JPH03502165A - 精製された熱安定酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 精製された熱安定酵素 本発明は、精製した熱安定酵素に関する。一つの態様では、この酵素はテルムス ・アクアチフス（Ｔｈｅｒμ＋ｓ　ａ　ｕａｔｉｃｕｓ）から精製されたＤＮＡ ポリメラーゼであり、その分子量は約８６、０００〜９５，０００である。

本発明は、既存の核酸配列が試験試料中に存在するならばそれらを増幅し、且つ もし存在するならばそれらをプローブを用いることによって検出する方法に関す る。更に具体的には、本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡの所定の配列から特定の核 酸配列を最初に存在している量に比較して大量に産生じてこれらの配列の検出を 容易にし、反応を触媒する熱安定酵素を用いる方法に関する。ＤＮＡまたはＲＮ Ａは、一本鎖または二本鎖であってもよく、比較的純粋な種類または核酸の混合 物の一成分であってもよい。本発明の方法は、所望な核酸配列の増幅を達成する ため、反復反応を利用する。

Ｅ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）のような中温微生物からのＤＮＡポリメラーゼの単 離について、広範な研究が行われてきた０例えば、ベスマン（Ｂｅｓｓｍａｎ） 　　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、　（１９５７年）、２３３巻、１７１〜１７ ７頁およびブチン（Ｂｕｔｔｉｎ）とコルンベルグ（Ｋｏｒｎ−ｂｅｒｇ）　Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　（１９６６年）、２４１巻、５４１９〜５４２７頁を 参照されたい。

対照的に、テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　因」１国服）のような好 熱菌からのＤＮＡポリメラーゼの単離と精製については、余り研究が行なわれて いない。カレジン（Ｋａｌｅｄｉｎ）ら、ｈ並り畦ｕ、（１９８０年）４５巻、 ６４４〜６５１頁は、テルムス・アクアチフス（Ｔ、肥」１国服）ＹＴＩ株の細 胞からのＤＮＡポリメラーゼの６段階単離および精製法を開示している。これら の工程は、粗製抽出物の単離、ＤＥＡＥ−セルロース・クロマトグラフィ、ヒド ロキシアパタイト上での分別、ＤＥＡＥ−セルロース上での分別および単一鎖Ｄ ＮＡ−セルロース上でのクロマトグラフィから成っている。それぞれの段階から のプールは、エンド−およびエクソヌクレアーゼの混入についてはスクリーニン グされていない。精製された酵素の分子量は、モノマ一単位当たり６２．０００ ドルトンと報告されている。

テルムス・アクアチフス（Ｔ、　凹ｙ態国■）からのポリメラーゼについての第 二の精製法は、エイ・チェノ（Ａ、Ｃｈｉｅｎ）ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 　（１９７６年）　、１２７巻、１５５０〜１５５７頁によって記載されている 。この方法では、粗製の抽出物をＤＥＡＥ−セファデックスカラムにかける。透 析下プール分画を次に、ホスホセルロースカラム上での処理に付す。このプール した分画を透析して、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えてポリメラーゼの活 性の損失を防止する。生成する混合物をＤＮＡ−セルロースカラムにかける。カ ラムからのプールした物質透析し、ゲル濾過によって分析すると分子量は約６３ ，０００ドルトンであり、スクロース遠心分離によれば約６８，０００ドルトン である。

熱安定酵素を用いて、既存の核酸配列を初めに存在する量に比べて大量に増幅す る方法は、米国特許Ｎα４，６８３．１９５明細書に示唆されている。この方法 では、プライマー、ヌクレオチドトリホスフェートおよびポリメラーゼが用いら れ、変性、鋳型鎖の合成およびハイブリダイゼーションからなっている。

それぞれのプライマーの伸長生成物は、所望の核酸配列を製造するための鋳型に なる。この明細書では、用いられるポリメラーゼが熱安定酵素である場合には、 熱によってその活性が破壊されないので、各変性工程の後にそれを添加する必要 はない。精製された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用については、他の利益お よび詳細な点についてはなにも提供されていない。さらに、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄ　ＢｉｏｌａｂｓはＴ、アクアチフス（Ｔ、括」１国躾）由来のポリメラー ゼを販売しているが、非イオン性洗剤を含有しない強緩衝液中でポリメラーゼ活 性が時間と共に実質的に低下することが知られている。

したがって、当業界では、上記の診断用増幅工程を改良するために使用すること ができる精製された安定な熱安定酵素を製造することが望まれている。

〔問題点を解決するための手段〕

したがって、本発明はヌクレオチドトリホスフェートの結合を触媒して核酸鋳型 鎖に相補的な核酸鎖を形成する精製された熱安定酵素を提供する。好ましくは、 精製された酵素はテルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　剋朋復工旺）　由 来（７）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼであり、分子量は約８６．０００〜９５．０ ００ドルトンである。この精製された材料を温度サイクル増幅反応に用いて、所 定の核酸配列から核酸配列を初めに存在する量に比較して大量に産生させて、そ れらを容易に操作しそして／又は分析することができるようにすることができる 。

テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｓｕｓ　括！匹国ｕ）由来の゛ＤＮＡポリメ ラーゼからの酵素をコードする遺伝子も同定され、本発明の熱安定酵素を回収す るもう一つの手段を提供する。

約８６．０００〜９５．０００ドルトンの酵素をコードする遺伝子に加えて、Ｄ ＮＡポリメラーゼ活性をコードする遺伝子誘導体も提供される。

本発明はまた、１種以上の非イオン性のポリマー性洗剤を含む緩衝液に上記のよ うな精製された熱安定酵素を含有する安定な酵素組成物をも包含する。

精製された酵素および組替えＤＮＡ技術によって産生される酵素は、温度循環増 幅反応において使用する場合、熱安定性ではないフレノウ０［１ｅｎｏｗ）フラ グメントよりも遥かに高い特異性を提供する。更に、精製された酵素及び組換え 技術によって産生された酵素は、ＴＴＰまたは他のヌクレオチドトリホスフェー トがＤＮＡ鋳型と共にインキュベーション混合物中に存在しないときに予想され る適当な活性を示す、また、これらの酵素は、文献に記載されているテルムス・ アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　括狙匹国■）由来の熱安定酵素のｐＨよりも広 いｐＨ範囲を有し、ｐＨ６，４ではｐＨ８における場合の５０％より大きな活性 を示す。

第１図は、ＴａｑポリメラーゼのＤＮＡ配列及び予想されるアミノ酸配列を示す 、推定される一次翻訳生成物に対対するアミノ酸配列を１−８３２と称する。

第２図は、プラスミド８５Ｍ１３°中にサブクローニングされた約４．５　ｋｂ のＨｉｎｄｌｌｌ　Ｉ　、アクアチクスＤＮＡ挿入部を含有するプラスミドｐＦ Ｃ８３の制限地図である。

第２図は、プラスミドＢＳＭ１３”中にサブクローニングされた〜２．６８ｋｂ のＨｉｎｄＩ［Ｉ−Ａｓｐ７１８Ｔ、アクアチクスＤＮＡ挿入部を含有するプラ スミドｐＦｃ８５の制限地図である。

本明細書に用いられる「細胞」　「細胞系（セルライン）」および「細胞培養物 」は相互交換可能に用いることができ、これらの名称は総て子孫を包含する。し たがって、「形質転換体」または「形質転換された細胞」とは、−次細胞および トランスファーの回数とは関係なしにその細胞に由来する培養物を包含する。ま た、総ての子孫は、故意のまたは偶然の突然変異によりＤＮＡ含量が正確には同 一ではないことがあることも理解される。最初に形質転換された細胞に置いてス クリーニングしたのと同じ機能を有する変異体子孫も包含される。

「制御配列」という用語は、特定の宿主生物における作用可能に連結されたコー ド配列の発現に必要なりＮＡ配列を指す、原核生物に好適な制御配列は、例えば プロモーター、任意にはオペレーター配列、リボゾーム結合部位があるが、さら にその他の余り理解されていない配列も包含することが可能である。真核細胞は 、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサ−を利用することが 知られている。

「発現系」という用語は、作用可能に連結された所望のコード配列および制御配 列を含むＤＮＡ配列を指し、これらの配列で形質転換される宿主はコードされた 蛋白質を産生ずることができる。形質転換を行うために、発現系をベクターに包 含させてもよいが、次に、関連のＤＮＡが宿主染色体に組み込まれてもよい。

本明細書で用いられる「遺伝子」という用語は、回収可能な生物活性を有するポ リペプチドまたは前駆体をコード化するＤＮＡ配列を指す、このポリペプチドは 、完全な長さの遺伝子配列によりまたは酵素活性が保持されているかぎりコード 配列のいずれかの部分によってコードされていてもよい。

本発明の１つの態様においては、テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　凹 」１国並）　（Ｔａｇ）の完全な長さの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする ＤＮＡ配列が提供される。第１図は、このＤＮＡ配列及び推定されるアミノ酸配 列を示す０便宜上、このＴａｑポリメラーゼのアミノ酸配列を参照として使用し 、そして耐熱性酵素の他の形態を、第１図に示される配列に言及することにより 特定する。Ｎ−末端メチオニンは存在する場合としない場合があるので、耐熱性 酵素が細菌により生産されるすべての場合において両方の形態が含まれる。

「作用可能に連結した」という用語は、成分の正常な機能を行うことができる併 置を指す。例えば、制御配列に「作用可能に連結した」コード配列は、このコー ド配列が制御配列の制御下で発現することができる配置を指す。

「混合物」なる語は、これがＴａｑポリメラーゼを含有する混合物に関する場合 、Ｔａｑポリメラーゼを含有するがしかしさらに他の蛋白質を含む物質の集合を 意味する。Ｔａｑポリメラーゼが組換宿主細胞に由来する場合、他の蛋白質は通 常、宿主と関連するものであろう。宿主が細菌である場合、夾雑蛋白質は言うま でもなく、細菌性蛋白質であろう。

「非イオン性のポリマー性洗剤」とは、イオン性電荷を持たず、本発明の目的に は、約３．５〜約９．５のｐＨ範囲、好ましくは４〜８．５のｐＨ範囲で酵素を 安定化することができることを特徴とする界面活性剤を指す。

本明細書に用いられる「オリゴヌクレオチドｊという用語は、２個以上のデオキ シリボヌクレオチドまたはりボヌクレオチド、好ましくは３個以上のものからな る分子として定義される。その正確な大きさは多くのファクターによって異り、 これらのファクターはオリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途によって異 る。オリゴヌクレオチドは、合成的にまたはクローニングによって誘導すること ができる。

本明細書に用いられる「ブライマー」という用語は、生成された制限消化物中に おけるように天然存在し、または合成的に製造されるオリゴヌクレオチドであっ て、核酸鎖に相補的なブライマー伸長生成物の合成を誘発する条件、すなわち、 適当な緩衝液（「緩衝液」とはｐＨ、イオン強度、コファクター等を包含する） 中で、好適な温度で４種の異なるヌクレオチドトリホスフェートと熱安定酵素の 存在の条件下に置くとき、合成の開始点として作用することができるものを指す 。

Ｔａｑポリメラーゼについては、本明細書の緩衝液は、好ましくは１．５〜２＋ ｗＭのマグネシウム塩、好ましくはＭａＣｆ、、１５０〜２００オのそれぞれの ヌクレオチドおよび１声のそれぞれのブライマーを含有し、好ましくは、５０ｍ ＭのＫＣｆと１０ｎ＋Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８〜８．４）および１００ｇ／ｊ ｄのゼラチンを含む。

このブライマーは、増幅において最大効率を得るには好ましくは単一鎖であるが 、二本鎖でもよい。二本鎖の場合には、ブライマーは最初に処理されて、伸長生 成物を調製するのに用いる前にそれらの鎖ごとに分離される。好ましくは、ブラ イマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。ブライマーは十分に長く、 熱安定酵素の存在で伸長生成物の合成をプライムできるものでなければならない 。ブライマーの正確な長さは、温度、ブライマー由来および方法用途のような多 くのファクターによって変わる。例えば、目標とする配列の複雑さによっては、 オリゴヌクレオチドブライマーは典型的には、１５〜２５ヌクレオチドを含むが 、それより多くのまたはそれより少ないヌクレオチドを含むこともある。短いブ ライマー分子は一般的には、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成する には、低温が必要である。

これらのブライマーは、増幅されるそれぞれの特定の列の異なる鎖に「実質的に 」相補的になるように選択される。これは、それらのそれぞれの鎖とハイブリッ ド形成するには十分に相補的でなければならないことを意味する。それ故、ブラ イマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレ オチドフラグメントをブライマーの５′末端に結合させ、残りのブライマー配列 が鎖に対して相補的であるようにすることができる。また、ブライマー配列が増 幅される鎖の配列に対して十分に相補的で、この鎖とハイブリッド形成すること によって、他のブライマーの伸長生成物の合成用の鋳型となる場合には、非相補 的塩基またはより長い配列をブライマー中に含むことができる。しかしながら、 検出の目的には、詳細には標識した配列特異的プローブを用いて検出するには、 ブライマーは典型的には正確な相補性を有する場合に最高の結果が得られる。

本明細書に用いられる「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用 語は、細菌酵素であって、それぞれが特異的ヌクレオチド配列のまたはその付近 の二重鎖ＤＮＡを切断するものを指す。　　・ 本明細書に用いられる「熱安定酵素」という用語は、熱に安定であり、耐熱性を 有し、それぞれの核酸鎖に相補的であるブライマー伸長生成物を形成する適当な 方法でヌクレオチドの結合を触媒（促進）する酵素を意味する。一般的には、合 成はそれぞれのブライマーの３′末端で開始され、合成が終結するまで鋳型鎖に 沿って５′方向に進行し、異なる長さの分子を産生ずる。しかしながら、５′末 端で合成を開始し、上記と同様な工程を用いて、他の方向に進む熱安定酵素もあ る。

本明細書に用いられる熱安定酵素は、増幅反応に効果的であるという唯一の規準 を満たすものでなければならず、すなわち、酵素は、二本鎖核酸の変性を行うの に必要な時間高温に付す時に、不可逆的に変性（不活性化）するものであっては ならない、この場合の不可逆的変性とは、酵素活性を永久に且つ完全に喪失する ことを意味する。変性に必要な加熱条件は、例えば緩衝液の塩濃度、変性される 核酸の長さおよびヌクレオチ１組成によって変わるが、典型的には、約９０〜約 １０５°Ｃの範囲であり、時間については主として温度および核酸の長さによっ て変わり、典型的には約０．５〜４分間である。

緩衝液の塩濃度および／または核酸のＧＣ組成が増加すると、更に高温を用いる こともできるや好ましくは、酵素は約９０〜１００°Ｃで不可逆的に変性しない 。

本明細書に用いられる熱安定酵素は、好ましくはその酵素が機能する最適温度は 約４０°Ｃよりも高く、鋳型へのブライマーのハイブリダイゼーションが促進さ れる温度よりも低い温度であるが、（１）マグネシウムおよび塩濃度および（２ ）ブライマーの組成および長さによっては、ハイブリダイゼーションは更に高い 温度（例えば４５〜７０°Ｃ）で起こることができる。酵素にとっての最適温度 が高くなれば、ブライマー関連の伸長法の特異性および／または選択性は大きく なる。しかしながら、４０°Ｃ未満（例えば３７°Ｃ）で活性な酵素も、熱に安 定であるかぎり、本発明の範囲内に含まれる。好ましくは、最適温度は約５０〜 ９０°Ｃであり、更に好ましくは６０〜８０℃である。

本明細書に用いられる熱安定酵素は、如何なる由来から得ることもでき、天然ま たは組換え蛋白質であってもよい、耐熱性を有するものとして文献に報告されて いる酵素の例は、熱に安定なポリメラーゼ、例えば好熱菌のテルムス・フラプス （Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｆｌａｖｕｓ）　、テルムス・テルモフィルスＴｈｅｒａ＋ ｏ　ｈｉｌｕｓ）　、バシルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉ一旦ｕｓ　 ５ｔｅａｒ＋江ｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）　（他の文献に報告されているものよ りも幾分低い最適温度を有する）、テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　 凹」１国■）　、テルムス・ラフテラス（Ｔｈｅｒｍｕｓｌａｃｔｅｕｓ）テル ムス・ルーベンス（Ｔｈｅｒｉ＋ｕｓ　ｒｕｂｅｎｓ）　、およびメタノテルム ス・フェルビドウス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ　ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から 抽出されたポリメラーゼである。好熱性元始細菌から単離される熱安定性ポリメ ラーゼには、例えば、スルホルブス・ソルファタリクス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ 　５ｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）　、スルホルブス・アシドカルダリラム（Ｓｕｌ ｆｏｌｏｂｕｓ　ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）　、テルモプラズマ・アシド フィルム（Ｔｈｅｒｎ＋ｏ　Ｉａｓｍａ　ａｃｉｄｏ　ｈｉｌｕｓ）、メタノバ クテリウム・テルモオートトロフィクム（Ｍｅｔｈａｎｏ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　ｔｒｅｒｎ＋ｏａｕｔｏｔｒｏ　ｈｉｃｕｍ）、及びデスルフロユツカス・モ ビリス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ）のものが含まれる 。

本発明の熱安定酵素は第１図に示されるアミノ酸配列を有する。さらに、この中 に存在する９個又はそれより多（のアミノ酸のいずれかの連続した範囲に対する ５０％以上の相同性を含む任意の熱安定ポリメラーゼも本発明の範囲内であると 意図される。この相同性は、Ｅｕｐｏｐｅａｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｎ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ）又はＧｅｎｂａｎｋのごとき市販のデ ーターバンクを用いて決定することができる。さらに、さらに、新規な熱安定ポ リメラーゼが同定される場合、この新規に同定された配列とＴａｑポリメラーゼ 配列との間の相同性の特異的領域を、例えば、ライスコンシン大学の遺伝子コン ピューターグループの配列分析ソフトウェア−パッケージを用いて決定すること ができよう、相同性の特異的領域には次の領域（第１図のアミノ酸の番号に従う ）；残基１９０−２０４．２６２−２７０゜５６９−５８７．７１８−７３２． ７４３−７５９　、及び７７Ｂ−７９０が包含される。

本明細書に用いられる好ましい熱安定酵素は、テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅ ｒｍｕｓ　鱈！１国躾）から単離されたＤＮＡポリメラーゼである。その各種の 株も、アメリカン・タイプ・カルチ＋−コレクション（Ａ＋５ｅｒｉｃａｎ　Ｔ ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）ロックビル、メリーランド、 から入手することができ、ティ・ディ・ブ０７り（Ｔ、Ｄ、Ｂｒｏｃｋ）　、Ｊ 、Ｂａｃｔ、　（１９６９年）、９８巻、２８９〜２９７頁、およびティ・オシ マ（７，Ｑ３ｈｉｓａ）、Ａｒｃｈ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　、（１９７８）、１１７巻、１８９〜１９６真に記載さ れている。これらの好ましい菌株の一つは、ＴＹ−１株である。

天然タンパク質を回収するためには、細胞を適当な技術を用いて増殖させる。こ の様な技術は、カレジン（Ｋａｌｅｄｉｎ）ら、…ｏｋｈｉａ＋ｉ■、（１９８ ０年）同上、に記載されており、この記載を引用によりこの明細書に組み入れる 。簡単に言えば、１リツトルに、ニトリロトリ酢酸（１００■）、トリプトン（ ３ｇ）酵母抽出液（３ｇ）　、コハク酸（５ｇ）、亜硫酸ナトリウム（５０■） 、リボフラビン（１■）　、Ｋ、ＨＰＯ４（５２２■）　、ＭｇＳＯａ（４８０ ｇ）、ＣａＣｊ！　ｚ　（２２２Ｍ）、ＮａＣｊ！　（２０ｇ）　、および痕跡 量の元素を含む培地上で細胞を増殖させる。培地のｐｏは、ＫＯＨで８．０±０ ．２に調整している。　７０℃の温度で激しく通気しながら培養すると、細胞１ リツトルに対して２０ｇまで収量は増加する。後期対数増殖期における細胞（５ ００ｎ−での吸収により測定）を遠心分離によって集めて、緩衝液で洗浄し、− ２０”Ｃに凍結保存した。

チェノ（Ｃｈｉｅｎ）ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１９７６年、同上、によ る細胞を生育させるもう一つの方法では、０．１■／ｌのビオチンを補填した０ 、３％のグルタミン酸、０．１■／ｌ、チアミンおよび０．０５■／ｌのニコチ ン酸を含む定義された無機塩培地が用いられる。これらの塩にはニトリロトリ酢 酸、Ｃａ５Ｏｎ、　ＭｇＳＯ４＋ＮａＣｆ、　ＫＮＯ３１ＮａＮ０＊＋　Ｚｎ５ Ｏｎ、　ｕ、ｎｏ、、　Ｃｕ５Ｏａ、　ＮａＭｏ０ｎ＋　ＣｏＣｆｆ１ｚＦｅＣ １２２，ＭｎＳＯ４、およびＮａｚＨＰＯａがある。培地のｐＨはＭａｉｌで８ ．０に調整している。

チェノ（Ｃｈｉｅｎ）　　らの方法では、細胞は最初は７５℃で水浴シェーカー 中で増殖させる。一定の濃度に達したなら、これらの細胞１リツトルを、熱風イ ンキュベーターに入れである１６リツトルのカーボーイ（ｃａｒｂｏｙｓ）に移 す。無菌空気を培養液中に通して、温度を７５℃に維持する。細胞を２０時間増 殖させた後、遠心分離によって回収する。

細胞の増殖の後、酵素の単離および生成を６段階で行い、それぞれの段階は室温 より低い温度、好ましくは約４℃で行う。

第一の段階または工程では、細胞が、凍結している場合には、解凍し、超音波で 破砕し、ｐＨが約７．５の緩衝液に懸濁する。

第二の段階では上澄液を集めて、次いで乾燥１ｉＡ酸アンモニウムのような塩を 加えることによって分別する。適当な両分（典型的には、４５〜７５％飽和）を 集めて、０．２リン酸カリウム緩衝液、好ましくはｐＨ６，５の緩衝液に溶解し て、同じ緩衝液に対して透析する。

第三の段階では、核酸及びある種の蛋白質を取り除く、第二の段階からの画分を 、上記と同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＲ−セルロースカラムにかける０次いで 、二〇カラムを同じ緩衝液で洗浄し、蛋白質含有画分を溶出し、２８０ｎ−での 吸収によって測定し、集めて、１０−Ｍリン酸カリウム緩衝液に対して、好まし くは第一の緩衝液でｐＨを７．５にしたものと同じ成分を有するもので透析する 。

第四の段階では、上記のようにして集めた分画を、第三の段階で透析に用いた緩 衝液で平衡にしたヒドロキシアパタイトカラムにかける。次いで、このカラムを 洗浄し、１０−Ｍの２−メルカプトエタノールと５％のグリセリンを含むＰＨ７ ，５の０．０１Ｍ−０，５Ｍリン酸カリウム緩衝液の直線グラジェントで酸素を 溶出する。プールした熱安定酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ）活性を含む両分 を、第三の段階で透析に使用したのと同じ緩衝液で透析する。

第五の段階では、透析した画分を、第三の段階で透析に使用した緩衝液で平滑化 したＤＥＡＥ−セルロースカラムにかける。

このカラムを次に洗浄し、第三の段階で透析に使用した緩衝液中で０．０１〜０ ．６ＭのＭＣＩのような緩衝液の直線グラジェントで、酵素を溶出する。熱安定 酵素の活性を有する画分を、適当な方法を用いてデオキシリボヌクレアーゼ（エ ンド−およびエキソヌクレアーゼ）の混入について試験した。例えば、エンドヌ クレアーゼ活性は、過剰のＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートした後ファ ージλＤＮＡまたはスーパーコイルプラスミドＤＮＡの分子量の変化から、電気 泳動によって測定することができる。同様に、エキソヌクレアーゼ活性は、数個 の部位で開裂する制限酵素を用いて処理した後、ＤＮＡの分子量の変化から電気 泳動によって測定することができる。

デオキシリボヌクレアーゼ活性を持たないと決定された両分をプールして、第三 の段階で用いたのと同じ緩衝液で透析する。

第六の段階では、プールした両分を、一定のベッドボリウムを有するホスホセル ロースカラムに入れる。このカラムを洗浄して、ｐＨ７，５でリン酸カリウム緩 衝液中０．０１〜０．４　ＭのＭＣＩ！、のような緩衝液の直線グラジェントで 酵素を溶出する。

熱安定なポリメラーゼ活性を有し、デオキシリボヌクレアーゼ活性を有しないプ ールした両分を、ｐＨ８，０の緩衝液で透析する。

透析した生成物の分子量は、蛋白質分子量マーカーを用いてＳＯＳ　ＰＡＧＥに よる方法等によって決定することができる。好ましい酵素の一つであるテルムス ・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ凹彫工国■）から精製されたＤＮＡポリメラー ゼの分子量は、上記方法によって、約８６．０００〜９０．０００ドルトンと決 定される。

この同じＤＮＡポリメラーゼの分子量は、予想アミノ酸配列により決定する場合 、約９４．０００ダルトンであると計算される。

従って、完全な長さのＤＮＡポリメラーゼの分子量はこの数値を決定するために 用いられる方法に依存し、そして８６．０００−９５．０００ダルトンの範囲に ある。

本発明の熱安定酵素は、この酵素をコードする遺伝子がテルムス・アクアチフス （Ｔｈｅｒｍｕｓ　結上１匡■）ゲノムＤＮＡからクローン化されたとき、組換 えＤＮＡ技術によって産生させることもできる。テルムス・アクアチフス（Ｔａ ｑ）ポリメラーゼについての完全なコード配列は、約１８ｋｂ　（キロベース） のゲノムＤＮＡインサートフラグメント内に含まれる約３．５ｋｂ（７）　Ｂｇ ｌ　Ｉｔ　−Ａｓｐ７１８　（部分）制限フラグメント上バクテ’）オファージ ＣＨ３５：　Ｔａｑ　＃４−２から誘導することができる。このバクテリオファ ージは、１９８７年５月２９日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ン（ＡＴＣＣ）に寄託され、寄託番号第４０，３３６号を有する。また、この遺 伝子は、プラスミドｐＦＣ８３（ＡＴＣＣ第６７、４２２号、１９８７年５月２ ９日寄託）から単離された〜７３０塩基対（ｂｐ）のＢｇｌ　ＩＩ　　Ｈｉｎｄ 　ｍ制限フラグメントを、プラスミドｐＦＣ８５（ＡＴＣＣ第６７．４２１号、 １９８７年５月２９日寄託）がら単離された〜２．６８ｋｂ　Ｈｉｎｄｎｌ　　 Ａｓｐ７１８制限フラグメントに連結することによって造成することができる。

　ｐＦｃ８３制限フラグメントはＴａｑポリメラーゼ遺伝子のアミノ末端を有す るが、ｐＦＣ８５からの制限フラグメントはカルボキシ−末端を有する。

したがって、これらの２個のフラグメントを、適当な制御配列ををする対応して 消化されたベクターと連結すると、全長Ｔａｑポリメラーゼの翻訳が得られる。

前記のように、好ましい熱安定酵素のＤＮＡ及び推定アミノ酸配列は第１図に示 される。前記のＮ−末端欠失に加えて、Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子の全コード配 列は、所望の酵素活性を有する生物学的に活性な遺伝子生成物を回収することを 必要としないことも見出された。アミノ末端の欠失であって、コード配列の約３ 分の１が不在であるものが、ポリメラーゼ分析において完全に活性な遺伝子生成 物を産生じた。

Ｎ−末端の欠失に加えて、Ｔａｑポリメラーゼを構成するペプチド鎖中の個々の アミノ酸残基は、酸化、還元、またはその他の誘導体化によって改変することが でき、そしてこの蛋白質を開裂して、活性を保持するフラグメントを得ることが できる。活性を破壊しないかかる変更は、遺伝子の定義から上記蛋白質をコード するＤＮＡ配列を除外しない。

したがって、翻訳の間に配列に組み込まれるアミノ酸の欠失、付加または変更に よる二次構造自体の改変は、蛋白質の活性を破壊することなく行うことができる 。かかる置換またはその他の変更は、本発明の予想された範囲内にあるＤＮＡに よってコードされたアミノ酸配列を有する蛋白質をもたらす。

本発明の精製された８６，０００〜９５，０００ドルトンのポリメラーゼで免疫 したウサギからのポリクローナル抗血清を用いて、テルムス・アクアチフス（Ｔ ｈｅｒＩｌｕｓ　剪！国国■）の部分ゲノム発現ライブラリーをプローブして、 下記のようにして適当なコード配列を得た。クローン化されたゲノム配列は融合 ポリペプチドとして発現させたり、それ自体の制御配列を用いて直接に発現させ たり、または酵素の発現に用いられる特定の宿主に好適な制御配列を用いる構成 によって発現させることができる。

勿論、これらの配列をコードするＤＮＡ入手可能性は、コドン配列を改変してＤ ＮＡポリメラーゼ活性をも有するムティン（ｍｕｔｅｉｎ）形を生じるようにす る機会を提供する。

例えば、これらの手段は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのための完全なコード配列 を提供して、これから、各種の宿主系に適用できるものを発現ベクター構成し、 そしてコード配列を発現することができる。以上のことから、Ｔａｑポリメラー ゼコード配列の部分はプローブとして有用であり、色々な種のその他の熱安定ポ リメラーゼコード配列を回収するためのプローブとして有用である。したがって 、少なくとも６個のアミノ酸をコードするゲノムＤＮＡの部分をＥ、コリ（Ｅ、 　ｅｏｌｉ）において複製することができ、そして少なくとも６個のアミノ酸を コード化し且つ熱安定ポリメラーゼをコード化するその他のＤＮＡを回収するた めに使用されるプローブまたはオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブとして 用いられる変形した形態のものを合成することができる。テルムス・アクアチフ ス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　皿」旦江旦）におけるヌクレアーゼ配列とその他の種類の 対応する部分の配列は正確には一致しないことがあるので、（６個のアミノ酸ス トレッチをコードする）約１２〜１８個のヌクレオチドを有するオリゴマーは、 恐らく、間違った陽性を排除するのに十分なストリンジエンシー条件下でハイブ リダイゼーションを行うのに必要であろう。６個のアミノをコードする配列は、 かかるプローブに十分な情報を供給するであろう。

一般的な言い方では、組換え形のＴａｑポリメラーゼの製造は、以下のような工 程を含む。

第−に、成熟酵素（この場合、総てのムティンを含むように用いられる）、ある いはＴａｑポリメラーゼとその活性を破壊しない追加の配列との融合体または制 御された条件下で（例えば、ペプチドでの処理によるような）の開裂して他の蛋 白質をもたらすことができる追加の配列との融合体をコード化するＤＮＡを得る 。配列がイントロンによって中断されていないときには、それは如何なる宿主に おける発現にも好適である。この配列は、切り出し可能で且つ回収可能な形であ るべきである。

次に、好ましくは、切り出されたまたは回収されたコード配列を、複製可能な発 現ベクター中の好適な制御配列と作用可能に連結する。このベクターを用いて、 好適な宿主を形質転換し、形質転換された宿主を好ましい条件下で培養して、組 替えＴａｑポリメラーゼを産生させる。任意には、Ｔａｑポリメラーゼを培養液 または細胞から単離するが、ある種の不純物が許容される場合には、蛋白質の回 収および精製は必要でないこともある。

上記の段階のそれぞれは、各種の方法で行うことができる。

例えば、所望のコード配列をゲノムフラグメントから得て、適当な宿主に直接用 いることもできる。各種の宿主で作用可能な発現ベクターの造成は、以下のよう な適当なレプリコンを用いて行なわれる。好適な制限部位は、通常は利用可能で ない場合には、コード配列の末端に加えて切り出し可能な遺伝子を得、これらの ベクターに抽入することができる。

制御配列、発現ベクターおよび形質転換法は、遺伝子を発現するのに用いられる 宿主細胞の型によって異る。一般的には、原核細胞、酵母、昆虫または哺乳類細 胞が、宿主として現在有用である。原核宿主は、一般的には組換え蛋白質の産生 にとって最も有効で好都合であり、それ故Ｔａｑポリメラーゼの発現にとって好 ましい。

Ｔａｑポリメラーゼの特定の場合には、組換え条件下および自然条件下のいずれ においても、蛋白質のＮ−末端でかなり欠失が起こり、そして蛋白質のＤＮＡポ リメラーゼ活性はなお保持されたままであることを示す証拠が存在する。単離さ れた天然蛋白質は、蛋白質分解による減成の結果であり、不完全な遺伝子の翻訳 の結果ではない、プラスミドｐＦＣ８５の不完全な遺伝子から産生されたムティ ンは、しかしながら、ＤＮＡポリメラーゼの分析で完全な長さを有する配列をコ ード化するＤＮＡから産生されたムティンと同様に、完全に活性である。ある種 のＮ末端が短縮された形は活性であることが明らかであるので、用いられる遺伝 子構成またはポリメラーゼの発現も、対応する短縮された形状のコード配列を有 することがある。

原核生物は、最も一般的には、Ｅ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｔ）の各種株によっ゛て 代表される。しかしながら、バシルス属、例えばバシルス・ズブチリス（Ｂａｃ ｉｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、各種のシュドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａ ｓ）またはその他の菌株のような他の微生物株を用いることもできる。かかる原 核系では、宿主と適合性の種に由来する複製部位と制御配列を有するプラスミド ベクターが用いられる。例えば、Ｅ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）は、典型的には、 ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら、膿、１９７７年、２巻、９５頁によるＥ、コリ （Ｅ、　ｃｏｌｉ）種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用い て形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の 遺伝子を有し、所望のベクターを造成する際に保持されまたは破壊される付加的 マーカーを提供する。転写開始を促進し、任意にはオペレーターを有し且つリボ ゾーム結合部位配列を有する本明細書記載の一般的に用いられる原核制御配列に は、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモー ター系〔チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７７年）１９８巻、１ ０５６頁）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系〔ゲーデル（Ｇｏｅｄｄ ｅｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８０年）８巻、４０ ５７頁〕、およびλ由来のＰＬプロモーター〔シマタケ（Ｓｈｉｓａｔａｋｅ） 　　ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１年）２９２巻、１２８頁〕および輸送可能な制 御カセットとして有用なＮ−遺伝子リボゾーム結合部位があり、これはポータプ ル制御カセットとして有用にされており、このものはＮ□Ｓ配列の６ｂ９３’内 での開裂を可能にする少なくとも１個の制限部位を有する第三のＤＮＡ配列のＮ ＲＢＳ上流に対応する第二のＤＮＡ配列に操作可能に連結したＰ、プロモーター である第−ＤＮＡ配列を含んで成る。チャン（Ｃｈａｎｇ）らの欧州特許出願公 開第１９６，８６４号明細書（１９８６年１０月８日発行）に記載され、同じ承 継人に承継されたホスファターゼＡ（ｐｈｏＡ）系も有用である。しかしながら 、原核生物に適合性の如何なる利用可能なプロモーターも用いることができる。

細菌に加えて、酵母のような真核微生物も宿主として用いることができる。サツ カロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ−ｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ）の実験室菌株であるパン酵母が最も多く用いられるが、その他の多くの菌 株も一般的に利用可能である。２ミクロン複製開始点用いるベクターが示されて いるが〔ブローチ、ジェイ、アール（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、Ｒ，）、Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚ。

（１９８３年）１０１巻、３０７頁〕、酵母の発現に好適な他のプラスミドベク ターも知られている［例えば、スチンクコンブ（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ）ら、Ｎ ａｔｕｒｅ　（１９７９年）２８２巻、３９頁、チェンベ（Ｔｓｃｈｅｗ＋ｐｅ ）ら、Ｇｅｎｅ　（１９８０年）１０巻、１５７頁およびクラーク（Ｃ１ａｒｋ ｅ）ら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、　（１９８３年）１０１巻、３００頁を参照された い〕。酵母ベクターに対する制御配列は、解糖酵素の合成のプロモーターを有す る〔ヘス（Ｈｅｓｓ）ら、ムル比、Ｅｎｚ戸１１１゜（１９６８年）７巻、１４ ９頁、ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）　ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ−観圏■（１９７８年 ）１７巻、４９００頁〕。

その他の当業界に知られているプロモーターには、３−ホスフィングリセレート ・キナーゼ（ヒッ゛ンエマン（Ｈｉｔｚｅｓａｎ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ 、　（１９８０年）２５５巻、２０７３頁）およびその他の解糖酵素、例えばグ リセルアルデヒド−３−ホスフェ・−ト・デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、 ピルベート・デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６− ホスフェート・イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベート ・キナーゼ、トリオセホスフェート・イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラ ーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターがある。増殖条件による制御される追 加の利点を有するその他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イ ソチトクロームＣ１酸性ホスフアターゼ、窒素代謝に関係する分解酵素およびマ ルトースおよびガラクトース利用に関する酵素のプロモーターである（ホランド （Ｈｏｌ　１ａｎｄ）同上〕。

ターミネータ−配列は、コード配列の３′末端において望ましいと思われる。か かるターミネータ−は、酵母由来の遺伝子におけるコード配列に続く３′非翻訳 領域に見出される。

示されたベクターの多くはプラスミドｐｅｎｏ４６を有するエノラーゼ遺伝子〔 ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ、　Ｍ、、Ｊ、）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＋＋。

（１９８１年）２５６巻、１３８５頁〕またはＹＥｐ１３から得られるＬＥＬＩ 　２遺伝子〔ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、）ら、Ｇｅｎｅ　（１９７８年） ８巻、１２１頁〕から誘導される制御配列を有するが、酵母適合性プロモーター 、複製開始点およびだの制御配列を有する如何なるベクターも好適である。

勿論、多細胞生物に由来する真核宿主細胞培養液においてポリペプチドをコード する遺伝子を発現させることも可能である０例えば、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、クルゾ（Ｃｒ ｕｚ）とパターリン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）監修（１９７３年）を参照されたい 。有用な宿主細胞系には、ネズミミエローマＮ５１、ＶＥＲＯおよびＨｅ１ａ細 胞、およびテンジクネズミ卵巣（ＣＩＯ）細胞がある。これらの細胞の発現ベク ターは、通常は、シミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）からの一般的に用いられ る早期および後期プロモーター（フィールス（Ｆｉｅｒｓ）　ら、Ｎａｔｕｒｅ 　（１９７８年）２７３巻、１１３頁）、またはポリオーマ、アデノウィルス２ 、ウシパピローマウィルスまたはトリザルコーマウィルスに由来するようなプロ モーター、または免疫グロブリンプロモーターおよび熱シヨツクプロモーターの ような哺乳類細胞に適合性のプロモーターおよび制御配列を有する。

ＢＰＶをベクターとして用いる哺乳類系におけるＤＮＡ発現系は、米国特許第４ ．４１９．４４６号明細書に開示されている。この系の変形は、米国特許第４， ６０１．９７８号明細書に記載されている。哺乳類細胞系の形質転換の一般的態 様は、米国特許第４．３９９．２１６号明細書に記載されている。「エンハンサ −」領域が、最適な発現において重要であると思われるが、これらの領域は一般 的にはプロモーター領域の上流に見出される配列である。所望であるならば、複 製開始点をウィルス源から得ることができる。しかしながら、染色体への組み込 みは、真核生物でのＤＮＡ複製では一般的な機構である。

植物細胞も宿主として利用可能であり、植物細胞に適合する制御配列、例えばツ バリン・シンターゼ・プロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列（デピフ カー（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ。

Ａ、）ら、Ｌμ状Ｊ肝！、Ｇｅｎ、　（１９８２年）１巻、５６１頁）が利用で きる。

更に、最近では、バクロウィルス・ベクターによって提供される制御系を利用す る昆虫細胞を用いた発現系も報告されている〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｄ、Ｗ 、）ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｔｎ（１９８６年）、セトロウ（Ｓ ｅｔｌｏｗ、　Ｊ、に、）ら監修、ブレナム・パブリッシング（Ｐｌｅｎｕｍ　 Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）　、８巻、２７７〜２９７頁〕。

これらの系はＴａｑポリメラーゼの産生にも成功している。

用いる宿主細胞に依存して、形質転換はその細胞に適当な標準的な技術を用いて 行なわれる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理（コーヘン（Ｃｏｈｅｎ、 　Ｓ、Ｎ、）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

監ｉ、（ＵＳ旺（１９７２年）６９巻、２１１０頁）は、原核生物またはその他 の実質的な細胞障壁を有する細胞に用いられる。アグロバクテリウム・チュメフ ァシエンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋　ｔｕ＋５ｅｆａ−劇μ型）での感 染〔シアウ（Ｓｈａｗ、　Ｃ，Ｈ，）ら、Ｇｅｎｅ　（１９８３年）２３巻、３ １５頁〕は、ある種の植物細胞で用いられる。上記のような細胞壁を持たない哺 乳類細胞では、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）とヴアン・デル・ニブ（ｖａｎ　ｄｅ ｒ　Ｅｂ）のリン酸カルシウム沈澱法が好ましい〔■匹且■（１９７８年）５２ 巻、５４６頁〕。酵母への形質転換は、ヴアン・ゾリシゲン（ＶａｎＳｏｌｉｎ ｇｅｎ、　Ｐ、）ら（Ｊ、Ｂａｃｔ、、１９７７年、１３０巻、９４６頁）およ びシアオ（Ｈｓｉａｏ。

Ｃ，Ｉ、、）　ら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　、１ ９７９年、７６巻、３８２９頁）の方法によって行なわれる。

所望の蛋白質をコードするＤＮＡ、例えばＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮ Ａをバクテリオファージλｇｔｌｌを用いて単離する方法は、次の通りである。

ライブラリーは、テルムス・アクアチフスＣＴｈｅｒｒａｕｓ　ａ　ｕａｔｉｃ ■）　ＤＮＡの完全な消化によって生じ、λｇｔｌｌファージのＥｃｏＲ１部位 に挿入されたＥｃｏＲ１部位を両端に有するＡｌｕ　Ｉフラグメントから構成さ れ得る〔ヤング（Ｙｏｕｎｇ）とデービス（Ｄａｖｉｓ）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ。

飽ムＵＳＡ、１９８３年、８０巻、１１９４〜１１９８頁〕、このバクテリオフ ァージ中のユニークＥｃｏＲＩ部位がβ−ガタラトシダーゼ遺伝子のカルボキシ 末端に配置しているので、（適当なフレームおよび方向で）挿入されたＤＮＡは 、ラクトースオペロンプロモーター／オペレーターの制御下でβ−ガラクトシダ ーゼと融合した蛋白質として発現される。

ゲノム発現ライブラリーを次に抗体プラークハイブリダイゼーション法を用いて スクリーニングする。この方法は「エピトープ選択」と呼ばれ、このファージに よってコードされた融合蛋白質配列に対する抗血清を用いてハイブリッド形成し たプラークを同定するものである。例えば、この組換えファージのライブラリー は、８６．０００〜９５，０００ドルトンのＴａｑポリメラーゼを認識する抗体 を用いてスクリーニングして、この蛋白質の抗原決定基をコードするＤＮＡセグ メントを有するファージを同定することができる。

約２Ｘ１０’個の組換えファージを、全ウサギＴａｑポリメラーゼ抗血清を用い てスクリーニングする。この−次スクリーニングでは、陽性シグナルが検出され 、これらのプラークの１種以上が、免疫前血清と反応せず且つ免疫血清と反応す る候補プラークから精製され、幾分詳細に分析される。組換えファージによって 産生される融合蛋白質を検査するため、宿主Ｙ１０８９におけるファージの溶原 株を得る。溶原株を誘発し、生成する蛋白質をゲル電気泳動した後、それぞれの 溶原株が他の溶原株には見られない新たな蛋白質を産生ずるのを観察することが でき、または重複配列が生じることもある。

陽性シグナルを有するファクターを取り出す。ここに記載する例においては陽性 プラークを取り出して更に同定を行ない、低密度で再プレートして組換体を純化 し、純化したクローンをＥｃｏＲＩ制限酵素での消化によるサイズクラスによっ て分析した。次に、プローブを単離されたＤＮＡ挿入配列から作り、適当に標識 を行い、そしてこれらのプローブをマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ ｓ１９８２年に記載されている通常のプラークハイブリダイゼーション又はコロ ニーハイブリダイゼーション分析法に用いることができる。

標識したプローブを用いて、シャロン（Ｃｈａｒｏｎ）　３５バクテリオフアー ジ中に構成された第二のゲノムライブラリーをプローブした（ウイルヘルマイン （Ｗｉｌｂｅｌｍｉｎｅ、　Ａ、Ｍ、）ら、Ｇｅｎｅ、１９８３年、２６巻、１ ７１〜１７９頁）、このライブラリーは、テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒ＋ ｗｕｓ　皿シ匹匡巨）ゲノムＤＮＡの５ａｕ３Ａ部分消化によって作られ、そし てサイズ分別したフラグメント（１５〜２０ｋｂ）をシャロン３５フアージのＢ ａ５ｉｎ　１部位にクローン化した。このプローブを用いて、Ｔａｑポリメラー ゼをコードするＤＮＡを含むファージを単離した。　ＣＨ３５：　Ｔａｑ＃４− ２と命名した生成するファージの一つは、全遺伝子配列を有することが判明した 。この遺伝子の部分をコードする部分配列も単離された。

所望のコード配列および制御配列を含有する好適なベクターの造成は、当業界で 周知の標準的な連結および制限技術を用いる。単離したプラスミド、ＤＮＡ配列 または合成されたオリゴヌクレオチドを開裂し、ととのえ、そして再連結して所 望の形状にする。

部位特異的ＤＮＡ開裂は、当業界で周知の条件下で好適な（１種以上の）制限酵 素を用いて処理することによって行ない、その詳細はこれらの市販の制限酵素の 製造業者によって記載されている。例えば、二ニー・イングランド・バイオラプ ス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　、製品カタログを参照された い。

一般的には、約１〜のプラスミドまたはＤＮＡ配列を、約２゜Ｉの緩衝溶液中で １単位の酵素で開裂し、本明細書の実施例では、典型的には、過剰量の制限酵素 を用いてＤＮＡ基質を完全に消化するようにしている。約３７°Ｃで約１〜２時 間のインキュベーション時間が有効であるが、変更を行なうこともできる。それ ぞれのインキュベーションの後に、蛋白質をフェノール／クロロホルムで抽出し て、次いでエーテル抽出を行なうことによって除去して、核酸を水性分画からエ タノール沈澱によって回収することができる。所望ならば、開裂フラグメントの サイズ分離を、標準的技術を用いるポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲ ル電気泳動によって行なうことができる。サイズ分離の一般的説明については、 ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｓｏｌｏｇｙ、１９８０年、６５巻、４９９〜５６ ０頁に記載されている。

制限開裂したフラグメントを、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７，６，５゜−ｎのＮａ Ｃｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ−ｚ　、１０ｍＭのＤＴＴおよび５０〜１００尤のｄ ＮＴＰｓ中で、２０〜２５℃で約１５〜２５分間のインキュベーション時間を用 いて、４種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェ）　（ｄＮＴＰ）の存在でＥ 、コリ（ｔ！、ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ！　（フレノウ（Ｋｌｅｎ ｏｅｖ）　）の大フラグメントで処理することによって平滑末端にすることがで きる。フレノウフラグメントは５′接着末端をフィルインするが、４種のｄＮＴ Ｐｓが存在していても、突出する３′単一鎖をチューバック（ｃｈｅｗｓｂａｃ ｋ）する。所望ならば、接着末端の性状によって指定される制限内で唯１種のま たは選択された複数のｄＮＴＰｓを供給することによって選択的修復を行なうこ とができる。フレノウで処理した後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出 し、エタノールで沈澱させた。適当な条件下でＳｌヌクレアーゼを用いて処理す ると、単一鎖部分の加水分解が起こる。

合成オリゴヌクレオチドは、マテウチ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）ら（ＬＡｍ、Ｃｈ ｅ＋ｎ、Ｓｏｃ、、１９８１年、１０３巻、３１８５〜３１９１頁）のトリエス テル法を用いて、または自動合成法を用いて調製することができる。アニーリン グの前のまたは標識のための単一鎖のキナーゼ処理は、５０５Ｍのトリス、ｐＨ ７，６，１０＋ｗＭのＭｇＣｆｚ、５１のジチオスレイトール、１〜２ｗＭのＡ ＴＰの存在下で、１ｎＨの基質に対して過剰量の、例えば約１０単位のポリヌク レオチドキナーゼを用いて行なう。このキナーゼ処理がプローブの標識するため のものであるときには、ＡＴＰは高比活性のＴ　３！ｐを有する。

連結は、下記の標準的条件及び温度で１５〜３０１Ｘ１の容積で行なう、　２０ ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！、（ｐＨ７，５）　１０ａ＋Ｍ　ＭａＣｆ　ｚ　、　 １０ｍＭ　ＤＴＴ。

３３ｔｒｇ／ｌｄ　ＢＳＡ、　１０ｓ＋Ｍ〜５０ｍＭのＮａＣｌ、および（「接 着末端」の連結には）４０−のａｒｐ　、０．ｏｌ　〜ｏ、０２　（ワイス（Ｗ ｅｉｓｓ）　）単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ、０℃；または（「平滑末端」の連 結には）１−ＭのＡＴＰ　、　０．３〜０．６　（ワイス（Ｗｅｉｓｓ）　３単 位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ、１４°Ｃ０分子内「粘着末端」連結は、通常は３３ 〜１００ｘ／ｄの総ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＨの総末端濃度）で行なう。分子 間平滑末端連結（通常は１０〜３０倍の過剰モルのリンカ−を用いる）は、１岸 の総末端濃度で行なう。

「ベクターフラグメント」を用いるベクターの造成では、ベクターフラグメント を通常は細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理して５′ホスフエート を除去して、ベクターの再連結を防止する。ＢＡＰ消化は、ｐＨ８で、約１５０ ｍＭのトリス中で、Ｎａ＋およびＭ　ｇ　＋　＠の存在で、ベクター１■当たり 約１単位のＢＡＰを用いて、６０°Ｃで約１時間行なう。核酸フラグメントを回 収するため、調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱せし める。また、好ましくないフラグメントを追加的制限酵素消化によって二重消化 されたベクターでは、連結は防止することができる。

配列の改変を必要とするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来するベクターの部分 については、部位特異的なブライマー指令変異誘発を用いる。この技術は現在で は当業界で標準的であり、所望の変異を表わす限定されたミスマツチを除いて変 異誘発されるべき単一鎖ファージＤＮＡに相補的なブライマー合成オリゴヌクレ オチドを用いて行なわれる。要約すれば、ファージに相補的な鎖の合成を指令す るブライマーとして合成オリゴヌクレオチドを用い、生成する二本鎖ＤＮＡをフ ァージ支持性の宿主細菌に形質転換する。形質転換された細菌の培養液を上層寒 天に塗布しファージを有する単一細胞からプラークを形成させる。

理論的には、新たなプラークの５０％は変異形を単一鎖として有するファージを 含み、５０％はもとの配列を有する。ブラ−りをニトロセルロースフィルターに 移して、正確にマツチするハイブリダイゼーション可能にし且つもとの鎖とのミ スマツチがハイブリダイゼーションを防止するのに十分であるような温度で、キ ナーゼ処理した合成プライマーで「リフト（ｌｉｆｔｓ）　Ｊハイブリダイゼー ションを行なう。次に、このプローブとハイブリッド形成するプラークを採取し て、培養し、ＤＮＡを回収する。

以下の造成では、プラスミド造成物の正確な連結を、最初に連結混合物を用いて Ｅ、コリ（ｒＩＣｏ　１　ｉ　）　ＭＭ２９４株または他の適当な宿主を形質転 換することによって確かめる。当業界で理解されているように、好結果の形質転 換体を、プラスミド造成の方式に依存してアンピシリン耐性、テトラサイクリン 耐性またはその他の抗生物質耐性によって選択する。次に、形質転換体からのプ ラスミドを、フレウェル（Ｃｌｅｗｅ１１．　Ｄ、Ｂ、）ら、（Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　１９６９年、６２巻、１１５９頁）の方法 により、場合によってはクロラムフェニコール増幅法（フレウェル（Ｃ１ｅｅ１ ｅ１１．　ｏ、ａ−）＋　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、１９７２年、１１０巻 、６６７頁）によって調製する。単離したＤＮＡを、制限処理により分析しそし て／又はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ＋　Ｆ、）ら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　１９７７年、７４巻、５４６３頁）のジデオキシ法であて 更にメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｔｄｓ展、１９８ １年、９巻、３０９頁）によって記載されている方法またはマクサム（Ｍａｘａ ｍ　）ら（厘旦剋■Ｌ旦Ｕ鯨旦■、１９８０年、６５巻、４９９頁）の方法によ って配列決定する。

この発明においてクローニング及び発現に用いられる宿主菌株は、次の通りであ る。

クローニング及び配列決定、並びにほとんどの細菌性プロモーターの制御下での 造成物の発現には、Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｔ）ゲネチック・ストック・センター ＧＣＳＧ＃６１３５から得たＥ、コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＭＭ２９４を宿主と して用いた。ｐｔ？Ｊｍ＊ｓプロモーターの制御下での発現には、Ｅ、コリ（Ｅ 、　ｃｏｌ　ｉ）　Ｋ　１２株ＭＣ１０００λ溶原株、ＮＪｓｓＣ１８５７Ｓｕ ｓＰ＠６、ＡＴＣＣ３９５３１を用いることができる。本明細書では、１９８７ 年４月７日にＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ５３６０６）で寄託したＥ、コリ（Ｌ匹旦）Ｄ Ｇ１１６、及び１９８５年３月２９日にＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ５３０７５）に寄託 されたＥ、コリＫＢ２を用いる。

Ｍ１３ファージ組換体のためには、ファージ感染を受けやすいＥ、コリ（Ｅ、　 ｃｏｌｉ）　、例えばＥ、コリに１２株ＤＧ９８を用いる。

ＤＧ９８株は１９８４年７月１３日にＡＴＣＣ寄託され、寄託番号３９７６８を 有する。

哺乳１での発現はＣＯ５−７，Ｃ０５−Ａ２．　ＣＶ−１およびネズミ細菌で行 うことができ、そして昆虫細胞ではスポドプテラ・フルジペイダ（釘列〃ぶ二ロ ℃１１畦蝕）での発現を基礎とする。

前記の精製法に加えて、本発明の熱安定ポリメラーゼは疎水性相互作用クロマト グラフィーを用いて精製することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィー は、疎水性基を含有する非荷電の床材料との疎水性相互作用の強さの差に基いて 物質を分離する分離技法である。典型的には、カラムはまず、疎水性結合に好都 合な条件、例えば強イオン強度、のもとて平衡化される。サンプルを溶出するの に低下する塩勾配を用いることができる。

本発明によれば、水性混合物（生来のポリメラーゼ又は組換ポリメラーゼを含有 する）が、フェニルセファロース（ファルマシアにより製造される）又はフェニ ルＴＳＫ　（東ソーにより製造される）のごとき比較的強疎水性のゲルを含むカ ラムに付加される。フェニルセファロースカラムとの疎水性相互作用を促進する ため、例えば０．２Ｍ又はそれより高濃度の硫酸アンモニウムを含有する溶剤が 使用され、０．２Ｍが好ましい、すなわち、カラム及びサンプルは５０５Ｍ　Ｔ ｒｉｓ−１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中０．２Ｍ硫酸アンモニウムに調整され、そして このサンプルがカラムに適用される。カラムは０．２Ｍ硫酸アンモニウム緩衝液 により洗浄′される。次に酵素を、例えば低下する塩勾配、エチレングリコール もしくはプロピレングリコール、又は尿素のごとく疎水性相互作用を低下させる 溶剤により溶出することができる。Ｔａｑポリメラーゼのために好ましい態様は 、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液及び２０％エチレングリコールを含有するＴｒｉｓ −ＥＤＴＡ緩衝液により次々と洗浄することを含む。次に、Ｔ　ａ、　ｑポリメ ラーゼはＴｒｉｓ−ＩＥＤＴＡエチレングリコール緩衝液中０−４Ｍ尿素グラジ ェントによりカラムから溶出される。

酵素は、長期間安定にするためには、１種又は複数種の非イオン性ポリマー性洗 剤を含む緩衝液中に貯蔵しなければならない、この様な洗剤は一般的には分子量 が約１００〜２５０　、０００の範囲であり、好ましくは約４．０００〜２００ ．０００ドルトンであり、ｐｌ’ｌが約３．５〜約９．５、好ましくは約４〜８ ．５で酵素を安定化するものである。この様な洗剤の例としては、マツグ・クチ ェオン（ＭｃＣｕ　ｔｃｈｅｏｎ）のむ凪刀工１ｅｒｓ　＆　Ｄｅｔｅｒ　ｅｎ ｔｓ、北アメリカ版（１９８３年）エムシー・パブリッシング・カンパニー（Ｍ ＣＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、）のマツグ・クチェオン部門発行、１７５、ロ ックロード、グレンロック、ニュージャージ（米国）、の２９５〜２９８頁に記 載されているものがあり、その詳細については上記文献を参照されたい。好まし くは、洗剤はエトキシル化した脂肪族アルコールエーテルおよびラウリルエーテ ル、エトキシル化したアルキルフェノール、オクチルフェノキシポリエトキシエ タノール化合物、改質オキシエチル化したおよび／またはオキシプロピル化した 直鎖状アルコール、ポリエチレングリコールモノオレエート化合物、ポリソルベ ート化合物およびフェノール性脂肪族アルコールエーテルからなる群から選択さ れる。更に詳細には、好ましくは、ポリオキシエチル化（２０）ソルビタンモノ ラウレートであるツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０　　（Ｉ　ＣＩ　・アメリカス・ インコーボレーテド（ＩＣＩＡｍｅｒｉｃａｓ　Ｉｎｃ、）、ウイルミントン、 ＤＥＩおよびエトキシル化アルキルフェノール（ノニル）であるイコノール（Ｉ ｃｏｎｏｌ）（登録商標）　ＮＰ−４０（バスフ（ＢＡＳＦ）イアンドット・コ ーポレーション、パーシバニー、ニューシャーシー）である。

本発明の熱安定酵素は、この酵素が必要であるかまたは望ましいような目的に用 いられる。特定の好ましい態様では、この酵素は下記のような増幅プロトコール に用いられる。

本発明の酵素を用いる増幅プロトコールは、１９８７年７月２８日に発行された 米国特許ｋ　４．６８３．２０２　（引用によりその記載を本明細書に組み入れ る）に記載されている、既存の核酸配列を増幅する方法である。しかしながら、 この酵素は下記のような増幅工程で用いるのが好ましい。

更に具体的には、この増幅方法は、核酸または核酸の混合物に含まれる少なくと も１種の特定の核酸配列を増幅することを含み、核酸が二本鎖である時には、こ の核酸が同じまたは異なる長さの２本の別々の相補的鎖からなり、（ａ）それぞ れの核酸鎖を、４個の異なるヌクレオチドトリホスフェートと増幅されるべきそ れぞれの異なる特定の配列について１個のオリゴヌクレオチドプライマーとに接 触させ、但しそれぞれのブライマーはそれぞれの特定の配列の異なる鎖に実質的 に相補的であるように選択され、１個のブライマーから合成された伸長生成物が 、その相補体から分離したとき、他のブライマーの伸長生成物の合成の鋳型とし て働くことができるようにし、上記接触を、それぞれのブライマーのその相補的 核酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する温度で行い； （ｂ）それぞれの核酸鎖を、工程（ａ）と同時にまたはこの工程の後に、ヌクレ オチドトリホスフェートの結合を可能にするテルムス・アクアチフス由来のＤＮ Ａポリメラーゼと接触させて、それぞれの核酸のそれぞれの鎖に相補的なブライ マー伸長生成物を形成し； （Ｃ）酵素の活性化し、そして増幅されるべきそれぞれの異なる配列について、 それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのブライマーの伸長生成物を合成する ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型か ら分離する程の高温ではない温度において、酵素の活性を促進するために有効な 時間にわたり、工程（ｄ）からの混合物を保持し： （ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型から該プライマー伸長生 成物を分離して一本鎖分子を生成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし 酵素を不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、有効な時間にわた り、工程（Ｃ）からの混合物を加熱し；（ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、それ ぞれのブライマーの工程（ｄ）で産生される一本鎖分子のそれぞれへのハイブリ ダイゼーションを促進するために有効な温度に有効な時間にわたり冷却し； （ｆ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそれぞれの異なる配列につ いて、工程（ｄ）で産生されるそれぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのブラ イマーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸 長生成物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温度において、有効 な時間にわたり、工程（ｂ）からの混合物を保持し、工程（ｅ）および（ｆ）を 同時にまたは順次に行うことを特徴とする方法を提供する。

工程（ｄ）〜（ｆ）は、所望な水準の配列の増幅が得られるまで繰り返すことが できる。

この増幅方法は、既存の完全に特徴付けられた核酸配列の多量生産のためのみな らず、存在することは知られているが完全には特徴付けられていない核酸配列を 生産するためにも有用である。いずれの場合には、増幅されるべき配列の最初の コピーは入手可能でなければならないが、純粋な又は個別の分子である必要はな い。

一般的には、増幅工程は、連鎖反応であって、関与する反応段階の数に関して対 数的な量で少なくとも１種の特異的核酸配列を産生ずる連鎖反応からなる。但し 、（ａ）所望な配列の末端が十分詳細に知られており、それらにハイブリッド形 成するオリゴヌクレオチドを合成することができ、（ｂ）少量の配列を連鎖反応 を開始するのに利用することができることを条件とする。連鎖反応の生成物は、 用いられる特定のブライマーの末端に対応する末端を有する別個の核酸デュプレ ックスであろう。

精製されたまたは未精製の形の如何なる核酸配列も、それが所望の特定の核酸配 列を含むかまたは含むと考えられる場合には、出発核酸として用いることができ る。したがってこの工程は、例えばＤＮＡまたはメツセンジャーＲＮＡを包含す るＲＮＡを用いることができ、これらのＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖または二本 鎖であってもよい。更に、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであってそれぞれの１つ づつの鎖を有するものを利用することもできる。これらの核酸のいずれかの混合 物を用いることもでき、または同じまたは異るブライマーを用いて先行する増幅 反応から産生された核酸も同様に用いることができる。増幅されるべき特定の核 酸配列は大きな分子の単なる部分であってもよく、または最初から別個な分子と して存在し、該特定の配列が全核酸を構成していてもよい。

増幅される配列は純粋な形で存在することは必要ではなく、複雑な混合物の少量 分画、例えば全ヒトＤＮＡに含まれるβ−グロビンの一部分（サイキ（Ｓａ　ｉ 　ｋ　ｉ　）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３０巻、１５３０〜１５３４頁、１９８５ 年、に例示されているようなもの〕または、特定の生物学的試料の極少量部分の みを構成する特定の微生物の核酸配列の一部分であることもできる。出発核酸配 列は１種又は複数の所望の特定の核酸配列を有し、この配列は同じでも異なるも のであってもよい。それ故、この増幅工程は、ある種の特定の核酸配列を多量に 産生ずるのに有用であるだけでなく、同じまたは異る核酸分子に配置された１種 以上の異る特定の核酸配列を同時に増幅するのにも有用である。

１種又は複数種の核酸は、如何なる由来からも得ることができ、例えばｐＢＲ３ ２２のようなプラスミド、クローン化されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、または細菌 、酵母、ウィルス、オルガネラおよび植物または動物のような高等生物のあらゆ る由来の天然ＤＮＡまたはＲＮＡから得ることもできる。ＤＮＡまたはＲＮＡは 血液、組織材料例えば絨毛膜または羊膜細胞から、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ ｓ）ら、同上、２８０〜２８１頁によって記載されている方法のような各種技法 によって抽出することができる。

増幅され、その後検出される配列に特異的なプローブを用いるときには、細胞は 核酸の抽出を行なわずに直ちに用いることができ、この場合にはそれらを低張緩 衝液に懸濁して、細胞の溶解及び分子内成分の分散が起こるまで、一般的には１ 〜１５分間約９０〜１００℃に加熱する。加熱工程の後、増幅試薬を、溶解した 細胞に直接に加えることができる。

如何なる特定の核酸配列も、増幅工程によって産生ずることができる。必要なこ とは、配列の両端の十分な数の塩基が十分詳細に知られており、所望の配列の異 なる鎖と共に配列に沿った相対的な位置でハイブリッド形成する２個のオリゴヌ クレオチドブライマーを調製することができ、一つのブライマーから合成された 伸長生成物が、その鋳型（相補体）から分離した時に、画定された長さの核酸配 列へのもう一方の伸長のための鋳型として働くことができるようにすることであ る。配列の両端の塩基についての知識が多くなるに従って、標的核酸配列のため のプライマーの特異性を高くすることができ、工程の効率も高くなる。

これ以後に用いられる「プライマー」という用語は、増幅される１又は複数のフ ラグメントの末端配列に関する情報が幾分不明確である場合には特に、１種より 多くのプライマーを意味することができる。例えば、核酸配列が蛋白質配列情報 から推定される場合には、遺伝子コードの縮重による総ての可能なコドンの多様 性を代表する配列が有するブライマーの集合をそれぞれの鎖について用いられる であろう。この集合からのある１つのプライマーは、増幅されるべき所望の配列 の末端と相同であろう。

オリゴヌクレオチドプライマーは、例えば上記のホスホトリエステルおよびホス ホジエステル法又はそれらの自動化した態様のような如何なる好適な方法を用い ても調製することができる。この様な自動化した態様ではジエチルホスホルアミ ダイトを出発物質として用い、ビューケージ（Ｂｅａ−ｕａｃａｇｅ）らの方法 （Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　１９８１年、２２巻、１８５９ 〜１８６２頁）によって合成してもよい、修飾された固形支持体上でオリゴヌク レオチドを合成する方法は、米国特許第４，４５８．０６６号明細書に記載され ている。生物学的起源（例えば制限エンドヌクレアーゼ消化物）から単離したブ ライマーを用いることも可能である。

特定の核酸配列は、この配列を含有する核酸を鋳型として用いて産生される。第 一の段階は、それぞれの核酸鎖を、増幅されまたは検出されるべきそれぞれの異 なる核酸配列について、４種の異なるヌクレオチドトリホスフェートと１種のオ リゴヌクレオチドプライマーと接触させることを含む。増幅されまたは検出され るべき核酸がＤＮＡである時には、ヌクレオチドトリホスフェートはｄＡＴＰ　 、　ｄＣＴＰ　、　ｄＧＴＰおよびＴＴＰである。

核酸鎖は、追加の核酸鎖の合成用の鋳型として用いられる。

この合成は、如何なる好適な方法を用いて行なうこともできる。一般的には、そ れは、好ましくはｐＨは７〜９であり、最も好ましくは約８である水性緩衝溶液 中で起こる。好ましくは、分離された鋳型鎖を含む緩衝液に２種のオリゴヌクレ オチドプライマーを、過剰モル量で（クローン化された核酸については、通常は 約１０００：１のプライマー二鋳型比であり、ゲノム性核酸については、通常は 約１０’　　：　１のブライマー：鋳型比である）加える。しかしながら、この 方法を診断的用途に用いるときには、相補的鎖の量が知られていないことがあり 、したがって相補的鎖の量に対するプライマーの量は確定することができないこ とがあることが理解される。しかしながら、実際的には、加えられるプライマー の量は、一般的には、増幅される配列が複雑な長鎖核酸鎖の混合物中に含まれる ときには、相補的鎖（鋳型）の量に対して過剰モル量となるであろう。工程の効 率を向上するには、大過剰量が好ましい。

ヌクレオチドトリホスフェートの濃度は、増幅用の緩衝液中ではそれぞれ１５０ 〜２０Ｍであり、ＭｇＣＩ！、、は緩衝液中に１．５〜２ｗＭの量で存在するこ とにより反応の効率及び特異性を増加させる。

次に、生成する溶液を、増幅または検出されるべき核酸が二本鎖か一本鎖かに依 存して処理する。核酸が一本鎖であるときには、変性段階を用いる必要はなく、 反応混合物は、プライマーのその相補的標的（鋳型）配列へのハイブリダイゼー ションを促進する温度に保持される。このような温度は一般的には約３５℃〜６ ５℃又はそれ以上であり、好ましくは約３７〜６０°Ｃであり、効果的な時間は 一般的には０．５〜５分間であり、好ましくは１〜３分間である。好ましくは、 Ｔａｑポリメラーゼ及び１５−マー以上のブライマーについては４５〜５８℃を 用いてブライマーのハイブリダイゼーションの特異性を増加させる。プライマー が短い場合には、より低温が必要である。

もとの−末鎖の核酸に対する相補体は、それに１または２個のオリゴヌクレオチ ドプライマーを加えることによって合成することができる。適当な単一プライマ ーを加えた場合、ブライマー伸長生成物が、該ブライマー、テルムス・アクアチ フスからのＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドトリホスフェートの存在で合 成される。この生成物は該−末鎖の核酸に部分的に相補的であり、そして該核酸 鎖とハイブリダイズして等しくない長さの鎖のデュプレックスを形成し、次いで これが上記のように一本鎖に分離されて、２本の単一の分離された相補的鎖を生 成する。また、２種の適当なブライマーを一本鎖核酸に加えて、反応を行なって もよい。

核酸が二本の鎖を有するときには、これを鋳型として用いる前に核酸の鎖を分離 する必要がある。この鎖分離は、物理的、化学的または酵素的手段のような好適 な変性法によって行なうことができる。核酸の鎖を分離する好ましい物理的方法 は、核酸が完全（９９％以上）に変性するまで加熱することを含む。典型的な熱 変性の温度は約９０〜１０５°Ｃであり、時間は一般的には約０．５〜５分間で ある。好ましくは、効果的な変性温度は、９０〜１００℃であり、０．５〜３分 間である。鎖の分離は、へりカーゼとして知られている酵素のクラスからの酵素 、またはへりカーゼ活性を有しそしてリボＡＴＰの存在下でＤＮＡを変性するこ とが知られている酵素ＲｅｃＡによって誘発することもできる。ヘリカーゼを用 いて核酸の鎖を分離するのに好適な反応条件は、ターン・ホフマン−ベリング（ Ｋｕｈｎ　Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇ）、　Ｃ３Ｈ−Ｑｕａｎｔｉｔａ ｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏ　　４３巻、６３頁、１９７８年に記載されており、Ｒｅ ｃＡを用いる技法はシー・ラッシング（Ｃ，Ｒａｄｄｉｎｇ）、　Ａｎｎ、Ｒｅ ｖ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　１６巻、４０５〜３７頁、１９８２年に記載されてい る。これらの変性法により、等しいかまたは等しくない長さの２本の分離された 相補的類が生じる。

二本鎖核酸が熱によって変性された場合には、反応混合物を、存在するそれぞれ のブライマーの相補的標的（鋳型）配列へのハイブリダイゼーションを促進する 温度に放冷する。

この温度は、試薬によって異り、通常は約３５°Ｃ〜６５°Ｃ又はこれ以上であ り、好ましくは３７〜６０’Ｃであり、効果的な時間、一般的には０．５〜５分 間、好ましくは１〜３分間維持される。

実際には、Ｔａｑポリメラーゼについては、温度は単に約９５°Ｃから３７℃程 度へ、好ましくは約４５〜５８°Ｃへ低下させるだけであり、ハイブリダイゼー ションはこの範囲内の温度で起きる。

核酸が一本鎖または二本鎖のいずれであっても、テルムス・アクアチフス由来の ＤＮＡポリメラーゼを変性段階で加えることができ、あるいはハイブリダイゼー ションを促進する範囲まで温度が下がった時又はこの範囲の温度にあるときに加 えることができる。次いで、反応混合物を、酵素の活性が促進されまたは最適化 される温度、すなわちハイブリダイズしたブライマー及び鋳型からのブライマー 伸長生成物の合成を促進するのに酵素の活性を増加させるのに十分な温度まで加 熱する。この温度は、実際にそれぞれの核酸鋳型に相補的なそれぞれのブライマ ーの伸長生成物を合成するのに十分なものでなければならないが、その相補的鋳 型からのそれぞれの伸長生成物を変性してしまうほど高温であってはならない（ すなわち、この温度は一般的には約８０℃〜９０°Ｃ以下である）。

この合成反応に効果的な典型的な温度は、主として用いられる酵素および１種又 は複数種の核酸のタイプによって異り、一般的には約４０〜８０°Ｃ１好ましく は５０〜７５°Ｃである。この温度は更に好ましくは、テルムス・アクアチフス （Ｔｈｅｒｍｕｓ剋」１国服）からのＤＮＡポリメラーゼを用いる場合には、約 ６５〜７５℃である。この合成に要する時間は、主として温度、核酸の長さ、酵 素および核酸混合物の複雑さによって変わり、約０．５〜４０分間又はこれ以上 、好ましくは１〜３分間の範囲にある。核酸が長いものであれば、一般的にはよ り長時間を必要とする。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）はＴａｑポリメラー ゼ酵素の活性を阻害することが見出だされているので、ＤＭＳＯは存在する必要 はなくまたは推奨されない。

新たに合成された鎖とその相補的核酸鎖は二本鎖の分子を形成し、この分子はこ の工程の引き続く段階において用いられる。次の段階では、二本鎖分子を変性す るのに効果的ではあるがしかし熱安定酵素が完全且つ不可逆的に変性しまたは不 活性化するほど高くはない温度で熱変性することによって二本鎖分子の鎖を分離 する。この温度は、主として酵素のタイプおよび核酸の長さによって異り、一般 的には約９０〜１０５℃、更に好ましくは９０〜１００℃であり、変性に要する 時間は、主として温度と核酸の長さによって変わり、典型的には０．５〜４分間 である。

この時間の後、ブライマーに相補的な前の段階から生成した一本鎖分子（鋳型） へのブライマーのハイブリダイゼーションを促進する水準まで温度を下げる。こ の温度は、上記したような温度である。

このハイブリダイゼーション段階の後に、またはハイブリダイゼーション段階の 代わりに（またはそれと同時に）、熱安定酵素の活性を促進しそして前の段階か らの新たに合成された鎖を鋳型として用いてブライマー伸長生成物を合成するこ とができる温度に調整する。この温度も、上記したように、その鋳型から伸長生 成物を分離（変性）するほど高いものであってはならない（通常は、４０〜８０ ℃で０．５〜４分間、好ましくは５０〜７０℃で１〜３分間である）、ハイブリ ダイゼーションがこの段階中に起こるので、前の段階の変性後冷却は必要でない 。このような２つ以上の段階を同時に行なう場合には、好ましい温度範囲は５０ 〜７０″Ｃである。

鎖の分離、ハイブリダイゼーションおよび伸長生成物の合成の加熱および冷却段 階は、所望量の特定の核酸配列を産生ずるのに必要な回数だけ繰り返すことがで き、この回数は最終的用途によって変わる。この回数は、存在するブライマー、 熱安定酵素およびヌクレオチドトリホスフェートの量によって制限されるだけで ある。これらの段階は、少なくとも２回繰り返すのが好ましい、検出に使用する ためには、サイクルの数は、例えば試料の性状によって変わる。例えば、増幅さ れるべき試料が純粋なときにはサイクル数は少なくて済む。

試料が核酸の複雑な混合物であるときには、シグナルを十分に増幅して検出する には、より多くのサイクル数が必要となる。一般的な増幅および検出には、工程 を少なくとも２０回繰り返すのが好ましい。

下記のように、標識した配列特異的プローブを用いるときには、これらの段階を 少なくとも５回繰り返すのが好ましい。

ヒトゲノムＤＮＡを上記のようなプローブと共に用いるときには、この工程を好 ましくは１５〜３０回繰り返して配列を十分に増幅して、明確に検出可能なシグ ナルが生成するようにする。すなわちバックグラウンドノイズが検出を妨げない ようにする。

以下に更に詳細に説明するように、生成した特異的核酸配列の量は、指数的に蓄 積する。

酵素が不可逆的に変性または不活性化しない限り、ヌクレオチド、ブライマーま たは熱安定酵素を最初に加えた後に更に添加する必要はない、酵素が不可逆的変 性又は不活性化を受ける場合には、それぞれの変性段階の後に酵素を補充する必 要がある。しかしながら、それぞれの段階でこれらの物質を添加しても反応には 悪影響を及ぼさない。

第一の核酸または核酸の混合物から１種より多くの特定の核酸配列を産生させる ことが所望な時には、適当な数の異なる種類のオリゴヌクレオチドブライマーを 利用する６例えば、２種類の異なる特定の核酸配列を産生させるときには、４種 類のブライマーを用いる。これらのブライマーの２つは特定の核酸配列の一つに 特異的であり、残りの２種のブライマーは第二の特定の核酸配列に特異的である 。この場合には、２種類の異なる特定の配列のそれぞれが、本発明によって指数 的に産生される。

適当な長さの時間が経過して所望量の特定の核酸配列が産生された後、既知の方 法（例えば、ＥＤＴＡ、フェノール、ＳＤＳまたはＣＨ（／！、の添加）で酵素 を不活性化することによって、または反応の成分を分離することによって、反応 を停止させる。

増幅工程は連続的に行なってもよい、自動化法の一態様では、温度を所定の水準 に所定の時間制御するように設定する温度サイクルを反応混合物に行なってもよ い。

この目的のための一つの装置はコンピューターによって制御される液体取扱系を 利用しており、第一の容器で成る制御された温度で保管された酵素を、温度がコ ンピューターで制御されて所定のインキュベーション方式に一致するようになっ ている第二の容器に液体移動させるものである。この第二の容器は１種又は複数 の増幅される核酸配列とヌクレオチドトリホスフェートとブライマーを貯蔵して いる。コンピューターはユーザー・インターフェースを備えており、それによっ て使用者がインキュベーションの時間および温度、移動させる酵素の量などの、 増幅工程における各種段階の特徴を制御する工程パラメーターを入力することが できるようになっている。

酵素はサイクル毎に移動させる必要はないので、用いることができる好ましい装 置は液体制御系のない温度循環を利用している。この様な装置は１９８７年９月 ９日に公開されたヨーロッパ特許出願公開Ｎａ２３６．０６９にさらに完全に記 載されておりこの記載を引用により本明細書に組み入れる。要約すれば、この装 置は下記の系から成る。

１、所定数の試験管、好ましくは５００　ｄ試験管であって、ヌクレオチドトリ ホスフェート、ブライマー、核酸配列および酵素の反応混合物が入っている試験 管を固定する熱伝導性容器。

Ｚ　熱伝導性容器を加熱、冷却し且つ室温より高いおよび低い温度に保持する装 置であり、この装置は容器を加熱、冷却しまたは保持する温度を制御する制御シ グナルを受けとる入力部を有する〔この様な装置はマテリアルス・エレクトロニ クス・プロダクツ・コーポレーション（Ｍｅｔｅｒｉａｌｓ　Ｅｌｅｃｔｒｏ− ｎｆｃｓ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、トレントン、二３． −シャーシーから発売されているベルティーア（Ｐｅｌｔｉｅｒ）熱ポンプまた は水熱交換器でもよい〕。

３、上記の装置の入力部に接続したコンビエータ−装置（例えば、マイクロプロ セッサ−・コントローラー）であって、増幅工程、温度水準および温度勾配とタ イミングを自動的に制御するシグナルを発生する装置。

代表的な増幅プロトコールを模式的に示す。ここでは、相補的な鎖〔Ｓ゛〕及び 〔Ｓ−〕を含んで成る所望の配列（Ｓ）を含有する２本鎖ＤＮＡが核酸として使 用される。第１の及びこれに続（各反応サイクルの間、もとの鋳型上での各オリ ゴヌクレオチドブライマーの延長が、ブライマーの１つのみにより停止する無限 長の新しい、、ＤＮＡ分子生成物を生成する。

今後“長生放物”と称するこれらの生成物は直線的に蓄積するであろう。すなわ ち、ある数のサイクルの後に存在する量がサイクル数に比例するであろう。

こうして生成された長生放物は、その後のサイクルの間一方又は他方のオリゴヌ クレオチドプライマーの鋳型として機能し、そして所望の配列〔Ｓ゛〕又は〔Ｓ −〕の分子を生成するであろう。これらの分子もまた、一方又は他方のオリゴヌ クレオチドプライマーの鋳型として機能してさらに〔Ｓ″″〕及び（Ｓ−）を生 成し、そしてそれ故に、サイクル数に対して指数的速度での（Ｓ）の蓄積をもた らすであろう連鎖反応が継続され得る。

意図されるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション以外のオリゴヌクレオチ ドハイブリダイゼーションにより生成される副産物は自己触媒的ではなく、そし てそれ故に直線的速度で蓄積する。１つのブライマーのオリゴヌクレオチド配列 及び他方の相補的配列で終る各類は生産されることが望まれる特定の核酸配列Ｓ である。もとのヌクレオチドは複製されないので、その量は全工程を通じて一定 に維持される。長生放物はもとの核酸からのみ生成されるのでその量は直線的に 増加する。特定の配列の量は指数的に増加する。すなわち、特定の配列は支配的 な種となる。これは次の表に示される。

この表は、各サイクルの効率を１００％として、ｎサイクル数に存在する種の相 対量を示す。

０〜ｎサイクル′の２　　′の １５　　　　　１　　　　　１５　　　　　　３２．７５２２０　　　　　１　 　　　　２０　　　　　１．０４Ｂ、５５５ｎｌ　　　　　　ｎ　　　　　　　 （２わ−ｎ−１）鋳型として一末鎖ヌクレオチドが使用される場合、サイクル当 り１個のみの長生放物が生成する。

少なくとも１サイクルの増幅の後に、増幅される配列の（末端にない）内部配列 に相補的な一組のブライマーを加えることによって、所定回数の増幅の後、所定 の配列内の配列を増幅して反応の特異性を大きくすることができる。この様なブ ライマーは如何なる段階で加えてもよく、そしてこのものはより短い増幅された ブライマーを供するであろう。また、非相補的末端を有するが、増幅において前 に用いてブライマーと幾分オーバーラツプするブライマーを用いることによって より長いフラグメントを調製することができる。

増幅方法は、特定の核酸配列をクローン化して、適当な発現ベクターに挿入する ことができる。次に、このベクターを用いて適当な宿主生物を形質転換して、組 換えＤＮＡ技法の標準的方法によって配列の遺伝子生成物を産生させることがで きる。このクローニングは、平滑末端連結を用いてのベクターへの直接連結、又 はブライマー内に含まれる部位において開裂するための制限酵素の使用を含むこ とができる。

更に、この増幅工程は、試験管内での変異誘発に用いることができる。オリゴヌ クレオチドブライマーは、増幅されるべき核酸配列に正確に相補的である必要は ない。それらは、熱安定酵素によって伸長されるべき配列十分にハイブリダイズ することだけが必要である。用いられるブライマーが元の鋳型に正確には相補的 ではない場合の増幅反応の生成物は、鋳型配列ではなくブライマーの配列を有す るので、試験管内突然変異が導入される。引き続くサイクルでは、この突然変異 は、それ以上不対合プライミングを必要としないので、限定されない効率で増幅 される。このようにして産生された変異体を標準的な生物学的技法によって適当 なベクターへ挿入することができ、このベクターに変更された蛋白質の産生態の ような変異体特性を付与することができる。

上記のような変更されたＤＮＡ配列を作る工程は、他の配列の変化を誘発するた めの異なるブライマーを用いて、変更されたＤＮＡに対して繰り返すことができ る。このようにして、一連の変異配列が徐々に産生され、このシリーズに新たに 加えられたそれぞれのものは前のものから僅かしか粉となっていないが元のＤＮ Ａ源配列からはかなりの点で異なっているようにすることができる。このように して、非常に不適正なブライマーを機能させることはできないために単一段階で は得られないような変化を、最終的に行なうことができる。

更に、十分な量のブライマーが、増幅されるべき鎖に相補的な配列を含有する場 合には、ブライマーはその配列の一部に非相補的配列を有することができる。例 えば、（プロモーター、リンカ−、コード配列などの）鋳型配列に相補的でない ヌクレオチド配列をブライマーの一方または両方の５′末端に結合させ、これに よって増幅工程の生成物に付加することができる。伸長ブライマーが添加された 後、工程を十分な回数だけ繰り返し、非相補的ヌクレオチド挿入部を含有する新 たな鋳型を所望な量で得る。これによって、単純な技法を用いて、比較的短時間 （例えば２時間以下）で結合したフラグメントを多量に産生ずることができる。

この増幅方法を用いて、感染症、遺伝学的疾患または細胞性疾患、例えば癌に関 する特異的核酸配列、例えば腫瘍遺伝子の検出および／または特徴化を行なうこ とができる０分析に利用できる核酸の量が極めて少ないとき、例えば胎児細胞か ら得られるＤＮＡを用いる繊状赤血球貧血の出生前診断で有用である。この増幅 法は、３）１放射性検出法を用いる本来鋭敏でない分析法を用いて少量試料の分 析を行なう場合、または放射分析法を用いる場合であって速やかな検出が望まれ る場合に、特に有用である。

本発明の目的に関して、遺伝学的疾患は、例えば繊状赤血球貧血、α−サラセミ ア、β−サラセミア等のような生体からのゲノムＤＮＡの特異的欠失および／ま たは変異誘発を包含する。繊状赤血球貧血は、本方法により適当なりＮＡ配列の 増幅を行なった後の１９８５年１２月１１日発行の欧州特許出願公開第１６４． ０５４号明細書に記載のオリゴマー制限分析によりまたはＲＦＬＰ様分析により 、容易に検出することができ、α−サラセミアは、この疾患を起こす変異部に緊 密に関連した多形制限部位の不在によって検出することができ、またβ−サラセ ミアはその制限部位の存在によって検出することができる。

これらの遺伝的疾患の総ては、適当な配列を増幅し、それをサチン法によって放 射性プローブを用いることなく分析することによって検出することができる。こ の様な方法では、例えば極めて低水準の所望な配列を含む羊水からのＤＮＡの少 量の試料を増幅し、制限酵素で切断し、サチン法によって分析する。増幅された 高水準のシグナルによって非放射性プローブの使用が容易になる。

もう一つの態様では、ＤＮＡの少量試料を通常の水準にまで増幅した後、伸長反 応のサイクルを続けて行ない、この場合、（３！　ｐ−標識またはビオチン−標 識したヌクレオチドトリホスフェートのような）容易に検出されるヌクレオチド 誘導体を最終のＤＮＡ生成物中に直接に導入し、これを制限酵素処理および電気 泳動法による分離またはその他の適当な方法で分析することが可能である。

もう一つの態様では、核酸を、増幅前に特定の制限エンドヌクレアーゼに暴露す ることができる。切断された配列は増幅することは出来ないので、あらかじめＤ ＮＡ試料を制限酵素処理したにもかかわらず増幅されたフラグメントが出現する ことは、増幅された配列内のエンドヌクレアーゼの部位の不在を示唆する。増幅 された配列の存在または不在は、適当な方法によって検出することができる。

本発明の方法の実際的応用は、本明細書、および欧州特許第１６４，０５４号明 細書（同上）およびサイキ（Ｓａｉｋｉ）らのＢｉ。

／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　３巻、１００８〜１０１２頁に記載されているオリ ゴマー制限法によって繊状赤血球貧血の検出を容易にするためのその使用によっ て例示することができる。繊状赤血球貧血は、β−グロブリン遺伝子の６番目の コドンにおける唯一つの塩基対の変化によって起こるヘモグロビン疾患である。

本発明の増幅方法は、配列特異的オリゴヌクレオチドを用いて（ゲノムＤＮＡの ような）核酸配列の一塩基対の変化を直接に検出するのにも用いることができる 。これは、１９８７年９月１６日に公開されたヨーロッパ特許出願公開Ｎａ　２ ３７，３６２に一層十分に記載されており、その記載を引用により本明細書に組 み入れる。

要約すれば、この方法においては、増幅されたサンプルが一連の膜上に直接スポ ットされ、そして各膜が異るラベル化配列特異的オリゴヌクレオチドプローブと ハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションの後、サンプルは洗浄されそし てラベルが検出される。この技法はＤＮＡ多形の検出において特に有用である。

各種感染生疾患は、臨床試料中に起因微生物に特徴的な特定のＤＮＡ配列が存在 することによって診断することができる。これら起因微生物には、サルモネラ、 クラミジア、ネイセリアのような細菌、肝炎ウィルスのようなウィルスおよびマ ラリアの原因となるプラスモジウムのような寄生虫がある。

ファルコウ（Ｆａｌｋｏｗ）らに発行された１９８６年５月１３日付は米国特許 再審査証明書第８１４．３５８，５３５号は、感染性疾患の診断への特異的ＤＮ Ａハイブリダイゼーションプローブの使用を記載している。比較的少数の病原生 物が、感染した患者からの臨床試料中に存在するので、これらから抽出されるＤ ＮＡは試料中の総ＤＮＡの極めて小さな分画だけを構成することがある。ＤＮＡ 試料の固定の前に、推定される病原特異的配列を特異的に増幅し、検出すること によって、従来の方法の感度および特異性を著しく向上することができる。

ワード（Ｗａｒｄ）の欧州特許第６３．８７９号明細書に記載されているように 、非放射性標識されたプローブを用いることができれば、感染性疾患の診断のた めのＤＮＡプローブの日常的臨床使用はかなり簡略化されるであろう。この方法 では、ビオチン含有ＤＮＡプローブを、アビジンまたはビオチン特異的抗体に結 合した発色性酵素によって検出する。この型の検出法は好都合であるが、感受性 が比較的低い。本発明の方法による特異的ＤＮＡ増幅と安定に標識されたプロー ブの使用の組み合わせによって、ファルコウ（Ｆａ　ｌ　ｋｏｗ）とワード（Ｗ ａｒｄ）の方法を日常の臨床検査に有用にするのに要する便宜と感度が得られる 。

ＡＩＤＳウィルスの検出と監視に対するこの増幅技術の具体的な使用は１９８７ 年７月２２日に公開されたヨーロッパ特許出願公開ｋ　２２９．７０１に記載さ れており、その記載を引用により本明細書に組み入れる。要約すれば、ブライマ ーとプローブであって、それぞれＡＩＤＳウィルスの核酸中に実質的に保存され ておりＡＩＤＳウィルス中の核酸に特異的な核酸配列を増幅し検出するように設 定されているものを、増幅および検出法に用いる。したがって、検出される配列 はＡＩＤＳウィルス中の核酸に十分に相補的であり、酵素およびヌクレオチドト リホスフェートの存在で、好ましくは室温で重合を開始するものでなければなら ない。

好ましい増幅方法はラベルされたブライマーを使用する。

増幅された生成物上のラベルは、その後の検出のために生成物を「捕捉する」又 は固定化するために使用することができる（例えば、ビオチン化された増幅プラ イマーはラベルされた生成物をもたらし、この生成物はアビジン又はストレプト アビジンとの相互作用により「捕捉」され得る）。前記の増幅プロトコールにお いて示したように、一方のラベルされたブライマーの延長生成物は、他方とハイ ブリダイズした場合、目的とする特定の核酸配列の生産のための鋳型となり、こ の逆も真であり、そしてこの方法は所望の量の配列を生産するのに必要な回数だ け反復される。ラベルとして使用することができる特定の好ましい試薬の例は米 国特許ＮＩＬ　４，５８２．２８９に記載されており、その記載を引用により本 明細書に組み入れる。

この増幅法を利用して、単一コピーヒト遺伝子からＤＮＡを十分な量で産生させ 、単純な非特異的ＤＮＡ染色剤例えば臭化エチジウムをＤＮＡの検出に直接に用 いられる様にできる。

生物のゲノムにおける感染性疾患及び病理学的異常の検出に加えて、病的状態を 伴わないＤＮＡ多形を検出するのに用いることもできる。

要約すれば、増幅法は連鎖反応と熱安定酵素を用いる１種以上の特定の核酸配列 を増幅する方法を提供するものであり、上記反応においてブライマー伸長生成物 を産生させ、これを次にその後のブライマー伸長反応の鋳型として働くことがで きるようにする。この方法は、最初は極めて少量でのみ存在する核酸配列を検出 するのに特に有用である。

以下の実施例は、単に例示のために提供するものであり、発明の範囲および特許 請求の範囲を限定することを意図するものではない。これらの実施例において、 総てのパーセンテージは、特に断らないかぎり、固体の場合には重量％、液体の 場合には容積％であり、総ての温度は摂氏で表わしている。

裏施±土 Ａ、ブライマーの合成 次の２種類のブライマーを下記の方法により調製した。

５’　−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ−３’　（ＰＣＯ３）５’ 　−ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ−３’　（ＰＣＯ４）これらの ブライマーはいずれも２０−マーであり、ゲノムＤＮＡの相対する鎖に、１１０ 塩基対の間隔をおいてそれらの５′端にアニールする。

１、　自動化された合成法 Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ　（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ ｔｅｒｓ（１９８１）２２　：１８５９−１８６２）の方法に従って合成された ジエチルホスホラミダイトを、ヌクレオチドで誘導体化された制御された孔サイ ズのガラス支持体上に逐次縮合させた。この方法は、ジクロロメタン中トリクロ ロ酢酸による脱トリチル化、活性化プロトン供与体としてベンゾトリアゾールを 使用する縮合、並びにテトラヒドロフラン及びピリジン中無水酢酸及びジメチル アミノピリジンによるキャッピングを含む。サイクル時間は約３０分間であった 。各段階での収率は本質的に定量的であり、そして脱トリチル化中に放出される ジメトキシトリチルアルコールの回収及び分光分析により決定した。

２　オリゴデオキシリボヌクレオチドの脱保護及び精製固体支持体をカラムから 取り出し、そして密閉チューブ中で室温にて４時間、ｌａｄの濃水酸化アンモニ ウムに暴露した。

次に、支持体を濾過によって除去し、そして部分的に保護されたオリゴデオキシ ヌクレオチドを含有する溶液を５時間５５°℃とした。アンモニアを除去し、そ して残渣を分取用ポリアクリルアミドゲルに適用した。３０Ｖ／ｅｌｌにて９０ 分間電子泳動を行い、次に生成物を含有するバンドを、蛍光プレートのＵＶシャ ドーにより同定した。バンドを切り出し、そして工ｄの蒸留水により４°Ｃにて 一夜溶出した。この溶液をＲＰ−１１ＰＬＣカラムに適用し、そして１％酢酸ア ンモニウム緩衝液（ｐＨ６，０）中ア七ト二トリル７〜１３％のグラジェントに より溶出した。この溶出を２６ｏｎ閣でのＵＶ吸収によりモニターし、そして適 当な画分を集め、一定容量中でのＵＶ吸収により定量し、そして真空遠心機中で 室温にて蒸発乾固した。

３、　オリゴデオキシヌクレオチドの特徴付は精製されたオリゴヌクレオチドの 試験アリコートをポリヌクレオチドキナーゼ及びγ−”Ｐ−ＡＴＰにより３１− Ｐラベルした。

ラベルされた化合物を、５０Ｖ／ｅ１ｍにて４５分間の電気泳動の後、１４−２ ０％ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーにより試験した。この方 法により分子量が確認される。塩基組成を、ヘビ毒ジェステラーゼ及び細菌アル カリ性ホスファターゼによるオリゴデオキシヌクレオチドのヌクレオシドへの消 化、並びにこれに続く、逆相ＨＰＬＣカラム及び１０％アセトニトリル＋１％酢 酸アンモニウム移動相を用いる該ヌクレオシドの分離・定量により決定した。

Ｂ、セルラインからのヒトゲノムＤＮＡの単離高分子量ゲノムＤＡＮを、Ｍａｎ ｉａｔｉｓ等、前掲、Ｐ２Ｏ３−２８１に本質的に従うて、ヒユーマン・ゼネテ ィック・ミュータント・セル・デボジトリ−、カムデン、ＮＪからＧＭ２２１９ Ｃとして入手可能な、正常β−グロビンについてホモ接合性のＴ細胞系から単離 した。

Ｃ，テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｏｓ　凹犯匹国■）からのポリメラー ゼの精製 アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション、１２３０１バークラウンド ライブ、ロックビル、ＭＤからＡＴＣＣＮａ２５．１０４としてなんら制御なく 入手できるテルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒ＋ｍｕｓ肥」１国ｕｓ）ＹＴＩ株 をフラスコ中で、下記の培地で増殖せしめた。

クエン酸ナトリウム　　　　　１ｎＭ リン酸カリウムｐＨ７，９５ｓＭ 塩化アンモニウム　　　　　　１０ｗ＋Ｍ硫酸マグネシウム　　　　　０．２ｍ Ｍ塩化カルシウム　　　　　　０．１ｍＭ塩化ナトリウム　　　　　　１ｇ／ｌ 酵母エキス　　　　　　　　Ｉｇ／ｌ 硫酸第一鉄　　　　　　　　０．０１ｍＭ（オートクレーブ前にｐＨを８．０に 調整）上記培地中で７０℃にて一夜培養したフラスコ種母を１０ｊ！発酵槽に接 種した。種母フラスコからの合計６００ｄの種母を１０２の同じ培地に接種した 。　ｐＨを水酸化アンモニウムにより８．０に調節し、溶存酸素を４０％に調節 し、温度を７０℃に調節し、そして攪拌速度を４００ｒｐ−とした。

細胞の増殖の後、最初の５段階についてはＫａｌｅｄｉｎ等、前掲、の方法（わ ずかに変更を加えて）を用い、そして第６段階では異る方法を用いて精製を行っ た。６段階すべてを４℃にて行った。カラムでの分画速度は０．５力ラム／時と し、溶出中のグラジェントの容量は１０カラム容量とした。これに代る好ましい 方法を例６に後記する。

要約すれば、上記培養のＴ、アクアチフス（Ｔ、　Ｊａ！ｔｔｉｃｕｓ）細胞を 、９時間の培養の後、後期対数期１．４ｇ乾燥重量／ｌの細胞濃度において、遠 心分離により集菌した。２０ｇの細胞を、５０ｖ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ ｐＨ７，５）及び０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む緩衝液８０ｄ中の懸濁した。細 胞を溶解し、そして溶解物を１℃のローター中で３５，０００ｒｐｍにて２時間 遠心した。上滑を集め（画分Ａ）、そして硫酸アンモニウムの４５〜７５飽和の 間で沈澱する蛋白質画分を集め、０．２Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６，５）、１０ ａ＋Ｍ　２−メルカプトエタノール及び５％グリセリンを含有する緩衝液中に溶 解し、そして最後に同じ緩衝液に対して透析して画分Ｂを得た。

画分Ｂを、上記の緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥ−セルロースの２．２　Ｘ３０ ｃｍカラムに適用した。次に、このカラムを同じ緩衝液で洗浄し、そして蛋白質 を含有する両分（２８０ｎｍにおける吸収により決定する）を集めた。−緒にし た蛋白質画分を、０．０１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７，５）　、１０ａ＋Ｍ　２ −メルカプトエタノール及び５％グリセリンを含有する第二緩衝液に対して透析 して画分Ｃを得た。

画分Ｃを、第二緩衝液で平衡化されたヒドロキシアパタイトの２．６Ｘ２１Ｃｍ カラムに適用した０次に、二〇カラムを洗浄し、そして１０ａ＋Ｍ　２−メルカ プトエタノール及び５％グリセリンを含有する０、０１〜０．５Ｍリン酸カリウ ム（ｐＨ７，５）緩衝液の直線グラジェントにより酵素を溶出した。ＤＮＡポリ メラーゼ活性を含有する両分（９０〜１８０ｗＭリン酸カリウム）を集め、アミ コン攪拌セル及びＹＭＩＯ膜を用いて４倍に濃縮し、そして第二緩衝液に対して 透析して画分りを得た。

画分りを、第二緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースの１、６　Ｘ２８Ｃｌ カラムに適用した。このカラムを洗浄し、そして第二緩衝液中０．０１〜０．５ Ｍリン酸カリウムの直線グラジェントによりＤＮＡポリメラーゼを溶出した。ａ 分をエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼの汚染について測定した。

これは、過剰のＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートした後のファージλＤ ＮＡ又はスーパーコイルプラスミドＤＮＡの分子量の変化を電気泳動により検出 することにより（エンドヌクレアーゼについて）、そしてＤＮＡを幾つかのフラ グメントに開裂せしめる制限酵素による処理の後に（エキソヌクレアーゼについ て）行った。最少のヌクレアーゼ汚染を有するＤＮＡポリメラーゼ画分（６５〜 ９５ｍＭリン酸カリウム）のみをプールした。このプールにオートクレーブした ゼラチンを２５０ｇ／ｉｄ！の量で添加し、そして第二緩衝液に対して透析を行 って画分Ｅを得た。

画分Ｅをホスホグルコースカラムに適用し、そして２０５Ｍリン酸カリウム（ｐ Ｈ７，５）中０．０１〜０．４ＭＫＣｆのグラジェント１００ｄにより溶出した ０両分を上記のようにしてエンドヌクレアーゼ／エキソヌクレアーゼの汚染につ いて、そしてさらにポリメラーゼ活性について（Ｋａｌｅｄｉｎ等の方法により ）測定した。プールした画分を第二緩衝液に対して透析し、次に５０％グリセリ ン及び第二緩衝液に対する透析により濃縮した。

ポリメラーゼの分子量を５Ｏ５−ＰＡＧＥにより決定した。マーカー蛋白質はホ スホリダーゼＢ　（９２，０００）、ウシ血清アルブミン（６６、２００）、オ バルプミン（４５，０００）、カーボニックアンヒドラーゼ（３１、０００）、 大豆トリプシンインヒビター（２１，５００）、及びリゾチーム（１４，４００ ）であった。

予備的データは、文献（例えばＫａｌｅｄｉｎ等）に報告されている６２．００ ０〜６３．０００ドルトンではなく、約８６．０００〜９０．０００ドルトンで あった。

このポリメラーゼを、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ６，４及びｐＨ８ ，０）０．１ＭＫＣｊ！、１０ｍＰＩ　ＭｇＣｊ！ｚ　、１ｍＭ　２−メルカプ トエタノール１０ｎｍｏｌｅずつのｄＧＴＰ，　ｄＡＴＰ及びＴＴＰ　、及び０ ．　５　、Ｅ／　Ｃｉ　（”Ｈ）ｄＣＴＰ。

８にの“活性化されたウシ”胸腺ＤＮＡ並びに０．　５　−　５ユニツトのポリ メラーゼを含有する混合物５０ｄ中でインキエベートした．″活性化されたＤＮ Ａは、ＤＮＡの５％が酸−溶解性画分に移るまでＤＮａｓｅ　Ｉにより消化して 部分加水分解した後のＤＮＡの天然調製物である．この反応は７０℃にて３０分 間行い、そして０．１２５Ｍ　ＥＤＴＡ−Ｈａｔを含有するリン酸ナトリウムの 飽和水溶液的５０ｄの添加により停止せしめた。サンプルをＫａｌｅｄｉｎ等、 前掲に記載されているようにして処理しそして活性を測定した。

この結果は、ポリメラーゼはｐＨ６．４においてｐｕｓ．ｏにおける活性の半分 より活性であることを示した．これに対して、Ｋａｌｅｄｉｎ等は、酸素はｐＨ 約７．　０において、ｐＨ８．３における活性の８％を有することを見出した． 従って、本発明の熱安定酵素のｐｉプロフィールはＫａｌｅｄｉｎ等の酵素のそ れよりも広い。

最後に、ＤＮＡポリメラーゼ測定反応混合物から１種類のみ又は複数種類のヌク レオチドトリホスフェートを除去した場合、本発明の酵素を用いて活性がほとん ど観察されず、活性は予想値と一致しており、そして酵素は高い忠実性を示した ．これに対して、Ｋａｌｅｄｉｎ等、前掲、を用いて観察さた活性は予想値と一 致しておらず、そしてヌクレオチドトリボスフエートの間違った導入が示唆され る。

Ｄ．増幅反応 上記の１ｎのゲノムＤＮＡを、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ８．　０ 　）、５０＋＋＋Ｍ　ＫＣＩ，　１０ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｘ、５■Ｈジチオスレイ トール、２００Ｉ＠／ｄゼラチン、１声のプライマーＰＣＯ２、ｌ洲のプライマ ーＰＣＯ４、１．　５　ｍＭ　ｄＡＴＰ　、　１．　５園Ｉｔ　ｄＣＴＰ　、　 １．　５■Ｍ　ｄＧＴＰ及び１．５ｍＭ　ＴＴＰを含有するＩｏｏｉｔｌの初期 水性反応容量中に稀釈した。

サンプルを９８℃にて１０分間加熱してゲノムＤＮＡを変性せしめ、次に室温に 冷却した．テルムス・アクアチフスからのポリメラーゼ４Ｉを反応混合物に加え 、そして１００Ｉの鉱油を重層した．次にサンプルを、溶体を供給するためにプ ログラムされたピペット及び変温のための温度調節装置を用いる上記の液体取扱 い及び加熱装置のアルミニウム加熱ブロックに入れた。

ＤＮＡサンプルを、次のプログラムサイクルを反復して２０サイクルの増幅にか けた。

１）加熱ブロック中で２．５分間にわたり３７℃から９８℃に加熱し；そして ２）３分間にわたって９８℃から３７℃に冷却してブライマーとＤＮＡとのアニ ールを可能にする。

最終サイクルの後、サンプルをさらに１０分間５５℃でインキエベートして最終 伸長反応を完了する。

Ｅ．オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブの合成及びリン酸化 次の配列： ５′−”ＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡ ＧＧＡＧＴＣＡＧ−３’　（ＲＳ２４）を有しＲＳ２４と称するラベルされたＤ ＮＡプローブを調製した。

配列中、＊はラベルを示す．このプローブは４０塩基の長さを有し、遺伝子の第 ４コドンから第７コドンまでを含み、そして正常β−グロビン対立遺伝子（βＡ ）を相補的である．ブライマーとプローブとの関係を次に模式的に示す。

死’ｒｆＮ　　　　　　■■　　　　　Ｒ■このプローブを例１．１．に記載し た方法に従って合成した。

２Ｑｐ−ｏｌｅのプローブを４ユニクトのＴ４ボリヌクレオチドキ゛ナーゼおよ び約４０ｐｍｏｌｅのｙ　−”Ｐ−ＡＴＰ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌ ｅａｒ　；約７０００Ｃｉ／ｍｓ＋ｏｌｅ）と、　７０ｓＭ　　Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．６　　）　　、　１０＋ｓＭ　　ｎｇｃｊ！　＊　　、１、５ｍＭスペルミ ン及び１０＋ｓＭジチオスレイトールを含有する４０Ｉの反応容量中で３７°Ｃ にて６０分間接触せしめた．次に２５ｓＭＥＤＴ＾により全容量を１００Ｉに調 製し、そしてＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（１０ｓ＋Ｍ　　Ｔｒｉｓ、０ ．１ｓＩＭεＤＴＡ　、　ｐＨ８．　０　）により平衡化したＩＨ１スピン透析 カラム上で、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｄｅｃｕｌａｒすμ住」（１９８２）　、 ｐ４６６−４６７の方法に従って精製した。反応生成物のＴＣＡ沈澱は、ＲＳ２ ４にってい比活性が４．３μＣｉ／を示した。

Ｆ・　ドツトプロットハイブリダイゼーション前記■．からの増幅されたサンプ ル４ｄ、並びに７０　、　７５　。

８０　、　８５　、　９０　、　９５及び１００％の増幅効率を代表するように 計算されたβ−グロビンプラスミドＤＮＡの適当な稀釈物５．６メを２００　ｄ の０．　４　Ｎ　ＮａＯＨ及び２５ｍＭ　ＥＤＴＡで稀釈し、そしてＧｅｎ　ｔ ｒａ４５（Ｐｌａｓｃｏ）ナイロンフィルター上にスポットした．これは、フィ ルターを水で湿し、これを、フィルターを定位置に保持するドツトブロック調製 用Ｂｉｏ−Ｄｏｔ（リッチモンド、ＣＡ）装置中に入れ、サンプルを適用し、そ してＲｅｅｄ及びＭａｎｎ＋Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｃｆｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ ．　ｌ：３．　７２０２−７２２１（１９８５）により開示されているようにし て、０．　１　ａｔの２０ＸＳＳＰＥ　（　３．　６　Ｈ　ＮａＣｆｆｉ、２０ ０ｍＭ　ＮａＨｚＰＯａ、２０＋＊Ｍ　ＥＤＴＡ）により各ウェルをすすいだ． 次に、フィルターを取り出し、２０　Ｘ　ＳＳＰＥ中で洗浄し、そして真空オー ブン中で８０℃にて３０分間加熱した。

加熱の後、各フィルターを、３　ＸＳＳＰＥ，　５　Ｘデンハート溶液（ｌｘ− ０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％フィコール、０、０２％ウシ血清 アルブミン、０．　２　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　０．　２　ｓｉｌＩＩＩ！ＤＴＡ 　。

ｐＨ８．０）、０．５％ＳＯＳ及び３０％ホルムアミドから成るハイブリダイゼ ーション溶液１６Ｍ１と接触せしめ、そして４２℃にて２時間インキエベートし た．次に、２３）ｍｏｌｅのプローブＲＳ２４をハイブリダイゼーション溶液に 加え、そしてフィルターを４２℃にて２分間インキエベートした。

最後に、ハイブリダイズした各フィルターを１００ｄの２×ＳＳＰＥ及び０．１ ％ＳＤＳで２回室温にて１０分間洗浄した，次に、フィルターを１００ｄの２　 ｘＳＳＰＥ，　０．　１％ＳＤＳで、６０℃にて１０分間処理した。

次に、各フィルターをオートラジオグラフ処理した．シグナルは２時間後に容易 に出現した。

Ｇ、オートラジオグラムの検討 ２時間後にドツトプロットのオートラジオグラムを分析して、そしてＨａｅｌｌ ［／Ｍ＋狙■−消化ｐＢＲ：β＾により調製された標準逐次稀釈β−グロビン調 製物と、強度について比較した。

β１は、５ａｉｋｉ等５ｃｉｅｎｃｅ−，前掲、において記載されている野性型 対立遺伝子である０反応生成物の分析により、全体゛の増幅効率は約９５％であ ることが示され、これはβ−グロビン標的配列の６３０．０００倍の増加に相当 する。

１施１１ Ａ、増幅反応 例１に記載したようにしてＭｏ１ｔ４セルラインから抽出されたゲノムＤＮＡの ＩＮのサンプル２個をそれぞれ、５０＋Ｍ、ＫＣｊ２．２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｆ ｌ（／！　（ｐＨ８，０）　、１０ｍＭ　Ｍｇ（／！ｚ　、Ｉ　Ａのブライマー ＰＣ０３，１岸のブライマーＰＣＯ４，２００層／ｄのゼラチン、１０％ジメチ ルスルホキシド、並びに１．５　ｍＭずつのｄＡＴＰ。

ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ及びＴＴＰを含有する１００１１１の反応容量中に稀釈し た。この混合物を９８°Ｃで１０分間加熱してゲノムＤＮＡを変性した後、サン プルを室温に冷却し、そして例１に記載したテルムス・アクアチフスからのポリ メラーゼ４Ｊ１１を各サンプルに加えた。サンプルに鉱油を重層して凝縮及び蒸 発ロスを防止した。

サンプルの１つを例１に記載した機械の加熱ブロックに入れ、そして次のプログ ラムサイクルを反復して２５サイクルの増刷にかけた。

（１）２．５分間にわたり３７℃から９３℃に加熱し；（２）３分間にわたって ９３℃から３７℃に冷却することによりブライマー及びＤＮＡをアニールせしめ ；そして（３）　３７℃に２分間保持した。

最終サイクルの後、サンプルを６０℃にてさらに１０分間インキュベートして最 終伸長反応を完結した。

第二サンプルをＥＰ　２３６，０６９に一層詳細に記載されている温度サイクル 機の熱伝導コンテナーに入れた。この機械においては、熱伝導コンテナーに温度 を上方又は下方に調節するベルティールヒートポンプ並びに増幅サイクル、温度 レベル、温度勾配及び温度のタイミングを自動的にコントロールするマイクロプ ロセッサ−に取り付けられる。

第二サンプルを、次のプログラムサイクルを反復する２５サイクルの増幅に付し た。

（１）３分間にわたり３７°Ｃから９５°Ｃに加熱し；（２）　９５°Ｃに０． ５分間保持して変性を生じさせ：（３）１分間にわたり９５°Ｃから３７℃に冷 却し；そして（４）３７℃にて１分間保持する。

Ｂ、アッセイ 分析、すなわちドツトプロット分析及びアガロース分析のために２つの試験を行 った。

ドツトプロット分析のためには、次の配列：５’　−”　ＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡ ＧＡＡＧＴＣＴＧＣ−３’　（ＲＳｌＢ）のラベルされたＤＮＡプローブを調製 した。この配列中＊はラベルを示す。このプローブは１９塩基の長さを存し、遺 伝子の第４〜第７コドンを含み、そして正常β−グロビン対立遺伝子（βＡ）に 相補的である。ブライマー及びプローブの概略の関係を次に示す。

このプローブを、例１．１．に記載した方法により合成した。

１０ｐｍｏｌｅのプローブを４ユニツトＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び約４ ０ｐｍｏｌｅの１−”Ｐ−ＡＴＰ（Ｎｅｓｖ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ 　；約７０００Ｃｉ　／　ａ＋ｓ＋ｏ　ｌ　ｅ）と、７０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（ ／！　（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ！　ｚ、１．５１１ＩＭスペルミン 及び１０ａ＋Ｍジチオスレイトールを含む４ｏＩの反応容量中で３７°Ｃにて６ ０分間接触せしめた。次に２５ｍＭ　ＥＤＴＡにより全容量を１００ｐ１に調整 し、そしてＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ ！、０．１　＋ａＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ８，０）で平衡化された１Ｍｌスピン 透析カラム上でＭａｎｉａｔｉｓ等、前掲、ｐ４６６−４６７の方法に従って精 製した。反応生成物のＴＣＡ沈澱は、Ｒ５１Ｂについては比活性が４．６μＣｉ ／ｐａ＋ｏｌｅでありそして最終濃度が０、１１４ｐｍｏｌｅ／　ｔｒｌである ことを示した。

前記１．からの増幅されたサンプル５Ｉ、及び熱安定酵素の代りにＥ、コリＤＮ ＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏ−断片を用いたほか前記の方法と同様にして増幅 したサンプル５Ｉを、１９５Ｉの０．４　Ｎ　ＮａＯＨ，２５ｍＭ　ＥＤＴＡに より稀釈し、そして２枚のＧｅｎｔｒａｎ４５（Ｐｌａｓｃｏ）ナイロンフィル ターにスポットした。

この場合、まずフィルターを水で湿し、フィルターを適切な場所に保持するドツ トプロット調製用のＢｉｏ−Ｄｏｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　。

リッチモンド、ＣＡ）装置に入れ、サンプルを適用し、そしてＲｅｅｄ及びＭａ ｎｎ、前掲、により開示されている様にして０．４ｄの２０ＸＳＳＰＥ　（３， ６Ｍ　ＮａＣ１，２００ｍＭ　ＮａＨｚＰＯｎ、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ）で各ウェ ルをすすいだ。次に、フィルターを取り出し、そして真空オーブン中で８０°Ｃ にて３０分間加熱した。

加熱の後、各フィルターを、５　Ｘ５ＳＰＥ、５×デンハート溶液（ＩＸ＝０． ０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％フィコール、０．０２％ウシ血清アル ブミン、０．２　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、０．２　ｍＭ　ＥＤＴＡ　。

ｐＨ８，０）及び０．５％ＳＤＳから成るハイブリダイゼーション溶液６ｄと接 触せしめ、そして５５℃にて６０分間インキュベートした。次に、５Ｉ１１のプ ローブＲ５１Ｂをハイブリダイゼーション溶液に加え、そしてフィルターを５５ ℃にて６０分間インキュベートした。最後に、ハイブリダイズした各フィルター を１００ｄの２ＸＳＳＰＥ及び０．１％ＳＤＳで２回室温にて１０分間洗浄した 。

次に、フィルターをさらに２回（１回は１分間、２回目は３分間）１００ｄの５ 　Ｘ５ＳＰＥ、０．１％ＳＤＳにより処理した。

次に、各フィルターをオートラジオグラフ処理し、シグナルは９０分間後に容易 に現われた。

アガロースゲル分析において、５Ｉずつの増幅反応混合物を、ｌ　ＸＴＢＥ緩衝 液（０，０８９１’ｌ　Ｔｒｉｓ、　　０．０８９Ｍ硼酸及び２ｍＭＥＤＴＡ　 ）中４％ＮｕＳｉｅｖｅ／　０．５％アガロースゲルに負荷し、そして１００ｖ にて６０分間電気泳動した。臭化エチジウムで染色した後、ＤＮＡをＵＶ蛍先に より可視化した。

この結果は、例１において使用した機械及びこの例がＤＮＡの増幅において同様 に効果的であることを示し、目的の配列に対応する同様の強度の別個の高強度１ １０塩基対、並びに非常に低強度の少数の他の別個のバンドを示した。これに対 して、Ｅ、コリーポリメラーゼＩのフレノウフラグメントを用いて各サイクルの 後に試薬を移送する増幅方法は、多くの無関係のＤＮＡ配列の非特異的増幅から 生ずるＤＮＡのよごろ（ｓｍｅｒ）をもたらした。

１’１ＬＡ−ＤＱ、　ＤＲ及びＤＰ病変の評価において、増幅及び検出の同様の 改良が達成されることが期待される。

上記の実験において、増幅反応緩衝液が１０ｍＭ　ＭｇＣｌ　ｚではなく　２ｍ Ｍ　ＭｇＣｊ！ｚ　、及び１．５１１Ｍずつではなく１５０〜２００茹ずつの各 ヌクレオチドを含有する場合、並びに増幅の間３７°Ｃの低温を４５°Ｃ〜５８ °Ｃに上げた場合、増幅の一層良好な特異性及び効率が得られる。さらに、ＤＭ ＳＯは増幅のために必要でないか、又は好ましくないことが見出された。

１隻ＩＬ −びクローニング ヒトβ−グロビン遺伝子上の１１９塩基対断片の増幅のため、Ｍｏ１ｔ４セルラ インから又はＧＭ２０６４Ｍｏ１ｔ４セルラインδ−ヒモグロビン領域のホモ接 合性欠失を代表し、そしてヒト・ケノミック・ミュータント・セル・デポンジト リー、カムデン、ＮＪから得られる）を、５０＋ｗＭ　ＫＣＩ、　２５ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ８）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｆｆ１ｚ　、　　２００ｘ／ ｍｆｆ１ゼラチン、５１２−メルカプトエタノール、１．５ｗＭずつのｄＡＴＰ 、　ｄＣＴＰ、　ＴＴＰ及びｄＧＴＰ、並びに１岸ずつの次のプライマｍ：５’ 　　−Ｃ丁ＴＣＴＧｃａｇＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ−３’　　（Ｇ Ｈ１８）５’−ＣＡＣａＡｇＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ−３’　　　 （Ｇ）１１９）を含有する１００ｉ１１の反応容量中で増幅した。上記プローブ の配列中、小文字は制限酵素部位を形成するための野性型配列からのミスマツチ を示す。ＧＨ１８は負鎖に対して相補的な２６−塩基のオリゴヌクレオチドであ り、そして内部ＰｓｔＩ部位を含有する。ＧＨ１９は、玉鎖に対して相補的な２ ９−塩基オリゴヌクレオチドであり、そして内部ＨｉｎｄｌＩ［認識部位を含有 する。

これらのプライマーは、ＰｓｔＩ及びＨｉｒＢｄｌｌ［制限部位に相同な遺伝子 の領域をまずスクリーニングすることにより選択された。次に、例１に記載した ようにしてプライマーを調製した。

上記の反応混合物を９５°Ｃにて１０分間加熱しそして次に室温に冷却した。例 １に記載したポリメラーゼ合計４４を各反応混合物に加え、そして次に各混合物 に鉱油を重層した。この反応混合物を次のプログラムによる３０サイクルの増幅 に付した。

２分間にわたり３７℃から９８℃に加熱し；３０分間にわたり９８°Ｃから３７ °Ｃに冷却し；そして ３７℃に２分間浸漬する。

最終サイクルの後、反応混合物を６５°Ｃにて２０分間インキエベートして最終 伸長を完結した。クロロホルムにより鉱油を抽出し、そして混合物を一２０″Ｃ に貯蔵した。

合計１０１！１の増幅生成物を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍから 一般に入手可能なＭ１３＋＊ｐｌＯクローニングベクター０．５にと共に、５０ ｍＭ　ＮａＣｆ、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！（ｐＨ７，８）　、ＩＯＲＩ Ｍ　ＭｇＣｊ！　ｔ　、２０ユニツトの力μ■及び２６ユニツトのＨｉｎｄｌＩ ［を含有する５０ｍの容量中で３７°Ｃにて９０分間消化した。−２０°Ｃに凍 結することにより反応を停止した。ＴＥ緩衝液により容量を１１０Ｉに調整し、 そして１００ｉ１１を１１１１のビオゲルＰ−４スピン透析カラムに負荷した。

１個の０．１　ｄ画分を集め、そしてエタノール沈澱せしめた。

（この時点において、Ｇ）１２０６４サンプル中にβ−グロビン増幅生成物が存 在することが見出された。次の実験は、プライマーＧＨ１８又はＧＨ１９への汚 染源を追跡した。他のブライマー源が得られなかったので、若干のクローン化配 列がブライマー中の汚染ＤＮＡに由来するであろうと理解して実験を続けた。） エタノールベレットを１５ＪＸ１の水に再懸濁し、次に５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｊ！　（ｐＨ７，８）　、１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、０．５ｍＭ　ＡＴＰ、　 １０ｍＭジチオスレイトール及び４００ユニツトのりガーゼを含有する２０ｄ容 量に調整した。この混合物を１６℃にて３時間インキュベートした。

Ｍｏ１ｔ４　ＤＮＡを含有する１０Ｊ１１の連結反応混合物を、ベセスダ、ＭＤ のＢＲＬから一般に入手可能なＥ、コリＪＭ１０３のコンピテント細胞に形質転 換した。形質転換された株を調製するための方法はＭｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、　（１ ９８１）Ｔｈｔｒｄ　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓ　ｔｍ　ｏｓｉｕ＊　ｏｎＭａｃ ｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　：　Ｒｅｃｏ＋１ｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、Ａ、Ｗａｌ ｔｏｎ［、エルゼビール、アムステルダム、　１４３−１６３に記載されている 。合計６５１個の無色のプラーク（及び０個の青色プラーク）が得られた。

これらの内、１１９個（１８％）は（＋）鎖挿入部を有し、１９個（３％）は（ −）鎖挿入部を有していた。これば、Ｅ、コリーポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ フラグメントを用いる増幅技法からのプライマー−陽性プラーク中のβ−グロビ ン陽性プラークのパーセントのほとんど２０倍である。　Ｋｌｅｎｏ−フラグメ ントを用いる方法においては、反応を２５°Ｃにて２分間行い、次に１００°Ｃ への加熱段階を２分間行い、冷却し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを添加し、そし て反応を９回反復した。これらの結果は、この発明の熱安定酵素を用いる増幅反 応の改良された特異性を確認している。

ＧＭ２０６４及び汚染されたプライマーを用いる後のクローニング実験において は、５１０個の無色プラーク中４３個（８％）が（＋）鎖挿入部を有していた。

これは、Ｍｏ１ｔ４からの１１９クローンの約半分が汚染配列を含有することを 示唆する。

Ｍｏ１ｔ４からの（＋）鎖クローンの１０個を配列決定した。５個は正常な野性 型配列であり、そして１個のＣからＴへの変異を遺伝子の第二コドンの第三位置 に有していた（ＣＡＣ−ＣＡＴ）。

ＧＭ２０６４からの汚染クローンの４個を配列決定し、４個すべてが正常であっ た。

上記の技法を用いながら、制限部位変形ブライマーを用いてヒトＮ−ｒａｓ発癌 遺伝子を増幅し、クローン化し、そして部分的に配列決定し、及びＨＬＡＤＱ− α、ＤＱ−β及びＯＲ−β遺伝子の塩基対セグメントをクローン化するために使 用することができる。

実施±Ｎ 這春ｊシ（社）支束 Ａ、Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子のためのＤＮＡ配列プローブの同定 Ｔａｑ　ホ江遺伝子のための特異的ＤＮＡ配列プローブを、λｇｔｌ１発現ライ ブラリーの免疫的スクリーニングにより得た。

Ｔ、アクアチフスのＤＮＡをＡｌｕ　Ｉにより完全消化し、ＥｃｏＲ１１２−マ ーリンカ−（ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ、ニューイングランドバイオラプス）に 連結し、ＥｃｏＲＩで消化し、そしてＥｃｏＲＩ−消化され脱リン酸化されたλ ｇｔｌｌ　ＤＮＡ　（ブロゲマ・バイオチク）と連結した。連結されたＤＮＡを パッケージしくジガパックプラス、ストラテジーン）、そしてＥ、コリに一１２ 株Ｙ１０９０（Ｒ，Ｙｏｕｎｇより入手）にトランスフェクトした。

２Ｘ１０’プラークの最初のライブラリーを、精製されたＴａｑポリメラーゼ（ 例１及び例６を参照のこと）に対するラビットポリクローナル抗血清の１：２０ ００稀釈物を用いてスクリーニングした（Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，Ａ、及びＲ，Ｗ、 　Ｄａｖｉｓ　（１９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ。

２２２　：　７７Ｂ−７８２）　、候補プラークを限界稀釈で再プレートし、そ して均一になるまで（約３サイクル）再スクリーニングした。免疫前血清と反応 せずそして免疫血清と反応する候補プラークからファージを精製した。

候補ファージを用いてＥ、コリに一１２株Ｙ１０８９（Ｒ，Ｙｏｕｎｇ）を溶原 化した。溶原菌を、Ｔａｑポリメラーゼ抗血清と反応するＩＰＴＧ誘導性融合蛋 白質（β−ガラクトシダーゼより大）の産生についてスクリーニングした。固相 のサイズ分画された融合蛋白質を用いて、全ポリクローナル抗体からエピトープ 特異的抗体をアフィニティー精製した（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、　Ｌ、Ｓ、Ｂ、等 ＜１９８６）Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　１０２　：　２０７６−２０８７）。

“つり上げられた”エピトープ−選択された抗体をウェスタン分析において用い て、Ｔａｑポリメラーゼに特異的なりＮＡ配列をコードしているλｇｔｌｌファ ージ候補を同定した。

λｇｔ：１と称する１つのλｇｔｌｌファージ候補が、精製されたＴａｑポリメ ラーゼ及びＴａｑポリメラーゼを含有する粗抽出画分の両者と特異的に反応する 抗体を、全ラビットポリクローナルＴａｑポリメラーゼ抗血清から特異的に選択 した。

このファージλｇｔ：１を使用してさらに検討した。

テルムス・アクアチフスＤＮＡの約１１５ｂｐのＥｃｏＲＩ　　ａ合Ａｌｕ　Ｉ 断片をラベルしくＭａｎｉａｔｉｓ等、前掲）で、Ｔａｑポリメラーゼ特異的プ ローブを形成した。このプローブをサザン分析において、及びＴ、アクアチフス ＤＮＡランダムゲノムライブラリーをスクリーニングするために用いた。

Ｂ、テルムス・アクアチフス−ランダムゲノムライブラリーの造成及びスクリー ニング λフアージシャロン３５　（Ｗｉｌｈｅｌｍｉｎｅ、　Ａ、Ｍ、等、前掲）をそ の接着末端を介してアニールしそして連結し、ＢａｍＨＩにより完全消化し、そ してアニールされたアームをスタツフ−（５ｔｕｆｆｅｒ）フラグメントから、 酢酸カルシウム密度勾配超遠心（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、前掲）により精製した。

Ｔ、アクアチフスのＤＮＡを５ａｕ３Ａで部分分解し、そして１５〜２０ｋｂサ イズの両分をシェークロース密度勾配超遠心により精製した。標的ＤＮＡフラグ メント及びベクターＤＮＡフラグメントを１＝１のモル比で連結することにより ランダムゲノムライブラリーを造成した。ＤＮＡをパッケージし、そしてＥ、コ リに一１２株ＬＥ３９２又はに８０２にトランスフェクトした。９９％以上の組 換体を含有する２０，０００以上の最初のファージのランプラリ−をＥ、コリに 一１２株ＬＥ３９２上で増幅した。

λｇｔｌｌ：１の放射性ラベルされたＥＣＯＲＩ挿入部によりＣＨ３５Ｔａｑゲ ノムフアージライブラリーをスクリーニングした（マニアチス等、前掲）、特異 的にハイブリダイズする候補ファージプラークを精製し、そしてさらに分析した 。ＣＨ３５：　：４−２と称する１つのファージが、ＨｉｎｄＩＩ［による消化 の後に４個以上のＴ、アクアチフスＤＮＡフラグメントを放出した（約８、０　 、４．５　、０．８　、０．５８ｋｂ）。

４種類のＨｉｎｄｌ［ＩＴ、アクアチフスＤＮＡフラグメントを、Ｈｉｎｄｌｌ ｒで消化したプラスミドＢＳＭ１３”　　（３，２ｋｂ、ベクタークローニング システムス、サンジエゴ）に連結し、そしてそれぞれＥ、コリに一１２株ＤＧ９ ８の形質転換にクローン化した。

ＣＨ３５：：４−２からの約８．　Ｏｋｂ（７）Ｈｉｎｄ　ｍ　ＤＮＡ　７　ラ グメントをプラスミドｐＦＣ８２（１１，２ｋｂ）中に単離し、他方ＣＨ３５： ：４−２からの４、５　ｋｂ）ｌｉｎｄｌ［［ＤＮＡ７　ラグメントを７’　ラ スミｔ’　ｐＦＣ８３（７，７ｋｂ）中に単離した。

ｐＦＣ８２を含有するＥ、コリＤＧ９８株は熱安定性高温ＤＮＡポリメラーゼ活 性を含有することが示された（第１表）、さらに、この細胞は、免疫的にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼと関連する新たな約６０ｋｄの分子量のポリペプチドを合成 する。

８、　ＯｋｂＨｉｎｄ　ｍ　ＤＮＡフラグメントのＴａｑポリメラーゼコード領 域をさらに、８．　ＯｋｄＨｉｎｄ　ｍフラグメントの１ａｓ−プロモーター近 位′２．．８ｋｂ厖ｎｄｌｎ−担１７１８部分に位置付けた。この領域をサブク ローニングしてプラスミドｐＦＣ８５（６，０ｋｂ）を得た。

Ｉ　ＰＴＧと共にインキュベートした後、プラスミドｐＦＣ８２を含有するＥ、 ］すＤＧ９８細胞は、もとの親り０　７（ｐＦＣ８５／ＤＧ９Ｂ）に比べて１０ ０倍までの熱安定性Ｔａｑポリメラーゼ関連活性を合成する（第１表）　、　ｐ ＦＣ８５を含有する細胞は有意量の熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活性を合成するが 、Ｔａｑ　Ｐ！！ｌ！１ＤＮＡ配列の一部分のみが翻訳され、約６０ｋｄのＴａ ｑポリメラーゼ関連ポリペプチドの蓄積が起こる。

星−上一表 Ｅ、コリ（＃）における熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活性の発現ＢＳＭ１３／ＤＧ ９８−　　　　　　　　　　　　０．０２ｐＦｃ８２／　ＤＧ９Ｂ　　　　　　 　２．２　　　　２．７（＃）細胞は後期対数期まで増殖せしめ、（−）−／− ＩＰＴＧ、１０ＩＩＭ）、集菌し、音波処理し、７５℃にて２０分間加熱し、遠 心し、そして透明な上清を７０℃にてＤＮＡポリメラーゼ活性について測定した 。

（＊）１ユニット−３０分間に１　ｎＭ　ｄＣＴＰの導入。

１施■Ｍ この発明の熱安定酵素の遺伝子は種々の細菌発現ベクター、例えばＤＧ１４１（ ＡＴＣＣ３９５８８）及びｐＰＬＮ□５ＡＴＧ　（米国特許随４．７１１．８４ ５）に記載されており、その記載を引用により本明細書に組み入れる）中で発現 せしめることができる。これらの宿主ベクターの両者はｐＢＲ３２２の誘導体で あって、トリプトファン・プロモーターオペレーター及びＡＴＧ開始コドンと作 用可能に連結されたりボゾーム結合部位（ＤＧ１４１）　、又はλＰＬプロモー ターを含む配列及びＡＴＧ開始コドンに作用可能に連結された遺伝子Ｎ結合部位 （１）ＰＬＮ□５ＡＴＧ）を有する。

これらの宿主ベクターのいずれか一方をＳａｃ　Ｉにより制限酵素処理し、そし てＫｌｅｎｏｗ又はＳ１ヌクレアーゼにより平滑末端化して、Ｔａｑポリメラー ゼ遺伝子を後で挿入するための便利な部位を作ることができる。

次の様にして、プラスミドｐＦＣ８３及びｐＦＣ８５にサブクローニングされた ＤＮＡ挿入フラグメントから完全な長さのＴａｑポリメラーゼ遺伝子を造成した 。ベクターＢＳＭ１３″′　（ベクタークローニングシステムス、サンジエゴ、 ＣＡから市販されている）をユニークＢｉｎｄｌ［［部位において消化し、Ｋｌ ｅｎｏ−及びｄＮＴＰにより修復し、そしてＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いてシｄ ＩＩオクタヌクレオチドチドリンカ−５’　−ＣＡＧＡＴＣＴＧ−３’　（Ｎｅ ｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）に連結し、そしてＥ、コリＤＧ９８株に形 質転換したｅ　　Ａｍｐ”１ａｃＺ、　”形質転換体からプラスミドを単離した 。

クローンの１つをシ江■及び信組７１Ｂにより消化し、そして大ベクターフラグ メントをゲル電気泳動により精製した。

次に、プラスミドｐＦｃ８３をシＢ■及びＨｉｎｄｌＩ［で消化し、そして約７ ５０ｂｐのフラグメントを単離した。プラスミドｐＦＣ８５をＨｉｎｄＩ［１及 び担１７１Ｂで消化し、そして約２．８ｋｂのフラグメントを単離し、そして３ 片連結によりｐＦＣ８３からの約７５０ｂｐのＢａ１ＩＩ　　Ｈｉｎｄｌｎフラ グメント及びＢＳＭ１３”の坦佳■−担阻７１８ベクターフラグメントと連結し た。この連結混合物を用いてＥ。

コリＤＧ９８株（１９８４年７月１３日に寄託のＡＴＣＣ阻３９．７６Ｂ）を形 質転換し、これからＡ＋ｓｐ”コロニーを選択し、そして約６．７５ｋｂのプラ スミド（ｐＬＳＧ　１　”）を単離した。ｐＬＳＧ　１を含有するイソプロピル −β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）−誘導ＤＧ９８細胞は、Ｔ、アクアチ フスから単離された天然酵素とはサイズを異にするＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ を合成した。次に、プラスミドｐＬＳＧ　１を用いて、ベクタークローニングシ ステムスにより推奨される方法に従って単鎖ＤＮＡ鋳型を形成することができる 。

オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（参照、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｏ＋ｉｔ ｈ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（１９８２）１０　：　 ６８８７−６５００）を使用して、同時に、１　）Ｓｐｈ　１部位をＴａｑ　Ｄ ＮＡポリメラーゼ遺伝子配列のコドン３〜６（参照、第１図、ｎｔ８−１３）内 に導入し、２）コードされるアミノ酸に影響を与えないで最初の７コドンのうら の４つのＡ／Ｔ含量を増加しく参照、第１図においてコドン２−７）、３）ＤＮ Ａポリメラーゼ遺伝子の開始コドンに対して５′の１ａｃＺ　ＤＮＡおよびＴ、 アクアチフスＤＮＡの１７０ヌクレオチドを欠失する。

バクテリオファージＲ４０８（Ｒｕｓｓｅｌ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎ ｅ（１９８６）旦：　３３３−３３８）を使用して、ｐＬｓＧ１／ＤＧ９Ｂ細胞 を怒染させ、そしてｐＬｓＧｌの一本鎖ＤＮＡ　（ｓ　ｓ）の形態（＋鎖）の合 成を指令した。精製したｐＬｓＧｌ　５ｓＤＮＡを、精製したＰｖｕ　ｎ消化Ｂ ＳＭ１３”Ｂｇｌ　ＩＩベクターの断片および４７マーの突然変異誘発のオリゴ ヌクレオチドＤＧ２６（５’　−ＣＣＣＴＴＧＧＧＣＴＣＡＡＡＡＡＧＴＧＧＡ ＡＧＣＡＴＧＣＣＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧ　）とアニーリングし た。Ｅ、コリのＤＮＡポリメラーゼｌクレノー断片での伸長、ＤＧ９Ｂ細胞の形 質転換、およびＡｍｐ”形質転換体の選択の後、コロニーを５′３ｔｐ標識した ＤＧ２５でスクリーニングした。ハイブリダイゼーションする候補をＢｇｌＩＩ 制限部位の損失、１ａｃＺ　：　Ｔ、アクアチフスＤＮＡのほぼ１７０塩基対の 欠失、およびユニークｓｐｈ　Ｉ部位の導入についてスクリーニングした。ｐＬ ｓＧ　２と表示する、１つの候補を配列決定し、そして所望の配列をコードする ことが示された。

ｐＬＳＧ　１配列： 、、、ＡＡＣＡＴＧ　　ＡＧＧ　ＧＧＧ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＣＣＣＣＴＣＴＴＴ ｐＬＳＧ　２配列： オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用して、Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子 のためのＴＧＡ停止コドンの直後でプラスミドｐＬｓＧ　２中にＢｇ１１１部位 を導入した（第１図においてヌクレオチド２４９９後）。前述のように、バクテ リオファージＲ４０８を使用してプラスミドｐＬＳＧ　２の一本鎖（＋）形態を 生じさせた。精製したｐＬＳＧ２５ｓＤＮＡを、精製したＰｖｕ　Ｕ消化ＢＳＭ １３’Ｂｇｌ　ｍベクター断片および２９７−の突然変異誘発性オリゴヌクレオ チド５Ｃ１０７（５’　−ＧＣＡＴＧＧＧＧＴＧＧＴＡＧＡＴＣＴＣＡＣＴＣＣ ＴＴＧＧＣ）とアニーリングした。クレノー断片（５０ミリモルの各ｄＮＴＰ） を使用する伸長、ＤＧ９８細胞の形質転換およびＡｍｐ”形質転換体についての 選択の後、コロニーを５′ｆｆｇｐ標識５ｃ１０７でスクリーニングした。ハイ ブリダイゼーションする候補をユニークＢａ１１１部位の獲得についてスクリー ニングした。ｐｓＹｃ１５７８と表示する、１つの候補を配列決定し、そして所 望の配列を含有することが示された。

ｐＬＳＧ　２配列： 、、、　ＧＣＣＡＡＧ　ＧＡＧ　ＴＧＡ　ＴＡＣＣＡＣＣＣＣＡＴＧ　Ｃ、、。

ｐｓＹｃ１５７８配列： 」紅旦− 、、、ＧＣＣＡＡＧ　ＧＡＧ　ＴＧＡ　ＧＡＴＣＴＡＣＣＡＣＣＣＣＡＴＧ　Ｃ 、、。

実施■豆 ベク　−ＤＧ１６１およびＤＧ１６１のＣｏ１Ｅｉ　ｃｏｐ”ベクター中のＡｍ ｐ”またはＴｅｔ”ラムダＰＬプロモーターリポソーム結合部位、ポリリンカー 、ＢＴ　ｃｒｙ　ＰＲＥ（陽性のレトロ調節要素、米国特許第４，６６６．８４ ８号、１９８７年５月１９日発行、に記載されている）を、前述のプラスミドお よび二本鎖合成オリゴヌクレオチドリンカーＤＧ３１およびＤＧ３２から構成し た。ＤＧ３１／３２二本鎖リンカ−は、５’　Ｈｉｎｄｌｌ粘着末端及びこれに 続＜　Ｓａｌ　Ｉ　、　　Ｎｃｏ　Ｉ　、　　Ｋｐｎ　Ｉ　／Ａｓｐ７１８、Ｘ ＊ａ　Ｉ　／　Ｓｅａ　Ｉ認識部位および３’　Ｂａｗｌ　ｌ粘着末端をコード プラスミドｐＦＣ５４，７（前述の米国特許第４，６６６．８４８号に記載され ている５、９６ｋｂのプラスミド）をＨｉｎｄＩ［およびＢａｍＨＩで消化し、 そして単離されたベクター断片を５倍過剰量のリン酸化されておらずアニーリン グされたＤＧ３１／３２二本鎖と連結した。連結の後、ＤＮＡをＸｂａ　Ｉで消 化しく親ベクターＩＬ−２ＤＮＡ断片を不活性化するため）そしてＥ、コリに１ ２株ＤＧ１１６をアンピシリン抵抗性に形質転換するために使用した。コロニー をｄｅｓ−ａｌａ−ｓｅｒ”ＩＬ−２ムティン配列および制限酵素の消化による ＤＧ３１／３２ポリリンカー配列の獲得についてスクリーニングした。１つの候 補におけるポリリンカー領域（ｐＤＧ１６０と表示する）を配列決定し、そして 所望のポリリンカーＤＮＡ配列をコードすることが示された。

Ｂ、　Ｔｅｔ”プラスミドＤＧ１６１のプラスミドｐＡＷ７４０ｃＨＢ（ＡＴＣ Ｃ６７６０５）　（修飾されたテトラサイクリン抵抗性遺伝子源、ここでＢａｍ ＨＩおよび旧ｎｄＩ［制限部位が排除されており、そしてＣｏ１Ｅｉ　ｃｏｐ” ベクター中にラムダＰｔプロモーター、遺伝子Ｎリポソーム結合部位、ｃｒｙ　 ＰＲＥを含有する）を旧ｎｄｌ［ＩおよびＢａｍＨＩで完全に消化し、そして４ ．１９ｋｂのベクター断片をアガロースゲルの電気泳動により精製した。精製し たベクターＤＮＡ断片を５倍過剰のリン酸化されておらずアニーリングされたＤ Ｇ３１／３２二本鎖と連結した。

Ｅ、コリに１２株ＤＧ１１６をＤＮＡの一部分で形質転換し、そしてＴｅｔ”コ ロニーを４．２　ｋｂのプラスミドの存在についてスクリーニングした。いくつ かの候補を、さらに、制限酵素の消化によりスクリーニングし、そしてポリリン カー領域をサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）法により配列決定した。所望の配列をもつ 候補の１つを、ｐＤＧ１６１と表示した。

１旌■距 Ａ、　Ａｌ１ｐ”ＰＬプロモーター、遺伝子Ｎリポソーム結合部位（Ｎ□３）Ｔ ａｑポリメラーゼ（８３２）ＢＴ　ｃｒｙ　ＰＲＥ、　ｃｏｐ”発現ベクターの 構成 ラムダＰｔプロモーターおよび遺伝子Ｎリポソーム結合部位の制御下にプラスミ ドｐｓＹｃ１５７８によりコードされる全長（８３２アミノ酸）の突然変異した Ｔａｑポリメラーゼ配列を発現するために、プラスミドｐｓＹｃ１５７８および ｐＦＣ５４，ｔを使用した。

プラスミドｐｓＹｃ１５７８をＳｐｂ　ＩおよびＢａ１ＩＩで消化し、そして生 ずるほぼ２．５ｋｂのＴａｑポリメラーゼ遺伝子断片をアガロースゲルの電気泳 動および電気溶離により精製した。プラスミドｐＦＣ５４，ｔを旧ｎｄＩ［Ｉお よびＢａｗ＋ＨＩで完全に消化し、そしてベクターの断片をアガロースゲルの電 気泳動により精製した。

合成オリゴペプチドＤＧ２７（５’−ＡＧＣＴＴＡＴＧＡＧＡＧＧＣＡＴＧ）お よびＤＧ２Ｂ（５’−ＣＣＴＣＴＣＡＴＡ）を合成し、そしてアニーリングした 。

精製したｐＦＣ５４，を断片（０，０８５ピコモル）、精製したＴａｑポリメラ ーゼ遺伝子断片（０，２５ピコモル）およびアニーリングした非リン酸化ＤＧ２ ７／２Ｂ二本鎖アダプター（０，４３ピコモル）を３０ｐ１で一緒にし、そして １４℃において連結した。連結したＤＮＡの一部分を７５°Ｃ（１５分）加熱し て試料中のＤＮＡリガーゼを不活性化し、そしてχｂａＩで処理して、ＩＬ−２ を含有する連結生成物を線状化（不活性化）した。連結しそして消化された（は ぼ１０１００ｎを使用して、Ｅ、コリに１２株ＤＧ１１６をアンピシリン抵抗性 に形質転換した。Ａｏ＋ｐ”コロニーをほぼ８ｋｂのプラスミドの存在について スクリーニングし、前記プラスミドは旧ｎｄＩ［（６２１ｂｐ　＋７，４ｉ０ｂ ｐ）ＥｃｏＲＩ　（３，２５０ｂｐ＋４．７８１ｂｐ）およびＳｐｈ　Ｉ　（８ ，０３１ｂｐ）　、Ａｓｐ７１８（８，０３１ｂｐ）　、Ｂａ５ｉｎ　ｒ（８， ０３１ｂｐ）およびＰｖｕ　ＩＩ　（４，０９０ｂｐ＋３．４７７＋４６４ｂｐ ）をもつ期待する消化生成物を生じさせた。いくつかの候補を、５′ラムダＰ　 Ｌ　　：　ＴａｑＰｏｌ接合および３’　ＴａｑＰｏｌ　：　Ｂｔ横接合おいて ＤＮＡ配列分析した。候補の１つを、また、抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体を使用し て、はぼ９０ｋｂの免疫反応性抗原の合成についてスクリーニングした。単一の コロニーを３０℃の培養平板から４１℃の培養平板に２時間移した。コロニーを 楊枝で３０°Ｃおよび４０°Ｃの両者の平板からかき取り、ＳＤＳ導入緩衝液中 で沸騰させ、５Ｏ５−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、そして分離したタンパク質をニ トロセルロースの膜に移した。膜をポリクローナル抗Ｔａｑ抗体の１：６．ＯＯ Ｏ希釈物でブロービングし、そしてヤギ抗うサギＨＰＲ接合体で展開した。試験 した候補のすべては、温度誘導性のほぼ９０ｋｂのＴａｑポリメラーゼ関連タン パク質の証拠を示した。Ｅ、ｃｏｌｉ中でＴａｑポリメラーゼの合成を指令しそ して期待するＤＮＡ配列を含有する、いくつかの候補の１つをｐＬＳＧ　５と表 示する。

Ｂ、　Ｔｅｔ”Ｐ１プロモーター、遺伝子Ｎリポソーム結合部位、Ｔａｑポリメ ラーゼ（８３２）ＢＴ　ｃｒｙ　ｃｏｐ”発現ベクターの構成 Ｔｅｔ”ベクター中でラムダＰｔプロモーターおよび遺伝子Ｎリポソーム結合部 位の制御下にｐｓＹｃ１５７８によりコードされる全長（８３２アミノ酸）の突 然変異したＴａｑポリメラーゼ配列を発現するために、プラスミドｐｓＹｃ１５ ７ＢおよびｐｌＶ７４０ｃＨＢを使用した。プラスミドｐｓＹｃ１５７８をｓｐ ｈ　ＩおよびＢｇｌ　ＩＩで消化し、そして生ずるほぼ２．５ｋｂのＴａｑポリ メラーゼ遺伝子断片をアガロースゲルの電気泳動および電気溶離により精製した 。プラスミドｐＡＷ７４０ｃＨＢをＨｉｎｄｌ［ｒおよびＢａｗ＋ＨＩで完全に 消化し、そして生ずる４、１９ｋｂのベクターの断片をアガロースゲルの電気泳 動および電気溶離により精製した０合成オリゴペプチドＤＧ２７およびＩ）Ｇ２ ８　（前述の）をアニーリングした。精製したｐＡＷ７４０ｃＨＢ断片（０，１ ２ピコモル）を精製したＴａｑポリメラーゼ遺伝子断片（０，２４ピコモル）お よびアニーリングした非リン酸化ＤＧ２７／２Ｂ二本鎖アダプター（０，２４ピ コモル）を３０ｄで１４℃において結合した。結合したＤＮＡの一部分（１００ ｎｇ）を使用して、Ｅ、コリに１２株ＤＧ１１６をテトラサイクリン耐性に形質 転換した。Ｔｅ−の候補をほぼ６．７ｋｂのプラスミドの存在についてスクリー ニングし、前記プラスミドは旧ｎｄＩ［（６２１ｂｐ　＋　６．０７４ｂｐ）　 ＥｃｏＲＩ　（３，４４５ｂｐ　＋　３．６９５ｂｐ）、Ａｓｐ７１Ｂ（６，６ ９５ｂｐ）、Ｓｐｈ　Ｉ　（３，４４５ｂｐ＋３，２５０ｂｐ）、Ｂａｗｌ　Ｉ 　（６，６９５ｂｐ）およびＰｖｕ　Ｕ　（３，４７７ｂｐ＋　２．７５４＋４ ６４ｂｐ）をもつ期待される消化生成物を生じた。いくつかの候補を、５′ラム ダＰ　Ｌ：　ＴａｑＰｏｌ接合部および３’　ＴａｑＰｏｌ　：　Ｂｔ接合部に おいてＤＮＡ配列分析した。候補を、また、抗Ｔａｑポリメラーゼの温度誘発性 合成について前述したように、単一のコロニーイムノプロットによりスクリーニ ングした。Ｅ、コリ中でＴａｑポリメラーゼの合成を指令しそして期待するＤＮ Ａ配列を含有する、プラスミドの候補の１つをｐＬＳＧ　６と表示する。

実施例■ Ｍｅｔ４（３８２９アミノ　のノヒのＴａ　　ポリメラーゼの天然Ｔａｑポリメ ラーゼの予測される第４コドンは、メチオニン残基の導入を指令する（参照、上 のｐＬｓＧ　１およびｐＬＳＧ　２の５′配列）。８２９アミノ酸の一次翻訳生 成物の合成を指令するＴａｑポリメラーゼ遺伝子のさらに変異した形態を得るた めに、ｐｓＹｃ１５７８およびｐＤＧ１６１を使用した。プラスミドｐｓＹｃ１ ５７８をｓｐｈ　Ｉで消化し、ｄＧＴＰの存在下にＥ、コリＤＮＡポリメラーゼ Ｉクレノー断片で処理して、４塩基の粘着末端を除去し、そしてＣＴＴ　（ロイ シン、第５コドン）を発生させた。ＤＮＡポリメラーゼの不活性化および試料の Ｉｌ縮の後、ＤＮＡをａｇｉｎで消化し、そしてほぼ２．５ｋｂのＴａｑポリメ ラーゼの遺伝子断片をアガロースゲルの電気泳動および電気溶離により精製した 。プラスミドｐＤＧ１６１をＳａｃ　Ｉで完全に消化し、ｄＧＴＰの存在下にＥ 、コリＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片で修復して４塩基の３′粘着末端を除 去し、そしてＡＴＧ末端の二本鎖平滑末端を発生させた。ポリメラーゼの不活性 化の後、試料をＢａｍＨＩで消化した。

消化したｐＤＧ１６１　（０，１４６ピコモル）および精製したＴａｑポリメラ ーゼ断片（０，２９５ピコモル）を粘着末端条件下に一夜３０■／ｌｌ１１で連 結した６部分的に連結されたＤＮＡ試料（ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ末端）を１５ ｇ／ｄに希釈し、そして４時間平滑末端の条件下に連結した。ＤＮＡリガーゼを 不活性化しく７５℃、１０分）、そして試料をＮｃｏ　Ｉで消化して、ｐＤＧ１ ６１ポリリンカー配列を含有する結合生成物を線状化した。６０ｎｇの連結およ び消化したＤＮＡを使用して、Ｅ、コリに１２株ＤＧ１１６をテトラサイクリン 抵抗性に形質転換した。Ｔｅｔ”候補をほぼ６．７廟のプラスミドの存在につい てスクリーニングし、このプラスミドは旧ｎｄｎｌ　（６１２ｂｐ＋６．０７４ ｂｐ）、ＥｃｏＲＩ　（３，４４５ｂｐ＋３，２４１）およびＳｐｈ　Ｉ　（６ ，６８６ｂｐ）で処理したとき、期待する消化生成物を生じた。コロニーを、上 のように、単一コロニーのイムノプロットにより、はぼ９０ｋｂのＴａｑポリメ ラーゼ関連ポリペプチドの温度誘導合成についてスクリーニングした。Ｔａｑポ リメラーゼ関連ポリペプチドの合成を指令するプラスミドの１つ（ｐＬＳＧ　７ と表示する）を、５′ラムダＰＬプロモーター：Ｔａｑポリメラーゼ接合部およ び３’Ｔａｑボリメラ一ゼ二ＢＴ接合部において、サンガー配列決定法にかけた 。

５′接合部においてＤＮＡ配列の分析は、制限酵素の分析（ｐＬＳＧ　６におけ る１つのＳｐｈ　１部位の喪失、およびｐＬＳＧ　６中の６２１ｂｐのＨｉｎｄ １１１断片よりわずかに小さい、６１２ｂｌ）の旧ｎｄｌｌＩ断片）を確認し、 そしてＴａｑポリメラーゼの８２９アミノ酸の形態をコードするプラスミドの誘 導体化を示した。

皇施五入 Ｔａ　　ボ１メー−ゼのＭｅｔ２８９　２８９５４４アミノ　のｌ　の１底 天然Ｔａｑポリメラーゼの精製（実施例ＸＩ［）の間、７０°ＣにおけるｄＮＴ Ｐの鋳型依存性導入を触媒するＴａｑポリメラーゼの変更された形態を得た。Ｔ ａｑポリメラーゼのこの変更された形態は、実施例Ｘ■に記載するほぼ９０ｋｂ の形能に免疫学的に関係づけられるが、より低い分子量をもっていた。

５ＯＳ−ＰＡＧＥ電気泳動後のＢＳＡおよびオバルプミンに対する移動度に基づ いて、この形態の見掛けの分子量はほぼ６１ｋｄである。この変更した形態の酵 素は、５Ｏ５−ＰＡＧＥウェスタン・プロット分析あるいは５０Ｓ−ＰＡＧＥＳ ＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動及びその後のその場でのＤＮＡポリメラーゼ活性の 決定（Ｓｐａｎｏｓ、　Ａ、およびＨｕｂｓｃｈｅｒ、　Ｕ、　（１９８３）　 Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、　　９１　：　２６３−２７７）により決定した場合、サー ムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　括」１匡■）細胞の注意深く調製した粗 抽出物中には存在しない。この形態は、試料の取り扱いの間生じ得るタンパク質 分解による人工物であるように思われる。この低分子量の形態を均質に精製し、 そしてＡＢＩ自動化気相配列決定装置でＮ末端配列の決定にかけた。得られたＮ 末端の配列をＴａｑポリメラーゼ遺伝子の予測されるアミノ酸配列と比較すると （第１図参照）、このより短い形態はｇｌｕｚｓｖおよびｓｅｒ□。の間のタン パク質分解的切断の結果として生ずることが示される。

５４４アミノ酸の一次翻訳生成物の合成を指令するであろうＴａｑポリメラーゼ 遺伝子の更なる短縮形を得るために、プラスミドｐＦｃ５４．ｔ　、　ｐｓＹｃ １５７８並びに相補的合成オリゴヌクレオチドＤＧ２９（５’　−ＡＧＣＴＴＡ ＴＧＴＣＴＣＣＡＡＡＡＧＣＴ）およびＤＧ３０（５’　−ＡＧＣ丁ＴＴＴＧＧ ＡＧＡＣＡＴＡ）を使用した。プラスミドｐＦＣ５４，ｔをＨｉｎｄＩ［［およ びＢａｗｌ　Ｉで完全に消化した。プラスミドｐｓＹｃ１５７８をＢｓｔＸＩで 消化し、そしてすべてのｄＮＴＰの存在下にＥ６　コリＤＮＡポリメラーゼＩク レノー断片で処理して、４ヌクレオチドの３′粘着末端を除去し、そしてＴａｑ ポリメラーゼ配列中のＩｅｕｚｑ＜をコードするＣＴＧ末端の二本鎖平滑末端を 発生させた（参照、１１、ヌクレオチド８８０）。ＤＮＡの試料をＢｇｌｎで完 全に消化し、そしてほぼ１．６ｋｂのＢｓｔＸＩ（修復された）／　ＢｇＩＩ［ Ｔａｇ　ＤＮＡ断片をアガロースゲルの電気泳動および電気溶離により精製した 。ｐＦＣ５４，ｔ、ＰＬプロモーターの消化物（０，１ピコモル）を、粘着リガ ーゼ条件下にて３０珂／１１１．１５℃において一夜、Ｔａｑポリメラーゼ遺伝 子断片（０，３ピコモル）およびアニーリングした非リン酸化ＤＧ２９／ＤＧ３ ０と連結した。ＤＮＡをほぼ１０　ｔｓ　／　ａｄ！に希釈し、そして連結を平 滑末端条件下に続けた。連結したＤＮＡの試料をＸｂａ　Ｉで消化して、ＩＬ− ２ムテインをコードする連結生成物を線状化（不活性化）した。８０ｎｇの連結 および消化したＤＮＡを使用して、Ｅ、コリに１２株ＤＧ１１６をアンピシリン 耐性に形質転換した。

Ａｍｐ”の候補をほぼ７．１７ｋｂのプラスミドについてスクリーニングし、こ のプラスミドはＥｃｏＲＩ　（４，７８１ｂｐ　＋　２．３８６ｂｐ）、Ｐｓｔ 　Ｉ　（４，１３８ｂｐ＋３．０２９ｂｐ）、Ａｐａ　Ｉ　（７，１６７ｂｐ） およびＨｉｎｄＩ［／　Ｐｓｉ　Ｉ　（３，４００ｂｐ＋３．Ｑ２９ｂｐ　＋７ ３８ｂｐ）をもつ期待する消化生成物を生じた。候補のプラスミドを収容するＥ 、コリのコロニーを、前述したように、単一コロニーのイムノブロックにより、 はぼ６１ｋｄのＴａｑポリメラーゼ関連ポリペプチドの温度誘導合成についてス クリーニングした。さらに、候補のプラスミドを、５′ラムダＰＬプロモーター ：　Ｔａｑ　ＤＮＡ接合部および３’Ｔａｑポリメラーゼ：　ＢＴ　ｃｒｙ　Ｐ ＲＥ接合部においてＤＮＡ配列を決定した。意図するＤＮＡ配列をコードしそし て温度誘導性の６１ｋｄのＴａｑポリメラーゼ関連ポリペプチドの合成を指令す るプラスミドの１つを、ｐＬＳＧ６７と表示した。

プラスミドｐＦＣ８５の約２．６８ｋｄのＨｉｎｄｌ［［−Ａｓｐ７１８断片内 に含断片−ドするアミノ末端Ｈｉｎｄ　ｍ制限部位をＡＴＧ開始コドンに作用可 能に連結することによって発現させることができる。

発現したときのこの融合生成物は、約７０．０００〜７２．０００ダルトンの短 縮ポリメラーゼを生ずるであろう。

この特定の構成体は、ｐＦＣ８５を旧ｎｄＩＩ［で処理し、そしてｄＡＴＰおよ びｄＧＴＰの存在下にクレノー断片で処理することによって作ることができる。

生ずる断片を３１ヌクレアーゼで処理して一本鎖の伸長部を除去し、そして生ず るＤＮＡをＡｓｐ７１Ｂで消化し、そしてすべての４種類のｄＮＴＰの存在下に クレノー断片で処理する。回収した断片は、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを使用して、 Ｓａｃ　Ｉで消化しそしてｄＧＴＰの存在下にクレノー断片で処理してＡＴＧ平 滑末端を構成したリン酸化されていないプラスミドｐＰＬＮＲＩＳＡＴＧに結合 することができる。次いで、この結合混合物を使用してＥ、コリＤＧ１１６を形 質転換し、そして形質転換体をＴａｑポリメラーゼの産生についてスクリーニン グすることができる。発現はウェスタン免疫プロット分析および活性分析により 確証することができる。

実差［Ｘ Ａｍｐ”ｔｒｐプロモーターオペレーター、ｔ、ｒ　ｐ　Ｌリポソーム結合部位 、Ｔａｑポリメラーゼ（８３２）　ＢＴ　ｃｒｙ　ＰＲＥ　ｃｏｐ”発現ベクタ ーの構成 Ｅ、コリｔｒｐオペロンプロモーター／オペレーターおよＫＢ　２　（ＡＴＣＣ ｋ５３０７５）に形質転換した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ分画した全細胞抽出タンパク質のクーマツシーの蓄積を指令す る。プラスミドの１つをｐＬｓＧＩＱと表示する。

２施五Ｘ上 同時にラムダＰｔプロモーターを抑制解除しくｃ　Ｉ　Ｉｓ？　リプレッサーの 不活性化）かつＣｏ１Ｅｉ　ｃｏｐ”プラスミドベクターのコピー数を増加した 。３７℃において６９時間増殖させた後、細胞のアリコートを収得し、細胞を遠 心し、そして沈澱を一７０℃において貯蔵した。

あるいは、プラスミドｐＬｓＧ１０を収容するＥ、コリに１２株ＫＢ２を０．５ ％のグルコース、５　ｔｒｇ　／　ａｄ！のトリプトファン、１゜ｐｇ　／　ｄ のチアミン、０．２５％（Ｗ／Ｖ）のディフコ（Ｄｉｒｃｏ）カサミノ酸および アンピシリン（１００■／ｄ）を含有するボンナたように収穫した。

細胞の沈澱を、５０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−（／！　（ｐＨ１，５）、１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ　。

２．４ｍＭのＰＭＳＦおよび０．５■／Ｉｄ、のロイブチン中で約６２．５れ。

。 ／Ｈ１（約１５０〜１６０ｇの合計タンパク質／Ｍ１）に再懸濁し、そして超音 波処理により溶菌した。超音波処理した抽出物を５０５−ＰＡＧＥにかけ、そし てクーマツシー染色およびウサギポリクローナル抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体を使 用するウェスタン例Ｘ■参照）においてアッセイした。

−マッシーブルーの染色は、これらの誘導された菌株における約９４ｋｄにおけ る新しい主たるタンパク質の存在を明らかにした。最後に、高温活性測定は、こ れらのＥ、コリ株における有意のレベルの組換えＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼの 合成を確証した（下表参照）。

ｐＤＧ１６０／ＤＧ１１６　　　　　　　　　Ｐ　Ｌ　　　　　　−ｏｒ＋　　 　　＜１．０ｐＬＳＧ５／ＤＧ１１６　　　　　　＋　　　　　　　Ｐ　Ｌ　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２３ｐＬＳＧ５／ＤＧ１１６　 　　　　　＋　　　　　　　　Ｐ　Ｌ　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　 　　　　３０８ｐＬｓＧ６／ＤＧ１１６　　　　　　＋　　　　　　　Ｐ　Ｌ　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｐＬｓＧ６／ＤＧ１１６　 　　　　　＋　　　　　　　Ｐ　Ｌ　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　 　　　１７０ｐＬｓＧ１０／ＫＢ　２　　　　＋　　　　　Ｔｒｐ　　　　　　 ＋　　　　　　　３００ｘ１単位＝７４°Ｃ／３０分において取込まれた１０ナ ノモルの合計ヌクレオチド。

直ｍ えＴａＤＮ＾ボ１メー−ゼの　１ ｐＬｓＧ　５を収容するＥ、コリ株［ｌＧ１１６を１０１の発酵器内で増殖させ た。培地はＩＯＩＩＩＭ（ＮＨＪｔＳＯａ、２５５Ｍ　ＫｌｂＰＯ４，４ｍＭＮ ａ５サイトート、　４００ｍＦＩの　ＦｅＣ１ｇ　、２８ＪＳ　ＺｎＣｊ！　ｚ 　、３４ＪＩＭ　ＣｏＣｊ！　ｇ　、３３ＪＩＭ　ＮａＦＩｏＯａ、２７渕のＣ ａＣｊ！　ｚ、３ＯａＭ　ＣｕＣｌ　ｇおよび３２ｄ　ＨＪＯｓであった。培地 を１５ｍＭ　ＮａＯＨでｐＨ６，５に調節し、そして滅菌した０次の滅菌成分を 添加した；２０■７１のチアミン・ＨＣｆ、３　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏａ、１０ｇ／ｌ のグルコースおよび１２．５■／ｊ！のアンピシリン、　ｐＨを６．８に調節し 、そしてそこにＮＨ４ＯＨを使用して保持した。グルコースを培養物にアルカリ の要求と組み合わせて供給して、自動的なｒｐｍの増加（３５０〜１０００）お よび空気流の増加（２〜５ｆ／分）により、４０％の空気飽和にグルコース濃度 を維持した。必要に応じて、ポリプロピレングリコールを使用して発砲を制御し た。

発酵器に細胞を接種し、そしてＡ６１１０＝５、α（１４，２５時間）に増殖さ せた。温度を３７°Ｃに上げて組換えＴａｑポリメラーゼの合成を誘導し、そし て増殖を１６．５のＡ。。に５時間続けた。

特記しない限り、すべての精製工程は４℃において実施した。プラスミドｐＬＳ Ｇ　５を収容する誘導され凍結されたＥ、コリに１２株ＤＧ１１６の１２ｇ（湿 潤重量）を、３体積の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）、１　ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ、　３　ｗＭ　ＰＭＳＦ、、０．６４ａｇ／　ｄ（７）　Ｏイペプ チン中で融解し、そしてフレンチプレスで２０，０００ｐｓｉで粉砕した。細胞 溶解物を５．５×細胞体積に追加の緩衝液で調節し１．そして超音波処理して（ ４Ｘ３０秒）粘度を減少させたｇ／りに調節し、そして２０．０ＱＯＸ　ｇにお いて１５分間遠心した。上澄液（分画■）を７５°Ｃに加熱しく１００”Ｃの水 浴中で）そして７２〜７５°Ｃに１５分間維持して、Ｅ、コリ宿主タンパク質を 変性させた。試料を氷水浴中で撹拌することによって４℃に急速に冷却した。０ ℃において２０分後、試料を２０．０００ｘ　ｇにおいて１５分間遠心して、変 性したタンパク質を沈澱させた。

上澄液（分画■）を、４ａｄ！／時間で、５０ｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ＣｐＨ７ ，５）、１ｍＭのＥＤＴＡ　（緩衝液Ａ）（０，２Ｍ　（ＮＨａ）ｚｓＯ４を含 有する）により平衡化した６ｍのフェニル−セファ０−ズＣＬ　−４Ｂ（Ｐｈａ ｒｍａｓｉａ）カラムに適用した。このカラムを順次に３〜１゜カラムの体積の ａ）同一の緩衝液、ｂ）緩衝液Ａ、ｃ）２０％のエチレングリコールを含有する 緩衝液Ａで洗浄して、核酸および非Ｔａｑポリメラーゼタンパク質を除去した。

Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼの活性を、６ｏＩｄの直線勾配の２０％のエチレン グリコールを含有する緩衝液Ａ中の０〜４Ｍ尿素で溶出した。

活性分画（約２Ｍ尿素）をプールしく分画■）、そして３１１１／時間で、５０ ｗＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（／！　（ｐＨ７，５）　、０．１ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ　、　 ０．２％ノツイー７２０　（緩衝液Ｂ）（０，１Ｍ　ＫＣｊｌ！を含有する）に より平衡化した１２Ｉｄ（１，５ｘ　６．　Ｏｃｍ）のヘパリン−セファローズ ＣＬ−６８（Ｐｈａｒｍａｓｉａ）カラムに適用した。このカラムを２力ラム体 積の０．１５ＭＫ１を含有する緩衝液Ｂで洗浄した。

Ｔａｑポリメラーゼを１２０ｄの直線勾配の緩衝液Ｂ中の０．１５〜０．６５Ｍ 　ＫＣｊ２で溶出した。Ｔａｑポリメラーゼは単一のＡ２８０および約０．２９ Ｍ　ＭＣ１，における活性のピークとして溶離した。

精製した組換えＴａｑポリメラーゼタンパク質および天然Ｔａｑポリメラーゼタ ンパク質は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上での電気泳動およびクーマツシーブルーの染色 で同時に移動する。精製したＴａｑポリメラーゼは精製したホスホリラーゼＢ　 （Ｐｈａｒｖａｓｉａ）よりわずかに速く移動し、９３．９２０ダルトンのＤＮ Ａ配列（ｐＬＳＧ　５の）から予測される分子量と一致する。

ピーク活性の分画をプールし、そして一部分をアプライド・バイオシステムス（ Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓ＋ｓ）気相配列決定装置のＮ末端アミノ酸 配列にかけた。ブロッキングされたアミノ末端を有する天然Ｔａｑポリメラーゼ と対照的に、精製したＴａｑポリメラーゼの配列および個々のサイクルの収率は 、プラスミドｐＬＳＧ　５によりコードされるＴａｑポリメラーゼタンパク賞の アミノ末端について予測される末端配列と一致した。

プラスミドｐＬＳＧ　５によりコードされそして前述したように精製した組換え Ｔａｑポリメラーゼは、ヒトの「単一コピーｊの配列を増幅することができるで あろう。５５℃の低い温度の限界、７２℃の伸長温度、９４°Ｃの上限の温度お よび２〜２．５分のサイクル時間で、匹敵する収率および効率が、１〜２単位／ 　ＬｏｏｐｌのＰＣＲを使用して天然および組み換えのＴａｑポリメラーゼにつ いて認められた。

豊−製 熱安定性ポリメラーゼは、後に記載する例に従って、テルムス・アクアチフス（ Ｔｈｅｒｍｕｓ　肥彫工匡■）の培養物から直接精製することができ、あるいは 粗抽出物の調製において必要なわずかな変更を伴って、組換生産された酵素を含 有する細面培養物から精製することができる。

遠心分離により集菌した後、６０ｇの細胞を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ（ｐＨ ８，１）及び１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する緩衝液７５ｄ中に懸濁した。細胞を フレンチプレス中で１４．０００〜１６，０ＯＯＰＳＩにて溶菌し、この後４容 積（３００Ｍ１．）の追加の丁ｒｉｓ−ＥＤＴＡを加えた。緩衝液Ａ（β−メル カプトエタノールを５１１１Ｍに、そしてＮＰ　−４０及びトウィーン２０をそ れぞれ０．５　ｖ　／　ｖ％に）を添加し、そしてこの溶液を冷却しながら十分 に音波処理した。得られる均質懸濁液を緩衝液Ａによりさらに稀釈して最終容量 が出発細胞重量の７．５〜８倍となるようにした。これを画分Ｉと称する。

画分■及び上清画分中のポリメラーゼ活性を、０．０２５ＭＴＩＰＳ−ＨＣｊ！ 　（ｐ）１９．４　、２０°Ｃ）　、０．００２Ｍ　ＭｇＣｆ　ｔ　、０．０５ Ｍ　ＭＣＩ、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．２＋ｓＭずつのｄＧＴＰ　 、　ｄＡＴＰ　。

ＴＴＰ　、　Ｏ，Ｌｗ＋Ｍ　ｄＣＴＰ　　［α−”Ｐ　、　０．０５Ｃｉ／ｍＭ ）　、１２．５１１ｇ”活性化された”サケ***ＤＮＡ及び０．０１〜０．２ユ ニツトのポリメン２０及び１ｍＭ２−メルカプトエタノール中に稀釈）を含んで 成る５０１の混合物中で測定した。１ユニツトは３０分間中１０ｎＦＩの生成物 に相当する。“活性化された”ＤＮＡは、ＤＮＡの５％が酸可溶性画分に変るま でＤＮａｓｅ　Ｉにより部分加水分解された後のＤＮＡの天然調製物である。反 応を７４°Ｃにて１０分間行い、そして次に４０４を２ｍＭＥＤＴＡ中５０■／ ｉ中手０■／ｉＤＮＡ溶液１．０ｍ（０℃）中に移した。同容量（１，０ｍ）の ２０％ＴＣＡ及び２％ピロリン酸ナトリウムを加えた。Ｏ″Ｃにて１５−２０分 間の後、サンプルをワットマンＧＦ／Ｃディスクを通して濾過し、そして冷５％ ＴＣ＾−１％ピロリン酸塩により十分に洗浄し、次に冷９５％エタノールで洗浄 し、そして乾燥し、計数した。

百分■を、ベックマンＴ１４５０−ター中で３５．００Ｏｒｐｍにて２時間、２ ℃にて遠心し、そして集めた上清を画分■とした。

活性の９０〜９５％を沈澱せしめるのに必要なポリメン（Ｐｏｌｓ＋１ｎ）Ｐの 最少量（この量は一般に最終容量の０．２５〜０．３％であることが見出された ）を決定した後、ポリメンＰ　（ＢＲＬ、ガイセルブルグ、ＭＤ）（１０ｖ／ｖ ％、ｐＨ７，５に調整しそしてオートクレーブしたもの）によりＴａｑポリメラ ーゼ活性を沈澱せしめた。

０　”Ｃにて１５分間にわたり攪拌しながら、適当なレベルのポリメンＰを画分 ■に徐々に添加した。この溶液を０℃にてベックマンＪＡ１４０−ター中で２０ 分間にわたり１３．００Ｏｒｐｍにて遠心した。上清の活性を測定し、そしてペ レットを１１５容量の０．５×緩衝液Ａ（水で１：２に稀釈したもの）に再懸濁 した。

この懸濁液を再遠心分離し、そしてベレットを１７４容量の緩衝液Ａ（ｏ、４Ｍ ＫｃＩ！、を含有）に再懸濁した。この懸濁液を十分にホモジナイズし、そして ４°Ｃに一装置いた。このホモジネートを前記のように遠心し、そして集めた上 滑を画分■と命名した。

蛋白質画分を硫酸アンモニウムの７５％飽和での“沈澱”により集め、遠心分離 し、（２７，００Ｏｒｐｍ、　５Ｗ２７０−ター、３０分間）そして浮上した薄 膜を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＣ／！　（ｐＨ８）、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中に再懸 濁した。これらの段階を反復し、そして蛋白質懸濁液を８０ｍＭ　ＫＣｊ！を含 有するＰ−ｃｅｌｌ緩衝液〔２０＊Ｍ　ＫＰＯａ　、ｐＨ７，５０、５ｄ　ＥＤ ＴＡ　、　　５　ｍｌ’ｌβ−メルカプトエタノールグリセロール、０．５ｖ／ ｖ％ＮＰ　−　４０及びトウィーン２０〕により十分に透析した。

透析物を遠心ビンに移し、これに、８抛ＭＫＣｆを含有するＰ−ｃｅｌｌ緩衝液 ですすがれたサックから回収された蛋白質を加えた。遠心を２０．０００Ｘｇに て行い、そして時間は１５分間に短縮した。上清を貯蔵し、そして残ったベレッ トをＰ−ｃｅｌｌ緩衝液及び８０ｍＭ　ＫＣｊ２により洗浄・抽出し、そして再 遠心した。

次に上清を一緒にして画分■と命名した。

画分■を、８０ａ＋Ｍ　ＫＣＩ！を含有するＰ−ｃｅｌｌ緩衝液で平衡化したホ スホセルロースの２．　２　Ｘ２２ｃｍＯカラムに通用した。このカラムを同じ 緩衝液で洗浄しくカラムの２．５〜３倍容量）、そしてＰ−ｃｅｌｌ緩衝液中８ ０〜４００ｅｏＭ　ＫＣｊ！の直線グラジェントを用いて蛋白質を溶出した。Ｄ ＮＡポリメラーゼ活性を含有する画分（約０．１８〜０．２０Ｍ　ＫＣｊ２　） をプールし、そしてアミコン撹拌セル及びＹＭ３０膜上で３〜４倍濃縮した。こ のセルを、ＫＣｆを含有しないＰ−ｃｅｌｌ緩衝液ですすぎ、そして両分濃縮物 （０．１５？ｌ　ＫＣｊ２最終容量調整）に加えて画分Ｖとした。

画分■を、Ｐ−ｃｅｌｌ緩衝液及び０．１５Ｍ）［Ｃ／！で平衡化したヘパリン ・セファロースＣＬ　−　６８カラム（ファルマシア）５−に適用した。カラム を０．１５Ｍ　ＫＣｊｌ！緩衝液（３〜４カラム容量）により洗浄し、そしてＰ −ｃｅｌｌ緩衝液中０．１５　〜０．６５Ｍ　ＫＣｊ！の直線グラジェントによ り蛋白質を溶出した。ＳＯＳ−ＰＡＥＧ分析のためにゼラチンを含まない稀釈剤 への１：１０稀釈を行い、そして酵素の測定に使用するため１■／ｄのゼラチン を含有する稀釈剤への引続いての１：２０稀釈を行った．活性画分（約０．　３ ＭＫＣ／！で溶出）を、スーパーコイルＤＮＡ鋳型上で特異的及び非特異的エン ドヌクレアーゼ／トポイソメラーゼについて、過剰のＤＮＡポリメラーゼと共に インキュベートした後のスーパーコイルプラスミドＤＮＡの分子量の変化を電気 泳動により検出することによって測定した。少量の線状ＤＮＡフラグメントとの インキュベーションの後エキソヌクレアーゼの汚染が検出された。ピーク画分中 、約８８ｋｄ蛋白質が主たるバンドであることが見出された。画分■と称する主 要画分は、このプールを約３〜５ポリメラーゼユニツト／６００ｎｇ　ＤＮＡで ５５℃にて３０分間測定した場合、最少の検出可能なエンドヌクレアーゼ活性を 伴って最高のポリメラーゼ活性を有していた。

画分■を、１０ｍＭ　ＫＰＯ４（ｐＨ７．　５　）　、５ｗＭβ−メルカプトエ タノール、５％グリセロール、０．　２％ＮＰ−４０及び０，２％トウィーン２ ０（ＨＡｆｆｌ衝液）に対して透析した。こ°の透析されたサンプルを、ヒドロ キシアパタイトの３ｄのカラムに適用し、そしてＨＡ緩衝液中１０〜２５０ａ＋ Ｍ　ＫＰＯ４　（１）１１７．　５　）の直線グラジェントにより酵素を溶出し た。ポリメラーゼ活性は７５ｓＭ　ＫＰＯａにおいて溶出し始め、１００ｍＭ　 ＰＯａにおいてピークを示した。

活性ピーク画分を１：１００〜１：３００稀釈で測定した。前のクロマトグラフ ィ一段階におけるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のため、ゼラチンを含まない稀 釈剤中１＝１０の稀釈物を調製した。５ポリメラーゼユニツトで５５℃において 有意なエンドヌクレアーゼ又は二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有しない百分を プールし、そして画分■と命名した。

百分■を、２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．　２　）　、５％グリセロール、 ５顛ｈβ−メルカプトエタノール、０．１■Ｍ　ＥＤＴＡ　、　０．　１％ＮＰ 　−　４０及び０．　１％トウィーン２０の溶液に対して透析し、室温において ｐＨ５に調整した。透析されたサンプルを、あらかじめ平衡化した２ＩｉのＤＥ ＡＥ−Ｔｒｉｓ−Ａｃｒｙｌ−Ｍ（ＬＫＢ）カラムに適用し、そして次に同じ緩 衝液で洗浄した。カラムに付着しなかったポリメラーゼ活性を含有する両分をプ ールし、そして同じ緩衝液中５０ｍＭ　ＮａＣｊ！に調整し、画分■を得た。

画分■を、同じ緩衝液（２５ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｓ＋Ｍ　ＮａＣ１，５％ グリセロール、０．１　ｓＭ　ＥＤＴＡ　、　０．１％ＮＰ　−４０及び０．１ ％トウィーン２０）で平衡化された２ｄのＣＭ−Ｔｒｉｓ−Ａｃｒｙｌ−Ｍ（Ｌ ＫＢ）カラムに適用した。このカラムを、４〜５カラム容量の同じ緩衝液で洗浄 し、そして酵素を酢酸ナトリウム緩衝液中５０〜４００＋ＩＩＭ　Ｍａｃｅの直 線グラジェントにより溶出した。ポリメラーゼ活性のピークは約０．１５〜０． ２０Ｍ　ＮａＣ１において溶出された。ポリメラーゼ活性を、５ＯＳ−ＰＡＧＥ 分析のためゼラチンを含有しない稀釈剤中にまず１：１０で稀釈し、１：３００ 〜１：５００稀釈において測定した。７４°ＣにてＤＮＡポリメラーゼアフセイ 塩（２５ｍＭ　ＴＡＰＳ−ＨＣｊ！　、　ｐＨ９，４，２，ＯｍＭＭｇＣｊ！ｚ 及び５０ｍＭＫＣｆ）を用いて特異的及び非特異的エンドヌクレアーゼ／トポイ ソメラーゼについてスーパーコイルＤＮＡ鋳型に対する活性ピークにわたる測定 を行い、さらにＭ１３ｓｓＤＮＡ及びｐＢＲ３２２フラグメントに対するヌクレ アーゼの測定も行った。検出可能なヌクレアーゼを含有しない活性画分をプール し、そして銀染色５ＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル上を泳動せしめた。この結果は、〜 ２００．０００ユニツト／■の比活性を有する約８８ｋｄ単一バンドを示す。

この比活性は、すでに単離されているＴａｑポリメラーゼについてクレームされ ているものに比べて１オーダー以上高く、そしてＥ、コリポリメラーゼＩのそれ に比べて少なくとも１オーダー高い。

１１皿Ｘヱ 実施例Ｘ■に記載したようにして精製されたＴａｑポリメラーゼは、Ｔａｑエン ドヌクレアーゼ活性及びＴａｑエキソヌクレアーゼ活性により汚染されていない ことが見出された。

さらに、Ｔａｑポリメラーゼは好ましくは、使用される各非イオン性洗剤約０． １〜約０．５　ｖ　／　ｖ％を含有する貯蔵緩衝液中に貯蔵される。さらに好ま しくは、貯蔵緩衝液は５０ｖ／ｖ％グリセロール、１００＋ｍＭ　ＫＣｊ！、２ ０ｄｌ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（／！　（ｐＨ８，０）、０．１ｍＭエチレンジアミン四 酢酸酢酸ＤＴＡ）、１ｍＭジチオスレイトール、０．５　ｖ　／　ｖ％ＮＰ　− ４０，０，５ｖ　／　ｖ％トウイーン２０及び２０ｇ／ａｄ！ゼラチンからなり 、そして好ましくは一２０°Ｃで貯蔵される。

この貯蔵されたＴａｑポリメラーゼを、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（、ｅ（ｐＨ８ ，０）　、２０ｍＭ　ＫＣｊ！　、　　１　ｗ＋Ｍβ−メルカプトエタノール、 ０．５％ＮＰ　−４０，０，５％トウィーン２０及び５００ｘ／ｄゼラチンから 成る緩衝液に稀釈した０次に、５０ｗＭ　ＫＣｊ！、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ Ｉ　（ｐＨ８，３）　、１．５ｓＭ　ＭｇＣｊ！ｇ　、０．０１ｗ／　ｖ％ゼラ チン、２００団ずつのｄＮＴＰ、　１−ずつのプライマー（バクテリオファージ λからの対照鋳型上の５００塩基対の標的配列を定義する）、及び２．０〜２． ５ユニツトのＴａｑポリメラーゼ／１測定を１００Ｉの最終容量中に含有する反 応緩衝液を調製した。この反応緩衝液に鋳型を添加し、サンプルを０．５　ｍの ポリプロピレンチューブに入れ、そしてサンプルを１００ｉ１１の重白色鉱油で 覆って蒸発を防止した。

ｌｏｇの対照鋳型（バクテリオファージλＤＮＡ）を使用し、標的配列がＤＮＡ の出発量の約１％を占め、次の条件を用いた場合、少なくとも１０’倍の増幅が 達成された。

チューブを熱浴中に置くことにより９４°Ｃにて３０秒間、１分間にわたり鋳型 混合物をまず変性した。次に、チューブを３７°Ｃの熱浴に２分間入れた。次に 、チューブを７２°Ｃの熱浴に３分間入れ、そして次に９４°Ｃの熱浴に１分間 入れた。このサンプルを合計２５サイクル反復した。２５回目のサイクルの終り において、９４゛Ｃにおける熱変性段階を省略し、そしてその代りに、７２°Ｃ のインキュベージジン段階をさらに３分間延長した。

測定を停止した後、サンプルを室温に放冷し、そして先行例において記載したよ うにして分析した。

異る濃度のｄＮＴＰ及び異る濃度のＴａｑポリメラーゼを用いて、鋳型を最適に 増幅することができよう。さらに、ＤＮＡサンプル中の標的配列のサイズは、適 切な伸長（７２℃でのインキュベーション段階）のために必要な最短時間に影響 を与えるであろう、最大の効率を得るため、増幅されるべき個々の鋳型について 温度サイクルプロフィールの最適化を行うべきである。

１隻１１ 実施例Ｉに記載したようにして精製したＴａｑポリメラーゼを先行する例におい て記載したようにして貯蔵のために製剤化した。但し、非イオン性ポリマー洗剤 を使用しなかった。

その例において記載したようにして活性を測定した場合、この酵素貯蔵混合物は 不活性であることが見出された。貯蔵緩衝液にＮＰ　−２０及びトウィーン２０ を添加した場合、十分な酵素活性が保存されており、酵素製剤の安定のために非 イオン性洗剤が必要であることが示された。

尖施Ｕ立 ヒトゲノムＤＮＡのＩｇのサンプル数個を、同等のユニット数のＫｌｅｎｏ−フ ラグメント又はＴａｑポリメラーゼを用いて、実施例■に記載したようにして２ ０〜３５サイクルの増幅に付し、そしてアガロースゲル電気泳動及びサザンプロ ットにより分析した。これらの反応において使用されたプライマーＰＣＯ３及び ＰＣＯ４はヒトβ−グロビン遺伝子の１１０ｂｐセグメントの合成を指令する。

　Ｋｌｅｎｏ−ポリメラーゼ増幅は、この酵素を用いる場合に典型的に観察され るＤＮＡの汚れ（ｓｍｅａｒ）を示し、その予想される原因は非特異的アニーリ ング、及び本質的に非−ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（１× Ｋｌｅｎｏ−塩、３７℃）下での無関係のゲノム配列へのプライマーの伸長であ る。それにもかかわらず、サザンプロットにおいて、すべてのレーンで特異的１ １０ｂＰβ−グロビン標的フラグメントが観察された。Ｔａｑポリメラーゼを用 いて行われた増幅において実質的に異る電気泳動パターンが見られ、この場合、 単一の主要バンドは１１０ｂｐ標的配列である。この顕著な特異性は疑いなくプ ライマーが伸長された時の温度によるものであった。

Ｋｌｅｎｏ−フラグメント増幅の場合のように、アニーリング段階は３７°Ｃで 行われたが、Ｔａｑ−触媒反応の温度を約７０℃に上昇せしめた後に酵素は有意 な活性を示した。３７℃から７０”Ｃへのこの変温の間、貧弱にマツチしたプラ イマー−鋳型バイブリド（３７℃で形成される）が解離し、反応混合物が酵素活 性化温度に達する時点までに、高度に相補的な基質のみが伸長のために利用可能 であった。この特異性はまた、Ｋｌｅｎｏ−フラグメントを用いて行われる同様 の増幅に比べて高収量の標的配列をもたらす。なぜなら、非特異的伸長生成物が ポリメラーゼに関して効果的に競争し、これによりＫｌｅｎｏ−フラグメントに より作られ得る。１０−マーの量が減少するからである。

実施ＩＸ−舅 １　ｔｒｇ　Ｍ’ｏｌｔ　４　ＤｆＪＡ、　５０ｎ＋Ｍ　ＫＣＩ、１０ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ（ｐＨ８，３）　、１０＋ｓＭ　ＭｇＣ４ｚ　、Ｏ，０１％ゼラチン、１ 洲ずつの次のプライマー（１５０ｂｐ６Ｎ域を増幅するためのもの）：５’　− ＣＡＴＧＣＣＴＣＴＴＴＧＣＡＣＣＡＴＴＣ−３’　（ＲＳ７９）及び ５’　−ＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＴＴＧＴＡＧＣＴＧ−３’　（ＲＳ８０）１、 ５　ｍＭずつのｄＮＴＰ及び５．０ニー１−　ットのＴａｑポリメラーゼを１０ ０ｍの反応容量当りに含有するサンプルの増幅を行った。

２．５．１．３、又は０．６ユニツトの、Ｔａｑポリメラーゼを含有する３個の 追加のサンプルを調製した。次のサイクルを用いて前記の温度サイクル機中で３ ０サイクルの増幅を行った。

１分間にわたり７０°Ｃから９８℃に加熱し；９８°Ｃにて１分間保持し； １分間にわたり９８°Ｃから３５°Ｃ１４５°Ｃ又は５５°Ｃに冷却し：３５° Ｃ１４５℃又は５５°Ｃに１分間保持し；１分間にわたり３５℃、４５℃又は５ ５℃から７０°Ｃに加熱し；そして ７０℃に３０秒間保持する。

３５℃のアニーリング温度において、２．５ユニツト／　１００ｄのＴａｑ酵素 稀釈物が、アガロースゲル電気泳動において、他のすべてのＴａｑポリメラーゼ 濃度に比べて最良のシグナル；ノイズ比を与える。４５℃においては、５ユニツ ト／１００ＩのＴａｑ酵素が、他の濃度に比べて最良のシグナル：ノイズ比を与 える。５５°Ｃにおいては、５ユニツト／　１００ＩｌｌのＴａｑ酵素が、他の 濃度及び４５°Ｃでのアニーリングに比べて最良のシグナル：ノイズ比、及び改 良された収量を与える。Ｔａｑポリメラーゼは５５℃において一層特異性が高く 、そして一層好収量を与える。

別の実験において、Ｍｏ１ｔ　４　ＤＮＡを、ヒユーマン・ゼネティック・ミュ ータント・セル・デポジトリ−（Ｈｕｍａｎ　ＧｅｎｅｔｉｃＭｕｔａｎｔ　Ｃ ｅ１ｌ　Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）　、カムデン、ニューシャーシーから得られる β−又はＴ−グロビン配列を含有するセルラインＧＭ２０６４　ＤＮＡに１０倍 ごとに、細胞当りのコピーの相違を代表する種々の濃度で稀釈し、そしてこれら のサンプルについて、３５°Ｃ及び５５℃のアニーリング温度においてこの例に おいて記載したようにして増幅を行った。３５°Ｃにおいて、アガロースゲル電 気泳動により見ることができる最良のものは５０細胞中１コピーであった。５５ ℃においては、見られる最良のものは１　／　５．０００細胞（低温に比べて１ ００倍の改良）であり、これらの条件下でのＴａｑポリメラーゼの特異性のため には上昇したアニーリング温度が重要であることが示された。

第三の実験において、ニューヨーク、シラクスのＢ、Ｐｏ１ｅｓｚ州立大学から 得られるＨＩＶ−陽性ＤＮＡを含有するセルライン３６８ＨからのＤＮＡを同様 にして、ＳＣＩセルライン（１９８５年３月１９日にＡＴＣＣに寄託されている ；鎌形赤血球対立遺伝子についてホモ接合性でありそしてＨＩＶ配列をすべて欠 いているＥＢＶ−形質転換されたβ−セルライン）からのＤＮＡに、細胞当りの コピーの相違を代表する種々の濃度で稀釈し、そしてＨＩＶ配列の１１５ｂｐ領 域を増幅するプライマー５Ｋ３８及び５Ｋ３９　： ５’　　−ＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣ丁ＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴ−３’ 　　（ＳＫ３８）及び ５’　−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣ−３’　 （ＳＫ３９）を用いて、３５°Ｃ及び５５℃のアニーリング温度において、この 例に記載したようにして増幅を行った。

アガロースゲル電気泳動による結果が示すところによれば、３５°Ｃのアニーリ ング温度においては未稀釈の３６８Ｈサンプルのみが検出されたが、５５℃のア ニーリング温度によれば少なくとも１０−２稀釈を検出することができ、検出に おける１００倍の改良が与えられた。

次のバクテリオファージおよびバクテリアの株は、アメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｗ＋ｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　 Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）米国マリイランド州ロックビレ、パークローンドライブ １２３０１　、に受託された。これらの受託物は、特許び手順およびその下の調 整の目的で微生物の受託の国際的認識のブタベスト条約の規定に基づいてなされ た（ブタベスト条約）。

ｉｕ卜遣主　　　　ＣＭＣＣ阻　畠　ニジｌ−ＣＢ５５　：　Ｔａｑｉｆ４−２ 　　　　　　　　　　３１２５　　　　４０３６６　　　　　５／２９／８７Ｔ ａｑ　　ＤＮＡポリメラーゼ配列 ＧＧω−ＧＣＧτＴＴ（τ蒜ＡＡＧＣＣＣ？？■−■にＧＣＴλＣＣＣＧＧＧＧ ＧＣＧＧＧτＧＧτＧ以ＧＧＧτににＢ０　　　　　　　　　　１０ｏ　　　　 　　　　　　　１２０２００　、　　　　　　　　　　２２０　　　　　　　　 　　２４０２６０　　　　　　・　　　　２Ｂ０　　　　　　　　　　３００Ｆ ＩＧ、ｌ−１ Ｔａｑ　　ＤＮＡポリメラーゼ配列 ７４０　　　　、　　　　　　　１６０　　　　　　　　　　７８０８００　　 　　　　　　　　８２０　　　　　　　　　　　Ｂ４０ＦＩＧ＋−２ Ｔａｑ　　ＤＮＡポリメラーゼ配列 １０４０　　　　　　　　　　　ｌｏｇｏ　　　　　　　　　　　１０８０ｉ２ Ｂ０　　　　　　　　　　１３００　　　　　　　　　　１３２０ＦＩＧ、　ｌ −３ Ｔａｑ　　ＤＮＡポリメラーゼ配列 ＦＩＧ、Ｉ−４ Ｔａｑ　　ＤＮＡポリメラーゼ配列 Ｔａｑ　　ＤＮＡポリメラーゼ配列 ２２４０　　　　　　　　　　２２６０　　　　　　　　　　２２Ｂ０４．５ｋ ｂ□ ＦＩＧ、２ ２、Ｅ３ｋｔ＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　’手続補正書（方式） 平成３年２月１５日 特許庁長官　植　松　　　敏　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１００１２７ ２、　発明の名称 精製された熱安定酵素 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　シタス　コーポレイション ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、補正の対象 明細書、請求の範囲及び図面の翻訳文 ７、補正の内容 明細書、請求の範囲及び図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 明細書、請求の範囲及び図面の 翻訳文　　　　　　　　　　　　　各１通国際調査報告

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．８６〜９５，０００ダルトンの分子量を有しそしてｐＨ８．０においてそれ が有する活性の少なくとも半分をｐＨ６．４において有する、テルムス・アクア チクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）からの、精製された自然の熱安定 ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子。
2. ２．テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）のゲノムか らクローニングされた、上記第１項記載の遺伝子。
3. ３．第１図のＤＮＡ配列またはそのアレル変異型を有する、請求項２に記載の遺 伝子。
4. ４．約８６，０００〜９５，０００ダルトンの分子量を有するポリメラーゼをコ ードする、請求項２に記載の遺伝子。
5. ５．第１図の４〜８３２のアミノ酸残基を有するポリメラーゼをコードする、請 求項４に記載の遺伝子。
6. ６．第１図の８３２のアミノ酸残基を有するポリメラーゼをコードする、請求項 ４に記載の遺伝子。
7. ７．約６０，０００〜６５，０００ダルトンの分子量を有するポリメラーゼをコ ードする、請求項２に記載の遺伝子。
8. ８．第１図の２９０〜８３２のアミノ酸残基を有するポリメラーゼをエンコード する、請求項７に記載の遺伝子。
9. ９．第１図に示す９またはそれ以上のアミノ酸の連続するストレッチに対して少 なくとも５０％の相同性を含有するポリメラーゼである熱安定酵素。
10. １０．前記９またはそれ以上のアミノ酸の連続するストレッチが次の配列： ａ）残基１９０〜２０４、 ｂ）残基２６２〜２７０、 ｃ）残基５６９〜５８７、 ｄ）残基７１８〜７３２、 ｅ）残基７４３〜７５９、および ｆ）残基７７８〜７９０、 から選択される、請求項９に記載の熱安定ポリメラーゼ。
11. １１．上記第１項記載の遺伝子から組み換え的に産生される酵素。
12. １２．ブロッキングされていないアミノ末端を有する、請求項１１に記載の酵素 。
13. １３．上記第４項記載の遺伝子から組み換え的に産生される酵素。
14. １４．上記第７項記載の遺伝子から組み換え的に産生される酵素。
15. １５．１または２以上の非イオン性ポリマーの洗浄剤からなる緩衝液中の、上記 第１１項記載の酵素を含んでなる安定な酵素組成物。
16. １６．熱安定ポリメラーゼを含有する水性混合物を疎水性の相互作用支持体で、 疎水性相互作用を促進する条件下に処理し、そして前記熱安定ポリメラーゼを前 記支持体からの、疎水性相互作用を弱める溶媒で溶離することを含んでなる、熱 安定ポリメラーゼを精製する方法。
17. １７．疎水性クロマトグラフィー支持体がフェニルセファローズ（Ｓｅｐｈａｒ ｏｓｅ）である、請求項１６に記載の方法。
18. １８．前記疎水性相互作用が０．０５ＭＮａＣｌより大きいか、又はそれに等し いイオン強度をもつ緩衝液により提供される、請求項１６に記載の方法。
19. １９．前記疎水性相互作用を促進する条件が、０．２Ｍより大きいか、又はそれ に等しい硫酸アンモニウムを含有する緩衝液を使用して提供される、請求項１８ に記載の方法。
20. ２０．前記溶離溶媒が、０．２Ｍ尿素の勾配を使用する、請求項１６に記載の方 法。
21. ２１．熱安定ポリメラーゼがテルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａ ｔｉｃｕｓ）から分離されるＤＮＡポリメラーゼである、請求項１６に記載の方 法。
22. ２２．前記熱安定ポリメラーゼが組換え酵素である、請求項１６に記載の方法。
23. ２３．水性混合物が細胞溶解物を熱処理することによって、熱安定ポリメラーゼ について前以て濃縮されている、請求項２２に記載の方法。
24. ２４．熱処理を少なくとも４５℃〜約９０℃の範囲の温度において実施する、請 求項２３に記載の方法。
25. ２５．細胞溶解物を少なくとも４５℃〜約９０℃の温度で処理し、そして熱安定 ポリメラーゼの活性を回収することからなる、熱不安定性宿主細胞中で産生され る組み換え熱安定ポリメラーゼを精製する方法。
26. ２６．前記熱安定ポリメラーゼがテルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑ ｕａｔｉｃｕｓ）からのものである、請求項２５に記載の方法。