JPH11169182A - Mutant type secretion device gene that efficiently secrets protein in the cell bodies of corynebacterium - Google Patents
Mutant type secretion device gene that efficiently secrets protein in the cell bodies of corynebacteriumInfo
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- JPH11169182A JPH11169182A JP9361768A JP36176897A JPH11169182A JP H11169182 A JPH11169182 A JP H11169182A JP 9361768 A JP9361768 A JP 9361768A JP 36176897 A JP36176897 A JP 36176897A JP H11169182 A JPH11169182 A JP H11169182A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、コリネ型細菌にお
いて、蛋白質の分泌を効率よく行わせる変異型分泌装置
を構成する蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡに関する。
本発明の変異型分泌装置遺伝子を保有するコリネ型細菌
においては、工業的レベルにおいて所定の蛋白質を効率
よく培地中へ分泌生産させることが可能である。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a gene DNA encoding a protein constituting a mutant secretory apparatus that efficiently secretes proteins in coryneform bacteria.
In a coryneform bacterium having the mutant secretory apparatus gene of the present invention, it is possible to efficiently secrete and produce a predetermined protein into a medium at an industrial level.
【０００２】[0002]
【従来の技術】コリネ型細菌による蛋白質の分泌につい
ては今日まであまり研究が進んでいない。Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍによるＤＮ
ａｓｅの分泌［米国特許第４９６５１９７号明細書］及
びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍの細胞壁蛋白質であるＰＳ１・ＰＳ２の分泌［国際
公開第ＷＯ９３／０３１５８号］に関する研究が報告さ
れているにすぎない。また、コリネ型細菌由来の分泌装
置（トランスロケーションマシナリー）を構成する主要
因子についても、ＳｅｃＹ［特開平６−１６９７８０号
公報］、ＳｅｃＥ［特開平６−２７７０７３号公報］及
びＳｅｃＡ［特開平７−１０７９８１号公報］をコード
する遺伝子を各々単離したという報告があるのみであ
り、系統的な研究は行われていない。2. Description of the Related Art The secretion of proteins by coryneform bacteria has not been studied so far. Coryne
DN by B. glutamicum
secretion [US Pat. No. 4,965,197] and Corynebacterium glutamic.
Only research on the secretion of PS1 and PS2, which are cell wall proteins of um [WO 93/03158], has been reported. In addition, regarding the main factors constituting the secretory apparatus (translocation machinery) derived from coryneform bacteria, SecY [JP-A-6-169780], SecE [JP-A-6-277703] and SecA [JP-A-7-207] No. 107981] has only been reported to have isolated each gene, and no systematic study has been carried out.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】これらの野生型の分泌
装置を構成する主要因子を用いて分泌蛋白質の分泌量を
増加させる試みは十分ではなく、工業的レベルで必要と
考えられている、野生型の装置を用いた場合の少なくと
も２〜３倍、望ましくは４倍以上の分泌量は達成されて
いない。Attempts to increase the secretion amount of secretory proteins using the main factors constituting these wild-type secretory apparatus have not been sufficient, and it has been considered necessary to increase the amount of secreted proteins at the industrial level. At least 2-3 times, and desirably 4 times or more the secretion amount when using a device of the type is not achieved.
【０００４】本発明は、工業的レベルにおいて、所定の
蛋白質を培地中へ効率よく分泌させるために必要な変異
型分泌装置をコードするコリネ型細菌由来のＤＮＡの提
供を目的とする。[0004] It is an object of the present invention to provide a DNA derived from a coryneform bacterium which encodes a mutant secretory apparatus necessary for efficiently secreting a predetermined protein into a medium at an industrial level.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌内
で、所定の蛋白質を培地中へ効率よく分泌させるために
必要な変異型分泌装置をコードする遺伝子ＤＮＡを見い
出し、本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, it has become necessary to efficiently secrete a predetermined protein into a culture medium in coryneform bacteria. The present inventors have found gene DNA encoding a mutant secretion apparatus, and have completed the present invention.
【０００６】かくして本発明によれば、配列番号２のア
ミノ酸配列における４４位のアミノ酸残基に相当するア
ミノ酸残基がフェニルアラニン残基である配列番号２の
アミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有する蛋白質を
コードするＤＮＡであって、前記蛋白質を含んで構成さ
れる分泌装置は、コリネ型細菌内で、所定の蛋白質を、
配列番号１３のアミノ酸配列を有する蛋白質を含んで構
成される分泌装置よりも効率よく分泌させるＤＮＡ（以
下、本発明ＤＮＡともいう）、該ＤＮＡを導入した組換
えプラスミド、及び、該プラスミドを保有するコリネ型
細菌が提供される。Thus, according to the present invention, there is provided a protein having an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 wherein the amino acid residue corresponding to the amino acid residue at position 44 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is a phenylalanine residue. A secretory apparatus, which is a DNA encoding and comprises the protein, comprises:
DNA that secretes more efficiently than a secretion apparatus including a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 (hereinafter, also referred to as DNA of the present invention), a recombinant plasmid into which the DNA has been introduced, and the plasmid Coryneform bacteria are provided.
【０００７】本発明ＤＮＡは、好ましくは、配列番号２
のアミノ酸配列をコードする。具体的には、配列番号１
の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。コリネ型細菌
は、好ましくは、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevi
bacterium flavum)ＭＪ−２３３である。[0007] The DNA of the present invention preferably comprises SEQ ID NO: 2.
Encodes the amino acid sequence of Specifically, SEQ ID NO: 1
DNA having the base sequence of The coryneform bacterium is preferably Brevibacterium flavum.
bacterium flavum) MJ-233.
【０００８】組み換えプラスミドは、さらに、コリネ型
細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡを含む
ことが好ましい。[0008] It is preferable that the recombinant plasmid further contains a DNA containing a gene responsible for the replication growth function in coryneform bacteria.
【０００９】[0009]
【発明の実施の形態】以下、本発明についてさらに詳細
に説明する。本発明ＤＮＡは、コリネ型細菌内で生産さ
れた所定の蛋白質を菌体外（例えば培地中）へ効率よく
分泌生産させるために必要な分泌装置を構成する蛋白質
をコードするものであって、コリネ型細菌の染色体上、
もしくは染色体外に存在させることによって使用するも
のである。すなわち、本発明ＤＮＡは、染色体上、もし
くは染色体外に存在し、分泌蛋白質前駆体のＮ末端配列
を認識し、該分泌蛋白質を培地中に分泌生産させる分泌
装置を構成する蛋白質の遺伝子を意味するものである。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in more detail. The DNA of the present invention encodes a protein constituting a secretory apparatus necessary for efficiently secreting and producing a predetermined protein produced in a coryneform bacterium outside the cell (for example, in a culture medium). On the chromosome of a type bacterium,
Alternatively, it is used by causing it to exist outside the chromosome. That is, the DNA of the present invention refers to a gene of a protein that exists on a chromosome or extrachromosome, recognizes the N-terminal sequence of a secretory protein precursor, and constitutes a secretory apparatus that secretes and produces the secretory protein in a medium. Things.
【００１０】本発明ＤＮＡがコードする蛋白質を含んで
構成される変異型分泌装置は、蛋白質の分泌装置を構成
する蛋白質群をコードする遺伝子ＤＮＡ群の一つである
ｓｅｃＥ遺伝子ＤＮＡがコードする蛋白質の代わりに本
発明ＤＮＡがコードする蛋白質を含むものと考えられ
る。[0010] The mutant secretory apparatus comprising the protein encoded by the DNA of the present invention comprises a gene encoding the secE gene DNA which is one of the gene DNA groups encoding the protein group constituting the protein secretory apparatus. Instead, it is considered to include the protein encoded by the DNA of the present invention.
【００１１】本発明ＤＮＡは、コリネ型細菌から、ｓｅ
ｃＥ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片（以下、これを「Ａ
断片」と略称することがある）を調製し、これに改変を
加えることにより得ることができる。The DNA of the present invention can be obtained from coryneform bacteria
A DNA fragment containing cE gene DNA (hereinafter referred to as “A
Fragment, which may be abbreviated as "fragment"), and then modify it.
【００１２】Ａ断片は、コリネ型細菌由来の染色体上か
らクローニングすることができ、その供給源となるコリ
ネ型細菌としては、例えば、ブレビバクテリウム・フラ
バム（Brevibacterium flavum) ＭＪ−２３３（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニ
アゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ＡＴＣＣ
６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４
６、ブレビバクテリウム・デバリカタム（Brevibacteri
um devaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofe
rmentum）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・
グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ
３１８３１等を用いることができる。[0012] The fragment A can be cloned from a chromosome derived from a coryneform bacterium. As a coryneform bacterium serving as a source, for example, Brevibacterium flavum MJ-233 (FER)
MBP-1498), Brevibacterium ammoniagenes, ATCC
6871, ATCC 13745, ATCC 1374
6. Brevibacterium debaricatam
um devaricatum) ATCC 14020, Brevibacterium lactofementum
rmentum) ATCC 13869, Corynebacterium
Glutamicum (Corynebacterium glutamicum) ATCC
31831 or the like can be used.
【００１３】これらの供給源微生物からＡ断片を調製す
るための基本操作の一例を述べれば次のとおりである。
Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリ
ウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）株の染色体上に存在
し、染色体上にコードされる蛋白質遺伝子を単離する通
常の方法、すなわち、大腸菌変異株を用いた相補、ある
いは相同性領域のアミノ酸配列を基にデザインしたオリ
ゴＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法に
より分離・取得することができる。An example of the basic operation for preparing the A fragment from these source microorganisms is as follows.
The A fragment is obtained from the above-mentioned coryneform bacterium, for example, Brevibacterium flavum MJ-23.
3 (FERM BP-1497), a conventional method for isolating a protein gene that is present on the chromosome and encoded on the chromosome, that is, based on the amino acid sequence of a complementary or homologous region using a mutant strain of Escherichia coli. Can be separated and obtained by a hybridization method using an oligo DNA probe designed as described above.
【００１４】目的遺伝子を含む断片を単離し、単離した
断片の塩基配列を決定することにより、全遺伝子断片を
確認することができる。上記のＡ断片は、天然のコリネ
型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、塩
基配列が決定された後であれば、通常用いられるＤＮＡ
合成装置、例えば、アプライド・バイオシステムズ(App
lied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイ
ザーを用いて合成されたものであってもよい。By isolating the fragment containing the target gene and determining the nucleotide sequence of the isolated fragment, all the gene fragments can be confirmed. The above-mentioned A fragment is not limited to a DNA isolated from a natural coryneform bacterial chromosomal DNA, but may be a commonly used DNA after the base sequence is determined.
Synthesizers such as Applied Biosystems (App
lied Biosystems) 394 DNA / RNA synthesizer.
【００１５】上記のようにして得られたＡ断片は、配列
番号２に示すアミノ酸配列における４４位のアミノ酸残
基に相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン残基とな
るように改変される。この改変は、部位特異的突然変異
などの公知の方法によって塩基配列にヌクレオチドの置
換、欠失、挿入などの変異を導入することによって生じ
させることができる。The A fragment obtained as described above is modified so that the amino acid residue corresponding to the amino acid residue at position 44 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 becomes a phenylalanine residue. This modification can be produced by introducing a mutation such as nucleotide substitution, deletion or insertion into the nucleotide sequence by a known method such as site-directed mutation.
【００１６】なお、本発明ＤＮＡは、その塩基配列が決
定された後においては通常用いられるＤＮＡ合成装置を
用いて合成することも可能である。本発明ＤＮＡがコー
ドする蛋白質は、配列番号２のアミノ酸配列に相当する
配列であって、配列番号２のアミノ酸配列における４４
位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基がフェニルア
ラニン残基であるアミノ酸配列を有するという特徴を有
し、コリネ型細菌内で、所定の蛋白質を、配列番号１３
のアミノ酸配列を有する蛋白質を含んで構成される分泌
装置よりも効率よく分泌させる分泌装置を構成し、好ま
しくは、工業的レベルにおいて、所定の蛋白質を培地中
へ効率よく分泌させるために必要な変異型分泌装置を構
成するものである。従って、本発明ＤＮＡがコードする
蛋白質は、上記のような機能を実質的に損なうことがな
く、工業的レベルにおいて培地中に所定の蛋白質を分泌
生産可能ならしめるものであれば、配列番号２に示すア
ミノ酸配列の一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基と
置換されていてもよく又は削除されていてもよく、或い
は新たにアミノ酸残基が挿入されていてもよく、さらに
アミノ酸残基の一部が転位されているものであってもよ
く、これらの誘導体をコードするＤＮＡのいずれもが、
配列番号２のアミノ酸配列に相当する配列をコードする
ものとして本発明ＤＮＡに包含されるものである。The DNA of the present invention can be synthesized using a commonly used DNA synthesizer after its base sequence is determined. The protein encoded by the DNA of the present invention has a sequence corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
Is characterized in that the amino acid residue corresponding to the amino acid residue at position 1 has an amino acid sequence of a phenylalanine residue.
A secretion device that secretes the protein more efficiently than a secretion device comprising a protein having the amino acid sequence of, preferably, a mutation necessary for efficiently secreting a given protein into a medium at an industrial level. It constitutes a type secretory device. Therefore, the protein encoded by the DNA of the present invention may be any of SEQ ID NO: 2 if it does not substantially impair the above-mentioned functions and can secrete and produce a predetermined protein in a medium at an industrial level. Some amino acid residues in the amino acid sequence shown may be substituted or deleted with other amino acid residues, or new amino acid residues may be inserted. Some may be transposed, and any of the DNAs encoding these derivatives may be:
It is included in the DNA of the present invention as encoding a sequence corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
【００１７】特には、配列番号２に示すアミノ酸配列と
８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有
するものが好ましい。また、蛋白質の構造の一部を、自
然又は人工の突然変異によって上記機能を実質的に変え
ずに変化させることも可能である。すなわち、本発明Ｄ
ＮＡのコードする蛋白質は、配列番号２に示すアミノ酸
配列を有する蛋白質の同種変異型に相当する構造を有す
る蛋白質も包含する。また、通常の変異誘発法により変
異を導入し、通常のスクリーニング法により分泌量を指
標として選択を行うことにより得られ得る同等の配列も
包含する。Particularly, those having homology of 80% or more, more preferably 90% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are preferable. In addition, a part of the protein structure can be changed by a natural or artificial mutation without substantially changing the above function. That is, the present invention D
The protein encoded by NA also includes a protein having a structure corresponding to the homologous variant of the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Also included are equivalent sequences that can be obtained by introducing a mutation by a normal mutagenesis method and performing selection by a normal screening method using the secretion amount as an index.
【００１８】本発明ＤＮＡの機能発現及び本発明ＤＮＡ
がコードする蛋白質を含んで構成される分泌装置の分泌
の効率は、例えば後記実施例２に示すようにして、培地
中に分泌される分泌蛋白質の活性等を測定することによ
り確認及び評価することができる。Functional expression of DNA of the present invention and DNA of the present invention
The secretion efficiency of the secretory apparatus comprising the protein encoded by the secretory protein should be confirmed and evaluated by measuring the activity of the secretory protein secreted into the medium, for example, as described in Example 2 below. Can be.
【００１９】使用する分泌蛋白質としては、例えば、ア
ミラーゼが挙げられ、アミラーゼ遺伝子をコリネ型細菌
染色体上、またはコリネ型細菌内で複製可能なプラスミ
ドに挿入し、アミラーゼ活性を指標にしてその変異型分
泌装置の分泌能を判定することができる。また、アミラ
ーゼにとどまらず、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラ
ナーゼ、プルラナーゼ、等、通常菌体外に分泌されるも
のはいずれも同様に使用することができる。なお、分泌
される所定の蛋白質は、その分泌に分泌装置が関与して
いる限り、特に制限はなく、これらの測定が容易な酵素
蛋白質に限定されるものではない。Examples of the secretory protein to be used include amylase. The amylase gene is inserted into a plasmid capable of replicating in the chromosome of the coryneform bacterium or in a coryneform bacterium, and the mutant secreted protein is expressed using the amylase activity as an index. The secretory capacity of the device can be determined. In addition, not only amylase, but also proteases, cellulases, xylanases, pullulanases, and the like that are normally secreted outside the cells can be used. The predetermined protein to be secreted is not particularly limited as long as the secretory apparatus is involved in the secretion, and is not limited to an enzyme protein whose measurement is easy.
【００２０】本発明ＤＮＡの具体例としては、配列番号
１に示す塩基配列が挙げられる。本発明ＤＮＡを導入し
た組換えプラスミドは、通常に使用されるプラスミドに
本発明ＤＮＡを常法に従って導入することによって得る
ことができる。例えば、特開平６−２７００７３号公報
に、ｓｅｃＥ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片について記
載されているのと同様にして、本発明ＤＮＡを適当なプ
ラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増
殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクタ
ーに導入することにより、コリネ型細菌内で、変異型分
泌装置を構成する蛋白質を高発現することが可能な組換
えプラスミドを得ることができる。A specific example of the DNA of the present invention is the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. The recombinant plasmid into which the DNA of the present invention has been introduced can be obtained by introducing the DNA of the present invention into a commonly used plasmid in a conventional manner. For example, in the same manner as described for a DNA fragment containing the secE gene DNA in JP-A-6-270073, the DNA of the present invention is responsible for the replication-proliferation function of the plasmid in an appropriate plasmid, for example, a coryneform bacterium. By introducing the gene into a plasmid vector containing at least a gene, a recombinant plasmid capable of highly expressing a protein constituting a mutant secretory apparatus in coryneform bacteria can be obtained.
【００２１】上記組換えプラスミドを保有するコリネ型
細菌は、上記組換えプラスミドにより常法に従ってコリ
ネ型細菌を形質転換することによって得ることができ
る。例えば、特開平６−２７００７３号公報に、組換え
プラスミドを保有するコリネ型細菌について記載されて
いるのと同様にして得ることができる。The coryneform bacterium having the above-mentioned recombinant plasmid can be obtained by transforming the coryneform bacterium with the above-mentioned recombinant plasmid according to a conventional method. For example, it can be obtained in the same manner as described in Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 6-270073 for a coryneform bacterium having a recombinant plasmid.
【００２２】[0022]
【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。 調製例１ 評価用プラスミドの作製 （Ａ）シャトルベクターの構築 米国特許第５１８５２６２号明細書記載のプラスミドｐ
ＣＲＹ３１より、コリネ型細菌内でのプラスミドの安定
化に必要な領域をＰＣＲ法により増幅させ、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（ＴＯＹＯＢＯ社製）のＥｃｏ
ＲＩ，ＸｈｏＩサイトにクローニングした。The present invention has been described above, and will be described more specifically with reference to the following examples. Preparation Example 1 Preparation of plasmid for evaluation (A) Construction of shuttle vector Plasmid p described in US Pat. No. 5,185,262
From CRY31, a region necessary for stabilizing the plasmid in coryneform bacteria was amplified by PCR, and pBlue
Eco of scriptIISK + (manufactured by TOYOBO)
It was cloned into RI and XhoI sites.
【００２３】プラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コ
リネ型細菌内でのプラスミドの安定化に必要な領域の配
列は決定されており、この配列をもとに、下記の１対の
プライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applie
d Biosystems）社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザ
ー（synthesizer）を用いて合成した。The sequence of the region required for stabilizing the plasmid in coryneform bacterium, which is present in the plasmid pCRY31, has been determined. Based on this sequence, the following pair of primers was used to apply Applied Bio Systems (Applie
d Biosystems) using 394 DNA / RNA synthesizer.
【００２４】（a-1）5'-TTT CTC GAG CGC ATT ACC TCC
TTG CTA CTG-3'（配列番号３） （b-1）5'-TTT GAA TTC GAT ATC AAG CTT GCA CAT CAA-
3'（配列番号４） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。）(A-1) 5'-TTT CTC GAG CGC ATT ACC TCC
TTG CTA CTG-3 '(SEQ ID NO: 3) (b-1) 5'-TTT GAA TTC GAT ATC AAG CTT GCA CAT CAA-
3 ′ (SEQ ID NO: 4) (In the sequence, A represents adenine, G represents guanine, C represents cytosine, and T represents thymine.)
【００２５】ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製
のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のa-1及びb-1プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ（2.5 Ｕｎｉｔ） 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。For PCR, a DNA thermal cycler manufactured by Perkin Elmer Cetus Co., Ltd. was used, and as a reaction reagent, recombinant tack DNA / polymerase / takara.
Tack (Recombinant Taq DNA Polymerase TaKaRa Taq)
(Takara Shuzo) under the following conditions. Reaction solution: (10 ×) PCR buffer 10 μl 1.25 mM dNTP mixture 16 μl Template DNA 10 μl (DNA content 1 μM or less) 1 μl each of the above-mentioned a-1 and b-1 primers (final concentration 0.25 μM) Recombinant Tack DNA polymerase 0.5 μl (2.5 Unit) 61.5 μl or more of sterile distilled water was mixed, and 100 μl of the reaction solution was subjected to PCR. PCR cycle: Denaturation process: 94 ° C. for 60 seconds Annealing process: 52 ° C. for 60 seconds Extension process: 72 ° C. for 120 seconds One cycle was performed as described above, and 25 cycles were performed.
【００２６】上記で生成した反応液１０μｌを０．８％
アガロースゲルによる電気泳動に付したところ、約１．
１ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確
認できた反応液１０μｌおよびプラスミドｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋溶液１μｌに各々制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩおよびＸｈｏＩを加え、各溶液中のＤＮＡを完全に
切断し、次いで、７０℃で１０分処理することにより制
限酵素を失活させた後、両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガ
ーゼ（１０×）緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１
ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにし
て、１５℃で３時間反応させ、結合させた。The above-prepared reaction solution (10 μl) was added to 0.8%
When subjected to electrophoresis on an agarose gel, about 1.
A 1 kb DNA fragment was detected. 10 μl of the reaction solution in which the amplification product was confirmed above and plasmid pBlues
Restriction enzyme Eco was added to 1 μl of the scriptIISK + solution.
RI and XhoI were added to completely cut the DNA in each solution, followed by treatment at 70 ° C. for 10 minutes to inactivate the restriction enzymes. Then, the two were mixed and buffered with T4 DNA ligase (10 ×) buffer. Solution 1µl, T4 DNA ligase 1
Each component of the unit was added, adjusted to 10 μl with sterile distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound.
【００２７】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
Ｌに溶解〕に塗抹した。Using the resulting plasmid mixture, the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 15
9 (1970)] by Escherichia coli JM109
(Manufactured by Takara Shuzo), and a medium containing 50 mg of ampicillin [10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of NaCl and 16 g of agar was distilled water 1
L).
【００２８】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の
長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．１ｋｂの
挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳｐ
ａｒと命名した。The strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture solution, the plasmid was cut with restriction enzymes, and the inserted fragment was confirmed. As a result, an inserted DNA fragment having a length of 1.1 kb was recognized in addition to the DNA fragment having a length of 3.0 kb and the plasmid pBluescriptIISK +. This plasmid is called pBSp
ar.
【００２９】次に、米国特許第５１８５２６２号明細書
記載のプラスミドｐＣＲＹ３１より、コリネ型細菌内で
のプラスミドの複製に必要な領域をＰＣＲ法により増幅
させ、上記プラスミドｐＢＳｐａｒのＸｈｏＩ，Ｋｐｎ
Ｉサイトにクローニングし、シャトルベクターを作製し
た。Next, from the plasmid pCRY31 described in US Pat. No. 5,185,262, a region necessary for plasmid replication in coryneform bacteria was amplified by PCR, and the XhoI, Kpn of the above plasmid pBSpar was amplified.
Cloning at the I site produced a shuttle vector.
【００３０】プラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コ
リネ型細菌内でのプラスミドの複製に必要な領域の配列
は決定されており、この配列をもとに、下記の１対のプ
ライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied
Biosystems）社製３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザ
ー（synthesizer ）を用いて合成した。The sequence of the region required for plasmid replication in coryneform bacteria, which is present in plasmid pCRY31, has been determined. Based on this sequence, the following pair of primers was used to apply Applied Biosystems. (Applied
The DNA was synthesized using a 394 DNA / RNA synthesizer (Biosystems).
【００３１】（a-2）5'-TTT GGT ACC GAC TTA GAT AAA
GGT CTA-3'（配列番号５） （b-2）5'-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-3'
（配列番号６） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。）(A-2) 5'-TTT GGT ACC GAC TTA GAT AAA
GGT CTA-3 '(SEQ ID NO: 5) (b-2) 5'-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-3'
(In the sequence, A indicates adenine, G indicates guanine, C indicates cytosine, and T indicates thymine.)
【００３２】ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製
のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のa-2及びb-2プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ（2.5 Ｕｎｉｔ） 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。The PCR was carried out using a DNA thermal cycler manufactured by Perkin Elmer Cetus Co., Ltd., and recombinant tuck DNA polymerase polymerase TAKARA
Tack (Recombinant Taq DNA Polymerase TaKaRa Taq)
(Takara Shuzo) under the following conditions. Reaction solution: (10 ×) PCR buffer 10 μl 1.25 mM dNTP mixture 16 μl Template DNA 10 μl (DNA content 1 μM or less) 1 μl each of the above-mentioned a-2 and b-2 primers (final concentration 0.25 μM) Recombinant Tack DNA polymerase 0.5 μl (2.5 Unit) 61.5 μl or more of sterile distilled water was mixed, and 100 μl of the reaction solution was subjected to PCR. PCR cycle: Denaturation process: 94 ° C. for 60 seconds Annealing process: 52 ° C. for 60 seconds Extension process: 72 ° C. for 120 seconds One cycle was performed as described above, and 25 cycles were performed.
【００３３】上記で生成した反応液１０μｌを０．８％
アガロースゲルによる電気泳動に付したところ、約１．
８ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確
認できた反応液１０μｌおよびプラスミドｐＢＳｐａｒ
溶液１μｌに各々制限酵素ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩを加
え、各液中の核酸を完全に切断し、次いで、７０℃で１
０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者
を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１０×）緩衝液 １μ
ｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、
滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応さ
せ、結合させた。10 μl of the reaction solution produced above was added to 0.8%
When subjected to electrophoresis on an agarose gel, about 1.
An 8 kb DNA fragment was detected. 10 μl of the reaction solution in which the amplification product was confirmed above and plasmid pBSpar
Restriction enzymes XhoI and KpnI were respectively added to 1 μl of the solution to completely cleave the nucleic acid in each solution.
After inactivating the restriction enzyme by treating for 0 min, the two were mixed and mixed with 1 μl of T4 DNA ligase (10 ×) buffer.
l, add each component of 1 unit of T4 DNA ligase,
The mixture was made up to 10 μl with sterile distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound.
【００３４】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
１に溶解〕に塗抹した。Using the resulting plasmid mixture, the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 15
9 (1970)] by Escherichia coli JM109
(Manufactured by Takara Shuzo), and a medium containing 50 mg of ampicillin [10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of NaCl and 16 g of agar was distilled water 1
1).
【００３５】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＢＳｐａｒの長さ４．１ｋｂのＤＮ
Ａ断片に加え、長さ１．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認め
られた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒ−ｒｅｐと命名し
た。The strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture, and the plasmid was cut with restriction enzymes to confirm the inserted fragment. As a result, a plasmid of 4.1 kb in length was obtained from the plasmid pBSpar.
In addition to the A fragment, an inserted DNA fragment having a length of 1.8 kb was observed. This plasmid was designated as pBSpar-rep.
【００３６】上記で作製したプラスミドｐＢＳｐａｒ−
ｒｅｐ溶液１μｌ、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）溶液
１μｌに各々制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩを加
え、各溶液中のＤＮＡを完全に切断し、次いで、７０℃
で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、
両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１０×）緩衝液１
μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加
し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応
させ、結合させた。The plasmid pBSpar-
Restriction enzymes KpnI and EcoRI were added to 1 μl of the rep solution and 1 μl of pHSG298 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), respectively, to completely cut the DNA in each solution.
After inactivating restriction enzymes by treating for 10 minutes,
The two were mixed, and T4 DNA ligase (10 ×) buffer 1
1 μl of each unit of 1 unit of T4 DNA ligase was added, made up to 10 μl with sterile distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound.
【００３７】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
１に溶解〕に塗抹した。Using the resulting plasmid mixture, the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 15
9 (1970)] by Escherichia coli JM109
(Manufactured by Takara Shuzo), and a medium containing 50 mg of kanamycin [10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of NaCl, and 16 g of agar were distilled water 1
1).
【００３８】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８の長さ２．６ｋｂのＤ
ＮＡ断片に加え、長さ２．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認
められた。本プラスミドをｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅ
ｐと命名した。The strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture, and the plasmid was cut with restriction enzymes to confirm the inserted fragment. This resulted in a plasmid pHSG298 with a 2.6 kb D
In addition to the NA fragment, an inserted DNA fragment of 2.9 kb in length was observed. This plasmid was transferred to pHSG298par-re.
It was named p.
【００３９】（Ｂ）ｔａｃプロモーターの挿入 プラスミドｐＴｒｃ９９Ａを鋳型としたＰＣＲ法によ
り、ｔａｃプロモーター断片を増幅させるべく、下記の
１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ
（Applied Biosystems）社製３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシ
ンセサイザー（synthesizer）を用いて合成した。(B) Insertion of the tac promoter In order to amplify the tac promoter fragment by PCR using the plasmid pTrc99A as a template, the following pair of primers was used with 394 DNA / RNA manufactured by Applied Biosystems. Synthesized using a synthesizer.
【００４０】（a-3）5'-TTT GGT ACC GAT AGC TTA CTC
CCC ATC CCC-3'（配列番号７） （b-3）5'-TTT GGA TCC CAA CAT ATG AAC ACC TCC TTT
TTA TCC GCT CACAAT TCC ACA CAT-3'（配列番号８） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。）(A-3) 5'-TTT GGT ACC GAT AGC TTA CTC
CCC ATC CCC-3 '(SEQ ID NO: 7) (b-3) 5'-TTT GGA TCC CAA CAT ATG AAC ACC TCC TTT
TTA TCC GCT CACAAT TCC ACA CAT-3 '(SEQ ID NO: 8) (In the sequence, A indicates adenine, G indicates guanine, C indicates cytosine, and T indicates thymine.)
【００４１】ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製
のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のa-3及びb-3プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ（2.5 Ｕｎｉｔ） 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。The PCR was carried out using a DNA thermal cycler manufactured by Perkin Elmer Cetus Co., Ltd.
Tack (Recombinant Taq DNA Polymerase TaKaRa Taq)
(Takara Shuzo) under the following conditions. Reaction solution: (10 ×) PCR buffer 10 μl 1.25 mM dNTP mixture 16 μl Template DNA 10 μl (DNA content 1 μM or less) 1 μl each of the above-mentioned a-3 and b-3 primers (final concentration 0.25 μM) Recombinant Tack DNA polymerase 0.5 μl (2.5 Unit) 61.5 μl or more of sterile distilled water was mixed, and 100 μl of the reaction solution was subjected to PCR. PCR cycle: Denaturation process: 94 ° C. for 60 seconds Annealing process: 52 ° C. for 60 seconds Extension process: 72 ° C. for 120 seconds One cycle was performed as described above, and 25 cycles were performed.
【００４２】上記で生成した反応液１０μｌを３％アガ
ロースゲルによる電気泳動に付したところ、約１００ｂ
ｐのＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確認で
きた反応液１０μｌおよび上記（Ａ）で作製したプラス
ミドｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐの溶液５μｌに各々
制限酵素ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩを加え、各溶液中の
ＤＮＡを完全に切断し、次いで、７０℃で１０分処理す
ることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１０×）緩衝液 １μｌ、Ｔ4 Ｄ
ＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水
で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させ
た。When 10 μl of the reaction solution produced above was subjected to electrophoresis on a 3% agarose gel, about 100 b
p DNA fragment was detected. Restriction enzymes BamHI and KpnI were respectively added to 10 μl of the reaction solution in which the amplification product was confirmed above and 5 μl of the plasmid pHSG298par-rep solution prepared in (A) above, and the DNA in each solution was completely cut. After inactivating the restriction enzyme by treating at 10 ° C. for 10 minutes, the two were mixed,
1 μl of T4 DNA ligase (10 ×) buffer, T4 D
One unit of NA ligase was added, and the mixture was made up to 10 μl with sterilized distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound.
【００４３】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
１に溶解〕に塗抹した。Using the obtained plasmid mixture, the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 15
9 (1970)] by Escherichia coli JM109
(Manufactured by Takara Shuzo), and a medium containing 50 mg of kanamycin [10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of NaCl, and 16 g of agar were distilled water 1
1).
【００４４】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、上記（Ａ）作製のプラスミドの長さ５．５ｋｂの
ＤＮＡ断片に加え、長さ０．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が
認められた。このプラスミドをｐＨＳＧ２９８ｔａｃと
命名した。The strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture solution, the plasmid was cut with restriction enzymes, and the inserted fragment was confirmed. As a result, an inserted DNA fragment of 0.1 kb in length was observed in addition to the 5.5 kb DNA fragment of the plasmid prepared in (A) above. This plasmid was named pHSG298tac.
【００４５】（Ｃ）アミラーゼ遺伝子の挿入 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｒｅｑｕｅｆａｃｉｅｎ
ｓのアミラーゼ遺伝子の配列は決定されており［Journa
l of Biological Chemistry, 258, 1007-1013(198
3)］、この遺伝子部分をＰＣＲ法により増幅させ、上記
（Ｂ）で作製のプラスミドｐＨＳＧ２９８ｔａｃに挿入
し、評価用プラスミドを作製した。(C) Insertion of amylase gene Bacillus amylorequefacien
s amylase gene has been sequenced [Journa
l of Biological Chemistry, 258, 1007-1013 (198
3)], This gene portion was amplified by PCR, and inserted into the plasmid pHSG298tac prepared in the above (B) to prepare a plasmid for evaluation.
【００４６】下記の１対のプライマーを、アプライド・
バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３９４
ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）を用い
て合成した。The following pair of primers were used
394 manufactured by Applied Biosystems
Synthesized using a DNA / RNA synthesizer.
【００４７】（a-4）5'-TTT CAT ATG ATT CAA AAA CGA
AAG-3'（配列番号９） （b-4）5'-TTT GGA TCC TTA TTT CTG AAC ATA-3'（配列
番号１０） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。）(A-4) 5'-TTT CAT ATG ATT CAA AAA CGA
AAG-3 '(SEQ ID NO: 9) (b-4) 5'-TTT GGA TCC TTA TTT CTG AAC ATA-3' (SEQ ID NO: 10) (In the sequence, A is adenine, G is guanine, C is cytosine, T Represents thymine.)
【００４８】ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製
のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のa-4及びb-4プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ（2.5 Ｕｎｉｔ） 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。For PCR, a DNA thermal cycler manufactured by Perkin Elmer Cetus was used, and as a reaction reagent, recombinant tack DNA polymerase Takara PCR was used.
Tack (Recombinant Taq DNA Polymerase TaKaRa Taq)
(Takara Shuzo) under the following conditions. Reaction solution: (10 ×) PCR buffer 10 μl 1.25 mM dNTP mixture 16 μl Template DNA 10 μl (DNA content 1 μM or less) 1 μl each of the above-mentioned a-4 and b-4 primers (final concentration 0.25 μM) Recombinant Tack DNA polymerase 0.5 μl (2.5 Unit) 61.5 μl or more of sterile distilled water was mixed, and 100 μl of the reaction solution was subjected to PCR. PCR cycle: Denaturation process: 94 ° C. for 60 seconds Annealing process: 52 ° C. for 60 seconds Extension process: 72 ° C. for 120 seconds One cycle was performed as described above, and 25 cycles were performed.
【００４９】上記で生成した反応液１０μｌを０．８％
アガロースゲルによる電気泳動に付したところ、約１．
３ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確
認できた反応液１０μｌおよび上記（Ｂ）で作製したプ
ラスミドの溶液５μｌに各々制限酵素ＮｄｅＩおよびＢ
ａｍＨＩを加え、各溶液中のＤＮＡを完全に切断し、次
いで、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失
活させた後、両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１０
×）緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの
各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃
で３時間反応させ、結合させた。10 μl of the reaction solution produced above was added to 0.8%
When subjected to electrophoresis on an agarose gel, about 1.
A 3 kb DNA fragment could be detected. Restriction enzymes NdeI and B were added to 10 μl of the reaction solution in which the amplification product was confirmed above and 5 μl of the plasmid solution prepared in (B) above, respectively.
amHI was added, the DNA in each solution was completely cut, and then treated at 70 ° C. for 10 minutes to inactivate the restriction enzymes. Then, both were mixed, and T4 DNA ligase (10
×) Add 1 μl of buffer solution and 1 unit of T4 DNA ligase, make up to 10 μl with sterile distilled water, and add
And allowed to react for 3 hours.
【００５０】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
１に溶解〕に塗抹した。Using the obtained plasmid mixture, the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 15]
9 (1970)] by Escherichia coli JM109
(Manufactured by Takara Shuzo), and a medium containing 50 mg of kanamycin [10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of NaCl, and 16 g of agar were distilled water 1
1).
【００５１】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、上記（Ｂ）作製のプラスミドの長さ５．６ｋｂの
ＤＮＡ断片に加え、長さ１．３ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が
認められた。The strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture, and the plasmid was cut with restriction enzymes to confirm the inserted fragment. As a result, an inserted DNA fragment having a length of 1.3 kb was observed in addition to the DNA fragment having a length of 5.6 kb prepared in the above (B).
【００５２】このプラスミドをｐＳｅｃ１と命名した。This plasmid was named pSec1.
【００５３】実施例１ コリネ型細菌由来分泌装置を構
成する蛋白質の遺伝子ＤＮＡ断片の改変 （Ａ）コリネ型細菌由来分泌装置を構成する蛋白質の遺
伝子ＤＮＡ断片の単離 特開平６−１６９７８０号公報、特開平６−２７７０７
３号公報、特開平７−１０７９８１号公報記載の方法に
従って、コリネ型細菌由来の分泌装置を構成する主要因
子ＳｅｃＹ，ＳｅｃＥ，ＳｅｃＡをコードする遺伝子を
各々単離した。Example 1 Modification of Gene DNA Fragment of Protein Constituting Secretory Device Derived from Coryneform Bacteria (A) Isolation of Gene DNA Fragment of Protein Constituting Secretory Device Derived from Coryneform Bacteria JP-A-6-169780, JP-A-6-27707
According to the methods described in Japanese Patent Publication No. 3 and JP-A-7-107981, the genes encoding the major factors SecY, SecE and SecA constituting the secretory apparatus derived from coryneform bacteria were respectively isolated.
【００５４】（Ｂ）コリネ型細菌由来分泌装置を構成す
る蛋白質の遺伝子ＤＮＡ断片の改変 前記（Ａ）で調製したＳｅｃＥをコードする遺伝子を含
むプラスミドｐＵＣ１１８−ｓｅｃＥを鋳型としてＰＣ
Ｒを行うことにより、ｓｅｃＥ遺伝子断片を増幅させ
た。このときＴａｑポリメラーゼのフィデリティーを下
げるために、Ｍｎイオンを反応液中に存在させ、変異を
ランダムに導入した断片を増幅させた。(B) Modification of the DNA fragment of the gene constituting the protein constituting the secretory apparatus derived from coryneform bacterium The plasmid pUC118-secE containing the gene encoding SecE prepared in (A) was used as a template for PC
By performing R, the secE gene fragment was amplified. At this time, in order to reduce the fidelity of Taq polymerase, Mn ions were present in the reaction solution, and the fragment into which the mutation was randomly introduced was amplified.
【００５５】下記の１対のプライマーを、アプライド・
バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３９４
ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）を用い
て合成した。The following pair of primers were used
394 manufactured by Applied Biosystems
Synthesized using a DNA / RNA synthesizer.
【００５６】（a-5）5'-TTT GGA TCC ATG GGA GAA GTC
CGT AAG -3'（配列番号１１） （b-5）5'-TTT CCT GCA GGC TAC GGA GTC AGA ATC TT -
3'（配列番号１２） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミン、を示す。）(A-5) 5'-TTT GGA TCC ATG GGA GAA GTC
CGT AAG -3 '(SEQ ID NO: 11) (b-5) 5'-TTT CCT GCA GGC TAC GGA GTC AGA ATC TT-
3 ′ (SEQ ID NO: 12) (In the sequence, A indicates adenine, G indicates guanine, C indicates cytosine, and T indicates thymine.)
【００５７】ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製
のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のa-5及びb-5プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） １００ｍＭ ＭｎＣｌ2 ０．５μｌ レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ（2.5 Ｕｎｉｔ） 滅菌蒸留水 ５９．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。In the PCR, a DNA thermal cycler manufactured by Perkin Elmer Cetus Co., Ltd. was used.
Tack (Recombinant Taq DNA Polymerase TaKaRa Taq)
(Takara Shuzo) under the following conditions. Reaction solution: (10 ×) PCR buffer 10 μl 1.25 mM dNTP mixture 16 μl Template DNA 10 μl (DNA content 1 μM or less) 1 μl each of the above-mentioned a-5 and b-5 primers (final concentration 0.25 μM) 100 mM MnCl 2 0.5 μl Recombinant tack DNA polymerase 0.5 μl (2.5 Unit) 59.5 μl or more of sterile distilled water were mixed, and 100 μl of the reaction solution was subjected to PCR. PCR cycle: Denaturation process: 94 ° C. for 60 seconds Annealing process: 52 ° C. for 60 seconds Extension process: 72 ° C. for 120 seconds One cycle was performed as described above, and 25 cycles were performed.
【００５８】上記で生成した反応液１０μｌを３％アガ
ロースゲルによる電気泳動に付したところ、約１５０ｂ
のＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確認でき
た反応液１０μｌおよび上記実施例１（Ｃ）で作製した
プラスミドｐＳｅｃ１の溶液５μｌに各々制限酵素Ｂａ
ｍＨＩおよびＳｓｅＩを加え、各溶液中のＤＮＡを完全
に切断し、次いで、７０℃で１０分処理することにより
制限酵素を失活させた後、両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリ
ガーゼ（１０×）緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ
１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌに
して、１５℃で３時間反応させ、結合させた。When 10 μl of the reaction solution formed above was subjected to electrophoresis on a 3% agarose gel, about 150 b
Was detected. Restriction enzyme Ba was added to 10 μl of the reaction solution in which the amplification product was confirmed as described above and 5 μl of the solution of plasmid pSec1 prepared in Example 1 (C).
mHI and SseI were added to completely cut the DNA in each solution, followed by treatment at 70 ° C. for 10 minutes to inactivate the restriction enzymes. Then, both were mixed and buffered with T4 DNA ligase (10 ×). 1 µl of the solution and 1 unit of T4 DNA ligase were added, and the mixture was made up to 10 µl with sterile distilled water, reacted at 15 ° C for 3 hours, and bound.
【００５９】一方、通常のＰＣＲの条件にて野生型のｓ
ｅｃＥ遺伝子を増幅させ、同様にして、プラスミドｐＳ
ｅｃ１のＢａｍＨＩ、ＳｓｅＩサイトに挿入した。On the other hand, wild-type s
The ecE gene was amplified and the plasmid pS
It was inserted into the BamHI and SseI sites of ec1.
【００６０】（Ｃ）分泌能を増加させる変異の同定 実施例１（Ｂ）で作製した変異の導入されたｓｅｃＥ遺
伝子、および野生型のｓｅｃＥ遺伝子を含むライゲーシ
ョン液を米国特許第５１８５２６２号明細書記載の方法
に従って、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）に導入した。(C) Identification of Mutations that Increase Secretion Ability A ligation solution containing the mutated secE gene prepared in Example 1 (B) and the wild-type secE gene is described in US Pat. No. 5,185,262. According to the method of Brevibacterium flavum MJ-233
(FERM BP-1498).
【００６１】本菌体溶液を、コーンスターチを１％、カ
ナマイシンを５０μｇ／ｌ含有するＬＢ培地にまき、形
成するハローのサイズの大きいものをピックアップし
た。このコロニーと、野生型のｓｅｃＥ遺伝子を用いて
形質転換したコロニーより、常法に従い、プラスミドを
抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断
片を確認した。この結果、上記調製例１（Ｃ）で作製さ
れたプラスミドの長さ６．９ｋｂのＤＮＡ断片に加え、
長さ１５０ｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。The bacterial cell solution was spread on an LB medium containing 1% of corn starch and 50 μg / l of kanamycin, and a large halo formed was picked up. A plasmid was extracted from this colony and a colony transformed with the wild-type secE gene by a conventional method, and the plasmid was cut with a restriction enzyme to confirm an inserted fragment. As a result, in addition to the 6.9 kb long DNA fragment prepared in Preparation Example 1 (C),
An inserted DNA fragment of 150 b in length was observed.
【００６２】変異型のｓｅｃＥ遺伝子の挿入されたプラ
スミドをｐＳｅｃ１Ｅｍｔ、野生型のｓｅｃＥ遺伝子の
挿入されたプラスミドをｐＳｅｃ１Ｅｗｔと各々命名し
た。本プラスミドに挿入された変異型ｓｅｃＥ遺伝子の
ＤＮＡ塩基配列を決定した。決定された塩基配列及びそ
れから推定されるアミノ酸配列を下記配列表配列番号１
に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
その結果、野生型ｓｅｃＥ蛋白質の４４番目のアミノ酸
ＶａｌがＰｈｅに変化していることが判明した。なお、
野生型ｓｅｃＥ蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１３に
示す。The plasmid having the mutant type secE gene inserted therein was named pSec1Emt, and the plasmid having the wild type secE gene inserted therein was named pSec1Ewt. The DNA base sequence of the mutant secE gene inserted into this plasmid was determined. The determined nucleotide sequence and the amino acid sequence deduced therefrom are shown in the following Sequence Listing, SEQ ID NO: 1.
Shown in In addition, only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
As a result, it was found that the amino acid Val at position 44 of the wild-type secE protein was changed to Phe. In addition,
The amino acid sequence of the wild-type secE protein is shown in SEQ ID NO: 13.
【００６３】実施例２ 変異型分泌装置の評価 ｐＳｅｃ１Ｅｍｔ、ｐＳＥＣ１Ｅｗｔプラスミドを米国
特許第５１８５２６２号明細書記載の方法に従って、ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９８）に導入した。Example 2 Evaluation of Mutant Secretion Apparatus The pSec1Emt and pSEC1Ewt plasmids were prepared according to the method described in US Pat. No. 5,185,262 to Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM).
BP-1498).
【００６４】形質転換されたブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３菌体を、白金耳にて１０ｍｌの半合成
培地Ａ培地〔組成：尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７
ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０. ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｍ
ｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、Ｍ
ｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス ２. ５
ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸チ
アミン ２００μｇ、及び、グルコース ２０ｇを蒸留
水 １ｌに溶解した〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜
１６時間振とう培養（前培養）した。次にＡ培地１００
ｍｌに前培養液を２％植菌し、３１℃で５時間振とうし
た後集菌し、アミラーゼ活性測定用培養液とした。The transformed Brevibacterium flavum MJ-233 cells were placed in a loop of 10 ml of a semi-synthetic medium A medium [composition: 2 g of urea, (NH 4 ) 2 SO 4 7].
g, K 2 HPO 4 0. 5g , KH 2 PO 4 0.5g, M
gSO 4 0.5 g, FeSO 4 .7H 2 O 6 mg, M
nSO 4 · 4~6H 2 O 6mg, yeast extract 2.5
g, casamino acid 5 g, biotin 200 μg, thiamine hydrochloride 200 μg, and glucose 20 g were dissolved in 1 liter of distilled water].
Shaking culture (pre-culture) was performed for 16 hours. Next, A medium 100
2 ml of the preculture was inoculated into each ml, shaken at 31 ° C. for 5 hours, and collected to obtain a culture for amylase activity measurement.
【００６５】アミラーゼ活性の測定は市販のアミラーゼ
活性測定キット［アミラーゼ Ｂ−テストワコー（和光
純薬社製）］添付のプロトコールに従って行った。アミ
ラーゼ活性測定の結果、ｐＳｅｃ１Ｅｗｔを導入した菌
体に比較して、ｐＳｅｃ１Ｅｍｔを導入した菌体の培養
上清中の活性は約５倍に上昇しており、配列番号１記載
の塩基配列からなるＡ断片の活性が著しく高いことを確
認した。The amylase activity was measured according to the protocol attached to a commercially available amylase activity measurement kit [Amylase B-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries)]. As a result of the amylase activity measurement, the activity in the culture supernatant of the cells into which pSec1Emt was introduced was increased about 5-fold as compared with the cells into which pSec1Ewt had been introduced. It was confirmed that the activity of the fragment was remarkably high.
【００６６】[0066]
【発明の効果】コリネ型細菌由来の、所定の蛋白質を培
地中へ効率よく分泌させるために必要な変異型分泌装置
を構成する蛋白質をコードするＤＮＡが提供され、所定
の蛋白質を培地中へ効率よく分泌生産させる系の構築、
製造法の確立が可能となった。Industrial Applicability The present invention provides a DNA encoding a protein constituting a mutant secretory apparatus necessary for efficiently secreting a predetermined protein derived from a coryneform bacterium into a medium, and efficiently transferring the predetermined protein into the medium. Construction of a system for secretory production,
The production method can be established.
【００６７】[0067]
配列番号：１ 配列の長さ：153 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム(Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ233 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..150 特徴を決定した方法：E 配列 GTG GGA GAA GTC CGT AAG GTT ATT TGG CCT ACT GCG CGC CAG ATG GTC 48 Val Gly Glu Val Arg Lys Val Ile Trp Pro Thr Ala Arg Gln Met Val 1 5 10 15 ACG TAC ACC CTT GTG GTT TTG GGA TTT TTG ATT GTT TTG ACC GCT TTG 96 Thr Tyr Thr Leu Val Val Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu 20 25 30 GTG TCT GGT GTG GAT TTC CTA GCT GGT CTT GGA TTT GAG AAG ATT CTG 144 Val Ser Gly Val Asp Phe Leu Ala Gly Leu Gly Phe Glu Lys Ile Leu 35 40 45 ACT CCG TAG 153 Thr Pro 50 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 153 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA Origin Organism name: Brevibacterium flavum (Brevibacteriu)
m flavum) Strain name: MJ233 Sequence characteristics Symbol indicating characteristics: peptide Location: 1..150 Method for determining characteristics: E sequence GTG GGA GAA GTC CGT AAG GTT ATT TGG CCT ACT GCG CGC CAG ATG GTC 48 Val Gly Glu Val Arg Lys Val Ile Trp Pro Thr Ala Arg Gln Met Val 1 5 10 15 ACG TAC ACC CTT GTG GTT TTG GGA TTT TTG ATT GTT TTG ACC GCT TTG 96 Thr Tyr Thr Leu Val Val Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu 20 25 30 GTG TCT GGT GTG GAT TTC CTA GCT GGT CTT GGA TTT GAG AAG ATT CTG 144 Val Ser Gly Val Asp Phe Leu Ala Gly Leu Gly Phe Glu Lys Ile Leu 35 40 45 ACT CCG TAG 153 Thr Pro 50
【００６８】配列番号：２ 配列の長さ：50 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Gly Glu Val Arg Lys Val Ile Trp Pro Thr Ala Arg Gln Met Val 1 5 10 15 Thr Tyr Thr Leu Val Val Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu 20 25 30 Val Ser Gly Val Asp Phe Leu Ala Gly Leu Gly Phe Glu Lys Ile Leu 35 40 45 Thr Pro 50 SEQ ID NO: 2 Sequence length: 50 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: peptide sequence Val Gly Glu Val Arg Lys Val Ile Trp Pro Thr Ala Arg Gln Met Val 1 5 10 15 Thr Tyr Thr Leu Val Val Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu 20 25 30 Val Ser Gly Val Asp Phe Leu Ala Gly Leu Gly Phe Glu Lys Ile Leu 35 40 45 Thr Pro 50
【００６９】配列番号：３ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTCTCGAGC GCATTACCTC CTTGCTACTG 30SEQ ID NO: 3 Sequence length: 30 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other Synthetic DNA sequence TTTCTCGAGC GCATTACCTC CTTGCTACTG 30
【００７０】配列番号：４ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTGAATTCG ATATCAAGCT TGCACATCAA 30SEQ ID NO: 4 Sequence length: 30 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear Sequence type: other Synthetic DNA sequence TTTGAATTCG ATATCAAGCT TGCACATCAA 30
【００７１】配列番号：５ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTGGTACCG ACTTAGATAA AGGTCTA 27SEQ ID NO: 5 Sequence length: 27 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other Synthetic DNA sequence TTTGGTACCG ACTTAGATAA AGGTCTA 27
【００７２】配列番号：６ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTCTCGAGT GCTGGTAAAA CAACTTT 27SEQ ID NO: 6 Sequence length: 27 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single stranded Topology: linear Sequence type: other Synthetic DNA sequence TTTCTCGAGT GCTGGTAAAA CAACTTT 27
【００７３】配列番号：７ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTGGTACCG ATAGCTTACT CCCCATCCCC 30SEQ ID NO: 7 Sequence length: 30 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other Synthetic DNA sequence TTTGGTACCG ATAGCTTACT CCCCATCCCC 30
【００７４】配列番号：８ 配列の長さ：54 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTGGATCCC AACATATGAA CACCTCCTTT TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAT 54SEQ ID NO: 8 Sequence length: 54 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear Sequence type: other Synthetic DNA sequence TTTGGATCCC AACATATGAA CACCTCCTTT TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAT 54
【００７５】配列番号：９ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTCATATGA TTCAAAAACG AAAG 24SEQ ID NO: 9 Sequence length: 24 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other Synthetic DNA sequence TTTCATATGA TTCAAAAACG AAAG 24
【００７６】配列番号：１０ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTGGATCCT TATTTCTGAA CATA 24SEQ ID NO: 10 Sequence length: 24 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other Synthetic DNA sequence TTTGGATCCT TATTTCTGAA CATA 24
【００７７】配列番号：１１ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTGGATCCA TGGGAGAAGT CCGTAAG 27SEQ ID NO: 11 Sequence length: 27 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other Synthetic DNA sequence TTTGGATCCA TGGGAGAAGT CCGTAAG 27
【００７８】配列番号：１２ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTCCTGCAG GCTACGGAGT CAGAATCTT 29SEQ ID NO: 12 Sequence length: 29 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other Synthetic DNA sequence TTTCCTGCAG GCTACGGAGT CAGAATCTT 29
【００７９】配列番号：１３ 配列の長さ：50 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Gly Glu Val Arg Lys Val Ile Trp Pro Thr Ala Arg Gln Met Val 1 5 10 15 Thr Tyr Thr Leu Val Val Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu 20 25 30 Val Ser Gly Val Asp Phe Leu Ala Gly Leu Gly Val Glu Lys Ile Leu 35 40 45 Thr Pro 50SEQ ID NO: 13 Sequence length: 50 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide sequence Val Gly Glu Val Arg Lys Val Ile Trp Pro Thr Ala Arg Gln Met Val 1 5 10 15 Thr Tyr Thr Leu Val Val Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu 20 25 30 Val Ser Gly Val Asp Phe Leu Ala Gly Leu Gly Val Glu Lys Ile Leu 35 40 45 Thr Pro 50
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） ──────────────────────────────────────────────────の Continued on front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 1/21 C12R 1:13) (C12P 21/02 C12R 1:19)
Claims (7)
位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基がフェニルア
ラニン残基である配列番号２のアミノ酸配列に相当する
アミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡであっ
て、前記蛋白質を含んで構成される分泌装置は、コリネ
型細菌内で、所定の蛋白質を、配列番号１３のアミノ酸
配列を有する蛋白質を含んで構成される分泌装置よりも
効率よく分泌させるＤＮＡ。1. an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
A DNA encoding a protein having an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 wherein the amino acid residue corresponding to the amino acid residue at position is a phenylalanine residue; A DNA that allows a predetermined protein to be secreted more efficiently in a coryneform bacterium than a secretion apparatus that includes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
る、請求項１に記載のＤＮＡ。2. The DNA according to claim 1, which encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
ラバム(Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３である請
求項１又は２記載のＤＮＡ。3. The DNA according to claim 1, wherein the coryneform bacterium is Brevibacterium flavum MJ-233.
１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ。4. The DNA according to claim 1, which has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
を導入した、組換えプラスミド。5. The DNA according to any one of claims 1 to 4,
A recombinant plasmid into which is introduced.
およびコリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子を含
むＤＮＡを含む、請求項５に記載の組換えプラスミド。6. The DNA according to any one of claims 1 to 4.
The recombinant plasmid according to claim 5, which comprises a DNA containing a gene that controls replication and growth in coryneform bacteria.
ドを保有するコリネ型細菌。7. A coryneform bacterium having the recombinant plasmid according to claim 5 or 6.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9361768A JPH11169182A (en) | 1997-12-10 | 1997-12-10 | Mutant type secretion device gene that efficiently secrets protein in the cell bodies of corynebacterium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9361768A JPH11169182A (en) | 1997-12-10 | 1997-12-10 | Mutant type secretion device gene that efficiently secrets protein in the cell bodies of corynebacterium |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11169182A true JPH11169182A (en) | 1999-06-29 |
Family
ID=18474804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9361768A Pending JPH11169182A (en) | 1997-12-10 | 1997-12-10 | Mutant type secretion device gene that efficiently secrets protein in the cell bodies of corynebacterium |
Country Status (1)
| Country | Link |
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