JPH107693A - 新規糖誘導体、その製造法、リパーゼ活性測定用試薬およびリパーゼ活性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血液中に共存するエステラーゼ、コリンエス
テラーゼの作用を受けずリパーゼに対する特異性が高
く、さらに溶解性にも優れている化合物を提供するこ
と、またリパーゼの高感度測定を可能にするリパーゼ活
性測定試薬、レートアッセイ法を適用することができ
る、簡便にリパーゼ活性の測定を行うことができるリパ
ーゼ活性測定方法を提供すること。 【解決手段】 一般式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ¹ は炭素数１２以上３０以下のヒドロキシ脂
肪酸エステル基を示し、Ｒ² は置換フェノキシ基を示
し、波線はαまたはβ結合を示す）で表される糖誘導
体、糖誘導体（Ｉ）を含むリパーゼ活性測定用試薬およ
び該測定用試薬を使用するリパーゼ活性測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な糖誘導体、
その製造法、臨床検査分野などで有効に使用されうる、
該糖誘導体を基質として含有するリパーゼの活性測定用
試薬、ならびに該試薬を用いたリパーゼの活性測定方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】膵臓の疾
患を診断するために、酵素を用いる方法が知られてい
る。例えば、十二指腸液や血液の中に存在するアミラー
ゼの活性を測定することにより診断するものであるが、
アミラーゼは食餌やホルモンの影響を受け易いために、
膵アミラーゼ活性の低下があったとしても、必ずしも膵
臓に器質的疾患が存在するとはいえない。また、血液中
のアミラーゼ活性の測定に関しても、アミラーゼは膵や
唾液腺イソアミラーゼとしても存在することから、血液
中のアミラーゼ活性の上昇により、必ずしも膵臓に器質
的疾患が存在するとはいえない。

【０００３】一方、膵リパーゼは膵臓の腺房細胞から分
泌され、膵管を通り十二指腸に***されて、脂肪消化作
用を示す。膵炎や膵癌などの膵疾患が起こると、膵腺房
細胞の破壊や膵管の閉塞などによって、膵リパーゼが血
液中に移行し、血清中のリパーゼ活性値を上昇させるこ
とが、臨床的に知られている。したがって、膵疾患の診
断には、血液中のアミラーゼ活性の測定よりも、膵に特
異性の高いリパーゼの活性を測定するほうが、より有用
な指標になると考えられている。

【０００４】このようなことから従来より種々のリパー
ゼの活性測定法が知られている。オリーブ油を基質とす
る測定方法として、試料とオリーブ油とを接触させ遊離
する脂肪酸をアルカリ滴定する測定方法、オリーブ油エ
マルジョンの温度変化を指標とする測定方法などがあ
る。しかしこれらの方法は、操作が煩雑で、オリーブ油
の品質やオリーブ油エマルジョンの調整方法の相違によ
り測定値が変動したり、測定値の再現性が悪くなるなど
の問題点がある（Ａｎａｌｉｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、第６巻、４５１頁（１９６３）参照）。

【０００５】合成高級脂肪酸エステルであるα−ナフチ
ルパルミテートを基質とした測定方法は、基質が溶解し
にくいために酵素活性測定に充分な量の基質を添加でき
なかったり、基質液の調整方法の相違により測定値が変
動したり、再現性が悪いなどの問題点がある（Ｃｌｉｎ
ｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、第４４巻、１３３
〜１３８頁（１９７３）、臨床化学、第７巻（４）、３
５０〜３５６頁（１９７９）参照）。

【０００６】合成チオエステルである３−ブチロイルオ
キシ−１，２−ビスブチロイルチオプロパン（ＢＡＬ
Ｂ）を基質とした活性測定法（特開昭５０−１５９７９
３号公報参照）は、再現性や精度が比較的よく、これま
でよく利用されてきた方法である。しかし、該基質は短
鎖の脂肪酸エステル残基を有するため、リパーゼだけで
なくエステラーゼにもよく加水分解され、基質特異性に
問題がある。さらに測定原理がエンドポイント法のため
操作の煩雑さもさることながら、反応停止液を必要と
し、酵素活性の測定を連続的に行うレートアッセイ法を
適用することができないといった問題点も有している。

【０００７】上記の基質にある問題点を解消するため、
糖エステル誘導体を基質として含有するリパーゼの活性
測定用試薬が提案されている（特公平６−７６４３１号
公報参照）。しかしながら、特公平６−７６４３１号公
報に開示されているようなマルトシドのエステル体は、
溶解性には優れるものの、リパーゼがほとんど作用しな
いという問題点がある。グルコシドのエステル体にはリ
パーゼが作用するものの、溶解性が不充分なため、リパ
ーゼ活性測定に充分な量の基質を添加することができ
ず、充分な分析感度を示さないという問題点がある。

【０００８】本発明は、上記した従来の基質の有する問
題点を解消しようとするもので、その目的とするところ
は、溶解性に優れ、かつ基質として有用な糖誘導体を提
供すること、簡便な操作でレートアッセイ法による測定
が可能なリパーゼ活性測定用の試薬を提供すること、お
よび簡便なリパーゼ活性測定方法を提供することであ
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記に示し
た従来方法の問題点を克服するために鋭意研究を行った
結果、本発明を完成した。即ち本発明は、以下に示すも
のに関する。 （１）一般式（Ｉ）

【００１０】

【化２】

【００１１】（式中、Ｒ¹ は炭素数１２以上３０以下の
ヒドロキシ脂肪酸エステル残基を示し、Ｒ² は置換フェ
ノキシ基を示し、波線はαまたはβ結合を示す）で表さ
れる糖誘導体。 （２）フェニルグリコシド誘導体のグルコース部分の６
位の水酸基のみをエステル化させることからなる上記
（１）に記載の糖誘導体の製造法。 （３）上記（１）に記載した糖誘導体を基質として含有
するリパーゼ活性測定用試薬。 （４）上記（３）に記載したリパーゼ活性測定用試薬を
用いるリパーゼ活性測定方法。

【００１２】本発明の一般式（Ｉ）で表される糖誘導体
は、グルコシドエステル誘導体、即ちグルコースの６位
のヒドロキシル基が修飾されたαまたはβフェニルグル
コシドである。該誘導体（Ｉ）の糖部分は、グルコース
である。糖誘導体（Ｉ）のＲ¹ は、炭素数１２以上３０
以下のヒドロキシ脂肪酸エステル残基であり、好ましく
は、１〜２個のヒドロキシル基が置換した炭素数１２〜
１８の飽和または不飽和脂肪酸エステル残基である。具
体的には、１２−ヒドロキシステアロイル、９，１０−
ジヒドロキシステアロイル、リシノレオイル（リシノレ
イルともいう）、１６−ヒドロキシパルミトイル、２−
ヒドロキシパルミトイル、３−ヒドロキシミリストイ
ル、２−ヒドロキシミリストイル、１２−ヒドロキシド
デカノイル、３−ヒドロキシドデカノイル、２−ヒドロ
キシドデカノイルなどが挙げられる。

【００１３】糖誘導体（Ｉ）のＲ² は、置換されたフェ
ノキシ基であり、遊離してフェノール性化合物となった
時、それ自体で高感度に発色するか、それ自体で発色し
ないものは呈色試薬などを添加した時に高感度に発色
し、かつ基質分子全体の溶解能を落とさないものが好ま
しい。グルコース部分と置換フェノキシ基との結合は、
グルコース部分の１位にα型で結合していてもβ型で結
合していてもよい。Ｒ² の具体例として以下の基が挙げ
られるが、これらに限定されるものではない。

【００１４】ソジオ−３，３′−ジクロロフェノールス
ルホンフタレイニルオキシ

【００１５】

【化３】

【００１６】ソジオ−４−（４′−ニトロ−２′−スル
ホフェニルアゾ）−１−ナフチルオキシ

【００１７】

【化４】

【００１８】フェノールインド−３′−クロロフェニル
オキシ

【００１９】

【化５】

【００２０】レゾルフィニルオキシ

【００２１】

【化６】

【００２２】レザズリニルオキシ

【００２３】

【化７】

【００２４】２−フルオロ−４−（２′−ニトロビニ
ル）フェニルオキシ

【００２５】

【化８】

【００２６】３−フルオロ−４−ニトロフェニルオキシ

【００２７】

【化９】

【００２８】２−フルオロ−４−ニトロフェニルオキシ

【００２９】

【化１０】

【００３０】４−ニトロフェニルオキシ

【００３１】

【化１１】

【００３２】３，４−ジニトロフェニルオキシ

【００３３】

【化１２】

【００３４】４−アミノフェニルオキシ

【００３５】

【化１３】

【００３６】２−アミノフェニルオキシ

【００３７】

【化１４】

【００３８】４−アセチルアミノフェニルオキシ

【００３９】

【化１５】

【００４０】２−アセチルアミノフェニルオキシ

【００４１】

【化１６】

【００４２】４−カルボキシフェニルオキシ

【００４３】

【化１７】

【００４４】２−クロロ−４−ニトロフェニルオキシ

【００４５】

【化１８】

【００４６】本発明の新規な誘導体（Ｉ）の具体例とし
ては以下のものが挙げられるが、これらに限定されるも
のではない。

【００４７】ソジオ−３，３′−ジクロロフェノールス
ルホンフタレイニル ６−Ｏ−１２′−ヒドロキシステ
アロイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【００４８】

【化１９】

【００４９】２−フルオロ−４−（２′−ニトロビニ
ル）フェニル ６−Ｏ−９′，１０′−ジヒドロキシス
テアロイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【００５０】

【化２０】

【００５１】４−カルボキシフェニル ６−Ｏ−リシノ
レオイル−α−Ｄ−グルコピラノシド

【００５２】

【化２１】

【００５３】２−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−
Ｏ−１２′−ヒドロキシステアロイル−β−Ｄ−グルコ
ピラノシド

【００５４】

【化２２】

【００５５】３，４−ジニトロフェニル ６−Ｏ−１
６′−ヒドロキシパルミトイル−β−Ｄ−グルコピラノ
シド

【００５６】

【化２３】

【００５７】４−ニトロフェニル ６−Ｏ−リシノレオ
イル−α−Ｄ−グルコピラノシド

【００５８】

【化２４】

【００５９】２−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−
Ｏ−リシノレオイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【００６０】

【化２５】

【００６１】２−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−
Ｏ−リシノレオイル−α−Ｄ−グルコピラノシド

【００６２】

【化２６】

【００６３】２−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−
Ｏ−１６’−ヒドロキシパルミトイル−α−Ｄ−グルコ
ピラノシド

【００６４】

【化２７】

【００６５】３，４−ジニトロフェニル ６−Ｏ−
９’，１０’−ジヒドロキシステアロイル−β−Ｄ−グ
ルコピラノシド

【００６６】

【化２８】

【００６７】３，４−ジニトロフェニル ６−Ｏ−リシ
ノレオイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【００６８】

【化２９】

【００６９】２−フルオロ−４−（２’−ニトロビニ
ル）フェニル ６−Ｏ−リシノレオイル−β−Ｄ−グル
コピラノシド

【００７０】

【化３０】

【００７１】４−カルボキシフェニル ６−Ｏ−９’，
１０’−ジヒドロキシステアロイル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシド

【００７２】

【化３１】

【００７３】４−カルボキシフェニル ６−Ｏ−１６’
−ヒドロキシパルミトイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【００７４】

【化３２】

【００７５】２−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−
Ｏ−９’，１０’−ジヒドロキシステアロイル−β−Ｄ
−グルコピラノシド

【００７６】

【化３３】

【００７７】２−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−
Ｏ−９’，１０’−ジヒドロキシステアロイル−α−Ｄ
−グルコピラノシド

【００７８】

【化３４】

【００７９】３−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−
Ｏ−９’，１０’−ジヒドロキシステアロイル−β−Ｄ
−グルコピラノシド

【００８０】

【化３５】

【００８１】３−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−
Ｏ−９’，１０’−ジヒドロキシステアロイル−α−Ｄ
−グルコピラノシド

【００８２】

【化３６】

【００８３】３−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−
Ｏ−リシノレオイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【００８４】

【化３７】

【００８５】３−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−
Ｏ−リシノレオイル−α−Ｄ−グルコピラノシド

【００８６】

【化３８】

【００８７】３−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−
Ｏ−１６’−ヒドロキシパルミトイル−α−Ｄ−グルコ
ピラノシド

【００８８】

【化３９】

【００８９】４−アミノフェニル ６−Ｏ−９’，１
０’−ジヒドロキシステアロイル−α−Ｄ−グルコピラ
ノシド

【００９０】

【化４０】

【００９１】２−アミノフェニル ６−Ｏ−９’，１
０’−ジヒドロキシステアロイル−β−Ｄ−グルコピラ
ノシド

【００９２】

【化４１】

【００９３】４−アミノフェニル ６−Ｏ−リシノレオ
イル−α−Ｄ−グルコピラノシド

【００９４】

【化４２】

【００９５】２−アミノフェニル ６−Ｏ−リシノレオ
イル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【００９６】

【化４３】

【００９７】４−アミノフェニル ６−Ｏ−１２’−ヒ
ドロキシステアロイル−α−Ｄ−グルコピラノシド

【００９８】

【化４４】

【００９９】２−アミノフェニル ６−Ｏ−１２’−ヒ
ドロキシステアロイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【０１００】

【化４５】

【０１０１】ソジオ−３，３’−ジクロロフェノールス
ルホンフタレイニル ６−Ｏ−１６’−ヒドロキシパル
ミトイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【０１０２】

【化４６】

【０１０３】２−フルオロ−４−（２’−ニトロビニ
ル）フェニル ６−Ｏ−１６’−ヒドロキシパルミトイ
ル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【０１０４】

【化４７】

【０１０５】４−ニトロフェニル ６−Ｏ−９’，１
０’−ジヒドロキシステアロイル−α−Ｄ−グルコピラ
ノシド

【０１０６】

【化４８】

【０１０７】レゾルフェニル ６−Ｏ−９’，１０’−
ジヒドロキシステアロイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【０１０８】

【化４９】

【０１０９】レゾルフェニル ６−Ｏ−リシノレオイル
−β−Ｄ−グルコピラノシド

【０１１０】

【化５０】

【０１１１】レザズリニル ６−Ｏ−９’，１０’−ジ
ヒドロキシステアロイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【０１１２】

【化５１】

【０１１３】レザズリニル ６−Ｏ−リシノレオイル−
β−Ｄ−グルコピラノシド

【０１１４】

【化５２】

【０１１５】３，４−ジニトロフェニル ６−Ｏ−１
２’−ヒドロキシステアロイル−β−Ｄ−グルコピラノ
シド

【０１１６】

【化５３】

【０１１７】ソジオ−４−（４’−ニトロ−２’−スル
ホフェニルアゾ−１−ナフチル ６−Ｏ−１２’−ヒド
ロキシステアロイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【０１１８】

【化５４】

【０１１９】フェノールインド−３’−クロロフェニル
６−Ｏ−９’，１０’−ジヒドロキシステアロイル−
β−Ｄ−グルコピラノシド

【０１２０】

【化５５】

【０１２１】４−アセチルアミノフェニル ６−Ｏ−１
２’−ヒドロキシステアロイル−β−Ｄ−グルコピラノ
シド

【０１２２】

【化５６】

【０１２３】２−アセチルアミノフェニル ６−Ｏ−１
２’−ヒドロキシステアロイル−β−Ｄ−グルコピラノ
シド

【０１２４】

【化５７】

【０１２５】２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ
−９’，１０’−ジヒドロキシステアロイル−α−Ｄ−
グルコピラノシド

【０１２６】

【化５８】

【０１２７】２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ
−１６′−ヒドロキシパルミトイル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシド

【０１２８】

【化５９】

【０１２９】４−ニトロフェニル ６−Ｏ−１６′−ヒ
ドロキシパルミトイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【０１３０】

【化６０】

【０１３１】３−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−
Ｏ−１２′−ヒドロキシステアロイル−α−Ｄ−グルコ
ピラノシド

【０１３２】

【化６１】

【０１３３】４−ニトロフェニル ６−Ｏ−１２′−ヒ
ドロキシステアロイル−α−Ｄ−グルコピラノシド

【０１３４】

【化６２】

【０１３５】フェノールインド−３’−クロロフェニル
６−Ｏ−９’，１０’−ジヒドロキシステアロイル−
α−Ｄ−グルコピラノシド

【０１３６】

【化６３】

【０１３７】本発明の糖誘導体（Ｉ）は、例えば、グル
コースをパーアセチル化したパーアセチルグルコピラノ
ースに、αあるいはβ型に、フェノール類（アグリコ
ン）を既知の方法でＯ−グリコシド結合させフェニルグ
リコシド誘導体を得、さらに該誘導体のグルコース部分
の６位水酸基のみを、脂肪酸の反応性誘導体を用いる既
知の方法でエステル化させることにより製造される。こ
こで、フェノール類（アグリコン）をα結合によりグル
コースと結合させる方法は、ペンタアセチルグルコース
を用いる方法により実施することができる（Ｔ．Ｄ．Ａ
ｕｄｉｃｈｙａらにより著された文献、Ｉｎｄｉａｎ
Ｊ．Ｃｈｅｍ．、第９巻、第３１５〜３１７頁（１９７
１）参照）。フェノール類とペンタアセチルグルコース
とを反応させ、その後精製することによりα体をとりだ
し、それを、氷冷下メタノール中で硫酸などを用いて脱
アセチル化して、一般式（ＩＩ）

【０１３８】

【化６４】

【０１３９】（式中、Ｒ² は前記と同義）で表されるα
−グルコシドを得ることができる。

【０１４０】フェノール類（アグリコン）をβ結合によ
りグルコース部分と結合させる方法は、テトラアセチル
グルコシルハライドを用いる方法により実施することが
できる（Ｓ．Ｔｏｋｕｔａｋｅらにより著された文献、
Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａ．Ｂｕｌｌ．、第３８巻、第１
３〜１８頁（１９９０）参照）。フェノール類のアルカ
リ金属塩とテトラアセチルグリコシルハライドとを反応
させた糖誘導体を、常温下メタノール中でナトリウムメ
チラートなどを用いて脱アセチル化し、一般式（ＩＩ
Ｉ）

【０１４１】

【化６５】

【０１４２】（式中、Ｒ² は前記と同義）で表されるβ
−グルコシドを得ることができる。

【０１４３】グルコース部分の６位の水酸基に、ヒドロ
キシ脂肪酸エステル残基を選択的に導入するには、グル
コシド体に飽和脂肪酸の活性エステル体を作用させる方
法に準じて（Ｓ．Ｒｉｖａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．、第１１０巻、第５８４〜５８９頁（１９８８）
参照）、ピリジン、トリエチルアミンなどの有機溶媒
中、α−グルコシド（ＩＩ）あるいはβ−グルコシド
（ＩＩＩ）にヒドロキシ脂肪酸の活性エステル体を作用
させ、本発明の糖誘導体（Ｉ）を合成することができ
る。

【０１４４】本発明のリパーゼ測定用試薬は、基質とし
て一般式（Ｉ）で表される糖誘導体を含む。試薬中の糖
誘導体（Ｉ）の濃度は特に限定されないが、通常０．０
１〜３重量％含まれている。本発明の試薬は、糖誘導体
（Ｉ）を、α−グルコシダーゼまたはβ−グルコシダー
ゼの共存下で、リパーゼ含有試料に作用させ、遊離する
フェノール系化合物を、分光光度計などで直接定量する
方法や、グルコシダーゼにより遊離してくるｐ−アミノ
フェノールまたはカルボキシフェノールに４−アミノア
ンチピリンと、過酸化水素およびパーオキシダーゼを添
加し、生成したキノン色素を連続的に発色させたり、ま
た、グルコシダーゼにより遊離してくるｐ−アミノフェ
ノールまたはカルボキシフェノールにアニリン誘導体お
よび、ラッカーゼまたはフェノールオキシダーゼ等を添
加し、生成したキノン色素を連続的に発色させたりして
分光光度計などで定量することによって、リパーゼ活性
を測定するものである。したがって、本発明の試薬に
は、基質である糖誘導体（Ｉ）に加えて、通常、α−グ
ルコシダーゼまたはβ−グルコシダーゼ（共役酵素
系）、および必要に応じてその他の添加剤が含有されて
いる。

【０１４５】当該測定に用いられるα−グルコシダーゼ
およびβ−グルコシダーゼの起源は特に限定されない。
例えば、酵母起源のα−グルコシダーゼ、アーモンドか
ら得られるβ−グルコシダーゼが好適に利用されうる。
なお、アグリコンがα型に結合した基質を用いる場合に
は、共役酵素系としてはα−グルコシダーゼが使用さ
れ、β型に結合した基質を用いる場合には、β−グルコ
シダーゼが使用される。

【０１４６】本発明の試薬には、カルシウム塩、ナトリ
ウム塩、マグネシウム塩、コール酸塩、コリパーゼなど
のリパーゼおよび共役酵素の活性化剤および安定化剤を
配合することが好ましい。他の添加剤として、緩衝剤、
界面活性剤、防腐剤などが挙げられる。

【０１４７】本発明の試薬を使用するリパーゼ活性測定
における基質分解の反応式を例を挙げて説明する。
〔 〕内は省略名である。

【０１４８】（１） ソジオ−３，３′−ジクロロフェ
ノールスルホンフタレイニル ６−Ｏ−１２′−ヒドロ
キシステアロイル−β−Ｄ−グルコピラノシド〔６−１
２′−ヒドロキシステアロイル ソジオ−３，３′−ジ
クロロフェノールスルホンフタレイニル−β−グルコシ
ド〕

【０１４９】

【化６６】

【０１５０】を基質とする場合：

【０１５１】６−１２′−ヒドロキシステアロイル
ソジオ−３，３′−ジクロロフェノールスルホンフタレ
イニル−β−グルコシドにリパーゼを作用させることに
より、ソジオ−３，３′−ジクロロフェノールスルホン
フタレイニル−β−グルコシド

【０１５２】

【化６７】

【０１５３】と１２−ヒドロキシステアリン酸に分解さ
れる。

【０１５４】ソジオ−３，３′−ジクロロフェノール
スルホンフタレイニル−β−グルコシドにβグルコシダ
ーゼを作用させることにより、３，３′−ジクロロフェ
ノールスルホンフタレイン

【０１５５】

【化６８】

【０１５６】とグルコースに分解される。

【０１５７】（２） ３，４−ジニトロフェニル ６−
Ｏ−１６′−ヒドロキシパルミトイル−β−Ｄ−グルコ
ピラノシド〔６−１６′−ヒドロキシパルミトイル
３，４−ジニトロフェニル−β−グルコシド〕

【０１５８】

【化６９】

【０１５９】を基質とする場合： ６−１６′−ヒドロキシパルミトイル ３，４−ジニ
トロフェニル−β−グルコシドにリパーゼを作用させる
ことにより、３，４−ジニトロフェニル−β−グルコシ
ド

【０１６０】

【化７０】

【０１６１】と１６−ヒドロキシパルミチン酸に分解さ
れる。

【０１６２】３，４−ジニトロフェニル−β−グルコ
シドにβグルコシダーゼを作用させることにより、３，
４−ジニトロフェノールとグルコースに分解される。

【０１６３】（３） ４−ニトロフェニル ６−Ｏ−リ
シノレオイル−α−Ｄ−グルコピラノシド〔６−リシノ
レオイル ４−ニトロフェニル−α−グルコシド〕

【０１６４】

【化７１】

【０１６５】を基質とする場合：

【０１６６】６−リシノレオイル ４−ニトロフェニ
ル−α−グルコシドにリパーゼを作用させることによ
り、４−ニトロフェニル−α−グルコシドとリシノール
酸に分解される。

【０１６７】４−ニトロフェニル−α−グルコシドに
α−グルコシダーゼを作用させると、４−ニトロフェノ
ールとグルコースに分解される。

【０１６８】上記反応で遊離したフェノール系化合物を
上記に示した方法によって、リパーゼ活性を測定するこ
とができる。また必要に応じて適当な手段によってフェ
ノール系化合物を連続的に発色させて測定してもよい。
本発明のリパーゼ活性測定試薬は、基質である糖誘導体
（Ｉ）と共役酵素とを混合した一液化型の試薬として
も、基質と共役酵素を使用する直前までは各々別に保存
する、いわゆる二液化型の試薬としても利用される。

【０１６９】

【発明の効果】本発明の糖誘導体（Ｉ）は、血液中に共
存するエステラーゼ、コリンエステラーゼの作用を受け
ずリパーゼに対する特異性が高く、さらに溶解性にも優
れている。従って糖誘導体（Ｉ）を基質として含有する
本発明のリパーゼ活性測定試薬は、リパーゼの高感度測
定を可能にする。さらに本発明の試薬を使用する測定法
では、レートアッセイ法を適用することができるので、
簡便にリパーゼ活性の測定を行うことができる。

【０１７０】

【実施例】以下、実施例および比較例により本発明をさ
らに詳細に説明する。

【０１７１】実施例１ ３−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−９′，１
０′−ジヒドロキシステアロイル−α−Ｄ−グルコピラ
ノシドの合成

【０１７２】

【化７２】

【０１７３】３−フルオロ−４−ニトロフェニル−α−
Ｄ−グルコピラノシドを１ｇ、２−クロロ−４−ニトロ
フェニル ９，１０−ジヒドロキシステアレートを１．
４９ｇ、および４Ａモレキュラーシーブスで脱水を行っ
たピリジン２５ｍｌを温度計を付した１００ｍｌ四つ口
フラスコに投入して均一な溶液とし、５５〜６０℃で４
８時間撹拌した。反応液を２００ｍｌナス型フラスコに
移し、ロータリーエバポレータで減圧下濃縮を行った。
濃縮物を酢酸エチル２００ｍｌに溶解し、３００ｍｌ分
液ロートに移した。酢酸エチル層を、１．２Ｎ塩酸水５
０ｍｌで２回分液洗浄し、濃縮残中の残存ピリジンを除
去し、５％炭酸カリ水５０ｍｌで２回分液洗浄して、遊
離した３−フルオロ−４−ニトロフェノールおよび２−
クロロ−４−ニトロフェノールを除去し、さらに、酢酸
エチル層を蒸留水５０ｍｌで３回洗浄した。また、この
分液操作で未反応の３−フルオロ−４−ニトロフェニル
−α−Ｄ−グルコピラノシドも除去された。酢酸エチル
層を濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１
０％メタノール−酢酸エチル）により、ＴＬＣ（薄層ク
ロマトグラフィー）でシングルスポット（Ｒｆ ０．２
２）になるまで徹底的に精製すると、３−フルオロ−４
−ニトロフェニル ６−Ｏ−９′，１０′−ジヒドロキ
システアロイル−α−Ｄ−グルコピラノシドの白色結晶
が１．２６ｇ得られた。 収率：６５％ 融点：１０３〜１０５℃ 図１に赤外線吸収スペクトル（ＩＲチャート）を示す。
またＴＬＣの条件は、次の通りである。 薄層板：メルク社製、シリカゲル６０Ｆ₂₅₄ ｓを予め塗
布したＨＰＴＬＣ板 検出：展開後、乾燥し、５％硫酸−メタノールを薄層板
に噴霧し、電熱器などにより、スポットを炭化させる。 展開相：酢酸エチル、メタノール、水（体積比率＝５
０：１：１）

【０１７４】実施例２ ２−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−１２′−
ヒドロキシステアロイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【０１７５】

【化７３】

【０１７６】２−フルオロ−４−ニトロフェニル−β−
Ｄ−グルコピラノシドを１ｇ、２−クロロ−４−ニトロ
フェニル １２−ヒドロキシステアレートを１．４２
ｇ、および４Ａモレキュラーシーブスで脱水を行ったピ
リジン３５ｍｌを、温度計を付した１００ｍｌ四つ口フ
ラスコに投入して均一な溶液とし、５５〜６０℃で６０
時間撹拌した。反応液を２００ｍｌナス型フラスコに移
し、ロータリーエバポレータで減圧下濃縮を行った。濃
縮物を酢酸エチル２００ｍｌに溶解し、３００ｍｌ分液
ロートに移した。酢酸エチル層を、１．２Ｎ塩酸水５０
ｍｌで分液洗浄し、濃縮残中の残存ピリジンを除去し、
５％炭酸カリ水５０ｍｌで分液洗浄して、遊離した２−
フルオロ−４−ニトロフェノールおよび２−クロロ−４
−ニトロフェノールを除去し、さらに、酢酸エチル層を
蒸留水５０ｍｌで２回洗浄した。また、この分液操作で
未反応の２−フルオロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−
グルコピラノシドも除去された。酢酸エチル層を濃縮
後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％メタノ
ール−酢酸エチル）により、ＴＬＣ（薄層クロマトグラ
フィー）でシングルスポット（Ｒｆ ０．３４）になる
まで徹底的に精製すると、２−フルオロ−４−ニトロフ
ェニル ６−Ｏ−１２′−ヒドロキシステアロイル−β
−Ｄ−グルコピラノシドの白色結晶が１．３６ｇ得られ
た。 収率：７２％ 融点：９５〜９８℃ 図２に赤外線吸収スペクトル（ＩＲチャート）を示す。
またＴＬＣの条件は、次の通りである。 薄層板：メルク社製、シリカゲル６０Ｆ₂₅₄ ｓを予め塗
布したＨＰＴＬＣ板 検出：展開後、乾燥し、５％硫酸−メタノールを薄層板
に噴霧し、電熱器などにより炭化させる。 展開相：酢酸エチル、メタノール、水（体積比率＝１０
０：１：１）

【０１７７】実施例３ ４−ニトロフェニル ６−Ｏ−９′，１０′−ジヒドロ
キシステアロイル−α−Ｄ−グルコピラノシド

【０１７８】

【化７４】

【０１７９】ピリジン中、４−ニトロフェニル−α−Ｄ
−グルコピラノシドに２−クロロ−４−ニトロフェニル
９，１０−ジヒドロキシステアレートを作用させ、実
施例１と同様の方法で合成した。 融点：１１６〜１２０℃ 図３に赤外線吸収スペクトル（ＩＲチャート）を示す。

【０１８０】実施例４ ３−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−９′，１
０′−ジヒドロキシステアロイル−β−Ｄ−グルコピラ
ノシド

【０１８１】

【化７５】

【０１８２】ピリジン中、３−フルオロ−４−ニトロフ
ェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドに２−クロロ−４−
ニトロフェニル ９，１０−ジヒドロキシステアレート
を作用させ、実施例１と同様の方法で合成した。 融点：９４〜９５℃ 図４に赤外線吸収スペクトル（ＩＲチャート）を示す。

【０１８３】実施例５ ２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−１６′−ヒ
ドロキシパルミトイル−α−Ｄ−グルコピラノシド

【０１８４】

【化７６】

【０１８５】ピリジン中、２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル−α−Ｄ−グルコピラノシドに２−クロロ−４−ニ
トロフェニル １６−ヒドロキシパルミテートを作用さ
せ、実施例２と同様の方法で合成した。 融点：９９〜１０１℃ 図５に赤外線吸収スペクトル（ＩＲチャート）を示す。

【０１８６】実施例６ ４−ニトロフェニル ６−Ｏ−１６′−ヒドロキシパル
ミトイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【０１８７】

【化７７】

【０１８８】ピリジン中、４−ニトロフェニル−β−Ｄ
−グルコピラノシドに２−クロロ−４−ニトロフェニル
１６−ヒドロキシパルミテートを作用させ、実施例２
と同様の方法で合成した。 融点：８３〜８６℃ 図６に赤外線吸収スペクトル（ＩＲチャート）を示す。

【０１８９】実施例７ ３−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−１２′−
ヒドロキシステアロイル−α−Ｄ−グルコピラノシド

【０１９０】

【化７８】

【０１９１】ピリジン中、３−フルオロ−４−ニトロフ
ェニル−α−Ｄ−グルコピラノシドに２−クロロ−４−
ニトロフェニル １２−ヒドロキシステアレートを作用
させ、実施例２と同様の方法で合成した。 融点：９１〜９３℃ 図７に赤外線吸収スペクトル（ＩＲチャート）を示す。

【０１９２】実施例８ ４−ニトロフェニル ６−Ｏ−１２′−ヒドロキシステ
アロイル−α−Ｄ−グルコピラノシド

【０１９３】

【化７９】

【０１９４】ピリジン中、４−ニトロフェニル−α−Ｄ
−グルコピラノシドに２−クロロ−４−ニトロフェニル
１２−ヒドロキシステアレートを作用させ、実施例２
と同様の方法で合成した。 融点：１０８〜１０９℃ 図８に赤外線吸収スペクトル（ＩＲチャート）を示す。

【０１９５】実施例９ ４−ニトロフェニル ６−Ｏ−リシノレオイル−α−Ｄ
−グルコピラノシド

【０１９６】

【化８０】

【０１９７】ピリジン中、４−ニトロフェニル−α−Ｄ
−グルコピラノシドに２−クロロ−４−ニトロフェニル
リシノレエートを作用させ、実施例２と同様の方法で
合成した。 融点：高粘性オイル状 図９に赤外線吸収スペクトル（ＩＲチャート）を示す。

【０１９８】実施例１０ フェノールインド−３’−クロロフェニル ６−Ｏ−
９’，１０’−ジヒドロキシステアロイル−α−Ｄ−グ
ルコピラノシド

【０１９９】

【化８１】

【０２００】実施例１に準じて、ピリジン中、フェノー
ルインド−３’−クロロフェニル−α−Ｄ−グルコピラ
ノシドに２−クロロ−４−ニトロフェニル ９，１０−
ジヒドロキシステアレートを作用させることにより合成
できる。

【０２０１】実施例１１ ３，４−ジニトロフェニル ６−Ｏ−９’，１０’−ジ
ヒドロキシステアロイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【０２０２】

【化８２】

【０２０３】実施例１に準じて、ピリジン中、３，４−
ジニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドに２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル ９，１０−ジヒドロキシス
テアレートを作用させることにより合成できる。

【０２０４】実施例１２ ソジオ−３，３′−ジクロロフェノールスルホンフタレ
イニル ６−Ｏ−１２′−ヒドロキシステアロイル−β
−Ｄ−グルコピラノシド

【０２０５】

【化８３】

【０２０６】実施例２に準じて、ピリジン中、ソジオ−
３，３′−ジクロロフェノールスルホンフタレイニル−
β−Ｄ−グルコピラノシドに２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル １２−ヒドロキシステアレートを作用させるこ
とにより合成できる。

【０２０７】実施例１３ ２−フルオロ−４−（２’−ニトロビニル）フェニル
６−Ｏ−リシノレオイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【０２０８】

【化８４】

【０２０９】実施例２に準じて、ピリジン中、２−フル
オロ−４−（２’−ニトロビニル）フェニル−β−Ｄ−
グルコピラノシドに２−クロロ−４−ニトロフェニル
リシノレエートを作用させることにより合成できる。

【０２１０】実施例１４ レザズリニル ６−Ｏ−９’，１０’−ジヒドロキシス
テアロイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【０２１１】

【化８５】

【０２１２】実施例１に準じて、ピリジン中、レザズリ
ニル−β−Ｄ−グルコピラノシドに２−クロロ−４−ニ
トロフェニル ９，１０−ジヒドロキシステアレートを
作用させることにより合成できる。

【０２１３】実施例１５ ソジオ−４−（４’−ニトロ−２’−スルホフェニルア
ゾ）−１−ナフチル ６−Ｏ−１２’−ヒドロキシステ
アロイル−β−Ｄ−グルコピラノシド

【０２１４】

【化８６】

【０２１５】実施例２に準じて、ピリジン中、ソジオ−
４−（４’−ニトロ−２’−スルホフェニルアゾ）−１
−ナフチル−β−Ｄ−グルコピラノシドに２−クロロ−
４−ニトロフェニル １２−ヒドロキシステアレートを
作用させることにより合成できる。

【０２１６】実施例１６ 下記組成の試薬を調製し、リパーゼ活性を測定した。 ・トリスバッファー（ｐＨ８．０） ５０ｍＭ ・ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．２％ ・デオキシコール酸ナトリウム ２ｍＭ ・α−グルコシダーゼ １６０Ｕ／ｍｌ ・塩化カルシウム １ｍＭ ・塩化ナトリウム ４０ｍＭ ・塩化マグネシウム ２ｍＭ ・３−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ− ３ｍＭ ９’，１０’−ジヒドロキシステアロイル−α −グルコシド 上記試薬液３．０ｍｌを３７℃に予備加温する。（１）
試薬液に膵リパーゼ試薬（フナコシ製）１００μｌを加
えて混合するものと、（２）試薬液に血清試薬（ファル
マシア製）１００μｌを加えて混合するもの、それぞれ
について３７℃で４００ｎｍにおける吸光度変化を連続
的に測定し、１分間あたりの吸光度変化量（リパーゼ活
性の指標となる）を求めた。ブランクとして、試料の代
わりに水を１００μｌを用いた。結果を以下に示す。 ブランク変化 ０．００２ 膵リパーゼ ０．０４２ 血清 ０．０２７ また上記組成試薬液３．０ｍｌを３７℃に予備加温し、
（１）試薬液にカルボキシエステラーゼ（ベーリンガー
・マンハイム社）試料１００μｌを加えて混合するもの
と、（２）試薬液にコリンエステラーゼ（コスモ・バイ
オ社）試料１００μｌを加えて混合するもの、それぞれ
について３７℃で４００ｎｍにおける吸光度変化を連続
的に測定し、１分間あたりの吸光度変化量を求めた。ブ
ランクとして、試料の代わりに水１００μｌを用いた。
以下に示すようにエステラーゼもコリンエステラーゼも
ほとんど作用しなかった。 ブランク変化 ０．００２ カルボキシエステラーゼ ０．００３ コリンエステラーゼ ０．００４

【０２１７】実施例１７ 下記組成の試薬を調製し、リパーゼ活性を測定した。 ・トリスバッファー（ｐＨ８．０） ５０ｍＭ ・ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．２％ ・デオキシコール酸ナトリウム ２ｍＭ ・β−グルコシダーゼ １５０Ｕ／ｍｌ ・塩化カルシウム １ｍＭ ・塩化ナトリウム ４０ｍＭ ・塩化マグネシウム ２ｍＭ ・２−フルオロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ− ２ｍＭ １２’−ヒドロキシステアロイル−β−グルコシド 上記試薬を用いて実施例１６と同様の操作を行った。結
果を以下に示す。 ブランク変化 ０．００２ 膵リパーゼ ０．０３０ 血清 ０．０１９

【０２１８】比較例１ 特公平６−７６４３１号公報記載の方法により、２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−ステアロイル−β
−グルコシドを合成した。以下にその方法を簡単に示
す。２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−グルコシド
１ｇ、ステアリン酸ビニル２．７７ｇおよびリパーゼＢ
〔シュードモナス フラジ（Pseudomonasfragi)２２−
３９Ｂ由来〕９０ｍｇをアセトン１３０ｍｌに懸濁さ
せ、２４〜２６℃で攪拌下４８時間反応を行った。酵素
を濾過により除き、反応液を濃縮し、シリカゲルカラム
クロマトグラフィー（酢酸エチル）により精製すると、
２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−ステアロイ
ル−β−グルコシドの白色結晶が１．１３ｇ得られた。
収率６３％。融点７４〜７６℃。実施例１６および実施
例１７に用いた試薬液への溶解性を調べたが、該化合物
は１ｍＭ程度しか溶解しなかった。 ・トリスバッファー（ｐＨ８．０） ５０ｍＭ ・ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．２％ ・デオキシコール酸ナトリウム ２ｍＭ ・塩化カルシウム １ｍＭ ・塩化ナトリウム ４０ｍＭ ・塩化マグネシウム ２ｍＭ ・β−グルコシダーゼ １２０Ｕ／ｍｌ ・２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ− １ｍＭ ステアロイル−β−グルコシド 上記試薬を用い実施例１６と同様の操作を行った。結果
を以下に示す。 ブランク変化 ０．００２ 膵リパーゼ ０．０１４ 血清 ０．００９

【０２１９】比較例２ 特公平６−７６４３１号公報記載の方法により、２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−ステアロイル−β
−マルトシドを合成した。以下にその方法を簡単に示
す。２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルトシド
１ｇ、ステアリン酸ビニル１．８７ｇおよびリパーゼＢ
〔シュードモナス フラジ（Pseudomonasfragi)２２−
３９Ｂ由来〕６０ｍｇをアセトン１００ｍｌに懸濁さ
せ、２４〜２６℃で攪拌下４８時間反応を行った。酵素
を濾過により除き、反応液を濃縮し、シリカゲルカラム
クロマトグラフィー（１０％メタノール−酢酸エチル）
により精製すると２−クロロ−４−ニトロフェニル ６
−Ｏ−ステアロイル−β−マルトシドの白色結晶が０．
７２ｇ得られた。収率４７％。融点１０６〜１０７℃。

【０２２０】 ・トリスバッファー（ｐＨ８．０） ５０ｍＭ ・ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．２％ ・デオキシコール酸ナトリウム ２ｍＭ ・塩化カルシウム １ｍＭ ・塩化ナトリウム ４０ｍＭ ・塩化マグネシウム ２ｍＭ ・α−グルコシダーゼ １６０Ｕ／ｍｌ ・グルコアミラーゼ １５Ｕ／ｍｌ ・β−グルコシダーゼ １８０Ｕ／ｍｌ ・２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ− ３ｍＭ ステアロイル−β−マルトシド 上記試薬を用いて、実施例１６と同様の操作を行った。
以下に示すようにリパーゼはほとんど作用しなかった。 ブランク変化 ０．００１ 膵リパーゼ ０．００３ 血清 ０．００２

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で合成した３−フルオロ−４−ニトロ
フェニル ６−Ｏ−９′，１０′−ジヒドロキシステア
ロイル−α−Ｄ−グルコピラノシドの赤外線吸収スペク
トル（ＩＲチャート）である。

【図２】実施例２で合成した２−フルオロ−４−ニトロ
フェニル ６−Ｏ−１２′−ヒドロキシステアロイル−
β−Ｄ−グルコピラノシドの赤外線吸収スペクトル（Ｉ
Ｒチャート）である。

【図３】実施例３で合成した４−ニトロフェニル ６−
Ｏ−９′，１０′−ジヒドロキシステアロイル−α−Ｄ
−グルコピラノシドの赤外線吸収スペクトル（ＩＲチャ
ート）である。

【図４】実施例４で合成した３−フルオロ−４−ニトロ
フェニル ６−Ｏ−９′，１０′−ジヒドロキシステア
ロイル−β−Ｄ−グルコピラノシドの赤外線吸収スペク
トル（ＩＲチャート）である。

【図５】実施例５で合成した２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル ６−Ｏ−１６′−ヒドロキシパルミトイル−α
−Ｄ−グルコピラノシドの赤外線吸収スペクトル（ＩＲ
チャート）である。

【図６】実施例６で合成した４−ニトロフェニル ６−
Ｏ−１６′−ヒドロキシパルミトイル−β−Ｄ−グルコ
ピラノシドの赤外線吸収スペクトル（ＩＲチャート）で
ある。

【図７】実施例７で合成した３−フルオロ−４−ニトロ
フェニル ６−Ｏ−１２′−ヒドロキシステアロイル−
α−Ｄ−グルコピラノシドの赤外線吸収スペクトル（Ｉ
Ｒチャート）である。

【図８】実施例８で合成した４−ニトロフェニル ６−
Ｏ−１２′−ヒドロキシステアロイル−α−Ｄ−グルコ
ピラノシドの赤外線吸収スペクトル（ＩＲチャート）で
ある。

【図９】実施例９で合成した４−ニトロフェニル ６−
Ｏ−リシノレオイル−α−Ｄ−グルコピラノシドの赤外
線吸収スペクトル（ＩＲチャート）である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ¹ は炭素数１２以上３０以下のヒドロキシ脂
   肪酸エステル残基を示し、Ｒ² は置換フェノキシ基を示
   し、波線はαまたはβ結合を示す）で表される糖誘導
   体。
2. 【請求項２】 フェニルグリコシド誘導体のグルコース
   部分の６位の水酸基のみをエステル化させることからな
   る請求項１に記載の糖誘導体の製造法。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の糖誘導体を基質として
   含有するリパーゼ活性測定用試薬。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のリパーゼ活性測定用試
   薬を用いるリパーゼ活性測定方法。