JP3758686B2 - Cペプチド特異的アッセイ法 - Google Patents
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Description
インスリンは、ランゲルハンス島のβ細胞において、前駆体であるプロインスリンから合成される。プロインスリンには、それからインスリン(分子量5800ダルトン)およびCペプチド(分子量3020ダルトン)を分離させるタンパク質分解酵素が作用する。加水分解には、2つの型のプロテアーゼ(一方はカルボキシペプチダーゼ型、他方はエンドペプチダーゼ型)が使用される。この過程には、split32,33プロインスリン、split65,66プロインスリン、des−31,32プロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンのような中間体化合物が関与し、これらはインスリンおよびCペプチドと並行して、インタクトなプロインスリンとともに少ない割合(2%〜6%)で存在する。
門脈インスリンおよびCペプチドの等モル比は、末梢レベルに反映されない。基底状態の静脈末梢血には、平均でインスリンより3〜6倍多いCペプチドが存在する。この現象を、これら2つのポリペプチドの間の代謝の差によって説明することができる。インスリンの約50%は肝臓の通過に際して不活化される。残りの量は、筋肉組織または脂肪組織に主に存在するその末梢受容体において不活化される。対照的に、Cペプチドは肝臓を実際上自由に通過し、それゆえインスリンよりずっと長い血漿半減期を有する(Cペプチドについては30分、インスリンについては5分未満)。Cペプチドは既知の生物学的作用を有しない。その役割は、膵臓のβ細胞におけるプロインスリン分子の折りたたみに限定されている。Cペプチドは、血管セクターにおいて単純な残余として出現し、その後腎臓によってインタクトなまま排除される。
従って、Cペプチドの血漿または尿アッセイは、インスリンアッセイよりもずっと信頼性のある、インスリン分泌の評価手段を構成する。Cペプチドアッセイは、外因性インスリンの患者への投与の間または、直接的な免疫学的インスリンアッセイを許容しない抗インスリン抗体の存在下においてさえも内因性インスリン生産の評価を可能にする。
CペプチドアッセイはI型糖尿病とII型糖尿病の差別的診断、β細胞の残余膵臓機能の評価、I型糖尿病における緩解期の検出およびモニター、インスリン注射によって引き起こされる人工的低血糖症の検出、インスリノーマの診断、ならびに肝臓疾患の間のインスリン分泌の評価に特に有用である。
Cペプチドアッセイは、糖尿病の女性の妊娠をモニターする場合の、胎児の糖尿病予後を確立するためにも使用される。さらに、Cペプチドは、全膵切除をモニターする場合に測定される。
Cペプチドアッセイ法は公知である。特許出願EP 227351は、競合的放射免疫アッセイにおいてCペプチドを測定するための抗Cペプチド抗血清の使用を記載している。放射免疫試験において使用するための抗Cペプチドモノクローナル抗体は、Angeloら(Diabetes Research and Clinical Practice(1985)補遺1巻,18−19頁)にも記載されている。上記の場合のように、抗体は競合的イムノアッセイにおいて使用される。さらに、Madsenら(Endocrinology(1983)113,6号,2135−2144頁)は、ヒトプロインスリンに特異的なモノクローナル抗体の生産および特徴付けを記載している。出願EP 484961は、Cペプチド検出用の「サンドイッチ」型方法およびモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用して実施することができるアッセイを記載している。Cペプチドを例えばELISAを使用して評価することができる。
1993年3月17日に公開された特許CS 277597も、プロインスリンまたはCペプチドアッセイのためのモノクローナル抗体の使用を記載している。
ほぼ全ての抗Cペプチドモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、プロインスリンならびに、インスリンおよびCペプチドにに切断される前に生産される中間体形態と多かれ少なかれ交差反応することが知られている。Cペプチド単独から生産されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、プロインスリンならびに、インスリンおよびCペプチドへの切断前に生産される中間体形態中のCペプチドを認識することができる。なぜなら、遊離のCペプチドと、プロインスリンを形成するインスリンに結合したCペプチドとは非常に類似しているからである。
正常対象において、Cペプチド濃度はプロインスリン濃度より約50倍高い(絶食の5〜25pMに対して約0.5〜1.5nM)。しかし、NIDD(インスリン非依存性糖尿病)のいくつかの場合、新たに診断されたI型糖尿病患者およびその家族において、インスリノーマの間および家族性高プロインスリン血症において、プロインスリンの血漿濃度は増加し、2000pMを超え得る。このような状況において、血中に存在する主な形態は、インタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンである。他の中間体は、循環血液中に微量にのみ存在する(Reavenら、J.Clin.Endocrinol.Metabol.(1993),1,44−48頁)。
従って、全ての病態生理学的状況において信頼性のある結果を提供するためには、インタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンに起因する干渉を排除できる、Cペプチドを評価するための特異的方法を使用することが重要である。Dinesensら(「First assay specific for intact human proinsulin」1994年9月27日〜10月1日、
第30回年会で発表された報告)は、プロインスリン中のAC連結部(インスリンのA鎖とCペプチドとの間の連結部)およびBC連結部(インスリンのB鎖とCペプチドとの間の連結部)に特異的な2つの抗体を使用する−インスリンに起因する干渉のない−プロインスリンに特異的なアッセイを提唱した。しかし、この著者らは、プロインスリンに起因する干渉を排除できる特異的Cペプチドアッセイは提唱しなかった。
関連生物学的物質の存在に起因する干渉を排除するための特異的抗体(「スカベンジャー抗体」)の使用は、既に先行技術に記載されている。例えば、米国特許第4 722 889号は、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)および黄体形成ホルモン(LH)も認識できる2つの抗体を使用するヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)に特異的なサンドイッチ型アッセイ法を記載している。最後の3つのホルモンに起因する干渉を排除するために、TSH、FSHおよびLHのβユニットのエピトープを特異的に認識し、hCGのβユニットに対するより低い親和性を有する第3のスカベンジャー抗体を使用する。なお、干渉抗体が過剰である場合、固相の非特異的抗体は飽和され、従ってアッセイしようとする抗体は過少評価される。対照的に、特異的アッセイを得るために、アッセイしようとする物質および干渉すると考えられるこの物質の前駆体を認識する抗体を使用することが可能であることは、先行技術のどこにも記載されていない。そうすれば、競合型アッセイを含む全ての型のアッセイを意図することが可能である。
出願人らは、ここで、des−31,32プロインスリンおよび/またはdes−64,65プロインスリンに起因する全ての干渉を排除できる特異的Cペプチドアッセイ法を見出した。抗Cペプチド抗体のエピトープの近傍のエピトープを認識する、インタクトなプロインスリン、des−31,32プロインスリンおよび/またはdes−64,65プロインスリンに特異的な抗体の使用によって、生物学的媒質において高い特異性で、高度に正確なCペプチドアッセイを実施することが可能である。
本発明は、Cペプチドを含有し得る試料を、1つ以上の抗Cペプチド抗体ならびに
− インタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンに特異的であり、抗Cペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Cペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体、または
− インタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンに特異的であり、抗Cペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Cペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体、または
− インタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンに特異的なこの抗プロインスリン抗体とインタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンに特異的な該抗プロインスリン抗体との混合物
と接触させることを特徴とするCペプチドアッセイ法に関する。
本発明の特定の実施態様において、Cペプチドを含有し得る試料を:
・抗Cペプチド抗体ならびに
− インタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンに特異的であり、抗Cペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Cペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体、
− もしくは、インタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンに特異的であり、抗Cペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Cペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体と、
・または、第1の抗Cペプチド抗体ならびにインタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンに特異的であり、第1の抗Cペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Cペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体、
ならびに、第2の抗Cペプチド抗体ならびにインタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンに特異的であり、第2の抗Cペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、第2の抗Cペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体の混合物と;
のいずれかと接触させ、
この第1および第2の抗Cペプチド抗体は所望により同一である。
この第1および第2の抗Cペプチド抗体が同一である場合、Cペプチドを含有し得る試料を、抗Cペプチド抗体、インタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンに特異的な抗プロインスリン抗体、ならびにインタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンに特異的な抗プロインスリン抗体に接触させる。
本発明の好ましい実施態様において、インタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンに特異的な抗体が認識するエピトープはプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンのAC連結部に位置し:
配列
好ましくは配列
より好ましくは配列
から選択されるペプチド配列を含む。
本発明の抗プロインスリン抗体は、抗Cペプチド抗体と同じ濃度で存在する場合、好ましくは、抗Cペプチド抗体のプロインスリンへの結合の少なくとも50%を阻害する。
本発明の別の好ましい実施態様において、インタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンに特異的な抗体が認識するエピトープはプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンのBC連結部に位置し、ペプチド配列:
Arg Arg
を含む。
本発明の方法を実施するために使用する抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。好ましくは、少なくとも1つのモノクローナル抗体を使用する。
des−31,32プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な特定の抗体は、抗Cペプチド抗体のエピトープの近傍またはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Cペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンへの結合を干渉するモノクローナル抗体であり、このエピトープはプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンのAC連結部に位置し、この配列は:
Lys Arg、
好ましくは配列:
より特定すると配列:
から選択されるペプチド配列を含む。
抗体は、特に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(National Collection of Microorganism Cultures)at the Institut Pasteurに1997年6月4日に登録番号I−1873の下に寄託されたハイブリドーマから得られるモノクローナルAC1D4抗体であり得る。
本発明の方法には、des−64,65プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な抗体を使用し得、この抗体は抗Cペプチド抗体のエピトープの近傍またはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Cペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンへの結合を干渉し、このエピトープはプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンのBC連結部に位置し:
配列
配列
配列
配列
から選択されるペプチド配列を含む。
好ましくは、配列:
または
に対応するエピトープを認識するdes−64,65プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な抗体を使用する。
明らかに、インタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンに特異的な抗体を使用すれば、抗Cペプチド抗体のsplit32,33プロインスリンへの結合に起因する干渉を回避することが可能である。同様に、インタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンに特異的な抗体を使用すれば、抗Cペプチド抗体のsplit65,66プロインスリンへの結合に起因する干渉が回避される。
本発明の方法を、血漿、血清または尿のような生物学的試料中のCペプチドをアッセイするために使用することができる。
本発明による好ましいアッセイ法は、モノクローナルまたはポリクローナル抗Cペプチド抗体が固相に固定され得る「サンドイッチ」型アッセイである。好ましくは、抗Cペプチドは、モノクローナル抗体である。アッセイのために生物学的試料と接触させた後、トレーサー(例えば、酵素トレーサー)に結合させた第2の抗Cペプチド抗体を添加する。本発明によるCペプチドの特異的アッセイを可能にする抗体(特に、des31,32プロインスリンに特異的な抗体およびおそらくdes64,65プロインスリンに特異的な抗体)は、第2の抗Cペプチド抗体と同時か、またはその前のいずれかに使用することができる。アッセイを1段階または2段階で実施することができ、Cペプチドをいずれかの検出方法(酵素検出、または放射性、蛍光性もしくは化学蛍光性剤を使用する検出のような)を使用して評価することができる。
本発明の方法において使用できるアッセイのさらなる型は、「競合的」放射免疫アッセイである。この型のアッセイにおいて、モノクローナルまたはポリクローナル抗Cペプチド抗体(固相に結合させてもよい)を、アッセイしようとする生物学的試料と接触させる。次いで、des−31,32プロインスリンに特異的な抗体および/またはdes−64,65プロインスリンに特異的な抗体、ならびに検出可能なトレーサー(上記の薬剤のような)で標識したCペプチドを導入する。
抗Cペプチド抗体ならびにdes−31,32プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な抗体ならびに/またはdes−64,65プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な抗体を含有するキットも、本発明の一部を形成する。これらのキットは、特異的Cペプチドアッセイ法の実施を可能にする。本発明のキットは、サンドイッチまたは競合のいずれかの型の特異的Cペプチドアッセイに使用される。
AC1D4モノクローナル抗体の生産および特徴付け:
1.生産
AC1D4モノクローナル抗体をリンパ球ハイブリッド形成によって得た。
6週齢雌性Balb/Cマウスに総数4回のヒトプロインスリンの腹腔内注射を与えた。1日目に、マウスに、50μgのヒトプロインスリンを、完全フロイントアジュバントの存在下で腹腔内に免疫した。3週間後に、マウスに、50μgのヒトプロインスリンを、不完全フロイントアジュバントの存在下で再度免疫した。第3の免疫を、以前と同じ条件下で、リン酸緩衝生理食塩水溶液(PBS)(pH7.4)中のヒトプロインスリンの溶液を使用して、3週間後に実施した。血液試料を、第2および第3の注射の後に、各注射の12日後にマウスから採取した。血清を、ELISA、RIAおよびSPOT(Franck R.Tetrahedron,(1992),48,9217−9232頁)を使用して、ヒト抗プロインスリン抗体の存在について試験した。
高い血清抗プロインスリン抗体レベルを有するマウスをリンパ球融合のために選択した。選択したマウスに、第3の注射の1ヶ月後に最後のプロインスリンの注射を与えた。20μgの用量を2つのアリコートで注射した。3日後、マウスを断頭し、脾臓を取り出した。脾臓をすりつぶした後、リンパ球を、P3−X63−Ag8.653株由来のミエローママウス細胞と、ポリエチレングリコールの存在下で融合させた。使用したリンパ球ハイブリッド形成技術は、StemCell Technologies IncのClonaCellTM技術であった(フランスにおいては、TEBU,Le Perray Yvelinesによって配給される)。抗体分泌ハイブリドーマの選択を、ELISA(固定化ヒトプロインスリンを使用)およびRIA(ヨウ素化ヒトプロインスリンを使用)を使用する平行して実施した一連の試験によって行った。分泌ハイブリドーマをその抗ACまたはBC連結部活性についてSPOT分析した。
ELISA法については、NUNCマイクロプレートを、PBS中のヒトプロインスリンの溶液(C=0.1μg/ml)100μlを使用して、ヒトプロインスリンでコートした。プレートを一晩+4℃でインキュベートした。0.1%Tween 20を添加したリン酸緩衝化生理食塩水溶液(PBS−Tween)で3回洗浄した後、200μlの培養上清または100μlの精製抗体をマイクロプレートに漸減濃度で沈殿させ、3時間室温でインキュベートした。次いで、マイクロプレートをPBS−Tweenで3回洗浄し、第2の抗体を添加した。マウスIgG(γ特異性)に対するこの抗体をペルオキシダーゼに結合させ、PBS−Tween中に希釈しておいた(希釈1/3000)。マイクロプレートを1時間37℃でインキュベートし、次いでPBS−Twで3回洗浄した。0.03%の過酸化水素を含有するクエン酸緩衝溶液(pH=5)中の溶液(C=30mg/ml)中のオルトフェニルジアミンを基質として使用して、反応を明らかにした。吸光度をλ=450nmで、室温での遮光した20分間のインキュベーションの後に測定した。酵素反応を50μlの4N硫酸を用いて停止し、測定をλ=490nmで実施した。
RIA法については、100μlの培養上清または100μlの精製抗体を、ヒツジ抗マウスIgG抗体でコートしたチューブ中に漸減濃度で沈殿させた。室温で3時間インキュベートした後、チューブを2mlのPBSで3回洗浄し、その後、1%のBSAを含有するPBSの溶液中のヨウ素化プロインスリン100μl(3000cpm)を添加した。チューブを一晩室温でインキュベートし、次いでPBS(2ml/チューブ)で3回洗浄し、次いでガンマカウンターに読み取りのために導入した。
ハイブリドーマの1つがAC1D4であった。このハイブリドーマを限界希釈によってクローン化した(Lefkovits IおよびWaldman S.1979,Cambridge University Press,Cambridge)。この技術において、5細胞/mlを含有する溶液が得られるまで細胞懸濁液を10倍希釈した。この溶液を細胞培養マイクロプレートに1ウェル当り100μlの割合で分注した。倒立顕微鏡検査によって、細胞発達をモニターし、単一クローンを含むウェルを保持した。
2.特徴付け
2.1.抗原特異性
アイソタイプIgG1 AC1D4抗体は以下を認識する:
− ELISAフォーマット(固定化プロインスリン)において、ヒトプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリン;ならびに
− RIAフォーマット(溶液中のヨウ素化プロインスリン)においてヒトプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリン。
これらの研究の結果を図1および2に示す。
図1は、AC1D4抗体のELISA用プロインスリンへの結合を示す。
図2は、AC1D4抗体のRIA用標識プロインスリンへの結合を示す。
2.2.交差反応
インスリンおよびヒトCペプチドによる、AC1D4抗体のヨウ素化ヒトプロインスリンへの結合の競合試験を、RIAを使用して実施した。実験条件は、プロインスリンのインキュベーション工程以外、上記のRIA法の条件と同一であった(生産以下を参照のこと)。ここで、AC1D4抗体をチューブ中でインキュベートした後(続いて洗浄する)、インスリンまたはCペプチド(10μg/ml)をヨウ素化プロインスリンと同時にインキュベートした。
結果は、ヒトインスリンおよびCペプチドがAC1D4のヨウ素化プロインスリンへの結合を阻害しないことを示す。
2.3.エピトープ配列のアッセイ
エピトープ配列をSPOTTMを使用して決定した。8アミノ酸が重複する9アミノ酸からなるペプチドをニトロセルロース膜上に合成した。合成したペプチドはヒトプロインスリン分子の全体をカバーした(すなわち、総数78個のペプチド)。この膜を試験中のモノクローナル抗体によって認識される配列を分析するための抗原性支持体とした。
以下のプロトコルをペプチド合成後の免疫学的反応のために使用した:
膜を、10%のCRB(GENOSYSのCambridge Research Bichemicals、ref:SU−07−250)、0.5%のTweenおよび5%のサッカロースをTBS(Tris緩衝生理食塩水)中に含有する飽和緩衝液中で飽和させた。一晩室温で攪拌した後、膜をTBS−Tween中で洗浄し、飽和緩衝液中で希釈したAC1D4抗体(C=1μg/ml)を添加した。次いで、得られたものを攪拌しながら1.5時間37℃でインキュベートした。TBS−Tweenで洗浄した後、アルカリホスファターゼに結合させた抗マウスIgG抗体を添加することによって、研究しようとする抗体の存在を、1時間室温で攪拌しながらインキュベートした後、明らかにした。形成された複合体を、塩化マグネシウムおよびThiazolylブルーをクエン酸緩衝生理食塩水(CBS)溶液中に含有するBCIP基質(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェートトルイジニウム塩)を添加することによって可視化した。
AC1D4抗体によって認識されるペプチドは以下の配列を有するペプチドであった:
この配列はインスリンA鎖とCペプチドとの連結部に位置している。
2.4.反応速度パラメーター
パラメーターをBIAcoreTMシステムを使用して決定した。このシステムは抗体とその抗原との間の結合をリアルタイムで測定する。測定値の単位はRUであり、この方法によって会合速度定数(Kon)、解離速度定数(Koff)および最後に測定しようとするヒトインスリンへの抗体の結合についての定数(KA)が得られる。この研究の結果を表Iに示す。
2.5.AC1D4抗体の存在下および非存在下での抗Cペプチドモノクローナル抗体のヒトプロインスリンへの結合
PEP001抗Cペプチドモノクローナル抗体およびAC1D4抗体を、BIAcoreTMシステムを使用して、デキストランに結合させたプロインスリンに同時に固定する能力について試験した。DAKOのPEP001モノクローナル抗体は、以下の配列に対応するCペプチドエピトープを認識する:
このエピトープは、ヒトプロインスリン上でAC1D4抗体によって認識されるエピトープに隣接していた。
この試験に、漸増量のAC1D4抗体を使用した。この研究の結果を図3に示す。
− 曲線1は、AC1D4抗体の非存在下でのPEP001抗体のプロインスリンへの結合を表す。
− 曲線2は、PEP001抗体と同じ濃度のAC1D4抗体の存在下でのPEP001抗体のプロインスリンへの結合を表す。この場合、AC1D4抗体によるPEP001抗体の結合の50%阻害が観察された。
− 曲線3は、PEP001抗体の濃度より10倍高い濃度のAC1D4抗体の存在下でのPEP001抗体のプロインスリンへの結合を表す。この場合、AC1D4抗体によるPEP001抗体の結合の70%阻害が観察された。
下記の実施例によって本発明を例示するが、これらは本発明を限定するものではない。
実施例1:
血清における特異的Cペプチドアッセイ法 「サンドイッチ」型酵素免疫アッセイ 至適条件の評価
自動AccessTM型機器をこの試験を実施するために使用した。20μlの血清を使用して試験を実施した。2つのプロインスリン特異的抗体を使用した:
・プロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンを特異的に認識するAC1D4抗体、ならびに
・プロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンを特異的に認識するBC9B6抗体。
この後者の抗体は以下のペプチド配列に対応するBC連結部のエピトープを認識する:
漸増濃度のこれらの抗体を単独でまたは混合物として使用して、インタクトなプロインスリン、des−31,32プロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンに起因する干渉を排除するために必要なAC1D4およびBC9B6抗体の濃度を決定した。
使用した固相は、抗Cペプチドモノクローナル抗体PEP001が共有結合によって結合された鉄ラテックスビーズ
であった。
以下を順番に読み取りチューブ中に導入した:
1.抗Cペプチドモノクローナル抗体でコートしたビーズ50μl、
2.活性炭で事前に処理し、漸増濃度のプロインスリン、des−31,32プロインスリンまたはdes−64,65プロインスリンを導入した血清20μl、3.0.02M Tris、0.15M NaClおよび保存剤から構成されるpH=8緩衝液80μl、ならびに
4.pH=8緩衝液(0.1M Tris、MgCl2、2mM、0.1M ZnCl2、0.15M NaClから構成され、タンパク質および保存剤を添加)中の、AC1D4モノクローナル抗体およびBC9B6モノクローナル抗体を種々の濃度(0μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/mlおよび20μg/ml)で含有する抗Cペプチドヤギポリクローナル抗体に結合させたアルカリホスファターゼ50μl。
37℃で30分間インキュベートした後、これをpH−8緩衝液(0.02M Tris、0.15M NaClおよび保存剤から構成される)で3回洗浄し、200μlのLumi−PhosTM530基質を添加した。これを5分間37℃で再度インキュベートし、反応によって生成した発光をルミノメーターを使用して測定した。
この研究の結果を表II〜IVに示す。結果を交差反応の百分率として表す。
表IVの結果は、各々20μg/mlの濃度のAC1D4およびBC9B6抗体の混合物を添加することによって、5%未満のプロインスリンとの交差反応、15%未満のdes−31,32プロインスリンとの交差反応および10%未満のdes−64,65プロインスリンとの交差反応が生じることを示す。
実施例2:
尿用の特異的Cペプチドアッセイ法 「サンドイッチ」型酵素免疫アッセイ
尿中のCペプチドをアッセイするために、最初に尿試料を1/20に希釈して、実施例1に記載のように進めることが可能である。
30μg/mlの濃度のAC1D4抗体および5μg/mlの濃度のBC9B6を添加して、5%未満のプロインスリンに起因する干渉、10%未満のdes−31,32プロインスリンに起因する干渉および20%未満のdes−64,65プロインスリンに起因する干渉を得ることが可能である。
実施例3:
血清における特異的Cペプチドアッセイ法 競合的放射免疫アッセイ.
このアッセイは、ヨウ素(I25)で標識した固定量のtyr−Cペプチドと
参照溶液または測定しようとする試料中に含有されるCペプチドとの間の、限定数の抗Cペプチド抗体部位に対する競合に基づいた。
アッセイを、PEP001抗Cペプチドモノクローナル抗体でコートしたポリスチレンチューブを使用して以下のように実施した:
以下を各チューブに導入した:
− タンパク質を添加し、0.1%の窒化ナトリウムを含有するpH=6.8リン酸緩衝溶液中の0.2ng/ml〜30ng/mlのCペプチドを含有する標準溶液100μlまたはアッセイしようとする試料100μl、ならびに
− 0.1%の窒化ナトリウムおよび20μg/mlの量のプロインスリン分子のAC連結部に対する特異的AC1D4抗体を含有するリン酸緩衝液中で希釈した1ヨウ素Tyr−Cペプチドを含有する溶液50μl。
チューブをParafilmTMで覆った。2時間室温で水平に攪拌しながらインキュベートした後、反応媒質を吸引によって除去し、0.05Mイミダゾール、0.0025%アジ化ナトリウムおよび保存剤を含有するpH=7.4緩衝溶液2mlで洗浄した。この溶液を吸引によって除去し、洗浄をさらに2回繰り返した。
各チューブの放射能を、I125を測定するように調整したガンマシンチレーターを使用して測定した。計数を1分間にわたって実施した。
Cペプチドの量を、参照スケールに対して評価した。この方法の検出限界は0.15ng/mlであった。
このアッセイの特異性を評価するために、異なる濃度の2つの血清にプロインスリン、des−31,32プロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンを過負荷した。
試験をAC1D4抗体(C=20μg/ml)の存在下および非存在下で実施した。この試験の結果を表V〜VIIに示す。
この研究の結果は、プロインスリン中のAC連結部に特異的なモノクローナル抗体の存在によって、そのエピトープがAC1D4のエピトープに近いPEP001抗体を使用するCペプチドのアッセイにおいて、プロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンに起因する干渉を排除することができることを示す。
Claims (19)
- Cペプチドを含有し得る試料を、1つ以上の抗Cペプチド抗体ならびに
− インタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンに特異的であり、抗Cペプチド抗体のエピトープの近傍もしくは該エピトープに重複するエピトープを認識し、抗Cペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体、または
− インタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンに特異的であり、抗Cペプチド抗体のエピトープの近傍もしくは該エピトープに重複するエピトープを認識し、抗Cペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体、または
− インタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンに特異的な該抗プロインスリン抗体とインタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンに特異的な該抗プロインスリン抗体との混合物
と接触させることを特徴とするCペプチドアッセイ法。 - インタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンに特異的な抗プロインスリン抗体がプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンのAC連結部に位置するエピトープを認識し、該エピトープがペプチド配列:
Lys Arg
を含む、請求項1記載のCペプチドアッセイ法。 - インタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンに特異的な抗プロインスリン抗体がプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンのBC連結部に位置するエピトープを認識し、該エピトープがペプチド配列:
Arg Arg
を含む、請求項1〜4のいずれか1項記載のCペプチドアッセイ法。 - Cペプチドを含有し得る試料を、抗Cペプチド抗体ならびに、インタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンに特異的であり、抗Cペプチド抗体のエピトープの近傍もしくは該エピトープに重複するエピトープを認識し、抗Cペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンへの結合を妨害する抗プロインスリン抗体と接触させる、請求項1〜5のいずれか1項記載のCペプチドアッセイ法。
- Cペプチドを含有し得る試料を、抗Cペプチド抗体ならびに、インタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンに特異的であり、抗Cペプチド抗体のエピトープの近傍もしくは該エピトープに重複するエピトープを認識し、抗Cペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンへの結合を妨害する抗プロインスリン抗体と接触させる、請求項1〜5のいずれか1項記載のCペプチドアッセイ法。
- 抗体の少なくとも1つがモノクローナル抗体である、請求項1〜7のいずれか1項記載のCペプチドアッセイ法。
- 試料が血清、血漿または尿から得られる、請求項1〜8のいずれか1項記載のCペプチドアッセイ法。
- 請求項1〜9のいずれか1項記載の「サンドイッチ」型Cペプチドアッセイ法。
- 請求項1〜9のいずれか1項記載の競合的放射免疫アッセイ型Cペプチドアッセイ法。
- Collection Nationale de Cultures de Microorganismes at the Institut Pasteurに1997年6月4日に登録番号I−1873の下に寄託されたハイブリドーマ。
- 請求項13記載のハイブリドーマから得られる請求項12記載のdes−31,32プロインスリンおよびプロインスリンに特異的なモノクローナル抗体。
- 請求項1〜6および8〜11のいずれか1項記載のアッセイ法を実施するための、ペプチド配列:
Lys Arg
を含むプロインスリンおよびdes−31,32プロインスリンのAC連結部に位置するエピトープを認識するモノクローナル抗体の使用。 - 請求項1〜5および7〜11のいずれか1項記載のアッセイ法を実施するための、ペプチド配列:
Arg Arg
を含むプロインスリンおよびdes−64,65プロインスリンのBC連結部に位置するエピトープを認識するモノクローナル抗体の使用。 - Cペプチドをアッセイするための、抗Cペプチド抗体、ならびにdes−31,32プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な抗体、ならびに/またはdes−64,65プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な抗体を含むキットの使用。
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