DE4411588C1 - Puffer für DNA- und RNA-Polymerase-Reaktionen - Google Patents

Puffer für DNA- und RNA-Polymerase-Reaktionen

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Description

Die Erfindung betrifft einen Puffer für DNA- und RNA- Polymerase-Reaktionen, der Betain enthält, und die Ver­ wendung von Betain in DNA- und RNA-Polymerase-Reaktio­ nen, insbesondere in der spezifischen Polymerase-Ket­ ten-Reaktion und in der reversen Transkription von RNA in cDNA (RT).
Es ist bekannt, daß die in der Polymerase-Ketten-Reak­ tion verwendeten Puffer Tris-HCL, Tricin, Kaliumchlorid und Magnesiumchlorid beinhalten. Auch wurde der Zusatz von DMSO (Winship, P. R. et al., 1989, Nucl. Acids Res. 17, 1266) oder nicht-ionischen Detergenzien (Bachmann, B. et. al., 1990, Nucl. Acids Res. 18, 1309) vorge­ schlagen, um die DNA-Sequenzierungsreaktion zu verbes­ sern und Basenmißpaarungen zu vermeiden.
Hung et. al. beschreiben in Nucl. Acids Res. Vol. 18, No. 16, 4953 (1990) den Zusatz von Tetrameythylammoni­ umchlorid zu den üblichen PCR-Puffern, um die Spezifi­ tät der PCR zu erhöhen.
Um DNA-Moleküle mit mehr als 6 kbp zu amplifizieren, wird von M. R. Ponce et. al. in Nucl. Acids Res. Vol. 20, No. 3, 623 (1992) der Zusatz von Beta-Mercaptoetha­ nol, Gelatine und Thesit beschrieben.
Alle genannten PCR-Puffer weisen jedoch den Nachteil auf, daß durch die vorhandene Salzkonzentration die Am­ plifikation bestimmter DNA-Moleküle negativ beeinflußt werden kann. Daneben sind Dimethylsulfoxid und Tetramethylammoniumchlorid toxisch.
Es wurde nun gefunden, daß Puffer, die N, N, N-Trime­ thylglycin (Betain) und keine Kalium-, Ammonium- oder Tetraalkylammoniumionen enthalten, sehr gut für spezifische Polymerase-Ketten-Reaktionen geeignet sind.
Die Konzentration von Betain im erfindungsgemäßen Puf­ fer kann 200 bis 1000 mM betragen. So hat sich zum Bei­ spiel bei der spezifischen PCR von HLA-Antigenen ge­ zeigt, daß eine Zusammensetzung des Puffers aus 500 bis 800 mM Betain und 1 bis 6 mM Magnesiumchlorid optimal ist. Insbesondere enthält der Puffer zur spezifischen Amplifikation von HLA-B-Allelen 500 bis 800 mM Betain, 1 bis 6 mM Magnesiumchlorid, 8 bis 12 mM N-Tris(hydro­ xymethyl)methylglycin mit pH 8,3 und 93 bis 106 µg/ml BSA V. Dabei wird die PCR eines Fragmentes des HLA-B-Gens enthaltend Sequenzen von Exon 2 bis Exon 3 wie zum Beispiel von B 27, B27-Subtypen, B 12, B 44, B 45, B 7, BW 22, B 13, B 14, B 18, B 73, B 41, B*4001 oder B 42 mit 2 Allel-spezifischen Oligo­ desoxynukleotid-Primern durchgeführt, die am 3′-Ende in den drei letzten Nukleotiden mit der gesuchten Allelsequenz übereinstimmen und in der übrigen Sequenz zu mindestens 80% mit der Allelsequenz homolog sind.
Überraschend wurde auch gefunden, daß Betain-enthal­ tende Puffer für die reverse Transkription von RNA in cDNA sehr gut geeignet sind. Ein positiver Einfluß auf die reverse Transkription von sekundärstrukturreicher RNA wurde festgestellt.
Insbesondere können die erfindungsgemäßen Puffer für die reverse Transkription von RNA in cDNA unter Verwen­ dung eines Oligo-dT-Primers und von M-MLV reverser Transkriptase bis zu 3 M Betain und ggf. auch Kaliumchlorid enthalten. Die Aktivität der reversen Transkriptase wird, wie auch die Aktivität der Taq- Polymerase, durch Betain nicht merklich beeinträchtigt.
Vorzugsweise enthält ein erfindungsgemäßer Puffer zur reversen Transkription von RNA in cDNA zum Beispiel un­ ter Verwendung von Oligodesoxythymidin ((dT)12-18) und M-MLV reverser Transkriptase 1 bis 3 M Betain, 60 bis 75 mM Kaliumchlorid und 1 bis 6 mM Magnesiumchlorid.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann der Puffer zur reversen Transkription von RNA in cDNA auch 1 bis 3 M Betain, 20 bis 75 mM Kalium- oder Ammoniumionen und 1 bis 10 mM Magnesiumionen enthalten.
Zusammenfassend ist festzustellen, daß Betain eine Reihe von Vorteilen herkömmlicher, bisher in der PCR- und reversen Transkription verwendeten Kosolventien kombiniert:
Es ist chemisch inert und nicht-ionisch, d. h. es kann mit einer Anzahl anderer Kosolvenzien und Salzen kombiniert werden, um optimale Reaktionsbedingungen für die jeweiligen Primer und Template zu schaffen.
Daneben erleichtert es die Transkription GC-reicher Domänen. Da nur GC-Basenpaare destabilisiert werden, können Primer so gewählt werden, daß ihre Hybridi­ sierung mit der Zielsequenz möglichst wenig beeinträchtigt wird.
Allgemeine Destabilisierung von dsDNA, z. B. durch Glycerin, Dimethylsulfoxid oder Formamid setzt auch die Hybridisierungstemperatur der Primer herab und hat damit sowohl positive wie negative Auswirkungen auf die Ausbeute von DNA-Polymerase-Reaktionen. Betain ist unter den nicht-ionischen Kosolvenzien einzigartig in seiner Eigenschaft, AT-Basenpaare zu binden und dadurch zu stabilisieren. Da nicht-ionische Kosolvenzien allgemein dsDNA destabilisieren, erfolgt in Anwesenheit von Betain insgesamt eine spezifische Destabilisierung GC-reicher Domänen in DNA und RNA. Betain ist jedoch erheblich billiger als Deoxyguanidin-Analoge wie sie zu diesem Zweck in Sequenzierung und PCR erfolgreich ein­ gesetzt wurden und kann außerdem auch in der RT verwendet werden. AT-reiche Primer wie z. B. (dT)12-18 in der RT werden jedoch weniger beeinflußt als GC- reiche Domänen im Templat.
Magnesiumchlorid ist ein essentieller Kofaktor für DNA- Polymerasen, jedoch hängt die optimale Konzentration in der PCR stark von den jeweiligen Primern oder Templaten ab. In Gegenwart von Betain erweitert sich dieser optimale Bereich, wodurch sich die Optimierung, insbesondere von Koamplifikationen ("Multiplex-PCR"), vereinfacht.
Desweiteren ist bekannt, daß sowohl NaCl als auch Heparin als Verunreinigungen in DNA-Proben auftreten können. So hat Heparin in Konzentrationen zwischen 2,5 · 10-4 - 10-3 U/µl ähnliche Effekte wie NaCl. Im Stand der Technik wurde deshalb Heparinase-Verdau oder Vorbehandlung Heparin-enthaltender DNA mit Chelex 100 vorgeschlagen (Francesca Poli, Rosa Catteano, Loretta Crespiatico, Angelea Nocco und Girolamo Sirchia, PCR Methods and Applications, 1993, 2, 356-358).
Es wurde nun gefunden, daß die PCR-Ausbeuten, insbesondere von HLA-B, bei Heparin-enthaltenden DNA- Proben in Gegenwart von Betain deutlich verbessert werden können. Vorzugsweise zeigen sich diese Befunde bei Betainkonzentrationen von 500-800 mM. In Gegenwart von 0,8 M Betain werden bis zu 10fach höhere Heparin­ konzentrationen toleriert.
Betain macht also die Aufreinigung von Salz- oder Heparin-enthaltenden DNA-Proben weitgehend überflüssig, was vor allem in der routinemäßigen Untersuchung klinischer und forensischer Proben von Vorteil ist.
Daneben ist Betain ist im Gegensatz zu den Kosolvenzien DMSO, Formamid und Methyl-Quecksilberhydroxid ungiftig und ein natürlicher Schutz, den Zellen im Laufe der Evolution gegen thermische und ionische Denaturierung ihrer Proteine entwickelt haben.
Die Aktivität der Taq-Polymerase und der reversen Transkriptase wird durch Betain nicht merklich beeinträchtigt.
Die Erfindung soll nachstehend durch Ausführungsbei­ spiele näher erläutert werden:
Ausführungsbeispiele 1. Polymerase-Ketten-Reaktion von HLA-B-Allelen a) Reaktionsansatz
Die Amplifikationen werden in DNA-Thermocyclern (z. B. dem DNA-Thermocycler 480 der Firma Perkin-Elmer-Cetus) in 500 µl"Eppendorf"-Reaktionsgefäßen durchgeführt. DNA wird durch Verdauung von zu untersuchenden Proben mit Proteinase K und nachfolgende Phenol/Chloroform- Extraktion gewonnen. Zur Reaktion werden Mengen von 50 bis 1000 ng in einem 20 µl Reaktionsvolumen eingesetzt.
Der Ansatz enthält außerdem:
10 mM N-Tris(hydroxymethyl)methylglycin, pH 8,3 bei 20°C (Tricin)
100 µg/ml Rinder-Serumalbumin (BSA V)
0,2 mM je Nukleotidtriphosphat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
3 ng/µl je Primer
0,025 U/µl Taq-Polymerase
mit TNFβ als Kontrolle:
600 mM N,N,N-Trimethylglycin (Betain)
  3 mM Magnesiumchlorid
mit Genen XA/XB als Kontrolle:
800 mM N,N,N-Trimethylglycin (Betain)
  4 mM Magnesiumchlorid
b) Temperaturschritte
Die PCR-Programme werden in folgenden Temperaturschritten durchgeführt:
Erfindungsgemäß erweisen sich in Gegenwart von Betain Hybridisierungstemperaturen, die ca. 10°C niedriger liegen als die theoretische Denaturierungstemperatur der Primer, und MgCl₂-Konzentrationen zwischen 3 und 4 mM als vorteilhaft.
c) Detektion
Erfolgreiche Amplifikation der internen Kontrolle und gegebenenfalls eines allelspezifischen HLA-B-Fragments wird durch Elektrophorese in einem 1,5%-igen Agarosegel, 0,5x TBE-Puffer geprüft. DNA-Banden werden durch Anfärbung mit Ethidiumbromid und Fluoreszenz unter einer UV-Lampe sichtbar gemacht. Die Länge der erhaltenen PCR-Produkte ist eine Kontrolle für die Spezifität der PCR für HLA-B.
d) Ergebnisse
HLA-B27, B 7, B 8, B 41, B 42, B 60, B 61 und B 73 wurden unter obigen Bedingungen erfolgreich amplifiziert. Die Spezifität der HLA-B PCR wurde mit Hilfe der folgenden Standard-Zellinien getestet:
Positive Kontrollen waren
  • a) für B27 und seine Subtypen: HOM2, JESTHOM, WT24, LS40 sowie die nicht-standartisierten Linien LH, NW, R69 und Wewak,
  • b) für B60 (B*40012): SLE, MADURA, MT14B, PE117, BRU, RLO, LS40 (B27/B60)
  • c) für B7: HHKB, SAVC, LD2B, R69 (B7/B27)
  • d) für B8: VAVY, LH (B8/B27)
  • e) für B42: RSH
  • f) für B41: RLO (B38/B41)
  • g) für B61 (B*4002) : SWEIG
Als Negativkontrolle dienten außerdem zahlreiche weitere, für die häufigsten HLA-B-Allele repräsentative, Standardlinien oder Linien, deren Allelsequenz zu einem der beiden verwendeten Primern vollständig komplementär war (z. B. B14 und B16 mit B7CREG1 in der B27-PCR).
Von 50 sowohl serologisch als auch mit Hilfe der PCR auf HLA-B27 untersuchten Spendern wurde in 43 Fällen positive Übereinstimmung zwischen beiden Tests und in 6 Fällen negative Übereinstimmung gefunden. Eine Probe eines Patienten mit Bechterev war serologisch B27- negativ und positiv anhand des PCR-Ergebnisses. Einmal wurde kein PCR-Produkt von einem serologisch positiven gesunden Spender erhalten. Die Spezifität der PCR- Produkte wurde weiterhin durch Gelelektrophorese (Groesse) und in den Amplifikationsprodukten von 22 verschiedenen vollständig HLA-B typisierten B27- heterozygoten Proben durch Verdau mit Restriktionsenzymen bestätigt.
Unspezifische (Co-)Amplifikationen wurden unter den obigen Bedingungen nicht beobachtet.
Um den Einfluß von Tetramethylammoniumchlorid, Betain und NaCl auf die Amplifikation von B7, B8 und B27 zu untersuchen wurden vier Puffer enthaltend 50 mM KCl und 1,5 mM MgCl₂ getestet: zwei handelsübliche (Boehringer Mannheim, Promega) mit Tris sowie zwei eigene mit Tris oder Tricine.
Es zeigte sich, daß 50 mM KCl sowie geringe Verunreinigungen mit 5-10 mM NaCl (final) die PCR der HLA-B-Allele der internen Kontrollen erst bei 70 mM NaCl-Konzentrationen behindern. Verbesserte Ampli­ fikation wird jedoch in Gegenwart von 50 mM TMACl erzielt und optimale PCR von HLA-B7, B8 und B27 bei 0,6-1,0 M Betain- und 2,5-4 mM MgCl₂-Konzentrationen. Oberhalb dieser Grenzen wirkt Betain inhibierend auf eine PCR mit den oben genannten Primern. Während die Amplifikation der internen Kontrollen in Abwesenheit isostabilisierender Substanzen robuster als die HLA-B PCR ist, kehrt sich dieses Verhältnis in Gegenwart von Betain und TMACl um.
2. Reverse Transkription mit M-MLV reverser Transkriptase a) Reaktionsansatz
3,0 M N,N,N-Trimethylglycin (Betain)
50 mM Tris(Hydroxymethyl)Aminomethan (Tris) pH 8,3 bei 20°C
75 mM KCl
3 mM MgCl₂
10 mM 1,4 Dithio-Threitol (DTT)
400 mM je Nukleotidtriphosphat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
100 mM Oligodesoxythymidin ((dT)12-18)
10 U/41 Murine Moloney-Leukaemie-Virus reverse Transkriptase (M-MLV) (Hersteller: GIBCO BRL)
RNA von ca. 2 × 10⁵ Blutzellen wird durch Guanidin-Iso­ thiocyanat/Phenolextraktion gewonnen und in destillier­ tem Wasser gelöst.
Vordenaturierung geschieht in Gegenwart von Oligo­ desoxythymidin für 10 Minuten bei 65°C. Dann werden die übrigen Reagenzien zugefügt und für 60 Minuten bei 37°C, 43°C oder 51°C inkubiert.
Die erhaltene cDNA wird durch semiquantitative PCR der T-Zellrezeptorgene V-beta8, V-beta20 und C-alpha geschätzt.
Es zeigte sich, daß Betain in Konzentrationen bis zu 3 M keinen sichtbaren Nachteil auf die cDNA-Ausbeute bei den üblichen Reaktionstemperaturen hat, jedoch den Vorteil, daß die erhöhte Temperatur von 51°C von M- MLV-reverser Transkriptase erheblich besser als in her­ kömmlichen RT-Puffern ohne Betain toleriert wird.

Claims (15)

1. Puffer für DNA- und RNA-Polymerase-Reaktionen, ent­ haltend Betain.
2. Puffer nach Anspruch 1 für die spezifische Polyme­ rase-Ketten-Reaktion (PCR), vorzugsweise für die PCR von Histokompatibilitäts-Antigenen (HLA).
3. Puffer nach Anspruch 1 oder 2 für die spezifische PCR von HLA-B-Allelen unter Verwendung von Taq- Polymerase.
4. Puffer nach einem der Ansprüche 2 oder 3, enthaltend 200-1000 mM Betain.
5. Puffer nach einem der Ansprüche 2 bis 4, enthaltend 200 bis 1000 mM Betain und 1 bis 6 mM Magnesium­ chlorid.
6. Puffer nach einem der Ansprüche 2 bis 5, enthaltend 500 bis 800 mM Betain, 1 bis 6 mM Magnesiumchlorid, 8 bis 12 mM N-Tris(hydroxymethyl)methylglycin mit pH 8,3 und 93 bis 106 µg/ml BSA V.
7. Puffer nach Anspruch 1 für die reverse Transkription von RNA in cDNA, vorzugsweise unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers und M-MLV reverser Transkriptase.
8. Puffer nach Anspruch 1 oder 7 für die reverse Transkription von RNA in cDNA unter Verwendung von Oligodesoxythymidin ((dT)12-18).
9. Puffer nach Anspruch 7 oder 8, enthaltend bis zu 3 M Betain.
10. Puffer nach einem der Ansprüche 7 bis 9, enthaltend 1 bis 3 M Betain, 20 bis 75 mM Kalium- oder Ammoniumionen und 1 bis 10 mM Magnesiumionen.
11. Puffer nach Anspruch 10, enthaltend 1 bis 3 M Betain, 60 bis 75 mM Kaliumchlorid und 1 bis 6 mM Magnesiumchlorid.
12. Verwendung von Betain für DNA- und RNA-Polymerase- Reaktionen.
13. Verwendung gemäß Anspruch 12 für die spezifische PCR, vorzugsweise für die PCR von Histokompatibili­ täts-Antigenen (HLA).
14. Verwendung gemäß Anspruch 12 oder 13 zur Amplifikation eines Fragmentes des HLA-B-Gens enthaltend Sequenzen von Exon 2 bis Exon 3.
15. Verwendung gemäß Anspruch 12 für die reverse Trans­ kription von RNA in cDNA, vorzugsweise unter Ver­ wendung eines Oligo-dT-Primers und M-MLV reverser Transkriptase.
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Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2733515A1 (fr) * 1995-04-27 1996-10-31 Cis Bio Int Tampon, procede et methode d'evaluation des conditions optimales, d'amplification de sequences cibles d'acide nucleique, et leurs applications
EP0742838A1 (de) * 1994-01-31 1996-11-20 The Regents Of The University Of California Methode zur eliminierung von sequentierartefakten
EP0808906A1 (de) * 1996-05-23 1997-11-26 COLPAN, Metin, Dr. Verwendung eines Osmolyten zur Verringerung von nichtkovalenten Bindungen biologischer Moleküle an inerten Oberflächen
EP0821059A2 (de) * 1996-07-25 1998-01-28 The Institute Of Physical & Chemical Research Verfahren für reverse Transkription
EP0828853A1 (de) * 1994-10-18 1998-03-18 Genzyme Corporation Verbessertes verfahren zur amplifikation von nukleotidsequenzen
WO1998048053A1 (en) * 1997-04-21 1998-10-29 Epicentre Technologies Corporation Reverse transcription method
WO1999046400A1 (en) 1998-03-13 1999-09-16 Life Technologies, Inc. Compositions and methods for enhanced synthesis of nucleic acid molecules
EP1002126A1 (de) * 1997-06-25 2000-05-24 Life Technologies, Inc. Verbessertes verfahren zur isolierung und wiedergewinnung von ziel-dna oder -rna molekülen mit einer gewünschten nukleotidsequenz
US6150094A (en) * 1996-05-23 2000-11-21 Qiagen Gmbh Use of an osmolyte for reducing or abolishing no-covalent interactions of biological molecules to inert surfaces
US6270962B1 (en) 1995-01-30 2001-08-07 The Regents Of The University Of California Methods for the elimination of DNA sequencing artifacts
DE10105208A1 (de) * 2001-02-06 2002-08-14 Ihf Inst Fuer Hormon Und Fortp Verfahren zur Herstellung von cDNA
WO2003014398A2 (en) * 2001-01-03 2003-02-20 Transgenomic, Inc. Methods and compositions for mutation detection by liquid chromatography
WO2004048596A2 (en) 2002-11-21 2004-06-10 Epicentre Technologies Methods for using primers that encode one strand of a double-stranded promoter
US6780588B2 (en) 2001-05-07 2004-08-24 Applera Corporation Methods for the reduction of stutter in microsatellite amplification
US6783940B2 (en) 2001-10-31 2004-08-31 Applera Corporation Method of reducing non-specific amplification in PCR
EP1452593A1 (de) * 2001-11-14 2004-09-01 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Dna-synthesepromotoren, mit dna-polymerase assoziierte faktoren und nutzung davon
US6841349B2 (en) 2001-05-07 2005-01-11 Applera Corporation Applied Biosystems Group Methods for the reduction of stutter in microsatellite amplification
EP1621638A1 (de) * 2003-05-07 2006-02-01 Takara Bio Inc. Verfahren zur analyse einer geneinfürungsstelle
GB2420560A (en) * 2004-11-30 2006-05-31 Bioline Ltd A method for increasing the specificity of enzymatic DNA synthesis
WO2009006438A2 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Epicentre Technologies Corporation Copy dna and sense rna
US7915450B2 (en) 1998-11-12 2011-03-29 Life Technologies Corporation Transfection reagents
US10195280B2 (en) 2014-07-15 2019-02-05 Life Technologies Corporation Compositions and methods for efficient delivery of molecules to cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rees. W.A.et.al., Biochemistry 32, 1993, 137-44 *

Cited By (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0742838A1 (de) * 1994-01-31 1996-11-20 The Regents Of The University Of California Methode zur eliminierung von sequentierartefakten
EP0742838A4 (de) * 1994-01-31 2000-01-05 Univ California Methode zur eliminierung von sequentierartefakten
EP0828853A4 (de) * 1994-10-18 1998-05-13 Genzyme Corp Verbessertes verfahren zur amplifikation von nukleotidsequenzen
EP0828853A1 (de) * 1994-10-18 1998-03-18 Genzyme Corporation Verbessertes verfahren zur amplifikation von nukleotidsequenzen
US6270962B1 (en) 1995-01-30 2001-08-07 The Regents Of The University Of California Methods for the elimination of DNA sequencing artifacts
FR2733515A1 (fr) * 1995-04-27 1996-10-31 Cis Bio Int Tampon, procede et methode d'evaluation des conditions optimales, d'amplification de sequences cibles d'acide nucleique, et leurs applications
US6150094A (en) * 1996-05-23 2000-11-21 Qiagen Gmbh Use of an osmolyte for reducing or abolishing no-covalent interactions of biological molecules to inert surfaces
EP0808906A1 (de) * 1996-05-23 1997-11-26 COLPAN, Metin, Dr. Verwendung eines Osmolyten zur Verringerung von nichtkovalenten Bindungen biologischer Moleküle an inerten Oberflächen
EP0821059A3 (de) * 1996-07-25 1998-04-22 The Institute Of Physical & Chemical Research Verfahren für reverse Transkription
EP1243661A1 (de) * 1996-07-25 2002-09-25 The Institute of Physical and Chemical Research Verfahren für reverse Transkription
EP0821059A2 (de) * 1996-07-25 1998-01-28 The Institute Of Physical & Chemical Research Verfahren für reverse Transkription
WO1998048053A1 (en) * 1997-04-21 1998-10-29 Epicentre Technologies Corporation Reverse transcription method
US6030814A (en) * 1997-04-21 2000-02-29 Epicentre Technologies Corporation Reverse transcription method
US6875568B2 (en) 1997-06-25 2005-04-05 Invitrogen Corporation Method for isolating and recovering target DNA or RNA molecules having a desired nucleotide sequence
EP1002126A1 (de) * 1997-06-25 2000-05-24 Life Technologies, Inc. Verbessertes verfahren zur isolierung und wiedergewinnung von ziel-dna oder -rna molekülen mit einer gewünschten nukleotidsequenz
EP1002126A4 (de) * 1997-06-25 2004-11-03 Life Technologies Inc Verbessertes verfahren zur isolierung und wiedergewinnung von ziel-dna oder -rna molekülen mit einer gewünschten nukleotidsequenz
US6268133B1 (en) 1997-06-25 2001-07-31 Invitrogen Corporation Method for isolating and recovering target DNA or RNA molecules having a desired nucleotide sequence
US6787305B1 (en) 1998-03-13 2004-09-07 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced synthesis of nucleic acid molecules
WO1999046400A1 (en) 1998-03-13 1999-09-16 Life Technologies, Inc. Compositions and methods for enhanced synthesis of nucleic acid molecules
EP1062360A4 (de) * 1998-03-13 2009-11-11 Life Technologies Corp Verbindungen und methoden zur vertäarkerrn nukleinsäuremolekül synthase
EP1062360A1 (de) * 1998-03-13 2000-12-27 Life Technologies, Inc. Verbindungen und methoden zur vertäarkerrn nukleinsäuremolekül synthase
US7344863B2 (en) 1998-03-13 2008-03-18 Invitrogen Corporation Methods for producing polypeptides through enhanced synthesis of encoding nucleic acid molecules
US8785200B2 (en) 1998-11-12 2014-07-22 Life Technologies Corporation Transfection reagents
US9358300B2 (en) 1998-11-12 2016-06-07 Life Technologies Corporation Transfection reagents
US8158827B2 (en) 1998-11-12 2012-04-17 Life Technologies Corporation Transfection reagents
US7915450B2 (en) 1998-11-12 2011-03-29 Life Technologies Corporation Transfection reagents
WO2003014398A2 (en) * 2001-01-03 2003-02-20 Transgenomic, Inc. Methods and compositions for mutation detection by liquid chromatography
WO2003014398A3 (en) * 2001-01-03 2003-07-10 Transgenomic Inc Methods and compositions for mutation detection by liquid chromatography
DE10105208A1 (de) * 2001-02-06 2002-08-14 Ihf Inst Fuer Hormon Und Fortp Verfahren zur Herstellung von cDNA
US6780588B2 (en) 2001-05-07 2004-08-24 Applera Corporation Methods for the reduction of stutter in microsatellite amplification
US6841349B2 (en) 2001-05-07 2005-01-11 Applera Corporation Applied Biosystems Group Methods for the reduction of stutter in microsatellite amplification
US8785126B2 (en) 2001-05-07 2014-07-22 Applied Biosystems, Llc Methods for the reduction of stutter in microsatellite amplification
US7211385B2 (en) 2001-05-07 2007-05-01 Applera Corporation Methods for the reduction of stutter microsatellite amplification
US6783940B2 (en) 2001-10-31 2004-08-31 Applera Corporation Method of reducing non-specific amplification in PCR
EP1452593A4 (de) * 2001-11-14 2005-11-30 Toyo Boseki Dna-synthesepromotoren, mit dna-polymerase assoziierte faktoren und nutzung davon
US7384739B2 (en) 2001-11-14 2008-06-10 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Compositions for enhancing DNA synthesis, DNA polymerase-related factors and utilization thereof
EP1452593A1 (de) * 2001-11-14 2004-09-01 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Dna-synthesepromotoren, mit dna-polymerase assoziierte faktoren und nutzung davon
WO2004048596A2 (en) 2002-11-21 2004-06-10 Epicentre Technologies Methods for using primers that encode one strand of a double-stranded promoter
JPWO2004099446A1 (ja) * 2003-05-07 2006-07-13 タカラバイオ株式会社 遺伝子導入部位の解析方法
EP1621638A1 (de) * 2003-05-07 2006-02-01 Takara Bio Inc. Verfahren zur analyse einer geneinfürungsstelle
JP4496166B2 (ja) * 2003-05-07 2010-07-07 タカラバイオ株式会社 遺伝子導入部位の解析方法
EP1621638A4 (de) * 2003-05-07 2007-05-09 Takara Bio Inc Verfahren zur analyse einer geneinfürungsstelle
GB2420560A (en) * 2004-11-30 2006-05-31 Bioline Ltd A method for increasing the specificity of enzymatic DNA synthesis
WO2009006438A2 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Epicentre Technologies Corporation Copy dna and sense rna
US10195280B2 (en) 2014-07-15 2019-02-05 Life Technologies Corporation Compositions and methods for efficient delivery of molecules to cells
US10792362B2 (en) 2014-07-15 2020-10-06 Life Technologies Corporation Compositions and methods for efficient delivery of molecules to cells
US11872285B2 (en) 2014-07-15 2024-01-16 Life Technologies Corporation Compositions and methods for efficient delivery of molecules to cells

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