JPH11335296A - 組換えミコバクテリアのワクチン - Google Patents
組換えミコバクテリアのワクチンInfo
- Publication number
- JPH11335296A JPH11335296A JP11077706A JP7770699A JPH11335296A JP H11335296 A JPH11335296 A JP H11335296A JP 11077706 A JP11077706 A JP 11077706A JP 7770699 A JP7770699 A JP 7770699A JP H11335296 A JPH11335296 A JP H11335296A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- bcg
- mycobacteria
- mycobacterium
- vaccine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 79
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 title claims abstract description 31
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 77
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims abstract description 42
- 241000187480 Mycobacterium smegmatis Species 0.000 claims abstract description 35
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 claims abstract description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 19
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 84
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 abstract description 25
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 abstract description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 9
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 abstract description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 abstract description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 149
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 59
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 18
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 18
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 18
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 16
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 16
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 12
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 12
- 241000894007 species Species 0.000 description 12
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 11
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 10
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 10
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 10
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 9
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 5
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 4
- 101150057950 aph gene Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 101150116440 pyrF gene Proteins 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 4
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 3
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 3
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- DHPRQBPJLMKORJ-XRNKAMNCSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-7-chloro-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O DHPRQBPJLMKORJ-XRNKAMNCSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 2
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 2
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 2
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 206010034038 Parotitis Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 241000242678 Schistosoma Species 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N Thiostrepton B Natural products N1C(=O)C(C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(C(C)CC)NC(C(C2=N3)O)C=CC2=C(C(C)O)C=C3C(=O)OC(C)C(C=2SC=C(N=2)C2N=3)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C(C(C)(O)C(C)O)NC(=O)C(N=4)CSC=4C(=CC)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C21CCC=3C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 2
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 229940053013 bio-mycin Drugs 0.000 description 2
- 108010083912 bleomycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000007787 long-term memory Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000032922 susceptibility to mycobacterium tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229930188070 thiostrepton Natural products 0.000 description 2
- NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N thiostrepton Chemical compound C([C@]12C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C(=O)NC(/C=3SC[C@@H](N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)[C@H]1N=1)[C@@H](C)OC(=O)C3=CC(=C4C=C[C@H]([C@@H](C4=N3)O)N[C@H](C(N[C@@H](C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)=O)[C@@H](C)CC)[C@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)=C\C)[C@@H](C)O)CC=1C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N 0.000 description 2
- 229940063214 thiostrepton Drugs 0.000 description 2
- NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N thiostrepton A Natural products CC[C@H](C)[C@@H]1N[C@@H]2C=Cc3c(cc(nc3[C@H]2O)C(=O)O[C@H](C)[C@@H]4NC(=O)c5csc(n5)[C@@H](NC(=O)[C@H]6CSC(=N6)C(=CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)c7csc(n7)[C@]8(CCC(=N[C@@H]8c9csc4n9)c%10nc(cs%10)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(=O)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC1=O)[C@@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)[C@H](C)O NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AWGBKZRMLNVLAF-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-n,2-dihydroxybenzamide Chemical compound ONC(=O)C1=CC(Br)=CC(Br)=C1O AWGBKZRMLNVLAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 241000203809 Actinomycetales Species 0.000 description 1
- 241000199898 Alaria <Phaeophyceae> Species 0.000 description 1
- 241001156002 Anthonomus pomorum Species 0.000 description 1
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000256844 Apis mellifera Species 0.000 description 1
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061765 Chromosomal mutation Diseases 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- 241001274613 Corvus frugilegus Species 0.000 description 1
- 244000026610 Cynodon dactylon var. affinis Species 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- RPNUMPOLZDHAAY-UHFFFAOYSA-N Diethylenetriamine Chemical compound NCCNCCN RPNUMPOLZDHAAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 1
- 241000064099 Massilioclostridium coli Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000186365 Mycobacterium fortuitum Species 0.000 description 1
- 241000186364 Mycobacterium intracellulare Species 0.000 description 1
- 241000018434 Mycobacterium phage TM4 Species 0.000 description 1
- 241001049988 Mycobacterium tuberculosis H37Ra Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 244000127759 Spondias lutea Species 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000589886 Treponema Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 101150118163 h gene Proteins 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005339 levitation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 101150069102 marB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150023497 mcrA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003936 merozoite Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 1
- 201000004409 schistosomiasis Diseases 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 208000037369 susceptibility to malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/32—Mycobacterium
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 汎用性ある組換えミコバクテリアのワクチン
に関する。 【解決手段】 少なくとも１つの蛋白質抗原をコードす
る外来ＤＮＡを発現する培養しうる組換えミコバクテリ
アを含んでなるワクチン。
に関する。 【解決手段】 少なくとも１つの蛋白質抗原をコードす
る外来ＤＮＡを発現する培養しうる組換えミコバクテリ
アを含んでなるワクチン。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は導入された外来のＤ
ＮＡを発現しうる組換えミコバクテリアのワクチンに関
する。
ＮＡを発現しうる組換えミコバクテリアのワクチンに関
する。
【０００２】
【背景の技術】免疫感作 外来抗原(例えば病原菌又は毒素)に対する免疫は受動ト
ランスフア(ｔｒａｎｓｆｅｒ)又は能動誘導によつて付
与することができる。前者の場合には、外来の蛋白質病
原体に対する抗体を個体に注射し、結果として短期間の
保護が付与される。後者の場合には、病原体の無害な
(無毒の)形態、病原体の一成分、又は毒素の改変形態
(変性毒素)の注射が個体の免疫系を刺激し、長期の保護
を付与する。
ランスフア(ｔｒａｎｓｆｅｒ)又は能動誘導によつて付
与することができる。前者の場合には、外来の蛋白質病
原体に対する抗体を個体に注射し、結果として短期間の
保護が付与される。後者の場合には、病原体の無害な
(無毒の)形態、病原体の一成分、又は毒素の改変形態
(変性毒素)の注射が個体の免疫系を刺激し、長期の保護
を付与する。
【０００３】能動免疫は、個体の免疫系が十分であるな
らば適当な抗原を用いて免疫系を刺激することによつて
誘導することができる。例えばこの方法で病原体の無毒
の又は弱毒化した形態を用いて免疫感作(予防免疫接種)
することにより、直接的な免疫応答並びに免疫学的「記
憶」がもたらされ、斯くして長期の保護も付与される。
一般にワクチンは、病原体の抗原決定基を含み且つ斯く
して免疫応答を引き出す病原体又は感染因子の不活性化
された、非病原性の又は弱体化された形態を含む。同様
に微生物、植物及び動物によつて産生される抗原物質で
ある毒素は変性毒素に転化することができる。即ちそれ
らはその毒性を破壊するがその抗原性を保持するように
改変することができ、結果として抗毒素抗体の産生を刺
激し、能動免疫を作り出す。そのような変性毒素は毒素
に対するワクチンとして使用することができる。
らば適当な抗原を用いて免疫系を刺激することによつて
誘導することができる。例えばこの方法で病原体の無毒
の又は弱毒化した形態を用いて免疫感作(予防免疫接種)
することにより、直接的な免疫応答並びに免疫学的「記
憶」がもたらされ、斯くして長期の保護も付与される。
一般にワクチンは、病原体の抗原決定基を含み且つ斯く
して免疫応答を引き出す病原体又は感染因子の不活性化
された、非病原性の又は弱体化された形態を含む。同様
に微生物、植物及び動物によつて産生される抗原物質で
ある毒素は変性毒素に転化することができる。即ちそれ
らはその毒性を破壊するがその抗原性を保持するように
改変することができ、結果として抗毒素抗体の産生を刺
激し、能動免疫を作り出す。そのような変性毒素は毒素
に対するワクチンとして使用することができる。
【０００４】感染性病原体の変形された形態の投与によ
る免疫応答の刺激を含む場合及び変性毒素の投与を含む
場合の双方において、現存する方法は一般に効果的であ
るが、ワクチンによる副作用及び死の起こることが知ら
れている。
る免疫応答の刺激を含む場合及び変性毒素の投与を含む
場合の双方において、現存する方法は一般に効果的であ
るが、ワクチンによる副作用及び死の起こることが知ら
れている。
【０００５】今や病原体の抗原決定基のより良い知識と
遺伝子工学／組換えＤＮＡ技術の適用によつて、より安
全なワクチンが開発されつつある。例えば免疫応答を引
き出すことが知られている蛋白質抗原の一成分(例えば
抗原決定基)であるポリペプチドを(例えば問題のポリペ
プチドをコードするＤＮＡの化学合成又は発現により)
作ることが可能である。ポリペプチドの宿主への投与に
続いて、宿主は抗原決定基に免疫応答する。そのような
ポリペプチドの使用は生の又は弱体化したワクチンの使
用に付随する感染の危険が伴なわない。
遺伝子工学／組換えＤＮＡ技術の適用によつて、より安
全なワクチンが開発されつつある。例えば免疫応答を引
き出すことが知られている蛋白質抗原の一成分(例えば
抗原決定基)であるポリペプチドを(例えば問題のポリペ
プチドをコードするＤＮＡの化学合成又は発現により)
作ることが可能である。ポリペプチドの宿主への投与に
続いて、宿主は抗原決定基に免疫応答する。そのような
ポリペプチドの使用は生の又は弱体化したワクチンの使
用に付随する感染の危険が伴なわない。
【０００６】免疫感作(ワクチンの投与)は通常の及び広
く行なわれている方法であり、用いるワクチンはウイル
ス種の死んだ微生物、弱体化した種の生きた微生物、及
び微生物、菌、植物、原生動物或いは後生動物の誘導体
又は産生物の調製物を含めて、本質的に「活性な免疫学
的予防に対して意図されたいずれかの調製物」であつて
よい。ステツドマンの図解医学辞典(Ｓｔｅｄｍａｎ'ｓ
Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔ
ｉｏｎａｒｙ)(第２４版)、ウイリアムズ・アンド・ウ
イルキンス(Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，
Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ)、１５２６頁(１９８２)。多くの
場合、ワクチンは効果的な保護を誘導するために１個よ
りも多く投与しなければならない。例えば公知の抗毒素
ワクチンは多数回の投薬量で与えなければならない。
く行なわれている方法であり、用いるワクチンはウイル
ス種の死んだ微生物、弱体化した種の生きた微生物、及
び微生物、菌、植物、原生動物或いは後生動物の誘導体
又は産生物の調製物を含めて、本質的に「活性な免疫学
的予防に対して意図されたいずれかの調製物」であつて
よい。ステツドマンの図解医学辞典(Ｓｔｅｄｍａｎ'ｓ
Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔ
ｉｏｎａｒｙ)(第２４版)、ウイリアムズ・アンド・ウ
イルキンス(Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，
Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ)、１５２６頁(１９８２)。多くの
場合、ワクチンは効果的な保護を誘導するために１個よ
りも多く投与しなければならない。例えば公知の抗毒素
ワクチンは多数回の投薬量で与えなければならない。
【０００７】子供の時代の予防接種は普通のことであ
り、一般に健康のサービスが容易に受けられる且つ多数
回の予防接種(例えば多数の病原体に対する免疫感作及
び単一の病原菌に対する連続的な又は多数の免疫感作)
が可能である発達した国々において成功している。発展
途上の世界では、予防接種はかなり一般的なものでな
く、またかなり問題を含んでいる。例えば発展途上の世
界で毎年生れる１００万人の子供の約２０％だけがジフ
テリヤ、百日咳、破傷風、風疹、小児マヒ、及び結核に
対して予防接種されているにすぎない。毎年発展途上国
では５百万人の子供が死に且つ他の５百万人の子供は適
当な免疫感作が可能であるならば防げたこれらの病気に
よつて肉体的に又は精神的にかたわになつている。１回
の投与で長期間の免疫を付与することのできる効果的な
ワクチンが存在すれば、勿論発達した及び発展途上の双
方の国々において有用であろう。
り、一般に健康のサービスが容易に受けられる且つ多数
回の予防接種(例えば多数の病原体に対する免疫感作及
び単一の病原菌に対する連続的な又は多数の免疫感作)
が可能である発達した国々において成功している。発展
途上の世界では、予防接種はかなり一般的なものでな
く、またかなり問題を含んでいる。例えば発展途上の世
界で毎年生れる１００万人の子供の約２０％だけがジフ
テリヤ、百日咳、破傷風、風疹、小児マヒ、及び結核に
対して予防接種されているにすぎない。毎年発展途上国
では５百万人の子供が死に且つ他の５百万人の子供は適
当な免疫感作が可能であるならば防げたこれらの病気に
よつて肉体的に又は精神的にかたわになつている。１回
の投与で長期間の免疫を付与することのできる効果的な
ワクチンが存在すれば、勿論発達した及び発展途上の双
方の国々において有用であろう。
【０００８】成人の予防接種も成人の多くの病気を防ぐ
ために役立つが、子供の場合と同様に、発展途上国では
特に多数回の免疫感作が必要であるが、それを行なうの
が困難である。中でもハンセン病、マラリヤ、結核、及
び小児マヒのような病気は、アフリカ、アジア、及びラ
テンアメリカにおいて成人の間で高い発病率を示し、年
々数千の死者を出している。
ために役立つが、子供の場合と同様に、発展途上国では
特に多数回の免疫感作が必要であるが、それを行なうの
が困難である。中でもハンセン病、マラリヤ、結核、及
び小児マヒのような病気は、アフリカ、アジア、及びラ
テンアメリカにおいて成人の間で高い発病率を示し、年
々数千の死者を出している。
【０００９】主な病気に対するワクチンを開発するのに
多くの努力が費やされ、最近外来の遺伝子を発現する組
換えワクチン・ビヒクル(ｖｅｈｉｃｌｅｓ)(例えば遺
伝子工学で処理されたウイルス)が考慮されている。例
えばウイルス抗原がワクシニア・ウイルス中に挿入され
た組換えワクシニア・ウイルスが開発された。例えばＢ
型肝炎遺伝子、インフルエンザ・ウイルス遺伝子又は狂
犬病ウイルス抗原をコードするＤＮＡはワクチンを製造
するための努力においてワクシニア・ウイルスＤＮＡに
スプライシング(ｓｐｌｉｃｅ)された。パニカリ(Ｐａ
ｎｉｃａｌｉ)、Ｄ．ら、国立科学アカデミー紀要(Ｐｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ)、ＵＳＡ、
８０、５３６４〜５３６８(１９８３)；オーア(Ｏｒ
ｒ)、Ｔ．、遺伝子工学ニユース(Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ)、１７頁(１９８５年３
月)；パオレツチ(Ｐａｏｌｅｔｔｉ)、Ｅ．及びＤ．パ
ニカリ、米国特許第４,６０３,１１２号。
多くの努力が費やされ、最近外来の遺伝子を発現する組
換えワクチン・ビヒクル(ｖｅｈｉｃｌｅｓ)(例えば遺
伝子工学で処理されたウイルス)が考慮されている。例
えばウイルス抗原がワクシニア・ウイルス中に挿入され
た組換えワクシニア・ウイルスが開発された。例えばＢ
型肝炎遺伝子、インフルエンザ・ウイルス遺伝子又は狂
犬病ウイルス抗原をコードするＤＮＡはワクチンを製造
するための努力においてワクシニア・ウイルスＤＮＡに
スプライシング(ｓｐｌｉｃｅ)された。パニカリ(Ｐａ
ｎｉｃａｌｉ)、Ｄ．ら、国立科学アカデミー紀要(Ｐｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ)、ＵＳＡ、
８０、５３６４〜５３６８(１９８３)；オーア(Ｏｒ
ｒ)、Ｔ．、遺伝子工学ニユース(Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ)、１７頁(１９８５年３
月)；パオレツチ(Ｐａｏｌｅｔｔｉ)、Ｅ．及びＤ．パ
ニカリ、米国特許第４,６０３,１１２号。
【００１０】しかしながら、そのような組換えワクシニ
ア・ウイルスがワクチンとして少くとも２つの重要な欠
点をもつているということは広く同意されている。第１
に、処置できないワクシニア・ウイルスと関連した重大
な死亡及び死亡率(１：１００,０００)が見られる。第
２に、ワクシニア・ウイルスに予じめ露呈された個体の
組換えワクシニアの予防接種は満足しうる免疫感作値を
与えるのにしばしば失敗した。フエンナー(Ｆｅｎｎｅ
ｒ)、Ｆ．、ワクチン開発への新手法(ＮｅｗＡｐｐｒｏ
ａｃｈｅｓ ｔｏ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ)、Ｒ．ベル(Ｂｅｌｌ)及びＧ．トリギアニ(Ｔｏ
ｒｒｉｇｉａｎｉ)編、シユワベ社(Ｓｃｈｗａｂｅ ＆
Ｃｏ．)、１８７頁(１９８４)。
ア・ウイルスがワクチンとして少くとも２つの重要な欠
点をもつているということは広く同意されている。第１
に、処置できないワクシニア・ウイルスと関連した重大
な死亡及び死亡率(１：１００,０００)が見られる。第
２に、ワクシニア・ウイルスに予じめ露呈された個体の
組換えワクシニアの予防接種は満足しうる免疫感作値を
与えるのにしばしば失敗した。フエンナー(Ｆｅｎｎｅ
ｒ)、Ｆ．、ワクチン開発への新手法(ＮｅｗＡｐｐｒｏ
ａｃｈｅｓ ｔｏ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ)、Ｒ．ベル(Ｂｅｌｌ)及びＧ．トリギアニ(Ｔｏ
ｒｒｉｇｉａｎｉ)編、シユワベ社(Ｓｃｈｗａｂｅ ＆
Ｃｏ．)、１８７頁(１９８４)。
【００１１】今日まで、与えられた病原体に対する免疫
を誘導する多くの場合に有効であるけれども、１回以上
投与しなければならない、また長期間の基準において病
原体から保護することができないワクチンが開発されて
きた。更に多くの場合(例えばハンセン病、マラリヤな
ど)、効果的なワクチンが依然として開発されなければ
ならない。
を誘導する多くの場合に有効であるけれども、１回以上
投与しなければならない、また長期間の基準において病
原体から保護することができないワクチンが開発されて
きた。更に多くの場合(例えばハンセン病、マラリヤな
ど)、効果的なワクチンが依然として開発されなければ
ならない。
【００１２】ミコバクテリア ミコバクテリア(Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ)は人間及び
動物の主たる病原体である。例えば結核は一般に人間の
場合にミコバクテリウム・ツバーキユロシス(Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ(Ｍ.)ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ)に
より、また家畜の場合に(これは人間及び他の動物に伝
染しえて、その結核を誘発する)ミコバクテリウム・ボ
ビス(ｂｏｖｉｓ)により引き起こされる。結核は広く存
在しており、特に発展途上国の場合重要な公衆の健康問
題である。世界では約千万の結核例があり、年々３百万
人が死亡する。結核に対する国際連合及び世界健康機構
の合同研究グループ、ツバークル(Ｔｕｂｅｒｃｌｅ)、
６３、１５７〜１６９(１９８２)。
動物の主たる病原体である。例えば結核は一般に人間の
場合にミコバクテリウム・ツバーキユロシス(Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ(Ｍ.)ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ)に
より、また家畜の場合に(これは人間及び他の動物に伝
染しえて、その結核を誘発する)ミコバクテリウム・ボ
ビス(ｂｏｖｉｓ)により引き起こされる。結核は広く存
在しており、特に発展途上国の場合重要な公衆の健康問
題である。世界では約千万の結核例があり、年々３百万
人が死亡する。結核に対する国際連合及び世界健康機構
の合同研究グループ、ツバークル(Ｔｕｂｅｒｃｌｅ)、
６３、１５７〜１６９(１９８２)。
【００１３】Ｍ．レプラエ(ｌｅｐｒａｅ)により引き起
こされるハンセン病は主に発展途上国において千万人の
人間を苦しませている。ブルーム(Ｂｌｏｏｍ)、Ｂ.
Ｐ．及びＴ．ゴーダル(Ｇｏｄａｌ)、感染病総覧(Ｒｅ
ｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｄｉｓｅａｓ
ｅｓ)、５、６５７〜６７９(１９８４)。アビウム(ａｖ
ｉｕｍ)-インターセルラレ(ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａ
ｒｅ)-スクロフラセウム(ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ)
(ＭＡＩＳ)群の結核及びミコバクテリアは免疫不全症
(エイズ)をもつ患者の主にかかりやすい病原体である。
病気駆除センター(Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅ
ａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ)、死亡率及び死亡週報(Ｍｏｒ
ｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋ
ｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ)、３４、７７４(１９８６)。Ｍ．
プシユードツバーキユロシス(ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓ)は家畜の主な病原体である。
こされるハンセン病は主に発展途上国において千万人の
人間を苦しませている。ブルーム(Ｂｌｏｏｍ)、Ｂ.
Ｐ．及びＴ．ゴーダル(Ｇｏｄａｌ)、感染病総覧(Ｒｅ
ｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｄｉｓｅａｓ
ｅｓ)、５、６５７〜６７９(１９８４)。アビウム(ａｖ
ｉｕｍ)-インターセルラレ(ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａ
ｒｅ)-スクロフラセウム(ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ)
(ＭＡＩＳ)群の結核及びミコバクテリアは免疫不全症
(エイズ)をもつ患者の主にかかりやすい病原体である。
病気駆除センター(Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅ
ａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ)、死亡率及び死亡週報(Ｍｏｒ
ｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋ
ｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ)、３４、７７４(１９８６)。Ｍ．
プシユードツバーキユロシス(ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓ)は家畜の主な病原体である。
【００１４】一方Ｍ．ボビスの無毒性種であるバシル・
カルメツト-グエリン(Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔ
ｅ-Ｇｕｅｒｉｎ、ＢＣＧ)は世界中で最も広く使用され
ている人間のワクチンであり、５０年以上にわたつて生
ワクチンとして使用されてきた。過去３５年において、
それは５億人以上の人間に投与されたが、副作用は稀で
あつた(例えば推定死亡６０人／億人)。ＢＣＧは多くの
研究において結核に対して保護効果を有することが発見
されている。しかしながら最近、それが南インドにおい
て結核を防止するのに有効でないことが発見された。結
核防止の試み、マドラス、インデイアン・ジヤーナル・
オブ・メデイカル・リサーチ(Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ)、
７２、１〜７４(１９８０)。
カルメツト-グエリン(Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔ
ｅ-Ｇｕｅｒｉｎ、ＢＣＧ)は世界中で最も広く使用され
ている人間のワクチンであり、５０年以上にわたつて生
ワクチンとして使用されてきた。過去３５年において、
それは５億人以上の人間に投与されたが、副作用は稀で
あつた(例えば推定死亡６０人／億人)。ＢＣＧは多くの
研究において結核に対して保護効果を有することが発見
されている。しかしながら最近、それが南インドにおい
て結核を防止するのに有効でないことが発見された。結
核防止の試み、マドラス、インデイアン・ジヤーナル・
オブ・メデイカル・リサーチ(Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ)、
７２、１〜７４(１９８０)。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】即ちＢＣＧを含めて多
くのワクチンは存在するけれど、それらは限られた免疫
応答を誘導し、多数回投薬しなければならず、及び／又
は副作用があるから価値が限定される。他の事例(例え
ばハンセン病、マラリア)において、ワクチンは単純に
は入手することができない。関連する病原体に対するワ
クチン、即ち副作用なしに病原体から保護するのに十分
な免疫を長期間刺激するワクチンが入手できるならば、
それは非常に有用である。
くのワクチンは存在するけれど、それらは限られた免疫
応答を誘導し、多数回投薬しなければならず、及び／又
は副作用があるから価値が限定される。他の事例(例え
ばハンセン病、マラリア)において、ワクチンは単純に
は入手することができない。関連する病原体に対するワ
クチン、即ち副作用なしに病原体から保護するのに十分
な免疫を長期間刺激するワクチンが入手できるならば、
それは非常に有用である。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明は遺伝子工学の技
術を用いて導入された興味あるＤＮＡを発現する遺伝子
組換えの(遺伝子工学的に処理した)培養しうるミコバク
テリアに関し、そしてＤＮＡをミコバクテリアに導入し
て遺伝子組換えミコバクテリアを生産する方法に関す
る。得られる遺伝子組換えミコバクテリアは、問題のＤ
ＮＡを発現しうるビヒクルとして、例えば保護抗原(即
ち宿主の免疫応答を引き出しうる抗原)を発現するワク
チン・ビヒクル、例えば問題の病原体の１種又はそれ以
上に対するもの或いは抗繁殖性ワクチン・ビヒクルを生
産するのに有用なものとして特に有用である。興味ある
病原体はウイルス、微生物、或いは病気を引き起こす他
の有機体又は物質(例えば毒素又は変性毒素)を含む。
術を用いて導入された興味あるＤＮＡを発現する遺伝子
組換えの(遺伝子工学的に処理した)培養しうるミコバク
テリアに関し、そしてＤＮＡをミコバクテリアに導入し
て遺伝子組換えミコバクテリアを生産する方法に関す
る。得られる遺伝子組換えミコバクテリアは、問題のＤ
ＮＡを発現しうるビヒクルとして、例えば保護抗原(即
ち宿主の免疫応答を引き出しうる抗原)を発現するワク
チン・ビヒクル、例えば問題の病原体の１種又はそれ以
上に対するもの或いは抗繁殖性ワクチン・ビヒクルを生
産するのに有用なものとして特に有用である。興味ある
病原体はウイルス、微生物、或いは病気を引き起こす他
の有機体又は物質(例えば毒素又は変性毒素)を含む。
【００１７】更に本発明は、宿主の保護免疫を引き出す
ために宿主に組換えミコバクテリウムを予防接種する方
法に関する。更に本発明は異なる微生物属間で遺伝物質
を伝達する方法に関し、そして異なる微生物属間での遺
伝物質の伝達に有用なシヤトル・ファスミド（ｐｈａｓ
ｍｉｄ）として言及される遺伝子工学によるベクターに
関する。シヤトル・ファスミドはバクテリア(例えば大
腸菌)においてプラスミドとして、またミコバクテリア
においてフアージとして複製する。これはミコバクテリ
ア例えばミコバクテリウム・スメグマチス(Ｍ．ｓｍｅ
ｇｍａｔｉｓ)、及びミコバクテリウム・ボビス-ＢＣＧ
(ＢＣＧ)中に、他の起源(例えばＭ．スメグマチス又は
ＢＣＧ以外の起源)からのＤＮＡを導入することを可能
にした。更に、本発明は組換えの培養しうるミコバクテ
リウムによつて発現される抗原の、ワクチンとしての或
いは診断試剤に対する使用法に関する。
ために宿主に組換えミコバクテリウムを予防接種する方
法に関する。更に本発明は異なる微生物属間で遺伝物質
を伝達する方法に関し、そして異なる微生物属間での遺
伝物質の伝達に有用なシヤトル・ファスミド（ｐｈａｓ
ｍｉｄ）として言及される遺伝子工学によるベクターに
関する。シヤトル・ファスミドはバクテリア(例えば大
腸菌)においてプラスミドとして、またミコバクテリア
においてフアージとして複製する。これはミコバクテリ
ア例えばミコバクテリウム・スメグマチス(Ｍ．ｓｍｅ
ｇｍａｔｉｓ)、及びミコバクテリウム・ボビス-ＢＣＧ
(ＢＣＧ)中に、他の起源(例えばＭ．スメグマチス又は
ＢＣＧ以外の起源)からのＤＮＡを導入することを可能
にした。更に、本発明は組換えの培養しうるミコバクテ
リウムによつて発現される抗原の、ワクチンとしての或
いは診断試剤に対する使用法に関する。
【００１８】特に本発明は、問題の病原体(ウイルス、
微生物或いは病気を誘導する他の有機体又は物質のいず
れか)１種又はそれ以上をコードしたワクチン・ビヒク
ル以外の起源からのＤＮＡ(外来ＤＮＡと言及)を発現す
る遺伝子組換えＢＣＧ又は遺伝子組換えＭ．スメグマチ
スであるワクチン・ビヒクルに関する。本発明のワクチ
ン・ビヒクルは受精を妨害する(例えば受胎調節剤とし
て有用なワクチン)のに有用な抗原をコードするＤＮＡ
も発現する。
微生物或いは病気を誘導する他の有機体又は物質のいず
れか)１種又はそれ以上をコードしたワクチン・ビヒク
ル以外の起源からのＤＮＡ(外来ＤＮＡと言及)を発現す
る遺伝子組換えＢＣＧ又は遺伝子組換えＭ．スメグマチ
スであるワクチン・ビヒクルに関する。本発明のワクチ
ン・ビヒクルは受精を妨害する(例えば受胎調節剤とし
て有用なワクチン)のに有用な抗原をコードするＤＮＡ
も発現する。
【００１９】保護抗原が組換えワクチンによつて発現し
うる病原体は、ミコバクテリウム・レプラエ(Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ)、ミコバクテリウ
ム・ツバーキユロシス(Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ)、ミコバクテリウム・イン
トラセルラレ(Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒ
ａｃｅｌｌｕｌａｒｅ)、ミコバクテリウム・アフリカ
ナム(Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕ
ｍ)、ミコバクテリウム・アビウム(Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ)、マラリア・スポロゾイテス(ｍ
ａｌａｒｉａ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ)及びメロゾイ
テス(ｍｅｒｏｚｏｉｔｅｓ)、ジフテリア変性毒素、破
傷風変性毒素、リーシユマニア(Ｌｅｉｓｈｍａｎｉ
ａ)、サルモネラ、いくつかのトレポネマ(Ｔｒｅｐｏｎ
ｅｍａ)属、百日咳変性毒素及び他の抗原決定基、ウイ
ルス［風疹、耳下腺炎、インフルエンザ、住血吸虫性皮
膚炎(Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ)、赤痢、ナイセリア(Ｎ
ｅｉｓｓｅｒｉａ)、ボレリア(Ｂｏｒｒｅｌｉａ)、狂
犬病、小児マヒウイルス、人間の免疫不全ウイルス(Ｈ
ＩＶ)、ＨＩＬＶ−Ｉ、ＨＩＬＶ−ＩＩ、並びに蛇及び
昆虫の毒液を含むが、これに限定されるものでない。
うる病原体は、ミコバクテリウム・レプラエ(Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ)、ミコバクテリウ
ム・ツバーキユロシス(Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ)、ミコバクテリウム・イン
トラセルラレ(Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒ
ａｃｅｌｌｕｌａｒｅ)、ミコバクテリウム・アフリカ
ナム(Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕ
ｍ)、ミコバクテリウム・アビウム(Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ)、マラリア・スポロゾイテス(ｍ
ａｌａｒｉａ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ)及びメロゾイ
テス(ｍｅｒｏｚｏｉｔｅｓ)、ジフテリア変性毒素、破
傷風変性毒素、リーシユマニア(Ｌｅｉｓｈｍａｎｉ
ａ)、サルモネラ、いくつかのトレポネマ(Ｔｒｅｐｏｎ
ｅｍａ)属、百日咳変性毒素及び他の抗原決定基、ウイ
ルス［風疹、耳下腺炎、インフルエンザ、住血吸虫性皮
膚炎(Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ)、赤痢、ナイセリア(Ｎ
ｅｉｓｓｅｒｉａ)、ボレリア(Ｂｏｒｒｅｌｉａ)、狂
犬病、小児マヒウイルス、人間の免疫不全ウイルス(Ｈ
ＩＶ)、ＨＩＬＶ−Ｉ、ＨＩＬＶ−ＩＩ、並びに蛇及び
昆虫の毒液を含むが、これに限定されるものでない。
【００２０】本発明の１つの具体例において、そのよう
な保護抗原をコードする外来のＤＮＡを発現しうる組換
えミコバクテリアは、問題の保護抗原をコードする遺伝
子(単数又は複数)をミコバクテリアのゲノム中に組込む
ことによつて生産される。単一の抗原をコードする遺伝
子或いはそれぞれ抗原をコードする２つ又はそれ以上の
遺伝子を、ミコバクテリウムの複製に必須でないミコバ
クテリアのゲノム領域に挿入する。それぞれ問題の抗原
をコードする１つ又はそれ以上の遺伝子を、ミコバクテ
リアへの導入後にミコバクテリアの染色体中に組込み、
続いて染色体ＤＮＡで発現することのできる溶原性のバ
クテリオフアージ中に挿入することも可能である。他に
問題の抗原をコードする遺伝子を、遺伝子の発現が染色
体外的に(例えばエピソーム的に)起こるようにミコバク
テリア中に挿入することができる。例えば問題の遺伝子
をミコバクテリアのプラスミド中へクローン化し、そし
て培養しうるミコバクテリア中に導入する。この結果そ
れはエピソーム的複写(染色体外的複写)を受ける。
な保護抗原をコードする外来のＤＮＡを発現しうる組換
えミコバクテリアは、問題の保護抗原をコードする遺伝
子(単数又は複数)をミコバクテリアのゲノム中に組込む
ことによつて生産される。単一の抗原をコードする遺伝
子或いはそれぞれ抗原をコードする２つ又はそれ以上の
遺伝子を、ミコバクテリウムの複製に必須でないミコバ
クテリアのゲノム領域に挿入する。それぞれ問題の抗原
をコードする１つ又はそれ以上の遺伝子を、ミコバクテ
リアへの導入後にミコバクテリアの染色体中に組込み、
続いて染色体ＤＮＡで発現することのできる溶原性のバ
クテリオフアージ中に挿入することも可能である。他に
問題の抗原をコードする遺伝子を、遺伝子の発現が染色
体外的に(例えばエピソーム的に)起こるようにミコバク
テリア中に挿入することができる。例えば問題の遺伝子
をミコバクテリアのプラスミド中へクローン化し、そし
て培養しうるミコバクテリア中に導入する。この結果そ
れはエピソーム的複写(染色体外的複写)を受ける。
【００２１】本発明のワクチンは現存するワクチンより
も重要な利点を有する。第一にミコバクテリアは最も良
く知られたものの中でアジユバント(ａｄｊｕｖａｎｔ)
性を有し、従つて受体免疫系を、大きな効果でもつて他
の抗原に応答すべく刺激する。これは、それが細胞介在
の免疫性を誘導し且つ斯くして細胞介在免疫性が耐性に
対して決定的であるように見える場合に病原体に対する
免疫性を提供するのに特に有用であるであろうから、ワ
クチンの特に有用な観点である。第二に、ミコバクテリ
アは長期間の記憶又は免疫を刺激する。結果として、蛋
白質抗原に対して長期間の敏感性を作り出すために、単
一(一回)の接種で済ますことができる。即ち単一の接種
は感性が５〜５０年間持続しうる。本発明のワクチン・
ビヒクルを用いることにより、長期に持続するＴ細胞の
記憶の発火点とすることができ、これが感染性因子又は
毒素を中和する２次的な抗体応答を刺激する。これは例
えば破傷風及びジフテリヤの毒素、百日咳、マラリア、
インフルエンザ、疱疹ウイルス及び蛇の毒液に対して有
用である。
も重要な利点を有する。第一にミコバクテリアは最も良
く知られたものの中でアジユバント(ａｄｊｕｖａｎｔ)
性を有し、従つて受体免疫系を、大きな効果でもつて他
の抗原に応答すべく刺激する。これは、それが細胞介在
の免疫性を誘導し且つ斯くして細胞介在免疫性が耐性に
対して決定的であるように見える場合に病原体に対する
免疫性を提供するのに特に有用であるであろうから、ワ
クチンの特に有用な観点である。第二に、ミコバクテリ
アは長期間の記憶又は免疫を刺激する。結果として、蛋
白質抗原に対して長期間の敏感性を作り出すために、単
一(一回)の接種で済ますことができる。即ち単一の接種
は感性が５〜５０年間持続しうる。本発明のワクチン・
ビヒクルを用いることにより、長期に持続するＴ細胞の
記憶の発火点とすることができ、これが感染性因子又は
毒素を中和する２次的な抗体応答を刺激する。これは例
えば破傷風及びジフテリヤの毒素、百日咳、マラリア、
インフルエンザ、疱疹ウイルス及び蛇の毒液に対して有
用である。
【００２２】ＢＣＧは特に、１）それが誕生時に現在投
与されている小児時代だけのワクチンである；２）過去
４０年において、それは結核に対するワクチンとして投
与した時副作用の例が非常に低かつた；及び３）それが
個体に繰返し(例えば多数回の形態で)使用できる、とい
う点でワクチン・ビヒクルとして重要な利点を有する。
与されている小児時代だけのワクチンである；２）過去
４０年において、それは結核に対するワクチンとして投
与した時副作用の例が非常に低かつた；及び３）それが
個体に繰返し(例えば多数回の形態で)使用できる、とい
う点でワクチン・ビヒクルとして重要な利点を有する。
【００２３】特にＢＣＧ並びに一般にミコバクテリアの
更なる利点は、ゲノムの大きさが大きいことである(長
さが約４×１０6ｈｐ)。ゲノムが大きいから、それは新
しい(即ち外来の)ＤＮＡを多量に保有することができ、
斯くしてマルチ-ワクチン・ビヒクル(即ち１つよりも多
い病原体に対する保護抗原をコードする外来のＤＮＡを
保持するもの)を作るために使用できる。
更なる利点は、ゲノムの大きさが大きいことである(長
さが約４×１０6ｈｐ)。ゲノムが大きいから、それは新
しい(即ち外来の)ＤＮＡを多量に保有することができ、
斯くしてマルチ-ワクチン・ビヒクル(即ち１つよりも多
い病原体に対する保護抗原をコードする外来のＤＮＡを
保持するもの)を作るために使用できる。
【００２４】本発明の遺伝子工学によるベクターは、異
なる微生物属間で遺伝物質を伝達することに用いる点で
独特である。特にベクターは遺伝子的にミコバクテリオ
フアージに継ぎ込まれたバクテリア・プラスミドからの
ＤＮＡを含んでなる。得られる組換えシヤトル・ベクタ
ーは、大腸菌のコスミド［ラムダ付着末端部位(ＣＯＳ)
を含む大腸菌プラスミド］がクローン化された頭部を切
つたミコバクテリオフアージＤＮＡ分子を含む。これは
その大腸菌におけるプラスミド(この場合それは薬剤例
えばアンピシリン耐性を発現する)としての及びミコバ
クテリアにおけるフアージとしての複製能力が故にファ
スミドとして称される。例えば大腸菌からのプラスミド
のＤＮＡは遺伝的にミコバクテリオフアージＴＭ４に継
ぎ込まれ、その結果シヤトル・ファスミドｐｈＡＥ１を
産生する。シヤトル・ファスミドの使用は大腸菌におい
て遺伝物質を取り扱うことを可能にし、次いでこれを効
果的に培養しうるミコバクテリア(例えばＢＣＧ、Ｍ．
スメグマチス)中に伝達することを可能にする。斯くし
て第一に外来ＤＮＡを感染によつてミコバクテリアに導
入することができる。
なる微生物属間で遺伝物質を伝達することに用いる点で
独特である。特にベクターは遺伝子的にミコバクテリオ
フアージに継ぎ込まれたバクテリア・プラスミドからの
ＤＮＡを含んでなる。得られる組換えシヤトル・ベクタ
ーは、大腸菌のコスミド［ラムダ付着末端部位(ＣＯＳ)
を含む大腸菌プラスミド］がクローン化された頭部を切
つたミコバクテリオフアージＤＮＡ分子を含む。これは
その大腸菌におけるプラスミド(この場合それは薬剤例
えばアンピシリン耐性を発現する)としての及びミコバ
クテリアにおけるフアージとしての複製能力が故にファ
スミドとして称される。例えば大腸菌からのプラスミド
のＤＮＡは遺伝的にミコバクテリオフアージＴＭ４に継
ぎ込まれ、その結果シヤトル・ファスミドｐｈＡＥ１を
産生する。シヤトル・ファスミドの使用は大腸菌におい
て遺伝物質を取り扱うことを可能にし、次いでこれを効
果的に培養しうるミコバクテリア(例えばＢＣＧ、Ｍ．
スメグマチス)中に伝達することを可能にする。斯くし
て第一に外来ＤＮＡを感染によつてミコバクテリアに導
入することができる。
【００２５】問題の病原体をコードする遺伝子或いは１
つより多い問題の病原体をコードする１つより多い遺伝
子を、それらが発現されるミコバクテリア例えばＢＣＧ
及びＭ．スメグマチス中に導入することにより、現存す
るワクチンと異なつて１つ又はそれ以上の病原体に対し
て長期間の免疫を提供することの出来るワクチンを製造
することが可能である。この長期間の免疫は１回の予防
接種で及び接種したものに副作用が非常に起こりにくい
状態で付与することができる。
つより多い問題の病原体をコードする１つより多い遺伝
子を、それらが発現されるミコバクテリア例えばＢＣＧ
及びＭ．スメグマチス中に導入することにより、現存す
るワクチンと異なつて１つ又はそれ以上の病原体に対し
て長期間の免疫を提供することの出来るワクチンを製造
することが可能である。この長期間の免疫は１回の予防
接種で及び接種したものに副作用が非常に起こりにくい
状態で付与することができる。
【００２６】以下、図面を参照しながら、本発明をさら
に具体的に説明する。
に具体的に説明する。
【００２７】図１はミコバクテリウム・スメグマチスの
スフエロプラストの、ミコバクテリオフアージＤ２９Ｄ
ＮＡでのトランスフエクシヨンの結果を示す。
スフエロプラストの、ミコバクテリオフアージＤ２９Ｄ
ＮＡでのトランスフエクシヨンの結果を示す。
【００２８】図２は、シヤトル・ファスミドphＡＥ１の
製造の概略図である。
製造の概略図である。
【００２９】図３はミコバクテリオフアージＴＭ４ＤＮ
Ａ及びＫpnIで消化されたシヤトル・ファスミドphＡＥ
１ＤＮＡの、エチジウム・ブロマイドで染色した０.７
％アガロースゲル（パネルＡ）及びpＨＣ７９をプロー
ブとして用いることによるファスミドphＡＥ１のサザー
ン・ブロット（Ｓouthern blot）分析（パネルＢ）を
示す。
Ａ及びＫpnIで消化されたシヤトル・ファスミドphＡＥ
１ＤＮＡの、エチジウム・ブロマイドで染色した０.７
％アガロースゲル（パネルＡ）及びpＨＣ７９をプロー
ブとして用いることによるファスミドphＡＥ１のサザー
ン・ブロット（Ｓouthern blot）分析（パネルＢ）を
示す。
【００３０】パネルＡにおいて、レーン１はＨindＩＩ
Ｉで消化したラムダＤＮＡを含み；レーン２及び３はＫ
pnＩで消化切断する前に連結してない（レーン２）又は
連結した（レーン３）ＴＭ４ＤＮＡを含み；レーン４及
び５はＭ.スメグマチス上で増殖されたフアージ粒子か
ら単離されたphＡＥ１ＤＮＡ（レーン４）及びプラスミ
ドとしての大腸菌細胞から単離されたphＡＥ１（レーン
４）を含む。ここに矢印は付着端（cohesive end）で
連結した時に３.９Ｋbフラグメントを形成する２.１Ｋb
及び１.８Ｋbフラグメントを指していることを特記す
る。
Ｉで消化したラムダＤＮＡを含み；レーン２及び３はＫ
pnＩで消化切断する前に連結してない（レーン２）又は
連結した（レーン３）ＴＭ４ＤＮＡを含み；レーン４及
び５はＭ.スメグマチス上で増殖されたフアージ粒子か
ら単離されたphＡＥ１ＤＮＡ（レーン４）及びプラスミ
ドとしての大腸菌細胞から単離されたphＡＥ１（レーン
４）を含む。ここに矢印は付着端（cohesive end）で
連結した時に３.９Ｋbフラグメントを形成する２.１Ｋb
及び１.８Ｋbフラグメントを指していることを特記す
る。
【００３１】パネルＢにおいて、バイオトランス（Ｂio
trans）ナイロン膜（ＩＣＮ）上に浸みこませ且つ32Ｐ
−dＣＴＰでニック・トランスレーシヨン（nick trans
lation）したpＨＣ７９ＤＮＡで検出した後のパネルＡ
のオートラジオグラフを示す。
trans）ナイロン膜（ＩＣＮ）上に浸みこませ且つ32Ｐ
−dＣＴＰでニック・トランスレーシヨン（nick trans
lation）したpＨＣ７９ＤＮＡで検出した後のパネルＡ
のオートラジオグラフを示す。
【００３２】図４はphＡＥ１のＢＣＧ上での複製を示
す。これは、他のミコバクテリア上でなくて結核菌及び
ＢＣＧ上でのプラーク（plaque）に対して公知のミコバ
クテリオフアージであるＤＳ６Ａ；Ｍ.スメグマチスで
あってＢＣＧでないプラークに対して公知のフアージ３
３Ｄ；及び両種のプラークに対して公知のフアージＴＭ
４によるＢＣＧのグラクソ（Ｇlaxo）ワクチン種の溶解
を比較する。
す。これは、他のミコバクテリア上でなくて結核菌及び
ＢＣＧ上でのプラーク（plaque）に対して公知のミコバ
クテリオフアージであるＤＳ６Ａ；Ｍ.スメグマチスで
あってＢＣＧでないプラークに対して公知のフアージ３
３Ｄ；及び両種のプラークに対して公知のフアージＴＭ
４によるＢＣＧのグラクソ（Ｇlaxo）ワクチン種の溶解
を比較する。
【００３３】パネルＡは各フアージによるＢＣＧの溶解
を示す。１０-1希釈で用いたフアージの力価（pfu／m
l）は、結核菌Ｈ３７Ｒa上でＤＳ６a、２×１０6；Ｍ.
スメグマチスmc2６上で３３Ｄ、２×１０6；及びmc2６
上でＴＭ４、３×１０8；及びmc 2６上でphＡＥ１、３×
１０8であった。フアージの希釈物（５ul）を、１０8個
のＢＣＧ細胞を含む軟い寒天の上層上にスポットした。
３７℃で１０日間の培養後の得られた溶解を写真にし
た。
を示す。１０-1希釈で用いたフアージの力価（pfu／m
l）は、結核菌Ｈ３７Ｒa上でＤＳ６a、２×１０6；Ｍ.
スメグマチスmc2６上で３３Ｄ、２×１０6；及びmc2６
上でＴＭ４、３×１０8；及びmc 2６上でphＡＥ１、３×
１０8であった。フアージの希釈物（５ul）を、１０8個
のＢＣＧ細胞を含む軟い寒天の上層上にスポットした。
３７℃で１０日間の培養後の得られた溶解を写真にし
た。
【００３４】パネルＢはphＡＥ１におけるコスミドＤＮ
Ａの存在物を示す。これらのプレート上プラーク・リフ
ト（lift）は下記の如く行ない、そして32Ｐで標識した
pＨＣ７９ＤＮＡとハイブリダイズし、次いでオートラ
ジオグラフイーにかけた。
Ａの存在物を示す。これらのプレート上プラーク・リフ
ト（lift）は下記の如く行ない、そして32Ｐで標識した
pＨＣ７９ＤＮＡとハイブリダイズし、次いでオートラ
ジオグラフイーにかけた。
【００３５】パネルＣはシヤトル・ファスミドのphＡＥ
１フアージ粒子の電子顕微鏡図である。ＣsＣlグラジエ
ントにより精製したフアージ粒子を、カーボンを被覆し
且つパーロイドン（Ｐarloidon）を被覆したグリッド上
に置き、１％ホスホタングステン酸１滴を落し、洗浄し
た。電子顕微鏡写真はＪＥＯＬ １２００ＥＸ電子顕微
鏡を８０kV、３００００Ｘで用いて撮った。
１フアージ粒子の電子顕微鏡図である。ＣsＣlグラジエ
ントにより精製したフアージ粒子を、カーボンを被覆し
且つパーロイドン（Ｐarloidon）を被覆したグリッド上
に置き、１％ホスホタングステン酸１滴を落し、洗浄し
た。電子顕微鏡写真はＪＥＯＬ １２００ＥＸ電子顕微
鏡を８０kV、３００００Ｘで用いて撮った。
【００３６】ミコバクテリウム・ボビス‐ＢＣＧ（ＢＣ
Ｇ）は世界中で広く使用されている無毒のＭ.ボビス誘
導体であり、そしてその効果が最近問題になってきたけ
れども、結核からの保護のために通常使用されている。
ミコバクテリウム・スメグマチスは、ＢＣＧと抗原性及
びアジユバンド性を共有する非病原体杆菌である。両方
とも培養で容易に生長せしめうる。
Ｇ）は世界中で広く使用されている無毒のＭ.ボビス誘
導体であり、そしてその効果が最近問題になってきたけ
れども、結核からの保護のために通常使用されている。
ミコバクテリウム・スメグマチスは、ＢＣＧと抗原性及
びアジユバンド性を共有する非病原体杆菌である。両方
とも培養で容易に生長せしめうる。
【００３７】両ミコバクテリアは細胞媒介性の免疫の誘
導に対して優秀なアジユバンド活性を有し、長期の記憶
（免疫）を刺激し、そしてその使用と関連した死亡の低
さが故に、組換えワクチンとして優秀な候補者である。
即ちそれらは問題の遺伝物質（免疫応答が求められてい
る１つ又はそれ以上の抗原体をコードするＤＮＡ）が挿
入でき且つ続いて発現できるビヒクル（ワクチン・ビヒ
クル）として用いるのに優秀な候補者である。遺伝子の
すべて又は一部であってよい且つミコバクテリアに導入
されるそのようなＤＮＡは本明細書において外来のＤＮ
Ａとして言及される。そのようなビヒクルは、抗原が外
来ＤＮＡでコードされている病原体に対して免疫を与え
るワクチンとして使用することができる。またそれらは
抗受精「ワクチン」ビヒクルとしても使用しうる。例え
ば人間の生殖腺刺激ホルモン（ＨＧＨ）フラグメントの
ような抗原をコードしているＤＮＡを含むミコバクテリ
アは抗受精ワクチンとして使用でき、また受胎調節剤と
して投与することができる。外来ＤＮＡは、このＤＮＡ
を導入するミコバクテリア以外の起源からのＤＮＡ（例
えばＢＣＧの場合、ＢＣＧ以外のＤＮＡ）である。病原
体はウイルス、微生物、或いは病気を引き起こす他の微
生物又は物質である。ミコバクテリアは、大きいゲノム
（例えばＢＣＧのゲノムは長さが約４×１０6bpであ
る）を有するから、多量の新しい（外来の）ＤＮＡを保
持することができ、従ってマルチ‐ワクチン・ビヒクル
として役立つ。
導に対して優秀なアジユバンド活性を有し、長期の記憶
（免疫）を刺激し、そしてその使用と関連した死亡の低
さが故に、組換えワクチンとして優秀な候補者である。
即ちそれらは問題の遺伝物質（免疫応答が求められてい
る１つ又はそれ以上の抗原体をコードするＤＮＡ）が挿
入でき且つ続いて発現できるビヒクル（ワクチン・ビヒ
クル）として用いるのに優秀な候補者である。遺伝子の
すべて又は一部であってよい且つミコバクテリアに導入
されるそのようなＤＮＡは本明細書において外来のＤＮ
Ａとして言及される。そのようなビヒクルは、抗原が外
来ＤＮＡでコードされている病原体に対して免疫を与え
るワクチンとして使用することができる。またそれらは
抗受精「ワクチン」ビヒクルとしても使用しうる。例え
ば人間の生殖腺刺激ホルモン（ＨＧＨ）フラグメントの
ような抗原をコードしているＤＮＡを含むミコバクテリ
アは抗受精ワクチンとして使用でき、また受胎調節剤と
して投与することができる。外来ＤＮＡは、このＤＮＡ
を導入するミコバクテリア以外の起源からのＤＮＡ（例
えばＢＣＧの場合、ＢＣＧ以外のＤＮＡ）である。病原
体はウイルス、微生物、或いは病気を引き起こす他の微
生物又は物質である。ミコバクテリアは、大きいゲノム
（例えばＢＣＧのゲノムは長さが約４×１０6bpであ
る）を有するから、多量の新しい（外来の）ＤＮＡを保
持することができ、従ってマルチ‐ワクチン・ビヒクル
として役立つ。
【００３８】しかしながら今日まで、プラスミドＤＮＡ
を用いてミコバクテリアを形質転換することは可能でな
かった。これは、溶原性（即ちミコバリテリア自体の溶
解なしに、他の種の一般的な溶解を培養中に誘導するこ
と）及びトランスフエクシヨンがいくつかの種について
記述されており且つ多種類のミコバクリオフアージが存
在するにもかかわらず、分子生物学の知識及びミコバク
リアの遺伝学が多くの微生物類のそれよりも多分に進歩
していなかったということに一部原因しよう。
を用いてミコバクテリアを形質転換することは可能でな
かった。これは、溶原性（即ちミコバリテリア自体の溶
解なしに、他の種の一般的な溶解を培養中に誘導するこ
と）及びトランスフエクシヨンがいくつかの種について
記述されており且つ多種類のミコバクリオフアージが存
在するにもかかわらず、分子生物学の知識及びミコバク
リアの遺伝学が多くの微生物類のそれよりも多分に進歩
していなかったということに一部原因しよう。
【００３９】ワクチン・ビヒクルとして使用すべき組換
えミコバクテリウムの開発研究の主な目的は、産生物が
１つ又はそれ以上の病原体に対する保護にとって重要で
ある遺伝子の発現を指示するＤＮＡベクターをミコバク
リアに導入することである。今や本発明の方法及びシヤ
トル・ベクターを用いることにより、外来のＤＮＡを培
養しうるミコバクテリアに導入することが可能である。
ここに外来のＤＮＡは問題の抗原１つ又はそれ以上をコ
ードするＤＮＡを含んでなる。本発明のシヤトル・ベク
ターは、それがバクテリアにおけるプラスミドとして及
びミコバクテリアにおけるフアージとして複製すること
に独自性がある。特別な具体例において、シヤトル・フ
ァスミドとして言及されるシヤトル・ベクターは特異的
な付着端（又はＣos部位）の２つの種を含む：１つは大
腸菌において機能するラムダフアージ及び１つはミクロ
バクテリア（例えばミコバクテリアにおいて機能するミ
コバクテリオフアージＴＭ）に対するもの。即ちそれは
２組の付着端を含む。それはラムダに対して１組及びミ
コバクテリアに対して１組を含むから、両方に導入する
ことができる。ラムダＣＯＳシーケンス存在は、大きい
ＤＮＡ分子を大腸菌へ効果的にクローン化するためにラ
ムダ試験管内パッケージ（packaging）系を利用するコ
スミド・クローン化の効果的な技術を用いることも可能
にする。更にシヤトル・ベクターは、抗原をコードする
ＤＮＡを挿入することができる独特なＥcoＲI部位を有
する。斯くしてベクターは組換えＤＮＡ分子のミコバク
テリアへの導入を許容するトランスフエクシヨン系を開
発することを可能にした。
えミコバクテリウムの開発研究の主な目的は、産生物が
１つ又はそれ以上の病原体に対する保護にとって重要で
ある遺伝子の発現を指示するＤＮＡベクターをミコバク
リアに導入することである。今や本発明の方法及びシヤ
トル・ベクターを用いることにより、外来のＤＮＡを培
養しうるミコバクテリアに導入することが可能である。
ここに外来のＤＮＡは問題の抗原１つ又はそれ以上をコ
ードするＤＮＡを含んでなる。本発明のシヤトル・ベク
ターは、それがバクテリアにおけるプラスミドとして及
びミコバクテリアにおけるフアージとして複製すること
に独自性がある。特別な具体例において、シヤトル・フ
ァスミドとして言及されるシヤトル・ベクターは特異的
な付着端（又はＣos部位）の２つの種を含む：１つは大
腸菌において機能するラムダフアージ及び１つはミクロ
バクテリア（例えばミコバクテリアにおいて機能するミ
コバクテリオフアージＴＭ）に対するもの。即ちそれは
２組の付着端を含む。それはラムダに対して１組及びミ
コバクテリアに対して１組を含むから、両方に導入する
ことができる。ラムダＣＯＳシーケンス存在は、大きい
ＤＮＡ分子を大腸菌へ効果的にクローン化するためにラ
ムダ試験管内パッケージ（packaging）系を利用するコ
スミド・クローン化の効果的な技術を用いることも可能
にする。更にシヤトル・ベクターは、抗原をコードする
ＤＮＡを挿入することができる独特なＥcoＲI部位を有
する。斯くしてベクターは組換えＤＮＡ分子のミコバク
テリアへの導入を許容するトランスフエクシヨン系を開
発することを可能にした。
【００４０】問題の遺伝子物質をミコバクテリア中に導
入して本発明の組換えミコバクテリアを生産するにはい
くつかの手段がある。例えば問題のＤＮＡは、シヤトル
・ファスミド、特に溶原性のシヤトル・ファスミド（例
えば細胞を溶原化しうるフアージ）中にクローン化する
ことによってミコバクテリア細胞中に安定に導入するこ
とができる。この方法による問題のＤＮＡ（外来ＤＮ
Ａ）の導入は、そのＤＮＡの、ミコバクテリアの染色体
中への組込みをもたらす。他にプラスミド・ベクターを
用いて、外来ＤＮＡを、そのＤＮＡが染色体外的に発現
されるミコバクテリア中に導入することができる。
入して本発明の組換えミコバクテリアを生産するにはい
くつかの手段がある。例えば問題のＤＮＡは、シヤトル
・ファスミド、特に溶原性のシヤトル・ファスミド（例
えば細胞を溶原化しうるフアージ）中にクローン化する
ことによってミコバクテリア細胞中に安定に導入するこ
とができる。この方法による問題のＤＮＡ（外来ＤＮ
Ａ）の導入は、そのＤＮＡの、ミコバクテリアの染色体
中への組込みをもたらす。他にプラスミド・ベクターを
用いて、外来ＤＮＡを、そのＤＮＡが染色体外的に発現
されるミコバクテリア中に導入することができる。
【００４１】外来ＤＮＡを導入し且つこれをフアージな
しに宿主染色体中に組み込むことも可能である。例えば
これは相同組換え、部位特異的組換え、又は非相同組換
えにより（例えば宿主の染色体物質中へのランダムな挿
入をもたらすトランスポソンを用いることにより）達成
することができる。
しに宿主染色体中に組み込むことも可能である。例えば
これは相同組換え、部位特異的組換え、又は非相同組換
えにより（例えば宿主の染色体物質中へのランダムな挿
入をもたらすトランスポソンを用いることにより）達成
することができる。
【００４２】本発明のシヤトル・ベクターを用いること
によって外来のＤＮＡ（即ち問題の病原体１つ又はそれ
以上に対する抗原１つ又はそれ以上をコードするＤＮ
Ａ）をミコバクテリア例えばＢＣＧ中に成功裏に導入す
るために、次の一般的な手法に従う。以下はＭ.スメグ
マチス及びＢＣＧに関して記述されるけれども、それは
異質のＤＮＡを他のミコバクテリア中に導入するために
も使用することができ且つ外来ＤＮＡを含有するこれら
の他のミコバクテリアはワクチン・ビヒクルとしても使
用しうることが理解される。ワクチン・ビヒクルとして
使用すべきミコバクテリア（例えばＢＣＧ及び結核菌）
がゆっくり生長する場合、Ｍ.スメグマチスを介し（即
ちこれに問題の抗原をコードするＤＮＡを導入し）、続
いてＢＣＧに導入することが特に有用である。
によって外来のＤＮＡ（即ち問題の病原体１つ又はそれ
以上に対する抗原１つ又はそれ以上をコードするＤＮ
Ａ）をミコバクテリア例えばＢＣＧ中に成功裏に導入す
るために、次の一般的な手法に従う。以下はＭ.スメグ
マチス及びＢＣＧに関して記述されるけれども、それは
異質のＤＮＡを他のミコバクテリア中に導入するために
も使用することができ且つ外来ＤＮＡを含有するこれら
の他のミコバクテリアはワクチン・ビヒクルとしても使
用しうることが理解される。ワクチン・ビヒクルとして
使用すべきミコバクテリア（例えばＢＣＧ及び結核菌）
がゆっくり生長する場合、Ｍ.スメグマチスを介し（即
ちこれに問題の抗原をコードするＤＮＡを導入し）、続
いてＢＣＧに導入することが特に有用である。
【００４３】ＤＮＡをミコバクテリアに伝達するための
シヤトル・ベクターの開発ミコバクテリオフアージＤＮ
Ａの、Ｍ.スメグマチスへのトランスフエクシヨン ミコバクテリア中でのＤＮＡの取扱いを可能にする系を
開発するためには、最初にＤＮＡを杆菌に伝達する効果
的な手段を開発することが必要であった。用いた技術
は、ストレプトマイシス（Ｓtreptomyces）に対するス
フエロプラスト（Ｓpheroplast）の製造に関してオカニ
シ及びホプウツド（Ｈopwood）に記述されているものの
改変法であった。ストレプトマイシスはミコバクテリア
のようにアクチノマイセタレス（Ａctinomycetales）で
ある。オカニシ、Ｍ.ら、マイクロバイオロジー（Ｍicr
obiology）、８０、３８９〜４００（１９７４）；ホプ
ウツド、Ｄ.Ａ.及びＨ.Ｍ.ライト（Ｗright）、モレキ
ユラー・ジエネテイクス（Ｍolecular Ｇentics）、１
６２、３０７〜３１７（１９７８）。Ｍ.スメグマチス
に関して用いるためのこの技術の改変は、ＤＮＡ分子
の、バクテリア・スフエロプラスト中への組込みを容易
にするためにポリエチレングリコールの添加と組合せる
ことであった。
シヤトル・ベクターの開発ミコバクテリオフアージＤＮ
Ａの、Ｍ.スメグマチスへのトランスフエクシヨン ミコバクテリア中でのＤＮＡの取扱いを可能にする系を
開発するためには、最初にＤＮＡを杆菌に伝達する効果
的な手段を開発することが必要であった。用いた技術
は、ストレプトマイシス（Ｓtreptomyces）に対するス
フエロプラスト（Ｓpheroplast）の製造に関してオカニ
シ及びホプウツド（Ｈopwood）に記述されているものの
改変法であった。ストレプトマイシスはミコバクテリア
のようにアクチノマイセタレス（Ａctinomycetales）で
ある。オカニシ、Ｍ.ら、マイクロバイオロジー（Ｍicr
obiology）、８０、３８９〜４００（１９７４）；ホプ
ウツド、Ｄ.Ａ.及びＨ.Ｍ.ライト（Ｗright）、モレキ
ユラー・ジエネテイクス（Ｍolecular Ｇentics）、１
６２、３０７〜３１７（１９７８）。Ｍ.スメグマチス
に関して用いるためのこの技術の改変は、ＤＮＡ分子
の、バクテリア・スフエロプラスト中への組込みを容易
にするためにポリエチレングリコールの添加と組合せる
ことであった。
【００４４】ミコバクテリアを変性するためのプラスミ
ドにおいて有用な選択しうる抗生物質耐性マーカーが存
在しないから、ＤＮＡのミコバクテリアへの伝達に対し
て最適な条件を評価するために選択した系は溶菌性のミ
コバクテリアフアージからのＤＮＡのトランスフエクシ
ヨンであった。そのような系の２つの利点は、得られる
結果が定量的であり且つ２４時間以内にプラークとして
容易に可視化しうることである。
ドにおいて有用な選択しうる抗生物質耐性マーカーが存
在しないから、ＤＮＡのミコバクテリアへの伝達に対し
て最適な条件を評価するために選択した系は溶菌性のミ
コバクテリアフアージからのＤＮＡのトランスフエクシ
ヨンであった。そのような系の２つの利点は、得られる
結果が定量的であり且つ２４時間以内にプラークとして
容易に可視化しうることである。
【００４５】ミクロバクテリオフアージＤＮＡの、Ｍ.
スメグマチスへのトランスフエクシヨンは実施例１に詳
細に記述される。概述すると、最初にポリエチレングリ
コールを用いることにより細胞壁のすべて又は一部が除
去されたミクロバクテリア（即ち原形質体又はスフエロ
プラスト）中にＤＮＡを導入した。トランスフエクシヨ
ンの実験をミコバクテリオフアージＤ２９からのＤＮＡ
を用いて開始した。これは多種のミコバクテリア上で増
殖して、Ｍ.スメグマチス上に大きい透明なプラークを
生成した。Ｍ.スメグマチス上で調製されたＤ２９フア
ージのプレート溶解物は一貫して溶解物１ml当り１０11
pfu（プラーク生成単位）以上を生成した。収穫したフ
アージをＣsＣl平衡グラジエント上で２回精製した。そ
れは平衡浮揚密度１.５１にバンドを形成した。フアー
ジＤＮＡをプロテイナーゼＫでの処理及びフエノール‐
クロロホルムでの抽出により抽出した。連結した及び連
結してないＤ２９ＤＮＡの制限（restriction）分析
は、フアージのゲノムＤＮＡが二重ら線であり、寸法が
５０kbであり、そして付着端を有することを示した。
スメグマチスへのトランスフエクシヨンは実施例１に詳
細に記述される。概述すると、最初にポリエチレングリ
コールを用いることにより細胞壁のすべて又は一部が除
去されたミクロバクテリア（即ち原形質体又はスフエロ
プラスト）中にＤＮＡを導入した。トランスフエクシヨ
ンの実験をミコバクテリオフアージＤ２９からのＤＮＡ
を用いて開始した。これは多種のミコバクテリア上で増
殖して、Ｍ.スメグマチス上に大きい透明なプラークを
生成した。Ｍ.スメグマチス上で調製されたＤ２９フア
ージのプレート溶解物は一貫して溶解物１ml当り１０11
pfu（プラーク生成単位）以上を生成した。収穫したフ
アージをＣsＣl平衡グラジエント上で２回精製した。そ
れは平衡浮揚密度１.５１にバンドを形成した。フアー
ジＤＮＡをプロテイナーゼＫでの処理及びフエノール‐
クロロホルムでの抽出により抽出した。連結した及び連
結してないＤ２９ＤＮＡの制限（restriction）分析
は、フアージのゲノムＤＮＡが二重ら線であり、寸法が
５０kbであり、そして付着端を有することを示した。
【００４６】Ｍ.スメグマチスのスフエロプラストの、
ミコバクテリオフアージＤ２９ＤＮＡによるトランスフ
エクシヨンの結果を図１に示す。１０3〜１０4pfu／Ｄ
２９ＤＮＡugの効率が得られた。即ちこれはミコバクテ
リアに対する最初の有効なトランスフエクシヨン系を示
す。これらのプラークがＭ.スメグマチスのトランスフ
エクシヨンの結果であるということは、次のことによっ
て示された：(ｉ)トランスフエクシヨンがＤＮアーゼに
より壊滅された；(ｉｉ)処理した細胞の滲透圧シヨツク
が産生的トランスフエクシヨンを妨害した；そして(ｉ
ｉｉ)Ｍ.スメグマチスのＤ２９フアージ耐性変異体に由
来するスフエロプラストが親種に匹敵する頻度でトラン
スフエクシヨンした。これらの技術の更なる向上は、１
０5pfu／Ｄ２９ＤＮＡug以上の頻度を得ることを可能に
した。
ミコバクテリオフアージＤ２９ＤＮＡによるトランスフ
エクシヨンの結果を図１に示す。１０3〜１０4pfu／Ｄ
２９ＤＮＡugの効率が得られた。即ちこれはミコバクテ
リアに対する最初の有効なトランスフエクシヨン系を示
す。これらのプラークがＭ.スメグマチスのトランスフ
エクシヨンの結果であるということは、次のことによっ
て示された：(ｉ)トランスフエクシヨンがＤＮアーゼに
より壊滅された；(ｉｉ)処理した細胞の滲透圧シヨツク
が産生的トランスフエクシヨンを妨害した；そして(ｉ
ｉｉ)Ｍ.スメグマチスのＤ２９フアージ耐性変異体に由
来するスフエロプラストが親種に匹敵する頻度でトラン
スフエクシヨンした。これらの技術の更なる向上は、１
０5pfu／Ｄ２９ＤＮＡug以上の頻度を得ることを可能に
した。
【００４７】外来ＤＮＡのミコバクテリア中への導入 重要な工程は、大腸菌におけるミコバクテリアのＤＮＡ
構築物（constructs）の取扱い及び増殖並びに続くミコ
バクテリア中への転写及びそこでの複写の双方を可能に
するベクターの開発であった。特に外来のＤＮＡを、迅
速に生長する非病原性ミコバクテリア（例えばＭ.スメ
グマチス）、並びにゆっくり生長するミコバクテリア
（例えばＢＣＧ及び結核菌）中に導入する可能性をもつ
ことは非常に望しい。プラスミドはＭＡＩＳ複合体中の
いくつかのミコバクテリア種中に及びＭ.フオルツイタ
ム（fortuitum）中に見出されているけれど、Ｍ.スメグ
マチス、ＢＣＧ、又は結核菌内で複製するものは未だに
記述されていない。１つの例外はあるが、これらのプラ
スミドはいずれもが選別しうるマーカーを有さない。ク
ロウフオード（Ｃrawford），Ｊ.Ｔ.及びＪ.Ｈ.ベイツ
（Ｂates）、インフエクシヨンズ・アンド・イミユニテ
イー（Ｉnfections and Ｉmmunity）２４，９７９〜９
８１（１９７９）；ミズグチ，Ｙ.ら、ジヤーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Ｊournal of Ｂacteriolog
y），１４６，６５６〜６５９（１９８１）；マイスナ
ー（Ｍeissner），Ｐ.Ｓ.及びＪ.Ｏ.フアルキンハム
（Ｆalkinham），ジヤーナル・オブ・バクテリオロジ
ー，１５７，６６９〜６７２（１９８４）。これに対
し、Ｍ.スメグマチス、ＢＣＧ、及び結核菌中で複製す
る種々のフアージが単離物の型別のために記述され且つ
使用されてきた。
構築物（constructs）の取扱い及び増殖並びに続くミコ
バクテリア中への転写及びそこでの複写の双方を可能に
するベクターの開発であった。特に外来のＤＮＡを、迅
速に生長する非病原性ミコバクテリア（例えばＭ.スメ
グマチス）、並びにゆっくり生長するミコバクテリア
（例えばＢＣＧ及び結核菌）中に導入する可能性をもつ
ことは非常に望しい。プラスミドはＭＡＩＳ複合体中の
いくつかのミコバクテリア種中に及びＭ.フオルツイタ
ム（fortuitum）中に見出されているけれど、Ｍ.スメグ
マチス、ＢＣＧ、又は結核菌内で複製するものは未だに
記述されていない。１つの例外はあるが、これらのプラ
スミドはいずれもが選別しうるマーカーを有さない。ク
ロウフオード（Ｃrawford），Ｊ.Ｔ.及びＪ.Ｈ.ベイツ
（Ｂates）、インフエクシヨンズ・アンド・イミユニテ
イー（Ｉnfections and Ｉmmunity）２４，９７９〜９
８１（１９７９）；ミズグチ，Ｙ.ら、ジヤーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Ｊournal of Ｂacteriolog
y），１４６，６５６〜６５９（１９８１）；マイスナ
ー（Ｍeissner），Ｐ.Ｓ.及びＪ.Ｏ.フアルキンハム
（Ｆalkinham），ジヤーナル・オブ・バクテリオロジ
ー，１５７，６６９〜６７２（１９８４）。これに対
し、Ｍ.スメグマチス、ＢＣＧ、及び結核菌中で複製す
る種々のフアージが単離物の型別のために記述され且つ
使用されてきた。
【００４８】用いた方策は、大腸菌中でプラスミドとし
て及びミコバクテリア中でフアージとして複製するベク
ターを構築することであった。このシヤトル・ファスミ
ドの開発を達成する１つの方法は、ミコバクテリアＤＮ
Ａが大腸菌中で良好に発現されないから、大腸菌宿主を
溶解しないであろう機能的ミコバクテリオフアージのゲ
ノムをプラスミド・ベクター中にクローン化することが
可能である筈であるという考えに基づいた。斯くしてそ
れは両種の有機体中で複製しうるであろう。Ｍ.スメグ
マチスのトランスフエクシヨンはミコバクテリオフアー
ジ粒子を生成するであろうから、外来ＤＮＡの、ゆつく
り生長するミコバクテリア（例えばＢＣＧ）中への導入
はフアージの感染により達成できた。ストレプトマイシ
スに対する２機能性ベクターは、スアレズ（Ｓuarez）
によって記述されている。スアレズ、Ｊ．Ｅ．及びＫ．
Ｆ．チヤター（Ｃhater）、ネーチヤー（Ｎature），２
８６，５２７〜５２９（１９８０）。大腸菌において二
重の性質をもつラムダーＣｏ１Ｅ１ベクターはブレンナ
ー（Ｂrenner）及び共同研究者によってプラスミドとし
て言及された。ブレンナー，Ｓ．ら、ジエン（Ｇen
e），１７，２７〜４４（１９８２）。
て及びミコバクテリア中でフアージとして複製するベク
ターを構築することであった。このシヤトル・ファスミ
ドの開発を達成する１つの方法は、ミコバクテリアＤＮ
Ａが大腸菌中で良好に発現されないから、大腸菌宿主を
溶解しないであろう機能的ミコバクテリオフアージのゲ
ノムをプラスミド・ベクター中にクローン化することが
可能である筈であるという考えに基づいた。斯くしてそ
れは両種の有機体中で複製しうるであろう。Ｍ.スメグ
マチスのトランスフエクシヨンはミコバクテリオフアー
ジ粒子を生成するであろうから、外来ＤＮＡの、ゆつく
り生長するミコバクテリア（例えばＢＣＧ）中への導入
はフアージの感染により達成できた。ストレプトマイシ
スに対する２機能性ベクターは、スアレズ（Ｓuarez）
によって記述されている。スアレズ、Ｊ．Ｅ．及びＫ．
Ｆ．チヤター（Ｃhater）、ネーチヤー（Ｎature），２
８６，５２７〜５２９（１９８０）。大腸菌において二
重の性質をもつラムダーＣｏ１Ｅ１ベクターはブレンナ
ー（Ｂrenner）及び共同研究者によってプラスミドとし
て言及された。ブレンナー，Ｓ．ら、ジエン（Ｇen
e），１７，２７〜４４（１９８２）。
【００４９】この目的のために、ミコバクテリオフアー
ジＴＭ４を用いた。ＴＭ４はＭ．アビウムから単離され
る溶原性フアージであると報告されている。チンメ（Ｔ
imme），Ｔ．Ｌ．及びＰ．Ｊ．ブレンナン（Ｂrenna
n），ジヤーナル・オブ・ジエネラル・マイクロバイオ
ロジー（Ｊournal of Ｇeneral Ｍicrobiology），１３
０，２０５９〜２０６６（１９８４）。それはＭ．スメ
グマチスを溶解するフアージであると特徴づけられた。
それはＭ．スメグマチス、ＢＣＧ、及び結核菌中で複製
することが示され、そして溶原性であると報告された。
このフアージも５０ｋｂの二重ら線のＤＮＡゲノムを有
し、そして付着端をもつ。しかしながら、同様の特性を
もつ他のミコバクテリオフアージを用いることも可能で
ある。ＴＭ４で使用されるものとして記述される次の方
法はベクターを構築するに際してそのような他のミコバ
クテリオフアージで使用することも可能である。
ジＴＭ４を用いた。ＴＭ４はＭ．アビウムから単離され
る溶原性フアージであると報告されている。チンメ（Ｔ
imme），Ｔ．Ｌ．及びＰ．Ｊ．ブレンナン（Ｂrenna
n），ジヤーナル・オブ・ジエネラル・マイクロバイオ
ロジー（Ｊournal of Ｇeneral Ｍicrobiology），１３
０，２０５９〜２０６６（１９８４）。それはＭ．スメ
グマチスを溶解するフアージであると特徴づけられた。
それはＭ．スメグマチス、ＢＣＧ、及び結核菌中で複製
することが示され、そして溶原性であると報告された。
このフアージも５０ｋｂの二重ら線のＤＮＡゲノムを有
し、そして付着端をもつ。しかしながら、同様の特性を
もつ他のミコバクテリオフアージを用いることも可能で
ある。ＴＭ４で使用されるものとして記述される次の方
法はベクターを構築するに際してそのような他のミコバ
クテリオフアージで使用することも可能である。
【００５０】大腸菌中でプラスミドとして及びミコバク
テリア中でフアージとして複製するベクターを生じさせ
るために大腸菌のプラスミド・レプリコンをフアージＴ
Ｍ４に導入すべく用いた方策を図２に系統的に示す。Ｄ
２９フアージに対して記述したように、プレート原料溶
解物及びＴＭ４フアージのゲノムＤＮＡを準備する（実
施例１参照）。ＴＭ４・ＤＮＡを高濃度で連結して長い
コンカテマーを生成させ、その付着端をアニーリングし
た。連続したＤＮＡをＳａｕ３Ａで部分的に消化した。
テリア中でフアージとして複製するベクターを生じさせ
るために大腸菌のプラスミド・レプリコンをフアージＴ
Ｍ４に導入すべく用いた方策を図２に系統的に示す。Ｄ
２９フアージに対して記述したように、プレート原料溶
解物及びＴＭ４フアージのゲノムＤＮＡを準備する（実
施例１参照）。ＴＭ４・ＤＮＡを高濃度で連結して長い
コンカテマーを生成させ、その付着端をアニーリングし
た。連続したＤＮＡをＳａｕ３Ａで部分的に消化した。
【００５１】Ｓａｕ３ＡはＴＭ４ゲノムを頻度よく（例
えば平均３００ｂｐごとに１回）、寸法３０〜５０ｋｂ
のフラグメントに切断する。これは、長さが完全なＴＭ
４ゲノム又は小さな欠落をもつＴＭ４ゲノムのそれであ
ったＤＮＡフラグメントの組を生じ、ゲノム内のＳａｕ
３Ａ部位のいずれかにおいて開裂せしめる。これらのＤ
ＮＡフラグメントを、ＢamＨＩで開裂された６.５ｋｂ
コスミドｐＨＣ７９に連結させた。ホーン（Ｈohn），
Ｂ．及びＪ．コリンズ（Ｃollins），ジエン，９，２９
１〜２９８（１９８０）。適当な寸法の組換え分子を選
別するために、連結混合物を試験管内でバクテリオフア
ージのラムダ頭部にパツケージした。これはラムダｃｏ
ｓ部位を含み且つ寸法が３８〜５３ｋｂであるＤＮＡフ
ラグメントを選別した。得られるフアージ粒子を大腸菌
に形質導入し、そしてｐＨＣ７９：ＴＭ４ＤＮＡ分子を
含むコロニーをアンピシリンを含有する媒体上で選別し
た。プラスミドの共有結合的に閉じた環状ＤＮＡを４
０，０００の貯留したアンピシリン耐性（ampr）コロニ
ーから単離した。バーンボイム（Ｂirnboim），Ｈ．及
びドリー（Ｄoly），ジヤーナル・オブ・ヌクレイツク
・アシツド・リサーチ（Ｊournal of Ｎucleic Ａcid
Ｒesearch），７，１５１３〜１５２５（１９７９）。
えば平均３００ｂｐごとに１回）、寸法３０〜５０ｋｂ
のフラグメントに切断する。これは、長さが完全なＴＭ
４ゲノム又は小さな欠落をもつＴＭ４ゲノムのそれであ
ったＤＮＡフラグメントの組を生じ、ゲノム内のＳａｕ
３Ａ部位のいずれかにおいて開裂せしめる。これらのＤ
ＮＡフラグメントを、ＢamＨＩで開裂された６.５ｋｂ
コスミドｐＨＣ７９に連結させた。ホーン（Ｈohn），
Ｂ．及びＪ．コリンズ（Ｃollins），ジエン，９，２９
１〜２９８（１９８０）。適当な寸法の組換え分子を選
別するために、連結混合物を試験管内でバクテリオフア
ージのラムダ頭部にパツケージした。これはラムダｃｏ
ｓ部位を含み且つ寸法が３８〜５３ｋｂであるＤＮＡフ
ラグメントを選別した。得られるフアージ粒子を大腸菌
に形質導入し、そしてｐＨＣ７９：ＴＭ４ＤＮＡ分子を
含むコロニーをアンピシリンを含有する媒体上で選別し
た。プラスミドの共有結合的に閉じた環状ＤＮＡを４
０，０００の貯留したアンピシリン耐性（ampr）コロニ
ーから単離した。バーンボイム（Ｂirnboim），Ｈ．及
びドリー（Ｄoly），ジヤーナル・オブ・ヌクレイツク
・アシツド・リサーチ（Ｊournal of Ｎucleic Ａcid
Ｒesearch），７，１５１３〜１５２５（１９７９）。
【００５２】このライブラリー（library）は、ｐＨＣ
７９コスミドＤＮＡがＴＭ４ゲノムの周囲のＳａｕ３Ａ
部位にランダムに導入されたＴＭ４ゲノムの組換え分子
を含む。これをＭ．スメグマチスのスフエロプラスト中
にトランスフエクシヨンして、ｐＨＣ７９が必須でない
領域に挿入されたＴＭ４フアージを選別した。斯くして
そのようなフアージはシャトル・ファスミドである。こ
のトランスフエクシヨンは１００プラーク形成単位（ｐ
ｆｕ）／プラスミドＤＮＡｕｇを生成した。プラーク・
リフトを用いて32Ｐで標識したｐＨＣ７９ＤＮＡへの交
雑を選別した。４０００のプラークのうち１０だけが標
識したｐＨＣ７９に交雑した。
７９コスミドＤＮＡがＴＭ４ゲノムの周囲のＳａｕ３Ａ
部位にランダムに導入されたＴＭ４ゲノムの組換え分子
を含む。これをＭ．スメグマチスのスフエロプラスト中
にトランスフエクシヨンして、ｐＨＣ７９が必須でない
領域に挿入されたＴＭ４フアージを選別した。斯くして
そのようなフアージはシャトル・ファスミドである。こ
のトランスフエクシヨンは１００プラーク形成単位（ｐ
ｆｕ）／プラスミドＤＮＡｕｇを生成した。プラーク・
リフトを用いて32Ｐで標識したｐＨＣ７９ＤＮＡへの交
雑を選別した。４０００のプラークのうち１０だけが標
識したｐＨＣ７９に交雑した。
【００５３】プラークの精製およびＭ．スメグマチス細
胞上での増殖後、１つのそのようなフアージを詳細に検
討し、そしてプラークｐｈＡＥ１として表示した。ファ
スミドｐｈＡＥ１は寄託番号４０３０６のもとにアメリ
カン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（Ａmerican
Ｔype Ｃulture Ｃollection,Ｒockville,ＭＤ）に寄託
した（１９８６年２月２６日）。ＤＮＡはＭ．スメグマ
チス上で生長させたｐｈＡＥ１フアージ粒子から単離さ
れ、ＣｓＣｌグラジエント上で精製し、コンカタマーを
生成するために連結し、そして試験管内でバクテリオフ
アージラムダ頭部中にパツケージした。得られる粒子は
アンピシリン耐性を大腸菌細胞に転写し、そしてトラン
スフエクシヨンした時Ｍ．スメグマチス上にプラークを
生成した。これはｐｈＡＥ１がシヤトル・ベクターとし
て機能する証拠であった。
胞上での増殖後、１つのそのようなフアージを詳細に検
討し、そしてプラークｐｈＡＥ１として表示した。ファ
スミドｐｈＡＥ１は寄託番号４０３０６のもとにアメリ
カン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（Ａmerican
Ｔype Ｃulture Ｃollection,Ｒockville,ＭＤ）に寄託
した（１９８６年２月２６日）。ＤＮＡはＭ．スメグマ
チス上で生長させたｐｈＡＥ１フアージ粒子から単離さ
れ、ＣｓＣｌグラジエント上で精製し、コンカタマーを
生成するために連結し、そして試験管内でバクテリオフ
アージラムダ頭部中にパツケージした。得られる粒子は
アンピシリン耐性を大腸菌細胞に転写し、そしてトラン
スフエクシヨンした時Ｍ．スメグマチス上にプラークを
生成した。これはｐｈＡＥ１がシヤトル・ベクターとし
て機能する証拠であった。
【００５４】Ｍ．スメグマチス上で増殖されたフアージ
粒子から単離されたｐｈＡＥ１ ＤＮＡの及び大腸菌か
ら単離されたプラスミドＤＮＡとして単離されたｐｈＡ
Ｅ１ＤＮＡの制限消化物は、フアージＤＮＡ調製物に見
られる付着端によって一緒に保持されたアニーリングさ
れてないフラグメントの存在を除いて同一のパターンを
示した（図３のＡ）。サザーン分析は、コスミドｐＨＣ
７９がＴＭ４ゲノムの２つの１１ｋｂＫｐｎＩ制限フラ
グメントの１つ内にクローン化されているということを
示した（図３のＢ）。電子顕微鏡により、ｐｈＡＥ１粒
子は平均の直径５０ｕｍである６辺形の頭部を有するバ
クテリオフアージラムダに似ていた。しかしながら、こ
れらの粒子はテール（tail）上に多く存在する円板状の
ベースプレート（baseplate）をもつ長いテール（長さ
１８０〜２２０ｕｍ）を有する（図４のＣ）。この構造
は親のＴＭ４フアージのそれに非常に類似している。チ
ンメ（Ｔimme），Ｔ．Ｌ．及びＰ．Ｊ．ブレンナン（Ｂ
rennan）,ジヤーナル・オブ・ジエン・ミクロバイオロジー
（Ｊournal of Ｇen-Ｍicro-biology），１３０，２０
５〜２０９（１９８４）。
粒子から単離されたｐｈＡＥ１ ＤＮＡの及び大腸菌か
ら単離されたプラスミドＤＮＡとして単離されたｐｈＡ
Ｅ１ＤＮＡの制限消化物は、フアージＤＮＡ調製物に見
られる付着端によって一緒に保持されたアニーリングさ
れてないフラグメントの存在を除いて同一のパターンを
示した（図３のＡ）。サザーン分析は、コスミドｐＨＣ
７９がＴＭ４ゲノムの２つの１１ｋｂＫｐｎＩ制限フラ
グメントの１つ内にクローン化されているということを
示した（図３のＢ）。電子顕微鏡により、ｐｈＡＥ１粒
子は平均の直径５０ｕｍである６辺形の頭部を有するバ
クテリオフアージラムダに似ていた。しかしながら、こ
れらの粒子はテール（tail）上に多く存在する円板状の
ベースプレート（baseplate）をもつ長いテール（長さ
１８０〜２２０ｕｍ）を有する（図４のＣ）。この構造
は親のＴＭ４フアージのそれに非常に類似している。チ
ンメ（Ｔimme），Ｔ．Ｌ．及びＰ．Ｊ．ブレンナン（Ｂ
rennan）,ジヤーナル・オブ・ジエン・ミクロバイオロジー
（Ｊournal of Ｇen-Ｍicro-biology），１３０，２０
５〜２０９（１９８４）。
【００５５】ｐＨＣ７９に交雑しなかったＭ．スメグマ
チスへのｐＨＣ７９：：ＴＭ４ライブラリーのトランス
フエクシヨンに由来する単離されたフアージからのＤＮ
Ａの制限分析は、それらが同一であることを示した。フ
アージは２つ又はそれ以上のｐＨＣ７９：：ＴＭ４分子
を含むトランスフエクシヨンした細胞に起こる組換えに
由来して、野生種のＴＭ４ゲノムを生成するように見え
る。
チスへのｐＨＣ７９：：ＴＭ４ライブラリーのトランス
フエクシヨンに由来する単離されたフアージからのＤＮ
Ａの制限分析は、それらが同一であることを示した。フ
アージは２つ又はそれ以上のｐＨＣ７９：：ＴＭ４分子
を含むトランスフエクシヨンした細胞に起こる組換えに
由来して、野生種のＴＭ４ゲノムを生成するように見え
る。
【００５６】特に興味あるのは、Ｍ．スメグマチスから
得られたシヤトル・ファスミドｐｈＡＥ１が、試験した
３つの異なるＭ．ボビス−ＢＣＧワクチン種、即ちグラ
クソ，パスツール、及びダニツシユＢＣＧに感染し且つ
複製しうる親のＴＭ４に類似している。これらの結果は
図４のＡ及び図４のＢに示される。
得られたシヤトル・ファスミドｐｈＡＥ１が、試験した
３つの異なるＭ．ボビス−ＢＣＧワクチン種、即ちグラ
クソ，パスツール、及びダニツシユＢＣＧに感染し且つ
複製しうる親のＴＭ４に類似している。これらの結果は
図４のＡ及び図４のＢに示される。
【００５７】即ちこれは、大腸菌中においてプラスミド
として及びミコバクテリア中においてフアージとして複
製する能力を有するばかりでなく、バクテリオフアージ
のラムダ頭部に又はミコバクテリオフアージ粒子にパツ
ケージする能力を有する組換えＤＮＡ分子である大腸菌
ミコバクテリアのシヤトル・ファスミドの成功裏の構築
を示す。またそれは組換えＤＮＡが速く生長するミコバ
クテリア（Ｍ．スメグマチス）及びゆっくり生長するミ
コバクテリア（Ｍ．ボビス−ＢＣＧ）の双方に導入され
たことを示す。これはＢＣＧワクチン種をシヤトル・フ
ァスミドで感染し、斯くしてクローン化された遺伝子を
ミコバクテリア中に導入することを可能にする。斯くし
てこれはＢＣＧに対するトランスフエクシヨン系を開発
する必要がなくなる。即ち大腸菌のミコバクテリアのシ
ヤトル・ファスミドがミコバクテリア中にトランスフエ
クシヨンした時にミコバクテリア粒子中にパツケージさ
れるから、外来のＤＮＡはトランスフエクシヨンよりも
むしろ形質導入によってゆっくり生長するミコバクテリ
ア（例えばＢＣＧ）中に導入することができる。現在ま
でこれは行なわれえなかったし、またそれは問題の抗原
１つ又はそれ以上に対して免疫化するために使用しうる
組換えミコバクテリアのワクチン・ビヒクルを生産する
ことを可能せしめる。
として及びミコバクテリア中においてフアージとして複
製する能力を有するばかりでなく、バクテリオフアージ
のラムダ頭部に又はミコバクテリオフアージ粒子にパツ
ケージする能力を有する組換えＤＮＡ分子である大腸菌
ミコバクテリアのシヤトル・ファスミドの成功裏の構築
を示す。またそれは組換えＤＮＡが速く生長するミコバ
クテリア（Ｍ．スメグマチス）及びゆっくり生長するミ
コバクテリア（Ｍ．ボビス−ＢＣＧ）の双方に導入され
たことを示す。これはＢＣＧワクチン種をシヤトル・フ
ァスミドで感染し、斯くしてクローン化された遺伝子を
ミコバクテリア中に導入することを可能にする。斯くし
てこれはＢＣＧに対するトランスフエクシヨン系を開発
する必要がなくなる。即ち大腸菌のミコバクテリアのシ
ヤトル・ファスミドがミコバクテリア中にトランスフエ
クシヨンした時にミコバクテリア粒子中にパツケージさ
れるから、外来のＤＮＡはトランスフエクシヨンよりも
むしろ形質導入によってゆっくり生長するミコバクテリ
ア（例えばＢＣＧ）中に導入することができる。現在ま
でこれは行なわれえなかったし、またそれは問題の抗原
１つ又はそれ以上に対して免疫化するために使用しうる
組換えミコバクテリアのワクチン・ビヒクルを生産する
ことを可能せしめる。
【００５８】これらのファスミドを構築するための試験
管内パッケージの使用は、パッケージ系の寸法の制限を
越えない限りにおいて、遺伝子（例えば免疫応答が所望
の１つ又はそれ以上の病原体に対する抗原をコードする
遺伝子又は外来遺伝子）の、これらベクターへのクロー
ン化に対する効果的な方策として拡張することができ
る。更なるＴＭ４：：pＨＣ７９組換えファスミドを選
別することにより、フアージから欠落しうるＤＮＡの最
大量を決定すること及びＤＮＡが挿入できるフアージの
ゲノムの必須でない更なる領域を決定することも可能で
ある。
管内パッケージの使用は、パッケージ系の寸法の制限を
越えない限りにおいて、遺伝子（例えば免疫応答が所望
の１つ又はそれ以上の病原体に対する抗原をコードする
遺伝子又は外来遺伝子）の、これらベクターへのクロー
ン化に対する効果的な方策として拡張することができ
る。更なるＴＭ４：：pＨＣ７９組換えファスミドを選
別することにより、フアージから欠落しうるＤＮＡの最
大量を決定すること及びＤＮＡが挿入できるフアージの
ゲノムの必須でない更なる領域を決定することも可能で
ある。
【００５９】シヤトル・ファスミドを用いることによる
新しい遺伝子（例えば外来ＤＮＡをコードする抗原）の
ミコバクテリアの導入は、ＤＮＡフラグメントの、大腸
菌中のシヤトル・ファスミドへのクローン化及び続くそ
れらのＭ.スメグマチスのスフエロプラストへのトラン
スフエクシヨンを含む。これはクローン化された遺伝子
を含む組換えフアージ粒子を生成する。組換えフアージ
を含む得られるＭ.スメグマチスのスフエロプラストを
用いることにより、ＢＣＧを高効率（凡そ１００％の効
率）で感染させることが可能であり、斯くして組換えフ
アージ中に含まれる外来のＤＮＡをＢＣＧ中に導入でき
る。ミコバクテリア細胞において外来の遺伝子を安定に
発現するための、溶原性又は組換えを確立する条件の開
発は非常に望ましい。
新しい遺伝子（例えば外来ＤＮＡをコードする抗原）の
ミコバクテリアの導入は、ＤＮＡフラグメントの、大腸
菌中のシヤトル・ファスミドへのクローン化及び続くそ
れらのＭ.スメグマチスのスフエロプラストへのトラン
スフエクシヨンを含む。これはクローン化された遺伝子
を含む組換えフアージ粒子を生成する。組換えフアージ
を含む得られるＭ.スメグマチスのスフエロプラストを
用いることにより、ＢＣＧを高効率（凡そ１００％の効
率）で感染させることが可能であり、斯くして組換えフ
アージ中に含まれる外来のＤＮＡをＢＣＧ中に導入でき
る。ミコバクテリア細胞において外来の遺伝子を安定に
発現するための、溶原性又は組換えを確立する条件の開
発は非常に望ましい。
【００６０】外来ＤＮＡのミコバクテリア細胞への導入 上述したシヤトル・ベクター（ファスミド）は、問題の
病原体１つ又はそれ以上に対する抗原１つ又はそれ以上
をコードする外来のＤＮＡをミコバクテリア例えばＢＣ
Ｇ又はＭ.スメグマチス中に導入するために使用するこ
とができる。またそれは抗受精ワクチンを製造するため
に適当な抗原例えば人間のゴナドトロピン・ホルモン
（ＨＧＨ）のフラグメントをコードするＤＮＡをミコバ
クテリア中に導入することによって使用することもでき
る。シヤトル・ファスミドは現在まで可能でなかったも
の、即ち組換えＤＮＡ構築物をバクテリア（例えば大腸
菌、ストレプトマイシス、杆菌）、又は他の有機体（例
えばイースト菌）中での取り扱い及び増殖、続くミコバ
クテリアへの転写及びそこでの複製を達成する手段を提
供する。
病原体１つ又はそれ以上に対する抗原１つ又はそれ以上
をコードする外来のＤＮＡをミコバクテリア例えばＢＣ
Ｇ又はＭ.スメグマチス中に導入するために使用するこ
とができる。またそれは抗受精ワクチンを製造するため
に適当な抗原例えば人間のゴナドトロピン・ホルモン
（ＨＧＨ）のフラグメントをコードするＤＮＡをミコバ
クテリア中に導入することによって使用することもでき
る。シヤトル・ファスミドは現在まで可能でなかったも
の、即ち組換えＤＮＡ構築物をバクテリア（例えば大腸
菌、ストレプトマイシス、杆菌）、又は他の有機体（例
えばイースト菌）中での取り扱い及び増殖、続くミコバ
クテリアへの転写及びそこでの複製を達成する手段を提
供する。
【００６１】結果として、個体を例えばハンセン病、結
核、マラリア、ジフテリア、破傷風、リーシユマニア、
サルモネラ、住血吸虫性皮膚炎、風疹、耳下腺炎、疱
疹、及びインフルエンザに対して免疫にするために使用
しうる組換えミコバクテリア・ワクチンを製造すること
が可能である。１つ又はそれ以上の病気を引き起こす病
原体に対する１つ又はそれ以上の保護抗原をコードする
遺伝子はミコバクテリア中に導入することができる。Ｔ
細胞の記憶又はエフエクター機能を必要とする病原体の
抗原をコードする遺伝子を導入しうることは特に有用で
ある。得られる組換えミコバクテリア・ワクチンの宿主
への投与は、宿主の免疫系を刺激して保護免疫応答を作
り出す。
核、マラリア、ジフテリア、破傷風、リーシユマニア、
サルモネラ、住血吸虫性皮膚炎、風疹、耳下腺炎、疱
疹、及びインフルエンザに対して免疫にするために使用
しうる組換えミコバクテリア・ワクチンを製造すること
が可能である。１つ又はそれ以上の病気を引き起こす病
原体に対する１つ又はそれ以上の保護抗原をコードする
遺伝子はミコバクテリア中に導入することができる。Ｔ
細胞の記憶又はエフエクター機能を必要とする病原体の
抗原をコードする遺伝子を導入しうることは特に有用で
ある。得られる組換えミコバクテリア・ワクチンの宿主
への投与は、宿主の免疫系を刺激して保護免疫応答を作
り出す。
【００６２】また相同組換えにより、１つの遺伝子を他
の遺伝子と交換し、そしてミコバクテリアの毒性に対す
る遺伝子に挿入変異を作り、毒性に必要な遺伝子を、そ
の存在が無毒性有機体をもたらす遺伝子で代替すること
も可能である。この方法で、抗原性をコードする遺伝子
を保持し、一方で有機体の毒性をコードする又は毒性と
関連する遺伝子を除去することが可能である。
の遺伝子と交換し、そしてミコバクテリアの毒性に対す
る遺伝子に挿入変異を作り、毒性に必要な遺伝子を、そ
の存在が無毒性有機体をもたらす遺伝子で代替すること
も可能である。この方法で、抗原性をコードする遺伝子
を保持し、一方で有機体の毒性をコードする又は毒性と
関連する遺伝子を除去することが可能である。
【００６３】病原体又は毒素に対するワクチンは次の方
法で製造しうる：保護が望ましい病原体又は毒素に対す
る抗原（単数又は複数）をコードするＤＮＡを得る。こ
のＤＮＡは（例えば病原有機体又は毒素を産生する有機
体からの）天然に産するＤＮＡを単離することにより；
公知の遺伝子工学の技術を用いることによって問題のＤ
ＮＡシーケンスをクローン化し且つ増殖することにより
［参照、例えばマニアチス（Ｍaniatis）、Ｔ.ら、分子
クローン化（Ｍolecular Ｃloning）：研究所マニユア
ル（Ａ Ｌaboratory Ｍanual）、コールド・スプリン
グ・ハーバー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor、Ｎ.Ｙ.）
（１９８２）］；或いは機械的合成により得ることがで
きる。
法で製造しうる：保護が望ましい病原体又は毒素に対す
る抗原（単数又は複数）をコードするＤＮＡを得る。こ
のＤＮＡは（例えば病原有機体又は毒素を産生する有機
体からの）天然に産するＤＮＡを単離することにより；
公知の遺伝子工学の技術を用いることによって問題のＤ
ＮＡシーケンスをクローン化し且つ増殖することにより
［参照、例えばマニアチス（Ｍaniatis）、Ｔ.ら、分子
クローン化（Ｍolecular Ｃloning）：研究所マニユア
ル（Ａ Ｌaboratory Ｍanual）、コールド・スプリン
グ・ハーバー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor、Ｎ.Ｙ.）
（１９８２）］；或いは機械的合成により得ることがで
きる。
【００６４】次の方法により、問題の（即ち免疫が所望
される抗原１つ又はそれ以上をコードする）遺伝子をシ
ヤトル・ファスミド中にクローン化する。これはシヤト
ル・ファスミドを系統的に表示する図２を参照にして説
明することができる。シヤトル・ファスミドの付着端を
公知の技術によって連結する。得られるシヤトル・ファ
スミド物質を独特な制限酵素（例えばシヤトル・ファス
ミド中の独特な部位例えばＥcoＲＩ及びＥcoＲＶで切断
する制限酵素）で切断（消化）する。この方法で作られ
た切断への別法は、他の制限酵素で有用である（切断し
うる）ポリリンカー（polylinker）（オリゴヌクレチオ
ドシーケンス）の（連結による）付加である。この場
合、このリンカーは選択した制限酵素で開裂され、外来
ＤＮＡが挿入できる部位を生成する。
される抗原１つ又はそれ以上をコードする）遺伝子をシ
ヤトル・ファスミド中にクローン化する。これはシヤト
ル・ファスミドを系統的に表示する図２を参照にして説
明することができる。シヤトル・ファスミドの付着端を
公知の技術によって連結する。得られるシヤトル・ファ
スミド物質を独特な制限酵素（例えばシヤトル・ファス
ミド中の独特な部位例えばＥcoＲＩ及びＥcoＲＶで切断
する制限酵素）で切断（消化）する。この方法で作られ
た切断への別法は、他の制限酵素で有用である（切断し
うる）ポリリンカー（polylinker）（オリゴヌクレチオ
ドシーケンス）の（連結による）付加である。この場
合、このリンカーは選択した制限酵素で開裂され、外来
ＤＮＡが挿入できる部位を生成する。
【００６５】第１の場合（独特な制限酵素を用いて切断
する場合）、結果は一度切断された且つ外来のＤＮＡが
挿入しうるシヤトル・ファスミドである。第２の場合に
は、ＤＮＡが挿入できる少くとも１つの部位も存在す
る。抗生物質耐性をコードする遺伝子（例えばアンピシ
リン耐性をコードする遺伝子）及び免疫が望しい抗原１
つ又はそれ以上をコードするＤＮＡは公知の技術によ
り、制限部位で連結することができる。挿入されるＤＮ
Ａ及びシヤトル・ファスミドＤＮＡは一般に等モル量で
連結される。
する場合）、結果は一度切断された且つ外来のＤＮＡが
挿入しうるシヤトル・ファスミドである。第２の場合に
は、ＤＮＡが挿入できる少くとも１つの部位も存在す
る。抗生物質耐性をコードする遺伝子（例えばアンピシ
リン耐性をコードする遺伝子）及び免疫が望しい抗原１
つ又はそれ以上をコードするＤＮＡは公知の技術によ
り、制限部位で連結することができる。挿入されるＤＮ
Ａ及びシヤトル・ファスミドＤＮＡは一般に等モル量で
連結される。
【００６６】この場合シヤトル・ファスミドＤＮＡ、抗
生物質耐性遺伝子及び抗原コードするＤＮＡを含む得ら
れる連結したＤＮＡを、ラムダ試験管内パッケージ混合
物を用いてバクテリアフアージのラムダ頭部中へパッケ
ージする。続いて大腸菌にこのフアージで形質導入す
る。この結果、抗生物質耐性をコードする遺伝子及び抗
原をコードするＤＮＡを含むコロニーを（抗生物質を含
む媒体を用いて）選別することが可能である。
生物質耐性遺伝子及び抗原コードするＤＮＡを含む得ら
れる連結したＤＮＡを、ラムダ試験管内パッケージ混合
物を用いてバクテリアフアージのラムダ頭部中へパッケ
ージする。続いて大腸菌にこのフアージで形質導入す
る。この結果、抗生物質耐性をコードする遺伝子及び抗
原をコードするＤＮＡを含むコロニーを（抗生物質を含
む媒体を用いて）選別することが可能である。
【００６７】得られる「ライブラリー」をＭ.スメグマ
チスのスフエロプラスト中にトランスフエクシヨン（感
染）し、クローン化された挿入ＤＮＡを有するシヤトル
・ファスミドを含むプラークを選別する。続いて、組換
えＭ.スメグマチスのスフエロプラストを用いて培養し
うるミコバクテリア例えばＢＣＧを高効率で感染させる
ことができる。結果として抗原をコードしたＤＮＡがミ
コバクテリアのゲノムＤＮＡ中に導入され、そこでそれ
が発現されることになろう。
チスのスフエロプラスト中にトランスフエクシヨン（感
染）し、クローン化された挿入ＤＮＡを有するシヤトル
・ファスミドを含むプラークを選別する。続いて、組換
えＭ.スメグマチスのスフエロプラストを用いて培養し
うるミコバクテリア例えばＢＣＧを高効率で感染させる
ことができる。結果として抗原をコードしたＤＮＡがミ
コバクテリアのゲノムＤＮＡ中に導入され、そこでそれ
が発現されることになろう。
【００６８】ゲノムＤＮＡ中に組込まれた１つ又はそれ
以上の抗原をコードするＤＮＡを含有するＢＣＧの選択
は選択しうるマーカーを用いて行なうことができる。組
換えフアージでの感染によって導入された１つ又はそれ
以上の抗原をコードするＤＮＡを含むＢＣＧの１つの選
別法は、抗生物質耐性遺伝子である選択しうるマーカー
の使用に基づく。この場合ファスミドは例えばカナマシ
イン耐性、ビオマイシン耐性、チオストレプトン耐性、
ヒグロマイシン耐性、又はブレオマイシン耐性をコード
する遺伝子を含む。
以上の抗原をコードするＤＮＡを含有するＢＣＧの選択
は選択しうるマーカーを用いて行なうことができる。組
換えフアージでの感染によって導入された１つ又はそれ
以上の抗原をコードするＤＮＡを含むＢＣＧの１つの選
別法は、抗生物質耐性遺伝子である選択しうるマーカー
の使用に基づく。この場合ファスミドは例えばカナマシ
イン耐性、ビオマイシン耐性、チオストレプトン耐性、
ヒグロマイシン耐性、又はブレオマイシン耐性をコード
する遺伝子を含む。
【００６９】問題のＤＮＡを含むＢＣＧを選択するため
に選別しうるマーカーを用いる第２の方法は、栄養要求
方策（即ち変異体の元の有機体が必要とないある栄養又
は物質を必要とする変異体微生体の使用に基づくもの）
である。この場合、変異を有するミコバクテリアを使用
し、消失した又は変性した機能をコードする遺伝子を
（抗原コードしたＤＮＡも含む）シヤトル・ファスミド
中に導入する。即ち抗原をコードするＤＮＡを含むミコ
バクテリアの選別は、シヤトル・ファスミドが成功裏に
導入されたミコバクテリアの、適当な媒体上で生育した
時に生き残る能力に基づく。
に選別しうるマーカーを用いる第２の方法は、栄養要求
方策（即ち変異体の元の有機体が必要とないある栄養又
は物質を必要とする変異体微生体の使用に基づくもの）
である。この場合、変異を有するミコバクテリアを使用
し、消失した又は変性した機能をコードする遺伝子を
（抗原コードしたＤＮＡも含む）シヤトル・ファスミド
中に導入する。即ち抗原をコードするＤＮＡを含むミコ
バクテリアの選別は、シヤトル・ファスミドが成功裏に
導入されたミコバクテリアの、適当な媒体上で生育した
時に生き残る能力に基づく。
【００７０】例えば宿主変異体（例えばＭ.スメグマチ
ス、ＢＣＧ）及び変異を補足する選別しうるマーカーを
含む系を使用することができる。そのような系はpyrＦ-
ＢＣＧ変異体である宿主変異体及び抗原をコードするＤ
ＮＡを（変異体）ＢＣＧ中に導入するために用いたファ
スミドのシヤトル・ベクター中に存在する選別しうるマ
ーカー例えばpyrＦ+遺伝子を含むことができる。この場
合、ファスミドはコスミドＤＮＡ中に挿入された抗原を
コードするＤＮＡの他に、pyrＦ+遺伝子を含む。即ちフ
ァスミドが感染によって導入されたＢＣＧ変異体は最小
媒体（minimalmedia）上での培養により選択することが
できる。別の方法は２‐デオキシグルコース耐性の変異
体を使用することである。この場合、ミコバクテリアの
グルコキナーゼ遺伝子がファスミド中にクローン化さ
れ、pyrＦに対して上述したように選別に使用される。
ス、ＢＣＧ）及び変異を補足する選別しうるマーカーを
含む系を使用することができる。そのような系はpyrＦ-
ＢＣＧ変異体である宿主変異体及び抗原をコードするＤ
ＮＡを（変異体）ＢＣＧ中に導入するために用いたファ
スミドのシヤトル・ベクター中に存在する選別しうるマ
ーカー例えばpyrＦ+遺伝子を含むことができる。この場
合、ファスミドはコスミドＤＮＡ中に挿入された抗原を
コードするＤＮＡの他に、pyrＦ+遺伝子を含む。即ちフ
ァスミドが感染によって導入されたＢＣＧ変異体は最小
媒体（minimalmedia）上での培養により選択することが
できる。別の方法は２‐デオキシグルコース耐性の変異
体を使用することである。この場合、ミコバクテリアの
グルコキナーゼ遺伝子がファスミド中にクローン化さ
れ、pyrＦに対して上述したように選別に使用される。
【００７１】この基準での選別は、抗原をコードするＤ
ＮＡがゲノムＤＮＡ中に安定に組込まれ且つ杆菌によっ
て発現されるＢＣＧをもたらすであろう。このために、
遺伝子の発現シグナル（例えばプロモーター、リボソー
ム結合部位）が外来の（抗原をコードする）ＤＮＡの上
流に含まれて、抗原をコードするＤＮＡを含むＢＣＧ
（変性ＢＣＧ）が、この変性ＢＣＧを投与した宿主に免
疫応答を誘導するのに十分な程度でそれを発現すること
を可能にする。
ＮＡがゲノムＤＮＡ中に安定に組込まれ且つ杆菌によっ
て発現されるＢＣＧをもたらすであろう。このために、
遺伝子の発現シグナル（例えばプロモーター、リボソー
ム結合部位）が外来の（抗原をコードする）ＤＮＡの上
流に含まれて、抗原をコードするＤＮＡを含むＢＣＧ
（変性ＢＣＧ）が、この変性ＢＣＧを投与した宿主に免
疫応答を誘導するのに十分な程度でそれを発現すること
を可能にする。
【００７２】モノクローナル抗体を用いることにより、
１つ又はそれ以上の抗原をコードするＤＮＡを含むＢＣ
Ｇを選別することも可能である。この場合、モノクロー
ナル抗体が有効である抗原（例えばＭ.レプラエ又は結
核菌）の１つ又はそれ以上のエピトープをコードする遺
伝子又は遺伝子フラグメントをミコバクテリア中に導入
する。そのようなモノクローナル抗体は、これらのエピ
トープの１つ又はそれ以上をコードする遺伝子（単数又
は複数）を含む組換えＢＣＧを選別するために使用され
る。この方法で導入された抗原遺伝子はプロモーター・
シーケンス及び他の調節シーケンスを含む。結果とし
て、遺伝子工学の技術により、（例えば他の抗原をコー
ドする）更なるシリーズをフレーム（frame）中に付加
することができ、斯くして１つの抗原に対するモノクロ
ーナル抗体によって同定される組換えＢＣＧがそのよう
に導入された他の外来の抗原をコードするＤＮＡも発現
するであろう。
１つ又はそれ以上の抗原をコードするＤＮＡを含むＢＣ
Ｇを選別することも可能である。この場合、モノクロー
ナル抗体が有効である抗原（例えばＭ.レプラエ又は結
核菌）の１つ又はそれ以上のエピトープをコードする遺
伝子又は遺伝子フラグメントをミコバクテリア中に導入
する。そのようなモノクローナル抗体は、これらのエピ
トープの１つ又はそれ以上をコードする遺伝子（単数又
は複数）を含む組換えＢＣＧを選別するために使用され
る。この方法で導入された抗原遺伝子はプロモーター・
シーケンス及び他の調節シーケンスを含む。結果とし
て、遺伝子工学の技術により、（例えば他の抗原をコー
ドする）更なるシリーズをフレーム（frame）中に付加
することができ、斯くして１つの抗原に対するモノクロ
ーナル抗体によって同定される組換えＢＣＧがそのよう
に導入された他の外来の抗原をコードするＤＮＡも発現
するであろう。
【００７３】抗原をコードするＤＮＡを培養しうるミコ
バクテリア中に導入するためにプラスミドを利用し且つ
ＤＮＡのエピソーム（即ち染色体外性）発現をもたらす
平行的な方策も、ワクチン・ビヒクルを製造するために
使用しうる。
バクテリア中に導入するためにプラスミドを利用し且つ
ＤＮＡのエピソーム（即ち染色体外性）発現をもたらす
平行的な方策も、ワクチン・ビヒクルを製造するために
使用しうる。
【００７４】この場合、抗原をコードするＤＮＡを含む
細胞を選別することを可能にする選別しうるマーカーが
必要とされる。選別しうるマーカーは例えば抗生物質耐
性をコードする遺伝子又は栄養要求性変異体において消
失しているものを補う遺伝子であつてよい。例えばカナ
マイシン耐性、ビオマイシン耐性、チオストレプトン耐
性、ニグロマイシン耐性又はブレオマイシン耐性をコー
ドする遺伝子はプラスミド中に導入することができる。
栄養要求性の方策においては、栄養要求性ミコバクテリ
ア変異体（例えばｐｙｒ-Ｆ）変異体を単離し、対応す
る野生型（非変異体）ミコバクテリア中に存在する遺伝
子をプラスミド中に導入する。ｐｙｒ-Ｆ変異体のほか
に、グルコキナーゼ遺伝子に欠陥をもつデオキシグルコ
ース変異体、並びに他の生合成過程における変異（例え
ばアミノ酸生合成、ビタミン生合成及び炭水化物代謝例
えばアラビノース及びガラクトース代謝における変異）
をもつデオキシグルコース変異体を単離することが可能
である。
細胞を選別することを可能にする選別しうるマーカーが
必要とされる。選別しうるマーカーは例えば抗生物質耐
性をコードする遺伝子又は栄養要求性変異体において消
失しているものを補う遺伝子であつてよい。例えばカナ
マイシン耐性、ビオマイシン耐性、チオストレプトン耐
性、ニグロマイシン耐性又はブレオマイシン耐性をコー
ドする遺伝子はプラスミド中に導入することができる。
栄養要求性の方策においては、栄養要求性ミコバクテリ
ア変異体（例えばｐｙｒ-Ｆ）変異体を単離し、対応す
る野生型（非変異体）ミコバクテリア中に存在する遺伝
子をプラスミド中に導入する。ｐｙｒ-Ｆ変異体のほか
に、グルコキナーゼ遺伝子に欠陥をもつデオキシグルコ
ース変異体、並びに他の生合成過程における変異（例え
ばアミノ酸生合成、ビタミン生合成及び炭水化物代謝例
えばアラビノース及びガラクトース代謝における変異）
をもつデオキシグルコース変異体を単離することが可能
である。
【００７５】いずれの方法においても、ミコバクテリア
変異体が選別され、そして変異を相補する遺伝子を、問
題の抗原をコードするＤＮＡも含むプラスミド・ベクタ
ー中に導入する。抗原をコードするＤＮＡが成功裏に導
入されたミコバクテリア変異体は、適当に選択した媒体
（例えば耐性が付与される抗生物質を含む媒体、用いる
変異体に影響される生合成過程に含まれる栄養を含む又
は欠く媒体）上で培養することにより同定しうる（選別
できる）であろう。
変異体が選別され、そして変異を相補する遺伝子を、問
題の抗原をコードするＤＮＡも含むプラスミド・ベクタ
ー中に導入する。抗原をコードするＤＮＡが成功裏に導
入されたミコバクテリア変異体は、適当に選択した媒体
（例えば耐性が付与される抗生物質を含む媒体、用いる
変異体に影響される生合成過程に含まれる栄養を含む又
は欠く媒体）上で培養することにより同定しうる（選別
できる）であろう。
【００７６】抗原をコードするＤＮＡを、組換えミコバ
クテリアのワクチン・ビヒクル中に導入するのに有用な
プラスミドの他の成分は、その存在がプラスミドを自律
的に（染色体外的に）複製される場合の主要な決定因子
である自律的に複製するシーケンス（例えばレプリコ
ン）である。これらのシーケンスは例えばプラスミド・
レプリコン、ミコバクテリオフアージのグメント又は染
色体複製起源のセグメントを含むことができる。
クテリアのワクチン・ビヒクル中に導入するのに有用な
プラスミドの他の成分は、その存在がプラスミドを自律
的に（染色体外的に）複製される場合の主要な決定因子
である自律的に複製するシーケンス（例えばレプリコ
ン）である。これらのシーケンスは例えばプラスミド・
レプリコン、ミコバクテリオフアージのグメント又は染
色体複製起源のセグメントを含むことができる。
【００７７】シヤトル・ファスミドｐｈＡＥ１のデザイ
ンはこれらの因子のいくつかを含む。例えば大腸菌コス
ミドｐＨＣ７９の、ミコバクテリオフアージＴＭ４中へ
の導入は、大腸菌プラスミドのレプリコン起源及び選択
しうるアンピシリン遺伝子、並びにバクテリオフアージ
のラムダ付着端（ＣＯＳ）シーケンス及び独特なＥｃｏ
ＲＩ部位を提供することを可能にした。ＴＭ４フアージ
内にＥｃｏＲＩ部位は存在しない；ｐｈＡＥ１内の独特
なＥｃｏＲＩ部位は外来の遺伝子をファスミドへ導入す
るために使用することができる。実施例４に記述するよ
うに、Ｔｎ９０３からのアミノグリコシドホスホトラン
スフエラーゼ（ａｐｈ）遺伝子をコードする１.６ｋｂ
のＥｃｏＲＩフラグメントはこのコスミドをクローン化
する方法によりｐｈＡＥ１中にクローン化した。
ンはこれらの因子のいくつかを含む。例えば大腸菌コス
ミドｐＨＣ７９の、ミコバクテリオフアージＴＭ４中へ
の導入は、大腸菌プラスミドのレプリコン起源及び選択
しうるアンピシリン遺伝子、並びにバクテリオフアージ
のラムダ付着端（ＣＯＳ）シーケンス及び独特なＥｃｏ
ＲＩ部位を提供することを可能にした。ＴＭ４フアージ
内にＥｃｏＲＩ部位は存在しない；ｐｈＡＥ１内の独特
なＥｃｏＲＩ部位は外来の遺伝子をファスミドへ導入す
るために使用することができる。実施例４に記述するよ
うに、Ｔｎ９０３からのアミノグリコシドホスホトラン
スフエラーゼ（ａｐｈ）遺伝子をコードする１.６ｋｂ
のＥｃｏＲＩフラグメントはこのコスミドをクローン化
する方法によりｐｈＡＥ１中にクローン化した。
【００７８】抗原をコードするＤＮＡを、ワクチン・ビ
ヒクルとして使用すべき培養しうるミコバクテリア例え
ばＢＣＧ又はＭ．スメグマチス中に効果的に導入するい
くつかの有用な方法がある。問題の抗原をコードするＡ
ＮＡ、選別しうるマーカー及び自律的に複製するシーケ
ンスを含むプラスミドの場合、ミコバクテリア中への効
果的な導入に対して、原形質体融合が使用できる。この
場合、大腸菌又はクローン化されたプラスミドを有する
ストレプトマイシスを、公知の技術を用いることによ
り、ミコバクテリアのスフエロプラストと融合させる。
この方法を用いることにより、外来の（抗原をコードす
る）ＤＮＡをミコバクテリアに転写することができる。
他にプラスミドＤＮＡを含み且つ染色体ＤＮＡを本質的
に含まない大腸菌ミニ細胞はミニ細胞の原形質体融合を
行なうのに使用することができる。
ヒクルとして使用すべき培養しうるミコバクテリア例え
ばＢＣＧ又はＭ．スメグマチス中に効果的に導入するい
くつかの有用な方法がある。問題の抗原をコードするＡ
ＮＡ、選別しうるマーカー及び自律的に複製するシーケ
ンスを含むプラスミドの場合、ミコバクテリア中への効
果的な導入に対して、原形質体融合が使用できる。この
場合、大腸菌又はクローン化されたプラスミドを有する
ストレプトマイシスを、公知の技術を用いることによ
り、ミコバクテリアのスフエロプラストと融合させる。
この方法を用いることにより、外来の（抗原をコードす
る）ＤＮＡをミコバクテリアに転写することができる。
他にプラスミドＤＮＡを含み且つ染色体ＤＮＡを本質的
に含まない大腸菌ミニ細胞はミニ細胞の原形質体融合を
行なうのに使用することができる。
【００７９】別に、外来のＤＮＡがミコバクテリア中に
効果的に移行させうるならば、自律的に複製するシーケ
ンスは必ずしも必要でなく、その代りに外来の（例えば
抗原をコードする）ＤＮＡがミコバクテリアの染色体中
に組込める。これは例えばミニ細胞の原形質体融合を用
いて達成することができる。この場合、抗生物質耐性遺
伝子又は染色体変異であつてよいミコバクテリアに対す
る選別しうるマーカーは大腸菌コスミド中にクローン化
できる。また外来ＤＮＡの染色体中への効果的な取込み
を行なわせるＤＮＡは大腸菌のコスミド中にも存在する
であろう。例えば、Ｍ．レプラエにおいて、組換えと関
連するように見える反復シーケンスが起こる；対応する
シーケンスはＢＣＧ及びＭ．スメグマチス中で同定され
且つそれから単離し、（選択しうるマーカーと一緒に）
大腸菌コスミド中に導入でき、高度の組換えがもたらさ
れる。
効果的に移行させうるならば、自律的に複製するシーケ
ンスは必ずしも必要でなく、その代りに外来の（例えば
抗原をコードする）ＤＮＡがミコバクテリアの染色体中
に組込める。これは例えばミニ細胞の原形質体融合を用
いて達成することができる。この場合、抗生物質耐性遺
伝子又は染色体変異であつてよいミコバクテリアに対す
る選別しうるマーカーは大腸菌コスミド中にクローン化
できる。また外来ＤＮＡの染色体中への効果的な取込み
を行なわせるＤＮＡは大腸菌のコスミド中にも存在する
であろう。例えば、Ｍ．レプラエにおいて、組換えと関
連するように見える反復シーケンスが起こる；対応する
シーケンスはＢＣＧ及びＭ．スメグマチス中で同定され
且つそれから単離し、（選択しうるマーカーと一緒に）
大腸菌コスミド中に導入でき、高度の組換えがもたらさ
れる。
【００８０】問題の（１つ又はそれ以上の抗原をコード
する）遺伝子（単数又は複数）［例えば大腸菌レプリコ
ン、組換えと関連したミコバクテリアの染色体ＤＮＡの
セグメント（リコンビノゲニツク(recombinogenic)シー
ケンス）及び２つの選別しうるマーカー、即ち大腸菌に
おいてマーカーとして役立つもの及びミコバクテリアに
おいてマーカーとして役立つものを含む］は、記述した
構築物中に導入することができる。次いで遺伝子をミク
ロバクテリアの染色体ＤＮＡ例えばＢＣＧ又はＭ．スメ
グマチスの染色体ＤＮＡ中に組込みうる。問題の遺伝子
がこの方法でＭ．スメグマチスに組込めるならば、それ
は一般的な形質導入フアージを用いることによつてＢＣ
Ｇ中に移動させることもできる。この場合、他の構築物
成分のほかに、２つのリコミノゲニツク・シーケンス、
即ちＭ．スメグマチスからのもの及びＢＣＧからのもの
を含むことが好適である。
する）遺伝子（単数又は複数）［例えば大腸菌レプリコ
ン、組換えと関連したミコバクテリアの染色体ＤＮＡの
セグメント（リコンビノゲニツク(recombinogenic)シー
ケンス）及び２つの選別しうるマーカー、即ち大腸菌に
おいてマーカーとして役立つもの及びミコバクテリアに
おいてマーカーとして役立つものを含む］は、記述した
構築物中に導入することができる。次いで遺伝子をミク
ロバクテリアの染色体ＤＮＡ例えばＢＣＧ又はＭ．スメ
グマチスの染色体ＤＮＡ中に組込みうる。問題の遺伝子
がこの方法でＭ．スメグマチスに組込めるならば、それ
は一般的な形質導入フアージを用いることによつてＢＣ
Ｇ中に移動させることもできる。この場合、他の構築物
成分のほかに、２つのリコミノゲニツク・シーケンス、
即ちＭ．スメグマチスからのもの及びＢＣＧからのもの
を含むことが好適である。
【００８１】ワクチンの構築(construction) 本発明を用いることにより、ハンセン病に対する免疫化
に有用な組換えミコバクテリアのワクチン・ビヒクルを
構築することが可能である。ミコバクテリア例えばＢＣ
Ｇの異常なアジユバント活性が故に、そのようなワクチ
ンは特に長期性又は持久性の細胞介在免疫性を形成させ
るのに有効であろう。ハンセン病寄生体Ｍ．レプラエの
蛋白質抗原をコードする遺伝子はヤング(Young)により
単離されており、本明細書に引用することによりその教
示が取り込まれる１９８６年７月３１日付けの米国特許
願第８９２,０９５に詳細に記述されている。特に５つ
の免疫原蛋白質抗原（即ち分子量６５ｋＤ、３６ｋＤ、
２８ｋＤ、１８ｋＤ及び１２ｋＤの抗原）をコードする
遺伝子が単離されている。更に６５ｋＤの抗原に対して
遺伝子によりコードされた６つの異なるエピトープが定
義されている。これらのエピトープの少くとも１つは
Ｍ．レプラエに独特であることが示され、他のエピトー
プは他のミコバクテリアの６５ｋＤ蛋白質を共有するこ
とが示された。
に有用な組換えミコバクテリアのワクチン・ビヒクルを
構築することが可能である。ミコバクテリア例えばＢＣ
Ｇの異常なアジユバント活性が故に、そのようなワクチ
ンは特に長期性又は持久性の細胞介在免疫性を形成させ
るのに有効であろう。ハンセン病寄生体Ｍ．レプラエの
蛋白質抗原をコードする遺伝子はヤング(Young)により
単離されており、本明細書に引用することによりその教
示が取り込まれる１９８６年７月３１日付けの米国特許
願第８９２,０９５に詳細に記述されている。特に５つ
の免疫原蛋白質抗原（即ち分子量６５ｋＤ、３６ｋＤ、
２８ｋＤ、１８ｋＤ及び１２ｋＤの抗原）をコードする
遺伝子が単離されている。更に６５ｋＤの抗原に対して
遺伝子によりコードされた６つの異なるエピトープが定
義されている。これらのエピトープの少くとも１つは
Ｍ．レプラエに独特であることが示され、他のエピトー
プは他のミコバクテリアの６５ｋＤ蛋白質を共有するこ
とが示された。
【００８２】本発明のシヤトル・ベクターを用いること
により、上述した及び次の実施例の方法に従つて、Ｍ．
レプラエ蛋白質抗原をコードする遺伝子の１つ又はそれ
以上をＢＣＧ中に導入することが可能である。例えば６
５ｋＤのＭ．レプラエ抗原をコードする遺伝子は、ＢＣ
Ｇ中に導入され、そのゲノムＤＮＡ中に安定に組混まれ
且つそれを投与する宿主に免疫応答を刺激する又は誘導
するのに十分な量で発現することができる。この方法
で、１つ又はそれ以上のＭ．レプラエの保護抗原を含有
し、寛容原性決定基を有さず、そして細胞介在免疫を誘
導するための優秀なアジユバントを有するという点で理
想に近いワクチンを構築することが可能である。
により、上述した及び次の実施例の方法に従つて、Ｍ．
レプラエ蛋白質抗原をコードする遺伝子の１つ又はそれ
以上をＢＣＧ中に導入することが可能である。例えば６
５ｋＤのＭ．レプラエ抗原をコードする遺伝子は、ＢＣ
Ｇ中に導入され、そのゲノムＤＮＡ中に安定に組混まれ
且つそれを投与する宿主に免疫応答を刺激する又は誘導
するのに十分な量で発現することができる。この方法
で、１つ又はそれ以上のＭ．レプラエの保護抗原を含有
し、寛容原性決定基を有さず、そして細胞介在免疫を誘
導するための優秀なアジユバントを有するという点で理
想に近いワクチンを構築することが可能である。
【００８３】同様にして、シヤトル・ベクターと本発明
の方法を用いることにより、結核に対して特異的な保護
を提供するワクチンを構築することができる。そのよう
なワクチンは、現在使用されているワクチンが無効果で
あることが証明されつつあるという前述した最近の発見
が故に、特に魅力的である。結核杆菌の結核菌の免疫原
性蛋白質抗原を暗号化する遺伝子は、１９８７年２月２
日付けのロバート(Robert)Ｎ．ハツソン(Husson)及びリ
チヤード(Richard)Ａ．ヤングによる「結核菌の蛋白質
抗原をコードする遺伝子及びそれに対する使用法」とい
う関連米国特許願第１０,００７号並びにメバートＮ．
ハツソン、リチヤードＡ．ヤング、及びトーマス(Thoma
s)Ｍ．シンニツク(Shinnick)による「結核菌の蛋白質抗
原をコードする遺伝子及びそれに対する使用法」という
一連の関連特許願（１９８８年２月１０日付けの速達法
によつて申請された代理人処理番号第ＷＨＩ８６−０６
Ａ号）に記述されている。ここにこれらの教示は本明細
書に引用することにより取り込まれる。
の方法を用いることにより、結核に対して特異的な保護
を提供するワクチンを構築することができる。そのよう
なワクチンは、現在使用されているワクチンが無効果で
あることが証明されつつあるという前述した最近の発見
が故に、特に魅力的である。結核杆菌の結核菌の免疫原
性蛋白質抗原を暗号化する遺伝子は、１９８７年２月２
日付けのロバート(Robert)Ｎ．ハツソン(Husson)及びリ
チヤード(Richard)Ａ．ヤングによる「結核菌の蛋白質
抗原をコードする遺伝子及びそれに対する使用法」とい
う関連米国特許願第１０,００７号並びにメバートＮ．
ハツソン、リチヤードＡ．ヤング、及びトーマス(Thoma
s)Ｍ．シンニツク(Shinnick)による「結核菌の蛋白質抗
原をコードする遺伝子及びそれに対する使用法」という
一連の関連特許願（１９８８年２月１０日付けの速達法
によつて申請された代理人処理番号第ＷＨＩ８６−０６
Ａ号）に記述されている。ここにこれらの教示は本明細
書に引用することにより取り込まれる。
【００８４】この場合、結核菌の免疫原性蛋白質抗原を
コードする遺伝子を上述した如くシヤトル・ベクターに
よりＢＣＧ中に導入する。それぞれ蛋白質抗原をコード
する１つよりも多い結核菌遺伝子をＢＣＧ中に導入する
ことも可能である。例えば、分子量１２ｋＤ、１４ｋ
Ｄ、１９ｋＤ、６５ｋＤ及び７１ｋＤの免疫原性結核菌
をコードする遺伝子或いはこれらの遺伝子の２つ又はそ
れ以上の組合せをＢＣＧ中に挿入し、ゲノムＤＮＡ中に
安定に組込み、且つ発現することができる。この結果は
結核菌に対する免疫化に特異的であり且つ杆菌に対する
長期の免疫性を誘導するワクチンである。
コードする遺伝子を上述した如くシヤトル・ベクターに
よりＢＣＧ中に導入する。それぞれ蛋白質抗原をコード
する１つよりも多い結核菌遺伝子をＢＣＧ中に導入する
ことも可能である。例えば、分子量１２ｋＤ、１４ｋ
Ｄ、１９ｋＤ、６５ｋＤ及び７１ｋＤの免疫原性結核菌
をコードする遺伝子或いはこれらの遺伝子の２つ又はそ
れ以上の組合せをＢＣＧ中に挿入し、ゲノムＤＮＡ中に
安定に組込み、且つ発現することができる。この結果は
結核菌に対する免疫化に特異的であり且つ杆菌に対する
長期の免疫性を誘導するワクチンである。
【００８５】本発明の方法を用いることにより、多目的
又は多機能性ワクチン（即ちそれぞれ異なる蛋白質又は
毒素に対する蛋白質抗原をコードする１つよりも多い遺
伝子を含む外来のＤＮＡを含有し且つこれを発現する単
一のワクチン・ビヒクル）を構築することも可能であ
る。例えば上述したシヤトル・ベクター・ファスミドを
用いることにより、Ｍ．レプラエに対する蛋白質抗原を
コードする遺伝子、リーシユマニアに対する蛋白質抗原
をコードする遺伝子、及びマラリアに対する蛋白質抗原
をコードする遺伝子をＢＣＧ中に導入することも可能で
ある。この多機能ワクチンの投与は、各抗原に対する免
疫応答を刺激し、ハンセン病、結核、リーシユマニア、
及びマラリアに対する長期の保護を提供する。
又は多機能性ワクチン（即ちそれぞれ異なる蛋白質又は
毒素に対する蛋白質抗原をコードする１つよりも多い遺
伝子を含む外来のＤＮＡを含有し且つこれを発現する単
一のワクチン・ビヒクル）を構築することも可能であ
る。例えば上述したシヤトル・ベクター・ファスミドを
用いることにより、Ｍ．レプラエに対する蛋白質抗原を
コードする遺伝子、リーシユマニアに対する蛋白質抗原
をコードする遺伝子、及びマラリアに対する蛋白質抗原
をコードする遺伝子をＢＣＧ中に導入することも可能で
ある。この多機能ワクチンの投与は、各抗原に対する免
疫応答を刺激し、ハンセン病、結核、リーシユマニア、
及びマラリアに対する長期の保護を提供する。
【００８６】
【実施例】今や次の実施例によつて本発明を例示する
が、実施例はいずれの具合いにも本発明を制限するもの
と考えるべきでない。
が、実施例はいずれの具合いにも本発明を制限するもの
と考えるべきでない。
【００８７】実施例１ Ｍ.スメグマチスのスフエロプラストの、ミコバクテリ
オフアージＤ２９ＤＮＡとのトランスフエクシヨン Ｍ.スメグマチス種ｍｃ2６のスフエロプラストを次の方
法に従って準備した。ｍｃ2６はＡＴＣＣ６０７号のＭ.
スメグマチス原培養物から単離された主にコロニー型で
ある単一コロニー単離物である。これは再生媒体上で橙
色のの粗いコロニーを形成した。ホプウツドら、ストレ
プトマイシスの遺伝子的取り扱い−実験室マニユアル、
ジヨン・インネス基金(The John Innes Foundation, No
rwich, England）（１９８５）。
オフアージＤ２９ＤＮＡとのトランスフエクシヨン Ｍ.スメグマチス種ｍｃ2６のスフエロプラストを次の方
法に従って準備した。ｍｃ2６はＡＴＣＣ６０７号のＭ.
スメグマチス原培養物から単離された主にコロニー型で
ある単一コロニー単離物である。これは再生媒体上で橙
色のの粗いコロニーを形成した。ホプウツドら、ストレ
プトマイシスの遺伝子的取り扱い−実験室マニユアル、
ジヨン・インネス基金(The John Innes Foundation, No
rwich, England）（１９８５）。
【００８８】Ｍ．スメグマチスに対してウドウ(Udou)ら
の記述するスフエロプラスト調製物に対する媒体を用い
ることにより、ストレプトマイセスに関してＭ．スメグ
マチスのスフエロプラストを調製した。ウドウ、Ｔ．
ら、ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー、１５１、１
０３５〜１０３９（１９８２）。ｍｃ2６細胞を、２５
０mlのバツフルド(baffled）フラスコ中において３７℃
において適度に振とうしながら、１％グルコース及び
０.２％ツウイーン８０を含むトリプシン大豆汁４０ml
中でＡ600＝０.２まで生長させた。この時点で２０％グ
リシン溶液を最終濃度１％まで添加した。次いで、細胞
を更に１６時間培養し、５０００×ｇで１０分間遠心分
離することによって室温下に収穫した。ペレツトを１
０.３％スクローズ１０mlで２回洗浄し、次いでリソザ
イム溶液２mg／mlを含む原形質体（ｐ）緩衝液中に再懸
濁した。３７℃で２時間の培養後、ｐ緩衝液５mlを添加
し、スフエロプラストを３０００×ｇで７分間遠心分離
することによってペレツトとした。このペレツトをｐ緩
衝液１０ml中に再懸濁させ、３時間以内に使用した。
の記述するスフエロプラスト調製物に対する媒体を用い
ることにより、ストレプトマイセスに関してＭ．スメグ
マチスのスフエロプラストを調製した。ウドウ、Ｔ．
ら、ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー、１５１、１
０３５〜１０３９（１９８２）。ｍｃ2６細胞を、２５
０mlのバツフルド(baffled）フラスコ中において３７℃
において適度に振とうしながら、１％グルコース及び
０.２％ツウイーン８０を含むトリプシン大豆汁４０ml
中でＡ600＝０.２まで生長させた。この時点で２０％グ
リシン溶液を最終濃度１％まで添加した。次いで、細胞
を更に１６時間培養し、５０００×ｇで１０分間遠心分
離することによって室温下に収穫した。ペレツトを１
０.３％スクローズ１０mlで２回洗浄し、次いでリソザ
イム溶液２mg／mlを含む原形質体（ｐ）緩衝液中に再懸
濁した。３７℃で２時間の培養後、ｐ緩衝液５mlを添加
し、スフエロプラストを３０００×ｇで７分間遠心分離
することによってペレツトとした。このペレツトをｐ緩
衝液１０ml中に再懸濁させ、３時間以内に使用した。
【００８９】ｍｃ2−１１は、１０8個の細胞を３×１０
8個のＤ２９プラーク形成単位と混合し且つトリプシン
大豆寒天プレートで処理した時、ＡＴＣＣ６０７号の
Ｍ．スメグマチス原培養物の自然によるＤ２９耐性単離
物として単離された。Ｄ２９耐性コロニーは１０-7の頻
度で起った。
8個のＤ２９プラーク形成単位と混合し且つトリプシン
大豆寒天プレートで処理した時、ＡＴＣＣ６０７号の
Ｍ．スメグマチス原培養物の自然によるＤ２９耐性単離
物として単離された。Ｄ２９耐性コロニーは１０-7の頻
度で起った。
【００９０】ｍｃ2６スフエロプラストをＤ２９ＤＮＡ
１ｕｇと混合した；得られた混合物の1/10を、０.５Ｍ
スクローズの有無下にトリプシン大豆寒天プレートで処
理した。次いでこれに、１０8個のｍｃ2６細胞を含む適
当な軟質寒天を上塗りした。ＤＮアーゼI（シグマ）を
５０ｕｇ／mlの最終濃度でＤ２９ＤＮＡに添加すること
によってＤＮアーゼ処理を行なった。
１ｕｇと混合した；得られた混合物の1/10を、０.５Ｍ
スクローズの有無下にトリプシン大豆寒天プレートで処
理した。次いでこれに、１０8個のｍｃ2６細胞を含む適
当な軟質寒天を上塗りした。ＤＮアーゼI（シグマ）を
５０ｕｇ／mlの最終濃度でＤ２９ＤＮＡに添加すること
によってＤＮアーゼ処理を行なった。
【００９１】同一の方法でｍｃ2１１スフエロプラスト
の等量を用いたが、続いてｍｃ6６細胞を上塗りしてプ
ラーク形成単位（ｐｆｕ）を評価した。
の等量を用いたが、続いてｍｃ6６細胞を上塗りしてプ
ラーク形成単位（ｐｆｕ）を評価した。
【００９２】フアージ・プレート原料：Ｄ２９のプレー
ト溶解物を２mＭ ＣaＣｌ2を含有するトリプシン大豆
寒天媒体上で準備した。バツフルド・フラスコ中３７℃
において、ＡＤＣ濃厚物を含むミドルブルーク(Middleb
rook)７Ｈ９汁中で中対数増殖期まで生長させたＭ．ス
メグマチスを、ＭＰ緩衝液(１０mＭトリス−ＨＣｌ、p
Ｈ７.６−１０mＭ ＭgＣｌ2−１００mＭＮaＣｌ−２m
Ｍ ＣaＣｌ2）で希釈したフアージと混合し、プレート
が集密的になるまで３７℃下に３６時間培養した。フア
ージをＭＰ緩衝液で収穫し、次いで２回のＣsＣｌ 平衡
グラジエントで、続いてＭＰ緩衝液に対する強力な透析
により精製した。ＥＤＴＡを最終濃度５０mＭまで添加
し且つプロテイナーゼＫ１００ｕｇ／mlで５５℃下に２
４時間処理し、続いてフエノール−クロロホルム抽出及
びＴＥ緩衝液に対する強力な透析を行なうことによりＤ
ＮＡをフアージから抽出した。
ト溶解物を２mＭ ＣaＣｌ2を含有するトリプシン大豆
寒天媒体上で準備した。バツフルド・フラスコ中３７℃
において、ＡＤＣ濃厚物を含むミドルブルーク(Middleb
rook)７Ｈ９汁中で中対数増殖期まで生長させたＭ．ス
メグマチスを、ＭＰ緩衝液(１０mＭトリス−ＨＣｌ、p
Ｈ７.６−１０mＭ ＭgＣｌ2−１００mＭＮaＣｌ−２m
Ｍ ＣaＣｌ2）で希釈したフアージと混合し、プレート
が集密的になるまで３７℃下に３６時間培養した。フア
ージをＭＰ緩衝液で収穫し、次いで２回のＣsＣｌ 平衡
グラジエントで、続いてＭＰ緩衝液に対する強力な透析
により精製した。ＥＤＴＡを最終濃度５０mＭまで添加
し且つプロテイナーゼＫ１００ｕｇ／mlで５５℃下に２
４時間処理し、続いてフエノール−クロロホルム抽出及
びＴＥ緩衝液に対する強力な透析を行なうことによりＤ
ＮＡをフアージから抽出した。
【００９３】トランスフエクシヨン：各トランスフエク
シヨンに対して、スフエロプラスト懸濁液２.５mlを１
５mlのコニカル・ポリスチレン管中でペレットにした。
上澄流体を注意深く傾斜し、スフエロプラストを緩衝液
の残留滴中に再懸濁させた。１０ｕｇよりも少い全容量
中ＤＮＡ１ｕｇを添加した後、ｐ緩衝液中で準備した２
５％ＰＥＧ−１０００［Ｊ．Ｔ．ベーカー・ケミカル社
（Ｊ．Ｔ．Baker Chemical Co., Ohila, PA)]溶液０.５
ｍを混合した。３分以内にｐ緩衝液を混合物に添加し、
スフエロプラストを上述の如くペレットにした。上澄液
を注意深く除去した後、ペレットをｐ緩衝液１ｍ中に再
懸濁させ、試料を０.５Ｍスクロースの有無下にトリプ
シン大豆寒天に移した。次いでプレートに軟いトリプシ
ン大豆寒天３.０mlを上塗りし、３７℃で培養した。プ
ラークを培養２４時間後に数えた。
シヨンに対して、スフエロプラスト懸濁液２.５mlを１
５mlのコニカル・ポリスチレン管中でペレットにした。
上澄流体を注意深く傾斜し、スフエロプラストを緩衝液
の残留滴中に再懸濁させた。１０ｕｇよりも少い全容量
中ＤＮＡ１ｕｇを添加した後、ｐ緩衝液中で準備した２
５％ＰＥＧ−１０００［Ｊ．Ｔ．ベーカー・ケミカル社
（Ｊ．Ｔ．Baker Chemical Co., Ohila, PA)]溶液０.５
ｍを混合した。３分以内にｐ緩衝液を混合物に添加し、
スフエロプラストを上述の如くペレットにした。上澄液
を注意深く除去した後、ペレットをｐ緩衝液１ｍ中に再
懸濁させ、試料を０.５Ｍスクロースの有無下にトリプ
シン大豆寒天に移した。次いでプレートに軟いトリプシ
ン大豆寒天３.０mlを上塗りし、３７℃で培養した。プ
ラークを培養２４時間後に数えた。
【００９４】実施例２ シヤトル・ファスミドｐｈＡＥ１の構築 ＴＭ４フアージＤＮＡを２５０ｕｇ／mlの濃度で連結し
た。一部を、連続的に希釈したＳau ３Ａで部分的に消
化した；この方法で（アガロース・ゲル電気泳動で分析
して）平均長さ３０〜５０ｋｂのフラグメントを得た。
これらのフラグメントを、ＴＭ４フラグメントとＢamＨ
Ｉで開裂したｐＨＣ７９とのモル比１：２において連結
した。この連結の一部分を試験管内パツケージ混合物
［ギガパツク・プラス(Gigapack plus, Stratagene, Sa
n Diego, CA)]でパツケージし、続いてＥＲ１３８１[hs
dＲ mcrＡ+ marＢ+、Ｅ．ラリー(Raleigh)]中に形質導
入した。これは、アンピシリンを５０ｕｇ／mlで含有す
るＬ寒天プレートで処理した時ＴＭ４ＤＮＡ挿入物ｕｇ
当り１０6個のアンピシリン・コロニーを生成した。
た。一部を、連続的に希釈したＳau ３Ａで部分的に消
化した；この方法で（アガロース・ゲル電気泳動で分析
して）平均長さ３０〜５０ｋｂのフラグメントを得た。
これらのフラグメントを、ＴＭ４フラグメントとＢamＨ
Ｉで開裂したｐＨＣ７９とのモル比１：２において連結
した。この連結の一部分を試験管内パツケージ混合物
［ギガパツク・プラス(Gigapack plus, Stratagene, Sa
n Diego, CA)]でパツケージし、続いてＥＲ１３８１[hs
dＲ mcrＡ+ marＢ+、Ｅ．ラリー(Raleigh)]中に形質導
入した。これは、アンピシリンを５０ｕｇ／mlで含有す
るＬ寒天プレートで処理した時ＴＭ４ＤＮＡ挿入物ｕｇ
当り１０6個のアンピシリン・コロニーを生成した。
【００９５】Ｌブロス中コロニーをガラス・スプレツダ
ーでホモゲナイズ(homogenize)することにより４０,０
００個のアンピシリン耐性コロニーの貯蔵物を準備し
た。クローンの貯蔵物から、アルカリ性ＳＤＳ抽出、続
くフエノール−クロロホルム抽出及びエタノールでの濃
縮によりプラスミドを単離した。共有結合的に閉じたプ
ラスミドＤＮＡを実施例１に記述したようにｍｃ2６の
スフエロプラスト中にトランスフエクシヨンした。ベン
トン(Benton)及びデービス(Davis)の手順並びにバイオ
トランス・ナイロン膜（ＩＣＮ）を用いてプラーク・リ
フトを行なうことにより、プラークをｐＨｃ７９の存在
に対して選別した。ベントン、Ｗ．Ｄ．及びＲ．Ｗ．デ
ービス、サイエンス(Science)、１９６、１８０〜１８
２（１９７７）。この膜を32ｐ−ｄｃＴＰでニツク・ト
ランスレーシヨンしたｐＨｃ７９ＤＮＡと交雑させ、オ
ートラジオグラフイーに供した。
ーでホモゲナイズ(homogenize)することにより４０,０
００個のアンピシリン耐性コロニーの貯蔵物を準備し
た。クローンの貯蔵物から、アルカリ性ＳＤＳ抽出、続
くフエノール−クロロホルム抽出及びエタノールでの濃
縮によりプラスミドを単離した。共有結合的に閉じたプ
ラスミドＤＮＡを実施例１に記述したようにｍｃ2６の
スフエロプラスト中にトランスフエクシヨンした。ベン
トン(Benton)及びデービス(Davis)の手順並びにバイオ
トランス・ナイロン膜（ＩＣＮ）を用いてプラーク・リ
フトを行なうことにより、プラークをｐＨｃ７９の存在
に対して選別した。ベントン、Ｗ．Ｄ．及びＲ．Ｗ．デ
ービス、サイエンス(Science)、１９６、１８０〜１８
２（１９７７）。この膜を32ｐ−ｄｃＴＰでニツク・ト
ランスレーシヨンしたｐＨｃ７９ＤＮＡと交雑させ、オ
ートラジオグラフイーに供した。
【００９６】実施例３ ＢＣＧ及びＭ．スメグマチスへ
の、シヤトル・ファスミドｐｈＡＥ１の感染 ＡＤＣ濃厚物［デイフコ（Ｄifco）］及び０.５％ツウ
イーン８０（シグマ）を含有するミドルブルーク７Ｈ９
汁（デイフコ）中において、ＢＣＧ−グラクソ（Ｗ．ジ
ヨーンズ）を３７℃下の放置培養で増殖した。１０8個
のＢＣＧ細胞を、補充したトツプ・ソフト（top soft）
の寒天と混合し且つＯＡＤＳ濃厚物（デイフコ）を補充
したツウイーン８０（ギブコ）を含まないデユボス（Ｄ
ubos）寒天上に注ぐことによってＢＣＧ−グラクソ又は
ｍｃ2６細胞のローン（lawn）を製造した。ジヨンズ
（Ｊones），Ｗ．Ｄ．Ｊｒ．，ツバークル（Ｔubercl
e），６０，５５〜５８（１９７９）。４つのフアー
ジ、ＤＳ６Ａ、ＴＭ４、ｐｈＡＥ１、及び３３Ｄを連続
的に希釈し、２つのローン上にスポツトをつけた。プレ
ートをＢＣＧ−グラクソ及びＭ．スメグマチスに対して
それぞれ１４日及び２日で読みとった。
の、シヤトル・ファスミドｐｈＡＥ１の感染 ＡＤＣ濃厚物［デイフコ（Ｄifco）］及び０.５％ツウ
イーン８０（シグマ）を含有するミドルブルーク７Ｈ９
汁（デイフコ）中において、ＢＣＧ−グラクソ（Ｗ．ジ
ヨーンズ）を３７℃下の放置培養で増殖した。１０8個
のＢＣＧ細胞を、補充したトツプ・ソフト（top soft）
の寒天と混合し且つＯＡＤＳ濃厚物（デイフコ）を補充
したツウイーン８０（ギブコ）を含まないデユボス（Ｄ
ubos）寒天上に注ぐことによってＢＣＧ−グラクソ又は
ｍｃ2６細胞のローン（lawn）を製造した。ジヨンズ
（Ｊones），Ｗ．Ｄ．Ｊｒ．，ツバークル（Ｔubercl
e），６０，５５〜５８（１９７９）。４つのフアー
ジ、ＤＳ６Ａ、ＴＭ４、ｐｈＡＥ１、及び３３Ｄを連続
的に希釈し、２つのローン上にスポツトをつけた。プレ
ートをＢＣＧ−グラクソ及びＭ．スメグマチスに対して
それぞれ１４日及び２日で読みとった。
【００９７】実施例４ アミノグリコシド・ホスホトラ
ンスフエラーゼ遺伝子のｐｈＡＥ１へのクローン化 Ｔｎ９０３からのアミノグリコシド・ホスホトランスフ
エラーゼ遺伝子（ａｐｈ）をコードする１.６ｋｂのＥ
ｃｏＲＩフラグメントを、コスミド・クローン化法を利
用してｐｈＡＥ１中にクローン化した。プラスミドｐｈ
ＡＥ１ ＤＮＡを大腸菌から単離し、ＥｃｏＲＩで切断
し、その１.６ｋｂフラグメントをこれらの大きいＤＮ
Ａ分子に連結した。連結した生成物を試験管内でフアー
ジ・ラムダにパツケージし、大腸菌細胞にカナマイシン
耐性とアンピシリン耐性を形質導入した粒子を生成せし
めた。これらの大腸菌細胞からプラスミドＤＮＡを単離
した。これはＭ．スメグマチスｍｃ2６の原形質体中に
トランスフエクシヨンした時プラーク形成単位を高頻度
で生ずることが示された。これは、更なるＤＮＡの少く
とも１.６ｋｂを、ｐｈＡＥ１の独特なＥｃｏＲＩ部位
中にクローン化できることを示す。シヤトル・ファスミ
ドｐｈＡＥ２、即ちｐｈＡＥ１と同様の特性を有する
が、寸法でｐｈＡＥ１よりも２ｋｂ小さいシヤトル・ベ
クターを用いても同様の結果が得られた。この場合には
更なるＤＮＡの少くとも３.６ｋｂのクローン化が可能
なはずである。両方の場合、ａｐｈ遺伝子の導入は、新
しいＮｒｕＩ部位の導入をもたらした。これは、更なる
フラグメントがクローン化でき且つシヤトル・ファスミ
ド中で安定に維持しうるという証明を提供する。斯くし
て、これらのベクターは更なる改変なしに、更なる遺伝
子をミコバクテリア中にクローン化するのに有用であ
る。
ンスフエラーゼ遺伝子のｐｈＡＥ１へのクローン化 Ｔｎ９０３からのアミノグリコシド・ホスホトランスフ
エラーゼ遺伝子（ａｐｈ）をコードする１.６ｋｂのＥ
ｃｏＲＩフラグメントを、コスミド・クローン化法を利
用してｐｈＡＥ１中にクローン化した。プラスミドｐｈ
ＡＥ１ ＤＮＡを大腸菌から単離し、ＥｃｏＲＩで切断
し、その１.６ｋｂフラグメントをこれらの大きいＤＮ
Ａ分子に連結した。連結した生成物を試験管内でフアー
ジ・ラムダにパツケージし、大腸菌細胞にカナマイシン
耐性とアンピシリン耐性を形質導入した粒子を生成せし
めた。これらの大腸菌細胞からプラスミドＤＮＡを単離
した。これはＭ．スメグマチスｍｃ2６の原形質体中に
トランスフエクシヨンした時プラーク形成単位を高頻度
で生ずることが示された。これは、更なるＤＮＡの少く
とも１.６ｋｂを、ｐｈＡＥ１の独特なＥｃｏＲＩ部位
中にクローン化できることを示す。シヤトル・ファスミ
ドｐｈＡＥ２、即ちｐｈＡＥ１と同様の特性を有する
が、寸法でｐｈＡＥ１よりも２ｋｂ小さいシヤトル・ベ
クターを用いても同様の結果が得られた。この場合には
更なるＤＮＡの少くとも３.６ｋｂのクローン化が可能
なはずである。両方の場合、ａｐｈ遺伝子の導入は、新
しいＮｒｕＩ部位の導入をもたらした。これは、更なる
フラグメントがクローン化でき且つシヤトル・ファスミ
ド中で安定に維持しうるという証明を提供する。斯くし
て、これらのベクターは更なる改変なしに、更なる遺伝
子をミコバクテリア中にクローン化するのに有用であ
る。
【００９８】実施例５ シヤトル・ファスミドを用いる
ことによるミコバクテリア中の選別しうるマーカーの安
定な発現 ＴＭ４フアージに対して構築したものと同様の方法で、
フアージＬ１（ＡＴＣＣ２７１９９号）からシヤトル・
ファスミドを構築した。Ｓ．ドケ、クマモト・メデイカ
ル・ジヤーナル（Ｋumamoto Ｍedical Ｊournal），３
４，１３６０〜１３７３（１９６０）。同定されたＬ１
−シヤトル・ファスミドのすべてはＭ．スメグマチスを
溶原化する能力を有する。Ｌ１はＭ．スメグマチスの染
色体物質中に組込まれ且つ安定な溶原（lysogen）を形
成することが示された。他のフアージ例えばＬ３（ＡＴ
ＣＣ２７２００号）、即ちプラスミドとして残るフアー
ジ（染色体外性）及びＬ５（ＡＴＣＣ２７２０１号）も
シヤトル・ファスミドの構築に使用することができる。
結果は、これらのシヤトル・ファスミドがＭ．スメグマ
チスを溶原化するであろうということを示し、斯くして
外来のＤＮＡを初めてミコバクテリアに安定に組込むこ
とを可能にした。大腸菌におけるＴＭ４−シヤトル・フ
ァスミドに対して上述したように、ｐｈＡＥ１５と表示
されるＬ１−シヤトル・ファスミドの独特なＥｃｏＲＩ
部位にａｐｈ遺伝子をクローン化した。Ｍ．スメグマチ
ス細胞（ｍｃ2６）を、カナマイシンを含むデユボス寒
天プレート上の寒天の表面に上塗りした。シヤトル・フ
ァスミドｐｈＡＥ１５及びｐｈＡＥ１９（クローンａｐ
ｈ遺伝子を有するｐｈＡＥ１５）の希釈物を寒天ローン
上にスポツトした。プレートを３７℃で５日間培養し
た。生長したコロニーはすべてが、ａｐｈ遺伝子をクロ
ーン化したＬ１−シヤトル・プラスミドで溶原化した。
得られるシヤトル・ファスミドｐｈＡＥ１９はＭ．スメ
グマチス細胞を溶原化することができた。得られる溶原
は、それらがカナマイシンに耐性であるからクローン化
されたａｐｈ遺伝子を発現した。更にこれらの溶原は、
カナマイシン耐性Ｍ．スメグマチス細胞の続く転写及び
溶原化時にカナマイシン耐性発現型も発現するミコバク
テリオフアージ粒子を生成した。これらのフアージの転
写は、溶原性状態［即ちスーパーインフエクシヨン（su
perinfection）に対する免疫］及びカナマイシン耐性を
一緒に形質導入する。Ｍ．スメグマチスを溶原化するた
めに使用されるフアージＬ１フアージはＢＣＧ上でプラ
ークを形成しない。しかしながらＢＣＧ上でプラークを
形成するＬ１及びシヤトル・ファスミドｐｈＡＥ１９の
変種が単離された。これらは溶原性シヤトル・ファスミ
ドを用いることにより、ＢＣＧ及び結核菌において異質
の遺伝子を導入し且つそれを安定に発現する能力に関し
て試験することができる。斯くしてこれらのフアージは
異質のＤＮＡをＭ．スメグマチス中に安定に導入する能
力を有する。更にＢＣＧを感染し且つ溶原化するであろ
う宿主範囲の変種（例えばｐｈＡＥ１９）が単離され
た。これは問題のＤＮＡを含有する組換えミコバクテリ
アを生成せしめることを可能にした。そのような組換え
ミコバクテリアはワクチンとして使用することができ
る。
ことによるミコバクテリア中の選別しうるマーカーの安
定な発現 ＴＭ４フアージに対して構築したものと同様の方法で、
フアージＬ１（ＡＴＣＣ２７１９９号）からシヤトル・
ファスミドを構築した。Ｓ．ドケ、クマモト・メデイカ
ル・ジヤーナル（Ｋumamoto Ｍedical Ｊournal），３
４，１３６０〜１３７３（１９６０）。同定されたＬ１
−シヤトル・ファスミドのすべてはＭ．スメグマチスを
溶原化する能力を有する。Ｌ１はＭ．スメグマチスの染
色体物質中に組込まれ且つ安定な溶原（lysogen）を形
成することが示された。他のフアージ例えばＬ３（ＡＴ
ＣＣ２７２００号）、即ちプラスミドとして残るフアー
ジ（染色体外性）及びＬ５（ＡＴＣＣ２７２０１号）も
シヤトル・ファスミドの構築に使用することができる。
結果は、これらのシヤトル・ファスミドがＭ．スメグマ
チスを溶原化するであろうということを示し、斯くして
外来のＤＮＡを初めてミコバクテリアに安定に組込むこ
とを可能にした。大腸菌におけるＴＭ４−シヤトル・フ
ァスミドに対して上述したように、ｐｈＡＥ１５と表示
されるＬ１−シヤトル・ファスミドの独特なＥｃｏＲＩ
部位にａｐｈ遺伝子をクローン化した。Ｍ．スメグマチ
ス細胞（ｍｃ2６）を、カナマイシンを含むデユボス寒
天プレート上の寒天の表面に上塗りした。シヤトル・フ
ァスミドｐｈＡＥ１５及びｐｈＡＥ１９（クローンａｐ
ｈ遺伝子を有するｐｈＡＥ１５）の希釈物を寒天ローン
上にスポツトした。プレートを３７℃で５日間培養し
た。生長したコロニーはすべてが、ａｐｈ遺伝子をクロ
ーン化したＬ１−シヤトル・プラスミドで溶原化した。
得られるシヤトル・ファスミドｐｈＡＥ１９はＭ．スメ
グマチス細胞を溶原化することができた。得られる溶原
は、それらがカナマイシンに耐性であるからクローン化
されたａｐｈ遺伝子を発現した。更にこれらの溶原は、
カナマイシン耐性Ｍ．スメグマチス細胞の続く転写及び
溶原化時にカナマイシン耐性発現型も発現するミコバク
テリオフアージ粒子を生成した。これらのフアージの転
写は、溶原性状態［即ちスーパーインフエクシヨン（su
perinfection）に対する免疫］及びカナマイシン耐性を
一緒に形質導入する。Ｍ．スメグマチスを溶原化するた
めに使用されるフアージＬ１フアージはＢＣＧ上でプラ
ークを形成しない。しかしながらＢＣＧ上でプラークを
形成するＬ１及びシヤトル・ファスミドｐｈＡＥ１９の
変種が単離された。これらは溶原性シヤトル・ファスミ
ドを用いることにより、ＢＣＧ及び結核菌において異質
の遺伝子を導入し且つそれを安定に発現する能力に関し
て試験することができる。斯くしてこれらのフアージは
異質のＤＮＡをＭ．スメグマチス中に安定に導入する能
力を有する。更にＢＣＧを感染し且つ溶原化するであろ
う宿主範囲の変種（例えばｐｈＡＥ１９）が単離され
た。これは問題のＤＮＡを含有する組換えミコバクテリ
アを生成せしめることを可能にした。そのような組換え
ミコバクテリアはワクチンとして使用することができ
る。
【図１】ミコバクテリウム・スメグマチスのスフエロプ
ラストの、ミコバクテリオフアージＤ２９ＤＮＡでのト
ランスフエクシヨンの結果生じる細胞集団の状態を示す
図面に代わる写真である。
ラストの、ミコバクテリオフアージＤ２９ＤＮＡでのト
ランスフエクシヨンの結果生じる細胞集団の状態を示す
図面に代わる写真である。
【図２】シヤトル・ファスミドphＡＥ１の製造の概略図
である。
である。
【図３】ＫpnＩで消化されたミコバクテリオフアージＴ
Ｍ４ＤＮＡ及びシヤトル・ファスミドphＡＥ１ＤＮＡ
の、エチジウム・ブロマイドで染色した０.７％アガロ
ースゲル（パネルＡ）及びpＨＣ７９をプローブとして
用いることによるファスミドphＡＥ１のサザーン・ブロ
ット（Ｓouthern blot）分析（パネルＢ）結果を示す
図面に代わる写真である。
Ｍ４ＤＮＡ及びシヤトル・ファスミドphＡＥ１ＤＮＡ
の、エチジウム・ブロマイドで染色した０.７％アガロ
ースゲル（パネルＡ）及びpＨＣ７９をプローブとして
用いることによるファスミドphＡＥ１のサザーン・ブロ
ット（Ｓouthern blot）分析（パネルＢ）結果を示す
図面に代わる写真である。
【図４】phＡＥ１のＢＣＧ上での複製を示す。これは、
他のミコバクテリア上でなくて結核菌及びＢＣＧ上での
プラーク（plaque）に対して公知のミコバクテリオフア
ージであるＤＳ６Ａ；Ｍ.スメグマチス上であってＢＣ
Ｇでないプラークに対して公知のフアージ３３Ｄ；及び
両種のプラークに対して公知のフアージＴＭ４によるＢ
ＣＧのグラクソ（Ｇlaxo）ワクチン種の細胞溶解状態、
およびそれらの溶解物のコスミドＤＮＡの存在を示すオ
ートラジオグティーの結果を示す図面に代わる写真、な
らびにファージ粒子の形態を示す図面に代わる電子顕微
鏡写真である。
他のミコバクテリア上でなくて結核菌及びＢＣＧ上での
プラーク（plaque）に対して公知のミコバクテリオフア
ージであるＤＳ６Ａ；Ｍ.スメグマチス上であってＢＣ
Ｇでないプラークに対して公知のフアージ３３Ｄ；及び
両種のプラークに対して公知のフアージＴＭ４によるＢ
ＣＧのグラクソ（Ｇlaxo）ワクチン種の細胞溶解状態、
およびそれらの溶解物のコスミドＤＮＡの存在を示すオ
ートラジオグティーの結果を示す図面に代わる写真、な
らびにファージ粒子の形態を示す図面に代わる電子顕微
鏡写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:32） (72)発明者 ウイリアム・アール・ジエイコブズ・ジユ ニア アメリカ合衆国ニユーヨーク州10462ブロ ンクス・ポールデイングアベニユー2031 (72)発明者 リチヤード・エイ・ヤング アメリカ合衆国マサチユセツツ州01890ウ インチエスター・サセツクスロード11
Claims (5)
- 【請求項１】 少くとも１つの蛋白質抗原をコードする
外来ＤＮＡを発現する培養しうる組換えミコバクテリア
を含んでなるワクチン。 - 【請求項２】 培養しうる組換えミコバクテリウムがミ
コバクテリウム・ボビス‐ＢＣＧ、Ｍ.スメグマチス又
はその遺伝学的変種である請求項１記載のワクチン。 - 【請求項３】 適当な担体を更に含んでなる請求項１記
載のワクチン。 - 【請求項４】 哺乳動物宿主に、１つ又はそれ以上の病
原体のそれぞれに対する少くとも１つの蛋白質抗原をコ
ードする外来ＤＮＡが導入されている組換えバクテリウ
ムを投与することを含んでなる該宿主を該病原体に対し
て免疫化する方法。 - 【請求項５】 １つ又はそれ以上の病原体のそれぞれに
対する少くとも１つの蛋白質抗原をコードする外来ＤＮ
Ａを、ミコバクテリウム・ボビス‐ＢＣＧ中に導入する
ことを含んでなる哺乳動物宿主の該病原体に対する免疫
化のためのワクチンの作製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2045187A | 1987-03-02 | 1987-03-02 | |
| US020451 | 1987-03-02 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63502787A Division JP3011939B2 (ja) | 1987-03-02 | 1988-02-29 | 組換えミコバクテリア・ワクチン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11335296A true JPH11335296A (ja) | 1999-12-07 |
Family
ID=21798698
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63502787A Expired - Fee Related JP3011939B2 (ja) | 1987-03-02 | 1988-02-29 | 組換えミコバクテリア・ワクチン |
| JP11077706A Pending JPH11335296A (ja) | 1987-03-02 | 1999-03-23 | 組換えミコバクテリアのワクチン |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63502787A Expired - Fee Related JP3011939B2 (ja) | 1987-03-02 | 1988-02-29 | 組換えミコバクテリア・ワクチン |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0681026A1 (ja) |
| JP (2) | JP3011939B2 (ja) |
| AT (1) | ATE132195T1 (ja) |
| CA (1) | CA1336270C (ja) |
| DE (1) | DE3854840D1 (ja) |
| WO (1) | WO1988006626A1 (ja) |
Families Citing this family (55)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5504005A (en) * | 1987-03-02 | 1996-04-02 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Recombinant mycobacterial vaccine |
| US5807723A (en) * | 1987-03-02 | 1998-09-15 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Homologously recombinant slow growing mycobacteria and uses therefor |
| EP0486495A1 (en) * | 1989-03-08 | 1992-05-27 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Expression system for actinomycetes and related organisms |
| JP2903414B2 (ja) * | 1989-05-31 | 1999-06-07 | 味の素株式会社 | 抗酸菌分泌発現ベクター及び抗酸菌 |
| EP0400973B1 (en) * | 1989-05-31 | 1996-07-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Mycobacterial secretory expression vectors and transformants |
| DE69034100T2 (de) * | 1989-06-19 | 2004-06-09 | Whitehead Institute For Biomedical Research, Cambridge | Verktorvermittelte genominsertion und expression von dna in bcg |
| EP0517751A4 (en) * | 1990-02-26 | 1993-03-31 | Commonwealth Scientific & Industrial Research Organisation ( C.S.I.R.O. ) | Shuttle plasmid for escherichia coli and mycobacteria |
| CA2045842A1 (en) * | 1990-07-16 | 1992-01-17 | William R. Jacobs | Dna capable of site-specific integration into mycobacteria |
| AU2185592A (en) * | 1991-06-06 | 1993-01-08 | Med Immune, Inc. | Induction of ctl responses to foreign antigens expressed in mycobacteria |
| EP0587765A4 (en) * | 1991-06-06 | 1994-11-02 | Medimmune Inc | INDUCTION OF AN IMMUNE REACTION TO TETANUS TOXIN BY ADMINISTRATION OF MYCOBACTERIA EXPRESSING TETANUS TOXIN OR FRAGMENTS THEREOF. |
| US6566121B1 (en) | 1991-06-13 | 2003-05-20 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Insertional mutations in mycobacteria |
| AU2189392A (en) * | 1991-06-13 | 1993-01-12 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Insertional mutations in mycobacteria |
| AU681572B2 (en) * | 1991-10-21 | 1997-09-04 | Med Immune, Inc. | Bacterial expression vectors containing DNA encoding secretion signals of lipoproteins |
| KR100235849B1 (ko) * | 1993-10-19 | 1999-12-15 | 에가시라 구니오 | HIV에 대한 면역응답을 유도할 수 있는 펩티드 및 그 펩티드를 함유하는 항 AIDS 예방, 치료제(Peptides Capable of Inducing Immune Response to HIV and Anti-AIDS Agent for Preventing and Curing AIDS) |
| US7300660B2 (en) | 1993-11-23 | 2007-11-27 | The Regents Of The University Of California | Abundant extracellular products and methods for their production and use |
| ATE407945T1 (de) | 1993-11-23 | 2008-09-15 | Univ California | Reichlich vorhandene extrazelluläre produkte und methoden zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung |
| US6752993B1 (en) | 1993-11-23 | 2004-06-22 | The Regents Of The University Of California | Abundant extracellular product vaccines and methods for their production and use |
| US6013660A (en) * | 1996-10-02 | 2000-01-11 | The Regents Of The University Of California | Externally targeted prophylactic and chemotherapeutic method and agents |
| US6221364B1 (en) * | 1996-11-12 | 2001-04-24 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Recombinant mycobacteria auxotrophic for diaminopimelate |
| US5980898A (en) * | 1996-11-14 | 1999-11-09 | The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command | Adjuvant for transcutaneous immunization |
| US5972700A (en) * | 1997-09-26 | 1999-10-26 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | TM4 conditional shuttle phasmids and uses thereof |
| KR100503438B1 (ko) * | 1998-06-12 | 2005-09-26 | 에스케이케미칼주식회사 | 테레프탈산의 제조방법 |
| US6686339B1 (en) | 1998-08-20 | 2004-02-03 | Aventis Pasteur Limited | Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein C of Chlamydia |
| US6693087B1 (en) | 1998-08-20 | 2004-02-17 | Aventis Pasteur Limited | Nucleic acid molecules encoding POMP91A protein of Chlamydia |
| AU5366099A (en) | 1998-08-20 | 2000-03-14 | Connaught Laboratories Limited | Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein of (chlamydia) |
| US6291190B1 (en) * | 1998-08-25 | 2001-09-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Molecular differences between species of the M. tuberculosis complex |
| ATE391726T1 (de) | 1999-10-22 | 2008-04-15 | Sanofi Pasteur Ltd | Modifiziertes gp100 und dessen verwendung |
| US6471967B1 (en) * | 2000-04-17 | 2002-10-29 | The Regents Of The University Of California | Recombinant intracellular pathogen vaccines and methods for use |
| US6924118B2 (en) | 2000-04-17 | 2005-08-02 | The Regents Of The University Of California | Recombinant intracellular pathogen immunogenic compositions and methods for use |
| EP1792995A3 (en) | 2000-05-08 | 2007-06-13 | Sanofi Pasteur Limited | Chlamydia secretory locus orf and uses thereof |
| EP1741782B1 (en) | 2000-05-10 | 2011-06-22 | Sanofi Pasteur Limited | Immunogenic polypeptides encoded by MAGE minigenes and uses thereof |
| EP1313771B1 (en) | 2000-08-25 | 2007-03-21 | Aventis Pasteur Limited | Haemophilus influenzae lipopolysaccharide inner-core oligosaccharide epitopes as vaccines for the prevention of haemophilus influenzae infections |
| EP1343894A4 (en) | 2000-11-02 | 2005-05-04 | Univ Singapore | AOPB GENE, PROTEIN, HOMOLOGISTS, FRAGMENTS AND VARIANTS THEREOF, AND THE USE THEREOF FOR PRESENTATION ON THE CELL SURFACE |
| US7780961B2 (en) | 2001-05-03 | 2010-08-24 | Actogenix N.V. | Self-containing Lactococcus strain |
| EP1864691B1 (en) | 2002-04-09 | 2011-07-20 | Sanofi Pasteur Limited | Modified CEA nucleic acid and expression vectors |
| ATE389415T1 (de) | 2002-06-19 | 2008-04-15 | Actogenix Nv | Verfahren und mittel zur erhöhung der darmabsorption |
| DK2206514T3 (da) | 2003-10-16 | 2014-04-22 | Univ California | Rekombinante intracellulære patogene immunogene sammensætninger og metoder til anvendelse |
| US8383132B2 (en) | 2003-10-16 | 2013-02-26 | The Regents Of The University Of California | Immunostimulatory recombinant intracellular pathogen immunogenic compositions and methods of use |
| JP5410759B2 (ja) | 2005-11-29 | 2014-02-05 | アクトジェニックス・エヌブイ | 抗原に対する粘膜寛容の誘導 |
| EP2774621B1 (en) | 2007-01-25 | 2018-01-24 | Intrexon Actobiotics NV | Treatment of immune disease by mucosal delivery of antigens |
| MX2011006922A (es) | 2008-12-24 | 2012-06-12 | Netherlands Vaccine Inst | Polipeptidos de neumolisina (ply) modificada a partir de streptococcus pneumonia. |
| WO2012101509A2 (en) | 2011-01-28 | 2012-08-02 | Sanofi Pasteur Sa | Immunological compositions against hiv |
| JP6193231B2 (ja) | 2011-08-08 | 2017-09-06 | チュアラボ オンコロジー, インコーポレーテッドCurelab Oncology, Inc. | がんの治療および予防のための、ｐ６２に関する方法および組成物 |
| EP2895501B1 (en) | 2012-09-17 | 2017-01-18 | Novartis Tiergesundheit AG | Salmonid alphavirus and uses thereof |
| ES2642879T3 (es) | 2012-11-02 | 2017-11-20 | Novartis Tiergesundheit Ag | Flavivirus asociados a la enfermedad de Theiler |
| WO2014140938A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois | Immunological methods |
| SG11201605316VA (en) | 2013-12-29 | 2016-07-28 | Curelab Oncology Inc | Methods and compositions relating to p62/sqstm1 for the treatment and prevention of inflammation-associated diseases |
| EP3177644B1 (en) | 2014-08-05 | 2020-10-07 | Mabquest SA | Immunological reagents binding to pd-1 |
| CN108779168A (zh) | 2015-12-05 | 2018-11-09 | 沃迪奥斯大学医院中心 | Hiv结合剂 |
| EP3405497A2 (en) | 2016-01-22 | 2018-11-28 | Mabquest SA | Immunological reagents |
| KR102217613B1 (ko) * | 2019-05-23 | 2021-02-18 | 이석무 | 데크 난간대 |
| WO2021009697A2 (en) | 2019-07-15 | 2021-01-21 | Lausanne University Hospital | Hiv binding agents |
| TW202206098A (zh) | 2020-08-11 | 2022-02-16 | 美商碩騰服務公司 | 抗冠狀病毒疫苗 |
| CN114315985A (zh) | 2020-09-29 | 2022-04-12 | 硕腾服务有限责任公司 | 减毒猪流行性腹泻病毒 |
| CA3230802A1 (en) | 2021-08-31 | 2023-03-09 | Zoetis Services Llc | Attenuated alphavirus |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US1000787A (en) | 1910-10-06 | 1911-08-15 | Otto H Davidter | Wagon-rack standard. |
| US4603112A (en) | 1981-12-24 | 1986-07-29 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus |
| JPH0734745B2 (ja) * | 1984-10-05 | 1995-04-19 | 味の素株式会社 | 形質導入方法 |
| CA1238591A (en) * | 1984-09-27 | 1988-06-28 | Ramachandra N. Rao | Recombinant dna cosmid shuttle vectors |
-
1988
- 1988-02-29 EP EP95201559A patent/EP0681026A1/en not_active Withdrawn
- 1988-02-29 AT AT88903026T patent/ATE132195T1/de active
- 1988-02-29 EP EP88903026A patent/EP0347425B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-29 WO PCT/US1988/000614 patent/WO1988006626A1/en active IP Right Grant
- 1988-02-29 DE DE3854840T patent/DE3854840D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-29 JP JP63502787A patent/JP3011939B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1988-03-02 CA CA000560339A patent/CA1336270C/en not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-03-23 JP JP11077706A patent/JPH11335296A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02504461A (ja) | 1990-12-20 |
| EP0347425B1 (en) | 1995-12-27 |
| WO1988006626A1 (en) | 1988-09-07 |
| CA1336270C (en) | 1995-07-11 |
| DE3854840D1 (de) | 1996-02-08 |
| EP0347425A1 (en) | 1989-12-27 |
| EP0681026A1 (en) | 1995-11-08 |
| JP3011939B2 (ja) | 2000-02-21 |
| ATE132195T1 (de) | 1996-01-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3011939B2 (ja) | 組換えミコバクテリア・ワクチン | |
| JP3485916B2 (ja) | 組み換えマイコバクテリアの発現ベヒクルおよびその使用 | |
| Lee et al. | Site-specific integration of mycobacteriophage L5: integration-proficient vectors for Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis, and bacille Calmette-Guérin. | |
| AU637969B2 (en) | A method of maintaining a desired recombinant gene in a genetic population of cells | |
| US5773267A (en) | D29 shuttle phasmids and uses thereof | |
| Jacobs Jr et al. | [25] Genetic systems for mycobacteria | |
| EP0478664B1 (en) | Vector-mediated genomic insertion and expression of dna in bcg | |
| US6752994B2 (en) | Insertional mutations in mycobacteria | |
| Jacobs Jr et al. | Development of BCG as a recombinant vaccine vehicle | |
| US5972700A (en) | TM4 conditional shuttle phasmids and uses thereof | |
| EP0972839A1 (en) | Insertional mutations in mycobacteria | |
| US5736367A (en) | Vectors and prokaryotes which autocatalytically delete antibiotic resistance | |
| AU759776C (en) | An over-expressing homologous antigen vaccine and a method of making the same | |
| Seixas et al. | Stable expression of Leptospira interrogans antigens in auxotrophic Mycobacterium bovis BCG | |
| WO1993019603A1 (en) | Prokaryotes including dna encoding bacteriophage immunity | |
| JPH06501847A (ja) | ワクチンベクターとしてのコリネバクテリウム及び関連する生物 | |
| WO1995032277A9 (en) | Insertional mutations in mycobacteria | |
| WO1995032277A1 (en) | Insertional mutations in mycobacteria | |
| JACOBS Jr | Development of BCG As a Recombinant Vaccine Vehicle* WR JACOBS Jr., SB SNAPPER, L. LUGOSI, and BR BLOOM | |
| Barbian | Characterizing the molecular biology of a bacteriophage-like particle from Bartonella bacilliformis |