物の合成に触媒作用を与え、また、改善点がこのＤＮＡポリメラーゼを請求項７ に記載のように配合すること及び上記ＤＮＡポリメラーゼの配合でプライマーエ クステンションに触媒作用を及ぼすことを含む、繰り返しサイクル型のポリメラ ーゼ連鎖反応によって核酸配列を増幅するための方法。 ２５．何らかの繰り返しサイクルに利用されている１つまたはそれ以上のプラ イマーそのものがＰＣＲ増幅の生成物である、請求項２４に記載の方法。 ２６．各繰り返しサイクルに変性ステップを更に含み、この変性ステップは反 応混合物において約２０秒よりも短い期間を有している、請求項２４に記載の方 法。 ２７．上記変性ステップが反応混合物において約５秒よりも短い期間を有して いる請求項２６に記載の方法。 ２８．各々について異なる特定の配列が増幅される２つの相補鎖を、１つの、 １対の、又は、対の混合物をなすオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ＤＮ ＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を、合成に効果的な条件下で 各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの伸長生成物の合成に触媒作用を与える ために使用し、また、上記プライマーを各特定配列の異なる鎖に対して十分に相 補的になるように選択してそれとハイブリッド形成し、１つのプライマーから合 成された伸長生成物が、その補体から分離される際に、同じ又は別に含まれるプ ライマーを伸長させることによって伸長生成物の相補的な鎖の合成用の鋳型とし て作用することが出来るようにし、プライマー伸長生成物は、それらが合成され て一本鎖分子を生じた鋳型から分離されて、このようにして生じた一本鎖分子を プライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を 使用してプライマー伸長生成物の合成に有効な条件下で各プライマーの伸長生成 物の合成に触媒作用を与え、また、改善点が、野生型形体において３’−エキソ ヌクレアーゼ活性を呈し、かつ、温度サイクル型ポリメラーゼ連鎖反応に触媒作 用を与えることが出来る少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼからなるＤＮＡポ リメラーゼを配合することを含み、このとき上記少なくとも１つのＤＮＡポリメ ラーゼの上記３’−エキソヌクレアーゼ活性は、消えてはいないが、上記少なく とも１つのＤＮＡポリメラーゼのその野生型形体における３’−エキソヌクレア ーゼ活性の約７％よりも大きくない程度まで低減しており、また、上記ＤＮＡポ リメラーゼの配合でプライマーエクステンションに触媒を与えることを含む、繰 り返しサイクル型のポリメラーゼ連鎖反応によって核酸配列を増幅するための方 法。 ２９．３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を欠く少なくとも１つの耐熱性ＤＮ Ａポリメラーゼと３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を示す少なくとも１つの耐 熱性ＤＮＡポリメラーゼとからなる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配合。 ３０．３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を示す第１の耐熱性ＤＮＡポリメラ ーゼと３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼから なる組成物を合成プライマー、合成鋳型と混合するステップを含むポリヌクレオ チド配列を増幅する方法。 ３１．（ａ）Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ 、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍ ｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、そしてＰｙｒｏｃ ｏｃｃｕｓ ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選んだ３′−５′エ キソヌクレアーゼ活性を示す第１のＤＮＡポリメラーゼと、（ｂ）Ｔｈｅｒｍｕ ｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、（ｅｘｏ−）Ｔｈｅｒｍｏｃｏ ｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、（ｅｘｏ−）Ｐｙｒｏｃ ｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、そして（ｅｘｏ−）Ｐｙ ｒｏｃｏｃｃｕｓ ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選んだ３′− ５′エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼとからなる組成物 を合成プライマー、合成鋳型と混合するステップを含むポリヌクレオチド配列を 増幅する方法。 ３２．上記第１および第２のＤＮＡポリメラーゼが耐熱性である請求項３１に 記載の方法。 ３３．上記第１のＤＮＡポリメラーゼがＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓ ｕｓ ＤＮＡポリメラーゼである請求項３１に記載の方法。 ３４．上記第２のＤＮＡポリメラーゼがＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼである請求項３２に記載の方法。 ３５．上記第２のＤＮＡポリメラーゼがＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼである請求項３３に記載の方法。 【図３】 【図４】 【図５】 【図６】 【図６】 【図７】 【図９】 【図１０】 【図１１】 【図１２】 【図１３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実質的にＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼと同 じアミノ酸配列からなるが、前記ＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸 残基を欠くアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼをコード化する組換えＤＮ Ａ配列。 ２．実質的にＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼのそ れと同じアミノ酸配列からなり、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡ ポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸残基を除くアミノ酸配列を有するＤＮＡ ポリメラーゼ。 ３．配列番号：６のアミノ酸配列を有する請求項２に記載のＤＮＡポリメラー ゼ。 ４．プラスミドｐＷＢ２５４ｂに含まれるＤＮＡ配列によってコード化されて いる請求項２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。 ５．実質的にＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸 ２８０−８３１からなるアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼ。 ６．３′−エキソヌクレアーゼ活性を欠く少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリ メラーゼを含む多数成分と、３′−エキソヌクレアーゼ活性を示す少なくとも１ つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む少数成分とからなる耐熱性ＤＮＡポリメラ ーゼの配合。 ７．３′−エキソヌクレアーゼ活性を欠く少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリ メラーゼがＫｌｅｎｔａｑ−２７８である請求項６に記載の耐熱性ＤＮＡポリメ ラーゼの配合。 ８．３′−エキソヌクレアーゼ活性を示す少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリ メラーゼがＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓからのＰｆｕ ＤＮＡポリ メラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓからのＴｌｉ ＤＮ Ａポリメラーゼ、あるいは前記ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を 減少させるか、不活性化させる種々のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼあるいはＴｌ ｉ ＤＮＡポリメラーゼからなるグループから選ばれる請求項７に記載の耐熱性 ＤＮＡポリメラーゼの配合。 ９．配合の多数成分と少数成分は、少数成分の１単位に対して多数成分を約１ ０単位から２０００単位の割合で存在させる請求項６に記載の耐熱性ＤＮＡポリ メラーゼの配合。 １０．配合の多数成分と少数成分は、少数成分の１単位に対して多数成分を約 １００単位から６００単位の割合で存在させる請求項９に記載の耐熱性ＤＮＡポ リメラーゼの配合。 １１．少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼからなるＤＮＡポリメラーゼの配 合であって、野生型形体において、３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈し、かつ 、上記少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼの上記３’−エキソヌクレアーゼ活 性が上記少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼのその野生型形体における３’− エキソヌクレアーゼ活性の約０．２％から約７％の範囲に低減された温度サイク ル型ポリメラーゼ連鎖反応に触媒作用を及ぼすことが出来る少なくとも１つのＤ ＮＡポリメラーゼからなるＤＮＡポリメラーゼの配合。 １２．有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を何ら持たない１またはそれ 以上のＤＮＡポリメラーゼをＥ１とし、有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活 性を呈する１又はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼがＥ２とした場合に、Ｅ１とＥ ２からなり、Ｅ１のＥ２に対する量の比がＤＮＡポリメラーゼ単位にして少なく とも約４：１、または、（ｂ）タンパク質の重量にして少なくとも約４：１であ るＤＮＡポリメラーゼの配合。 １３．Ｅ２がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃ ｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−Ｄ、Ｔ７コリ ファージ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａあるいはそれらの組み合わ せからの遺伝子によってコード化されたＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択 され、Ｅ１が、突然変異体、Ｅ２の３’−エキソヌクレアーゼ陰性形体、又は、 Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓまたはＴ ｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの遺伝子によってコード化された ＤＮＡポリメラーゼ等の有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を突然変異し ていない形体では呈さないＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求 項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。 １４．Ｅ２がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓからのＰｆｕＤＮＡポ リメラーゼからなり、Ｅ１のＥ２に対する単位比が約１５０から１７０：１の 範囲である請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。 １５．Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓＤ ＮＡポリメラーゼに対する単位比が約１５０から約１７０：１であることを含む 請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。 １６．Ｋｌｅｎｔａｑ−２９１のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓＤ ＮＡポリメラーゼに対する単位比が約１５０から約１７０：１であることを含む 請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。 １７．Ｅ２がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−ＤからのＰｆｕＤＮＡポリメラー ゼからなり、Ｅ１のＥ２に対する単位比が約４５０から５００の範囲である請求 項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。 １８．野生型又はほぼ無損失のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポ リメラーゼのＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓＤＮＡポリメラーゼに対 する単位比が約１０から約１５：１であることを含む請求項１２に記載のＤＮＡ ポリメラーゼの配合。 １９．Ｅ１が逆転写酵素からなる、請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの 配合。 ２０．Ｅ１がＴ７又はＴ３ＤＮＡポリメラーゼの突然変異体或いは化学的修飾 からなり、Ｅ２が野生型のＴ７又はＴ３ＤＮＡポリメラーゼからなる、請求項１ ２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。 ２１．Ｅ１がＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ又はＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍ ｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼからなる請求項１２に記載のＤＮＡポリメラ ーゼの配合。 ２２．Ｅ１が有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を何ら持たないＴｈｅ ｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ変異型からなり、 Ｅ２が野生型のＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓＤＮＡポリメラ ーゼからなる、請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。 ２３．各々について異なる特定の配列が増幅される２つの相補鎖を、１つの、 １対の、又は、対の混合物をなすオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ＤＮ ＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を、合成に効果的な条件下で 各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの伸長（エクステンション）生成物の 合成に触媒作用を与えるために使用し、また、上記プライマーを各特定配列の異 なる鎖に対して十分に相補的になるように選択してそれとハイブリッド形成し、 １つのプライマーから合成された伸長生成物が、その補体から分離される際に、 同じ又は別に含まれるプライマーを伸長させることによって伸長生成物の相補的 な鎖の合成用の鋳型として作用することが出来るようにし、プライマー伸長生成 物は、それらが合成されて一本鎖分子を生じた鋳型から分離されて、このように して生じた一本鎖分子をプライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡ ポリメラーゼの混合物を使用してプライマー伸長生成物の合成に有効な条件下で 各プライマーの伸長生成物の合成に触媒作用を与え、また、改善点がこのＤＮＡ ポリメラーゼを請求項６に記載のように配合すること及び上記ＤＮＡポリメラー ゼの配合でプライマーエクステンションに触媒作用を及ぼすことを含む、繰り返 しサイクル型のポリメラーゼ連鎖反応によって核酸配列を増幅するための方法。 ２４．各々について異なる特定の配列が増幅される２つの相補鎖を、１つの、 １対の、又は、対の混合物をなすオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ＤＮ ＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を、合成に効果的な条件下で 各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの伸長生成物の合成に触媒作用を与える ために使用し、また、上記プライマーを各特定配列の異なる鎖に対して十分に相 補的になるように選択してそれとハイブリッド形成し、１つのプライマーから合 成された伸長生成物が、その補体から分離される際に、同じ又は別に含まれるプ ライマーを伸長させることによって伸長生成物の相補的な鎖の合成用の鋳型とし て作用することが出来るようにし、プライマー伸長生成物は、それらが合成され て一本鎖分子を生じた鋳型から分離されて、このようにして生じた一本鎖分子を プライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を 使用してプライマー伸長生成物の合成に有効な条件下で各プライマーの伸長生成 物の合成に触媒作用を与え、また、改善点がこのＤＮＡポリメラーゼを請求項７ に記載のように配合すること及び上記ＤＮＡポリメラーゼの配合でプライマーエ クステンションに触媒作用を及ぼすことを含む、繰り返しサイクル型のポリメラ ーゼ連鎖反応によって核酸配列を増幅するための方法。 ２５．何らかの繰り返しサイクルに利用されている１つまたはそれ以上のプ ライマーそのものがＰＣＲ増幅の生成物である、請求項２４に記載の方法。 ２６．各繰り返しサイクルに変性ステップを更に含み、この変性ステップは反 応混合物において約２０秒よりも短い期間を有している、請求項２４に記載の方 法。 ２７．上記変性ステップが反応混合物において約５秒よりも短い期間を有して いる請求項２６に記載の方法。 ２８．各々について異なる特定の配列が増幅される２つの相補鎖を、１つの、 １対の、又は、対の混合物をなすオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ＤＮ ＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を、合成に効果的な条件下で 各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの伸長生成物の合成に触媒作用を与える ために使用し、また、上記プライマーを各特定配列の異なる鎖に対して十分に相 補的になるように選択してそれとハイブリッド形成し、１つのプライマーから合 成された伸長生成物が、その補体から分離される際に、同じ又は別に含まれるプ ライマーを伸長させることによって伸長生成物の相補的な鎖の合成用の鋳型とし て作用することが出来るようにし、プライマー伸長生成物は、それらが合成され て一本鎖分子を生じた鋳型から分離されて、このようにして生じた一本鎖分子を プライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を 使用してプライマー伸長生成物の合成に有効な条件下で各プライマーの伸長生成 物の合成に触媒作用を与え、また、改善点が、野生型形体において３’−エキソ ヌクレアーゼ活性を呈し、かつ、温度サイクル型ポリメラーゼ連鎖反応に触媒作 用を与えることが出来る少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼからなるＤＮＡポ リメラーゼを配合することを含み、このとき上記少なくとも１つのＤＮＡポリメ ラーゼの上記３’−エキソヌクレアーゼ活性は、消えてはいないが、上記少なく とも１つのＤＮＡポリメラーゼのその野生型形体における３’−エキソヌクレア ーゼ活性の約７％よりも大きくない程度まで低減しており、また、上記ＤＮＡポ リメラーゼの配合でプライマーエクステンションに触媒を与えることを含む、繰 り返しサイクル型のポリメラーゼ連鎖反応によって核酸配列を増幅するための方 法。