JPH06501847A - ワクチンベクターとしてのコリネバクテリウム及び関連する生物 - Google Patents
ワクチンベクターとしてのコリネバクテリウム及び関連する生物Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ワクチンベクターとしてのコリネバクテリウム及び関連する生物本発明2よ、ワ
クチンベクターとしてのコリネバクテリウム及び関連する生物及び/又は変異体
又はそれらの誘導体の使用に一般的にであり、これは°“チーズ譬の腺(che
esy gland) ’”として通常知られている乾酪性リンパ節炎(CLA
)の原因物質である。この疾病は主に羊及びヤギに影響を及ぼすだけでなく、ま
たウマも影響を及ぼす。
C,プソイドッベルキュロシスの主なビルレンス因子は、ホスホリパーゼD(P
LD)と呼ばれる31KDaO外毒素であると思われる。羊は、C,プソイドッ
へルキュロシス培養上清液のホルマリン処理沈殿物による免疫化により又は純粋
なPLDのトキソイド形を用いることによってCLAから保護され得る。
本発明また導びく研究においては、コリネバクテリア及び関連する生物群のピル
レントメンハーに対して保護免疫応答を刺激できるワクチンベクターを生成する
ために前記生物群に関連するアジュバント性質を利用することが研究された。こ
れは、選択された種からのビルレンス遺伝子を欠失することによって、又は適切
な抗原性材料、たとえば&[1換えトキソイドを発現するように操作された非病
原性又は無毒性種を用いることによって達成される。
従って、本発明の1つの観点は、活性ビルレンス因子を発現できない、又は病原
性生物から免疫保護有効量の抗原を合成するコリネバクテリウム又は関連する生
物を含んで成るワクチンベクターに関する。
用語“ワクチンベクター”は、抗原表示のための生物学的手段を包含するように
その最大の範囲で使用される。その生物学的手段シよ便利には微生物であり、そ
して一般的には生存性であるが、但し死−んだ生物も使用され得る。生物学的ベ
クターは、非病原性であり、又は無毒性にされ、又は非病原性又は無毒性有効量
で与えられる。
“抗原表示”とは、天然に存在する抗原の表示及び/又は抗原又:よその抗原性
部分をコードする遺伝子を担持するプラスミドにより生物学的ベクターを形質転
換し、そして次に発現されるような組換え抗原の発現を意味し;又は染色体及び
/又はいづれか天然に存在する又は天然に存在しない染色体外要素を包含する、
プラスミド及び/又は遺伝子及び/又はそれらの一部が宿主ゲノム中に組込まれ
る場合、それらの遺伝子又はそれらの一部が発見される。他方、生物学的ベクタ
ーは、抗原、たとえばビルレンス因子の発現を妨ぎ又は滅しるように、又は抗原
又はその一部の変更された、及び非毒性形を生成するように操作される。この場
合、生物学的ベクターは、非ビルレンス又は非病原性有効量で他の非毒性抗原又
:よ毒性抗原を表わす、いづれにしても、細胞又は遺伝子又はその両者は、抗原
が十分な量で分泌されることを確保するようにさらに操作される必要がある。1
つのIJ欅において、発現された抗原は組換え体であり、そしてそれがビルレン
ス因子自体である場合、その組換え抗原がまた、解毒されるであろう。
本発明は、現時点まで、本発明の最良のH様を供給するPLI)をコードする遺
伝子における欠失を担持するC、プソイドツへルキュロヱスをワクチンベクター
として使用することを記載する。しかしながら、当業者は、他の種の旦ユ」バク
テリウム及び他の関連する生物、たとえばブレビバクテリウム(Breviba
cterium)種への本発明の適用能力を容易に認めるであろう。さらに、本
発明は、ビルレンス遺伝子の不活性化をもたらし、又は生成物の無毒性形、たと
えば不活性毒素をもたらす、そのビルレンス遺伝子におけるいづれか1つの又は
複数のヌクレオチドの置換、付加及び/又は欠失にも拡張する。
本発明によれば、C,ブソイドツベルキュロシスのワクチンベクターは、本明細
書の例に記載されるように、組換え技法を用いてビルレント株からPLO遺伝子
を遺伝的に破壊することによって得られた。しかしながら、他の技法、たとえば
化学的又は放射線的に誘発された変異誘発がまた、本発明の範囲内で使用され得
る。
手短に言及すれば、PLO遺伝子が、欠失及びその遺伝子内に挿入される耐エリ
スロマイシン性遺伝子により破壊される。これは、シャトルベクター、たとえば
耐カナマイシン性決定基を担持するpapヘクターに基づいてビルレントC,ブ
ソイドツベルキュロシス中に移された(オーストラリア特許出願第PJ881S
/90号を参照のこと)。
次に、種々の耐抗生物質性マーカーを担持する種々のpEPベクターがまた細菌
中に導入され、そして第2プラスミドのために選択が適用される。これは、染色
体PLO遺伝子中への欠失された遺伝子の組換えを促進し、従って前記株に耐エ
リスロマイシン性を付与し、そしてPLO生成を排除する。第29EPプラスミ
ドについての選択は、変異体PLOを担持する第1プラスミドの維持に対して作
用する。第1プラスミドは失なわれるが、しかし多くの場合、染色体に対する変
異体PLO及び耐エリスロマイシン性遺伝子の組換えが生したであろう。PLD
は血液プレート上で清澄化を仲介するので、耐カナマイシン性の付随する損失及
び耐エリスロマイシン性の維持による清澄表現型の損失は、C,ブソイドツへル
キュロシスの染色体中への欠失された遺伝子の組込みを示す。
シュハント性質及びビルレント株を無毒性にすることの組合された効果は、ワク
チンベクターを、ビルレント生物に対して免疫保護効果量の抗体及び/又は他の
免疫保護因子(細胞を包含する)を刺激できる特に可能性あるワクチンベクター
にする。
従って、本発明のこの観点1ま、PLOをコードする遺伝子に8’rする単−又
は複数のヌクレオチドの1換、付加及び/又は欠失を担持する、−q2ニηソイ
トツへ、!ヒ乞s O’/ Xを含んで成るワクチン−、フタ−に関する。PL
D遺伝子における置換、付加及び/又は欠失は、その遺伝子の発現を阻止し、す
なυち活性PLDの合成を阻止し又は合成されるPLDの非ビルレントを動量の
みをもたらすため5二効果的であるべきである。ワクチンは一般的に、生物の生
物学的純粋な配合物から成り、そしてさらに、意図される受容体及び投与の態様
シこ依存して1又は複数の医薬的に許容できるキャリヤー及び/又は希釈剤を含
むことができる。
本発明のもう1つの観点:よ、CLAに対して家畜動物をワクチン化するための
方法及び/′又t: −C、ブソイドツへルキエロンスニこより感染された動物
の処理方法に閲5、ここで前記処理方法はPLDをコート−rる遺伝子に8ける
単一の又:よ複数のヌクレオチドの置換、付加及び/又は欠失を担持する、C,
プソイドンヘル午s O’/ Zの誘導体の免疫保護量を前記動物シこ、現在の
又巳よ続<C,プソイドノへルキュロンス!染に対して動物を免疫応答性にする
のに十分な時間及び条件下で投与することを含んで成る。投与は、いづれか適切
な経路、たとえば経口又は静脈内投与により行なわれ得る。製剤はまた、乾燥形
又は液体形で存在できる。選択された投与路はまた、追加の成分、たとえばプロ
テアーゼインヒヒ゛ター及び同様のものを必要とすることもできる。
本発明のさろにもう1つの観点においては、非活性又はトキソイドPLDの生成
方法が提供され、ここで前記方法は、PLOをコードする遺伝子における単一の
又は複数のヌクレオチドの置換、付加及び/又は欠失を担持するC プ゛イ゛ツ
ヘルキュロシスを培養し、そして前記遺伝子の発現により生成される非活性又は
トキソイド化PLOを回収することを含んで成る。この方法により生成される非
活性又はトキソイド化されたPLOはたとえば、C,プソイドツベルキュロヱス
に対して保護免疫応答を刺激するためのワクチンにおいて活性免疫原として使用
され得る。
他の生物への本発明の疾病処理としての通用能力は容易に同定できる。たとえぽ
、ビルレント因子、たとえばPLOをコードする遺伝子が、トキソイドをコード
するために1又は複数の挿入、欠失及び/又は置換変異によりインビトロ又はイ
ンビボで変異誘発され、そして次に、ワクチンベクターを生成するために適切な
コリネハクテぶバクテリウム又は関連する生物において欠失され又は他方、破壊
され得る。すべてのそのような聾様は本発明の範囲内に包含される。
本発明は次の非制限的な図面及び例への参照によりさらに記載される。
図1は、部位特異的組換えプラスミドの図的な表示である。PLD遺伝子は、P
EP2のPst1部位中に、1.5kbのSac lフラグメントとしてサブク
ローン化された0次に耐エリスロマイシン性遺伝子がPLO遺伝子のpst1部
位中にt、7kbの…ndl[フラグメントとしてクローン化され、それによっ
て欠失が創造された。
図2は、C,プソイドッへルキュロシスPLO遺伝子の変異誘発を示す写真表示
である。野生型のC,プソイドツベルキュロンスが部位特異的組換え法を用いて
変異誘発された。細胞は羊の血液プレート上にプレートされた。 90%以上の
変異誘発された細胞が、赤血球の溶解を引き起こすのに失敗し、このことは、P
LO遺伝子が不活性化されたことを示唆する。
図3(A)及び(B)は、C,ブソイドツへルキュロシス変異体のサザンブロノ
ト分析を示す写真表示である。パネルA、5acl消化されたゲノムDNAはP
LD特異的プローブとハイブリダイズした。
レーン:A、野生型C,ブソイドツベルキュロンス株231;B、&li換えプ
ラスミドpBT858を含む株231;C,変異体1;D、変異体2;E、変異
体3;F、レーンBと同じであるが、巳かしDNA消化されていない一〇、変異
誘発の後、PLO活性を保持するC、ブソイドツベルキュロシスからのDNA、
高分子量及びヤギハンドはたぶん、一部消化された材料である。パネルB、パネ
ルAと同しであるが、しかしフィルターはエリスロマイシン遺伝子持異的プロー
ブとハイブリダイズした。レーンA及びBにおける2、0kbのPLD遺伝子S
ac 1フラグメントの不在を注目すること。
図3 (C)は、C,プソイドッへルキュロシスホスホリバーゼD遺伝子の5′
及び3′領域のヌクレオチド配列を示す口約な表示である。四角で囲まれた領域
は、公開された配列とのオーハーラ、プを示し、 5TOP下の点は、推定上の
翻訳ターミネーターを示し;逆にされた矢印は転写ターミネータ−ステムを示し
、そして点線はループ(L)構造(13,6kcal)を示す。
図4は、C,ブソイドツへルキュロンスのPLO産生性株及びトキノマイナス(
Tox慣1nus )株により注射された羊のT細胞応答のグラフである。
図5は、C,プソイドッへルキエロンストキシマイナス株の種々の用量により羊
を予防接種することでの血清学的応答のグラフである。
チリウム耐エリスロマイシン性遺伝子のptlc11Bクローン(Hodgso
n屋発表のために提供された)のための宿主であった。PLO産生のためのCプ
ソイドツへルキュロシス野生型株はDr、Doug Burrell(CSIR
ODivision of Animal Health、 Arm1dale
、 N!J)から得られた。三Σコーカス イクイ(Rhodococcus
e ui)株CC50は、Dr、Keith Hughes(Melbourn
e University、Depart@ent of Veterinar
g 5cience。
Werribee )からの送り吻であった。
培地。形質転換された旦−ユ悲は、必要な場合、1ml当たり50ggのアンピ
シリン(Sigma) 、50ggのカナマイシンスルフェート(Boehri
nger Mannheia+)、100μgのエリスロマイシン(Boehr
ingerMannheim)又は150.crgのハイグロマイシンB (S
igma)を含むLuriaブイヨン(LB:11当たり10gのトリプトン、
5gの酵母抽出物、10gのNaCl )において増殖された。C,プソイドッ
ペルキュロシスの細胞は、0.1%(v / v )のTween80 (BH
I)を含む脳心臓インフュージョン培地(Dirco)において37℃で培養さ
れた。形質転換された細胞は、1ml当たり50ggのカナマイシン、150g
gのハイグロマイシンB又は100μgのエリスロマイシンにより補充されたB
HI上で選択された。推定上のCプソイドッペルキュロシス変異体は、1ml当
たり1100nのエリスロマイシン及び150ggのハイグロマイシンB (S
igma)を含むB旧上で選択された。PLO活性を検出するために、C,プソ
イドツへルキュロシス細胞が、羊血液プレート(5%(v/v)の脱線維素化さ
れた完全な羊血液、ロドコーカス イ旦からの10%(v / v )のa過さ
れた(0.2μm〕の培養上清液を含むLB)上で培養された。
DNA技法。すべてのDNA操作は、標準の手段(Sambrookなど、。
1990)を用いて行なわれた。ゲノムDNAが、前に記載されたようにしてC
プソイドツベルキュロンスから単離された()lad(sonなど、。
1990a及びRadford and Hodgson 、発表のために提供
された)。
組換えプラスミド′の構成。組換えプラスミドを、pEP2 (pBT858)
のシ■1部位中にPLO遺伝子を担持するフラグメントをクローニングすること
によって構成した。耐エリスロマイシン性遺伝子を含む1.7kbのHindI
I[フラグメントを、均μIにより欠失されたPLO遺伝子中にクローン化5た
(pBTB58)。PLD及びユリスロマイシン遺伝子の配向は、5ail制限
分析により決定された。
C,ブソイドツベルキュロシスPLD遺伝子の変異誘発。姐換えプラスミドを野
生型のC,プソイドッへルキュロシス中に電気穿孔し、そして形質転換体を、エ
リスロマイシン及びカナマイノンを含むBHI上で選択しな。次に、組換えプラ
スミドを存するC、プソイドッへルキュロシスの細胞を、pEP3により電気穿
孔し、そして形質転換体を、エリスロマイシン、カナマイシン及びハイグロマイ
シンBにより補充されたBHIプレート上で選択した。プラスミドpEP3の存
在を、サザンブロント分析を用いて確かめた。両プラスミドを含む形質転換体を
、すべての3種の薬物を含むB旧中において一晩増殖せしめた。その培養物を、
ハイグロマイシンBのみにより補充され;’:BHIブイヨンにおいて1:10
0で継代培養し、そじて−晩、振盪した。
その継代培養手段を全体で3回くり返した。最終ブイヨン培養物を、エリスロマ
イシン及びハイグロマイシンBにより補充された羊血液プレート上に希釈プレー
トした。単一のコロニーを、エリスロマイシン及びハイグロマイシンB、及びカ
ナマイシンのみを含むB旧プレートにバッチした。
PLO活性についての変異誘発されたC ブソイドツベルキュロン囚の試験。3
種の変異誘発されたC、プソイドツベルキヱロシス株及び野生株を、B旧におい
て2日間増殖せしめ、ペレット化し、100μmのリン酸緩衝溶液(PBS )
に再懸濁し、次に音波処理し、細胞タンパク質を放した。サンプル(10μl)
を羊血液プレート上にスポットし、そして37゛Cで一晩維持した。
プラスミド養生。羊血液プレート上に溶菌の領域を生成できないCプソイドッペ
ルキュロシスのハイグロマイシンB及びユリスロマイシン耐性誘導体(トキシマ
イナス)を、プレーンB旧プレート上に単一のコロニーのために画線培養した。
その工程を合計5回くり返した。5回目の継代培養からの単一のコロニーを、ハ
イグロマイシンB又はエリスロマイシンのいづれかにより補充されたB旧上DN
Aを、3種のトキノマイナスC,ブソイドツベルキュロシスコロニーから単離し
た。 DNAをSac Iを用いて消化し、電気泳動し、そしてZeta−Pr
obeナイロンフィルター(Bio−Rad)にサザンプロノトした。フィルタ
ーを、PLD遺伝子特異的プローブにより37°Cで一晩ハイブリダイズし、ラ
ンダムプライマー(Feinberg and Vogelstein。
1983)を用いて32Pによりラヘルし、次に必要により高まる厳重さで洗浄
しく0.2xSScにおいて65°Cまで〕、そしてX−線フィルム(Fuji
RX)に暴露した。野生型C,ブソイドツベルキュロシス及びpBT858に
より形質転換されたものを、対照として含む。フィルターを0.4MのNa0)
1に45°Cで30分間、維持し、0.1 x 5SC20,1%(W/v)の
SDS、0.2MのトリスHC1,pH7,5において45’Cで30分間洗浄
し、次にエリスロマイ/ン遺伝子特異的プローブによりハイブリダイズし、洗浄
し、そして上記のようにしてX線フィルムに暴露した。
トキシマ・イナスC,ブソイドツベルキュロシスにおシするPLI)遺伝子発現
。野生型PLO遺伝子を含むプラスミドpBTB50を、トキシマイナスCブソ
イドツへルキュロンス中に電気穿孔した。形質転換体を連続的に希釈し、そして
カナマイシンを含む羊血液プレート上にプレートした。野生型及び形質転換され
たトキンマイナス細胞により生成された赤血球溶解の領域を測定した。
例2
C,ブソイドツへルキュロノスPLO遺伝子の変異誘発、C,プソイドッへルキ
ュロシス染色体と部位特異的組換えできるヘクターを製造するために、まずPL
O遺伝子をpEP2シャトルヘクター中にサブクローン化した。次に、PLD遺
伝子をPstlにより欠失し、そしてエリスロマイシン耐性遺伝子をPstI部
位中に導入し、プラスミドpBT85B (図1)を生成した。野生型C,プソ
イドツへルキュロシスをpBTB58及び続いて耐ハイグコマイシン性シャトル
プラスミドpEP3により形質転換した。両プラスミドにより形質転換された細
胞を、カナマイシン、エリスロマイシン及びハイグロマイシンを含む培地上で選
択した。プラスミドPEP3を維持し、そしてプラスミド分離を通してプラスミ
ドpBTB58の損失を促進するために、両プラスミドを含む細胞を、ハイグロ
マイノンのみを含む培地に継代培養した。組換え出来事が生したそれるの細胞を
検出するために、培養物を、ハイグロマイシン及びエリスロマイシンの両者を含
む血液プレート上にプレートした。90%以上のハイグロマイシン及びエリスロ
マイシン耐性コロニーは、血液プレート上での溶菌の領域を生成しなかった。(
図2)、さろに、スポットされた領域を生成するすべての10個のコロニーはカ
ナマイシンに対して耐性であり、そして試験された50個の領域のない変異体は
すべて、カナマイシン感受性であった。
これらの結果は、プラスミドp8TB58が宿王細胞から失なわれ、そして二重
クロスオーバー組換え出来事がエリスロマイシン耐性遺伝子を、PLO遺伝子を
不活性化する染色体中に導入した。すべての3種の抗生物質に耐性であり、そし
て血液プレート上に領域を生成できるコロニーは、染色体との単一のクロスオー
バー出来事の結果であり、又はpEP3及びpBTB58の両者が維持されてい
る細胞を表わすことができる。変異誘発された細胞がPLOを生成しないことを
確かめるために、細胞溶解物を血液プレート上にスポットじた。親C,ブソイド
ッへルキュロシスから得られた細胞タンパク質のみが、赤血球溶菌の領域を生成
した。この結果は、変異体が、PLOを生成しないので及び非分泌性変異誘発さ
れたPLOタンパク質を生成しないので、羊血液プレート上に溶菌の領域を生成
できないことを示唆する。
Cブソイドツベルキュロシス染色体との予測される組換え出来事が生したことを
確かめるために、変異誘発の後、領域を生成できる1つの変異体、ρBT858
を含む野生型細菌及び野生型株を、サザンブロソト分析を用いて試験した(図3
)。Sac Iにより切断された野生型C,プソイドッベルキュロシスゲノムが
PL[l遺伝子を用いてプローブされる場合、単一の2.0kbのハンドが観察
された(図3A)。
同し手段で分析された3種のトキシマイナスmsから単離されたゲノムDNAは
、3.4kbの単一のバンドのみを示した(図3A)、この結果は、欠失された
PLD/エリスロマインン耐性遺伝子カセットによる染色体PLO遺伝子の置換
をもたらす二重クロスオーバー出来事の発生に一致する。
変異誘発後でさえ、羊血液プレートを溶解できない変異体から単離された未切断
ケ゛ツムDNAがPLO遺伝子プローブを用いてプローブされる場合、pBT8
58対照により生成されるハンドパターンと同一のバンドパターンが観察された
。この結果は、羊血液を溶解する能力が、pBT858が細胞かみ失なわれず、
そしてPLO遺伝子が変異誘発されなかったので、保持されたことを示唆する。
同しフィルターが続いて、エリスロマイシン耐性遺伝子特異的プローブによりプ
ローブされる場合、3.4kbのSac Iフラグメントのみがハイブリダイズ
しく[3B)−このことは、エリスロマイシン遺伝子がPLDilt伝子中に組
込まれたことを確証する。
トキシマイナスC,プソイトツへルキュロンスにおけるPLO遺伝子の発現。P
LD遺伝子を担持するプラスミドpEP2を、トキシマイナスC,ブソイドッへ
ルキュロンス中に電気穿孔した。 PLO活性を検出するために、形質転換体を
血液プレート上にプレート5だ。形質転換された細胞は溶解領域を生成した。こ
の結果は、クローン化されたPLO遺伝子がC,プソイトツへルキュロシス変異
体に発現され、そしてその生成物が宿王細胞から分泌されることを示唆する。
C,ブソイドンへルキュロンスの第2のPLD陰性株(トキシマイナス■)をト
キノマイナスのために同し手段で生成しだ。但し、(1)PLD遺伝子の異なっ
たクローン化されたフラグメントが組換えカセットを創造するために使用され、
そして(2)工゛Jスロマイシン遺伝子が図1!、:示されるPLD遺伝子に対
して反対の方向シこPLDPst1部位中にクローン化された。
PLO遺伝子を、pljc118のSac 1部位中に2.1kbのSac T
フラグメントとしてクローン化し、そして新しい配列を決定した(図3C)。
第2 PLD遺伝子クローンの主な特徴は、翻訳停止コドンのすく下流での推定
上の転写ターミヱーターの存在である(図3C)。トキノマイナスに関じては、
二゛ノスロマインン遺伝子の染色体PLO遺伝子への挿入がサザンブロノト分析
により確かめられた(データは示されていない)、トキシマイナス■は、エリス
ロマイシン耐性遺伝子が反対方向に染色体中に挿入されることにおいてトキノマ
イナスとPLO陰性C、プソイドッベルキュロシスに対しての免疫学的応答。
毛を刈られていない生後9力月の羊を、ビルレントPLO陽性であり、且つPL
D欠失されたC、ブソイドツへルキュロシスにより接種した。
株231は高いPLD生成体であり、そして137eは低いPLD生成体であり
、そして両者は病原性である。血液サンプルを毎週、採取した。
血清学的転換を、酵素イムノアッセイ(EIA)を用いてモニターし、ここでト
レーは、C,ブソイドツへルキュロノス231音波処理物によ/)被覆された。
T細胞応答を、1ml当たり5μgのC,プソイトツへルキュロシ五音波処理物
と共にインキュベートされた完全な血液培養物へのT−インターフェロンの放出
を定量化することによって測定した。インターフ10ンのレヘルを、捕獲−タノ
グEIAを用いてアンセイした。
その結果は、トキシマイナスC,プソイドツへルキュロシス株に対する有意な抗
体応答(表1)、及びまたは、明白なT細胞応答(図4)も示す。両領域におい
て、それらは、親ビルレット株により刺激された反応に相当する。
表 1
ビルレント及びトキシマイナス株、EIA力価ビルレント 231 X 10”
38 340 440 2450ビルレント 137E X to@105
2400 5100 5400トキシマイナスxlO’ 82 1400 27
00 1900トキシマイナス xlO” 80 1600 5800 140
00対 照 115 80 70 64
予防接種された羊の血清学的力価。力価は、間接的なEIAにおいて被覆抗原と
して株231音波処理物を用いて1,25以上の吸光度を与える最後の希釈度の
逆数である。
例4
羊における乾酪性リンパ節炎に対する免疫学的応答及び保護。λプソイドツへル
キュロンストキシマイナス株の効能及び病原性の両者をさらに評価するために、
羊に、種々の用量のC,ブソイドツヘルキュロシストキシマイナスを、左の後脚
の蹄冠上の皮膚3cIl中に予防接種し、そして後で、右の後脚上の同し部位中
に接種されたビルレント4X10”C,プソイドツベルキュロシス株231によ
り挑戦せしめた。5匹の生後9力月の羊が個々のワクチン投薬のために使用され
、そして7匹の対照の羊が予防接種を伴わないで挑戦されたパ節での病理学的試
験、及びそれらの部位からの生物の培養により評価された。すべての羊の死体解
剖し、そして組織を病理学的徴候について試験した。血清を週1度取り出し、そ
してEIAにより旦−ブソイドツへルキュロシス特異的抗体について試験した。
表2
初期予防接種
対照 2 XIO’ 2 XIO’
血清学的結果は図5に示される。実質的な力価は、例3による予防接種により誘
発される。
2X10’又は2 X10’cfuのC,ブソイドツベルキュロシストキシマイ
ナスにより接種された予防接種された動物の剖検は、左の(予防接種された)M
窩のリンパ節に存在する又はいづれか他の組織からの感染性又は培養できるワク
チン株の徴候が存在しなかったことを示した。挑戦のために使用されるビルレン
ト株を、すべての予防接種されていない対照、及び10匹の予防接種された羊の
うち2匹から回収した。病理学的結果は表3に示され;指摘される場合を除いて
、ビルレント株はすべての肉眼的病変から培養された。
表 3
右の後脚の挑戦
Pop、 Sol Pop、 Sol Pop、 5olPop、=M窩のリン
パ節; 5OI=接種の部位(病変の大きさ、CIII、(病変の数))
これらのデータは、PLD欠失C,プソイドツへルキュロシストキシマイナス株
が、ビルレントC,プソイドツへルキュロシスによる挑戦に対して耐性を付与す
る(但し、これは使用される挑戦体の用量で絶対的ではない)ことを示唆する。
参考文献:
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ts t。
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n Escherichia coliof the phospholipa
se D gene from Cor nebacteriun+5eudo
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Maniatis、 T、 1989゜Mo1ecular cloning
: A 1aboratory manual、 2nd ed、 Cold
Spring Harbor Laboratory、Co1d Spring
Harbor、N、Y。
挑戦
用量
→ トキノ7ナイス 200,000 ÷ トキノマナイス 20.(XX)、
000 4″ 対照力(illi、1/(希釈度=1/2 MAX 001AB
CD ε FG
PLD遺伝子・
A8CDEFG
フロントページの続き
(51) Int、 C1,5識別記号 庁内整理番号C12R1:15)
(72)発明者 ホッジワン、エイトリアン レスリー マーク
オーストラリア国、ビクトリア 3145.イースト マルバーン、アルバート
ストリート 22
I
Claims (23)
- 1.活性ビルレンス因子を発現することができず、又は病原性生物から免疫保護 効果量の抗原を合成するコリネバクテリウム又は関連する生物を含んで成るワク チンベクター。
- 2.前記コリネバクテリウムが、コリネバクテリウム プソイドツベルキュロシ スである請求の範囲第1項記載のワクチンベクター。
- 3.前記コリネバクテリウムがビルレンス遺伝子に単一の又は複数のヌクレオチ ドの置換、欠失及び/又は付加を担持する請求の範囲第1又は2項記載のワクチ ンベクター。
- 4.前記ビルレンス遺伝子がホスホリバーゼDをコードする請求の範囲第3項記 載のワクチンベクター。
- 5.前記合成された抗原が組換え抗原である請求の範囲第1項記載のワクチンベ クター。
- 6.前記組換え抗原がトキソイドである請求の範囲第5項記載のワクチンベクタ ー。
- 7.前記関連する生物がブレビバクテリウムである請求の範囲第1項記載のワク チンベクター。
- 8.ホスホリパーゼDをコードする遺伝子に欠失及び/又は挿入を担持するコリ ネバクテリウム プソイドツベルキュロシスを含んで成るワクチンベクター。
- 9.1又は複数の医薬的に許容できるキャリヤー及び/又は希釈剤をさらに含ん で成る請求の範囲第1〜8のいづれか1項記載のワクチンベクター。
- 10.ビルレントコリネバクテリア及び/又は関連する生物に対して動物を予防 接種するための方法であって、活性ビルレンス因子を発現することができず、又 は病原性生物から免疫保護効果量の抗原を合成するコリネバクテリウムを含んで 成るワクチンベクターの予防接種的に有効な量を前記動物に投与することを含ん で成る方法。
- 11.前記コリネバクテリウムが、コリネバクテリウム プソイドツベルキュロ シスである請求の範囲第10項記載の方法。
- 12.前記コリネバクテリウムがビルレンス遺伝子に単一の又は複数のヌクレオ チドの置換、欠失及び/又は付加を担持する請求の範囲第10又は11項記載の 方法。
- 13.前記ビルレンス遺伝子がホスホリバーゼDをコードする請求の範囲第12 項記載の方法。
- 14.前記合成された抗原が組換え抗原である請求の範囲第10項記載の方法。
- 15.前記組換え抗原がトキソイドである請求の範囲第14項記載の方法。
- 16.前記関連する生物がブレビバクテリウムである請求の範囲第10項記載の 方法。
- 17.前記動物が家畜動物である請求の範囲第10項記載の方法。
- 18.乾酪性リンパ節炎に対して家畜動物を予防接種し、そして/又はコリネバ クテリウム プソイドツベルキュロシスにより感染された動物を処理するための 方法であって、ホスホリパーゼDをコードする遺伝子に単一の又は複数のヌクレ オチドの置換、欠失及び/又は付加を担持するC.プソイドツベルキュロシスの 誘導体の免疫保護量を、現在の又は続くC.プソイドツベルキュロシス感染に対 して動物を免疫応答性にするのに十分な時間、及び十分な条件下で、前記動物に 投与することを含んで成る方法。
- 19.コリネバクテリウム又は関連する生物からの変異誘発されたビルレンス遺 伝子の非活性生成物の生成方法であって、前記変異誘発された遺伝子を担持する 生物を、発現されるべき前記変異誘発された遺伝子のために十分な時間及び十分 な条件下で培養することを含んで成る方法。
- 20.前記コリネバクテリウムが、コリネバクテリウム プソイドッベルキュロ シスである請求の範囲第19項記載の方法。
- 21.前記ビルレンス遺伝子がホスホリバーゼDをコードする請求の範囲第19 又は20項記載の方法。
- 22.前記変異誘発された遺伝子が、単一の又は複数のヌクレオチドの置換、欠 失及び/又は付加を含む請求の範囲第19項記載の方法。
- 23.前記生物がブレビバクテリウムである請求の範囲第19項記載の方法。
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