JP4104219B2 - Method for producing anti-treponema antibody measuring reagent, measuring reagent and measuring method - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫反応による抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法、測定試薬及び測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
梅毒は梅毒トレポネーマ・パリダムにより引き起こされる感染症であり、梅毒に感染しているか否かは、血液中の抗トレポネーマ抗体の存在で確認される。
臨床検査分野においては、種々の方法により血液中の抗トレポネーマ抗体を測定している。
【０００３】
一般的な方法としては、梅毒菌（トレポネーマ・パリダム ニコルス株）より得られた梅毒菌固有の抗原蛋白質を担持した不溶性担体に、血液中の抗トレポネーマ抗体を反応させ、抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度合いを検出することにより、該抗体量を測定する免疫測定法が用いられている。
このような測定方法としては、赤血球凝集反応法（ＴＰＨＡ法）、ラテックス凝集反応法等が知られている。
これらの方法に用いられている梅毒菌由来抗原蛋白質は、梅毒菌から抽出・精製することによって得られる（特開平２−２３４０６３号公報）。しかしこのような方法で得られる梅毒菌由来抗原には、以下のような問題点があった。
▲１▼梅毒菌はｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養が不可能であるため、大量の菌体を得るには大きな労力と時間を要する。
▲２▼菌体からの抽出・精製過程が煩雑である。
▲３▼上記の様にして得られた精製抗原についても、ロット間差（バラツキ）が大きい。
またこれらの抗原を使用して得られた診断試薬においては時として検量線の感度不足などの重大な欠点が生じることがあった。
【０００４】
そこで上記の様な問題点を解決するために、種々の検討がなされてきた。
▲１▼、▲２▼を解決する目的では、遺伝子組み換え技術を用いて梅毒菌特有の抗原蛋白質を製造し、診断試薬に使用する方法が行なわれている。梅毒トレポネーマの表面抗原蛋白質は種々の分子量のものが存在することが知られており、その抗原抗体反応において主要なものとしては、４７ｋＤａ（以下４７ｋＤａ抗原）、１７ｋＤａ（以下１７ｋＤａ抗原）、１５ｋＤａ（以下１５ｋＤａ抗原）が知られている。これら表面抗原をコードする遺伝子はすでにクローニングされ、アミノ酸配列も決定されているので遺伝子工学的に抗原蛋白質を生産することが可能である。
【０００５】
これらの抗原蛋白質を使用した診断試薬の製造方法が、特表昭５９−５０２１３１号公報、特表平２−５００４０３号公報に開示されているが、実用的に使用可能なものが報告された例はない。これらの原因として、測定に必要な感度の不足、現行法のＴＰＨＡ法と特異性が一致しない等が考えられる。
また特開平７−２８７０１７号公報では、遺伝子工学的方法を用いて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと１５ｋＤａ、１７ｋＤａの各抗原蛋白質との複合蛋白質を製造し、診断試薬に利用している。しかしながらこの方法では、抗原蛋白質がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと結合しているため、純粋な梅毒抗原とは言いがたい。またグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが反応系に存在することになり、検体に悪影響を及ぼすおそれがある。
【０００６】
さらに▲３▼の感度不足を解決する目的で、特開平８−１７６１９５号公報では、還元型アルブミン溶液と梅毒菌由来抗原蛋白質の混合液を不溶性担体に担持する方法が記載されている。
しかしながらこの方法では、アルブミンを還元する工程、還元後にＳＨ基を保護する工程、及び還元に使用した物質を酸化処理する工程を含むなど、煩雑である。さらに梅毒菌由来抗原蛋白質を不溶性担体に担持する工程において、梅毒菌由来抗原蛋白質溶液を還元型アルブミン溶液で希釈する必要がある等の問題がある。
また遺伝子工学的に得られた梅毒抗原蛋白質を、一般的な種々の方法で不溶性担体に担持させ診断試薬を調製したが、測定に必要な感度は得られなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点を解決するものであり、その目的は、簡便にかつ梅毒菌由来抗原蛋白質を用いた診断試薬と同等以上の性能を有し、高感度に抗体量の定量が可能な抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法、試薬及び測定方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の請求項１に記載の抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法は、不溶性担体に遺伝子工学的な手法により得られる梅毒トレポネーマ抗原蛋白質が担持されてなる免疫学的抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法であって、
上記梅毒トレポネーマ抗原蛋白質とジスルフィド結合を開裂することのできる物質とを混合する工程を含むことを特徴とする抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法である。
また請求項２に記載の製造方法は、前記混合する工程が、不溶性担体に梅毒トレポネーマ抗原蛋白質を担持させる工程より前であることを特徴とする請求項１記載の抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法である。
また請求項３に記載の製造方法においては、さらに、不溶性担体に梅毒トレポネーマ抗原蛋白質を担持させる工程の後に、不溶性担体をアルブミンで被覆する工程を有することを特徴とする請求項２記載の抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法である。
【０００９】
そして請求項４に記載の製造方法は、不溶性担体に遺伝子工学的な手法により得られる梅毒トレポネーマ抗原蛋白質が担持されてなる免疫学的抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法であって、
不溶性担体に梅毒トレポネーマ抗原蛋白質を担持させる工程と、
アルブミンとジスルフィド結合を開裂することのできる物質とを混合する工程と、
上記不溶性担体を上記アルブミンとジスルフィド結合を開裂することのできる物質との混合物で被覆する工程とを有することを特徴とする抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法である。
さらに請求項５に記載の抗トレポネーマ抗体測定試薬は、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により製造された抗トレポネーマ抗体測定試薬である。
そして請求項６に記載の抗トレポネーマ抗体の測定方法は、請求項５に記載の抗トレポネーマ抗体測定試薬を用いて、検体中の抗トレポネーマ抗体量を測定することを特徴とする抗トレポネーマ抗体の測定方法である。
【００１０】
前記遺伝子工学的な手法により得られる梅毒トレポネーマ抗原蛋白質としては、梅毒菌体遺伝子からクローニングされたものであればよく、クローニング方法は特に限定されない。
上記抗原蛋白質を得る方法を、４７ｋＤａ抗原を例として説明する。梅毒トレポネーマ抗原の遺伝子はすでに公知であるので、ＰＣＲ法により４７ｋＤａ抗原に対するＤＮＡを増幅、精製し、これを適当な発現ベクターに組み込む。このベクターを大腸菌に導入し、大腸菌に大量に産生させる方法が挙げられる。
大腸菌から効率よく４７ｋＤａ抗原を精製する方法としては、特公平６−８１５９６号公報に記載される様に、ベクターにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下ＧＳＴとする）遺伝子を含むものを用いる方法が挙げられる。
この方法ではＧＳＴ遺伝子のあとに梅毒トレポネーマ抗原遺伝子を挿入し、大腸菌にＧＳＴと４７ｋＤａ抗原の融合蛋白質として産生させる。十分に産生されたあと菌体を破壊し、リゼイドを固定グルタチオンと接触させることで融合蛋白質を分離できる。次いでこの融合蛋白質を開裂させて４７ｋＤａ抗原が得られる。
【００１１】
本発明に用いられる梅毒トレポネーマ抗原は、前述の４７ｋＤａ、１７ｋＤａ、１５ｋＤａの他、４４ｋＤａ、４２ｋＤａ、３５ｋＤａ、３４ｋＤａ等の大きさの抗原があることが知られており、これらのうちの１種以上が用いられる。そのうち４７ｋＤａ、１７ｋＤａ、１５ｋＤａのものが主な抗原となっていると考えられており、これらを用いることが好ましい。
【００１２】
前記ジスルフィド結合を開裂することのできる物質としては、例えば、グルタチオン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、２−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ビピリジンジスルフィド誘導体、マレイミド誘導体、チオフタルイミド誘導体及び活性ハロゲン誘導体等の還元剤が挙げられるが、ジスルフィド結合を開裂させることができるものであれば特に限定されない。また、このように開裂させたジスルフィド結合を保護するために、アルキル化剤などで保護してもよい。
【００１３】
請求項１に記載の製造方法においては、上記梅毒トレポネーマ抗原蛋白質とジスルフィド結合を開裂することのできる物質とを混合する工程が含まれる。
この時のジスルフィド結合を開裂することのできる物質の濃度は、少なくなるとジスルフィド結合が十分に開裂されずその結果十分な検量線感度が得られず、、多くなるとジスルフィド結合は開裂されるが抗原蛋白質の変性等が生じて感度が低下することがあるので、好ましくは５〜２０００ｍＭ、より好ましくは５０〜１０００ｍＭである。
また混合時の温度は好ましくは２〜５０℃、より好ましくは４〜４０℃である。混合時の温度が１℃以下になると反応系が凍結してしまい、反応が進行しない。また、５０℃以上になると、抗原蛋白質が熱変性してしまい、抗原として機能しなくなる。
【００１４】
請求項１に記載の製造方法において、梅毒トレポネーマ抗原蛋白質とジスルフィド結合を開裂することのできる物質を混合する工程は、どの時点であっても、またどのような形態であってもよく、例えば、抗原蛋白質液とジスルフィド結合を開裂することのできる物質の溶液とを混合したり、あるいは不溶性担体液にジスルフィド結合を開裂することのできる物質を添加し、これに抗原蛋白質を添加して混合してもよい。
前者の場合、この混合液と不溶性担体を混合することにより不溶性担体に抗原蛋白質が担持される。また後者の場合、抗原蛋白質を添加し混合することにより不溶性担体に担持される。
【００１５】
請求項２に記載の製造方法においては、上記梅毒トレポネーマ抗原蛋白質とジスルフィド結合を開裂することのできる物質を混合する工程が、不溶性担体に抗原蛋白質を担持させる工程より前とされる。
その際のジスルフィド結合を開裂することのできる物質の濃度及び温度は、請求項１に記載の製造方法の場合と同様である。
【００１６】
上記不溶性担体としては、従来より免疫学的凝集反応及び凝集阻止反応において、一般的に用いられている微粒子の担体を用いることができるが、工業的に大量生産が可能な合成高分子微粒子を均一に懸濁させたラテックスが好ましい。
上記合成高分子としては、例えば、ポリスチレン、スチレン−スルホン酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられ、抗原蛋白質の吸着性に優れ、生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、特にポリスチレン、スチレン−スルホン酸共重合体が好ましい。
その他、プラスチック製マイクロタイタープレート；動物の赤血球、細菌の細胞等の生物学的粒子；ベントナイト、コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリン、炭素末等の非生物学的粒子なども用いることができる。
上記不溶性担体の平均粒径は、測定方法、測定機器によって異なるが、０．１〜１．０μｍ、好ましくは０．１〜０．５μｍのものが通常用いられる。
【００１７】
請求項２に記載の製造方法では、上記混合する工程の後、抗原蛋白質が不溶性担体に担持される。
上記不溶性担体に抗原蛋白質を担持させる方法としては、物理的に吸着させる方法、化学的に結合させる方法がある。物理的に吸着させる方法としては、例えば、一定条件下で抗原蛋白質と不溶性担体を混合することにより担持させることができる。
【００１８】
さらに上記担持させる工程の後、アルブミン、カゼイン、界面活性剤等の不活性物質により不溶性担体を被覆してもよい。
好ましくは請求項３に記載のように、上記不活性な物質による被覆がアルブミンによってなされる。
アルブミンは動物の血液中に存在する分子量約６５０００の蛋白質である。動物種としては、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、及びヒト等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
上記被覆する工程において、アルブミンの濃度は、小さくなると不溶性担体表面が十分に被覆されないため非特異的な凝集が生じ、多くなると逆に検量線感度が低下するので、０．０１〜１０重量％が好ましく、０．１〜５重量％がより好ましい。
【００１９】
不溶性担体を不活性な物質で被覆する方法としては、例えば、抗原蛋白質を不溶性担体に担持させた後、一定条件下で不活性な物質を混合することにより被覆することができる。
【００２０】
抗原蛋白質を不溶性担体に担持させる工程、及びさらに不活性物質により被覆する工程において、溶媒としては、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。
また反応時のｐＨは、酸性又はアルカリ性が強すぎると、抗原蛋白質が変性する等の問題が生じるため、４〜１０が好ましい。反応時の温度は、低くなると十分に反応しない、又は反応系が凍結してしまい、必要な感度を有するものが得難くなり、高くなると抗原蛋白質が変性する等の問題が生じるため、２〜５０℃が好ましく、４〜４０℃がより好ましい。
【００２１】
請求項４に記載の製造方法は、不溶性担体に遺伝子工学的な手法により得られる梅毒トレポネーマ抗原蛋白質が担持されてなる免疫学的抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法であって、
不溶性担体に梅毒トレポネーマ抗原蛋白質を担持させる工程と、
アルブミンとジスルフィド結合を開裂することのできる物質とを混合する工程と、
上記不溶性担体を上記アルブミンとジスルフィド結合を開裂することのできる物質との混合物で被覆する工程とを有することを特徴とする抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法である。
【００２２】
上記アルブミンとジスルフィド結合を開裂することのできる物質を混合する工程において、ジスルフィド結合を開裂することのできる物質の濃度は、小さくなると十分な検量線感度が得られず、大きくなると抗原蛋白質が変性等により感度が低下することがあるので、５〜２０００ｍＭが好ましく、２０〜１０００ｍＭがより好ましい。
【００２３】
さらに請求項５に記載の抗トレポネーマ抗体測定試薬は、上記請求項１〜４に記載の抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法により得られる。
また請求項６に記載の抗トレポネーマ抗体の測定方法は、上記請求項５に記載の測定試薬を用いて行なわれる。
具体的には、以上のようにして得られた試薬と検体中の抗トレポネーマ抗体との免疫反応により生じる凝集の度合いを光学的に測定することにより、検体中の抗トレポネーマ抗体量を測定する。
【００２４】
上記免疫反応を行う際の反応系の反応液としては、免疫反応が起こりうる生理的条件を満たす水溶液であれば特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
反応液のｐＨは、４〜１０が好ましく、より好ましくは６〜８である。
上記反応液には、更に必要に応じて、牛血清アルブミン、ショ糖等の安定化剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤、塩化ナトリウム等の塩濃度調整剤などを添加してもよい。
反応温度は、上記免疫反応が起こりうるものであれば特に限定されないが、恒温で１０〜５０℃の範囲内で行うのが好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。反応時間は適宜決められる。
【００２５】
上記凝集の度合いを光学的に測定する方法としては、公知の方法が用いられ、例えば、凝集の形成を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集の形成を粒度分布又は平均粒径の変化としてとらえる方法、凝集の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し透過光強度との比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。
上記の測定法において、異なる時点で少なくとも２つの測定値を得、これらの時点間における測定値の増加分（すなわち増加速度）に基づき凝集の程度を求める速度試験（レートアッセイ）、及びある時点（通常は反応の終点と考えられる時点）で１つの測定値を得、この測定値に基づき凝集の程度を求める終点試験（エンドポイントアッセイ）を利用でき、測定の簡便性、迅速性の点から比濁法による速度試験を行うことが好ましい。
光学的に測定する方法において、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出できる光学機器、特に汎用の自動分析機が使用できる。測定の波長は２５０〜１０００ｎｍが使用できる。
【００２６】
【実施例】
本発明を実施例につき説明する。
（実施例１）
１）４７ｋＤａ抗原蛋白質の調製
梅毒トレポネーマ継代ウサギ睾丸から梅毒トレポネーマ菌体を抽出し、ゲノムＤＮＡを抽出した。すでに４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は既知である（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８１，３７５−３８８（１９９８））ので、これをもとにＤＮＡ合成装置を用いてプライマーを作成した。このプライマーを用いて、先に抽出した梅毒トレポネーマゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ断片を得た。
ＧＳＴとの融合蛋白質を発現するためにつくられたベクターｐＧＥＸ４３にこのＤＮＡ断片を挿入し、ｐＧＥＸ４３−４７ｋと命名した。これを大腸菌に導入し、培養液にイソプロピル−β−（−）−チオガラクトピラノシドを加えることにより、融合蛋白質の発現を誘導した。
十分に融合蛋白質が発現した大腸菌を超音波処理によって菌体を破砕した。次いで遠心分離により細胞膜、核等を除いた上清にグルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）を加え、一晩放置し、融合蛋白質をグルタチオンセファロースに吸着させた。
遠心分離により融合蛋白質が吸着したグルタチオンセファロースを回収し、これをカラムにつめた。数回洗浄した後、グルタチオン溶液を流して融合蛋白質を遊離させて溶出した。
このようにして精製した４７ｋＤａ抗原−ＧＳＴ融合蛋白質溶液にトロンビン溶液を添加し、４７ｋＤａ抗原とＧＳＴの結合を切断した。この溶液をグルタチオンセファロースカラムにかけてＧＳＴを除去し、さらにヘパリンカラムにかけてトロンビンを除去して４７ｋＤａ抗原を精製した。
【００２７】
２）抗原蛋白質のラテックスへの担持
ジチオスレイトール（ナカライテスク社製）を３００ｍＭ含有する３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍｌと、上記１）で得られた４７ｋＤａ抗原蛋白質液（蛋白質濃度１ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌを混合した。この液の０．３ｍｌにポリスチレンラテックス（平均粒径０．４μｍ、１０ｗ／ｖ％、積水化学工業社製）０．０５ｍｌを添加し、３７℃で２時間攪拌し、抗原蛋白質をラテックスに担持させた。
３）抗原蛋白質担持ラテックスのブロッキング
牛血清アルブミン（シグマ社製、以下ＢＳＡとする）を１％（ｗ／ｖ）含有する３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．５ｍｌ添加し、３７℃で１時間攪拌してブロッキングを行なった。
この液を１５０００ｒｐｍで３０分遠心分離した。得られた沈殿物に、ＢＳＡを１％（ｗ／ｖ）含有する３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を２ｍｌ添加し、再懸濁して抗原蛋白質担持ラテックス溶液を調製した。
【００２８】
４）検体希釈液の調製
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＢＳＡを１％（ｗ／ｖ）になるように、また抗原抗体反応の促進剤としてグリコシルメチルメタクリレート（日本精化社製、平均分子量１００万、以下ＧＥＭＡとする）を１％（ｗ／ｖ）になるように添加し溶解させて検体希釈液を調製した。
５）抗トレポネーマ抗体測定試薬
本実施例の抗トレポネーマ抗体測定試薬は、上記３）で調製した抗原蛋白質担持ラテックス溶液からなる第１試薬と、上記４）で調製した検体希釈液からなる第２試薬とから構成される２液系の試薬である。
６）抗トレポネーマ抗体の測定
検体として、抗トレポネーマ抗体量が既知である梅毒陽性標準血清（積水化学工業社製）を用いた。
検体２０μｌに上記検体希釈液（第２試薬）２１０μｌを添加・混合し、一定時間経過後、上記ラテックス溶液（第１試薬）３０μｌを添加・混合した。ラテックス液混合後８０秒から３００秒の間の濁度変化量を反応量として測定した。測定は生化学自動分析装置（日立７１５０形自動分析機）を用い、測定波長は７００ｎｍ、測定温度は３７℃で行なった。結果を表１に示す。
【００２９】
（実施例２）
実施例１の１）において、４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列にかえて、１５ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列を用いたこと以外は同様にして、１５ｋＤａ抗原蛋白質を調製した。
４７ｋＤａ抗原蛋白質にかえて上記１５ｋＤａ抗原蛋白質を用いたこと以外は、実施例１の２）〜６）と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表１に示す。
【００３０】
（実施例３）
実施例１の２）において、４７ｋＤａ抗原蛋白質にかえて、４７ｋＤａ抗原蛋白質と１５ｋＤａ抗原蛋白質を体積比で１：１に混合したものを用いたこと以外は実施例１と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表１に示す。
【００３１】
（実施例４）
実施例１の２）において、ジチオスレイトールの濃度を３００ｍＭにかえて６ｍＭとしたこと以外は実施例１と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表１に示す。
【００３２】
（実施例５）
実施例１の２）において、ジチオスレイトールの濃度を３００ｍＭにかえて２０００ｍＭとしたこと以外は実施例１と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表１に示す。
【００３３】
（実施例６）
実施例１の２）において、ジチオスレイトールにかえて２−メルカプトエタノールを用いたこと以外は実施例１と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表１に示す。
【００３４】
（実施例７）
実施例１の１）において、４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列にかえて、１７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列を用いたこと以外は同様にして、１７ｋＤａ抗原蛋白質を調製した。
実施例１の２）において、４７ｋＤａ抗原蛋白質にかえて、１５ｋＤａ抗原蛋白質と１７ｋＤａ抗原蛋白質を体積比で１：１に混合したものを用いたこと以外は実施例１と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表１に示す。
【００３５】
（比較例１）
実施例１の２）において、ジチオスレイトールを含有しない３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】

【００３７】
なお表１中の抗体量の単位Ｔ．Ｕ．は、市販の抗トレポネーマ抗体測定試薬「メディエースＴＰＬＡ」（積水化学工業社製）で標準血清を測定した時の抗体量の単位である。
【００３８】
（実施例８）
１）４７ｋＤａ抗原蛋白質の調製
実施例１の１）と同様にして４７ｋＤａ抗原蛋白質を調製した。
２）抗原蛋白質のラテックスへの担持
３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍｌと、上記１）で得られた４７ｋＤａ抗原蛋白質液（蛋白質濃度１ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌを混合した。この液の０．３ｍｌにポリスチレンラテックス（平均粒径０．４μｍ、１０ｗ／ｖ％、積水化学工業社製）０．０５ｍｌを添加し、３７℃で２時間攪拌し、抗原蛋白質をラテックスに担持させた。
３）抗原蛋白質担持ラテックスのブロッキング
ジチオスレイトール（ナカライテスク社製）が３００ｍＭ、ＢＳＡが１％（ｗ／ｖ）となるように、３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に添加・混合した。この液０．５ｍｌを上記抗原蛋白質担持ラテックスに添加し、３７℃で１時間攪拌してブロッキングを行なった。
この液を１５０００ｒｐｍで３０分遠心分離した。得られた沈殿物にＢＳＡを１％（ｗ／ｖ）含有する３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を２ｍｌ添加し、再懸濁して抗原蛋白質担持ラテックス溶液を調製した。
４）検体希釈液の調製
実施例１の４）と同様にして検体希釈液を調製した。
５）抗トレポネーマ抗体測定試薬
本実施例の抗トレポネーマ抗体測定試薬は、上記３）で調製した抗原蛋白質担持ラテックス溶液からなる第１試薬と、上記４）で調製した検体希釈液からなる第２試薬とから構成される２液系の試薬である。
６）抗トレポネーマ抗体の測定
実施例１の６）と同様にして抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表２に示す。
【００３９】
（実施例９）
実施例１の１）において、４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列にかえて１５ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列を用いたこと以外は同様にして、１５ｋＤａ抗原蛋白質を調製した。
４７ｋＤａ抗原蛋白質にかえて上記１５ｋＤａ抗原蛋白質を用いたこと以外は、実施例８の２）〜６）と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表２に示す。
【００４０】
（実施例１０）
実施例８の２）において、４７ｋＤａ抗原蛋白質にかえて、４７ｋＤａ抗原蛋白質と１５ｋＤａ抗原蛋白質を体積比で１：１に混合したものを用いたこと以外は実施例８と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表２に示す。
【００４１】
（実施例１１）
実施例８の３）において、ジチオスレイトールの濃度を３００ｍＭにかえて６ｍＭとしたこと以外は実施例８と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表２に示す。
【００４２】
（実施例１２）
実施例８の３）において、ジチオスレイトールの濃度を３００ｍＭにかえて２０００ｍＭとしたこと以外は実施例８と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表２に示す。
【００４３】
（実施例１３）
実施例８の３）において、ジチオスレイトールにかえて２−メルカプトエタノールを用いたこと以外は実施例８と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表２に示す。
【００４４】
（実施例１４）
実施例１の１）において、４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列にかえて、１７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列を用いたこと以外は同様にして、１７ｋＤａ抗原蛋白質を調製した。
実施例８の２）において、４７ｋＤａ抗原蛋白質にかえて、１５ｋＤａ抗原蛋白質と１７ｋＤａ抗原蛋白質を体積比で１：１に混合したものを用いたこと以外は実施例８と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表１に示す。
【００４５】
【表２】

【００４６】
なお表２中の抗体量の単位Ｔ．Ｕ．は、市販の抗トレポネーマ抗体測定試薬「メディエースＴＰＬＡ」（積水化学工業社製）で標準血清を測定した時の抗体量の単位である。
【００４７】
（実施例１５）
実施例１の１）において調製した４７ｋＤａ抗原蛋白質を用い、実施例１の２）及び３）の工程を以下の２）及び３）のように変えたこと以外は、実施例１と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表３に示す。
【００４８】
２）抗原蛋白質のラテックスへの担持
０．５ｍｌのポリスチレンラテックス（平均粒径０．３μｍ、１ｗ／ｖ％、カルボキシル化修飾済み、積水化学工業社製）に、カルボジイミドを２重量％含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を０．５ｍｌ加えた後、２５℃で３時間攪拌し、次いで、１５０００ｒｐｍで１５分遠心分離した。得られた沈殿物を、ジチオスレイトール（ナカライテスク社製）を２０ｍｇ／ｍｌ含有する０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）１．１４ｍｌに懸濁した。この懸濁液に、４７ｋＤａ抗原蛋白質液（蛋白質濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）６０μｌを混合し、一晩、２５℃にて反応させた後、１５０００ｒｐｍで１５分遠心分離した。得られた沈殿物を、０．１Ｍ濃度でエタノールアミンを含有する０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに再懸濁し、２５℃で３０分間攪拌し、抗原蛋白質をラテックスに共有結合させた。次いで、この懸濁液を１５０００ｒｐｍで１５分遠心分離した。
【００４９】
３）抗原蛋白質担持ラテックスのブロッキング
上記２）の遠心分離によって得られた沈殿物（抗原蛋白質担持ラテックス）を、ＢＳＡを１％（ｗ／ｖ）含有する３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌに再懸濁し、室温で３０分間攪拌してブロッキングを行なった。
次いで、この懸濁液を１５０００ｒｐｍで１５分遠心分離した。得られた沈殿物に、ＢＳＡを１％（ｗ／ｖ）含有する３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を２ｍｌ添加し、再懸濁して抗原蛋白質担持ラテックス溶液を調製した。
【００５０】
（実施例１６）
実施例１５の２）において、４７ｋＤａ抗原蛋白質にかえて、実施例２で調製した１５ｋＤａ抗原蛋白質を用いたこと以外は実施例１５と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表３に示す。
【００５１】
（実施例１７）
実施例１５の２）において、４７ｋＤａ抗原蛋白質にかえて、４７ｋＤａ抗原蛋白質と１５ｋＤａ抗原蛋白質を体積比で１：１に混合したものを用いたこと以外は実施例１５と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表３に示す。
【００５２】
（実施例１８）
実施例１５の２）において、ジチオスレイトールの濃度を２０ｍｇ／ｍｌに変えて０．２ｍｇ／ｍｌとしたこと以外は実施例１５と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表３に示す。
【００５３】
（実施例１９）
実施例１５の２）において、ジチオスレイトールの濃度を２０ｍｇ／ｍｌに変えて２００ｍｇ／ｍｌとしたこと以外は実施例１５と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表３に示す。
【００５４】
（実施例２０）
実施例１５の２）において、ジチオスレイトールにかえて２−メルカプトエタノールを用いたこと以外は実施例１５と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表３に示す。
【００５５】
（比較例２）
実施例１５の２）において、ジチオスレイトールを含有する０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）にかえて、ジチオスレイトールを含有しない０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたこと以外は実施例１５と同様にして、抗トレポネーマ抗体量を測定した。結果を表３に示す。
【００５６】
【表３】

【００５７】
なお表３中の抗体量の単位Ｔ．Ｕ．は、市販の抗トレポネーマ抗体測定試薬「メディエースＴＰＬＡ」（積水化学工業社製）で標準血清を測定した時の抗体量の単位である。
【００５８】
表１、表２及び表３から明らかなように、実施例１〜２０の試薬では測定に必要な検量線感度が得られており、試薬としての反応性が高いが、比較例では低濃度の感度が低く、また高濃度においては検量線感度がほとんど得られていない。
【００５９】
【発明の効果】
本発明の抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法、抗トレポネーマ抗体測定試薬及び抗トレポネーマの抗体測定方法は上述のとおりであり、測定に必要な検量線感度が十分得られるので、高感度の抗トレポネーマ抗体測定試薬を得ることができ、かつ簡便に抗体量を測定することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing an anti-treponema antibody measuring reagent by an immune reaction, a measuring reagent, and a measuring method.
[0002]
[Prior art]
Syphilis is an infectious disease caused by syphilis treponema pallidum, and whether or not it is infected with syphilis is confirmed by the presence of anti-treponema antibodies in the blood.
In the field of clinical testing, anti-treponema antibodies in blood are measured by various methods.
[0003]
As a general method, an insoluble carrier carrying an antigenic protein peculiar to syphilis obtained from syphilis (Treponema pallidum nichols strain) is reacted with an anti-treponema antibody in the blood, and the insoluble produced by the antigen-antibody reaction. An immunoassay method for measuring the amount of the antibody by detecting the degree of aggregation of the carrier is used.
As such a measuring method, the hemagglutination reaction method (TPHA method), the latex agglutination reaction method, and the like are known.
The syphilis-derived antigenic protein used in these methods is obtained by extraction and purification from syphilis (Japanese Patent Laid-Open No. 2-234063). However, the syphilis-derived antigen obtained by such a method has the following problems.
(1) Since syphilis cannot be cultured in vitro, it takes a lot of labor and time to obtain a large amount of cells.
(2) The process of extraction / purification from the cells is complicated.
(3) The lot-to-lot difference (variation) is also large for the purified antigen obtained as described above.
In addition, diagnostic reagents obtained using these antigens sometimes have serious drawbacks such as insufficient sensitivity of the calibration curve.
[0004]
Therefore, various studies have been made to solve the above problems.
In order to solve (1) and (2), a method of producing an antigen protein peculiar to syphilis using a gene recombination technique and using it as a diagnostic reagent has been carried out. It is known that surface antigen proteins of syphilis treponema have various molecular weights, and 47 kDa (hereinafter referred to as 47 kDa antigen), 17 kDa (hereinafter referred to as 17 kDa antigen), 15 kDa (hereinafter referred to as “primary antigen antigen reaction”). 15 kDa antigen) is known. Since the genes encoding these surface antigens have already been cloned and their amino acid sequences have been determined, it is possible to produce antigenic proteins by genetic engineering.
[0005]
Examples of methods for producing diagnostic reagents using these antigenic proteins are disclosed in JP-A-59-502131 and JP-A-2-500403. There is no. Possible causes include a lack of sensitivity necessary for measurement and a mismatch in specificity with the current TPHA method.
In JP-A-7-287017, a genetic protein is used to produce a complex protein of glutathione-S-transferase and each antigen protein of 15 kDa and 17 kDa and use it as a diagnostic reagent. However, this method is not a pure syphilis antigen because the antigen protein is bound to glutathione-S-transferase. In addition, glutathione-S-transferase is present in the reaction system, which may adversely affect the sample.
[0006]
Furthermore, in order to solve the lack of sensitivity (3), JP-A-8-176195 describes a method in which a mixed solution of a reduced albumin solution and a syphilis-derived antigen protein is supported on an insoluble carrier.
However, this method is complicated, including a step of reducing albumin, a step of protecting the SH group after the reduction, and a step of oxidizing the substance used for the reduction. Furthermore, in the step of supporting the syphilis-derived antigen protein on an insoluble carrier, there is a problem that it is necessary to dilute the syphilis-derived antigen protein solution with a reduced albumin solution.
Moreover, the diagnostic reagent was prepared by carrying the syphilis antigen protein obtained by genetic engineering on an insoluble carrier by various general methods, but the sensitivity required for the measurement was not obtained.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention solves the above-mentioned problems, and its purpose is to have a performance equivalent to or better than that of a diagnostic reagent using a syphilis-derived antigenic protein, and capable of quantifying the amount of antibody with high sensitivity. It is to provide a production method, a reagent, and a measurement method of an anti-treponema antibody measurement reagent.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The method for producing an anti-treponema antibody measuring reagent according to claim 1 of the present invention is a method for producing an immunological anti-treponema antibody measuring reagent in which an syphilis treponema antigen protein obtained by a genetic engineering technique is supported on an insoluble carrier. Because
A method for producing an anti-treponema antibody measurement reagent comprising a step of mixing the syphilis treponema antigen protein and a substance capable of cleaving a disulfide bond.
The method for producing an anti-treponema antibody measuring reagent according to claim 1, wherein the mixing step is prior to the step of supporting the syphilis treponema antigen protein on an insoluble carrier. It is.
The method according to claim 3, further comprising a step of coating the insoluble carrier with albumin after the step of supporting the syphilis treponema antigen protein on the insoluble carrier. This is a method for producing an antibody measurement reagent.
[0009]
And the manufacturing method of Claim 4 is a manufacturing method of the immunological anti- treponema antibody measuring reagent by which the syphilis treponema antigen protein obtained by the genetic engineering method is carry | supported by the insoluble support | carrier,
Carrying an syphilis treponema antigen protein on an insoluble carrier;
Mixing albumin with a substance capable of cleaving disulfide bonds;
And coating the insoluble carrier with a mixture of the albumin and a substance capable of cleaving disulfide bonds.
Furthermore, the anti-treponema antibody measurement reagent according to claim 5 is an anti-treponema antibody measurement reagent produced by the method according to any one of claims 1 to 4.
The method for measuring an anti-treponema antibody according to claim 6 uses the anti-treponema antibody measurement reagent according to claim 5 to measure the amount of the anti-treponema antibody in the sample. Is the method.
[0010]
The syphilis treponema antigen protein obtained by the genetic engineering technique is not particularly limited as long as it is cloned from a syphilis cell gene.
A method for obtaining the antigen protein will be described using the 47 kDa antigen as an example. Since the gene for syphilis treponema antigen is already known, DNA for the 47 kDa antigen is amplified and purified by PCR, and this is incorporated into an appropriate expression vector. A method of introducing this vector into Escherichia coli and producing it in large quantities can be mentioned.
Examples of a method for efficiently purifying a 47 kDa antigen from E. coli include a method using a vector containing a glutathione-S-transferase (hereinafter referred to as GST) gene in a vector, as described in JP-B-6-81596. .
In this method, a syphilis treponema antigen gene is inserted after the GST gene, and E. coli is produced as a fusion protein of GST and a 47 kDa antigen. After sufficient production, the fusion protein can be isolated by destroying the cells and contacting the lysate with immobilized glutathione. This fusion protein is then cleaved to yield the 47 kDa antigen.
[0011]
The syphilis treponema antigen used in the present invention is known to have antigens of 44 kDa, 42 kDa, 35 kDa, 34 kDa, etc. in addition to the aforementioned 47 kDa, 17 kDa, and 15 kDa, and one or more of these antigens Used. Of these, 47 kDa, 17 kDa, and 15 kDa are considered to be main antigens, and it is preferable to use them.
[0012]
Examples of the substance capable of cleaving the disulfide bond include glutathione, dithiothreitol, dithioerythritol, 2-mercaptoethanol, β-mercaptoethylamine, bipyridine disulfide derivatives, maleimide derivatives, thiophthalimide derivatives, and active halogen derivatives. Although a reducing agent is mentioned, it will not specifically limit if a disulfide bond can be cleaved. Further, in order to protect the disulfide bond thus cleaved, it may be protected with an alkylating agent or the like.
[0013]
The production method according to claim 1 includes a step of mixing the syphilis treponema antigen protein and a substance capable of cleaving a disulfide bond.
At this time, if the concentration of the substance capable of cleaving the disulfide bond is reduced, the disulfide bond is not cleaved sufficiently, resulting in insufficient calibration curve sensitivity, and if it is increased, the disulfide bond is cleaved, but the antigen protein Therefore, the sensitivity is preferably lowered, so that the sensitivity is preferably 5 to 2000 mM, more preferably 50 to 1000 mM.
Moreover, the temperature at the time of mixing becomes like this. Preferably it is 2-50 degreeC, More preferably, it is 4-40 degreeC. When the temperature during mixing is 1 ° C. or lower, the reaction system freezes and the reaction does not proceed. Moreover, when it becomes 50 degreeC or more, an antigen protein will heat-denature and it will not function as an antigen.
[0014]
In the production method according to claim 1, the step of mixing the syphilis treponema antigen protein and the substance capable of cleaving the disulfide bond may be at any point in any form, for example, Mix the antigen protein solution with a solution of a substance capable of cleaving disulfide bonds, or add a substance capable of cleaving disulfide bonds to an insoluble carrier solution, add the antigen protein to this and mix. Also good.
In the former case, the antigen protein is supported on the insoluble carrier by mixing the mixed solution and the insoluble carrier. In the latter case, the antigen protein is added to and mixed with the insoluble carrier.
[0015]
In the production method according to claim 2, the step of mixing the syphilis treponema antigen protein and a substance capable of cleaving a disulfide bond is performed before the step of supporting the antigen protein on an insoluble carrier.
The concentration and temperature of the substance capable of cleaving the disulfide bond at that time are the same as in the production method according to claim 1.
[0016]
As the insoluble carrier, a carrier of fine particles generally used in immunological aggregation reactions and anti-aggregation reactions can be used, but synthetic polymer fine particles that can be industrially mass-produced are homogeneous. Latex suspended in water is preferred.
Examples of the synthetic polymer include polystyrene, styrene-sulfonic acid copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, vinyl chloride-acrylate copolymer, vinyl acetate-acrylic. Examples include acid ester copolymers, and polystyrene and styrene-sulfonic acid copolymers are particularly preferable because they have excellent antigen protein adsorbability and can maintain biological activity stably for a long period of time.
In addition, plastic microtiter plates; biological particles such as animal red blood cells and bacterial cells; non-biological particles such as bentonite, collodion, cholesterol crystals, silica, kaolin, and carbon powder can also be used.
The average particle size of the insoluble carrier varies depending on the measurement method and the measuring equipment, but those of 0.1 to 1.0 μm, preferably 0.1 to 0.5 μm are usually used.
[0017]
In the production method according to claim 2, after the mixing step, the antigen protein is supported on an insoluble carrier.
As a method for supporting the antigen protein on the insoluble carrier, there are a physical adsorption method and a chemical binding method. As a method of physically adsorbing, for example, it can be supported by mixing an antigen protein and an insoluble carrier under a certain condition.
[0018]
Further, after the supporting step, the insoluble carrier may be coated with an inert substance such as albumin, casein, or surfactant.
Preferably, as described in claim 3, the coating with the inert substance is performed by albumin.
Albumin is a protein having a molecular weight of about 65,000 that is present in the blood of animals. Examples of animal species include cattle, horses, rabbits, goats, and humans, but are not particularly limited.
In the coating step, when the concentration of albumin becomes small, the surface of the insoluble carrier is not sufficiently coated and non-specific aggregation occurs. Conversely, when the concentration increases, the calibration curve sensitivity decreases. Preferably, 0.1 to 5 weight% is more preferable.
[0019]
As a method for coating an insoluble carrier with an inert substance, for example, the antigen protein can be supported on an insoluble carrier and then mixed with an inert substance under certain conditions.
[0020]
Examples of the solvent in the step of supporting the antigen protein on an insoluble carrier and the step of coating with an inactive substance include phosphate buffer, Tris-HCl buffer, glycine buffer, and the like.
The pH during the reaction is preferably 4 to 10 because if the acidity or alkalinity is too strong, problems such as denaturation of the antigen protein occur. If the temperature at the time of the reaction is lowered, the reaction is not sufficiently performed, or the reaction system is frozen, and it becomes difficult to obtain a product having the necessary sensitivity. If the temperature is raised, problems such as denaturation of the antigen protein occur. ° C is preferred, and 4 to 40 ° C is more preferred.
[0021]
The production method according to claim 4 is a method for producing an immunological anti-treponema antibody measurement reagent in which a syphilis treponema antigen protein obtained by a genetic engineering technique is supported on an insoluble carrier,
Carrying an syphilis treponema antigen protein on an insoluble carrier;
Mixing albumin with a substance capable of cleaving disulfide bonds;
And coating the insoluble carrier with a mixture of the albumin and a substance capable of cleaving disulfide bonds.
[0022]
In the step of mixing albumin and a substance capable of cleaving a disulfide bond, if the concentration of the substance capable of cleaving a disulfide bond becomes small, sufficient calibration curve sensitivity cannot be obtained. 5 to 2000 mM is preferable, and 20 to 1000 mM is more preferable.
[0023]
Furthermore, the anti-treponema antibody measurement reagent according to claim 5 is obtained by the method for producing an anti-treponema antibody measurement reagent according to claims 1 to 4.
The method for measuring an anti-treponema antibody according to claim 6 is performed using the measuring reagent according to claim 5.
Specifically, the amount of anti-treponema antibody in the specimen is measured by optically measuring the degree of aggregation caused by the immune reaction between the reagent obtained as described above and the anti-treponema antibody in the specimen.
[0024]
The reaction solution in the reaction system for performing the above immune reaction is not particularly limited as long as it is an aqueous solution that satisfies physiological conditions that can cause an immune reaction. For example, a phosphate buffer solution, a citrate buffer solution, a glycine buffer solution, Examples include Tris buffer and Good buffer.
The pH of the reaction solution is preferably 4 to 10, more preferably 6 to 8.
If necessary, the reaction solution may further contain a stabilizer such as bovine serum albumin or sucrose, a preservative such as sodium azide, a salt concentration adjusting agent such as sodium chloride, and the like.
Although reaction temperature will not be specifically limited if the said immune reaction can occur, It is preferable to carry out within the range of 10-50 degreeC by constant temperature, and 30-40 degreeC is more preferable. The reaction time is appropriately determined.
[0025]
As a method for optically measuring the degree of aggregation, a known method is used. For example, a turbidimetric method in which the formation of aggregates is regarded as an increase in turbidity, and the formation of aggregates as a change in particle size distribution or average particle size. For example, an integrating sphere turbidity method in which a change in forward scattered light due to the formation of aggregates is measured using an integrating sphere, and the ratio to the transmitted light intensity is compared.
In the measurement method described above, a rate test (rate assay) that obtains at least two measurements at different time points and determines the degree of aggregation based on the increase in measurement value between these time points (ie, rate of increase), and a certain time point ( An endpoint test (endpoint assay) that obtains a single measured value at the point of time (usually considered to be the end point of the reaction) and calculates the degree of aggregation based on this measured value can be used. It is preferable to perform a speed test by the turbidity method.
In the optical measurement method, an optical instrument that can detect scattered light intensity, transmitted light intensity, absorbance, and the like, particularly a general-purpose automatic analyzer, can be used. The measurement wavelength can be 250 to 1000 nm.
[0026]
【Example】
The present invention will be described with reference to examples.
(Example 1)
1) Preparation of 47 kDa antigen protein
Syphilis treponema cells were extracted from syphilitic treponema passage rabbit testicles, and genomic DNA was extracted. Since the DNA sequence of the 47 kDa antigen is already known (Science, Vol. 281, 375-388 (1998)), a primer was prepared using a DNA synthesizer based on this. Using this primer, a 47 kDa antigen DNA fragment was obtained by PCR using the previously extracted syphilis treponema genomic DNA as a template.
This DNA fragment was inserted into a vector pGEX43 prepared for expressing a fusion protein with GST, and named pGEX43-47k. This was introduced into Escherichia coli, and isopropyl-β-(−)-thiogalactopyranoside was added to the culture solution to induce expression of the fusion protein.
Escherichia coli in which the fusion protein was sufficiently expressed was disrupted by sonication. Subsequently, glutathione sepharose 4B (manufactured by Pharmacia) was added to the supernatant from which cell membranes, nuclei and the like were removed by centrifugation, and allowed to stand overnight to adsorb the fusion protein to glutathione sepharose.
Glutathione sepharose adsorbed with the fusion protein was recovered by centrifugation and packed in a column. After washing several times, the glutathione solution was poured to release the fusion protein and eluted.
A thrombin solution was added to the 47 kDa antigen-GST fusion protein solution purified in this manner to cleave the bond between the 47 kDa antigen and GST. This solution was applied to a glutathione sepharose column to remove GST, and further applied to a heparin column to remove thrombin to purify the 47 kDa antigen.
[0027]
2) Loading antigen protein on latex
2 ml of 30 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 300 mM of dithiothreitol (Nacalai Tesque) and 0.1 ml of the 47 kDa antigen protein solution (protein concentration 1 mg / ml) obtained in 1) above were mixed. . Add 0.05 ml of polystyrene latex (average particle size 0.4 μm, 10 w / v%, manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) to 0.3 ml of this solution, and stir at 37 ° C. for 2 hours to support the antigen protein on the latex. It was.
3) Blocking antigen protein-carrying latex
Add 0.5 ml of 30 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% (w / v) bovine serum albumin (Sigma, hereinafter referred to as BSA), and stir at 37 ° C. for 1 hour for blocking. I did it.
This solution was centrifuged at 15000 rpm for 30 minutes. To the resulting precipitate, 2 ml of 30 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% (w / v) BSA was added and resuspended to prepare an antigen protein-supported latex solution.
[0028]
4) Preparation of sample diluent
In a 100 mM phosphate buffer (pH 7.4), BSA is 1% (w / v), and as an antigen-antibody reaction promoter, glycosylmethyl methacrylate (manufactured by Nippon Seika Co., Ltd., average molecular weight 1 million, hereinafter GEMA Was added to 1% (w / v) and dissolved to prepare a specimen diluted solution.
5) Anti-treponema antibody measurement reagent
The reagent for measuring anti-treponema antibody of the present example is a two-part solution composed of a first reagent comprising the antigen protein-supported latex solution prepared in 3) above and a second reagent comprising the sample diluent prepared in 4) above. It is a reagent of the system.
6) Measurement of anti-treponema antibody
As a specimen, syphilis positive standard serum (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) having a known anti-treponema antibody amount was used.
210 μl of the sample diluent (second reagent) was added to and mixed with 20 μl of the sample, and after a predetermined time, 30 μl of the latex solution (first reagent) was added and mixed. The amount of change in turbidity between 80 seconds and 300 seconds after mixing the latex solution was measured as the reaction amount. The measurement was performed using a biochemical automatic analyzer (Hitachi 7150 type automatic analyzer) at a measurement wavelength of 700 nm and a measurement temperature of 37 ° C. The results are shown in Table 1.
[0029]
(Example 2)
A 15 kDa antigen protein was prepared in the same manner as in Example 1) except that the DNA sequence of the 15 kDa antigen was used instead of the DNA sequence of the 47 kDa antigen.
The amount of anti-treponema antibody was measured in the same manner as in 2) to 6) of Example 1 except that the 15 kDa antigen protein was used instead of the 47 kDa antigen protein. The results are shown in Table 1.
[0030]
(Example 3)
In the same manner as in Example 1 except that a 47 kDa antigen protein and a 15 kDa antigen protein were mixed at a volume ratio of 1: 1 in place of the 47 kDa antigen protein in 2) of Example 1, the anti-treponema antibody The amount was measured. The results are shown in Table 1.
[0031]
Example 4
In Example 1 2), the amount of anti-treponema antibody was measured in the same manner as in Example 1 except that the concentration of dithiothreitol was changed to 300 mM to 6 mM. The results are shown in Table 1.
[0032]
(Example 5)
The amount of anti-treponema antibody was measured in the same manner as in Example 1 except that the concentration of dithiothreitol was changed from 300 mM to 2000 mM in 2) of Example 1. The results are shown in Table 1.
[0033]
(Example 6)
The amount of anti-treponema antibody was measured in the same manner as in Example 1 except that 2-mercaptoethanol was used in place of dithiothreitol in 2) of Example 1. The results are shown in Table 1.
[0034]
(Example 7)
A 17 kDa antigen protein was prepared in the same manner as in Example 1 except that the 17 kDa antigen DNA sequence was used instead of the 47 kDa antigen DNA sequence.
An anti-treponema antibody was prepared in the same manner as in Example 1 except that the 47 kDa antigen protein was mixed with a 15 kDa antigen protein and a 17 kDa antigen protein in a volume ratio of 1: 1 in Example 2). The amount was measured. The results are shown in Table 1.
[0035]
(Comparative Example 1)
The amount of anti-treponema antibody was measured in the same manner as in Example 1 except that a 30 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing no dithiothreitol was used in 2) of Example 1. The results are shown in Table 1.
[0036]
[Table 1]

[0037]
In Table 1, the unit of antibody amount T.P. U. Is a unit of the amount of antibody when standard serum is measured with a commercially available anti-treponema antibody measuring reagent “Mediace TPLA” (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.).
[0038]
(Example 8)
1) Preparation of 47 kDa antigen protein
A 47 kDa antigen protein was prepared in the same manner as in Example 1, 1).
2) Loading antigen protein on latex
2 ml of 30 mM phosphate buffer (pH 7.4) was mixed with 0.1 ml of the 47 kDa antigen protein solution (protein concentration 1 mg / ml) obtained in 1) above. Add 0.05 ml of polystyrene latex (average particle size 0.4 μm, 10 w / v%, manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) to 0.3 ml of this solution, and stir at 37 ° C. for 2 hours to support the antigen protein on the latex. It was.
3) Blocking antigen protein-carrying latex
Dithiothreitol (manufactured by Nacalai Tesque) was added to and mixed with 30 mM phosphate buffer (pH 7.4) so that 300 mM and BSA would be 1% (w / v). 0.5 ml of this solution was added to the antigen protein-laden latex and the mixture was stirred at 37 ° C. for 1 hour for blocking.
This solution was centrifuged at 15000 rpm for 30 minutes. 2 ml of 30 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% (w / v) BSA was added to the resulting precipitate and resuspended to prepare an antigen protein-supported latex solution.
4) Preparation of sample diluent
A specimen diluent was prepared in the same manner as in Example 1, 4).
5) Anti-treponema antibody measurement reagent
The reagent for measuring anti-treponema antibody of the present example is a two-part solution composed of a first reagent comprising the antigen protein-supported latex solution prepared in 3) above and a second reagent comprising the sample diluent prepared in 4) above. It is a reagent of the system.
6) Measurement of anti-treponema antibody
The anti-treponema antibody amount was measured in the same manner as in Example 1 6). The results are shown in Table 2.
[0039]
Example 9
A 15 kDa antigen protein was prepared in the same manner as in Example 1) except that the DNA sequence of the 15 kDa antigen was used instead of the DNA sequence of the 47 kDa antigen.
The amount of anti-treponema antibody was measured in the same manner as in 2) to 6) of Example 8 except that the 15 kDa antigen protein was used instead of the 47 kDa antigen protein. The results are shown in Table 2.
[0040]
(Example 10)
An anti-treponema antibody was prepared in the same manner as in Example 8 except that a 47 kDa antigen protein and a 15 kDa antigen protein were mixed at a volume ratio of 1: 1 in place of the 47 kDa antigen protein in Example 8 2). The amount was measured. The results are shown in Table 2.
[0041]
(Example 11)
In Example 8 3), the amount of anti-treponema antibody was measured in the same manner as in Example 8, except that the concentration of dithiothreitol was changed to 300 mM and changed to 6 mM. The results are shown in Table 2.
[0042]
(Example 12)
In Example 8 3), the amount of anti-treponema antibody was measured in the same manner as in Example 8 except that the concentration of dithiothreitol was changed to 300 mM and changed to 2000 mM. The results are shown in Table 2.
[0043]
(Example 13)
The amount of anti-treponema antibody was measured in the same manner as in Example 8 except that 2-mercaptoethanol was used instead of dithiothreitol in 3) of Example 8. The results are shown in Table 2.
[0044]
(Example 14)
A 17 kDa antigen protein was prepared in the same manner as in Example 1 except that the 17 kDa antigen DNA sequence was used instead of the 47 kDa antigen DNA sequence.
An anti-treponema antibody was prepared in the same manner as in Example 8 except that a 47 kDa antigen protein was mixed with a 15 kDa antigen protein and a 17 kDa antigen protein in a volume ratio of 1: 1 instead of the 47 kDa antigen protein. The amount was measured. The results are shown in Table 1.
[0045]
[Table 2]

[0046]
In Table 2, the unit of antibody amount T.P. U. Is a unit of antibody amount when standard serum is measured with a commercially available anti-treponema antibody measuring reagent “Mediace TPLA” (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.).
[0047]
(Example 15)
Except that the 47 kDa antigen protein prepared in 1) of Example 1 was used, and the steps 2) and 3) of Example 1 were changed as in 2) and 3) below, the same as in Example 1 The amount of anti-treponema antibody was measured. The results are shown in Table 3.
[0048]
2) Loading antigen protein on latex
0.02M phosphate buffer (pH 5.5) containing 2% by weight of carbodiimide in 0.5 ml of polystyrene latex (average particle size: 0.3 μm, 1 w / v%, carboxylated, manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) ) Was added, stirred at 25 ° C. for 3 hours, and then centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes. The obtained precipitate was suspended in 1.14 ml of 0.2 M borate buffer (pH 8.5) containing 20 mg / ml of dithiothreitol (manufactured by Nacalai Tesque). This suspension was mixed with 60 μl of a 47 kDa antigen protein solution (protein concentration 0.5 mg / ml), reacted at 25 ° C. overnight, and then centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes. The resulting precipitate is resuspended in 1 ml of 0.2 M borate buffer (pH 8.5) containing ethanolamine at a concentration of 0.1 M and stirred at 25 ° C. for 30 minutes to covalently bind the antigenic protein to the latex. I let you. The suspension was then centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes.
[0049]
3) Blocking antigen protein-carrying latex
The precipitate (antigen protein-carrying latex) obtained by the centrifugation in the above 2) is resuspended in 1 ml of 30 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% (w / v) of BSA, and 30 ml at room temperature. Blocking was performed by stirring for a minute.
The suspension was then centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes. To the resulting precipitate, 2 ml of 30 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% (w / v) BSA was added and resuspended to prepare an antigen protein-supported latex solution.
[0050]
(Example 16)
In Example 15 2), the amount of anti-treponema antibody was measured in the same manner as in Example 15 except that the 15 kDa antigen protein prepared in Example 2 was used instead of the 47 kDa antigen protein. The results are shown in Table 3.
[0051]
(Example 17)
An anti-treponema antibody was prepared in the same manner as in Example 15 except that a 47 kDa antigen protein and a 15 kDa antigen protein were mixed at a volume ratio of 1: 1 in place of the 47 kDa antigen protein in Example 15 2). The amount was measured. The results are shown in Table 3.
[0052]
(Example 18)
In Example 15 2), the amount of anti-treponema antibody was measured in the same manner as in Example 15 except that the dithiothreitol concentration was changed to 20 mg / ml to 0.2 mg / ml. The results are shown in Table 3.
[0053]
(Example 19)
In Example 15 2), the amount of anti-treponema antibody was measured in the same manner as in Example 15 except that the concentration of dithiothreitol was changed to 20 mg / ml to 200 mg / ml. The results are shown in Table 3.
[0054]
(Example 20)
The amount of anti-treponema antibody was measured in the same manner as in Example 15 except that 2-mercaptoethanol was used in place of dithiothreitol in 2) of Example 15. The results are shown in Table 3.
[0055]
(Comparative Example 2)
In Example 15 2), 0.2 M borate buffer (pH 8.5) not containing dithiothreitol was used instead of 0.2 M borate buffer (pH 8.5) containing dithiothreitol. The amount of anti-treponema antibody was measured in the same manner as in Example 15 except that. The results are shown in Table 3.
[0056]
[Table 3]

[0057]
In Table 3, the antibody amount unit T.P. U. Is a unit of antibody amount when standard serum is measured with a commercially available anti-treponema antibody measuring reagent “Mediace TPLA” (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.).
[0058]
As is clear from Tables 1, 2 and 3, the reagents of Examples 1 to 20 have the calibration curve sensitivity necessary for the measurement, and the reactivity as the reagent is high, but the comparative example has a low concentration. The sensitivity is low, and calibration curve sensitivity is hardly obtained at high concentrations.
[0059]
【The invention's effect】
The method for producing the anti-treponema antibody measuring reagent of the present invention, the anti-treponema antibody measuring reagent and the antibody measuring method of anti-treponema are as described above, and sufficient calibration curve sensitivity necessary for the measurement can be obtained. A measuring reagent can be obtained, and the amount of antibody can be measured easily.

Claims (6)

不溶性担体に遺伝子工学的な手法により得られた、４７ｋＤａ、１７ｋＤａ又は１５ｋＤａの梅毒トレポネーマ抗原蛋白質が担持されてなる免疫学的抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法であって、
上記梅毒トレポネーマ抗原蛋白質とジスルフィド結合を開裂することのできる物質とを溶液状態で混合した後、上記不溶性担体に梅毒トレポネーマ抗原蛋白質を担持させる工程を含むことを特徴とする抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法。A method for producing an immunological anti-treponema antibody measurement reagent obtained by genetic engineering techniques on an insoluble carrier, wherein a 47 kDa, 17 kDa, or 15 kDa syphilis treponema antigen protein is supported,
Production of an anti-treponema antibody measurement reagent comprising a step of mixing the syphilis treponema antigen protein and a substance capable of cleaving a disulfide bond in a solution state, and then supporting the syphilis treponema antigen protein on the insoluble carrier. Method. 上記梅毒トレポネーマ抗原蛋白質とジスルフィド結合を開裂することのできる物質とを混合した混合液を調製した後、上記梅毒トレポネーマ抗原蛋白質とジスルフィド結合を開裂することのできる物質との混合液に上記不溶性担体を含む液を加えて、不溶性担体に梅毒トレポネーマ抗原蛋白質を担持させることを特徴とする請求項１記載の抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法。  After preparing a mixture of the syphilis treponema antigen protein and a substance capable of cleaving a disulfide bond, the insoluble carrier is added to the mixture of the syphilis treponema antigen protein and a substance capable of cleaving a disulfide bond. The method for producing an anti-treponema antibody measuring reagent according to claim 1, wherein a solution containing the syphilis treponema antigen protein is supported on an insoluble carrier by adding a liquid. 不溶性担体に遺伝子工学的な手法により得られた、４７ｋＤａ、１７ｋＤａ又は１５ｋＤａの梅毒トレポネーマ抗原蛋白質が担持されてなる免疫学的抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法であって、
上記不溶性担体を含む液とジスルフィド結合を開裂することのできる物質とを混合した混合液を調製した後、上記不溶性担体を含む液とジスルフィド結合を開裂することのできる物質との混合液に上記梅毒トレポネーマ抗原蛋白質を加えて、不溶性担体に梅毒トレポネーマ抗原蛋白質を担持させることを特徴とする抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法。 A method for producing an immunological anti-treponema antibody measurement reagent obtained by genetic engineering techniques on an insoluble carrier, wherein a 47 kDa, 17 kDa, or 15 kDa syphilis treponema antigen protein is supported,
After preparing a mixed solution in which the liquid containing the insoluble carrier and the substance capable of cleaving disulfide bonds are prepared, the syphilis is added to the liquid mixture containing the liquid containing the insoluble carrier and the substance capable of cleaving disulfide bonds. added treponemal antigen protein, a manufacturing method of an anti-treponemal antibody assay reagent you characterized by supporting the T. pallidum antigen protein on an insoluble carrier. さらに、不溶性担体に梅毒トレポネーマ抗原蛋白質を担持させる工程の後に、不溶性担体をアルブミンで被覆する工程を有することを特徴とする請求項１、２又は３記載の抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法。  The method for producing an anti-treponema antibody measurement reagent according to claim 1, 2 or 3, further comprising a step of coating the insoluble carrier with albumin after the step of supporting the syphilis treponema antigen protein on the insoluble carrier. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により製造された抗トレポネーマ抗体測定試薬。  The anti- treponema antibody measuring reagent manufactured by the method of any one of Claims 1-4. 請求項５に記載の抗トレポネーマ抗体測定試薬を用いて、検体中の抗トレポネーマ抗体量を測定することを特徴とする抗トレポネーマ抗体の測定方法。  A method for measuring an anti-treponema antibody, comprising measuring the amount of an anti-treponema antibody in a specimen using the anti-treponema antibody measurement reagent according to claim 5.