JPH11169182A - コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく培地中へ分泌させる変異型分泌装置遺伝子 - Google Patents
コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく培地中へ分泌させる変異型分泌装置遺伝子Info
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- JPH11169182A JPH11169182A JP9361768A JP36176897A JPH11169182A JP H11169182 A JPH11169182 A JP H11169182A JP 9361768 A JP9361768 A JP 9361768A JP 36176897 A JP36176897 A JP 36176897A JP H11169182 A JPH11169182 A JP H11169182A
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- protein
- amino acid
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 コリネ型細菌由来の、所定の蛋白質を培地中
へ効率よく分泌させるために必要な変異型分泌装置を構
成する蛋白質をコードするＤＮＡを提供する。 【解決手段】 配列番号２のアミノ酸配列における４４
位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基がフェニルア
ラニン残基である配列番号２のアミノ酸配列に相当する
アミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡであっ
て、前記蛋白質を含んで構成される分泌装置は、コリネ
型細菌内で、所定の蛋白質を、配列番号１３のアミノ酸
配列を有する蛋白質を含んで構成される分泌装置よりも
効率よく分泌させるＤＮＡ。
へ効率よく分泌させるために必要な変異型分泌装置を構
成する蛋白質をコードするＤＮＡを提供する。 【解決手段】 配列番号２のアミノ酸配列における４４
位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基がフェニルア
ラニン残基である配列番号２のアミノ酸配列に相当する
アミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡであっ
て、前記蛋白質を含んで構成される分泌装置は、コリネ
型細菌内で、所定の蛋白質を、配列番号１３のアミノ酸
配列を有する蛋白質を含んで構成される分泌装置よりも
効率よく分泌させるＤＮＡ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、コリネ型細菌にお
いて、蛋白質の分泌を効率よく行わせる変異型分泌装置
を構成する蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡに関する。
本発明の変異型分泌装置遺伝子を保有するコリネ型細菌
においては、工業的レベルにおいて所定の蛋白質を効率
よく培地中へ分泌生産させることが可能である。
いて、蛋白質の分泌を効率よく行わせる変異型分泌装置
を構成する蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡに関する。
本発明の変異型分泌装置遺伝子を保有するコリネ型細菌
においては、工業的レベルにおいて所定の蛋白質を効率
よく培地中へ分泌生産させることが可能である。
【０００２】
【従来の技術】コリネ型細菌による蛋白質の分泌につい
ては今日まであまり研究が進んでいない。Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍによるＤＮ
ａｓｅの分泌［米国特許第４９６５１９７号明細書］及
びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍの細胞壁蛋白質であるＰＳ１・ＰＳ２の分泌［国際
公開第ＷＯ９３／０３１５８号］に関する研究が報告さ
れているにすぎない。また、コリネ型細菌由来の分泌装
置（トランスロケーションマシナリー）を構成する主要
因子についても、ＳｅｃＹ［特開平６−１６９７８０号
公報］、ＳｅｃＥ［特開平６−２７７０７３号公報］及
びＳｅｃＡ［特開平７−１０７９８１号公報］をコード
する遺伝子を各々単離したという報告があるのみであ
り、系統的な研究は行われていない。
ては今日まであまり研究が進んでいない。Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍによるＤＮ
ａｓｅの分泌［米国特許第４９６５１９７号明細書］及
びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍの細胞壁蛋白質であるＰＳ１・ＰＳ２の分泌［国際
公開第ＷＯ９３／０３１５８号］に関する研究が報告さ
れているにすぎない。また、コリネ型細菌由来の分泌装
置（トランスロケーションマシナリー）を構成する主要
因子についても、ＳｅｃＹ［特開平６−１６９７８０号
公報］、ＳｅｃＥ［特開平６−２７７０７３号公報］及
びＳｅｃＡ［特開平７−１０７９８１号公報］をコード
する遺伝子を各々単離したという報告があるのみであ
り、系統的な研究は行われていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】これらの野生型の分泌
装置を構成する主要因子を用いて分泌蛋白質の分泌量を
増加させる試みは十分ではなく、工業的レベルで必要と
考えられている、野生型の装置を用いた場合の少なくと
も２〜３倍、望ましくは４倍以上の分泌量は達成されて
いない。
装置を構成する主要因子を用いて分泌蛋白質の分泌量を
増加させる試みは十分ではなく、工業的レベルで必要と
考えられている、野生型の装置を用いた場合の少なくと
も２〜３倍、望ましくは４倍以上の分泌量は達成されて
いない。
【０００４】本発明は、工業的レベルにおいて、所定の
蛋白質を培地中へ効率よく分泌させるために必要な変異
型分泌装置をコードするコリネ型細菌由来のＤＮＡの提
供を目的とする。
蛋白質を培地中へ効率よく分泌させるために必要な変異
型分泌装置をコードするコリネ型細菌由来のＤＮＡの提
供を目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌内
で、所定の蛋白質を培地中へ効率よく分泌させるために
必要な変異型分泌装置をコードする遺伝子ＤＮＡを見い
出し、本発明を完成するに至った。
を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌内
で、所定の蛋白質を培地中へ効率よく分泌させるために
必要な変異型分泌装置をコードする遺伝子ＤＮＡを見い
出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】かくして本発明によれば、配列番号２のア
ミノ酸配列における４４位のアミノ酸残基に相当するア
ミノ酸残基がフェニルアラニン残基である配列番号２の
アミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有する蛋白質を
コードするＤＮＡであって、前記蛋白質を含んで構成さ
れる分泌装置は、コリネ型細菌内で、所定の蛋白質を、
配列番号１３のアミノ酸配列を有する蛋白質を含んで構
成される分泌装置よりも効率よく分泌させるＤＮＡ（以
下、本発明ＤＮＡともいう）、該ＤＮＡを導入した組換
えプラスミド、及び、該プラスミドを保有するコリネ型
細菌が提供される。
ミノ酸配列における４４位のアミノ酸残基に相当するア
ミノ酸残基がフェニルアラニン残基である配列番号２の
アミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有する蛋白質を
コードするＤＮＡであって、前記蛋白質を含んで構成さ
れる分泌装置は、コリネ型細菌内で、所定の蛋白質を、
配列番号１３のアミノ酸配列を有する蛋白質を含んで構
成される分泌装置よりも効率よく分泌させるＤＮＡ（以
下、本発明ＤＮＡともいう）、該ＤＮＡを導入した組換
えプラスミド、及び、該プラスミドを保有するコリネ型
細菌が提供される。
【０００７】本発明ＤＮＡは、好ましくは、配列番号２
のアミノ酸配列をコードする。具体的には、配列番号１
の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。コリネ型細菌
は、好ましくは、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevi
bacterium flavum)ＭＪ−２３３である。
のアミノ酸配列をコードする。具体的には、配列番号１
の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。コリネ型細菌
は、好ましくは、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevi
bacterium flavum)ＭＪ−２３３である。
【０００８】組み換えプラスミドは、さらに、コリネ型
細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡを含む
ことが好ましい。
細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡを含む
ことが好ましい。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明についてさらに詳細
に説明する。本発明ＤＮＡは、コリネ型細菌内で生産さ
れた所定の蛋白質を菌体外（例えば培地中）へ効率よく
分泌生産させるために必要な分泌装置を構成する蛋白質
をコードするものであって、コリネ型細菌の染色体上、
もしくは染色体外に存在させることによって使用するも
のである。すなわち、本発明ＤＮＡは、染色体上、もし
くは染色体外に存在し、分泌蛋白質前駆体のＮ末端配列
を認識し、該分泌蛋白質を培地中に分泌生産させる分泌
装置を構成する蛋白質の遺伝子を意味するものである。
に説明する。本発明ＤＮＡは、コリネ型細菌内で生産さ
れた所定の蛋白質を菌体外（例えば培地中）へ効率よく
分泌生産させるために必要な分泌装置を構成する蛋白質
をコードするものであって、コリネ型細菌の染色体上、
もしくは染色体外に存在させることによって使用するも
のである。すなわち、本発明ＤＮＡは、染色体上、もし
くは染色体外に存在し、分泌蛋白質前駆体のＮ末端配列
を認識し、該分泌蛋白質を培地中に分泌生産させる分泌
装置を構成する蛋白質の遺伝子を意味するものである。
【００１０】本発明ＤＮＡがコードする蛋白質を含んで
構成される変異型分泌装置は、蛋白質の分泌装置を構成
する蛋白質群をコードする遺伝子ＤＮＡ群の一つである
ｓｅｃＥ遺伝子ＤＮＡがコードする蛋白質の代わりに本
発明ＤＮＡがコードする蛋白質を含むものと考えられ
る。
構成される変異型分泌装置は、蛋白質の分泌装置を構成
する蛋白質群をコードする遺伝子ＤＮＡ群の一つである
ｓｅｃＥ遺伝子ＤＮＡがコードする蛋白質の代わりに本
発明ＤＮＡがコードする蛋白質を含むものと考えられ
る。
【００１１】本発明ＤＮＡは、コリネ型細菌から、ｓｅ
ｃＥ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片（以下、これを「Ａ
断片」と略称することがある）を調製し、これに改変を
加えることにより得ることができる。
ｃＥ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片（以下、これを「Ａ
断片」と略称することがある）を調製し、これに改変を
加えることにより得ることができる。
【００１２】Ａ断片は、コリネ型細菌由来の染色体上か
らクローニングすることができ、その供給源となるコリ
ネ型細菌としては、例えば、ブレビバクテリウム・フラ
バム（Brevibacterium flavum) ＭＪ−２３３（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニ
アゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ＡＴＣＣ
６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４
６、ブレビバクテリウム・デバリカタム（Brevibacteri
um devaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofe
rmentum）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・
グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ
３１８３１等を用いることができる。
らクローニングすることができ、その供給源となるコリ
ネ型細菌としては、例えば、ブレビバクテリウム・フラ
バム（Brevibacterium flavum) ＭＪ−２３３（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニ
アゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ＡＴＣＣ
６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４
６、ブレビバクテリウム・デバリカタム（Brevibacteri
um devaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofe
rmentum）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・
グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ
３１８３１等を用いることができる。
【００１３】これらの供給源微生物からＡ断片を調製す
るための基本操作の一例を述べれば次のとおりである。
Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリ
ウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）株の染色体上に存在
し、染色体上にコードされる蛋白質遺伝子を単離する通
常の方法、すなわち、大腸菌変異株を用いた相補、ある
いは相同性領域のアミノ酸配列を基にデザインしたオリ
ゴＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法に
より分離・取得することができる。
るための基本操作の一例を述べれば次のとおりである。
Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリ
ウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）株の染色体上に存在
し、染色体上にコードされる蛋白質遺伝子を単離する通
常の方法、すなわち、大腸菌変異株を用いた相補、ある
いは相同性領域のアミノ酸配列を基にデザインしたオリ
ゴＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法に
より分離・取得することができる。
【００１４】目的遺伝子を含む断片を単離し、単離した
断片の塩基配列を決定することにより、全遺伝子断片を
確認することができる。上記のＡ断片は、天然のコリネ
型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、塩
基配列が決定された後であれば、通常用いられるＤＮＡ
合成装置、例えば、アプライド・バイオシステムズ(App
lied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイ
ザーを用いて合成されたものであってもよい。
断片の塩基配列を決定することにより、全遺伝子断片を
確認することができる。上記のＡ断片は、天然のコリネ
型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、塩
基配列が決定された後であれば、通常用いられるＤＮＡ
合成装置、例えば、アプライド・バイオシステムズ(App
lied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイ
ザーを用いて合成されたものであってもよい。
【００１５】上記のようにして得られたＡ断片は、配列
番号２に示すアミノ酸配列における４４位のアミノ酸残
基に相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン残基とな
るように改変される。この改変は、部位特異的突然変異
などの公知の方法によって塩基配列にヌクレオチドの置
換、欠失、挿入などの変異を導入することによって生じ
させることができる。
番号２に示すアミノ酸配列における４４位のアミノ酸残
基に相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン残基とな
るように改変される。この改変は、部位特異的突然変異
などの公知の方法によって塩基配列にヌクレオチドの置
換、欠失、挿入などの変異を導入することによって生じ
させることができる。
【００１６】なお、本発明ＤＮＡは、その塩基配列が決
定された後においては通常用いられるＤＮＡ合成装置を
用いて合成することも可能である。本発明ＤＮＡがコー
ドする蛋白質は、配列番号２のアミノ酸配列に相当する
配列であって、配列番号２のアミノ酸配列における４４
位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基がフェニルア
ラニン残基であるアミノ酸配列を有するという特徴を有
し、コリネ型細菌内で、所定の蛋白質を、配列番号１３
のアミノ酸配列を有する蛋白質を含んで構成される分泌
装置よりも効率よく分泌させる分泌装置を構成し、好ま
しくは、工業的レベルにおいて、所定の蛋白質を培地中
へ効率よく分泌させるために必要な変異型分泌装置を構
成するものである。従って、本発明ＤＮＡがコードする
蛋白質は、上記のような機能を実質的に損なうことがな
く、工業的レベルにおいて培地中に所定の蛋白質を分泌
生産可能ならしめるものであれば、配列番号２に示すア
ミノ酸配列の一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基と
置換されていてもよく又は削除されていてもよく、或い
は新たにアミノ酸残基が挿入されていてもよく、さらに
アミノ酸残基の一部が転位されているものであってもよ
く、これらの誘導体をコードするＤＮＡのいずれもが、
配列番号２のアミノ酸配列に相当する配列をコードする
ものとして本発明ＤＮＡに包含されるものである。
定された後においては通常用いられるＤＮＡ合成装置を
用いて合成することも可能である。本発明ＤＮＡがコー
ドする蛋白質は、配列番号２のアミノ酸配列に相当する
配列であって、配列番号２のアミノ酸配列における４４
位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基がフェニルア
ラニン残基であるアミノ酸配列を有するという特徴を有
し、コリネ型細菌内で、所定の蛋白質を、配列番号１３
のアミノ酸配列を有する蛋白質を含んで構成される分泌
装置よりも効率よく分泌させる分泌装置を構成し、好ま
しくは、工業的レベルにおいて、所定の蛋白質を培地中
へ効率よく分泌させるために必要な変異型分泌装置を構
成するものである。従って、本発明ＤＮＡがコードする
蛋白質は、上記のような機能を実質的に損なうことがな
く、工業的レベルにおいて培地中に所定の蛋白質を分泌
生産可能ならしめるものであれば、配列番号２に示すア
ミノ酸配列の一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基と
置換されていてもよく又は削除されていてもよく、或い
は新たにアミノ酸残基が挿入されていてもよく、さらに
アミノ酸残基の一部が転位されているものであってもよ
く、これらの誘導体をコードするＤＮＡのいずれもが、
配列番号２のアミノ酸配列に相当する配列をコードする
ものとして本発明ＤＮＡに包含されるものである。
【００１７】特には、配列番号２に示すアミノ酸配列と
８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有
するものが好ましい。また、蛋白質の構造の一部を、自
然又は人工の突然変異によって上記機能を実質的に変え
ずに変化させることも可能である。すなわち、本発明Ｄ
ＮＡのコードする蛋白質は、配列番号２に示すアミノ酸
配列を有する蛋白質の同種変異型に相当する構造を有す
る蛋白質も包含する。また、通常の変異誘発法により変
異を導入し、通常のスクリーニング法により分泌量を指
標として選択を行うことにより得られ得る同等の配列も
包含する。
８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有
するものが好ましい。また、蛋白質の構造の一部を、自
然又は人工の突然変異によって上記機能を実質的に変え
ずに変化させることも可能である。すなわち、本発明Ｄ
ＮＡのコードする蛋白質は、配列番号２に示すアミノ酸
配列を有する蛋白質の同種変異型に相当する構造を有す
る蛋白質も包含する。また、通常の変異誘発法により変
異を導入し、通常のスクリーニング法により分泌量を指
標として選択を行うことにより得られ得る同等の配列も
包含する。
【００１８】本発明ＤＮＡの機能発現及び本発明ＤＮＡ
がコードする蛋白質を含んで構成される分泌装置の分泌
の効率は、例えば後記実施例２に示すようにして、培地
中に分泌される分泌蛋白質の活性等を測定することによ
り確認及び評価することができる。
がコードする蛋白質を含んで構成される分泌装置の分泌
の効率は、例えば後記実施例２に示すようにして、培地
中に分泌される分泌蛋白質の活性等を測定することによ
り確認及び評価することができる。
【００１９】使用する分泌蛋白質としては、例えば、ア
ミラーゼが挙げられ、アミラーゼ遺伝子をコリネ型細菌
染色体上、またはコリネ型細菌内で複製可能なプラスミ
ドに挿入し、アミラーゼ活性を指標にしてその変異型分
泌装置の分泌能を判定することができる。また、アミラ
ーゼにとどまらず、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラ
ナーゼ、プルラナーゼ、等、通常菌体外に分泌されるも
のはいずれも同様に使用することができる。なお、分泌
される所定の蛋白質は、その分泌に分泌装置が関与して
いる限り、特に制限はなく、これらの測定が容易な酵素
蛋白質に限定されるものではない。
ミラーゼが挙げられ、アミラーゼ遺伝子をコリネ型細菌
染色体上、またはコリネ型細菌内で複製可能なプラスミ
ドに挿入し、アミラーゼ活性を指標にしてその変異型分
泌装置の分泌能を判定することができる。また、アミラ
ーゼにとどまらず、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラ
ナーゼ、プルラナーゼ、等、通常菌体外に分泌されるも
のはいずれも同様に使用することができる。なお、分泌
される所定の蛋白質は、その分泌に分泌装置が関与して
いる限り、特に制限はなく、これらの測定が容易な酵素
蛋白質に限定されるものではない。
【００２０】本発明ＤＮＡの具体例としては、配列番号
１に示す塩基配列が挙げられる。本発明ＤＮＡを導入し
た組換えプラスミドは、通常に使用されるプラスミドに
本発明ＤＮＡを常法に従って導入することによって得る
ことができる。例えば、特開平６−２７００７３号公報
に、ｓｅｃＥ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片について記
載されているのと同様にして、本発明ＤＮＡを適当なプ
ラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増
殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクタ
ーに導入することにより、コリネ型細菌内で、変異型分
泌装置を構成する蛋白質を高発現することが可能な組換
えプラスミドを得ることができる。
１に示す塩基配列が挙げられる。本発明ＤＮＡを導入し
た組換えプラスミドは、通常に使用されるプラスミドに
本発明ＤＮＡを常法に従って導入することによって得る
ことができる。例えば、特開平６−２７００７３号公報
に、ｓｅｃＥ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片について記
載されているのと同様にして、本発明ＤＮＡを適当なプ
ラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増
殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクタ
ーに導入することにより、コリネ型細菌内で、変異型分
泌装置を構成する蛋白質を高発現することが可能な組換
えプラスミドを得ることができる。
【００２１】上記組換えプラスミドを保有するコリネ型
細菌は、上記組換えプラスミドにより常法に従ってコリ
ネ型細菌を形質転換することによって得ることができ
る。例えば、特開平６−２７００７３号公報に、組換え
プラスミドを保有するコリネ型細菌について記載されて
いるのと同様にして得ることができる。
細菌は、上記組換えプラスミドにより常法に従ってコリ
ネ型細菌を形質転換することによって得ることができ
る。例えば、特開平６−２７００７３号公報に、組換え
プラスミドを保有するコリネ型細菌について記載されて
いるのと同様にして得ることができる。
【００２２】
【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。 調製例１ 評価用プラスミドの作製 （Ａ）シャトルベクターの構築 米国特許第５１８５２６２号明細書記載のプラスミドｐ
ＣＲＹ３１より、コリネ型細菌内でのプラスミドの安定
化に必要な領域をＰＣＲ法により増幅させ、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（ＴＯＹＯＢＯ社製）のＥｃｏ
ＲＩ，ＸｈｏＩサイトにクローニングした。
例によりさらに具体的に説明する。 調製例１ 評価用プラスミドの作製 （Ａ）シャトルベクターの構築 米国特許第５１８５２６２号明細書記載のプラスミドｐ
ＣＲＹ３１より、コリネ型細菌内でのプラスミドの安定
化に必要な領域をＰＣＲ法により増幅させ、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（ＴＯＹＯＢＯ社製）のＥｃｏ
ＲＩ，ＸｈｏＩサイトにクローニングした。
【００２３】プラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コ
リネ型細菌内でのプラスミドの安定化に必要な領域の配
列は決定されており、この配列をもとに、下記の１対の
プライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applie
d Biosystems）社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザ
ー（synthesizer）を用いて合成した。
リネ型細菌内でのプラスミドの安定化に必要な領域の配
列は決定されており、この配列をもとに、下記の１対の
プライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applie
d Biosystems）社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザ
ー（synthesizer）を用いて合成した。
【００２４】（a-1）5'-TTT CTC GAG CGC ATT ACC TCC
TTG CTA CTG-3'（配列番号３） （b-1）5'-TTT GAA TTC GAT ATC AAG CTT GCA CAT CAA-
3'（配列番号４） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。）
TTG CTA CTG-3'（配列番号３） （b-1）5'-TTT GAA TTC GAT ATC AAG CTT GCA CAT CAA-
3'（配列番号４） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。）
【００２５】ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製
のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のa-1及びb-1プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ（2.5 Ｕｎｉｔ） 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のa-1及びb-1プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ（2.5 Ｕｎｉｔ） 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００２６】上記で生成した反応液１０μｌを０．８％
アガロースゲルによる電気泳動に付したところ、約１．
１ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確
認できた反応液１０μｌおよびプラスミドｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋溶液１μｌに各々制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩおよびＸｈｏＩを加え、各溶液中のＤＮＡを完全に
切断し、次いで、７０℃で１０分処理することにより制
限酵素を失活させた後、両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガ
ーゼ（１０×）緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１
ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにし
て、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
アガロースゲルによる電気泳動に付したところ、約１．
１ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確
認できた反応液１０μｌおよびプラスミドｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋溶液１μｌに各々制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩおよびＸｈｏＩを加え、各溶液中のＤＮＡを完全に
切断し、次いで、７０℃で１０分処理することにより制
限酵素を失活させた後、両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガ
ーゼ（１０×）緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１
ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにし
て、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００２７】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
Ｌに溶解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００２８】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の
長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．１ｋｂの
挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳｐ
ａｒと命名した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の
長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．１ｋｂの
挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳｐ
ａｒと命名した。
【００２９】次に、米国特許第５１８５２６２号明細書
記載のプラスミドｐＣＲＹ３１より、コリネ型細菌内で
のプラスミドの複製に必要な領域をＰＣＲ法により増幅
させ、上記プラスミドｐＢＳｐａｒのＸｈｏＩ，Ｋｐｎ
Ｉサイトにクローニングし、シャトルベクターを作製し
た。
記載のプラスミドｐＣＲＹ３１より、コリネ型細菌内で
のプラスミドの複製に必要な領域をＰＣＲ法により増幅
させ、上記プラスミドｐＢＳｐａｒのＸｈｏＩ，Ｋｐｎ
Ｉサイトにクローニングし、シャトルベクターを作製し
た。
【００３０】プラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コ
リネ型細菌内でのプラスミドの複製に必要な領域の配列
は決定されており、この配列をもとに、下記の１対のプ
ライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied
Biosystems）社製３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザ
ー（synthesizer ）を用いて合成した。
リネ型細菌内でのプラスミドの複製に必要な領域の配列
は決定されており、この配列をもとに、下記の１対のプ
ライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied
Biosystems）社製３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザ
ー（synthesizer ）を用いて合成した。
【００３１】（a-2）5'-TTT GGT ACC GAC TTA GAT AAA
GGT CTA-3'（配列番号５） （b-2）5'-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-3'
（配列番号６） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。）
GGT CTA-3'（配列番号５） （b-2）5'-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-3'
（配列番号６） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。）
【００３２】ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製
のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のa-2及びb-2プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ（2.5 Ｕｎｉｔ） 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のa-2及びb-2プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ（2.5 Ｕｎｉｔ） 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００３３】上記で生成した反応液１０μｌを０．８％
アガロースゲルによる電気泳動に付したところ、約１．
８ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確
認できた反応液１０μｌおよびプラスミドｐＢＳｐａｒ
溶液１μｌに各々制限酵素ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩを加
え、各液中の核酸を完全に切断し、次いで、７０℃で１
０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者
を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１０×）緩衝液 １μ
ｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、
滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応さ
せ、結合させた。
アガロースゲルによる電気泳動に付したところ、約１．
８ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確
認できた反応液１０μｌおよびプラスミドｐＢＳｐａｒ
溶液１μｌに各々制限酵素ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩを加
え、各液中の核酸を完全に切断し、次いで、７０℃で１
０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者
を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１０×）緩衝液 １μ
ｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、
滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応さ
せ、結合させた。
【００３４】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
１に溶解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
１に溶解〕に塗抹した。
【００３５】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＢＳｐａｒの長さ４．１ｋｂのＤＮ
Ａ断片に加え、長さ１．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認め
られた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒ−ｒｅｐと命名し
た。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＢＳｐａｒの長さ４．１ｋｂのＤＮ
Ａ断片に加え、長さ１．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認め
られた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒ−ｒｅｐと命名し
た。
【００３６】上記で作製したプラスミドｐＢＳｐａｒ−
ｒｅｐ溶液１μｌ、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）溶液
１μｌに各々制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩを加
え、各溶液中のＤＮＡを完全に切断し、次いで、７０℃
で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、
両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１０×）緩衝液１
μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加
し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応
させ、結合させた。
ｒｅｐ溶液１μｌ、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）溶液
１μｌに各々制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩを加
え、各溶液中のＤＮＡを完全に切断し、次いで、７０℃
で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、
両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１０×）緩衝液１
μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加
し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応
させ、結合させた。
【００３７】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
１に溶解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
１に溶解〕に塗抹した。
【００３８】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８の長さ２．６ｋｂのＤ
ＮＡ断片に加え、長さ２．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認
められた。本プラスミドをｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅ
ｐと命名した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８の長さ２．６ｋｂのＤ
ＮＡ断片に加え、長さ２．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認
められた。本プラスミドをｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅ
ｐと命名した。
【００３９】（Ｂ）ｔａｃプロモーターの挿入 プラスミドｐＴｒｃ９９Ａを鋳型としたＰＣＲ法によ
り、ｔａｃプロモーター断片を増幅させるべく、下記の
１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ
（Applied Biosystems）社製３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシ
ンセサイザー（synthesizer）を用いて合成した。
り、ｔａｃプロモーター断片を増幅させるべく、下記の
１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ
（Applied Biosystems）社製３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシ
ンセサイザー（synthesizer）を用いて合成した。
【００４０】（a-3）5'-TTT GGT ACC GAT AGC TTA CTC
CCC ATC CCC-3'（配列番号７） （b-3）5'-TTT GGA TCC CAA CAT ATG AAC ACC TCC TTT
TTA TCC GCT CACAAT TCC ACA CAT-3'（配列番号８） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。）
CCC ATC CCC-3'（配列番号７） （b-3）5'-TTT GGA TCC CAA CAT ATG AAC ACC TCC TTT
TTA TCC GCT CACAAT TCC ACA CAT-3'（配列番号８） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。）
【００４１】ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製
のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のa-3及びb-3プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ（2.5 Ｕｎｉｔ） 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のa-3及びb-3プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ（2.5 Ｕｎｉｔ） 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００４２】上記で生成した反応液１０μｌを３％アガ
ロースゲルによる電気泳動に付したところ、約１００ｂ
ｐのＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確認で
きた反応液１０μｌおよび上記（Ａ）で作製したプラス
ミドｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐの溶液５μｌに各々
制限酵素ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩを加え、各溶液中の
ＤＮＡを完全に切断し、次いで、７０℃で１０分処理す
ることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１０×）緩衝液 １μｌ、Ｔ4 Ｄ
ＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水
で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させ
た。
ロースゲルによる電気泳動に付したところ、約１００ｂ
ｐのＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確認で
きた反応液１０μｌおよび上記（Ａ）で作製したプラス
ミドｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐの溶液５μｌに各々
制限酵素ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩを加え、各溶液中の
ＤＮＡを完全に切断し、次いで、７０℃で１０分処理す
ることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１０×）緩衝液 １μｌ、Ｔ4 Ｄ
ＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水
で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させ
た。
【００４３】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
１に溶解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
１に溶解〕に塗抹した。
【００４４】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、上記（Ａ）作製のプラスミドの長さ５．５ｋｂの
ＤＮＡ断片に加え、長さ０．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が
認められた。このプラスミドをｐＨＳＧ２９８ｔａｃと
命名した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、上記（Ａ）作製のプラスミドの長さ５．５ｋｂの
ＤＮＡ断片に加え、長さ０．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が
認められた。このプラスミドをｐＨＳＧ２９８ｔａｃと
命名した。
【００４５】（Ｃ）アミラーゼ遺伝子の挿入 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｒｅｑｕｅｆａｃｉｅｎ
ｓのアミラーゼ遺伝子の配列は決定されており［Journa
l of Biological Chemistry, 258, 1007-1013(198
3)］、この遺伝子部分をＰＣＲ法により増幅させ、上記
（Ｂ）で作製のプラスミドｐＨＳＧ２９８ｔａｃに挿入
し、評価用プラスミドを作製した。
ｓのアミラーゼ遺伝子の配列は決定されており［Journa
l of Biological Chemistry, 258, 1007-1013(198
3)］、この遺伝子部分をＰＣＲ法により増幅させ、上記
（Ｂ）で作製のプラスミドｐＨＳＧ２９８ｔａｃに挿入
し、評価用プラスミドを作製した。
【００４６】下記の１対のプライマーを、アプライド・
バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３９４
ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）を用い
て合成した。
バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３９４
ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）を用い
て合成した。
【００４７】（a-4）5'-TTT CAT ATG ATT CAA AAA CGA
AAG-3'（配列番号９） （b-4）5'-TTT GGA TCC TTA TTT CTG AAC ATA-3'（配列
番号１０） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。）
AAG-3'（配列番号９） （b-4）5'-TTT GGA TCC TTA TTT CTG AAC ATA-3'（配列
番号１０） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。）
【００４８】ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製
のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のa-4及びb-4プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ（2.5 Ｕｎｉｔ） 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のa-4及びb-4プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ（2.5 Ｕｎｉｔ） 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００４９】上記で生成した反応液１０μｌを０．８％
アガロースゲルによる電気泳動に付したところ、約１．
３ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確
認できた反応液１０μｌおよび上記（Ｂ）で作製したプ
ラスミドの溶液５μｌに各々制限酵素ＮｄｅＩおよびＢ
ａｍＨＩを加え、各溶液中のＤＮＡを完全に切断し、次
いで、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失
活させた後、両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１０
×）緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの
各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃
で３時間反応させ、結合させた。
アガロースゲルによる電気泳動に付したところ、約１．
３ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確
認できた反応液１０μｌおよび上記（Ｂ）で作製したプ
ラスミドの溶液５μｌに各々制限酵素ＮｄｅＩおよびＢ
ａｍＨＩを加え、各溶液中のＤＮＡを完全に切断し、次
いで、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失
活させた後、両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１０
×）緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの
各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃
で３時間反応させ、結合させた。
【００５０】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
１に溶解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
１に溶解〕に塗抹した。
【００５１】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、上記（Ｂ）作製のプラスミドの長さ５．６ｋｂの
ＤＮＡ断片に加え、長さ１．３ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が
認められた。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、上記（Ｂ）作製のプラスミドの長さ５．６ｋｂの
ＤＮＡ断片に加え、長さ１．３ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が
認められた。
【００５２】このプラスミドをｐＳｅｃ１と命名した。
【００５３】実施例１ コリネ型細菌由来分泌装置を構
成する蛋白質の遺伝子ＤＮＡ断片の改変 （Ａ）コリネ型細菌由来分泌装置を構成する蛋白質の遺
伝子ＤＮＡ断片の単離 特開平６−１６９７８０号公報、特開平６−２７７０７
３号公報、特開平７−１０７９８１号公報記載の方法に
従って、コリネ型細菌由来の分泌装置を構成する主要因
子ＳｅｃＹ，ＳｅｃＥ，ＳｅｃＡをコードする遺伝子を
各々単離した。
成する蛋白質の遺伝子ＤＮＡ断片の改変 （Ａ）コリネ型細菌由来分泌装置を構成する蛋白質の遺
伝子ＤＮＡ断片の単離 特開平６−１６９７８０号公報、特開平６−２７７０７
３号公報、特開平７−１０７９８１号公報記載の方法に
従って、コリネ型細菌由来の分泌装置を構成する主要因
子ＳｅｃＹ，ＳｅｃＥ，ＳｅｃＡをコードする遺伝子を
各々単離した。
【００５４】（Ｂ）コリネ型細菌由来分泌装置を構成す
る蛋白質の遺伝子ＤＮＡ断片の改変 前記（Ａ）で調製したＳｅｃＥをコードする遺伝子を含
むプラスミドｐＵＣ１１８−ｓｅｃＥを鋳型としてＰＣ
Ｒを行うことにより、ｓｅｃＥ遺伝子断片を増幅させ
た。このときＴａｑポリメラーゼのフィデリティーを下
げるために、Ｍｎイオンを反応液中に存在させ、変異を
ランダムに導入した断片を増幅させた。
る蛋白質の遺伝子ＤＮＡ断片の改変 前記（Ａ）で調製したＳｅｃＥをコードする遺伝子を含
むプラスミドｐＵＣ１１８−ｓｅｃＥを鋳型としてＰＣ
Ｒを行うことにより、ｓｅｃＥ遺伝子断片を増幅させ
た。このときＴａｑポリメラーゼのフィデリティーを下
げるために、Ｍｎイオンを反応液中に存在させ、変異を
ランダムに導入した断片を増幅させた。
【００５５】下記の１対のプライマーを、アプライド・
バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３９４
ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）を用い
て合成した。
バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３９４
ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）を用い
て合成した。
【００５６】（a-5）5'-TTT GGA TCC ATG GGA GAA GTC
CGT AAG -3'（配列番号１１） （b-5）5'-TTT CCT GCA GGC TAC GGA GTC AGA ATC TT -
3'（配列番号１２） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミン、を示す。）
CGT AAG -3'（配列番号１１） （b-5）5'-TTT CCT GCA GGC TAC GGA GTC AGA ATC TT -
3'（配列番号１２） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミン、を示す。）
【００５７】ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製
のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のa-5及びb-5プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） １００ｍＭ ＭｎＣｌ2 ０．５μｌ レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ（2.5 Ｕｎｉｔ） 滅菌蒸留水 ５９．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のa-5及びb-5プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） １００ｍＭ ＭｎＣｌ2 ０．５μｌ レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ（2.5 Ｕｎｉｔ） 滅菌蒸留水 ５９．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００５８】上記で生成した反応液１０μｌを３％アガ
ロースゲルによる電気泳動に付したところ、約１５０ｂ
のＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確認でき
た反応液１０μｌおよび上記実施例１（Ｃ）で作製した
プラスミドｐＳｅｃ１の溶液５μｌに各々制限酵素Ｂａ
ｍＨＩおよびＳｓｅＩを加え、各溶液中のＤＮＡを完全
に切断し、次いで、７０℃で１０分処理することにより
制限酵素を失活させた後、両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリ
ガーゼ（１０×）緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ
１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌに
して、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
ロースゲルによる電気泳動に付したところ、約１５０ｂ
のＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確認でき
た反応液１０μｌおよび上記実施例１（Ｃ）で作製した
プラスミドｐＳｅｃ１の溶液５μｌに各々制限酵素Ｂａ
ｍＨＩおよびＳｓｅＩを加え、各溶液中のＤＮＡを完全
に切断し、次いで、７０℃で１０分処理することにより
制限酵素を失活させた後、両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリ
ガーゼ（１０×）緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ
１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌに
して、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００５９】一方、通常のＰＣＲの条件にて野生型のｓ
ｅｃＥ遺伝子を増幅させ、同様にして、プラスミドｐＳ
ｅｃ１のＢａｍＨＩ、ＳｓｅＩサイトに挿入した。
ｅｃＥ遺伝子を増幅させ、同様にして、プラスミドｐＳ
ｅｃ１のＢａｍＨＩ、ＳｓｅＩサイトに挿入した。
【００６０】（Ｃ）分泌能を増加させる変異の同定 実施例１（Ｂ）で作製した変異の導入されたｓｅｃＥ遺
伝子、および野生型のｓｅｃＥ遺伝子を含むライゲーシ
ョン液を米国特許第５１８５２６２号明細書記載の方法
に従って、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）に導入した。
伝子、および野生型のｓｅｃＥ遺伝子を含むライゲーシ
ョン液を米国特許第５１８５２６２号明細書記載の方法
に従って、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）に導入した。
【００６１】本菌体溶液を、コーンスターチを１％、カ
ナマイシンを５０μｇ／ｌ含有するＬＢ培地にまき、形
成するハローのサイズの大きいものをピックアップし
た。このコロニーと、野生型のｓｅｃＥ遺伝子を用いて
形質転換したコロニーより、常法に従い、プラスミドを
抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断
片を確認した。この結果、上記調製例１（Ｃ）で作製さ
れたプラスミドの長さ６．９ｋｂのＤＮＡ断片に加え、
長さ１５０ｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
ナマイシンを５０μｇ／ｌ含有するＬＢ培地にまき、形
成するハローのサイズの大きいものをピックアップし
た。このコロニーと、野生型のｓｅｃＥ遺伝子を用いて
形質転換したコロニーより、常法に従い、プラスミドを
抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断
片を確認した。この結果、上記調製例１（Ｃ）で作製さ
れたプラスミドの長さ６．９ｋｂのＤＮＡ断片に加え、
長さ１５０ｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
【００６２】変異型のｓｅｃＥ遺伝子の挿入されたプラ
スミドをｐＳｅｃ１Ｅｍｔ、野生型のｓｅｃＥ遺伝子の
挿入されたプラスミドをｐＳｅｃ１Ｅｗｔと各々命名し
た。本プラスミドに挿入された変異型ｓｅｃＥ遺伝子の
ＤＮＡ塩基配列を決定した。決定された塩基配列及びそ
れから推定されるアミノ酸配列を下記配列表配列番号１
に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
その結果、野生型ｓｅｃＥ蛋白質の４４番目のアミノ酸
ＶａｌがＰｈｅに変化していることが判明した。なお、
野生型ｓｅｃＥ蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１３に
示す。
スミドをｐＳｅｃ１Ｅｍｔ、野生型のｓｅｃＥ遺伝子の
挿入されたプラスミドをｐＳｅｃ１Ｅｗｔと各々命名し
た。本プラスミドに挿入された変異型ｓｅｃＥ遺伝子の
ＤＮＡ塩基配列を決定した。決定された塩基配列及びそ
れから推定されるアミノ酸配列を下記配列表配列番号１
に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
その結果、野生型ｓｅｃＥ蛋白質の４４番目のアミノ酸
ＶａｌがＰｈｅに変化していることが判明した。なお、
野生型ｓｅｃＥ蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１３に
示す。
【００６３】実施例２ 変異型分泌装置の評価 ｐＳｅｃ１Ｅｍｔ、ｐＳＥＣ１Ｅｗｔプラスミドを米国
特許第５１８５２６２号明細書記載の方法に従って、ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９８）に導入した。
特許第５１８５２６２号明細書記載の方法に従って、ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９８）に導入した。
【００６４】形質転換されたブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３菌体を、白金耳にて１０ｍｌの半合成
培地Ａ培地〔組成：尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７
ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０. ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｍ
ｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、Ｍ
ｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス ２. ５
ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸チ
アミン ２００μｇ、及び、グルコース ２０ｇを蒸留
水 １ｌに溶解した〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜
１６時間振とう培養（前培養）した。次にＡ培地１００
ｍｌに前培養液を２％植菌し、３１℃で５時間振とうし
た後集菌し、アミラーゼ活性測定用培養液とした。
バムＭＪ−２３３菌体を、白金耳にて１０ｍｌの半合成
培地Ａ培地〔組成：尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７
ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０. ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｍ
ｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、Ｍ
ｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス ２. ５
ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸チ
アミン ２００μｇ、及び、グルコース ２０ｇを蒸留
水 １ｌに溶解した〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜
１６時間振とう培養（前培養）した。次にＡ培地１００
ｍｌに前培養液を２％植菌し、３１℃で５時間振とうし
た後集菌し、アミラーゼ活性測定用培養液とした。
【００６５】アミラーゼ活性の測定は市販のアミラーゼ
活性測定キット［アミラーゼ Ｂ−テストワコー（和光
純薬社製）］添付のプロトコールに従って行った。アミ
ラーゼ活性測定の結果、ｐＳｅｃ１Ｅｗｔを導入した菌
体に比較して、ｐＳｅｃ１Ｅｍｔを導入した菌体の培養
上清中の活性は約５倍に上昇しており、配列番号１記載
の塩基配列からなるＡ断片の活性が著しく高いことを確
認した。
活性測定キット［アミラーゼ Ｂ−テストワコー（和光
純薬社製）］添付のプロトコールに従って行った。アミ
ラーゼ活性測定の結果、ｐＳｅｃ１Ｅｗｔを導入した菌
体に比較して、ｐＳｅｃ１Ｅｍｔを導入した菌体の培養
上清中の活性は約５倍に上昇しており、配列番号１記載
の塩基配列からなるＡ断片の活性が著しく高いことを確
認した。
【００６６】
【発明の効果】コリネ型細菌由来の、所定の蛋白質を培
地中へ効率よく分泌させるために必要な変異型分泌装置
を構成する蛋白質をコードするＤＮＡが提供され、所定
の蛋白質を培地中へ効率よく分泌生産させる系の構築、
製造法の確立が可能となった。
地中へ効率よく分泌させるために必要な変異型分泌装置
を構成する蛋白質をコードするＤＮＡが提供され、所定
の蛋白質を培地中へ効率よく分泌生産させる系の構築、
製造法の確立が可能となった。
【００６７】
配列番号：１ 配列の長さ：153 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム(Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ233 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..150 特徴を決定した方法：E 配列 GTG GGA GAA GTC CGT AAG GTT ATT TGG CCT ACT GCG CGC CAG ATG GTC 48 Val Gly Glu Val Arg Lys Val Ile Trp Pro Thr Ala Arg Gln Met Val 1 5 10 15 ACG TAC ACC CTT GTG GTT TTG GGA TTT TTG ATT GTT TTG ACC GCT TTG 96 Thr Tyr Thr Leu Val Val Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu 20 25 30 GTG TCT GGT GTG GAT TTC CTA GCT GGT CTT GGA TTT GAG AAG ATT CTG 144 Val Ser Gly Val Asp Phe Leu Ala Gly Leu Gly Phe Glu Lys Ile Leu 35 40 45 ACT CCG TAG 153 Thr Pro 50
m flavum) 株名：MJ233 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..150 特徴を決定した方法：E 配列 GTG GGA GAA GTC CGT AAG GTT ATT TGG CCT ACT GCG CGC CAG ATG GTC 48 Val Gly Glu Val Arg Lys Val Ile Trp Pro Thr Ala Arg Gln Met Val 1 5 10 15 ACG TAC ACC CTT GTG GTT TTG GGA TTT TTG ATT GTT TTG ACC GCT TTG 96 Thr Tyr Thr Leu Val Val Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu 20 25 30 GTG TCT GGT GTG GAT TTC CTA GCT GGT CTT GGA TTT GAG AAG ATT CTG 144 Val Ser Gly Val Asp Phe Leu Ala Gly Leu Gly Phe Glu Lys Ile Leu 35 40 45 ACT CCG TAG 153 Thr Pro 50
【００６８】配列番号：２ 配列の長さ：50 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Gly Glu Val Arg Lys Val Ile Trp Pro Thr Ala Arg Gln Met Val 1 5 10 15 Thr Tyr Thr Leu Val Val Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu 20 25 30 Val Ser Gly Val Asp Phe Leu Ala Gly Leu Gly Phe Glu Lys Ile Leu 35 40 45 Thr Pro 50
【００６９】配列番号：３ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTCTCGAGC GCATTACCTC CTTGCTACTG 30
【００７０】配列番号：４ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTGAATTCG ATATCAAGCT TGCACATCAA 30
【００７１】配列番号：５ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTGGTACCG ACTTAGATAA AGGTCTA 27
【００７２】配列番号：６ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTCTCGAGT GCTGGTAAAA CAACTTT 27
【００７３】配列番号：７ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTGGTACCG ATAGCTTACT CCCCATCCCC 30
【００７４】配列番号：８ 配列の長さ：54 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTGGATCCC AACATATGAA CACCTCCTTT TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAT 54
【００７５】配列番号：９ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTCATATGA TTCAAAAACG AAAG 24
【００７６】配列番号：１０ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTGGATCCT TATTTCTGAA CATA 24
【００７７】配列番号：１１ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTGGATCCA TGGGAGAAGT CCGTAAG 27
【００７８】配列番号：１２ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成DNA 配列 TTTCCTGCAG GCTACGGAGT CAGAATCTT 29
【００７９】配列番号：１３ 配列の長さ：50 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Gly Glu Val Arg Lys Val Ile Trp Pro Thr Ala Arg Gln Met Val 1 5 10 15 Thr Tyr Thr Leu Val Val Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu 20 25 30 Val Ser Gly Val Asp Phe Leu Ala Gly Leu Gly Val Glu Lys Ile Leu 35 40 45 Thr Pro 50
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (7)
- 【請求項１】 配列番号２のアミノ酸配列における４４
位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基がフェニルア
ラニン残基である配列番号２のアミノ酸配列に相当する
アミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡであっ
て、前記蛋白質を含んで構成される分泌装置は、コリネ
型細菌内で、所定の蛋白質を、配列番号１３のアミノ酸
配列を有する蛋白質を含んで構成される分泌装置よりも
効率よく分泌させるＤＮＡ。 - 【請求項２】 配列番号２のアミノ酸配列をコードす
る、請求項１に記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フ
ラバム(Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３である請
求項１又は２記載のＤＮＡ。 - 【請求項４】 配列番号１の塩基配列を有する、請求項
１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ
を導入した、組換えプラスミド。 - 【請求項６】 請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ
およびコリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子を含
むＤＮＡを含む、請求項５に記載の組換えプラスミド。 - 【請求項７】 請求項５又は６に記載の組換えプラスミ
ドを保有するコリネ型細菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9361768A JPH11169182A (ja) | 1997-12-10 | 1997-12-10 | コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく培地中へ分泌させる変異型分泌装置遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9361768A JPH11169182A (ja) | 1997-12-10 | 1997-12-10 | コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく培地中へ分泌させる変異型分泌装置遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11169182A true JPH11169182A (ja) | 1999-06-29 |
Family
ID=18474804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9361768A Pending JPH11169182A (ja) | 1997-12-10 | 1997-12-10 | コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく培地中へ分泌させる変異型分泌装置遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11169182A (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002081694A1 (fr) * | 2001-03-30 | 2002-10-17 | Ajinomoto Co.,Inc. | Procede de secretion et de production de proteine |
| WO2004029254A1 (ja) * | 2002-09-30 | 2004-04-08 | Ajinomoto Co.,Inc. | 安定同位体標識タンパク質の製造方法 |
| WO2013062029A1 (ja) | 2011-10-25 | 2013-05-02 | 味の素株式会社 | タンパク質の分泌生産法 |
| WO2013065869A1 (en) | 2011-11-02 | 2013-05-10 | Ajinomoto Co.,Inc. | Method for secretory production of protein |
| WO2013065772A1 (ja) | 2011-11-02 | 2013-05-10 | 味の素株式会社 | タンパク質の分泌生産法 |
| US8597907B2 (en) | 2004-04-20 | 2013-12-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing proteins |
| WO2018074578A1 (ja) | 2016-10-21 | 2018-04-26 | 味の素株式会社 | タンパク質の分泌生産法 |
| WO2018074579A1 (ja) | 2016-10-21 | 2018-04-26 | 味の素株式会社 | タンパク質の分泌生産法 |
| WO2019203368A1 (ja) | 2018-04-20 | 2019-10-24 | 味の素株式会社 | タンパク質の分泌生産法 |
| US10538798B2 (en) | 2015-04-24 | 2020-01-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for secretory production of protein |
-
1997
- 1997-12-10 JP JP9361768A patent/JPH11169182A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO2002081694A1 (fr) * | 2001-03-30 | 2002-10-17 | Ajinomoto Co.,Inc. | Procede de secretion et de production de proteine |
| WO2004029254A1 (ja) * | 2002-09-30 | 2004-04-08 | Ajinomoto Co.,Inc. | 安定同位体標識タンパク質の製造方法 |
| US8597907B2 (en) | 2004-04-20 | 2013-12-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing proteins |
| WO2013062029A1 (ja) | 2011-10-25 | 2013-05-02 | 味の素株式会社 | タンパク質の分泌生産法 |
| US9376701B2 (en) | 2011-10-25 | 2016-06-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for secretory production of protein |
| US9404138B2 (en) | 2011-11-02 | 2016-08-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for secretory production of protein |
| KR20140088215A (ko) | 2011-11-02 | 2014-07-09 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 단백질의 분비 생산 방법 |
| US9187554B2 (en) | 2011-11-02 | 2015-11-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for secretory production of protein |
| WO2013065772A1 (ja) | 2011-11-02 | 2013-05-10 | 味の素株式会社 | タンパク質の分泌生産法 |
| WO2013065869A1 (en) | 2011-11-02 | 2013-05-10 | Ajinomoto Co.,Inc. | Method for secretory production of protein |
| US10538798B2 (en) | 2015-04-24 | 2020-01-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for secretory production of protein |
| WO2018074579A1 (ja) | 2016-10-21 | 2018-04-26 | 味の素株式会社 | タンパク質の分泌生産法 |
| KR20190067888A (ko) | 2016-10-21 | 2019-06-17 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 단백질의 분비 생산법 |
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