JPH0734745B2

JPH0734745B2 - 形質導入方法

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Publication number: JPH0734745B2
Application number: JP59209060A
Authority: JP
Inventors: 清志三輪; 孝之輔佐野
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1984-10-05
Filing date: 1984-10-05
Publication date: 1995-04-19
Anticipated expiration: 2010-04-19
Also published as: JPS6188880A

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、コリネホルムグルタミン酸生産性細菌にお
ける目的遺伝子の形質導入法に関する。

コリネホルムグルタミン酸生産菌には大量のＬ−グルタ
ミン酸を生産するもの及び特にその変異株はリジン等の
アミノ酸、イノシン酸等のプリンヌクレオチドを生産す
るものが知られていて工業的に重要な微生物である。最
近、DNA組換え技術による工業微生物の育種・改良が試
みられており、コリネホルムグルタミン酸生産菌につい
ても、組換えDNA技術の開発が進められつつある。例え
ば昭和58年度日本農芸化学会大会講演要旨集333頁（198
3）、昭和58年度日本醗酵工学会大会講演要旨集283頁、
284頁（1983）にそれぞれコリネバクテリウム・グルタ
ミクムの宿主−ベクター系の開発、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムの宿主−ベクター系の開発とス
レオニン生産菌育種の例が報告されている。

しかるに従来知られているコリネホルムグルタミン酸生
産性細菌の宿主−ベクター系においては、いずれもベク
ターとしてプラスミドを用いるものであり、従って、こ
のプラスミドベクターを宿主に移入せしめるためには、
先ずこのプラスミドベクターを分離し、ついでプロトプ
ラスト法、カルシウム処理法などの煩瑣な形質転換手段
が必要である。

ところでエシェリヒアコリにおいてはラムダファージ由
来の付着末端（Cohesive end;Cos）を含むDNA領域をも
つ組換えプラスミドであるいわゆるコスミドが構築され
ている。（Fukumaki,Y.,Shimada,K.,Takagi,Y;Proc.Nat
l.Acad.Sci.,73,3238（1976）,Collins,J.Hohn,B:Proc.
Natl.Acad.Sci,75,4242（1978））このコスミドは、ファージを用いた形質導入法（ここで
は形質導入法はファージを介した遺伝子の移入と定義づ
ける（蛋白質核酸酵素別冊“細菌・ファージ遺伝実験
法"P64（1972））でその保持菌株から容易に別の菌株に
移入せしめることができるのが特長である。即ちコスミ
ド保持株にファージを感染させると一定の割合でコスミ
ドDNAを含む偽ファージ粒子が形成され、この粒子は新
たな宿主菌にコスミドDNAを導入する活性をもつという
ものである。コスミドを用いると、供与菌のファージ溶
菌液を調製後受容菌と混合し、感染させればよく従来の
プラスミドを用いる場合に比べ迅速かつ簡便にプラスミ
ドの移入を達成することができる。

しかしながら、コリネホルムグルタミン酸生産菌におい
ては、このような形質導入できるようなベクターの例は
なく、形質導入法によるプラスミドの移入はできなかっ
た。

本発明者らは叙上のような状況下においてコリネホルム
グルタミン酸生産菌を宿主とするプラスミドとコリネホ
ルムグルタミン酸生産菌を宿主とするファージのDNA断
片をくみ合わせて形質導入可能な複合プラスミドを作成
するのに成功し、このプラスミドを用いててコリネホル
ムグルタミン酸生産性細菌における目的遺伝子の形質導
入法を確立することに成功した。

即ちこの発明は、 A:（１）コリネホルムグルタミン酸生産性細菌の細胞内
で増殖できるプラスミドの少なくとも複製開始点を含む
DNA及び、（２）コリネホルムグルタミン酸生産性細菌
に感染できるファージ由来の付着末端（COS）を含むDNA
よりなる形質導入可能な複合ベクターに目的遺伝子を挿
入して組換えDNAを調製し、 B:同組換えDNAをコリネホルムグルタミン酸生産性細菌
に感染可能なファージの粒子内に取り込ませ、 C:同ファージをコリネホルムグルタミン酸生産性細菌に
感染させることにより上記組換えDNAを同細菌に導入
し、 D:同コリネホルムグルタミン酸生産性細菌細胞内で上記
目的遺伝子を発現させることを特徴とする、コリネホル
ムグルタミン酸生産性細菌における目的遺伝子の形質導
入法である。

この複合プラスミドは、コリネホルムグルタミン酸生産
性細菌細胞に形質導入法により、きわめて簡便迅速に移
入することができ、組換えDNA法による有用菌株の育種
に際しきわめて有利である。

コリネホルム・バクテリアは好気性、グラム陽性桿菌で
あり、非抗酸性でバーヂース・マニュアル・オブ・デタ
ーミネイティブバクテリオロジー第８版599頁（1974）
に記載されている。

本発明のコリネホルム・グルタミン酸生産性細菌はこれ
らのコリネホルム・バクテリアの内に大量のグルタミン
酸を生産するもの又はそれより誘導したグルタミン酸生
産性を失った変異株であり、その野性株の例としては次
のようなものがあげられる。

ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC 1406
6 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC 1406
8 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC 13
869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC 13
870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC 1580
6 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC 15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032,1306
0 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC 17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC 1535
4 コリネホルム・グルタミン酸生産性細菌にはグルタミン
酸生産性を失なった変異株、あるいは、リジン、アルギ
ニン等のアミノ酸、イノシン等のプリンヌクレオチド、
イノシン５′−モノりん酸等のプリンヌクレオチド、又
はその他の生産物を生産する変異株も含まれる。

これらコリネホルムグルタミン酸生産性細菌の細胞内で
増殖できるプラスミドとしては、どのようなものでもよ
く、例えばpAM330,pAM286（特開昭58−67699参照）、pH
M1519（特開昭58−77895参照）、pAJ655,pAJ611,pAJ184
4（特開昭58−192900参照）、pCG1（特開昭57−134500
参照）、pCG2（特開昭58−35197参照）pCG4,pCG11（特
開昭57−183799参照）などがある。

コリネホルムグルタミン酸生産性細菌の細胞内で増殖で
きるファージも又どのようなものでもよく、例えばCP−
2,CP−3,CP−5,CP−７などJ.Gen.Appl.Microbiol.,22 1
19（1976）に記載されているファージ、コリネバクテリ
ウム・グルタミクムを宿主として見出されたφCG1,φCG
2,φCG3,φCG4,φCG5など（日本農芸化学会昭和58年度
大会要旨集P332）“発酵と工業”誌35巻,198頁,294頁,3
92頁,473頁（1977）に記載のファージなどがある。

本発明の複合プラスミドは、上記プラスミドDNAの全部
を複合プラスミドの一部として含んでいてもよいが、少
くとも複製開始点を含んでいる必要がある。また、上記
ファージについてもそのDNAの全部を本発明の複合プラ
スミドの一部として含んでいてもよいが、少くともコリ
ネホルムグルタミン酸生産性細菌がこのファージにより
感染せしめられたとき、ファージ粒子内に取り込まれる
ようなDNA領域を少くとも含んでいる必要がある。この
ようなDNA領域は、本願発明においてはコリネホルムグ
ルタミン酸生産性細菌に感染できるファージ由来の付着
末端（COS）を含むDNAである。

プラスミドDNA及びファージDNAは通常の方法により分離
することができる。ついで、ファージDNA及びプラスミ
ドDNAはそれぞれ制限酵素を用いて切断する。ファージD
NAを切断分画し、コリネホルムグルタミン酸生産性細菌
に感染できるファージ由来の付着末端（COS）を含むDNA
を調製する。λファージDNAの付着端は通常一本鎖相補
性末端になっており、水素結合により付着端同士対合す
るが、加熱急冷操作により容易に離れることが知られて
いる。従って加熱急冷操作前後のDNA断片をアガロース
ゲル電気泳動により解析すれば付着末端を持つDNA断片
を容易に同定しうる。コリネホルムグルタミン酸生産性
細菌に感染できるファージ由来の付着末端（COS）を含
むDNAも、λファージの場合と同様の方法で同定ができ
る。付着末端を持つDNA断片を同定したならばこの断片
を電気泳動後のアガロースゲルより通常の方法で抽出精
製することができる。

かくして得られたファージDNA断片と切断されたプラス
ミドDNAとを連結せしめる方法は、リガーゼを用いる通
常の方法が使用できる。

一方、ターミナルトランスフエラーゼを用いて、ファー
ジDNA断片と開裂したプラスミドDNAとにデオキシアデニ
ル酸とデオキシチミジル酸、または、デオキシグアニル
酸とデオキシシチジル酸をそれぞれ付加し、混合したの
ち、アニーリングして連結せしめる方法も利用しうる。

このようにして得られた、ファージDNAとプラスミドDNA
との連結物のコリネホルムグルタミン酸生産性細菌に属
する受容菌への導入は、エシェリヒア・コリＫ−12につ
いて報告されている様な（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mo
l.Biol.,53.159（1970））受容菌細胞を塩化カルシウム
で処理してDNAの透過性を増す方法、またはバチルス・
ズブチリスについて報告されている様に（Duncan,C.H.,
Wilson,G.A.and Young,F.E.,Gene,１,153（1977））細
胞がDNAを取り込み得る様になる増殖段階（いわゆるコ
ンビテントセル）に導入する方法により可能である。あ
るいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵母に
ついて知られている様に（Chang.S.and Choen,S.N.,Mol
ec.Gen.Genet.,168,111（1979）;Bibb.M.J.,Ward,J.M.a
nd Hopwood.O.A.,Nature,274,398（1978）;Hinnen.A.,H
icks,J.B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75 1
929（1978））、DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に
取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストにして
プラスミドをDNA受容菌に導入することも可能である。

プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスの方
法でも充分高い頻度を得ることができるし、特開昭57−
183799に記載されたコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属のプロトプラストにポリエチレングリコ
ールまたはポリビニルアルコールと二価金属イオンとの
存在下にDNAをとり込ませる方法も当然利用できる。ポ
リエチレングリコールまたはポリビニルアルコールのか
わりに、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、
フイコール、ブルロニックF68（セルバ社）などの添加
によってDNAのとり込みを促進させる方法でも同等の結
果が得られる。

形質導入可能な組換えプラスミドを保有する菌株の選択
は以下の方法で達せられる。形質転換後適当な培地上で
一旦コロニーを形成させたのち、これらのコロニーを混
合して、ファージを感染させて溶菌せしめ、ファージ液
を調製する。これをプラスミドを含まない新たな宿主菌
に感染させたのち、プラスミドが導入された菌株を検索
すればよい。プラスミド上に薬剤耐性遺伝子などが存在
する場合にはこの形質を選択的に用いることができ、容
易に目的のプラスミドを保有する菌株を得ることができ
る。

目的の組換えプラスミドを保有する菌株よりプラスミド
DNAを単離する方法は、例えば菌体をリゾチーム・SDS処
理により溶菌させフェノール処理ののち、２容のエタノ
ールを加ええてDNAを沈澱回収するというような通常の
方法で達せられる。

実施例（１） F₁ファージDNAの調製複合プラスミド造成に用いたファージF₁はブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC13869を宿主菌とし
て新たに分離した。

F₁ファージDNAは以下の方法により調製した。

ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869
を１のCMG培地（ペプトン1g/dl、酵母エキス1g/dl、
グルコース0.5d/dl、及びNaCl0.5d/dlを含み、pH7.2に
調整したもの）に植菌し、30℃で約１時間振盪培養を行
なったのち、F₁ファージを多重感染度（moi）が約0.1に
なるように加え更に５時間振盪培養を継続し、これによ
りファージによる溶菌をおこさせた。溶菌液をハイフロ
スーパーセル（純正化学製）で濾過し菌体残渣を除去
後、濾液にデオキシリボヌクレアーゼＩとリボヌクレア
ーゼＡ（シグマ社製）を各々10μg/ml添加し、この濾液
を30℃に20分間保った。更に濾液にパンクレアチン200
μg/mlを加えて30℃に20分間保った後、塩化ナトリウム
を最終濃度0.5M,ポリエチレングリコール6000を最終濃
度10％になるようにそれぞれ濾液に添加し、ついでこれ
を４℃に１日置き、F₁ファージ粒子を沈澱させた。5000
rpm10分の遠心により沈澱を回収後、１％のSDSを含むTE
N緩衝液（20mMトリス塩酸塩、20mM NaCl,1mM EDTA（pH
8.0））10mlに溶解せしめた。これより通常のフェノー
ル処理法により、F₁ファージDNAを抽出、精製し、最終
的に約5mgのDNAを得た。

（２） F₁ファージ付着末端（COS）を含むDNA断片の調
製 F₁ファージDNA約５μｇを含む緩衝液に制限エンドヌク
レアーゼHind IIIを加えて37℃に２時間保ちDNA鎖を完
全に切断した。反応液の一部をとって70℃に10分間加熱
後急冷し、熱処理を施さない反応液と同時に0.8％のア
ガロースゲル電気泳動にかけた。泳動の結果、Hind III
処理により生じたF₁ファージDNA断片のうち、約2.1kbの
断片が熱処理により約1.6kbと約0.5kbの断片に分離し、
この2.1kb断片中に付着端（COS）が存在することが明ら
かとなった。そこでこの2.1kb断片をアガロースゲルよ
り抽出精製し、DNA約0.4μｇを得た。

（３）プラスミドDNAの調製ベクターとしてpAJ43（ブレビバクテリウム・ラクトフ
ェルメンタムAJ11997（FERM P−6857,FERM BP−591）と
して寄託されている）（分子量3.4メガダルトン）を用
いた。

pAJ655（特開昭58−192900参照）より次のようにしてpA
J43を造成した。

pAJ655を保持するブレビバクテリウム・ラクトフェルメ
ンタムNo.64はクロラムフェニコール100μg/mlを含むCM
G寒天培地（ペプトン10g/、酵母エキス10g/、グル
コース5g/、NaCl5g/、寒天20g/を含みpH7.2に調
製したもの）上で生育不可能であるが、本菌をCMG培地
で培養し、クロラムフェニコール100μg/mlを含むCMG液
体培地に30℃で一晩培養後、同濃度のクロラムフェニコ
ールを含むCMG培地に適当量塗布し30℃１〜２日間培養
することによりクロラムフェニコール100μg/mlに耐性
を示す株を１株得た。本株のクロラムフェニコール耐性
度をCMG培地で調べたところ200μg/mlまで耐性を示し
た。

上記の結果、得られたクロラムフェニコール高濃度耐性
株からpAJ43をDNA次のようにして調製した。まず本株を
クロラムフェニコールを10μg/ml含む１のCMG液体培
地に接種し、30℃で対数増殖期後期まで培養し、集菌し
た。常法によりリゾチームとSDSにより溶菌せしめた
後、30,000×g,30分の超遠心により上清を得た。これに
ポリエチレングリコール（最終濃度10％）を添加してDN
Aを沈澱せしめ、これを濃縮後、沈澱物をトリス・EDTA
・NaClバッファー（pH8.0）10mlに溶解した。DNAをリボ
ヌクレアーゼで処理（リボヌクレアーゼ150μg/mlで37
℃,30分間反応）後、フェノール抽出し、ついで２倍量
のエタノールを加え−20℃でDNAを沈澱させ、沈澱物を1
mlのトリス・EDTA・NaClバッファーに溶解した。このDN
A溶液をアガロースゲル電気泳動法（電圧ゲル1cm当り5
V,15時間）によって最終150μｇの純粋なpAJ43プラスミ
ドDNAを分画採取した。

pAJ43の分子量の決定はアガロースゲル電気泳動によっ
た。

アガロースゲル電気泳動はシャープ（P.A.Sharp）らの
方法（Biochemistry12,3055（1973））により、0.8％ゲ
ルを用い、ゲル長さcm当り、5Vで15時間、定電圧で泳動
した。分子量はpAJ43を１ケ所切断する制限酵素Hind II
I 0.5ユニットをpAJ43,0.5μｇに37℃、１時間反応さ
せ、切断し、直線状にした後、分子量既知の分子量マー
カー、λファージのHind IIIフラグメント（BRLから購
入）との移動度の比較によって算出し、3.4Mdと計算さ
れた。

制限酵素切断後のDNA断片をアガロースゲル電気泳動で
解析した結果、pAJ43はpAJ655からin vivoでdeletionに
より生じたpBR325のクロラムフェニコール耐性遺伝子領
域を含む約1MdとpAM330の複製維持に必須の領域を含む
約2.4Mdのフラグメントから成る小型プラスミドである
ことがが判明した。

（４） F₁ファージCOSを含むDNA断片のベクターへの挿
入（３）で得たプラスミドpAJ43約１μｇを制限エンドヌ
クレアーゼHind IIIで37℃に２時間保ち、完全に切断し
た。65℃,10分間の熱処理後、（２）で得た2.1kbのDNA
断片を加え、ATP及びジチオスレイトール存在下、T₄フ
ァージ由来のDNAリガーゼによって10℃、24時間DNA鎖の
連結反応を行った。反応液に２倍容のエタノールを加え
て連結反応終了後のDNAを沈澱採取した。

得られたDNAを少量のTEN緩衝液に溶解し以下の形質転換
に用いた。

（５）形質転換形質転換の方法としては、プロトプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。受容菌として用いたブレビバ
クテリウムラクトファーメンタムAJ12036（FERM−P755
9,FERM BP−734）はブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムATCC13869株よりスレプトマイシン耐性株とし
て分離した。まず、この受容菌を5mlのCMG液体培地で対
数増殖期の初期まで培養し、培地にペニシリンＧを0.6
ユニット/ml添加後、さらに1.5時間振盪培養し、遠心分
離により菌体を集めた。菌体を0.5Mシュークロース、20
mMマレイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペナッセ
イブロス（Difco）からなるSMMP培地（pH6.5）0.5mlで
洗浄した。次いで10mg/mlのリゾチームを含むSMMP培地
に懸濁し30℃で20時間プロトプラスト化を図った。6000
×ｇ、10分間遠心分離後、プロトプラストをSMMPで洗浄
し、0.5mlのSMMPに再度懸濁した。この様にして得られ
たプロトプラストと（４）で調製したDNA約１μｇを5mM
EDTA存在下で混合し、ポリエチレングリコールを最終
濃度が30％になる様に添加した後、DNAをプロトプラス
トに取り込ませる為に室温に２分間放置した。このプロ
トプラストをSMMP培地1mlで洗浄後、SMMP培地1mlに再懸
濁し、形質発現の為、30℃で２時間培養した。この培養
液をpH7.0のプロトプラスト再生培地上に塗布した。プ
ロトプラスト再生培地は蒸留水１あたりトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン12g、KCl0.5g、グルコース
10g、MgCl₂・6H₂O8.1g、CaCl₂・2H₂O2.2g、ペプトン4
g、粉末酵母エキス4g、カザミノ酸（Difco社）1g、K₂HP
O₄0.2g、コハク酸ナトリウム135g、寒天8g及びクロラム
フェニコール３μg/mlを含む。

30℃で10日間培養後、約1,000個のクロラムフェニコー
ル耐性コロニーが出現してきた。

（６）形質導入これらのコロニーを全部まとめてかきとって生理食塩水
に懸濁し、その一部をF₁ファージ約10⁵と共に２％寒
天、10μg/mlクロラムフェニコールを含むCMG培地平板
１枚に塗布し、30℃にて１日間培養した。平板上でF₁フ
ァージによる溶菌現象が確認されたので5mlの生理食塩
水を平板上に加えファージ粒子を懸濁した。15000rpm.1
0分間の遠心により菌体残渣を除去後、除菌フィルター
（ポアサイズ0.22μ）を通して生菌を除いた。

ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12036の
対数増殖期の菌体約10⁹に対し上記のファージ液0.1mlを
加え、30℃で90分ゆるやかに振盪し、3000rpm、10分間
遠心にて、菌体を回収し、これを２回生理食塩水で洗浄
した。洗浄菌体を、２％寒天及び10μg/mlクロラムフェ
ニコールを含むCMG培地平板に塗布した。30℃で２日培
養すると３コロニーが生じた。これらの３株をそれぞれ
生理食塩水に懸濁後、上記と同様にF₁ファージとともに
寒天平板上で培養してファージ液を調製しAJ12036株へ
の形質導入を行なった。

その結果ベクターのpAJ43を保持する菌株より得たファ
ージ液には形質導入能は全く検出されないが上記の３株
ではいずれから調製したファージ液によっても高頻度に
クロラムフェニコール耐性コロニーが生じこのうちAJ12
136（FERM−P7560,FERM BP−735）より得たファージ約1
0⁷を受容菌AJ12036株約10⁹に感染させた場合には約10³
のクロラムフェニコール耐性コロニーが生じた。これら
の耐性コロニー及びAJ12136株からは約4.8Mdのプラスミ
ドが検出され、このプラスミドがベクターのpAJ43（3.4
Md）とF₁ファージのCos部位を含むDNA断片（1.4Md）と
からなり、形質導入可能なコスミドであることは明らか
である。AJ12136株より見出されたコスミドをpAJ667と
名付けた。AJ12136より得たファージ液を用いコリネバ
クテリウム・グルタミクムATCC13060株へのpAJ667の導
入をはかった。

約10⁹ファージ粒子を用いた時、49コのクロラムフェニ
コール耐性株が得られた。これからはいずれも4.8メガ
ダルトンのpAJ667プラスミドDNAが検出された形質導入
によりpAJ667がコリネバクテリウム・グルタミクムATCC
13060株にも導入されたのは明らかである。

なお、プラスミドベクターとしてpAJ1844（特開昭58−1
92900参照）、ファージにCP−23ファージ（J.Gen.Appl.
Microbiol.,22 119（1976）参照）を用いた場合にも同
様にして形質導入可能な組換えプラスミドpAJ668が得ら
れる。

本発明に用いいたF₁ファージはAJ12136株に溶原化して
おり、自然誘発またはマイトマイシンＣを0.05〜0.2μg
/mlを含むCMG液体培地中で振盪培養することにより、培
地中に放出されてくる。これを例えばブレバクテリウム
・ラクトファーメンタムATCC13869株に感染させれば容
易に高い収量でファージ粒子が得られる。pAJ43を含む
菌株ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ1199
7は（FERM P−6857,FERMBP−591）として寄託されてい
る。

実施例２（１） PuC4K由来カナマイシン耐性遺伝子を含むDNA断
片の調製 pUC4K（ファルマシア社製、Gene,19 259（1982））５μ
ｇを制限エンドヌクレアーゼBamHIで37℃、２時間保
ち、完全に切断後、0.8％のアガロースゲル電気泳動に
かけた。泳動の結果BamH I処理により生じた約1.3kb断
片中にカナマイシン耐性遺伝子が存在することは明らか
であり、この1.3kb断片をアガロースゲル抽出精製し、D
NA約0.5μｇを得た。

（２）カナマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片コスミ
ドpAJ667への挿入実施例１の（３）で述べた方法により調製したコスミド
pAJ667（第１図に制限酵素切断地図を示した）約１μｇ
を制限エンドヌクレアーゼBamHIで37℃に２時間保ち、
完全に切断した。65℃、10分間の熱処理後、（１）で得
た1.3kbのDNA断片を加え、ATP及びジチオスレイトール
存在下、T₄ファージ由来のDNAリガーゼによって10℃、2
4時間DNA鎖の連結反応を行った。反応液に２倍容のエタ
ノールを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱採取した。

（３）形質転換形質転換の方法としては、プロトプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。受容菌として用いたブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムAJ12036（FERM P−7
559,FERM BP−734）はブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムATCC13869株よりストレプトマイシン耐性株
として分離した。まず、この受容菌を5mlのCMG液体培地
で対数増殖期の初期まで培養し、培地にペニシリンＧを
0.6ユニット/ml添加後、さらに1.5時間振盪培養し、遠
心分離により菌体を集めた。菌体を0.5Mシュークロー
ス、20mMマレイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペ
ナッセイブロス（Difco）からなるSMMP培地（pH6.5）0.
5mlで洗浄した。次いで10mg/mlのリゾチームを含むSMMP
培地に懸濁し30℃で20時間プロトプラスト化を図った。
6000×ｇ、10分間遠心分離後、プロトプラストをSMMPで
洗浄し、0.5mlのSMMPに再度懸濁した。この様にして得
られたプロトプラストと（２）で調製したDNA約１μｇ
を5mM EDTA存在下で混合し、ポリエチレングリコールを
最終濃度が30％になる様に添加した後、DNAをプロトプ
ラストに取り込ませる為に室温に２分間放置した。この
プロトプラストをSMMP培地1mlで洗浄後、SMMP培地1mlに
再懸濁し、形質発現の為、30℃で２時間培養した。この
培養液をpH7.0のプロトプラスト再生培地上に塗布し
た。プロトプラスト再生培地は蒸留水１あたりトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン12g、KCl0.5g、グル
コース10g、MgCl₂・6H₂O8.1g、CaCl₂・2H₂O2.2g、ペプ
トン4g、粉末酵母エキス4g、カザミノ酸（Difco社）1
g、K₂HPO₄0.2g、コハク酸ナトリウム135g、寒天8g及び
カナマイシン100μg/mlを含む。

30℃で６日間培養後、約30個のカナマイシン耐性コロニ
ーが出現してきた。その中からカナマイシン25μg/mlを
含むCMG寒天培地（ペプトン10g/、酵母エキス10g/
、グルコース5g/、NaCl5g/、寒天20g/を含みpH
7.2に調整したもの）上で生育した１株、即ちAJ12173
（FERM P−7885,FERM BP−743）からは約5.7Mdのプラス
ミドが検出された。このプラスミドがベクターのpAJ667
（4.8Md）とpUC4K由来カナマイシン耐性遺伝子を含むDN
A断片0.9Mdとからなることは、制限エンドヌクレアーゼ
BamHIで37℃、２時間反応させ、分子量既知の分子量マ
ーカー、λファージのHind IIIフラグメント（BRLから
購入）との移動度の比較により確認した。AJ12173株よ
り見出されたこのプラスミドをpAJ670と名づけた。第１
図にpAJ670の制限酵素切断地図を示した。

（４）形質導入 pAJ670を保持するAJ12173の対数増殖期の菌体約10⁸をF₁
ファージ約10⁵と共に２％寒天、25μg/mlカナマイシン
を含むCMG培地平板１枚に塗布し、30℃にて１日間培養
した。平板上でF₁ファージによる溶菌現象が確認された
ので5mlの生理食塩水を平板上に加えファージ粒子を懸
濁した。15000rpm,10分間の遠心により菌体残渣を除去
後、除菌フィルター（ポアサイズ0.22μ）を通して生菌
を除いた。

ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12036の
対数増殖期の菌体約10⁹に対し上記のファージ液0.1ml
（10⁶pfu）を加え、30℃で90分ゆるやかに振盪し、3000
rpm、10分間遠心にて、菌体を回収し、これを２回生理
食塩水で洗浄した。洗浄菌体を２％寒天及び25μg/mlカ
ナマイシンを含むCMG培地平板に塗布した。30℃で２日
培養すると約10³カナマイシン耐性コロニーが生じた。
これらの耐性コロニーからは約5.7MdのプラスミドpAJ67
0が検出され形質導入によりpAJ670がAJ12036株に導入さ
れたのは明らかである。（なお、pAJ670の形質導入頻度
はpAJ667と同じオーダーであった。）本発明に用いたF₁ファージはAJ12173株に溶原化してお
り、自然誘発またはマイトマイシンＣを0.05〜0.2μg/m
lを含むCMG液体培地中で振盪培養することにより、培地
中に放出されている。これを例えばブレバクテリウム・
ラクトファーメンタムATCC13869株に感染させれば容易
に高い収量でファージ粒子が得られる。pAJ667を含む菌
株ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12136
はFERM−P7560,FERM BP−735として寄託されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、複合プラスミドpAJ667及びpAJ670の制限酵素
切断地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:15）Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｒ 1:15）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】A:（１）コリネホルムグルタミン酸生産性
細菌の細胞内で増殖できるプラスミドの少なくとも複製
開始点を含むDNA及び、（２）コリネホルムグルタミン
酸生産性細菌に感染できるファージ由来の付着末端（CO
S）を含むDNAよりなる形質導入可能な複合ベクターに目
的遺伝子を挿入して組換えDNAを調製し、 B:同組換えDNAをコリネホルムグルタミン酸生産性細菌
に感染可能なファージの粒子内に取り込ませ、 C:同ファージをコリネホルムグルタミン酸生産性細菌に
感染させることにより上記組換えDNAを同細菌に導入
し、 D:同コリネホルムグルタミン酸生産性細菌細胞内で上記
目的遺伝子を発現させることを特徴とする、コリネホル
ムグルタミン酸生産性細菌における目的遺伝子の形質導
入法。