JPH06501847A - ワクチンベクターとしてのコリネバクテリウム及び関連する生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチンベクターとしてのコリネバクテリウム及び関連する生物本発明２よ、ワ クチンベクターとしてのコリネバクテリウム及び関連する生物及び／又は変異体 又はそれらの誘導体の使用に一般的にであり、これは°“チーズ譬の腺（ｃｈｅ ｅｓｙ　ｇｌａｎｄ）　’”として通常知られている乾酪性リンパ節炎（ＣＬＡ ）の原因物質である。この疾病は主に羊及びヤギに影響を及ぼすだけでなく、ま たウマも影響を及ぼす。

Ｃ，プソイドッベルキュロシスの主なビルレンス因子は、ホスホリパーゼＤ（Ｐ ＬＤ）と呼ばれる３１ＫＤａＯ外毒素であると思われる。羊は、Ｃ，プソイドッ へルキュロシス培養上清液のホルマリン処理沈殿物による免疫化により又は純粋 なＰＬＤのトキソイド形を用いることによってＣＬＡから保護され得る。

本発明また導びく研究においては、コリネバクテリア及び関連する生物群のピル レントメンハーに対して保護免疫応答を刺激できるワクチンベクターを生成する ために前記生物群に関連するアジュバント性質を利用することが研究された。こ れは、選択された種からのビルレンス遺伝子を欠失することによって、又は適切 な抗原性材料、たとえば＆［１換えトキソイドを発現するように操作された非病 原性又は無毒性種を用いることによって達成される。

従って、本発明の１つの観点は、活性ビルレンス因子を発現できない、又は病原 性生物から免疫保護有効量の抗原を合成するコリネバクテリウム又は関連する生 物を含んで成るワクチンベクターに関する。

用語“ワクチンベクター”は、抗原表示のための生物学的手段を包含するように その最大の範囲で使用される。その生物学的手段シよ便利には微生物であり、そ して一般的には生存性であるが、但し死−んだ生物も使用され得る。生物学的ベ クターは、非病原性であり、又は無毒性にされ、又は非病原性又は無毒性有効量 で与えられる。

“抗原表示”とは、天然に存在する抗原の表示及び／又は抗原又：よその抗原性 部分をコードする遺伝子を担持するプラスミドにより生物学的ベクターを形質転 換し、そして次に発現されるような組換え抗原の発現を意味し；又は染色体及び ／又はいづれか天然に存在する又は天然に存在しない染色体外要素を包含する、 プラスミド及び／又は遺伝子及び／又はそれらの一部が宿主ゲノム中に組込まれ る場合、それらの遺伝子又はそれらの一部が発見される。他方、生物学的ベクタ ーは、抗原、たとえばビルレンス因子の発現を妨ぎ又は滅しるように、又は抗原 又はその一部の変更された、及び非毒性形を生成するように操作される。この場 合、生物学的ベクターは、非ビルレンス又は非病原性有効量で他の非毒性抗原又 ：よ毒性抗原を表わす、いづれにしても、細胞又は遺伝子又はその両者は、抗原 が十分な量で分泌されることを確保するようにさらに操作される必要がある。１ つのＩＪ欅において、発現された抗原は組換え体であり、そしてそれがビルレン ス因子自体である場合、その組換え抗原がまた、解毒されるであろう。

本発明は、現時点まで、本発明の最良のＨ様を供給するＰＬＩ）をコードする遺 伝子における欠失を担持するＣ、プソイドツへルキュロヱスをワクチンベクター として使用することを記載する。しかしながら、当業者は、他の種の旦ユ」バク テリウム及び他の関連する生物、たとえばブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ）種への本発明の適用能力を容易に認めるであろう。さらに、本 発明は、ビルレンス遺伝子の不活性化をもたらし、又は生成物の無毒性形、たと えば不活性毒素をもたらす、そのビルレンス遺伝子におけるいづれか１つの又は 複数のヌクレオチドの置換、付加及び／又は欠失にも拡張する。

本発明によれば、Ｃ，ブソイドツベルキュロシスのワクチンベクターは、本明細 書の例に記載されるように、組換え技法を用いてビルレント株からＰＬＯ遺伝子 を遺伝的に破壊することによって得られた。しかしながら、他の技法、たとえば 化学的又は放射線的に誘発された変異誘発がまた、本発明の範囲内で使用され得 る。

手短に言及すれば、ＰＬＯ遺伝子が、欠失及びその遺伝子内に挿入される耐エリ スロマイシン性遺伝子により破壊される。これは、シャトルベクター、たとえば 耐カナマイシン性決定基を担持するｐａｐヘクターに基づいてビルレントＣ，ブ ソイドツベルキュロシス中に移された（オーストラリア特許出願第ＰＪ８８１Ｓ ／９０号を参照のこと）。

次に、種々の耐抗生物質性マーカーを担持する種々のｐＥＰベクターがまた細菌 中に導入され、そして第２プラスミドのために選択が適用される。これは、染色 体ＰＬＯ遺伝子中への欠失された遺伝子の組換えを促進し、従って前記株に耐エ リスロマイシン性を付与し、そしてＰＬＯ生成を排除する。第２９ＥＰプラスミ ドについての選択は、変異体ＰＬＯを担持する第１プラスミドの維持に対して作 用する。第１プラスミドは失なわれるが、しかし多くの場合、染色体に対する変 異体ＰＬＯ及び耐エリスロマイシン性遺伝子の組換えが生したであろう。ＰＬＤ は血液プレート上で清澄化を仲介するので、耐カナマイシン性の付随する損失及 び耐エリスロマイシン性の維持による清澄表現型の損失は、Ｃ，ブソイドツへル キュロシスの染色体中への欠失された遺伝子の組込みを示す。

シュハント性質及びビルレント株を無毒性にすることの組合された効果は、ワク チンベクターを、ビルレント生物に対して免疫保護効果量の抗体及び／又は他の 免疫保護因子（細胞を包含する）を刺激できる特に可能性あるワクチンベクター にする。

従って、本発明のこの観点１ま、ＰＬＯをコードする遺伝子に８’ｒする単−又 は複数のヌクレオチドの１換、付加及び／又は欠失を担持する、−ｑ２ニηソイ トツへ、！ヒ乞ｓ　Ｏ’／　Ｘを含んで成るワクチン−、フタ−に関する。ＰＬ Ｄ遺伝子における置換、付加及び／又は欠失は、その遺伝子の発現を阻止し、す なυち活性ＰＬＤの合成を阻止し又は合成されるＰＬＤの非ビルレントを動量の みをもたらすため５二効果的であるべきである。ワクチンは一般的に、生物の生 物学的純粋な配合物から成り、そしてさらに、意図される受容体及び投与の態様 シこ依存して１又は複数の医薬的に許容できるキャリヤー及び／又は希釈剤を含 むことができる。

本発明のもう１つの観点：よ、ＣＬＡに対して家畜動物をワクチン化するための 方法及び／′又ｔ：　−Ｃ、ブソイドツへルキエロンスニこより感染された動物 の処理方法に閲５、ここで前記処理方法はＰＬＤをコート−ｒる遺伝子に８ける 単一の又：よ複数のヌクレオチドの置換、付加及び／又は欠失を担持する、Ｃ， プソイドンヘル午ｓ　Ｏ’／　Ｚの誘導体の免疫保護量を前記動物シこ、現在の 又巳よ続＜Ｃ，プソイドノへルキュロンス！染に対して動物を免疫応答性にする のに十分な時間及び条件下で投与することを含んで成る。投与は、いづれか適切 な経路、たとえば経口又は静脈内投与により行なわれ得る。製剤はまた、乾燥形 又は液体形で存在できる。選択された投与路はまた、追加の成分、たとえばプロ テアーゼインヒヒ゛ター及び同様のものを必要とすることもできる。

本発明のさろにもう１つの観点においては、非活性又はトキソイドＰＬＤの生成 方法が提供され、ここで前記方法は、ＰＬＯをコードする遺伝子における単一の 又は複数のヌクレオチドの置換、付加及び／又は欠失を担持するＣ　プ゛イ゛ツ ヘルキュロシスを培養し、そして前記遺伝子の発現により生成される非活性又は トキソイド化ＰＬＯを回収することを含んで成る。この方法により生成される非 活性又はトキソイド化されたＰＬＯはたとえば、Ｃ，プソイドツベルキュロヱス に対して保護免疫応答を刺激するためのワクチンにおいて活性免疫原として使用 され得る。

他の生物への本発明の疾病処理としての通用能力は容易に同定できる。たとえぽ 、ビルレント因子、たとえばＰＬＯをコードする遺伝子が、トキソイドをコード するために１又は複数の挿入、欠失及び／又は置換変異によりインビトロ又はイ ンビボで変異誘発され、そして次に、ワクチンベクターを生成するために適切な コリネハクテぶバクテリウム又は関連する生物において欠失され又は他方、破壊 され得る。すべてのそのような聾様は本発明の範囲内に包含される。

本発明は次の非制限的な図面及び例への参照によりさらに記載される。

図１は、部位特異的組換えプラスミドの図的な表示である。ＰＬＤ遺伝子は、Ｐ ＥＰ２のＰｓｔ１部位中に、１．５ｋｂのＳａｃ　ｌフラグメントとしてサブク ローン化された０次に耐エリスロマイシン性遺伝子がＰＬＯ遺伝子のｐｓｔ１部 位中にｔ、７ｋｂの…ｎｄｌ［フラグメントとしてクローン化され、それによっ て欠失が創造された。

図２は、Ｃ，プソイドッへルキュロシスＰＬＯ遺伝子の変異誘発を示す写真表示 である。野生型のＣ，プソイドツベルキュロンスが部位特異的組換え法を用いて 変異誘発された。細胞は羊の血液プレート上にプレートされた。　９０％以上の 変異誘発された細胞が、赤血球の溶解を引き起こすのに失敗し、このことは、Ｐ ＬＯ遺伝子が不活性化されたことを示唆する。

図３（Ａ）及び（Ｂ）は、Ｃ，ブソイドツへルキュロシス変異体のサザンブロノ ト分析を示す写真表示である。パネルＡ、５ａｃｌ消化されたゲノムＤＮＡはＰ ＬＤ特異的プローブとハイブリダイズした。

レーン：Ａ、野生型Ｃ，ブソイドツベルキュロンス株２３１；Ｂ、＆ｌｉ換えプ ラスミドｐＢＴ８５８を含む株２３１；Ｃ，変異体１；Ｄ、変異体２；Ｅ、変異 体３；Ｆ、レーンＢと同じであるが、巳かしＤＮＡ消化されていない一〇、変異 誘発の後、ＰＬＯ活性を保持するＣ、ブソイドツベルキュロシスからのＤＮＡ、 高分子量及びヤギハンドはたぶん、一部消化された材料である。パネルＢ、パネ ルＡと同しであるが、しかしフィルターはエリスロマイシン遺伝子持異的プロー ブとハイブリダイズした。レーンＡ及びＢにおける２、０ｋｂのＰＬＤ遺伝子Ｓ ａｃ　１フラグメントの不在を注目すること。

図３　（Ｃ）は、Ｃ，プソイドッへルキュロシスホスホリバーゼＤ遺伝子の５′ 及び３′領域のヌクレオチド配列を示す口約な表示である。四角で囲まれた領域 は、公開された配列とのオーハーラ、プを示し、　５ＴＯＰ下の点は、推定上の 翻訳ターミネーターを示し；逆にされた矢印は転写ターミネータ−ステムを示し 、そして点線はループ（Ｌ）構造（１３，６ｋｃａｌ）を示す。

図４は、Ｃ，ブソイドツへルキュロンスのＰＬＯ産生性株及びトキノマイナス（ Ｔｏｘ慣１ｎｕｓ　）株により注射された羊のＴ細胞応答のグラフである。

図５は、Ｃ，プソイドッへルキエロンストキシマイナス株の種々の用量により羊 を予防接種することでの血清学的応答のグラフである。

チリウム耐エリスロマイシン性遺伝子のｐｔｌｃ１１Ｂクローン（Ｈｏｄｇｓｏ ｎ屋発表のために提供された）のための宿主であった。ＰＬＯ産生のためのＣプ ソイドツへルキュロシス野生型株はＤｒ、Ｄｏｕｇ　Ｂｕｒｒｅｌｌ（ＣＳＩＲ ＯＤｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ、　Ａｒｍ１ｄａｌｅ 、　Ｎ！Ｊ）から得られた。三Σコーカス　イクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　 ｅ　ｕｉ）株ＣＣ５０は、Ｄｒ、Ｋｅｉｔｈ　Ｈｕｇｈｅｓ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎ ｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｄｅｐａｒｔ＠ｅｎｔ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒ ｇ　５ｃｉｅｎｃｅ。

Ｗｅｒｒｉｂｅｅ　）からの送り吻であった。

培地。形質転換された旦−ユ悲は、必要な場合、１ｍｌ当たり５０ｇｇのアンピ シリン（Ｓｉｇｍａ）　、５０ｇｇのカナマイシンスルフェート（Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉａ＋）、１００μｇのエリスロマイシン（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）又は１５０．ｃｒｇのハイグロマイシンＢ　（Ｓ ｉｇｍａ）を含むＬｕｒｉａブイヨン（ＬＢ：１１当たり１０ｇのトリプトン、 ５ｇの酵母抽出物、１０ｇのＮａＣｌ　）において増殖された。Ｃ，プソイドッ ペルキュロシスの細胞は、０．１％（ｖ　／　ｖ　）のＴｗｅｅｎ８０　（ＢＨ Ｉ）を含む脳心臓インフュージョン培地（Ｄｉｒｃｏ）において３７℃で培養さ れた。形質転換された細胞は、１ｍｌ当たり５０ｇｇのカナマイシン、１５０ｇ ｇのハイグロマイシンＢ又は１００μｇのエリスロマイシンにより補充されたＢ ＨＩ上で選択された。推定上のＣプソイドッペルキュロシス変異体は、１ｍｌ当 たり１１００ｎのエリスロマイシン及び１５０ｇｇのハイグロマイシンＢ　（Ｓ ｉｇｍａ）を含むＢ旧上で選択された。ＰＬＯ活性を検出するために、Ｃ，プソ イドツへルキュロシス細胞が、羊血液プレート（５％（ｖ／ｖ）の脱線維素化さ れた完全な羊血液、ロドコーカス　イ旦からの１０％（ｖ　／　ｖ　）のａ過さ れた（０．２μｍ〕の培養上清液を含むＬＢ）上で培養された。

ＤＮＡ技法。すべてのＤＮＡ操作は、標準の手段（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、。

１９９０）を用いて行なわれた。ゲノムＤＮＡが、前に記載されたようにしてＣ プソイドツベルキュロンスから単離された（）ｌａｄ（ｓｏｎなど、。

１９９０ａ及びＲａｄｆｏｒｄ　ａｎｄ　Ｈｏｄｇｓｏｎ　、発表のために提供 された）。

組換えプラスミド′の構成。組換えプラスミドを、ｐＥＰ２　（ｐＢＴ８５８） のシ■１部位中にＰＬＯ遺伝子を担持するフラグメントをクローニングすること によって構成した。耐エリスロマイシン性遺伝子を含む１．７ｋｂのＨｉｎｄＩ Ｉ［フラグメントを、均μＩにより欠失されたＰＬＯ遺伝子中にクローン化５た （ｐＢＴＢ５８）。ＰＬＤ及びユリスロマイシン遺伝子の配向は、５ａｉｌ制限 分析により決定された。

Ｃ，ブソイドツベルキュロシスＰＬＤ遺伝子の変異誘発。姐換えプラスミドを野 生型のＣ，プソイドッへルキュロシス中に電気穿孔し、そして形質転換体を、エ リスロマイシン及びカナマイノンを含むＢＨＩ上で選択しな。次に、組換えプラ スミドを存するＣ、プソイドッへルキュロシスの細胞を、ｐＥＰ３により電気穿 孔し、そして形質転換体を、エリスロマイシン、カナマイシン及びハイグロマイ シンＢにより補充されたＢＨＩプレート上で選択した。プラスミドｐＥＰ３の存 在を、サザンブロント分析を用いて確かめた。両プラスミドを含む形質転換体を 、すべての３種の薬物を含むＢ旧中において一晩増殖せしめた。その培養物を、 ハイグロマイシンＢのみにより補充され；’：ＢＨＩブイヨンにおいて１：１０ ０で継代培養し、そじて−晩、振盪した。

その継代培養手段を全体で３回くり返した。最終ブイヨン培養物を、エリスロマ イシン及びハイグロマイシンＢにより補充された羊血液プレート上に希釈プレー トした。単一のコロニーを、エリスロマイシン及びハイグロマイシンＢ、及びカ ナマイシンのみを含むＢ旧プレートにバッチした。

ＰＬＯ活性についての変異誘発されたＣ　ブソイドツベルキュロン囚の試験。３ 種の変異誘発されたＣ、プソイドツベルキヱロシス株及び野生株を、Ｂ旧におい て２日間増殖せしめ、ペレット化し、１００μｍのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ　） に再懸濁し、次に音波処理し、細胞タンパク質を放した。サンプル（１０μｌ） を羊血液プレート上にスポットし、そして３７゛Ｃで一晩維持した。

プラスミド養生。羊血液プレート上に溶菌の領域を生成できないＣプソイドッペ ルキュロシスのハイグロマイシンＢ及びユリスロマイシン耐性誘導体（トキシマ イナス）を、プレーンＢ旧プレート上に単一のコロニーのために画線培養した。

その工程を合計５回くり返した。５回目の継代培養からの単一のコロニーを、ハ イグロマイシンＢ又はエリスロマイシンのいづれかにより補充されたＢ旧上ＤＮ Ａを、３種のトキノマイナスＣ，ブソイドツベルキュロシスコロニーから単離し た。　ＤＮＡをＳａｃ　Ｉを用いて消化し、電気泳動し、そしてＺｅｔａ−Ｐｒ ｏｂｅナイロンフィルター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にサザンプロノトした。フィルタ ーを、ＰＬＤ遺伝子特異的プローブにより３７°Ｃで一晩ハイブリダイズし、ラ ンダムプライマー（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ。

１９８３）を用いて３２Ｐによりラヘルし、次に必要により高まる厳重さで洗浄 しく０．２ｘＳＳｃにおいて６５°Ｃまで〕、そしてＸ−線フィルム（Ｆｕｊｉ 　ＲＸ）に暴露した。野生型Ｃ，ブソイドツベルキュロシス及びｐＢＴ８５８に より形質転換されたものを、対照として含む。フィルターを０．４ＭのＮａ０） １に４５°Ｃで３０分間、維持し、０．１　ｘ　５ＳＣ２０，１％（Ｗ／ｖ）の ＳＤＳ、０．２ＭのトリスＨＣ１，ｐＨ７，５において４５’Ｃで３０分間洗浄 し、次にエリスロマイ／ン遺伝子特異的プローブによりハイブリダイズし、洗浄 し、そして上記のようにしてＸ線フィルムに暴露した。

トキシマ・イナスＣ，ブソイドツベルキュロシスにおシするＰＬＩ）遺伝子発現 。野生型ＰＬＯ遺伝子を含むプラスミドｐＢＴＢ５０を、トキシマイナスＣブソ イドツへルキュロンス中に電気穿孔した。形質転換体を連続的に希釈し、そして カナマイシンを含む羊血液プレート上にプレートした。野生型及び形質転換され たトキンマイナス細胞により生成された赤血球溶解の領域を測定した。

例２ Ｃ，ブソイドツへルキュロノスＰＬＯ遺伝子の変異誘発、Ｃ，プソイドッへルキ ュロシス染色体と部位特異的組換えできるヘクターを製造するために、まずＰＬ Ｏ遺伝子をｐＥＰ２シャトルヘクター中にサブクローン化した。次に、ＰＬＤ遺 伝子をＰｓｔｌにより欠失し、そしてエリスロマイシン耐性遺伝子をＰｓｔＩ部 位中に導入し、プラスミドｐＢＴ８５Ｂ　（図１）を生成した。野生型Ｃ，プソ イドツへルキュロシスをｐＢＴＢ５８及び続いて耐ハイグコマイシン性シャトル プラスミドｐＥＰ３により形質転換した。両プラスミドにより形質転換された細 胞を、カナマイシン、エリスロマイシン及びハイグロマイシンを含む培地上で選 択した。プラスミドＰＥＰ３を維持し、そしてプラスミド分離を通してプラスミ ドｐＢＴＢ５８の損失を促進するために、両プラスミドを含む細胞を、ハイグロ マイノンのみを含む培地に継代培養した。組換え出来事が生したそれるの細胞を 検出するために、培養物を、ハイグロマイシン及びエリスロマイシンの両者を含 む血液プレート上にプレートした。９０％以上のハイグロマイシン及びエリスロ マイシン耐性コロニーは、血液プレート上での溶菌の領域を生成しなかった。（ 図２）、さろに、スポットされた領域を生成するすべての１０個のコロニーはカ ナマイシンに対して耐性であり、そして試験された５０個の領域のない変異体は すべて、カナマイシン感受性であった。

これらの結果は、プラスミドｐ８ＴＢ５８が宿王細胞から失なわれ、そして二重 クロスオーバー組換え出来事がエリスロマイシン耐性遺伝子を、ＰＬＯ遺伝子を 不活性化する染色体中に導入した。すべての３種の抗生物質に耐性であり、そし て血液プレート上に領域を生成できるコロニーは、染色体との単一のクロスオー バー出来事の結果であり、又はｐＥＰ３及びｐＢＴＢ５８の両者が維持されてい る細胞を表わすことができる。変異誘発された細胞がＰＬＯを生成しないことを 確かめるために、細胞溶解物を血液プレート上にスポットじた。親Ｃ，ブソイド ッへルキュロシスから得られた細胞タンパク質のみが、赤血球溶菌の領域を生成 した。この結果は、変異体が、ＰＬＯを生成しないので及び非分泌性変異誘発さ れたＰＬＯタンパク質を生成しないので、羊血液プレート上に溶菌の領域を生成 できないことを示唆する。

Ｃブソイドツベルキュロシス染色体との予測される組換え出来事が生したことを 確かめるために、変異誘発の後、領域を生成できる１つの変異体、ρＢＴ８５８ を含む野生型細菌及び野生型株を、サザンブロソト分析を用いて試験した（図３ ）。Ｓａｃ　Ｉにより切断された野生型Ｃ，プソイドッベルキュロシスゲノムが ＰＬ［ｌ遺伝子を用いてプローブされる場合、単一の２．０ｋｂのハンドが観察 された（図３Ａ）。

同し手段で分析された３種のトキシマイナスｍｓから単離されたゲノムＤＮＡは 、３．４ｋｂの単一のバンドのみを示した（図３Ａ）、この結果は、欠失された ＰＬＤ／エリスロマインン耐性遺伝子カセットによる染色体ＰＬＯ遺伝子の置換 をもたらす二重クロスオーバー出来事の発生に一致する。

変異誘発後でさえ、羊血液プレートを溶解できない変異体から単離された未切断 ケ゛ツムＤＮＡがＰＬＯ遺伝子プローブを用いてプローブされる場合、ｐＢＴ８ ５８対照により生成されるハンドパターンと同一のバンドパターンが観察された 。この結果は、羊血液を溶解する能力が、ｐＢＴ８５８が細胞かみ失なわれず、 そしてＰＬＯ遺伝子が変異誘発されなかったので、保持されたことを示唆する。

同しフィルターが続いて、エリスロマイシン耐性遺伝子特異的プローブによりプ ローブされる場合、３．４ｋｂのＳａｃ　Ｉフラグメントのみがハイブリダイズ しく［３Ｂ）−このことは、エリスロマイシン遺伝子がＰＬＤｉｌｔ伝子中に組 込まれたことを確証する。

トキシマイナスＣ，プソイトツへルキュロンスにおけるＰＬＯ遺伝子の発現。Ｐ ＬＤ遺伝子を担持するプラスミドｐＥＰ２を、トキシマイナスＣ，ブソイドッへ ルキュロンス中に電気穿孔した。　ＰＬＯ活性を検出するために、形質転換体を 血液プレート上にプレート５だ。形質転換された細胞は溶解領域を生成した。こ の結果は、クローン化されたＰＬＯ遺伝子がＣ，プソイトツへルキュロシス変異 体に発現され、そしてその生成物が宿王細胞から分泌されることを示唆する。

Ｃ，ブソイドンへルキュロンスの第２のＰＬＤ陰性株（トキシマイナス■）をト キノマイナスのために同し手段で生成しだ。但し、（１）ＰＬＤ遺伝子の異なっ たクローン化されたフラグメントが組換えカセットを創造するために使用され、 そして（２）工゛Ｊスロマイシン遺伝子が図１！、：示されるＰＬＤ遺伝子に対 して反対の方向シこＰＬＤＰｓｔ１部位中にクローン化された。

ＰＬＯ遺伝子を、ｐｌｊｃ１１８のＳａｃ　１部位中に２．１ｋｂのＳａｃ　Ｔ フラグメントとしてクローン化し、そして新しい配列を決定した（図３Ｃ）。

第２　ＰＬＤ遺伝子クローンの主な特徴は、翻訳停止コドンのすく下流での推定 上の転写ターミヱーターの存在である（図３Ｃ）。トキノマイナスに関じては、 二゛ノスロマインン遺伝子の染色体ＰＬＯ遺伝子への挿入がサザンブロノト分析 により確かめられた（データは示されていない）、トキシマイナス■は、エリス ロマイシン耐性遺伝子が反対方向に染色体中に挿入されることにおいてトキノマ イナスとＰＬＯ陰性Ｃ、プソイドッベルキュロシスに対しての免疫学的応答。

毛を刈られていない生後９力月の羊を、ビルレントＰＬＯ陽性であり、且つＰＬ Ｄ欠失されたＣ、ブソイドツへルキュロシスにより接種した。

株２３１は高いＰＬＤ生成体であり、そして１３７ｅは低いＰＬＤ生成体であり 、そして両者は病原性である。血液サンプルを毎週、採取した。

血清学的転換を、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）を用いてモニターし、ここでト レーは、Ｃ，ブソイドツへルキュロノス２３１音波処理物によ／）被覆された。

Ｔ細胞応答を、１ｍｌ当たり５μｇのＣ，プソイトツへルキュロシ五音波処理物 と共にインキュベートされた完全な血液培養物へのＴ−インターフェロンの放出 を定量化することによって測定した。インターフ１０ンのレヘルを、捕獲−タノ グＥＩＡを用いてアンセイした。

その結果は、トキシマイナスＣ，プソイドツへルキュロシス株に対する有意な抗 体応答（表１）、及びまたは、明白なＴ細胞応答（図４）も示す。両領域におい て、それらは、親ビルレット株により刺激された反応に相当する。

表　１ ビルレント及びトキシマイナス株、ＥＩＡ力価ビルレント　２３１　Ｘ　１０” 　３８　３４０　４４０　２４５０ビルレント　１３７Ｅ　Ｘ　ｔｏ＠１０５　 ２４００　５１００　５４００トキシマイナスｘｌＯ’　８２　１４００　２７ ００　１９００トキシマイナス　ｘｌＯ”　８０　１６００　５８００　１４０ ００対　照　１１５　８０　７０　６４ 予防接種された羊の血清学的力価。力価は、間接的なＥＩＡにおいて被覆抗原と して株２３１音波処理物を用いて１，２５以上の吸光度を与える最後の希釈度の 逆数である。

例４ 羊における乾酪性リンパ節炎に対する免疫学的応答及び保護。λプソイドツへル キュロンストキシマイナス株の効能及び病原性の両者をさらに評価するために、 羊に、種々の用量のＣ，ブソイドツヘルキュロシストキシマイナスを、左の後脚 の蹄冠上の皮膚３ｃＩｌ中に予防接種し、そして後で、右の後脚上の同し部位中 に接種されたビルレント４Ｘ１０”Ｃ，プソイドツベルキュロシス株２３１によ り挑戦せしめた。５匹の生後９力月の羊が個々のワクチン投薬のために使用され 、そして７匹の対照の羊が予防接種を伴わないで挑戦されたパ節での病理学的試 験、及びそれらの部位からの生物の培養により評価された。すべての羊の死体解 剖し、そして組織を病理学的徴候について試験した。血清を週１度取り出し、そ してＥＩＡにより旦−ブソイドツへルキュロシス特異的抗体について試験した。

表２ 初期予防接種 対照　２　ＸＩＯ’　２　ＸＩＯ’ 血清学的結果は図５に示される。実質的な力価は、例３による予防接種により誘 発される。

２Ｘ１０’又は２　Ｘ１０’ｃｆｕのＣ，ブソイドツベルキュロシストキシマイ ナスにより接種された予防接種された動物の剖検は、左の（予防接種された）Ｍ 窩のリンパ節に存在する又はいづれか他の組織からの感染性又は培養できるワク チン株の徴候が存在しなかったことを示した。挑戦のために使用されるビルレン ト株を、すべての予防接種されていない対照、及び１０匹の予防接種された羊の うち２匹から回収した。病理学的結果は表３に示され；指摘される場合を除いて 、ビルレント株はすべての肉眼的病変から培養された。

表　３ 右の後脚の挑戦 Ｐｏｐ、　Ｓｏｌ　Ｐｏｐ、　Ｓｏｌ　Ｐｏｐ、　５ｏｌＰｏｐ、＝Ｍ窩のリン パ節；　５ＯＩ＝接種の部位（病変の大きさ、ＣＩＩＩ、（病変の数）） これらのデータは、ＰＬＤ欠失Ｃ，プソイドツへルキュロシストキシマイナス株 が、ビルレントＣ，プソイドツへルキュロシスによる挑戦に対して耐性を付与す る（但し、これは使用される挑戦体の用量で絶対的ではない）ことを示唆する。

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ｈｉｇｈ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｓ 、　１３２　：　６６−１３゜２、Ｈｏｄｇｓｏｎ、　Ａ、Ｌ、Ｍ、、　Ｂｉｒ ｄ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｎ１５ｂｅｔ、　１．Ｔ、　１９９０ａ、　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ。

ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉ ｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉｏｆ　ｔｈｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａ ｓｅ　Ｄ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋５ｅｕｄｏ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７２　：　１２５６ −１２６１゜３、Ｈｏｄｇｓｏｎ、　Ａ、Ｌ、Ｍ、、　ＫｒｙｗｕｌＬ、　Ｊ、 　ａｎｄ　Ｒａｄｆｏｒｄ、　Ａ、Ｊ、　１９９０ｂ。

Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｒｙｔｈｒｏｍｙ ｃｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｃａｒ　ｎｅｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐ！ｌＧ２．　Ｎｕｃｌｅ土ｃ　４ｃｉｄｓ 　Ｒｅｓ。

１８　：　１８９１゜ ４、　５ａＩＩｌｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、　ａｎｄ 　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　１９８９゜Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ 　：　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　２ｎｄ　ｅｄ、　Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ。

挑戦 用量 →　トキノ７ナイス　２００，０００　÷　トキノマナイス　２０．（ＸＸ）、 ０００　４″　対照力（ｉｌｌｉ、１／（希釈度＝１／２　ＭＡＸ　００１ＡＢ ＣＤ　ε　ＦＧ ＰＬＤ遺伝子・ Ａ８ＣＤＥＦＧ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：１５） （７２）発明者　ホッジワン、エイトリアン　レスリー　マーク オーストラリア国、ビクトリア　３１４５．イースト　マルバーン、アルバート 　ストリート　２２ Ｉ

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．活性ビルレンス因子を発現することができず、又は病原性生物から免疫保護 効果量の抗原を合成するコリネバクテリウム又は関連する生物を含んで成るワク チンベクター。
2. ２．前記コリネバクテリウムが、コリネバクテリウム　プソイドツベルキュロシ スである請求の範囲第１項記載のワクチンベクター。
3. ３．前記コリネバクテリウムがビルレンス遺伝子に単一の又は複数のヌクレオチ ドの置換、欠失及び／又は付加を担持する請求の範囲第１又は２項記載のワクチ ンベクター。
4. ４．前記ビルレンス遺伝子がホスホリバーゼＤをコードする請求の範囲第３項記 載のワクチンベクター。
5. ５．前記合成された抗原が組換え抗原である請求の範囲第１項記載のワクチンベ クター。
6. ６．前記組換え抗原がトキソイドである請求の範囲第５項記載のワクチンベクタ ー。
7. ７．前記関連する生物がブレビバクテリウムである請求の範囲第１項記載のワク チンベクター。
8. ８．ホスホリパーゼＤをコードする遺伝子に欠失及び／又は挿入を担持するコリ ネバクテリウム　プソイドツベルキュロシスを含んで成るワクチンベクター。
9. ９．１又は複数の医薬的に許容できるキャリヤー及び／又は希釈剤をさらに含ん で成る請求の範囲第１〜８のいづれか１項記載のワクチンベクター。
10. １０．ビルレントコリネバクテリア及び／又は関連する生物に対して動物を予防 接種するための方法であって、活性ビルレンス因子を発現することができず、又 は病原性生物から免疫保護効果量の抗原を合成するコリネバクテリウムを含んで 成るワクチンベクターの予防接種的に有効な量を前記動物に投与することを含ん で成る方法。
11. １１．前記コリネバクテリウムが、コリネバクテリウム　プソイドツベルキュロ シスである請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．前記コリネバクテリウムがビルレンス遺伝子に単一の又は複数のヌクレオ チドの置換、欠失及び／又は付加を担持する請求の範囲第１０又は１１項記載の 方法。
13. １３．前記ビルレンス遺伝子がホスホリバーゼＤをコードする請求の範囲第１２ 項記載の方法。
14. １４．前記合成された抗原が組換え抗原である請求の範囲第１０項記載の方法。
15. １５．前記組換え抗原がトキソイドである請求の範囲第１４項記載の方法。
16. １６．前記関連する生物がブレビバクテリウムである請求の範囲第１０項記載の 方法。
17. １７．前記動物が家畜動物である請求の範囲第１０項記載の方法。
18. １８．乾酪性リンパ節炎に対して家畜動物を予防接種し、そして／又はコリネバ クテリウム　プソイドツベルキュロシスにより感染された動物を処理するための 方法であって、ホスホリパーゼＤをコードする遺伝子に単一の又は複数のヌクレ オチドの置換、欠失及び／又は付加を担持するＣ．プソイドツベルキュロシスの 誘導体の免疫保護量を、現在の又は続くＣ．プソイドツベルキュロシス感染に対 して動物を免疫応答性にするのに十分な時間、及び十分な条件下で、前記動物に 投与することを含んで成る方法。
19. １９．コリネバクテリウム又は関連する生物からの変異誘発されたビルレンス遺 伝子の非活性生成物の生成方法であって、前記変異誘発された遺伝子を担持する 生物を、発現されるべき前記変異誘発された遺伝子のために十分な時間及び十分 な条件下で培養することを含んで成る方法。
20. ２０．前記コリネバクテリウムが、コリネバクテリウム　プソイドッベルキュロ シスである請求の範囲第１９項記載の方法。
21. ２１．前記ビルレンス遺伝子がホスホリバーゼＤをコードする請求の範囲第１９ 又は２０項記載の方法。
22. ２２．前記変異誘発された遺伝子が、単一の又は複数のヌクレオチドの置換、欠 失及び／又は付加を含む請求の範囲第１９項記載の方法。
23. ２３．前記生物がブレビバクテリウムである請求の範囲第１９項記載の方法。