JPH07110879B2 - モノクロナール抗体 - Google Patents
モノクロナール抗体Info
- Publication number
- JPH07110879B2 JPH07110879B2 JP63104475A JP10447588A JPH07110879B2 JP H07110879 B2 JPH07110879 B2 JP H07110879B2 JP 63104475 A JP63104475 A JP 63104475A JP 10447588 A JP10447588 A JP 10447588A JP H07110879 B2 JPH07110879 B2 JP H07110879B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- type iii
- procollagen
- peptide type
- procollagen peptide
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Separation By Low-Temperature Treatments (AREA)
- Pressure Welding/Diffusion-Bonding (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 プロコラーゲンペプチドIII型はコラーゲンのアミノ末
端プロペプチドIII型であり、このものはプロコラーゲ
ンIII型分子の分泌後に細胞外で開裂放出される。ヨー
ロッパ特許第4940号に記載されるように、体液中におけ
るこのプロコラーゲンペプチドの濃度は放射線免疫学的
測定法により測定されうる。このペプチドの血清濃度を
知ることにより例えば肝臓の繊維形成性障害の活性度に
ついて判定を下すことができる（Rohde H.氏他、「Eur.
J.Clin.Invest.」９,451〜459（1979））。
端プロペプチドIII型であり、このものはプロコラーゲ
ンIII型分子の分泌後に細胞外で開裂放出される。ヨー
ロッパ特許第4940号に記載されるように、体液中におけ
るこのプロコラーゲンペプチドの濃度は放射線免疫学的
測定法により測定されうる。このペプチドの血清濃度を
知ることにより例えば肝臓の繊維形成性障害の活性度に
ついて判定を下すことができる（Rohde H.氏他、「Eur.
J.Clin.Invest.」９,451〜459（1979））。
しかしながら血清およびその他の体液中におけるプロコ
ラーゲンペプチドIII型はこれまでに記載された方法で
は正確で選択的に測定することができない。何故なら、
これらの方法で用いられるポリクローナル抗体は、一部
はプロコラーゲンペプチドIII型の分解生成物である血
清中の種々の抗原と比較的低くかつ異なる親和性を以っ
て反応するからである（Niemela,O.氏他、「Clin.Chim.
Acta」124,39〜44（1982））。それにより血清希釈曲線
および他の体液の希釈曲線が純粋なプロコラーゲンペプ
チドIII型を用いて作成された標準曲線に対して平行と
ならず、それゆえそれぞれの未知の検体についてその抗
原濃度を希釈曲線上50％インターセプトにより測定する
ためには、抗原含量を数種の希釈度で測定する必要があ
る。
ラーゲンペプチドIII型はこれまでに記載された方法で
は正確で選択的に測定することができない。何故なら、
これらの方法で用いられるポリクローナル抗体は、一部
はプロコラーゲンペプチドIII型の分解生成物である血
清中の種々の抗原と比較的低くかつ異なる親和性を以っ
て反応するからである（Niemela,O.氏他、「Clin.Chim.
Acta」124,39〜44（1982））。それにより血清希釈曲線
および他の体液の希釈曲線が純粋なプロコラーゲンペプ
チドIII型を用いて作成された標準曲線に対して平行と
ならず、それゆえそれぞれの未知の検体についてその抗
原濃度を希釈曲線上50％インターセプトにより測定する
ためには、抗原含量を数種の希釈度で測定する必要があ
る。
ヨーロッパ特許出願第0,089,008号記載の方法を用い
て、完全無傷のプロコラーゲンペプチドIII型およびそ
の分解生成物Col 1に対しほぼ等しい親和性を有する抗
体を使用することにより前記技術的問題が解決されう
る。この方法により完全無傷のおよび分解されたプロコ
ラーゲンペプチドIII型が一緒に測定されるが、しかし
このことにより診断結果が不正確となる。何故なら正常
集団と患者集団とが大いに重なり合う可能性があるから
である。
て、完全無傷のプロコラーゲンペプチドIII型およびそ
の分解生成物Col 1に対しほぼ等しい親和性を有する抗
体を使用することにより前記技術的問題が解決されう
る。この方法により完全無傷のおよび分解されたプロコ
ラーゲンペプチドIII型が一緒に測定されるが、しかし
このことにより診断結果が不正確となる。何故なら正常
集団と患者集団とが大いに重なり合う可能性があるから
である。
今、驚くべきことに、体液中に存在するプロコラーゲン
ペプチドIII型の分解生成物と反応しないモノクローナ
ル抗体が見出された。このモノクローナル抗体を用いる
ことにより、アミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型
をその分解生成物を同時に捕捉することなく免疫学的に
測定することができ、そしてこの測定法は血清希釈曲
線、他の体液の希釈曲線および標準曲線が完全に平行と
なる点で優れている。
ペプチドIII型の分解生成物と反応しないモノクローナ
ル抗体が見出された。このモノクローナル抗体を用いる
ことにより、アミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型
をその分解生成物を同時に捕捉することなく免疫学的に
測定することができ、そしてこの測定法は血清希釈曲
線、他の体液の希釈曲線および標準曲線が完全に平行と
なる点で優れている。
それゆえ本発明は、 （１）未分解（即ち、完全無傷）のプロコラーゲンIII
型およびＣ−末端プロペプチドが欠失したプロコラーゲ
ンであるpN−コラーゲン（ピーク4a）、未分解（即ち、
完全無傷）のアミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型
（ピーク5a）ならびにCol 1およびアミノ末端プロコラ
ーゲンペプチドIII型のCol 1と同じ分子量を有する分解
生成物（ピーク6a）に対する第３図に示される反応パタ
ーンを有するモノクローナル抗体、 （２）ミエローマ細胞系統の細胞と、予めプロコラーゲ
ンペプチドIII型を用いて免疫した動物のリンパ球とを
融合させることにより形成され、前記（１）項記載の抗
体を産生するものであるハイブリドーマ細胞系統、 （３）前記（１）項記載の抗体の製法、 （４）前記（１）項記載の抗体を用いるプロコラーゲン
ペプチドIII型の定量的な免疫学的測定法、および （５）診断上受容されうる担体を混合した、前記（１）
項記載のモノクローナル抗体の有効量からなる、体液中
のプロコラーゲンペプチドIII型量を測定するための診
断用組成物、に関する。
型およびＣ−末端プロペプチドが欠失したプロコラーゲ
ンであるpN−コラーゲン（ピーク4a）、未分解（即ち、
完全無傷）のアミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型
（ピーク5a）ならびにCol 1およびアミノ末端プロコラ
ーゲンペプチドIII型のCol 1と同じ分子量を有する分解
生成物（ピーク6a）に対する第３図に示される反応パタ
ーンを有するモノクローナル抗体、 （２）ミエローマ細胞系統の細胞と、予めプロコラーゲ
ンペプチドIII型を用いて免疫した動物のリンパ球とを
融合させることにより形成され、前記（１）項記載の抗
体を産生するものであるハイブリドーマ細胞系統、 （３）前記（１）項記載の抗体の製法、 （４）前記（１）項記載の抗体を用いるプロコラーゲン
ペプチドIII型の定量的な免疫学的測定法、および （５）診断上受容されうる担体を混合した、前記（１）
項記載のモノクローナル抗体の有効量からなる、体液中
のプロコラーゲンペプチドIII型量を測定するための診
断用組成物、に関する。
以下に本発明を特にその好ましい態様に関して詳細に説
明する。
明する。
モノクローナル抗体を調製するには、動物好ましくは例
えばマウス、ラツト、ウサギ、モルモツトのような齧齒
類を、ヨーロツパ特許第4940号記載の方法に従い単離さ
れたプロコラーゲンペプチドIII型を用いアジユバント
の存在下に免疫することができる。マウス、特にSJL系
統のマウスが用いられるのが特に好ましい。例えば４〜
８週間隔でブースター注射を反復することにより免疫応
答が強められる。放射線免疫学的結合アツセイで抗体濃
度を測定することにより免疫化の成果を検査する（R.Ti
mplおよびL.Risteli、「Immunochemistry of the extra
cellular matrix」H.Furthmayr編、１,199（1982））。
リンパ球をミエローマ細胞系統と融合させる数日前に動
物をアジユバントなしのプロコラーゲンペプチドIII型
で処理する。動物のリンパ球を取得しそして同じく前記
した動物種に由来しうるがしかし好ましくはマウスに由
来するミエローマ細胞系統、特に細胞系統P3X63AG8.653
と融合させる。リンパ球を同じ種のミエローマ細胞系統
と融合させるのが好ましい。融合および細胞クローンの
培養は当業者に知られた方法で行われ、細胞培養上澄み
液中の特異的な抗体濃度を免疫学的結合アツセイにより
測定する。融合により生ずる細胞クローンから免疫学的
方法に使用するのに適するクローンを選択する。プロコ
ラーゲンペプチドIII型に対するSJL系統のマウスのリン
パ球をマウスミエローマ細胞系統P3X63AG8.653と融合さ
せることにより調製される細胞系統を用いて操作するの
が特に好ましい。この細胞系統はEuropean Collection
of Animal Cell Cultures（ECACC）PHLS Centre for Ap
plied Microbiology and Research,Porton Down,Salisb
ury,SP40JG（英国内）、に寄託番号87042308の下にブダ
ペスト条約に基づく国際寄託として寄託されている。
えばマウス、ラツト、ウサギ、モルモツトのような齧齒
類を、ヨーロツパ特許第4940号記載の方法に従い単離さ
れたプロコラーゲンペプチドIII型を用いアジユバント
の存在下に免疫することができる。マウス、特にSJL系
統のマウスが用いられるのが特に好ましい。例えば４〜
８週間隔でブースター注射を反復することにより免疫応
答が強められる。放射線免疫学的結合アツセイで抗体濃
度を測定することにより免疫化の成果を検査する（R.Ti
mplおよびL.Risteli、「Immunochemistry of the extra
cellular matrix」H.Furthmayr編、１,199（1982））。
リンパ球をミエローマ細胞系統と融合させる数日前に動
物をアジユバントなしのプロコラーゲンペプチドIII型
で処理する。動物のリンパ球を取得しそして同じく前記
した動物種に由来しうるがしかし好ましくはマウスに由
来するミエローマ細胞系統、特に細胞系統P3X63AG8.653
と融合させる。リンパ球を同じ種のミエローマ細胞系統
と融合させるのが好ましい。融合および細胞クローンの
培養は当業者に知られた方法で行われ、細胞培養上澄み
液中の特異的な抗体濃度を免疫学的結合アツセイにより
測定する。融合により生ずる細胞クローンから免疫学的
方法に使用するのに適するクローンを選択する。プロコ
ラーゲンペプチドIII型に対するSJL系統のマウスのリン
パ球をマウスミエローマ細胞系統P3X63AG8.653と融合さ
せることにより調製される細胞系統を用いて操作するの
が特に好ましい。この細胞系統はEuropean Collection
of Animal Cell Cultures（ECACC）PHLS Centre for Ap
plied Microbiology and Research,Porton Down,Salisb
ury,SP40JG（英国内）、に寄託番号87042308の下にブダ
ペスト条約に基づく国際寄託として寄託されている。
本発明によるモノクローナル抗体はイムノグロブリン
群、好ましくはIgG、IgAおよびIgMクラスのタンパク質
に属する。IgGクラスの抗体特にIgG 2bサブクラスの抗
体が用いられるのが特に好ましい。それゆえ本発明によ
る抗体は特に驚くべきものである、何故なら、抗原に対
するその親和性がポリクローナル抗体の親和性より大き
いからである。通常はこの反対のことが見られる。血清
中に存在する抗原をゲル過クロマトグラフイーにより
それらの分子量に従って分別しそしてクロマトグラフイ
ーから得られるフラクシヨンをラジオイムノアツセイに
用いると、細胞系統ECACC 87042308から得られるモノク
ローナル抗体PIIIP 296によりモノクローナル抗体の性
質が明らかとなる。その際、ポリクローナル抗体を用い
る分析では一緒に検出され、分解生成物Col 1の分子量
を有する抗原フラクシヨンは本発明によるモノクローナ
ル抗体によっては検出されないことが示される。第３図
はモノクローナル抗体が示すヒト血清のゲル過クロマ
トグラフイーの溶離プロフイルをポリクローナル抗体が
示す溶離プロフイルと比較して示す。ピーク4/4aは完全
無傷のプロコラーゲンIII型およびpN−コラーゲンIII型
に相当する（Rohde H.氏他、「Eur.J.Biochem.」135,19
7（1983））。ピーク5/5aは完全無傷のアミノ末端プロ
コラーゲンペプチドIII型（PIIIP）に相当し、一方ピー
ク6/6aはCol 1ならびにアミノ末端プロコラーゲンペプ
チドIII型のCol 1と同じ分子量を有する分解生成物に相
当する（Rohde H.氏他、「Eur.J.Bi−ochem.」135,197
（1983））。相当するフラクシヨン中における物質の濃
度はプロコラーゲンペプチドIII型標準曲線を用いて測
定されうる。
群、好ましくはIgG、IgAおよびIgMクラスのタンパク質
に属する。IgGクラスの抗体特にIgG 2bサブクラスの抗
体が用いられるのが特に好ましい。それゆえ本発明によ
る抗体は特に驚くべきものである、何故なら、抗原に対
するその親和性がポリクローナル抗体の親和性より大き
いからである。通常はこの反対のことが見られる。血清
中に存在する抗原をゲル過クロマトグラフイーにより
それらの分子量に従って分別しそしてクロマトグラフイ
ーから得られるフラクシヨンをラジオイムノアツセイに
用いると、細胞系統ECACC 87042308から得られるモノク
ローナル抗体PIIIP 296によりモノクローナル抗体の性
質が明らかとなる。その際、ポリクローナル抗体を用い
る分析では一緒に検出され、分解生成物Col 1の分子量
を有する抗原フラクシヨンは本発明によるモノクローナ
ル抗体によっては検出されないことが示される。第３図
はモノクローナル抗体が示すヒト血清のゲル過クロマ
トグラフイーの溶離プロフイルをポリクローナル抗体が
示す溶離プロフイルと比較して示す。ピーク4/4aは完全
無傷のプロコラーゲンIII型およびpN−コラーゲンIII型
に相当する（Rohde H.氏他、「Eur.J.Biochem.」135,19
7（1983））。ピーク5/5aは完全無傷のアミノ末端プロ
コラーゲンペプチドIII型（PIIIP）に相当し、一方ピー
ク6/6aはCol 1ならびにアミノ末端プロコラーゲンペプ
チドIII型のCol 1と同じ分子量を有する分解生成物に相
当する（Rohde H.氏他、「Eur.J.Bi−ochem.」135,197
（1983））。相当するフラクシヨン中における物質の濃
度はプロコラーゲンペプチドIII型標準曲線を用いて測
定されうる。
本発明による抗体の調製にとって抗原の適当な入手原を
確保することが重要である。すでに述べたように、好ま
しくはヨーロツパ特許第4940号記載の方法に従い、組織
または病的な体液をコラーゲナーゼで分解し、反応溶液
からプロコラーゲンペプチドを分離しそしてクロマトグ
ラフイー法および／または免疫吸着法の組み合わせによ
り精製してヒトまたは動物の高度精製プロコラーゲンペ
プチドIII型を単離する。
確保することが重要である。すでに述べたように、好ま
しくはヨーロツパ特許第4940号記載の方法に従い、組織
または病的な体液をコラーゲナーゼで分解し、反応溶液
からプロコラーゲンペプチドを分離しそしてクロマトグ
ラフイー法および／または免疫吸着法の組み合わせによ
り精製してヒトまたは動物の高度精製プロコラーゲンペ
プチドIII型を単離する。
本発明によるモノクローナル抗体はラジオイムノアツセ
イのすべての種類を含む種々の免疫学的方法、例えば場
合によりクロラミンＴまたはボルトン−ハンター（Bolt
on−Hunter）試薬で標識後の逐次的な飽和分析または平
衡分析（Felber,「Meth.Biochem.Anal.」22，（1974）
およびShelley氏他、「Clin.Chem.」19,146（1975））
ならびに他の競合的および非競合的結合アツセイ例えば
蛍光イムノアツセイ、エンザイムイムノアツセイ、化学
ルミネセンスイムノアツセイまたは免疫放射線測定アツ
セイ（IRMA）を含めたその他のイムノアツセイに使用さ
れうる。それゆえこのモノクローナル抗体は組織および
体液中のプロコラーゲンペプチドIII型の単離および特
性化のためならびに定量的測定のための免疫学的方法に
使用されうる。当業者に知られた方法に従い、プロコラ
ーゲンペプチドIII型を含有する液体試料を溶液中また
は固形担体上の本発明によるモノクローナル抗体と反応
させそして形成された抗原−抗体−複合物にろいプロコ
ラーゲンペプチドIII型の量を測定する。その場合プロ
コラーゲンペプチドIII型がプロコラーゲンIII型のアミ
ノ末端となお結合しているか否かは全く意味をもたな
い。免疫学的測定をこれまで妨害していたプロコラーゲ
ンペプチドIII型の分解生成物、特にCol 1は本発明によ
る抗体によっては捕捉されない。
イのすべての種類を含む種々の免疫学的方法、例えば場
合によりクロラミンＴまたはボルトン−ハンター（Bolt
on−Hunter）試薬で標識後の逐次的な飽和分析または平
衡分析（Felber,「Meth.Biochem.Anal.」22，（1974）
およびShelley氏他、「Clin.Chem.」19,146（1975））
ならびに他の競合的および非競合的結合アツセイ例えば
蛍光イムノアツセイ、エンザイムイムノアツセイ、化学
ルミネセンスイムノアツセイまたは免疫放射線測定アツ
セイ（IRMA）を含めたその他のイムノアツセイに使用さ
れうる。それゆえこのモノクローナル抗体は組織および
体液中のプロコラーゲンペプチドIII型の単離および特
性化のためならびに定量的測定のための免疫学的方法に
使用されうる。当業者に知られた方法に従い、プロコラ
ーゲンペプチドIII型を含有する液体試料を溶液中また
は固形担体上の本発明によるモノクローナル抗体と反応
させそして形成された抗原−抗体−複合物にろいプロコ
ラーゲンペプチドIII型の量を測定する。その場合プロ
コラーゲンペプチドIII型がプロコラーゲンIII型のアミ
ノ末端となお結合しているか否かは全く意味をもたな
い。免疫学的測定をこれまで妨害していたプロコラーゲ
ンペプチドIII型の分解生成物、特にCol 1は本発明によ
る抗体によっては捕捉されない。
以下の実施例により本発明を詳細に説明する。％の記載
は別に断りなければ重量によるものとする。
は別に断りなければ重量によるものとする。
実施例１ プロコラーゲンペプチドIII型（PIIIP）の調製 プロコラーゲンIII型に37℃でコラーゲナーゼを作用さ
せることによりプロコラーゲンペプチドIII型を調製す
る。その間ペプチドは何ら変性性物質には露出されな
い。比較的大量のペプチドを調製するには、改良法が用
いられる。コラーゲナーゼを作用させるまでのすべての
工程は冷却室中で行われる。可溶化に用いられる種々の
NaCl溶液は0.05Mトリス−HCl（pH7.4）、0.01M EDTA、
ナトリウムアジド（200mg/ml）およびプロテアーゼ阻害
剤フエニルメチルスルホニルフルオライド（３μg/ml）
およびｐ−クロロメルクリベンゾエート（３μg/ml）を
含有する。
せることによりプロコラーゲンペプチドIII型を調製す
る。その間ペプチドは何ら変性性物質には露出されな
い。比較的大量のペプチドを調製するには、改良法が用
いられる。コラーゲナーゼを作用させるまでのすべての
工程は冷却室中で行われる。可溶化に用いられる種々の
NaCl溶液は0.05Mトリス−HCl（pH7.4）、0.01M EDTA、
ナトリウムアジド（200mg/ml）およびプロテアーゼ阻害
剤フエニルメチルスルホニルフルオライド（３μg/ml）
およびｐ−クロロメルクリベンゾエート（３μg/ml）を
含有する。
ウシ胎児の皮膚（3kg）を1M NaCl 10l中でホモジナイズ
しそして２日間抽出する。抽出溶液に最終濃度2.5Mとな
るまで固形NaClを添加することにより溶解コラーゲンを
沈澱させる。一夜攪拌したのち遠心分離（1800×ｇ、20
分）することにより沈澱を集め、2.5M NaClを用いて２
回洗い、そして0.5M NaCl 10l中で一夜攪拌することに
より再び溶解させる。少量の不溶物質を遠心分離により
除去する。コラーゲンIII型およびプロコラーゲンIII型
のかくして得られた混合物を1.6M NaClを用いて沈澱さ
せる。この沈澱を0.05Mトリス−HCl（pH8.0）2l中に懸
濁させそして0.02M CaCl2を添加したのち50℃で20分間
加熱し、次に湿った沈澱1g当たり1500Uの細菌性コラー
ゲナーゼ（CLSPA、Worthington、米国）と37℃で３時間
インキユベートする。コラーゲナーゼを作用させたのち
生成した沈澱を遠心分離により除去しそして溶液を0.00
5Mトリス−HCl（pH8）、6.8M尿素で透析し、そして同じ
緩衝液で平衡となしたDEAEセルロースカラム（5.0×30c
m）に加える。
しそして２日間抽出する。抽出溶液に最終濃度2.5Mとな
るまで固形NaClを添加することにより溶解コラーゲンを
沈澱させる。一夜攪拌したのち遠心分離（1800×ｇ、20
分）することにより沈澱を集め、2.5M NaClを用いて２
回洗い、そして0.5M NaCl 10l中で一夜攪拌することに
より再び溶解させる。少量の不溶物質を遠心分離により
除去する。コラーゲンIII型およびプロコラーゲンIII型
のかくして得られた混合物を1.6M NaClを用いて沈澱さ
せる。この沈澱を0.05Mトリス−HCl（pH8.0）2l中に懸
濁させそして0.02M CaCl2を添加したのち50℃で20分間
加熱し、次に湿った沈澱1g当たり1500Uの細菌性コラー
ゲナーゼ（CLSPA、Worthington、米国）と37℃で３時間
インキユベートする。コラーゲナーゼを作用させたのち
生成した沈澱を遠心分離により除去しそして溶液を0.00
5Mトリス−HCl（pH8）、6.8M尿素で透析し、そして同じ
緩衝液で平衡となしたDEAEセルロースカラム（5.0×30c
m）に加える。
カラムに結合したタンパク質をNaCl溶液を用いその濃度
を０〜0.3Mまで上昇させながら洗い出す。合計溶出量は
2lである。カラムから流出した溶液を236nmでの吸収お
よびプロコラーゲンIII型のアミノ末端セグメントに対
して特異的な抗体を用いてその抗原活性について検査す
る。通常、カラムから溶離される最後のピークがプロコ
ラーゲンペプチドIII型を含有する。このペプチドを蒸
留水で透析することにより脱塩しそして凍結乾燥する。
それ以上の精製は1M CaCl2、0.05Mトリス−HCl（pH7.
5）を用いて平衡化したアガロースA 1.5Mを含有するカ
ラム（２×120cm）上で行われる。
を０〜0.3Mまで上昇させながら洗い出す。合計溶出量は
2lである。カラムから流出した溶液を236nmでの吸収お
よびプロコラーゲンIII型のアミノ末端セグメントに対
して特異的な抗体を用いてその抗原活性について検査す
る。通常、カラムから溶離される最後のピークがプロコ
ラーゲンペプチドIII型を含有する。このペプチドを蒸
留水で透析することにより脱塩しそして凍結乾燥する。
それ以上の精製は1M CaCl2、0.05Mトリス−HCl（pH7.
5）を用いて平衡化したアガロースA 1.5Mを含有するカ
ラム（２×120cm）上で行われる。
実施例２ ハイブリドーマの生成 SJL系統のマウスを完全フロインドアジユバントの存在
下に実施例１により得られたプロコラーゲンペプチドII
I型５μｇを用いて筋肉内免疫する。４週間後および３
カ月後に５μｇのプロコラーゲンペプチドIII型を不完
全フロインドアジユバントの存在下にさらに筋肉内注射
することにより免疫反応を強化させる。融合の３日前に
さらに50μｇのプロコラーゲンペプチドIII型を腹腔内
注射することにより免疫応答を強化させる。
下に実施例１により得られたプロコラーゲンペプチドII
I型５μｇを用いて筋肉内免疫する。４週間後および３
カ月後に５μｇのプロコラーゲンペプチドIII型を不完
全フロインドアジユバントの存在下にさらに筋肉内注射
することにより免疫反応を強化させる。融合の３日前に
さらに50μｇのプロコラーゲンペプチドIII型を腹腔内
注射することにより免疫応答を強化させる。
融合させるには動物を殺しそして脾臓細胞を単離する。
ポリエチレングリコールの存在下にこの脾臓細胞をミエ
ローマ細胞系統P3X63AG8.653と融合させる。融合混合物
をヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地中で
２週間培養することにより脾臓細胞×P3X63AG8.653ハイ
ブリツドを選択する。安定した細胞系統を得るには得ら
れた細胞クローンを数回サブクローンする。形成された
細胞コロニーを放射線免疫学的結合アツセイにおいて抗
体産生について検査する。モノクローナル抗体PIIIP 29
6を産生する細胞系統はECACCに寄託番号87042308の下に
寄託されている。
ポリエチレングリコールの存在下にこの脾臓細胞をミエ
ローマ細胞系統P3X63AG8.653と融合させる。融合混合物
をヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地中で
２週間培養することにより脾臓細胞×P3X63AG8.653ハイ
ブリツドを選択する。安定した細胞系統を得るには得ら
れた細胞クローンを数回サブクローンする。形成された
細胞コロニーを放射線免疫学的結合アツセイにおいて抗
体産生について検査する。モノクローナル抗体PIIIP 29
6を産生する細胞系統はECACCに寄託番号87042308の下に
寄託されている。
実施例３ 放射線免疫結合アツセイ 細胞培養上澄み液、あるいは例えばマウスの腹腔中で細
胞を培養した後の腹水のような他の試料300μｌを125I
を用いて放射性標識したプロコラーゲンペプチドIII型
溶液（タンパク質1ng/100μｌ、ヨーロツパ特許第4940
号実施例１記載のようにして調製）100μｌと一夜イン
キユベーシヨンする。形成された抗原−抗体−複合物は
羊または他の種の抗マウス1gG血清を添加することによ
り沈澱させる。遠心分離および上澄み液をデカンテーシ
ヨンしたのち沈澱した放射能の量をγ−シンチレーシヨ
ン分光計で測定する。
胞を培養した後の腹水のような他の試料300μｌを125I
を用いて放射性標識したプロコラーゲンペプチドIII型
溶液（タンパク質1ng/100μｌ、ヨーロツパ特許第4940
号実施例１記載のようにして調製）100μｌと一夜イン
キユベーシヨンする。形成された抗原−抗体−複合物は
羊または他の種の抗マウス1gG血清を添加することによ
り沈澱させる。遠心分離および上澄み液をデカンテーシ
ヨンしたのち沈澱した放射能の量をγ−シンチレーシヨ
ン分光計で測定する。
実施例４ ラジオイムノアツセイ 分析すべき検体またはプロコラーゲンペプチドIII型標
準物0.2mlを標識された抗原の量に関して限定された量
のPIIIP 296（緩衝液0.1ml中）および125Iで標識された
プロコラーゲンペプチドIII型0.1ml（タンパク質1ng含
有）と４℃で一夜インキユベーシヨンする。次に10％ポ
リエチレングリコール（PEG 6000）の存在下に羊の予め
検査された量の抗マウス1gG血清と１時間インキユベー
シヨンする。沈澱した抗原−抗体複合物を遠心分離（15
00×ｇ）しそしてデカンテーシヨンしたのち放射能をγ
−シンチレーシヨン分光計で測定する。
準物0.2mlを標識された抗原の量に関して限定された量
のPIIIP 296（緩衝液0.1ml中）および125Iで標識された
プロコラーゲンペプチドIII型0.1ml（タンパク質1ng含
有）と４℃で一夜インキユベーシヨンする。次に10％ポ
リエチレングリコール（PEG 6000）の存在下に羊の予め
検査された量の抗マウス1gG血清と１時間インキユベー
シヨンする。沈澱した抗原−抗体複合物を遠心分離（15
00×ｇ）しそしてデカンテーシヨンしたのち放射能をγ
−シンチレーシヨン分光計で測定する。
種々の濃度のプロコラーゲンペプチドIII型を含有する
標準物を用いて作成した標準曲線と比較することにより
未知溶液中のプロコラーゲンペプチドIII型の濃度が測
定されうる。
標準物を用いて作成した標準曲線と比較することにより
未知溶液中のプロコラーゲンペプチドIII型の濃度が測
定されうる。
第1a図はPIIIP 296を用いた場合の、そして第1b図は比
較物としてヨーロツパ特許第4940号記載の方法に従いポ
リクローナル抗体を用いた場合の標準曲線（１）および
血清希釈曲線（２）を示す。
較物としてヨーロツパ特許第4940号記載の方法に従いポ
リクローナル抗体を用いた場合の標準曲線（１）および
血清希釈曲線（２）を示す。
実施例５ PIIIP 296の放射性標識化 pH7.4の0.05M燐酸塩緩衝液中のモノクローナルPIIIP 29
6 0.2mgを含有する溶液0.2mlをポリスチレン試験管（12
×55mm）中に入れそしてpH7.4の0.5M燐酸塩緩衝液10μ
ｌで緩衝した100MBqのNa125I溶液を加える。これに20μ
ｇのクロラミンＴの水溶液50μｌを添加したのち１分間
混合する。次にナトリウムビサルフアイト20μｇの水溶
液50μｌを添加することにより沃素化反応を停止させ
る。
6 0.2mgを含有する溶液0.2mlをポリスチレン試験管（12
×55mm）中に入れそしてpH7.4の0.5M燐酸塩緩衝液10μ
ｌで緩衝した100MBqのNa125I溶液を加える。これに20μ
ｇのクロラミンＴの水溶液50μｌを添加したのち１分間
混合する。次にナトリウムビサルフアイト20μｇの水溶
液50μｌを添加することにより沃素化反応を停止させ
る。
次に未反応のNa125Iをアニオン交換体でのクロマトグラ
フイーにより125I標識されたPIIIP 296から除去する。
精製された125I−標識抗体を含有するクロマトグラフイ
ーフラクシヨンをpH8.0の0.05Mトリス−HCl緩衝液１
中の20gのツイーン（Tween）20および14.6gのNa2EDTAか
らなる溶液を用いて、標識された抗体の濃度が200μg/l
となるまで希釈する。
フイーにより125I標識されたPIIIP 296から除去する。
精製された125I−標識抗体を含有するクロマトグラフイ
ーフラクシヨンをpH8.0の0.05Mトリス−HCl緩衝液１
中の20gのツイーン（Tween）20および14.6gのNa2EDTAか
らなる溶液を用いて、標識された抗体の濃度が200μg/l
となるまで希釈する。
実施例６ 試験管の抗体による被覆 ポリスチレン試験管（12×75mm）に抗体を固定させるた
めに各試験管中にpH6.4の0.01M燐酸ナトリウム緩衝液１
当たり4mgのモノクローナルPIIIP 296を含有する溶液
300μｌを加え室温で一夜インキユベーシヨンする。次
に抗体溶液を吸引により除去する。pH7.5の0.05Mトリス
−サイトレート緩衝液中の牛血清アルブミンの１％溶液
500μｌを各試験管に加え室温で一夜インキユベーシヨ
ンする。次にこの溶液を吸引により除去する。抗体で被
覆された試験管をシリカゲルで乾燥する。
めに各試験管中にpH6.4の0.01M燐酸ナトリウム緩衝液１
当たり4mgのモノクローナルPIIIP 296を含有する溶液
300μｌを加え室温で一夜インキユベーシヨンする。次
に抗体溶液を吸引により除去する。pH7.5の0.05Mトリス
−サイトレート緩衝液中の牛血清アルブミンの１％溶液
500μｌを各試験管に加え室温で一夜インキユベーシヨ
ンする。次にこの溶液を吸引により除去する。抗体で被
覆された試験管をシリカゲルで乾燥する。
実施例７ 免疫放射線測定アツセイ 分析すべき検体0.1mlまたはプロコラーゲンIII型標準物
0.1mlを、予め1.2μｇのモノクローナルPIIIP 296で被
覆したポリスチレン試験管中で燐酸塩緩衝食塩溶液（PB
S）0.1mlを添加して室温で２時間インキユベーシヨンす
る。次に試験管を1mlずつのPBSで２回洗いそしてデカン
テーシヨンする。この試験管に125Iで標識したモノクロ
ーナルPIIIP−抗体200μｌ（抗体40μｇを含有）を加え
室温で２時間インキユベーシヨンする。PBS1mlずつで２
回洗い、デカンテーシヨンしたのち試験管壁に結合した
抗体−抗原−125I−抗体複合物の放射能をシンチレーシ
ヨン測定装置で計測する。
0.1mlを、予め1.2μｇのモノクローナルPIIIP 296で被
覆したポリスチレン試験管中で燐酸塩緩衝食塩溶液（PB
S）0.1mlを添加して室温で２時間インキユベーシヨンす
る。次に試験管を1mlずつのPBSで２回洗いそしてデカン
テーシヨンする。この試験管に125Iで標識したモノクロ
ーナルPIIIP−抗体200μｌ（抗体40μｇを含有）を加え
室温で２時間インキユベーシヨンする。PBS1mlずつで２
回洗い、デカンテーシヨンしたのち試験管壁に結合した
抗体−抗原−125I−抗体複合物の放射能をシンチレーシ
ヨン測定装置で計測する。
種々の濃度のプロコラーゲンペプチドIII型を含有する
標準物を用いて作成した標準曲線と比較することにより
未知検体溶液中のプロコラーゲンペプチドIII型の濃度
が計算されうる。第２図は放射線免疫測定アツセイの標
準曲線を示す（B/Tは結合抗体／総抗体を意味する）。
標準物を用いて作成した標準曲線と比較することにより
未知検体溶液中のプロコラーゲンペプチドIII型の濃度
が計算されうる。第２図は放射線免疫測定アツセイの標
準曲線を示す（B/Tは結合抗体／総抗体を意味する）。
実施例９ ヒト血清中におけるPIIIP 296と反応する抗原の分子量
分布の測定 非イオン界面活性剤例えばポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレート（ツイーン20）0.04％を含有する燐酸
塩緩衝食塩水（PBS）中で平衡となした、N,N′−メチレ
ンビスアクリルアミドと架橋したアリルデキストラン
〔Sephacryl S300カラム（1.6×130cm）〕でのゲル
過クロマトグラフイーにより血清1mlを3.3mlずつのフラ
クシヨンに分別する。このフラクシヨンの0.2mlずつを
実施例４記載のラジオイムノアツセイに用いる。第３図
はPIIIP 296を用いて測定された抗原の溶離プロフイル
をポリクローナル抗体を用いて測定された抗原のプロフ
イルに比較して示す。
分布の測定 非イオン界面活性剤例えばポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレート（ツイーン20）0.04％を含有する燐酸
塩緩衝食塩水（PBS）中で平衡となした、N,N′−メチレ
ンビスアクリルアミドと架橋したアリルデキストラン
〔Sephacryl S300カラム（1.6×130cm）〕でのゲル
過クロマトグラフイーにより血清1mlを3.3mlずつのフラ
クシヨンに分別する。このフラクシヨンの0.2mlずつを
実施例４記載のラジオイムノアツセイに用いる。第３図
はPIIIP 296を用いて測定された抗原の溶離プロフイル
をポリクローナル抗体を用いて測定された抗原のプロフ
イルに比較して示す。
第３図において ピーク4/4aはpN−コラーゲンおよび完全無傷のアミノ末
端プロコラーゲンIII型に相当する。
端プロコラーゲンIII型に相当する。
ピーク5/5aはアミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型
＝（PIIIP）に相当する。
＝（PIIIP）に相当する。
ピーク6/6aはCol 1およびアミノ末端プロコラーゲンペ
プチドIII型のCol 1と同じ分子量を有する分解生成物に
相当する。
プチドIII型のCol 1と同じ分子量を有する分解生成物に
相当する。
関連するフラクシヨン中の物質濃度はプロコラーゲンペ
プチドIII型標準曲線を用いて測定されうる。
プチドIII型標準曲線を用いて測定されうる。
第1a図はPIIIP 296を用いた場合の、そして第1b図は比
較物としてヨーロツパ特許第4940号記載の方法に従いポ
リクローナル抗体を用いた場合の標準曲線（１）および
血清希釈曲線（２）を示す。 第２図は放射線免疫測定アツセイの標準曲線を示す（B/
Tは結合抗体／総抗体を意味する）第３図はPIIIP 296を
用いて測定された抗原の溶離プロフイルをポリクローナ
ル抗体を用いて測定された抗原のプロフイルに比較して
示す。
較物としてヨーロツパ特許第4940号記載の方法に従いポ
リクローナル抗体を用いた場合の標準曲線（１）および
血清希釈曲線（２）を示す。 第２図は放射線免疫測定アツセイの標準曲線を示す（B/
Tは結合抗体／総抗体を意味する）第３図はPIIIP 296を
用いて測定された抗原の溶離プロフイルをポリクローナ
ル抗体を用いて測定された抗原のプロフイルに比較して
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ユルゲン・ピユンター ドイツ連邦共和国デー‐6238 ホフハイ ム・アム・タウヌス．ライヒエンベルガー ヴエーク 11 (72)発明者 ヘルムート・シユトレツカー ドイツ連邦共和国デー‐6102 プフングシ ユタト．オーデンヴアルトシユトラーセ 56 (72)発明者 ルーペルト・テイムプル ドイツ連邦共和国デー‐8035 ガウテイン グ．ユーリウス‐ヘルリンシユトラーセ ３ (56)参考文献 特開 昭58−168961（ＪＰ，Ａ) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，135 ［２］（1983）Ｐ．197−202 Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，108［３ ］（1982）Ｐ．310−318
Claims (10)
- 【請求項１】未分解のプロコラーゲンIII型およびＣ−
末端プロペプチドが欠失したプロコラーゲンであるpN−
コラーゲンIII型（ピーク4a）、未分解のアミノ末端プ
ロコラーゲンペプチドIII型（ピーク5a）ならびにCol1
およびアミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型のCol1
と同じ分子量を有する分解生成物（ピーク6a）に対して
下図に＋の記号でプロットされた反応パターンを有する
モノクローナル抗体。 上記図は、モノクローナル抗体が示すヒト血清のゲル濾
過クロマトグラフィーの溶離プロフィル（＋）を、ポリ
クローナル抗体が示す溶離プロフィル（○）と比較して
示したものである。図において横軸はゲル濾過クロマト
グラフィーのフラクションを、縦軸は該フラクション中
の抗原濃度を示す。 - 【請求項２】アミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型
のエピトープでありかつCo１中には存在しないエピト
ープに対してのみ反応する請求項１記載のモノクローナ
ル抗体。 - 【請求項３】IgGクラスに属するものである請求項１ま
たは２記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】ミエローマ系統の細胞と、予めプロコラー
ゲンペプチドIII型を用いて免疫した動物（但し、ヒト
を除く）のリンパ球とを融合させることにより形成され
たハイブリドーマにより産生されることからなる請求項
１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項５】予めプロコラーゲンペプチドIII型を用い
て免疫したSJL系統のマウスのリンパ球をマウスミエロ
ーマ細胞系統P3×63AG 8.653と融合させて得られるハイ
ブリドーマ細胞系統ECACC 87042308が産生する請求項１
の図に示される反応パターンを有するモノクローナル抗
体PIIIP296。 - 【請求項６】ミエローマ細胞系統の細胞と、予めプロコ
ラーゲンペプチドIII型を用いて免疫した動物のリンパ
球とを融合させることにより形成され、請求項１〜５の
いずれかに記載の抗体を産生するものであるハイブリド
ーマ細胞系統。 - 【請求項７】予めプロコラーゲンペプチドIII型を用い
て免疫したSJL系統のマウスのリンパ球をマウスミエロ
ーマ細胞系統P3×63AG 8.653と融合させて得られ、請求
項１の図に示す反応パターンを有するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞系統ECACC 87042308。 - 【請求項８】アミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型
に対するモノクローナル抗体を調製するにあたり、 ａ）動物（但しヒトを除く）をアミノ末端プロコラーゲ
ンペプチドIII型を用いて免疫し、 ｂ）リンパ球を単離しそしてエミローマ細胞と融合さ
せ、 ｃ）請求項１〜５のいずれかに記載の性質を有する抗体
が存在するハイブリッドを選択してクローンさせ、そし
て ｄ）前記クローンから抗体を取得する ことからなる方法。 - 【請求項９】工程ｄ）を実施するのにハイブリドーマ細
胞系統ECACC 87042308が用いられることからなる請求項
８記載の方法。 - 【請求項１０】プロコラーゲンペプチドIII型を抗体を
用いて定量的に免疫学的に測定するに当たり、 ａ）アミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型またはプ
ロコラーゲンIII型を含有する液体試料を請求項１〜５
のいずれかに記載のモノクローナル抗体と反応させそし
て ｂ）形成された抗原−抗体複合物によりアミノ末端プロ
コラーゲンペプチドIII型またはプロコラーゲンの量を
測定する ことからなる方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3714633 | 1987-05-02 | ||
| DE3714633.5 | 1987-05-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63296695A JPS63296695A (ja) | 1988-12-02 |
| JPH07110879B2 true JPH07110879B2 (ja) | 1995-11-29 |
Family
ID=6326685
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63104475A Expired - Lifetime JPH07110879B2 (ja) | 1987-05-02 | 1988-04-28 | モノクロナール抗体 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0289930B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07110879B2 (ja) |
| AT (1) | ATE89862T1 (ja) |
| DE (1) | DE3881275D1 (ja) |
| DK (1) | DK169583B1 (ja) |
| ES (1) | ES2056850T3 (ja) |
| FI (1) | FI96433C (ja) |
| IE (1) | IE63371B1 (ja) |
| NO (1) | NO173104C (ja) |
| PT (1) | PT87376B (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5679583A (en) * | 1987-05-02 | 1997-10-21 | Hoechst Aktiengesellschaft | Monoclonal antibodies for the selective immunological determination of intact procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) in body fluids |
| GB2208865B (en) * | 1987-08-19 | 1991-12-11 | Farmos Group Ltd | Purified propeptide of procollagen type iii, antibody to the propeptide and assay method using the antibody. |
| US6010862A (en) * | 1987-11-06 | 2000-01-04 | Washington Research Foundation | Methods of detecting collagen type III degradation in vivo |
| EP1086135B1 (en) | 1998-05-28 | 2004-02-25 | Bayer HealthCare AG | "monoclonal anitbody and assay for detecting n-terminal procollagen (iii) propeptide (piiinp)" |
| US6602980B1 (en) | 1998-06-19 | 2003-08-05 | Washington Research Foundation | Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays |
| US6916903B2 (en) | 1998-06-19 | 2005-07-12 | Washington Research Foundation | Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3209149A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-10-06 | Hoechst Ag | Verfahren zur gemeinsamen immunologischen bestimmung von prokollagen-peptid (typ iii) und prokollagen-peptid col 1 (typ iii) und verfahren zur herstellung von anti-prokollagen-peptid col 1 (typ iii)-serum |
-
1988
- 1988-04-27 AT AT88106748T patent/ATE89862T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-04-27 DE DE8888106748T patent/DE3881275D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-27 EP EP88106748A patent/EP0289930B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-27 ES ES88106748T patent/ES2056850T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-28 DK DK232888A patent/DK169583B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-04-28 JP JP63104475A patent/JPH07110879B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-29 IE IE129088A patent/IE63371B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-04-29 FI FI882019A patent/FI96433C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-04-29 PT PT87376A patent/PT87376B/pt active IP Right Grant
- 1988-04-29 NO NO881905A patent/NO173104C/no not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１０８［３（１９８２）Ｐ．３１０−３１８ |
| Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３５［２（１９８３）Ｐ．１９７−２０２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE89862T1 (de) | 1993-06-15 |
| NO881905L (no) | 1988-11-03 |
| DK232888D0 (da) | 1988-04-28 |
| ES2056850T3 (es) | 1994-10-16 |
| IE63371B1 (en) | 1995-04-19 |
| EP0289930A3 (de) | 1991-06-12 |
| DK232888A (da) | 1988-11-03 |
| FI96433B (fi) | 1996-03-15 |
| EP0289930A2 (de) | 1988-11-09 |
| FI96433C (fi) | 1996-06-25 |
| PT87376B (pt) | 1992-08-31 |
| FI882019A (fi) | 1988-11-03 |
| IE881290L (en) | 1988-11-02 |
| JPS63296695A (ja) | 1988-12-02 |
| PT87376A (pt) | 1989-05-31 |
| EP0289930B1 (de) | 1993-05-26 |
| NO173104B (no) | 1993-07-19 |
| DE3881275D1 (de) | 1993-07-01 |
| DK169583B1 (da) | 1994-12-12 |
| NO881905D0 (no) | 1988-04-29 |
| NO173104C (no) | 1993-10-27 |
| FI882019A0 (fi) | 1988-04-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8501415B2 (en) | Identification of TSH receptor autoantibodies using affinity-purified antibodies | |
| US5382515A (en) | Creative kinase-MB immunoassay for myocardial infarction and reagents | |
| CA2008360A1 (en) | Myocardial infarction immunoassay | |
| JPH0720437B2 (ja) | モノクロナ−ル抗体 | |
| JP2001512143A (ja) | コラーゲン−ペプチドアッセイ法 | |
| FI95579B (fi) | Immunologinen menetelmä intaktin prokollageenipeptidin (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) määrittämiseksi selektiivisesti elimistönesteistä ja väline sen toteuttamiseksi | |
| CA1338324C (en) | Monoclonal antibody for the selective immunological determination of intact procollagen peptide (type iii) and procollagen (type iii) in body fluids | |
| EP1852442B1 (en) | Antibody for assay of adamts13 activity and method of activity assay | |
| JP3018110B2 (ja) | モノクローナル抗体 | |
| US20040248216A1 (en) | Method of examining cancer by assaying autoantibody against mdm2 and reagent therefor | |
| JPH07110879B2 (ja) | モノクロナール抗体 | |
| US5679583A (en) | Monoclonal antibodies for the selective immunological determination of intact procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) in body fluids | |
| JP2622260B2 (ja) | Ｉｆｎ−オメガに対する新規モノクローナル抗体、その製造方法、及びｉｆｎ−オメガの精製及び検出におけるその使用 | |
| US5514599A (en) | Antibodies against highly conserved amino acid sequences of insulin a process for the preparation of these antibodies and the use thereof in immunoassays | |
| JPH0667319B2 (ja) | Ａｎｐのｃ端側を認識するモノクローナル抗体 | |
| EP0504423A1 (en) | Method and kit for immunoassay of propeptide of osteocalcin and proosteocalcin | |
| JP3778979B2 (ja) | Ｎ−ペプチドのサンドイッチ免疫学的測定法 | |
| JP2845347B2 (ja) | オステオカルシンのプロペプチド、プロオステオカルシンを免疫学的に測定するための方法及びキツト | |
| JP2005502711A (ja) | Ａａ４ｒｐアッセイのための組成物および方法 | |
| JPH11236399A (ja) | モノクローナル抗体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071129 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081129 Year of fee payment: 13 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081129 Year of fee payment: 13 |