JPH1066596A - 浸透物質の使用 - Google Patents
浸透物質の使用Info
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- JPH1066596A JPH1066596A JP9133370A JP13337097A JPH1066596A JP H1066596 A JPH1066596 A JP H1066596A JP 9133370 A JP9133370 A JP 9133370A JP 13337097 A JP13337097 A JP 13337097A JP H1066596 A JPH1066596 A JP H1066596A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
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Abstract
の望ましくない相互作用を低減または阻害するシステム
を開発する。 【解決手段】 シリコン粒子存在下PCR反応が阻害さ
れることが示されていたが、本発明は、このようなシリ
コンなどの非活性表面に対する生物分子の非共有相互作
用を低減または阻害するための浸透物質の使用に関す
る。浸透物質としては、両性イオン浸透物質、グリシン
ベタインなどを利用することができる。
Description
る生物分子の非共有結合相互作用(non-covalentintera
ctions)を低減または阻害するための浸透物質の使用法
に関する。さらに、本発明は、本発明による使用法に用
いることのできるキットに関する。
において大きな影響を与えている。例えば、過去の例と
しては、シリコン、ガリウム亜ヒ酸塩、または多結晶物
質などの導入は半導体技術に根強く浸透した。現代生物
学においても、同様の開発が認められている。すなわ
ち、過去20年にわたり、ELISAなどの免疫計量
(immunometric)法において、実験プロトコルの基準化
及び実験結果のおける物質に基づく誤差率の最小化を実
現する物質が確立された。また、これと同様に重要な別
の開発としては、対象となる生物学的化合物を純化及び
分離するために(カラム)クロマトグラフィーにおいて
用いられる新規の担体物質の促進がある。
て科学者が直面する主な問題の一つとして、実験の精度
及び生産収量が、背景問題または望ましくない可能性の
ある不特定相互作用の問題によって損なわれるという問
題がある。かかる問題は、例えば、担体表面に対するタ
ンパク質または他の生物学的な化合物の非共有結合によ
り発生しうる。ELISA技術においてかかる問題を解
決するためには、問題の化合物をテストする前に、ポリ
スチロール(polystyrrol)などの担体物質の自由結合
サイトを異種構造タンパク質などの関連のない生物物質
に対して「遮断」する。
術は、PCR技術である。当然ながら、PCRの幅広い
適用性に鑑み、この技術の様々な側面をさらに改良すべ
く多大な努力が現在までも、また現在でも行われてい
る。これらの開発の一つとして、微少化されたPCRチ
ップ、すなわち、PCR反応チャンバを形成するために
平坦なガラス片に結合された微少化生成シリコンチップ
の開発がある(例えば、Shoffner el al.,"Chip PCR.I.
Surface passivation of microfabricated silicon-gla
ss chips for PCR", Nucl. Acids Res. 24(1996), 375-
379参照のこと)。これまでPCRチップの製造に用い
られてきた天然シリコンがPCRの阻害剤であることが
判明した。そのために研究者たちはかかる阻害剤または
背景問題によって損なわれることのない信頼できるPC
Rの結果を得るための物質及び方法を調査し、その結
果、この目標達成のために酸化シリコン(SiO2)の
使用を提案した。
般的に商業上の利用が可能な表面を修正せずに、あるい
は適当な非活性表面のわずかな部分の使用のみに限定す
ることなく、非活性表面と生物分子の不特定あるいは非
共有相互作用を低減または削除する方法があれば、非常
に望ましく効果的である。このような手段の開発が成功
すれば、その使用はPCR技術に限定されることなく現
代生物学において幅広く適用できる。例えば 、Vol
kmuth及びAustinにより、DNA分子のmicr
o-electrophesis(微量電気泳動法)が開発された(Vol
kmuth and Austin, "DNA electrophoresis in microlit
hographic arrays", Nature 358(1992),600-602)参照の
こと)。このような技術は、ベタインなどの浸透物質を
緩衝システムに含むという点からも効果がある。
技術的課題は、上述の従来技術に関する問題を解決し、
非活性表面に対する生物分子の望ましくない相互作用を
低減または阻害するシステムを開発することである。
に、本発明は、非活性表面に対する生物分子の非共有相
互作用を低減または阻害するための浸透物質の使用法を
提供する。本発明によれば、適当な濃度の浸透物質を、
生物分子を含む溶液に加えることにより、前記表面に対
する前記分子の非共有結合相互作用が阻害されないまで
も低減されるという驚くべき効果が得られる。
応力を与えられた(water-stressed)多種の原核生物及
び真核生物有機体から得られる。ハロバクテリアを除く
これらすべての有機体において見られる浸透物質システ
ムの3つの種類は、多価アルコール(グリセロール及び
サッカロースなど)、遊離アミノ酸とそれらの誘導体
(タウリン及びβアラニンなど)、及びメチルアミン
(例えば、トリメチルアミンN酸化物(TMAO)、ベ
タイン、及びサルコシン)あるいはメチルアミンと尿素
との組み合わせである(Yancey et al., "Living with
water stress: evolution of osmolyte systems "Scien
ce 217 (1982), 1214-1222 参照のこと)。
質をかかる溶液に加えるだけで、多種にわたる非活性表
面に対する前記物質の相互作用を適当に低減または阻害
することができる。よって、特定の実験設定または実験
目的を得るために必要な表面を特別に設計もしくは選択
する必要がない。本発明によるさらなる効果として、以
前は困難であった様々な実験の設計を単純化できるた
め、関心のある研究者にとっては時間とコストの節減に
なる。
物分子」という用語は、有機体または生物細胞(living
cell)の一部である有機分子、またはかかる分子の誘
導体を意味する。これらの分子の起源は、天然でも合成
でも半合成でもよい。
t)」という用語は、「化学的反応能力を全くまたはわ
ずかしか持たない」という意味である。したがって、こ
の用語は、大気中において結合されない状態で発生する
窒素に関する「不活性の性質(inertness)」と同義で
ある。
いて、前記浸透物質は、両性イオン浸透物質である。
形態では、前記両性イオン浸透物質は、以下の構造式
(structural formula)を有する。
またはその他任意のアルキルであり、R’は任意のアミ
ノ酸残基である。
形態では、前記両性イオン浸透物質は、アミノ酸または
そのメチル化産物である。
実施形態では、前記両性イオン浸透物質は、ベタイン及
び好ましくはグリシンベタインである。
は、前記浸透物質は、1〜2.5Mの最終濃度で存在す
る。
が1M以下の濃度で反応混合物に含まれる場合に得られ
るが、浸透物質が1〜2.5Mの最終濃度で存在する場
合に、特に効果的な結果が得られる。
は、前記生物分子は、巨大分子(macromolecule)であ
る。
用語は、当該分野の技術者には明らかであり、ここで詳
細な説明は必要でない。
いては、前記巨大分子は、炭水化物、多核酸またはポリ
ペプチド、またはそれらの混合物または修飾物である。
前記混合物または修飾物は必ずしも生物学的な機能を持
つ必要はない。実際には、その生物学的機能については
(現在のところ)当該技術分野では知られていない(例
えば、ペプチド核酸についての議論(Nielsen et al. S
cience 254 (1991), 1497-1500)を参照のこと)。しか
しながら、前記修正された生物学的巨大分子は、誘導源
である生物学的巨大分子と本質的に同一の物理化学的特
性を有し、例えば分子生物学において同一または同様に
適用できる可能性がある。
は、前記生物分子は、ペプチドまたはオリゴヌクレオチ
ドまたはこれらの混合物または修飾物である。
多核酸またはオリゴヌクレオチドはDNAである。
は、いかなるタイプのDNA、特にcDNA及びゲノム
DNAを含む。
は、前記多核酸またはオリゴヌクレオチドは、RNAで
ある。
う用語は、いかなるタイプのRNAを含めることができ
るが、特にmRNAを意味する。
前記非活性表面はシリコン表面、シリコンウェーハ、ガ
ラス表面、またはこれらの混合物または化学的修飾物で
ある。
リコンであり、かかるシリコンは、例えば、フォトリソ
グラフィーなどの標準的な製造または処理技術によって
得ることができる。
定された浸透物質の濃縮保存溶液と、(b)前記のよう
に規定された浸透物質を含む反応緩衝調整剤と、(c)
前記のように規定された浸透物質を含む酵素調整剤と、
の少なくともいずれか一つを含むキットに関する。
しくは標準的な反応ガラス瓶(reaction vials)中で調
整され、互いに独立している。本発明のキットに含まれ
る保存溶液に使用される濃度は、本発明において効果を
発揮するよう浸透物質を適当に希釈するのに適した濃度
である。本発明の緩衝剤の実施形態(b)及び(c)に
おいては、浸透物質は好ましくは最終的な濃度で包含さ
れている。前記最終濃度の範囲及び限定は、上述の通り
である。
在下でのポリメレース連鎖反応(PCR) 本実施例では、核酸鋳型に依存したPCR反応における
純粋なシリコン表面等の非活性表面による阻害効果がベ
タインなどの浸透物質の存在により低減されることを示
す。なお、本実施例では、Sigma社から市販されて
いるグリシンベタインを用いた。
要な材料であるばかりでなく、生物分野においても重要
である。これはこの物質の取り扱いが容易であり、ま
た、三次元の微小構造を迅速に形成することができるこ
とに由来する。そのため、PCRを初めとして、純粋な
シリコンの存在下における種々の実験は、例えば、シリ
コン懸濁液を用いた生物学的プロセスの小型化モデルの
確立という観点から、将来大変重要となる。純粋なシリ
コンは、種々の原因より一般にPCRのような生物学的
プロセスを阻害することが知られている。これらの原因
の一つとして、例えば、微少な反応チャンバ内の極小さ
な容積に比して、かなり大きな表面と分子とが相互作用
を行うことが考えられる。
効果を試験するために、モデルシステムとして、破砕し
たシリコン粒子の存在下、M13ベクターに挿入された
1.2kbのヒト染色体DNAをPCRにより増幅する
実験を行った。
から5)または1Mベタイン溶液(図1、レーン6から
9)に懸濁された種々の量(10、50、75)のシリ
コン粒子、0.2μM以下配列を有する2種のプライマ
ー、100μM各dNTP、1.5mM MgCl2 及
び2.5ユニットTaqポリメレースを含有した1倍濃
度の緩衝液(10mM Tris−HCl,pH8.8
及び50mM KCl)に、1ngのM13DNAを懸
濁し、最終容量を50μlとしたものを準備した。上記
2種のプライマーの配列は、M13−40(24塩基)
が、5’−CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’であり、ま
た、M13−Rev(24塩基)が、5’−TTTCACACAG
GAAACAGCTATGAC-3’である。また、上記においてベタ
インを含有する反応液の場合には、必要な量の水と5M
ベタインの保存溶液とを混合し最終反応容量の50μl
に調整した。
0.5mm x 0.5mm x 0.3mmのものを
用いた。
Rを行った。PCRの条件は、94℃、20秒間(変
性)、55℃、30秒間(アニーリング)、73℃、2
分30秒間(伸長)とし、これを30サイクル繰り返し
た。反応後、5μlの反応液に2μlの電気泳動溶液
(70%グリセロール、0.02mg/mlブロモフェ
ノールブルー)を混合し、アガロースゲル上で電気泳動
を行った。尚、この際にサイズマーカとしてλ−Bst
EIIを前記ゲル上に同時に泳動した。
の各レーンには、以下のサンプルを泳動した。レーン
1:λ−BstEIIマーカ;レーン2から5:水及び
種々の量のシリコン粒子を用いてバッファ中で行ったP
CR(50μl);レーン2:10粒子;レーン3:5
0粒子;レーン4:75粒子;レーン5:対照粒子ゼ
ロ;レーン6から9:1Mのベタイン及び種々の量のシ
リコン粒子を用いてバッファ中で行ったPCR(50μ
l);レーン6:10粒子;レーン7:50粒子;レー
ン8:75粒子;レーン9:対照粒子ゼロ。
増加による阻害効果が、PCRバッファー中に添加され
た種々のモル濃度のベタインにおいて示された。
浸透物質の存在下でのPCRに対する影響 上述したShoffnerらにより、近年、PCR反応
へのシリコン粉末の阻害効果が示されている。本実施例
は、PCRの反応バッファー中に浸透物質、例えば両性
イオン浸透物質であるベタインを添加することにより、
上記阻害効果を効果的に低減させることができることを
示す。
ト染色体DNA由来の1.5kb断片が挿入されたM1
3ベクターを用いて行った。シリコンを含有するPCR
反応液は、4.6mgシリコン粉末(Sigma社、3
25メッシュ、純度99%、製品番号21561−9)
を最終容量として100μlに調整した。ここで純粋な
シリコン粉末の濃度は、前記Shoffnerらにより
示されたPCR反応を阻害する濃度とした。
整した。すなわち、1倍濃度の緩衝液(10mM Tr
is−HCl,pH8.8及び50mM KCl)、水
(図2、レーン2)あるいは4.6mgシリコン粉末を
含有する溶液(図2、レーン3から8)、1ngM13
DNA、0.3μM M13−40プライマーDNA
(24塩基、5’−CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-
3’)、0.3μM M13−RevプライマーDNA
(24塩基、5’−TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-
3’)、200μM各dNTP、1.5mM MgCl
2 及び10ユニットTaqポリメレースを、最終容量と
して100μlに調整したものを準備した。前記4.6
mgシリコン粉末を含有する溶液は、水(図2、レーン
3)、0.5Mベタイン溶液(図2、レーン4)、1M
ベタイン溶液(図2、レーン5)、2Mベタイン溶液
(図2、レーン6)を用いて調整した。また、上記にお
いてベタインを含有する反応液の場合には、必要な量の
水と5Mベタインの保存溶液とを混合して最終容量の1
00μlに調整した。
反応を行った。すなわち、PCRの条件は、94℃、2
0秒間(変性)、55℃、30秒間(アニーリング)、
73℃、2分30秒間(伸長)とし、これを30サイク
ル繰り返した。反応後、5μlの反応液に2μlの電気
泳動溶液(70%グリセロール、0.02mg/mlブ
ロモフェノールブルー)を混合し、アガロースゲル上で
電気泳動を行った。尚、この際にサイズマーカとしてλ
−BstEIIを前記ゲル上に同時に泳動した。
る各レーンには、以下のサンプルを泳動した。レーン
1:λ−BstEIIマーカ;レーン2:シリコン粉末
を包含しない標準的なPCRバッファ中で行ったPC
R;レーン3から6:100μlのPCR量において
4.6mgのシリコン粉末を用いて行ったPCR反応;
レーン3:水をベースにしたバッファ;レーン4;0.
5Mベタイン溶液;レーン5:1ベタイン溶液;レーン
6;2Mベタイン溶液。
いたPCRは、PCRを効果的かつ特定的に増幅し、シ
リコン表面の阻害効果を低減させることができることが
示された。
ことにより、非活性表面に対する生物分子の非共有結合
による相互作用を削減または破壊することができる。こ
の結果、種々の生物学的実験の効率を向上させることが
可能となる。
下におけるPCR産物を電気泳動した際のパターンを示
す図である。
下におけるPCR産物を電気泳動した際のパターンを示
す図である。
その他任意のアルキルであり、R’は任意のアミノ酸残
基である。
る生物分子の非共有結合相互作用(non-covalentintera
ctions)を低減または阻害するための浸透物質の使用法
に関する。さらに、本発明は、本発明による使用法に用
いることのできるキットに関する。
において大きな影響を与えている。例えば、過去の例と
しては、シリコン、ガリウム亜ヒ酸塩、または多結晶物
質などの導入は半導体技術に根強く浸透した。現代生物
学においても、同様の開発が認められている。すなわ
ち、過去20年にわたり、ELISAなどの免疫計量
(immunometric)法において、実験プロトコルの基準化
及び実験結果のおける物質に基づく誤差率の最小化を実
現する物質が確立された。また、これと同様に重要な別
の開発としては、対象となる生物学的化合物を純化及び
分離するために(カラム)クロマトグラフィーにおいて
用いられる新規の担体物質の促進がある。
て科学者が直面する主な問題の一つとして、実験の精度
及び生産収量が、背景問題または望ましくない可能性の
ある不特定相互作用の問題によって損なわれるという問
題がある。かかる問題は、例えば、担体表面に対するタ
ンパク質または他の生物学的な化合物の非共有結合によ
り発生しうる。ELISA技術においてかかる問題を解
決するためには、問題の化合物をテストする前に、ポリ
スチロール(polystyrrol)などの担体物質の自由結合
サイトを異種構造タンパク質などの関連のない生物物質
に対して「遮断」する。
術は、PCR技術である。当然ながら、PCRの幅広い
適用性に鑑み、この技術の様々な側面をさらに改良すべ
く多大な努力が現在までも、また現在でも行われてい
る。これらの開発の一つとして、微少化されたPCRチ
ップ、すなわち、PCR反応チャンバを形成するために
平坦なガラス片に結合された微少化生成シリコンチップ
の開発がある(例えば、Shoffner el al.,"Chip PCR.I.
Surface passivation of microfabricated silicon-gla
ss chips for PCR", Nucl. Acids Res. 24(1996), 375-
379参照のこと)。これまでPCRチップの製造に用い
られてきた天然シリコンがPCRの阻害剤であることが
判明した。そのために研究者たちはかかる阻害剤または
背景問題によって損なわれることのない信頼できるPC
Rの結果を得るための物質及び方法を調査し、その結
果、この目標達成のために酸化シリコン(SiO2)の
使用を提案した。
般的に商業上の利用が可能な表面を修正せずに、あるい
は適当な非活性表面のわずかな部分の使用のみに限定す
ることなく、非活性表面と生物分子の不特定あるいは非
共有相互作用を低減または削除する方法があれば、非常
に望ましく効果的である。このような手段の開発が成功
すれば、その使用はPCR技術に限定されることなく現
代生物学において幅広く適用できる。例えば 、Vol
kmuth及びAustinにより、DNA分子のmicr
o-electrophesis(微量電気泳動法)が開発された(Vol
kmuth and Austin, "DNA electrophoresis in microlit
hographic arrays", Nature 358(1992),600-602)参照の
こと)。このような技術は、ベタインなどの浸透物質を
緩衝システムに含むという点からも効果がある。
技術的課題は、上述の従来技術に関する問題を解決し、
非活性表面に対する生物分子の望ましくない相互作用を
低減または阻害するシステムを開発することである。
に、本発明は、非活性表面に対する生物分子の非共有相
互作用を低減または阻害するための浸透物質の使用法を
提供する。本発明によれば、適当な濃度の浸透物質を、
生物分子を含む溶液に加えることにより、前記表面に対
する前記分子の非共有結合相互作用が阻害されないまで
も低減されるという驚くべき効果が得られる。
応力を与えられた(water-stressed)多種の原核生物及
び真核生物有機体から得られる。ハロバクテリアを除く
これらすべての有機体において見られる浸透物質システ
ムの3つの種類は、多価アルコール(グリセロール及び
サッカロースなど)、遊離アミノ酸とそれらの誘導体
(タウリン及びβアラニンなど)、及びメチルアミン
(例えば、トリメチルアミンN酸化物(TMAO)、ベ
タイン、及びサルコシン)あるいはメチルアミンと尿素
との組み合わせである(Yancey et al., "Living with
water stress: evolution of osmolyte systems "Scien
ce 217 (1982), 1214-1222 参照のこと)。
質をかかる溶液に加えるだけで、多種にわたる非活性表
面に対する前記物質の相互作用を適当に低減または阻害
することができる。よって、特定の実験設定または実験
目的を得るために必要な表面を特別に設計もしくは選択
する必要がない。本発明によるさらなる効果として、以
前は困難であった様々な実験の設計を単純化できるた
め、関心のある研究者にとっては時間とコストの節減に
なる。
物分子」という用語は、有機体または生物細胞(living
cell)の一部である有機分子、またはかかる分子の誘
導体を意味する。これらの分子の起源は、天然でも合成
でも半合成でもよい。
t)」という用語は、「化学的反応能力を全くまたはわ
ずかしか持たない」という意味である。したがって、こ
の用語は、大気中において結合されない状態で発生する
窒素に関する「不活性の性質(inertness)」と同義で
ある。
いて、前記浸透物質は、両性イオン浸透物質である。
形態では、前記両性イオン浸透物質は、以下の構造式
(structural formula)を有する。
またはその他任意のアルキルであり、R’は任意のアミ
ノ酸残基である。
形態では、前記両性イオン浸透物質は、アミノ酸または
そのメチル化産物である。
実施形態では、前記両性イオン浸透物質は、ベタイン及
び好ましくはグリシンベタインである。
は、前記浸透物質は、1〜2.5Mの最終濃度で存在す
る。
が1M以下の濃度で反応混合物に含まれる場合に得られ
るが、浸透物質が1〜2.5Mの最終濃度で存在する場
合に、特に効果的な結果が得られる。
は、前記生物分子は、巨大分子(macromolecule)であ
る。
用語は、当該分野の技術者には明らかであり、ここで詳
細な説明は必要でない。
いては、前記巨大分子は、炭水化物、多核酸またはポリ
ペプチド、またはそれらの混合物または修飾物である。
前記混合物または修飾物は必ずしも生物学的な機能を持
つ必要はない。実際には、その生物学的機能については
(現在のところ)当該技術分野では知られていない(例
えば、ペプチド核酸についての議論(Nielsen et al. S
cience 254 (1991), 1497-1500)を参照のこと)。しか
しながら、前記修正された生物学的巨大分子は、誘導源
である生物学的巨大分子と本質的に同一の物理化学的特
性を有し、例えば分子生物学において同一または同様に
適用できる可能性がある。
は、前記生物分子は、ペプチドまたはオリゴヌクレオチ
ドまたはこれらの混合物または修飾物である。
多核酸またはオリゴヌクレオチドはDNAである。
は、いかなるタイプのDNA、特にcDNA及びゲノム
DNAを含む。
は、前記多核酸またはオリゴヌクレオチドは、RNAで
ある。
う用語は、いかなるタイプのRNAを含めることができ
るが、特にmRNAを意味する。
前記非活性表面はシリコン表面、シリコンウェーハ、ガ
ラス表面、またはこれらの混合物または化学的修飾物で
ある。
リコンであり、かかるシリコンは、例えば、フォトリソ
グラフィーなどの標準的な製造または処理技術によって
得ることができる。
定された浸透物質の濃縮保存溶液と、(b)前記のよう
に規定された浸透物質を含む反応緩衝調整剤と、(c)
前記のように規定された浸透物質を含む酵素調整剤と、
の少なくともいずれか一つを含むキットに関する。
しくは標準的な反応ガラス瓶(reaction vials)中で調
整され、互いに独立している。本発明のキットに含まれ
る保存溶液に使用される濃度は、本発明において効果を
発揮するよう浸透物質を適当に希釈するのに適した濃度
である。本発明の緩衝剤の実施形態(b)及び(c)に
おいては、浸透物質は好ましくは最終的な濃度で包含さ
れている。前記最終濃度の範囲及び限定は、上述の通り
である。
在下でのポリメレース連鎖反応(PCR) 本実施例では、核酸鋳型に依存したPCR反応における
純粋なシリコン表面等の非活性表面による阻害効果がベ
タインなどの浸透物質の存在により低減されることを示
す。なお、本実施例では、Sigma社から市販されて
いるグリシンベタインを用いた。
要な材料であるばかりでなく、生物分野においても重要
である。これはこの物質の取り扱いが容易であり、ま
た、三次元の微小構造を迅速に形成することができるこ
とに由来する。そのため、PCRを初めとして、純粋な
シリコンの存在下における種々の実験は、例えば、シリ
コン懸濁液を用いた生物学的プロセスの小型化モデルの
確立という観点から、将来大変重要となる。純粋なシリ
コンは、種々の原因より一般にPCRのような生物学的
プロセスを阻害することが知られている。これらの原因
の一つとして、例えば、微少な反応チャンバ内の極小さ
な容積に比して、かなり大きな表面と分子とが相互作用
を行うことが考えられる。
効果を試験するために、モデルシステムとして、破砕し
たシリコン粒子の存在下、M13ベクターに挿入された
1.2kbのヒト染色体DNAをPCRにより増幅する
実験を行った。
から5)または1Mベタイン溶液(図1、レーン6から
9)に懸濁された種々の量(10、50、75)のシリ
コン粒子、0.2μM以下配列を有する2種のプライマ
ー、100μM各dNTP、1.5mM MgCl2 及
び2.5ユニットTaqポリメレースを含有した1倍濃
度の緩衝液(10mM Tris−HCl,pH8.8
及び50mM KCl)に、1ngのM13DNAを懸
濁し、最終容量を50μlとしたものを準備した。上記
2種のプライマーの配列は、M13−40(24塩基)
が、5’−CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(配列番号
1)であり、また、M13−Rev(24塩基)が、
5’−TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’(配列番号2)
である。また、上記においてベタインを含有する反応液
の場合には、必要な量の水と5Mベタインの保存溶液と
を混合し最終反応容量の50μlに調整した。
0.5mm x 0.5mm x 0.3mmのものを
用いた。
Rを行った。PCRの条件は、94℃、20秒間(変
性)、55℃、30秒間(アニーリング)、73℃、2
分30秒間(伸長)とし、これを30サイクル繰り返し
た。反応後、5μlの反応液に2μlの電気泳動溶液
(70%グリセロール、0.02mg/mlブロモフェ
ノールブルー)を混合し、アガロースゲル上で電気泳動
を行った。尚、この際にサイズマーカとしてλ−Bst
EIIを前記ゲル上に同時に泳動した。
の各レーンには、以下のサンプルを泳動した。レーン
1:λ−BstEIIマーカ;レーン2から5:水及び
種々の量のシリコン粒子を用いてバッファ中で行ったP
CR(50μl);レーン2:10粒子;レーン3:5
0粒子;レーン4:75粒子;レーン5:対照粒子ゼ
ロ;レーン6から9:1Mのベタイン及び種々の量のシ
リコン粒子を用いてバッファ中で行ったPCR(50μ
l);レーン6:10粒子;レーン7:50粒子;レー
ン8:75粒子;レーン9:対照粒子ゼロ。
増加による阻害効果が、PCRバッファー中に添加され
た種々のモル濃度のベタインにおいて示された。
浸透物質の存在下でのPCRに対する影響 上述したShoffnerらにより、近年、PCR反応
へのシリコン粉末の阻害効果が示されている。本実施例
は、PCRの反応バッファー中に浸透物質、例えば両性
イオン浸透物質であるベタインを添加することにより、
上記阻害効果を効果的に低減させることができることを
示す。
ト染色体DNA由来の1.5kb断片が挿入されたM1
3ベクターを用いて行った。シリコンを含有するPCR
反応液は、4.6mgシリコン粉末(Sigma社、3
25メッシュ、純度99%、製品番号21561−9)
を最終容量として100μlに調整した。ここで純粋な
シリコン粉末の濃度は、前記Shoffnerらにより
示されたPCR反応を阻害する濃度とした。
整した。すなわち、1倍濃度の緩衝液(10mM Tr
is−HCl,pH8.8及び50mM KCl)、水
(図2、レーン2)あるいは4.6mgシリコン粉末を
含有する溶液(図2、レーン3から8)、1ngM13
DNA、0.3μM M13−40プライマーDNA
(24塩基、5’−CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’
(配列番号1))、0.3μM M13−Revプライ
マーDNA(24塩基、5’−TTTCACACAGGAAACAGCTATG
AC-3’(配列番号2))、200μM各dNTP、
1.5mM MgCl2 及び10ユニットTaqポリメ
レースを、最終容量として100μlに調整したものを
準備した。前記4.6mgシリコン粉末を含有する溶液
は、水(図2、レーン3)、0.5Mベタイン溶液(図
2、レーン4)、1Mベタイン溶液(図2、レーン
5)、2Mベタイン溶液(図2、レーン6)を用いて調
整した。また、上記においてベタインを含有する反応液
の場合には、必要な量の水と5Mベタインの保存溶液と
を混合して最終容量の100μlに調整した。
反応を行った。すなわち、PCRの条件は、94℃、2
0秒間(変性)、55℃、30秒間(アニーリング)、
73℃、2分30秒間(伸長)とし、これを30サイク
ル繰り返した。反応後、5μlの反応液に2μlの電気
泳動溶液(70%グリセロール、0.02mg/mlブ
ロモフェノールブルー)を混合し、アガロースゲル上で
電気泳動を行った。尚、この際にサイズマーカとしてλ
−BstEIIを前記ゲル上に同時に泳動した。
る各レーンには、以下のサンプルを泳動した。レーン
1:λ−BstEIIマーカ;レーン2:シリコン粉末
を包含しない標準的なPCRバッファ中で行ったPC
R;レーン3から6:100μlのPCR量において
4.6mgのシリコン粉末を用いて行ったPCR反応;
レーン3:水をベースにしたバッファ;レーン4;0.
5Mベタイン溶液;レーン5:1ベタイン溶液;レーン
6;2Mベタイン溶液。
いたPCRは、PCRを効果的かつ特定的に増幅し、シ
リコン表面の阻害効果を低減させることができることが
示された。
ことにより、非活性表面に対する生物分子の非共有結合
による相互作用を削減または破壊することができる。こ
の結果、種々の生物学的実験の効率を向上させることが
可能となる。
下におけるPCR産物を電気泳動した際のパターンを示
す図である。
下におけるPCR産物を電気泳動した際のパターンを示
す図である。
Claims (13)
- 【請求項1】 非活性表面に対する生物分子の非共有結
合による相互作用を削減または破壊するための浸透物質
の使用。 - 【請求項2】 前記浸透物質が両性イオン浸透物質であ
る請求項1に記載の浸透物質の使用。 - 【請求項3】 前記両性イオン浸透物質が以下の構造か
らなる請求項2に記載の浸透物質の使用。 【化1】 R1,R2およびR3はH(水素),CH3,C2H5または
その他任意のアルキルであり、R’は任意のアミノ酸残
基である。 - 【請求項4】 前記両性イオン浸透物質がアミノ酸また
はアミノ酸のメチル化産物である請求項3に記載の浸透
物質の使用。 - 【請求項5】 前記両性イオン浸透物質がグリシンベタ
インまたはその他のベタインである請求項3に記載の浸
透物質の使用。 - 【請求項6】 前記浸透物質が最終濃度として1から
2.5Mの濃度で存在する請求項1〜5のいずれかに記
載の浸透物質の使用。 - 【請求項7】 前記生物分子が巨大分子である請求項1
〜6のいずれかに記載の浸透物質の使用。 - 【請求項8】 巨大分子が炭水化物、ポリ核酸、ポリペ
プチド、これらの組み合わせ、またはこれらの修飾物で
ある請求項1〜6のいずれかに記載の浸透物質の使用。 - 【請求項9】 生物分子がペプチド、オリゴヌクレオチ
ド、これらの組み合わせ、またはこれらの修飾物質であ
る請求項1〜6のいずれかに記載の浸透物質の使用。 - 【請求項10】 前記ポリ核酸及び前記オリゴヌクレオ
チドがDNAである請求項8又は9に記載の浸透物質の
使用。 - 【請求項11】 前記ポリ核酸及び前記オリゴヌクレオ
チドがRNAである請求項8又は9に記載の浸透物質の
使用。 - 【請求項12】 非活性表面がシリコン表面、シリコン
ウェーハ、ガラス表面、これらの組み合わせまたはこれ
らの化学修飾物である請求項1〜11のいずれかに記載
の浸透物質の使用。 - 【請求項13】 上記請求項1〜12のいずれかに記載
された浸透物質の濃縮保存溶液と、 上記請求項1〜12のいずれかに記載された浸透物質を
含有する反応緩衝液調整物質と、 上記請求項1〜12のいずれかに記載された浸透物質を
含有した酵素調整物質と、を少なくとも含むキット。
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1997
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