JPH10512894A - ２’−ｏ−置換ピリミジンおよびそのオリゴマー化合物の合成の改良法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドおよびこれらのヌクレオシドを持つオリゴマー化合物合成のための改良法が開示される。本合成法はルイス酸存在下、弱い求核試薬による２，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドまたは２Ｓ，２’−アンヒドロビリミジンヌクレオシドのアルキル化を特色としている。

Description

【発明の詳細な説明】 ２’−Ｏ−置換ピリミジンおよびそのオリゴマー化合物の合成の改良法関連出願のクロスリファレンス 本出願は１９９５年３月６日に出願された米国特許出願第０８／３９８，９０ １号（代理人書類番号ＩＳＩＳ−０７１９としても同定される）の一部継続出願 である１９９５年６月７日に出願された米国特許出願第０８／４７５，４６７号 （代理人書類番号ＩＳＩＳ−１９６５としても同定される）の一部継続出願であ る。前記の特許出願の内容は本明細書において援用される。発明の技術分野 本発明は２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオチドおよびこれらのヌクレオチド を含むオリゴマー化合物の合成のための改良法に関する。本発明は２，２’−ア ンヒドロピリミジンヌクレオシドまたは２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌク レオシドを弱い求核試薬およびルイス酸で処理することを特徴としている。本方 法は現在使用されている方法と比較して経済的な利点を持ち、大規模合成に応用 できる。本発明はまた、糖の２’−Ｏ−位およびピリミジンの５位が修飾された 少なくとも一つの修飾ピリミジン単量体サブユニットを持つオリゴマー化合物を 特徴としている。本発明のオリゴマー化合物は核酸に対する増加した結合親和性 および増加したヌクレアーゼ耐性を示す。背景技術 ２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドはそれ自体オリゴヌクレオチドおよび 関連する化合物の製造に有用である。２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドは 例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖｉｒｇｉｎｉａの ような会社から市販品として購入可能であり、商業的商品と考えられる。本発明 は２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドの製造のための新規かつ有用な方法に 関している。 オリゴヌクレオチドおよびそれらの類似体は、分子生物学においてプローブ、 プライマー、リンカー、アダプターおよび遺伝子フラグメントとしての使用を含 む種々の使用のために開発されてきた。これらの方法で使用されるオリゴヌクレ オチドへの修飾には、フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリ性 ホスファターゼまたは他のレポーター分子のような非放射性標識による標識化が 含まれる。生じる類似体のヌクレアーゼ安定性を増加させるためにリボースリン 酸主鎖へも修飾がなされた。これらの修飾にはメチルホスホネート、ホスホロチ オエート、ホスホロジチオエート結合および２’−Ｏ−メチルリボース糖ユニッ トの使用が含まれる。他の修飾はオリゴヌクレオチドの取り込みおよび細胞分布 に関している。診断および治療の両方の使用におけるこれらのオリゴヌクレオチ ドの成功は改良されたオリゴヌクレオチド類似体に対するさらなる要望を創り出 した。 多細胞系生物体の身体状態のほとんどは（ほとんどの疾患状態を含む）蛋白質 により影響される。直接的に働くにしても、またはその酵素的またはその他の機 能を通して働くにせよ、そのような蛋白質は動物またはヒトにおける多くの疾患 および制御的機能に主な比率で寄与している。疾患状態に対して、古典的治療で は一般的にそのような蛋白質の疾患を引き起こすまたは疾患を悪くする機能を和 らげようとしてそのような蛋白質との相互作用に焦点が合わされてきた。より新 しい治療方法においては、そのような蛋白質の実際の産生を調節することが望ま れている。蛋白質の産生を妨害することにより、最小の副作用で最大の治療効果 が得られるであろう。そのような治療法の一般的な目的は、望まれない蛋白質形 成を導くであろう遺伝子発現を妨害、さもなくば調節することである。 特定の遺伝子発現を阻害する一つの方法はオリゴヌクレオチド、特に特定の標 的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列に相補的であるオリゴヌクレオチドの 使用である。そのような使用のため、いくつかのオリゴヌクレオチドが現在臨床 試験されている。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは現在種々の疾患状態 のためのヒト臨床試験におけるアンチセンス剤（抗ウイルス剤としての使用を含 む）として使用されている。 転写因子は転写の制御において二本鎖ＤＮＡと相互作用する。オリゴヌクレオ チドは転写因子の競合阻害剤として働き、転写因子の作用を調節することができ る。いくつかの最近の報告はそのような相互作用を記載している（Ｂｉｅｌｉｎ ｓｋａ，Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２５０，９９７−１０００；およ びＷｕ，Ｈ．ら、Ｇｅｎｅ，１９９０，８９，２０３−２０９を参照されたい） 。 蛋白質の間接的および直接的両方の制御に加え、オリゴヌクレオチドには例え ば、体液、組織、無傷の細胞または単離された細胞成分を含む材料の診断試験に おける使用もまた見いだされている。遺伝子発現阻害のように、診断応用は核酸 の相補鎖とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力を利用している。ハイ ブリダイゼーションとはＲＮＡまたはＤＮＡへのワトソン−クリックおよび／ま たはフーグスティーン塩基対によるオリゴヌクレオチドの配列特異的水素結合で ある。そのような塩基対の塩基はお互いに相補的であると言われている。 オリゴヌクレオチドはまた研究用試薬として広く使用されている。それらは生 物学的分子の機能を調べる研究、ならびに生物学的分子の調製において特に有用 である。例えば、ＰＣＲ反応におけるプライマーとしての天然および合成の両オ リゴヌクレオチドの使用は商業的製造工業の拡大をもたらした。ＰＣＲは商業的 および研究的実験室の大黒柱となっており、ＰＣＲの応用は増加してきた。例え ば、現在ＰＣＲ技術は法廷、古生物学、進化的研究および遺伝学的相談の分野で の使用がみられる。商業化は、ＰＣＲの応用において分子生物学の訓練を受けて いない人を助けるキットの開発を導いた。 オリゴヌクレオチドはまた他の実験室操作でも使用される。これらの使用のい くつかはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，第二版、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓs，１９８９；およびＣｕｒｒ ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｌｏｌｏｇｙ ，Ｆ ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎs，１９ ９３のような一般の実験室マニュアルに記載されている。そのような使用の代表 的なものは、合成オリゴヌクレオチドプローブ、抗体およびオリゴヌクレオチド によるスクリーニング発現ライブラリー、ＤＮＡシークエンシング、ポリメラー ゼ連鎖反応によるＤＮＡのインビトロ増幅およびクローン化ＤＮＡの部位特異的 突然変異誘発（上記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｌｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔ ｏ ｒｙ Ｍａｎｕａｌ のＢｏｏｋ２参照）およびＤＮＡ−蛋白質相互作用およびホ リメラーゼ連鎖反応（上記Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ の第２巻参照）である。 オリゴヌクレオチドは所望の使用に適合するように調整されたあつらえた特性 を持つように合成できる。従って、診断において、研究試薬としておよび治療物 質としてのそれらの有用性を増加させるために多数の化学修飾が導入された。そ れらの修飾には、標的鎖への結合性を高くするため（すなわち、それらの融解温 度、Ｔ_mを高くする）、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド−標的複 合体の同定を助けるため、細胞侵入を増加させるため、オリゴヌクレオチドの構 造または活性を分解または妨害するヌクレアーゼおよびその他の酵素に対して安 定化させるため、標的へ配列特異的結合した後の破壊（終了事象）の様式を提供 するため、およびオリゴヌクレオチドの薬動力学的特性を改良ずるために設計さ れた修飾が含まれる。 Ｇｉｂｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．、およびＢｅｎｋｏｖｉｃ，Ｓ．Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉ ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ，１９８７，１５，６４５５−６４６７はオ リゴヌクレオチド内へ取り込まれたフタルイミド保護５−（３−アミノプロピル ）−２’−デオキシウリジン ヌクレオシドプローブを報告している。 Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ ，１９８７，１５，４８５７−４８７６はオリゴヌクレオチド内へ取り 込まれたＣ−５置換デオキシウリジンを報告している。置換基はマスクされた一 級脂肪族アミノ基を有しており、これをさらに種々の基で置換することができる 。 １９９３年１月２２日に出願され、１９９４年８月４日に公開されたＰＣＴ出 願第ＷＯ９４／１７０９４号は５−置換ピリミジン（シトシンまたはウラシル） 塩基（ここで、５−置換基はＣ_3-14 ｎ−アルキル、Ｃ_2-8（Ｅ）−ｎ−１−ア ルケニル、エチニルまたはＣ_4-12 ｎ−１−アルキル基である）、および一つま たはそれ以上の修飾５−置換ピリミジン塩基を持つオリゴヌクレオチドの合成を 報告している。 １９９２年１１月２４日に出願され、１９９３年６月１０日に公開されたＰＣ Ｔ出願第ＷＯ９３／１０８２０号は５−（１−プロピニル）ウラシルおよび５− （１−プロピニル）シトシンまたは関連類似体、および一つまたはそれ以上の修 飾５−置換ピリミジン塩基を持つオリゴヌクレオチドの合成を報告している。 １９９２年１１月２４日出願されたＰＣＴ出願第ＷＯ９３／１０８２０号は塩 基の５’位へ結合された炭素原子のパイ結合連結を持つオリゴヌクレオチド内へ 取り込まれた２’−および５−置換ピリミジンヌクレオチドを報告している。発明の要約 本発明は核酸に対する改良された親和性を持ちおよび構造Ｉの単量体ユニット を少なくとも一つ持つオリゴマー化合物を提供する： ［式中： Ｘはヒドロキシルまたはアミノであり； ＲはハロまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルまたは置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキル（ここで該置換 はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルである ）であり； Ｌは酸素または硫黄であり； ＺはフルオロまたはＯ−Ｒ₁Ｘ₁（式中、Ｒ₁はＣ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₆−Ｃ₁₀ア リール、Ｃ₇−Ｃ₁₈アルカリールであり、およびＸ₁はＨ、ＮＨ₂またはイミダゾ ールである）であり；および Ｑ₁およびＱ₂の一つは共有結合でヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレ オシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該Ｑ₁およびＱ₂の他 方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、ヌクレオチド、オリ ゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴーヌクレオチド／ ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスファイトまたは ホスファイトである］。 本発明の一つの好適な態様において、Ｌは酸素である。別の態様において、Ｚ はＦである。 本発明のさらに別の態様において、オリゴマー化合物は約５から２００サブユ ニットの長さである。本発明のより好適な態様において、オリゴマー化合物は約 ５から５０サブユニットの長さである。さらにより好適な態様において、オリゴ マー化合物は約１０から２０サブユニットの長さである。 別の態様においては、オリゴマー化合物における本発明の単量体サブユニット とヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシド 間の共有結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェンホス ホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホス ポノチオエート、ホスポロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホロア ミデートから選択される。 本発明のさらに別の態様において、オリゴマー化合物は構造Ｉの複数の単量体 サブユニットを持つように製造される。好適な態様において、構造Ｉの複数の単 量体サブユニットを持つオリゴマー化合物は、前もって選択された場所に位置す る単量体サブユニットを持つように製造される。本発明の特別な態様に含まれて いるのは構造IIの単量体サブユニットを少なくとも一つ持つオリゴマー化合物で ある： ［式中： Ｘはヒドロキシルまたはアミノであり； ＲはハロまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルまたは置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキル（ここで該置換 はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルである ）であり； Ｌは酸素または硫黄であり；および Ｑ₁およびＱ₂の一つは連結残基を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、 ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該Ｑ₁および Ｑ₂の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、ヌクレオチ ド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴ−ヌクレ オチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスファイ トまたはホスファイトである］。 本発明の好適な態様において、ＬはＯである。 さらに別の態様において、本発明のオリゴマー化合物は約５から５０サブユニ ットの長さである。 別の態様において、オリゴマー化合物における本発明の単量体サブユニットと ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシド間 の共有結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェンポスホ ネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホ ノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホロアミ デートから選択される。 本発明のさらに別の態様において、オリゴマー化合物は構造Ｉの複数の単量体 サブユニットを持つように製造される。好適な態様において、構造Ｉの複数の単 量体サブユニットを持つオリゴマー化合物は前もって選択された場所に位置する 単量体サブユニットを持つように製造される。本発明の特別な態様に含まれてい るのは構造IIIの単量体サブユニットを少なくとも一つ持つオリゴマー化合物で ある： ［式中： Ｘはヒドロキシルまたはアミノであり； ＲはハロまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルまたは置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキル（ここで該置換 はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーデルまたはチオエーテルである ）であり； Ｌは酸素または硫黄であり； Ｒ₁はＣ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₆−Ｃ₁₀アリール、Ｃ₇−Ｃ₁₈アルカリールであり 、およびＸ₁はＨ、ＮＨ₂またはイミダゾールであり；および Ｑ₁およびＱ₂の一つは連結残基を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、 ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該Ｑ₁および Ｑ₂の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、ヌクレオチ ド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴーヌクレ オチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスファイ トまたはホスファイトである］。 本発明の好適な態様において、ＬはＯである。 さらに別の態様において、本発明のオリゴマー化合物は約５から５０サブユニ ットの長さである。 別の態様において、オリゴマー化合物における本発明の単量体サブユニットと ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシド間 の共有結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェンホスホ ネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホ ノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホロアミ デートから選択される。 本発明のさらに別の態様において、オリゴマー化合物は構造Ｉの複数の単量体 サブユニットを持つように製造される。好適な態様において、構造Ｉの複数の単 量体サブユニットを持つオリゴマー化合物は前もって選択された場所に位置する 単量体サブユニットを持つように製造される。 本発明に従うと、式： ［式中： Ｑはピリミジン塩基または２−Ｓピリミジン塩基であり； Ｒ¹は置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₁−Ｃ₃₀アルケニル、Ｃ₁−Ｃ₃₀ アルキニル、Ｃ₆−Ｃ₁₄アリールまたはＣ₇−Ｃ₃₀アラルキルであり、ここで該置 換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルであ り；および Ｒ²およびＲ³は独立して水素またはヒドロキシル保護基である］ の２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシド合成のための改良法も提供され、該方 法は以下の工程を含む： ２−２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドを提供し； 式Ｒ¹−ＯＨのアルコールを選択し；および 該２−２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドおよび該アルコールを該２’ −Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドを得るのに有効な時間、温度および圧力の条 件下、ルイス酸で処理する。 本発明に従うと、式： 式中： Ｘ’はＯまたはＳであり； Ｒ₁は置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₁−Ｃ₃₀アルケニル、Ｃ₁−Ｃ₃₀ アルキニル、Ｃ₆−Ｃ₁₄アリールまたはＣ₇−Ｃ₃₀アラルキルであり、ここで該置 換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルであ る； Ｒ²およびＲ³は独立して水素またはヒドロキシル保護基であり； Ｒ⁵およびＲ⁶は独立してＨ、Ｃ₁−Ｃ₃₀ヒドロカルビルまたは置換Ｃ₁−Ｃ₃₀ヒ ドロカルビルであり； の２’−Ｏ−置換シチジンヌクレオシド合成のための改良法も提供され、該方法 は以下の工程を含む： 式： の２−２’−アンヒドロウリジンヌクレオシドを提供し； 式Ｒ¹−ＯＨのアルコールを選択し；および 該２−２’−アンヒドロウリジンヌクレオシドおよび該アルコールを該２’− Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドを得るのに有効な時間、温度および圧力の条件下 、ルイス酸で処理し；および 該２’−Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドを該２’−Ｏ−置換シチジンヌクレオ シドヘアミノ化する。 本発明の好適な態様において２−２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドお よび式Ｒ¹−ＯＨのアルコールは、反応容器として例えば、高圧容器のような圧 力封入容器中で処理される。好適には反応容器は約１２０℃から約２００℃で加 熱される。 本発明のより好適な態様において、ルイス酸はホウ酸エステル（ｂｏｒａｔｅ ）、特にホウ酸トリアルキルである。好適には、ホウ酸トリアルキルのアルキル 基はアルコールのＲ基と同一のものであり、従って、ホウ酸エステルの式はＢ（ ＯＲ¹）₃である。ホウ酸トリアルキルは好適には水素化ホウ素（ｂｏｒａｎｅ） をアルコールで処理することにより製造される。好適には、２−２’−アンヒド ロピリミジンヌクレオシドの処理に使用されるアルコールはまたホウ酸トリアル キルの製造にも使用され、好ましくは式ＨＯ−Ｒ¹のアルコールである。 本発明のいくつかの好適な態様において、Ｒ¹はＣ₁−Ｃ₃₀アルキルであり、よ り好ましくはＣ₁−Ｃ₁₀アルキルである。別の好適な態様において、Ｒ¹はＣ₆− Ｃ₁₄アリールである。 本発明の一つの好適な態様において、本方法により製造されるピリミジンヌク レオシドはウリジンまたは５−メチルウリジンである。 本発明の別の好適な態様において、本方法により製造される２’−Ｏ−置換シ チジンヌクレオシドはウリジンまたは２’−Ｏ−メチル−５−メチルシチジンで ある。 本発明に従うと、少なくとも一つの構造IVの単量体サブユニットを含むオリゴ マー化合物が提供される： ［式中： Ａはヒドロキシルまたはアミノであり； ＲはハロまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルまたは置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキル（ここで該置換 はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルである ）であり； Ｌは酸素または硫黄であり； Ｚ’は置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₁−Ｃ₃₀アルケニル、Ｃ₁−Ｃ_{3 0} アルキニル、Ｃ₆−Ｃ₁₄アリールまたはＣ₇−Ｃ₃₀アラルキルであり、ここで該 置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルで あり；および Ｑ₁およびＱ₂の一つは結合残基を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、 ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該Ｑ₁および Ｑ₂の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、ヌクレオチ ド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴーヌクレ オチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスファイ トまたはホスファイトである］。 本発明の好適な態様において、ＬがＯである単量体サブユニットを少なくとも 一つ持つオリゴマー化合物が提供される。本発明のさらに好適な態様において、 Ｚ’が置換アルキルである単量体サブユニットを少なくとも一つ持つオリゴマー 化合物が提供される。より好適な態様において、Ｚ’はメトキシエチル（ＣＨ₃ ＯＣＨ₂ＣＨ₂−）である。 一つの態様において、本発明のオリゴマー化合物は５から２００の単量体サブ ユニットを含んでいる。より好適な態様において、本発明のオリゴマー化合物は ５から５０の単量体サブユニットを含んでいる。さらにより好適な態様において 、本発明のオリゴマー化合物は１０から２０のサブユニットを含んでいる。 別の態様において、Ｑ₁およびＱ₂の一つは連結残基を通してヌクレオチド、オ リゴヌクレオチド、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、 ここで連結残基はホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェンホス ホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホス ホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホロア ミデートを含んでいる。 本発明のさらに別の態様において、オリゴマー化合物は上記の式の複数の単量 体サブユニットを持つように提供される。より好適な態様では、オリゴマー化合 物は前もって選択された場所に単量体サブユニットが位置するように提供される 。好適な態様の説明 本発明の好適なオリゴマー化合物は少なくとも一つの構造Ｉの単量体サブユニ ットを持っている。構造Ｉは２’位が置換され、１’がグリコシル結合を通して ５−置換ピリミジンの１へ結合されたβ−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル糖で ある。単量体サブユニットの５’および３’末端は、ヌクレオチド、ヌクレオシ ド、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは混合オリゴ−ヌクレオチド ／ヌクレオシドへ結合でき、またはオリゴマー化合物の３’または５’終結末端 でありうる。 本発明の化合物の製造に使用される単量体サブユニットはヌクレオチドおよび ヌクレオシドを含んでいる。ヌクレオチドはリン結合残基を含んでおり、一方、 ヌクレオシドはリン結合残基を含んでいないが、各々ともグリコシル結合を通し て核酸塩基へ結合されたリボフラノシル残基を有する。 本発明の単量体サブユニットは連結残基を用いて結合されている。連結残基に は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェンホスホネート、ア ルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホノチオエー ト、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート、ケトン 、スルホン、カーボネートおよびチオアミデートが含まれる。アルキルホスホノ チオエート結合はＷＯ９４／０２４９９号に開示されている。他のそのような残 基もまた使用することができる。 本発明の一つの態様において、２’−Ｆ−５−アルキル−ウリジン（および５ −ハロ類似体）単量体サブユニットは、最初にヌクレオシドの５−位に適当なア ルキル基を置換することにより製造される。５−ハロ基の場合、５−Ｆ、Ｃｌ、 ＢｒおよびＩウラシルがＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙか ら入手可能である。ウラシルのＣ−５でのアルキル、アルケニルおよびアルキニ ルの置換は１９９２年１１月２４日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／ １０１１５号に開示されており、アルキル置換の例はさらにＭａｎｏｈａｒａｎ ，Ｍ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ ｏｎｓ ，ＣｒｏｏｋｅおよびＬｅｂｌｅｕ編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３に記載されている。 ５−アルキル化ウリジンはＤＭＦ中で炭酸ジフェニルおよび炭酸水素ナトリウ ムで処理し、続いて精製することにより、２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ −アラビノフラノシル）−５−アルキルウリジン］へ変換される。２，２’−ア ンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−アルキルウリジン］は適 当な溶媒中（例えばジオキサン）、ＨＦ／ピリジンでさらに処理されて１−（２ −フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−アルキルウリジンを 与える。この化合物は標準的な方法および技術に従ってＤＭＴ／アミダイトへ変 換され、１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ− ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−β−Ｄ−エリスロ−ペ ントフラノシル）−５−アルキルウリジンを与える。１−（５−Ｏ−ジメトキシ トリチル−２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノ エチルホスファイト−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−アルキルウ リジンはオリゴマー化合物合成において単量体サブユニット前駆体として使用さ れる。 ５−アルキル化−２’−Ｆ−ウリジンの５−アルキル化−２’−Ｆ−４−Ｎ− 保護（例えばベンゾイル）シチジンへの変換は１，２，４−トリアゾールを用い る既知の方法および技術により達成される。５−Ｏ−アルキル化ウリジンは最初 、３’および５’位が保護される。この保護は無水酢酸により達成できる。塩基 存在下（例えば、トリエチルアミン）、適当な溶媒（例えばアセトニトリル）中 で１，２，４−トリアゾールを低温にてＰＯＣｌ₃で処理する。保護された５− Ｏ−アルキル化-２’−Ｆ−ウリジンを適当な溶媒に溶解し、トリアゾール／Ｐ ＯＣｌ₃を含む溶液に加える。十分な時間が経過した後、続いて後処理および精 製を行うとトリアジン−１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ− β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−アルキルウリジンが得られる。こ の化合物はアンモニア処理することにより５−アルキル−１−（2−フルオロ− β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシンへ変換される。環外アミノ基 は例えば、適当な溶媒（例えば、ピリジン）中で無水安息香酸で処理することに より保護される。 この化合物は標準的な方法および技術に従ってＤＭＴ／アミダイトへ変換され 、４−Ｎ−保護−５−アルキル−１−（２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソ プロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル −β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシンが得られる。４−Ｎ−保護 −５−アルキル−１−（２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソブロビルアミノ −２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリ スロ−ペントフラノシル）−シトシンはオリゴマー化合物合成において単量体サ ブユニット前駆体として使用される。 ５位の置換基に対しアルキルより複雑な基（例えば、ハロまたは置換Ｃ₁−Ｃ₆ アルキル、ここで該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルま たはチオエーテルである）を用いる５−置換−２’−Ｆ−ピリミジンの製造では 、適当な保護基を用いて、アンヒドロ化合物の製造に先立ってその基が保護され る ことが必要である。５位に保護基を持つ化合物の全合成は飽和アルキル基の代わ りにこれらの置換アルキル基のーつの取り込みに対して前に記載したものと同一 である。 本発明の別の態様において、２’−Ｏ−置換-５−置換ウリジン単量体サブユ ニットは、アンヒドロ体の開裂にアルコール（例えば、フェニル置換基に対して フェノール、またはＯ−プロピル置換基に対してプロパノール）が使用されるこ とを除いては上記の２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル ）−５−アルキルウリジン］の方法を用いて製造される。 生じる化合物は標準的な方法および技術に従ってＤＭＴ／アミダイトへ変換さ れ、１−（２−Ｏ−置換−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノ エチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペント フラノシル）−５−置換ウリジンが得られる。ＤＭＴ／アミダイトはオリゴマー 化合物合成において単量体サブユニット前駆体として使用される。 １−（２−Ｏ−置換−５−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフ ラノシル）−５−置換ウリジンは１，２，４−トリアゾールを用いる既知の方法 および技術によりシチジン類似体に変換される。５−置換−２’−Ｏ−置換ウリ ジンはまず、適当な保護基（例えば、無水酢酸）を用いて３’位が保護される。 本物質は後処理後に精製される。塩基存在下（例えば、トリエチルアミン）、適 当な溶媒（例えばアセトニトリル）中で１，２，４−トリアゾールを低温にてＰ ＯＣｌ₃で処理する。保護された５−置換−２’−Ｏ−置換−３’−Ｏ−保護ウ リジンを適当な溶媒に溶解し、トリアゾール／ＰＯＣｌ₃を含む溶液に加える。 十分な時間が経過した後、続いて後処理および精製を行うと１−（２−Ｏ−置換 −３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペント フラノシル）−４−トリアゾロ−５−置換ピリミジンが得られ、これはアンモニ アで処理することによりシチジン類似体へ変換される。環外アミノ基（Ｎ−４） は例えば、ピリジンまたはＤＭＦのような適した溶媒中で無水安息香酸で処理す ることにより保護され、前に例示したようにＤＭＴ／アミダイトへさらに変換さ れる。得られる１−（２−Ｏ−置換−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ− ２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリス ロ−ペントフラノシル）−４−Ｎ−ベンゾイル−５−置換シチジンはオリゴマー 化合物合成において単量体サブユニット前駆体として使用される。 本発明の別の態様において、２’−置換−５−置換ピリミジンの２−Ｓ類似体 が製造される。２’−Ｏ−置換−２−チオ−５−置換ウリジンは２，３，５−ト リ−Ｏ−ベンゾイルリボース糖から出発し、グリコシル化工程を経て２−チオ− ５−置換ピリミジンと結合させる１つの方法により製造される。種々の２−チオ −５−置換ピリミジンの合成はＶｏｒｂｒｕｇｇｅｎ，Ｐ．ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃ ｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ ．，１９６９，８，９７６−９７７およびＶｏｒｂｒｕｇ ｇｅｎ，Ｐ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１９７３，１０６，３０３９−３０６１ に記載されている。２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイルリボース糖および５−置 換−２−チオウラシルは適当な溶媒に溶解し、Ｎ−Ｏ−ビス（トリメチルシリル ）アセトアミドおよびトリメチルシリル トリフレートで処理される。生じた２ ，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−チオ−５−置換ウリジンを適当な溶媒中 でナトリウムメトキシドを用いて脱保護すると２−チオ−５−置換ウリジンが得 られる。２−チオ−５−置換ウリジンを適当な溶媒に溶解し、酸化ジブチルスズ およびヨウ化テトラブチルアンモニウム、続いてハロゲン化アルキル（例えば、 ヨウ化メチル）で処理すると、２’−Ｏ−置換−２−チオ−５−置換ウリジンが 得られる。 ２’−Ｏ−置換−２−チオ−５−置換ウリジンは標準的な方法および技術に従 ってＤＭＴ／アミダイトへ変換され、１−（２−Ｏ−置換−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジ イソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリ チル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−２−チオ−５−置換ウリジンが 得られる。ＤＭＴ／アミダイトはオリゴマー化合物合成において単量体サブユニ ット前駆体として使用される。 本発明のさらに別の態様において、２’−Ｆ−５−置換ピリミジンの２−Ｓ類 似体が製造される。２’−Ｆ−２−チオ−５−置換ピリミジンを製造する一つの 方法は２’−Ｆ−２−置換−５−置換ピリミジンの製造に使用される方法と類似 した方法を使用するものである。この方法では官能基を選択的に保護し、上記の Ｏ−２および２’間で形成されるアンヒドロ結合と同様に、Ｓ−２および２’間 にアンヒドロ結合を形成させる。 ２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−チオ−５−メチル−ウリジンは２， ３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイルリボースおよび５−置換−２−チオウリジン間の グリコシル化により形成される。適当な溶媒中、ナトリウムメトキシドで脱保護 して精製した後、得られた５−メチル−２−チオウリジンは標準的方法および技 術を用いて５’位がＤＭＴで保護される。次に、適当な溶媒中、ｔ−ブチルジメ チルシリルクロリドで処理して２’位がｔ−ブチルジメチルシリル基で保護され る。 得られた５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチル−ジメチルシリル −５−置換−２−チオウリジンは適当な溶媒に溶解し、メタンスルホニルクロリ ドで処理すると５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチル−ジメチルシ リル−２’−メタンスルホニル−５−置換−２−チオウリジンが得られる。５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチル−ジメチルシリル−２’−メタン スルホニル−５−置換−２−チオウリジンを適当な溶媒中、ナトリウムメトキシ ドでさらに処理すると５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチル−ジメ チルシリル−２−２’−チオアンヒドロ−５−置換−２−チオウリジンが得られ る。この化合物をジオキサン中、ＨＦ／ピリジンでさらに処理すると２’−フル オロ−３’−ｔ−ブチル−ジメチルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５ −置換−２−チオウリジンが得られる。 ２’−フルオロ−３’−ｔ−ブチル−ジメチルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシ トリチル−５−置換−２−チオウリジンは標準的な方法および技術を用いてアミ ダイトへ変換され１−（２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ −２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリ スロ−ペントフラノシル）−２−チオ−５−置換ウリジンが得られる。ＤＭＴ／ アミダイトはオリゴマー化合物合成において単量体サブユニット前駆体として使 用される。 ２’−フルオロ−３’−ｔ−ブチル−ジメチルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシ トリチル−５−置換−２−チオウリジンのシチジン類似体への変換は１，２，４ −トリアゾールを用いる１−（２−Ｏ−置換−５−ジメトキシトリチル−β−Ｄ −エリスロ−ペントフラノシル）−５−置換ウリジンのそのシチジン類似体への 変換のための上記の方法を用いて達成される。２−Ｓ化合物の変換のためにはこ の基はまた適当な保護基（例えば、トルオイル）を用いて保護されなければなら ない。 ”プロテインキナーゼＣのオリゴヌクレオチド調節”と題し、１９９５年７月 ９日に出願された米国特許出願第０８／０８９，９９６号（代理人書類番号ＩＳ ＩＳ−１１５４、本出願と共通して譲渡されており、その開示は本明細書に援用 される）において、ギャップを持つオリゴヌクレオチド（Ｄｅａｎら、Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ ．，１９９４，２３，１６４１６を参照されたい）が合成され、 その効力を決定するためプロテインキナーゼＣで試験されている。良好な効力を 持つオリゴヌクレオチドの一つの例は配列ＩＤ番号：２７であり、それは２０ｍ ｅｒデオキシホスホロチオエートである。このオリゴヌクレオチドは上記のアッ セイにおいて、小さい方の転写体の約８０％の減少、および大きい方の転写体の ９０％以上の減少を与えた。 本発明の一つの態様において、少なくとも一つの構造Ｉの単量体ユニットを持 つオリゴマー化合物が合成され、ＰＫＣ−α蛋白質合成の阻害に使用された。配 列ＩＤ番号：２７と類似の配列を持つ二つのオリゴヌクレオチドが合成された： オリゴヌクレオチド配列ＩＤ番号：２８、この配列は完全に修飾されたホスホロ チオエートであり、１−６および１５−２０位に２’−フルオロ、および２、３ 、５および１６−１８位のチミンの代わりにウラシルを持つ；オリゴヌクレオチ ド配列ＩＤ番号：２９、この配列は完全に修飾されたホスホロチオエートであり 、２、３、５および１６−１８位のチミンの代わりに２’−フルオロ−５−メチ ルウリジンを持ち、さらに１、４、６、１５、１９および２０位に２’−フルオ ロを持っている。これらの二つのオリゴヌクレオチド（配列ＩＤ番号：２８、配 列ＩＤ番号：２９）は上記のアッセイで評価され、その結果は配列ＩＤ番号：２ ７の結果と比較された。 配列ＩＤ番号：２８および配列ＩＤ番号：２９は配列ＩＤ番号：２７と比較し て約１０倍の効力の増加を示した。配列ＩＤ番号：２９はまた配列ＩＤ番号：２ ８と比較して測定できるほどの効力の増加を示した。 上記の結果から期待されるようにこれら三つのオリゴヌクレオチドのＴ_mは配 列ＩＤ番号：２９＞配列ＩＤ番号：２８＞配列ＩＤ番号：２７の順であった。 本発明の一つの態様において、本発明のオリゴマー化合物は式IVの複数の単量 体サブユニットを有する。 式中、置換基Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｑ₁、Ｑ₂およびＺは前に定義した通りである。 本発明の別の態様において、構造Ｉ−IVの複数の単量体サブユニットを持つ本 発明のオリゴマー化合物は前もって決められた配列を持っている。オリゴマー化 合物の活性を増加させるため、本発明の単量体サブユニットは前もって決められ た配列のオリゴマー化合物中の前もって決められた場所に位置することができる 。 本発明の一つの態様において、ヌクレオシドダイマーが本発明の化合物内へ取 り込まれる。本発明の化合物内へ混合オリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシドを取 り込むための一つの方法は、標準オリゴヌクレオチド合成プロトコールを用い、 オリゴマー化合物内へ前もって決められた順番でヌクレオチド、ヌクレオシドダ イマーおよび構造Ｉ−IVの単量体サブユニットを取り込ませることである。本発 明の一つの態様において、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシドおよびヌクレオシ ドダイマーは”ヒドラジンに基づいた、およびヒドロキシルアミンに基づいたオ リゴヌクレオシド結合およびその二方向性合成法”と題して１９９３年１２月２ ８日に出願された米国特許出願第０８／１７４，３７９号（代理人書類番号ＩＳ ＩＳ−０７１６としても同定される）；”主鎖修飾オリゴヌクレオチド類似体お よび基結合によるその製造”と題して１９９３年３月３１日に出願された米国特 許出願第０８／０４０，９３３号（代理人書類番号ＩＳＩＳ−０７１７としても 同定される）；および”主鎖修飾オリゴヌクレオチド類似体および基結合による その製造”と題して１９９３年３月３１日に出願された米国特許出願第０８／０ ４０，９０３号（代理人書類番号ＩＳＩＳ−０７１８としても同定される）（本 出願と共通して譲渡されており、その開示は本明細書において援用される）の開 示に従って製造される。 本発明の目的のためのオリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシドは、非リン酸結合 により共有結合で結合された少なくとも二つのヌクレオシドを持ち、前に定義し たような単量体サブユニットとのリン含有共有結合を形成する混合主鎖オリゴマ ーである。オリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシドはリン含有およびリンを含まな い結合を通して結合された複数のヌクレオチドおよびヌクレオシドを持つことが できる。 本発明の方法は２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドの合成に有用である。 ２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドはオリゴヌクレオチドおよび関連化合物 の合成に日常的に使用される重要な化合物である。市販品として入手可能な代表 的な２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドには２’−Ｏ−メチルウリジンおよ び２’−Ｏ−メチルシチジンが挙げられる。 本発明の目的には、ピリミジンヌクレオシドはウリジンおよびシチジンのよう な天然に存在するピリミジン塩基、ならびに２Ｓ類似体および５−および６−置 換ウリジンおよびシチジンのような天然に存在しないピリミジンを含んでいる。 Ｎ３置換ピリミジン、および例えば４および／または５位に結合されたヘテロ環 構造を持つピリミジンも含まれる。本発明に利用できる多くの修飾ピリミジンが 本分野で知られている（例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉ ｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ， Ｖｏｌｕｍｅ １ Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓs， Ｎ．Ｙ．１９８８を参照されたい）。本明細書で定義されるよう に、２Ｓピリミジン塩基とはその２位に結合された硫黄を持つピリミジン塩基で ある。 本発明に従う核酸塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、ウリジンおよび チミンのようなプリンおよびピリミジン、ならびにキサンチン、ヒポキサンチン 、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他のア ルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他のアルキル 誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよび チミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル，８−ハロ、アミノ、 チオール、チオアルキル、ヒドロキシおよびその他の８−置換アデニンおよびグ アニン、５−トリフルオロメチルおよびその他の５−置換ウラシルおよびシトシ ン，７−メチルグアニンのような他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。さ らに別のプリンおよびピリミジンには米国特許第３，６８７，８０８号に開示さ れているもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍ ｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ，８５８−８５９ペー ジ，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ，１９９０に記載されているもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎ ｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９９ １，３０，６１３に記載されているものが含まれる。 本明細書に定義されるように、２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシ ドはピリミジン環の２位とヌクレオシドの糖の２’−酸素を連結する単結合を持 つピリミジンヌクレオシドである。２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオ シドは、本明細書で定義されるようにピリミジン環の２位とヌクレオシドの糖の ２’位が間に入る硫黄原子により結合されているピリミジンヌクレオシドである 。 いくつかの好適な態様において、２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオ シドまたは２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドは一般式： ［式中： ＸはＯまたはＳであり； Ｒ²およびＲ³は独立して水素またはヒドロキシル保護基であり；および Ｒ⁵およびＲ⁶は独立してＨ、Ｃ₁−Ｃ₃₀ヒドロカルビルまたは置換Ｃ₁−Ｃ₃₀ヒ ドロカルビルである］ を持っている。 本発明の方法における使用に適した２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレ オシドおよび２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドには無置換のもの ならびにピリミジン環に置換基を持つものが含まれる。種々のそのように置換さ れたピリミジン置換が本分野で知られている（例えば、５位でのアルキル化）。 例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃ ｌｅｏｔｉｄｅｓ ，Ｖｏｌｕｍｅ １、上記文献、を参照されたい。そのような 置換２，２’および２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドは天然に存 在するヌクレオシドから製造でき、２，２’または２Ｓ，２’結合形成の前また は後に修飾できる。従って、本発明の一つの態様では、２，２’または２Ｓ，２ ’結合形成の後で２，２’または２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシ ドへ置換基が結合され、本発明の別の態様では２，２’または２Ｓ，２’−アン ヒドロピリミジンヌクレオシド形成に先立ってピリミジンヌクレオシドのピリミ ジン環へ置換基が結合される。 本発明の方法は２’−Ｏ−置換ピリミジンの製造において著しい経済的利点を 提供する。例えば、修飾オリゴヌクレオチドおよび関連化合物の合成の重要な中 間体である化合物２’−Ｏ−メチルウリジンは、本発明の方法を用いると市販品 として入手可能なものの約１０分の１の経費で製造できる。修飾オリゴヌクレオ チドおよび関連化合物の合成に有用な別の有用な中間体、２’−Ｏ−メチルシチ ジンは、本発明の方法を用いると市販品として入手可能なものの約５分の１の経 費で製造できる。これらの経費は大規模合成で以前に得られた収率、出発材料の 価格および必要とされる労働時間に基づいている。 ２，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドはピリミジンヌクレオシドをＤ ＭＦまたは他の伝統的な溶媒中で、炭酸ジフェニルおよび炭酸水素ナトリウムで 処理し、続いて精製することにより製造することができる。例えば、Ｔｏｗｎｓ ｅｎｄ，Ｌｅｒｏｙ Ｂ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８を参照されたい。得られた２，２’−アンヒドロピリミジ ンヌクレオシドは加熱しながら弱い求核試薬（例えば、アルコール）およびルイ ス酸（例えば、ホウ酸トリアルキル）で処理すると、対応する２’−Ｏ−置換ピ リミジンヌクレオシドが得られる。本発明の好適な態様において、２Ｓ，２’ま たは２，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドは弱い求核試薬の存在下、式 Ｒ¹−ＯＨのアルコールで処理され、各々２’−Ｏ−Ｒ¹−ピリミジンヌクレオシ ドまたは２Ｓ類似体が得られる。本方法は２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシ ドの小規模および大規模合成の両方に使用できる。 ２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドは例えば、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ，Ｌｅｒｏｙ Ｂ．（上記文献）の方法に従ってピリミジンヌクレオシドから製 造できる。Ｕｅｄａ，Ｔ．，Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕ ｌｌ．（Ｔｏｙｋｙｏ） ，１９７０，１８，１４９もまた参照されたい。２Ｓ， ２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドは次に本発明の方法に従って弱い求核 試薬（例えば、アルコール）およびルイス酸（例えば、ホウ酸トリアルキル）で 処理でき、対応する２’−Ｏ−置換 ２Ｓ−ピリミジンヌクレオシドが得られる 。 ２’−Ｏ−置換ピリミジンおよび２’−Ｏ−置換２Ｓ−ピリミジンヌクレオシ ドは標準的方法および技術に従って各々ＤＭＴ／アミダイトへ変換でき、１−［ ５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−置換−（３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ ルアミノ−２−シアノエチルホスファイト）］ピリミジンヌクレオシドまたは１ − ［５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−置換−（３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロ ピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト）］−２Ｓ−ピリミジンヌクレオシ ドが得られ、その各々はオリゴマー化合物合成において単量体サブユニット前駆 体として使用できる。 特定の理論に縛られるのは望まないが、アンヒドロピリミジンヌクレオシド環 の開裂機構には弱い求核試薬による２’−炭素への求核的攻撃が含まれていると 考えられる。求核攻撃は架橋酸素へのルイス酸の複合体形成により容易になって いると考えられる。得られる複合体は２’−炭素を弱い求核試薬による求核的攻 撃に対して活性化していると考えられる。適用できるであろう別の理論は、ルイ ス酸が５’および３’ヒドロキシル基へ複合し、分子のコンホメーション変化を 起こして弱い求核試薬による攻撃を可能にして生成物を与えることである。 本発明の一つの態様では、使用されるルイス酸はホウ酸トリアルキルである。 ホウ酸トリアルキルは購入でき、またはホウ酸のアルキル基が求核試薬のアルキ ル基と同一となるように製造できる。例えば、２’−Ｏ−メチルウリジンが製造 される場合、ホウ酸トリメチルが好適なルイス酸であろうし、メタノールが好適 な求核試薬であろう。ホウ酸トリメチル、トリエチルおよびトリプロピルはＡｌ ｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ ｃｏｎｓｉｎから市販品として入手可能である。 もしくは、ホウ酸トリアルキルは前に示したように水素化ホウ素および２’位 の所望の置換基に対応するアルコールから製造できる。典型的には、水素化ホウ 素（ＴＨＦ中、１．０Ｍ溶液として利用可能である）を各々のアルコールの３当 量と反応させる。水素の発生が完了したら、溶液を濃縮してＴＨＦを除去する。 得られた溶液は所望のアルコールに所望のホウ酸トリアルキルを含んでおり、前 に説明したように本方法においてアンヒドロ環の開裂を達成ずるために使用でき る。 本発明の一つの態様において、ピリミジンがウリジンまたは置換ウリジンであ る２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドは、既知の方法および技術により、例 えば、１，２，４−トリアゾールを用いて対応するシチジン類似体へ変換（アミ ノ化）できる。典型的には、２’−Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドは最初に例え ば無水酢酸のような伝統的な保護基で３’−Ｏおよび５’−Ｏ位が保護される。 １，２，４−トリアゾールは伝統的な溶媒（例えば、アセトニトリル）中、塩基 （例えば、トリエチルアミン）存在下でＰＯＣｌ₃にて低温で処理する。保護２ ’−Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドを伝統的な溶媒に溶解し、トリアゾール／Ｐ ＯＣｌ₃含有溶液へ加える。十分な時間が経過後、後処理し精製すると、トリア ジン−１−（３，５−ジ−Ｏ−保護−２−置換）ピリミジンヌクレオシドが得ら れる。この化合物はアンモニアで処理することによりシチジン類似体へ変換でき る。環外アミノ基は、例えば、伝統的な溶媒（例えば、ピリジン）中で無水安息 香酸で処理することにより保護できる。 本発明のさらに別の態様において、ピリミジンがウリジンまたは置換ウリジン である２’−Ｏ−置換−２Ｓ−ピリミジンヌクレオシドは既知の方法および技術 により、例えば、１，２，４−トリアゾールを用いて対応するシチジン類似体へ 変換できる。トリアゾールでの処理に先立って２Ｓ基が適当な保護基（例えば、 トルオイル）で保護されることを除いて前に示した方法に従う。 得られた２’−Ｏ−置換ウリジンおよび２’−Ｏ−置換２Ｓ−ウリジンは標準 的方法および技術に従って各々ＤＭＴ／アミダイトへ変換でき４−Ｎ−保護−１ −（２−Ｏ−置換-（３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチ ルホスファイト−５−Ｏ−ジメチキシトリチル）シチジンまたはその２Ｓ類似体 が得られる。４−Ｎ−保護−１−（２−Ｏ−置換−（３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプ ロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメチキシトリチル） シチジンまたはその２Ｓ類似体はオリゴマー化合物合成において単量体サブユニ ット前駆体として使用できる。 本発明の一つの態様において２’−Ｏ−置換−５−置換ウリジン単量体サブユ ニットは、上記のように合成された５−置換ウリジンから出発して製造される。 この化合物は適当な溶媒（例えば、メタノール）中で酸化ジブチルスズで処理し て、精製する。得られた１−（２’，３’−ジ−Ｏ−ブチルスズ−β−Ｄ−エリ スロ−ペントフラノシル）−５−置換ウリジンは適当な溶媒中でハロアルキル、 保護ハロアルキルアミノまたはハロアルキルイミダゾ化合物（例えば、ヨードプ ロパン）で処理すると各々２’−Ｏ−置換体が得られる。アラルキルおよびアリ ール基もまたアルキル基の代わりに使用できる。 種々の置換を持つピリミジン（即ち、置換基を持つピリミジン）が本分野で知 られている。本発明の方法で使用できるそのような置換基の代表的なものには、 アルキルまたは置換アルキル、アルケニルまたは置換アルケニル、アルキニルま たは置換アルキニル、炭素環式アルキル、炭素環式アルケニル、炭素環式アラル キル、アリール、アラルキルまたは置換アラルキルのようなヒドロカルビル基が 含まれる。好適には、アルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基は１から３ ０の炭素を持っており、１から約１０の炭素が特に好適である。好適には、アリ ール基は６から約１４の炭素を持ち、アラルキル基は７から約３０の炭素を持っ ている。上に掲げた置換基はそれら自身アルコキシ、アルコール、ベンジル、フ ェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、またはアルキル、アリ ール、アルケニルまたはアルキニル基およびエーテルのような置換基を持つこと ができる。 ウラシルのＣ−５でのアルキル、アルケニルおよびアルキニル基の置換は１９ ９２年１１月２４日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／１０１１５に報 告されており、アルキル置換の例はさらにＭａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，Ａｎｔｉ ｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ，Ｃｒｏｏ ｋｅ ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａ ｔｏｎ，１９９３に記載されている。さらに別の置換はＴｏｗｎｓｅｎｄ，Ｌ． Ｂ，（同上）により報告されている。 本発明の方法において、２Ｓ，２’または２，２’−アンヒドロピリミジンヌ クレオシドは式Ｒ¹−ＯＨのアルコールで処理される。代表的なＲ¹基にはアルキ ルまたは置換アルキル、アルケニルまたは置換アルケニル、アルキニルまたは置 換アルキニル、炭素環式アルキル、炭素環式アルケニル、炭素環式アラルキル、 アリール、アラルキルまたは置換アラルキルが含まれる。好適には、アルキル、 アルケニルおよびアルキニルＲ基は１から３０の炭素を持っており、１から約１ ０の炭素が特に好適である。好適には、アリール基は６から約１４の炭素を持ち 、アラルキル基は７から約３０の炭素を持っている。上に掲げたＲ¹基はそれら 自身アルコキシ、アルコール、アミノ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール 、 チオアルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、エーテル、またはさらにアルキル、ア リール、アルケニルまたはアルキニル基のような置換基を持つことができる。 本発明の方法に従って製造された２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドおよ び２’−Ｏ−置換２Ｓ−ピリミジンヌクレオシド（置換ピリミジンヌクレオシド ）は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、混合オリゴーヌクレオチド／ ヌクレオシドおよび本分野で知られている関連化合物を含む種々の化合物の製造 に使用できる。 本発明の文脈において、用語”オリゴヌクレオチド”とは二つまたはそれ以上 のヌクレオチドサブユニットを含むオリゴマーまたはポリマーを含む。本明細書 において使用される場合、ヌクレオチドとは天然に存在する糖、核酸および糖間 （主鎖）結合ならびに同様に機能する天然には存在しない部分を含んでいてもよ い。例えば、促進された細胞取り込みおよびヌクレアーゼ存在下での増加した安 定性のような特性のため、そのような化学的に修飾されたまたは置換されたオリ ゴヌクレオチドは天然の形よりもしばしば好適である。 本発明のために意図されるいくつかの好適なオリゴヌクレオチドの特定の例に は、ホスホジエステル糖間結合（主鎖）に加えて、ホスホロチオエート、ホスホ トリエステル、メチルホスホネート、鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合 または短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環式糖間結合のような修飾糖間結合が含まれ る。 本明細書で使用される場合、用語オリゴヌクレオシドは非リン結合残基を持つ 二つまたはそれ以上のヌクレオシドサブユニットを含むオリゴマーまたはポリマ ーを含む。本発明に従ったオリゴヌクレオシドはグリコシル結合を通して核酸塩 基に結合されたリボフラノース残基を持っている。本発明の目的のためのオリゴ ーヌクレオチド／ヌクレオシドは、非リン酸結合により共有結合で結合された少 なくとも二つのヌクレオシドおよびヌクレオチドとの少なくとも一つのリン含有 共有結合を持ち、ここで単量体ヌクレオチドまたはヌクレオシドユニットの少な くとも一つは本発明の方法を用いて製造された２’−Ｏ−置換化合物である。オ リゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシドはさらにリン含有および／または非リン含有 結合を通して結合された複数のヌクレオチドおよびヌクレオシドを持つことがで きる。 本発明の方法を用いて製造される２’−Ｏ−置換化合物を結合する方法には、 ホスホロアミダイトへの変換、続いての液相または固相化学が含まれる。代表的 な液相技術は１９９３年５月１１日に公開され、本発明と共通して譲渡されてい る米国特許第５，２１０，２６４号に記載されている。代表的な固相合成は標準 ホスホロアミダイト化学を利用するＤＮＡおよびＲＮＡ合成に典型的に用いられ ている技術である。（例えば、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃ ｌｅｏｔｉｄｅｓ Ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ ，Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．編、Ｈｕｍ ａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９３を参照されたい。）好適な 合成的固相合成は活性化リン酸としてホスホロアミダイトを利用する。ホスホロ アミダイトはＰ^III化学を利用する。中間体ホスファイト化合物は続いて既知の 方法を用いてＰ^V状態へ酸化される。これは、選択された酸化条件に依存してホ スホジエステルまたはホスホロチオエートリン酸結合を含む結合の合成を可能と する。他のリン酸結合もまた発生させることができる。適した結合の代表的な例 には、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェンホスホネート、 アルキルホスポネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホノチオエ ート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート、ケト ン、スルフォン、カルボネート、チオアミデートおよび本分野で知られているそ の他のそのような残基が含まれる。アルキルホスホノチオエート結合はＷＯ ９ ４／０２４９９に開示されている。 オリゴヌクレオチド合成の結合効率を増加させるために使用される標準的方法 および技術には３’および／または５’官能基の活性化が含まれる。いくつかの 一般的に活性化される基はリン酸および亜リン酸基であり、それらは対応する活 性化リン酸および活性化亜リン酸基を与える（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ ｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ；Ｂｌａｃｋｂｕｒ ｎ，Ｇ．Ｍ．，Ｇａｉｔ Ｍ．Ｊ．，Ｅｄｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅ ｓｉｓ；ＩＬ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０，第３章，ｐ．９８を参照されたい ）。多くの他の基が知られており、本発明で使用できる。 本明細書の目的のためには、アルキル基には置換および無置換直鎖、分岐鎖お よび脂環式炭化水素、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、 ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリ デシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデ シル、ノナデシル、エイコシルおよびその他のより高級な炭素アルキル基が含ま れるが、それらに制限されるわけではない。さらなる例としては２−メチルプロ ピル、２−メチル−４−エチルブチル、２，４−ジエチルプロピル、３−プロピ ルブチル、２，８−ジブチルデシル、６，６−ジメチルオクチル、６−プロピル −６−ブチルオクチル、２−メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペ ンチル、２−エチルヘキシルおよびその他の分岐鎖基が含まれる。 本発明に有用なアルケニル基には、ビニル、アリルおよびクロチルのような、 一つまたはそれ以上の炭素−炭素二重結合を含む上記のアルキル基から誘導され る残基が含まれるが、それらに制限されるわけではない。 本発明に有用なアルキニル基には、プロパルギルのような、一つまたはそれ以 上の炭素−炭素三重結合を含む上記のアルキル基から誘導される残基が含まれる が、それらに制限されるわけではない。 用語アリールとは例えば、フェニル、ナフチル、キシリル、ピロールおよびフ リル基を含む単環式および多環式芳香族基を示すことを企図している。アリール 基は少ない場合は３つの炭素原子を含むことができるが（例えば、イミダゾ基） 、好適なアリール基は６から約１４の炭素原子、より好適には６から約１０炭素 原子を持っている。 用語アラルキルはアルキルおよびアリール部分の両方を含む基を示すことを企 図しており、ここでそのような基の結合点はそのアルキル部分を通している。ベ ンジル基はアラルキル基の一つの例である。 多くの置換基が本発明の化合物内へ保護された（ブロックされた）形で導入で き、続いて脱保護されて最終的な所望の化合物が形成される。置換基にはピリミ ジン環および上記のアルコールＲ¹−ＯＨのＲ¹基へ共有結合で結合された基が含 まれる。一般に、保護基は特定の反応条件に対して化学官能性を不活性にし、実 質的に分子の残りの部分に障害を与えることなく分子のそのような官能性に付加 し、およびそれから除去することができる。例えば、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕ ｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔ ｈｅｓｉｓ ，第２版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎs，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ，１９９１を参照されたい。例えば、アミノ基はフタルイミド基または９−フル オレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基として保護でき、カルボキシル基は フルオレニルメチル基として保護できる。代表的なヒドロキシル保護基はＢｅａ ｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２，４８，２２２３により記載 されている。好適なヒドロキシル保護基はトリチル、モノメトキシトリチル、ジ メトキシトリチルおよびトリメチルトリチルのように酸に不安定である。 本発明に従った固相支持体には、調節細孔ガラス（ＣＰＧ）、オキサリル調節 細孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ １９９１，１９，１５２７を参照されたい）、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓｕｐ ｐｏｒｔ−−アミノポリエチレングリコール誘導化支持体（例えば、Ｗｒｉｇｈ ｔら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９３，３４，３３７３を 参照されたい）またはＰｏｒｏｓ−−ポリスチレン／ジビニルベンゼンの共重合 体が含まれる。多くの他の固相支持体が市販品として入手可能であり、本発明に 使用できる。 本発明の文脈における活性化固相支持体とは、得られる活性化固相支持体が本 発明の単量体サブユニットまたはヌクレオシドダイマーとの反応に対して化学的 に活性であるように、官能基で誘導化されているかまたは反応性残基で処理され ている固相支持体である。 いくつかの好適な態様において、本発明の方法は２’−Ｏ−置換−５−ハロピ リミジンヌクレオシドの製造に使用される。２’−Ｏ−置換−５−ハロウリジン はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能な５−Ｆ、 −Ｃｌ、−Ｂｒおよび−Ｉウラシルから製造することができる。２’−Ｏ−置換 −５−ハロウリジンは以下のようにシチジン類似体へ変換できる。 本発明の方法において、アルコール、ルイス酸およびアンヒドロピリミジンヌ クレオシドは反応容器中で処理される。反応容器は反応に適している本分野で既 知の任意の容器であり、その中で反応物は加熱される。好適には、反応容器は圧 力密封容器であり、より好適には高圧容器である。 好適な態様において、アルコール、ルイス酸およびアンヒドロピリミジンヌク レオシドはジオキサンのような適した溶媒中で約１２０℃から約２００℃で加熱 することにより処理される。特に好適な態様において、アルコール、ルイス酸お よびアンヒドロピリミジンヌクレオシドおよび溶媒は圧力密封容器中で加熱され る。高圧容器が特に好適である。 本明細書で使用される場合、用語ルイス酸とは分子またはイオンとしてのその 通常の意味を持っており、それは第二の分子またはイオンからの二つの電子と共 有結合を形成することにより別の分子またはイオンと結合できる。本発明の方法 での使用において、ルイス酸は一対の電子を受け取ることができる電子欠乏種で あると考えられる。特に好適なものは二価および三価の硬酸である。より好適な ものはマグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、クロム、銅、ホウ素、 スズ、水銀、鉄、マンガン、カドミウム、ガリウムおよびバリウムを含む二価お よび三価の金属の二価および三価陽イオンおよびその錯体である。それらの錯体 にはヒドロキシド、アルキル、アルコキシド、ジおよびトリハライド（特にトリ クロリドおよびトリフルオリド）およびアセテートのような有機酸リガンドが含 まれるであろうが、それらに制限されるわけではない。本方法で有用な特に好適 であるルイス酸の例はホウ酸エステル、特にホウ酸アルキルである。 ２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、遺伝 子発現を阻害するその能力、ならびに相補的ＲＮＡへのそのハイブリダイゼーシ ョン親和性を算定するための研究で評価された。２’−デオキシギャップを含む ２’−修飾オリゴヌクレオチドおよび均一に修飾された２’−修飾オリゴヌクレ オチドを用いたそのような研究の一つ（Ｍｏｎｉａ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ ．，１９９３，２６８，１４５１４−１４５２２参照）は、２’−修 飾オリゴヌクレオチドは対応する非修飾２’−デオキシオリゴヌクレオチドより も相補的ＲＮＡに対する高い親和性を持つことを示している。２’−デオキシギ ャップを含む２’−修飾オリゴヌクレオチドもまた細胞中のＨａ−ｒａs癌遺伝 子の発現に対する活性を示した。 均一に修飾された２’−Ｏ−置換オリゴリボヌクレオチドを含む別の研究にお いて、ヌクレアーゼ安定性および融解温度（Ｔ_m）が２’−フルオロ、２’−Ｏ −メチル、２’−Ｏ−プロピルおよび２’−Ｏ−ペンチルヌクレオチドを含む完 全修飾オリゴリボヌクレオチド配列について比較された。２’−Ｏ−ペンチルを 除いて修飾は相補的ＲＮＡと形成されたデュープレックスのＴ_mを増加させるこ とが観察された。修飾ホモデュープレックスは以下のＴ_m順で著しく高いＴ_mを示 した：２’−フルオロ：２’−フルオロ＞ ２’−Ｏ−プロピル：２’−Ｏ−プ ロピル＞２’−Ｏ−メチル：２’−Ｏ−メチル＞ＲＮＡ：ＲＮＡ＞ＤＮＡ：ＤＮ Ａ。２’−修飾オリゴリボヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性は蛇毒ホスホジエ ステラーゼ（ＳＶＰＤ）およびヌクレアーゼＳ１を用いて試験された。２’−修 飾により与えられる安定性が修飾の大きさに相関して観察された。二次構造を形 成する能力を持つオリゴリボヌクレオチドにおいてはヌクレアーゼ安定性のレベ ルが追加されたが、それは２’修飾オリゴリボヌクレオチドのみであり、２’− デオキシオリゴリボヌクレオチドでは観察されなかった。 本発明の他の目的、利点および新規な特色は以下に提供される実施例を調べる ことにより当業者には明らかになるであろう。実施例１ ２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリ ジン ］ ５−メチルウリジン（リボシルチミン、Ｙａｍａｓａ，Ｃｈｏｓｈｉ，Ｊａｐ ａｎを通して市販品として入手可能）（７２．０ｇ，０．２７９ｍｏｌ）ジフェ ニルカーボネート（９０．０ｇ，０．４２０ｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム （２．０ｇ，０．０２４ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（３００ｍＬ）に加え た。混合物は攪拌しながら加熱還流し、二酸化炭素ガスの発生が制御された様式 で行った。一時間後、わずかに色が濃くなった溶液は減圧下で濃縮した。得られ たシロップは攪拌したジエチルエーテル（２．５Ｌ）に注いだ。エーテルはデカ ントし、残渣は最少量のメタノール（約４００ｍＬ）に溶解した。この溶液を上 記のように新しいエーテル（２．５Ｌ）に注ぐと堅いゴム状物が得られた。エー テルをデカントしゴム状物を真空オーブン中で乾燥すると（６０℃、１ｍｍＨｇ で２４時間）固形物が得られ、それを粉砕するとうすい黄褐色の粉末（５７ ｇ，８５％の粗収率）が得られた。ＮＭＲは構造と、フェノールおよびそのナト リウム塩の混入（約５％）に一致した。この物質は環開裂にそのまま使用された 。この物質は酢酸エチル中、メタノールの濃度勾配（１０−２５％）を用いるカ ラムクロマトグラフィーによりさらに精製でき、白色固形物が得られた、ｍｐ ２２２−４℃。実施例２ １−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントロフラノシル）−５−メチルウ リジン ２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウ リジン］（７１ｇ，０．３２ｍｍｏｌ）およびジオキサン（７００ｍＬ）を２リ ットルのステンレス鋼高圧容器に入れ、ＨＦ／ピリジン（１００ｇ，７０％）を 加えた。混合物を１２時間、１２０−１２５℃で加熱し、その後氷浴で冷却した 。高圧容器を開け、混合物を３リットルの氷に注いだ。この混合物に注意深く炭 酸水素ナトリウム（３００ｇ）および飽和炭酸水素ナトリウム溶液（４００ｍＬ ）を加えた。混合物を濾過し、フィルターケーキを水（２ｘ１００ｍＬ）および メタノール（２ｘ５００ｍＬ）で洗浄した。水およびメタノール洗液は真空下濃 縮して乾固させた。メタノール（２００ｍＬ）および粗シリカゲル（８０ｇ）を 残渣に加え、混合物を真空下蒸発乾固させた。得られた物質はシリカゲル上に濃 縮し、酢酸エチルおよびメタノールの濃度勾配（１００：０から８５：１５）を 用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物分画をプー ルし濃縮すると３６．９ｇ（５１％，２工程収率）の表記化合物を得た。 またこの反応から１−（２−フェニル−β−Ｄ−エリスロ−ペントロフラノシ ル）−５−メチルウリジン（１０．３ｇ）も単離された。この物質は高圧容器反 応が不純な物質を用いて実施された場合、フェノールおよび上記無水反応からの ナトリウム塩から形成される。無水物が精製されている場合この生成物は形成さ れない。形成された１−（２−フェニル−β−Ｄ−エリスロ−ペントロフラノシ ル）−５−メチルウリジンは２’−フルオロ体と同じ反応条件を用いてそのＤＭ Ｔ／ホスホロアミダイトへ変換された。実施例３ １−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペント フラノシル）−５−メチルウリジン １−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントロフラノシル）−５−メチル ウリジン（３１．１５ｇ，０．１２ｍｏｌ）をピリジン（１５０ｍＬ）に懸濁し 、ジメトキシトリチルクロリド（４４．６２ｇ，０．１２ｍｏｌ）を加えた。こ の混合物は密閉されたフラスコ内で２時間攪拌し、メタノール（３０ｍＬ）を加 えた。混合物は真空下濃縮し、生じた残渣は飽和炭酸水素ナトリウム溶液（５０ ０ｍＬ）と酢酸エチル（３ｘ５００ｍＬ）に分配した。酢酸エチル分画をプール し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して真空下で濃縮すると粘張な油状物が得 られた。油状物はジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、シリカゲルカラムに のせ酢酸エチル：ヘキサン：トリエチルアミン（６０／３９／１から７５／２４ ／１２まで増加する）で溶出する。生成物分画をプールし真空下で濃縮すると５ ９．９ｇ（８９％）の表記化合物があわ状物として得られた。実施例４ １−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソピ ルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシ ル）−５−メチルウリジン １−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペン トフラノシル）−５−メチルウリジン（５９．８ｇ， ０．１０６ ｍｏｌ）を ジクロロメタンに溶解し２−シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプ ロピルホスホロジアミダイト（４６．９ｍＬ，０．１４８ｍｏｌ）およびジイソ プロピルアミンテトラゾリド（５．４６ｇ，０．３当量）を加えた。混合物は１ ６時間攪拌した。混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１Ｌ）で洗浄し、炭酸 水素溶液はジクロロメタン（５００ｍＬ）で逆抽出した。合併した有機層は食塩 水（１Ｌ）で洗浄し、食塩水はジクロロメタン（１００ｍＬ）で逆抽出した。合 併した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し濾過後、約２００ｍＬの容量まで濃縮し た。得られた物質はヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン（６０／４０／１ ）を用いた。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物分画 を真空下濃縮し、アセトニトリル（５００ｍＬ）に溶解し、濾過後真空下で濃縮 して乾燥するとあわ状物が得られた。あわ状物を砕き２４時時間乾燥させると一 定の重さになり６８．２ｇ（８４％）の表記化合物が得られた。¹Ｈ ＮＭＲ： （ＣＤＣｌ₃）δ ０．９−１．４（ｍ，１４Ｈ，４ｘＣＨ₃，２ｘＣＨ），２． ３−２．４（ｔ，１Ｈ，ＣＨ₂ＣＮ），２．６−２．７（ｔ，１Ｈ，ＣＨ₂ＣＮ） ，３．３−３．８（ｍ，１３Ｈ，２ｘＣＨ₃ＯＡｒ，５’ＣＨ₂，ＣＨ₂ＯＰ，Ｃ −５ ＣＨ₃），４．２−４．３（ｍ，１Ｈ，４’），４．３５−５．０（ｍ， １Ｈ，３’），４．９−５．２（ｍ，１Ｈ，２’），６．０−６．１（ｄｄ，１ Ｈ，１’），６．８−７．４（ｍ，１３Ｈ，ＤＭＴ），７．５−７．６（ｄ，１ Ｈ，Ｃ−６），８．８（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ）。³¹Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）；１ ５１．４６８，１５１．６０９，１５１．７９０，１５１．９０４。実施例５ １−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペン トフラノシル）−５−メチルウリジン 実施例２の方法に従って製造された１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ− ペントフラノシル）−５−メチルウリジン（２２．４ｇ，９２ ｍｍｏｌ，８５ ％純度）をピリジン（２ｘ１５０ｍＬ）と共蒸留し、ピリジン（２５０ｍＬ）に 溶解した。無水酢酸（５５ｍＬ，．５８ｍｏｌ）を加え混合物は１６時間攪拌し た。メタノール（５０ｍＬ）を加え攪拌を３０分間継続した。混合物を蒸発させ るとシロップ状物が得られた。シロップ状物を最少量のメタノールに溶解し、シ リカゲルカラムに加えた。生成物分画を溶出するためにヘキサン／酢酸エチル（ １：１）が用いられた。精製により１９．０ｇ（７４％）の表記化合物が得られ た。実施例６ ４−トリアジン−１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−Ｄ −エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン １，２，４−トリアゾール（１０６ｇ，１．５３ｍｏｌ）をアセトニトリル（ １５０ｍＬ）に溶解し続いてトリエチルアミン（２５７ｍＬ，１．８４ｍｏｌ） を加えた。混合物は氷浴を用いて０から１０℃の間に冷却した。ＰＯＣｌ₃（３ ４．５ｍＬ，．３７５ｍｏｌ）を滴加ロートを通してゆっくりと加え、混合物は さらに４５分間攪拌した。別のフラスコには１−(３’，５’−ジ−Ｏ−アセチ ル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル)−５−メチルウリジ ン（５６．９ｇ，．１４４ ｍｏｌ）をアセトニトリル（１５０ｍＬ）に溶解し た。１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル-２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ− ペントフラノシル）−５−メチルウリジンを含む溶液をカニューレを通してトリ アゾール溶液にゆっくりと加えた。氷浴を除き、反応混合物を１時間放置して室 温まで暖めた。アセトニトリルを真空下除去し、残渣を飽和炭酸水素ナトリウム 溶液（４００ｍＬ）およびジクロロメタン（４ｘ４００ｍＬ）に分配した。有機 層を合併し真空下濃縮した。得られた残渣を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解す ると固形物の沈殿が始まった。ヘキサン（３００ｍＬ）を加えると更に固形物が 沈殿した。固形物を濾過して集め、ヘキサン（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄し、真空 下で乾燥させると６３．５ｇの生成物が得られ、それは更に精製することなくそ のまま使用された。実施例７ ５−メチル−１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シ トシン ステンレス鋼高圧容器中、４−トリアジン−１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセ チル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−チミン（７５． ５ｇ，．１９８ｍｏｌ）をアンモニア（４００ｍＬ）に溶解し、一夜密封した。 高圧容器を冷却し、開放してアンモニアを蒸発させた。フラスコへ物質を移すた めにメタノールを加え、約１０容量のエチルエーテルを加えた。混合物は１０間 攪拌した後濾過した。固形物をエチルエーテルで洗浄し、乾燥すると５１．７ｇ （８６％）の表記化合物を得た。実施例８ ４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペ ントフラノシル）−シトシン ５−メチル-１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）− シトシン（５４．６ｇ，０．２１ｍｏｌ）をピリジン（７００ｍＬ）に懸濁し、 無水安息香酸（７０ｇ，．３０９ｍｏｌ）を加えた。混合物は４８時間室温で撹 拌した。ピリジンを蒸発させて除去し、メタノール（８００ｍＬ）を加え混合物 を攪拌した。形成された沈殿を濾過し、メタノール（４ｘ５０ｍＬ）およびエー テル（３ｘ１００ｍＬ）で洗浄し、真空オーブン中４５℃で乾燥させると４０． ５ｇの表記化合物が得られた。濾液は真空下で濃縮し、高圧容器中室温で一夜飽 和メタノール性アンモニアで処理した。混合物を真空下で濃縮し、得られた油状 物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。回収された出発物質 は上記のように再び処理するとさらに４．９ｇの表記化合物が得られ、合計で４ ５．４ｇ（６１％）の表記化合物が得られた。実施例９ ４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ−５−Ｏ−ジメトキシト リチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシン ４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ− ペントフラノシル）−シトシン（４５．３ｇ，．１２４ｍｏｌ）を２５０ｍＬの 乾燥ピリジンに溶解し、ジメトキシトリチルクロリド（４６．４ｇ，．１３７ｍ ｏｌ）を加えた。反応混合物は室温で９０分間攪拌し、メタノール（２０ｍＬ） を加えた。混合物は真空下で濃縮し、酢酸エチル（２ｘ１Ｌ）および飽和炭酸水 素ナトリウム溶液（１Ｌ）に分配した。酢酸エチル層を合併し、硫酸マグネシウ ムで乾燥して真空下蒸発させた。得られた油状物はジクロロメタン（２００ｍＬ ）に溶解し、酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミン（５０：５０：１）を用 いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物分画をプール し、真空濃縮して乾燥させると６３．６ｇ（７６．６％）の表記化合物が得られ た。実施例１０ ４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−(２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ,Ｎ−ジイソ プロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル −β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル)−シトシン ４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ−５−Ｏ−ジメトキシ トリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシン（６１．８ｇ，９ ２．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）、２−シアノエチル Ｎ，Ｎ ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（４０．９ｍＬ，．１ ３０ｍｏｌ）およびジイソプロビノレアミン テトラゾリド（４．７６ｇ，０． ３当量）と室温で１７時間攪拌した。混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１ Ｌ）で洗浄し、炭酸水素ナトリウム溶液はジクロロメタン（５００ｍＬ）で逆抽 出した。合併した有機層は食塩水（１Ｌ）で洗浄し、食塩水はジクロロメタン（ １００ｍＬ）で逆抽出した。合併した有機層は硫酸ナトリウムで乾燥し濾過後約 ２００ｍＬの容量まで濃縮した。得られた物質はヘキサン／酢酸エチル／トリエ チルアミン（６０／４０／１）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーに より精製した。生成物分画を真空下で濃縮し、アセトニトリル（５００ｍL）に 溶解し濾過して真空下で濃縮して乾燥させるとあわ状物が得られた。あわ状物を 砕き一定の重量となるまで２４時間乾燥させると７２．４ｇ（９０％）の表記化 合物が得られた。¹Ｈ ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ₃）δ １．１７−１．３（ｍ，１２ Ｈ，４ｘＣＨ₃），１．５−１．６（ｍ，２Ｈ，２ｘＣＨ），２．３−２．４（ ｔ，１Ｈ，ＣＨ₂ＣＮ），２．６−２．７（ｔ，１Ｈ，ＣＨ₂ＣＮ），３．３−３ ．９（ｍ，１３Ｈ，２ｘＣＨ₃ＯＡｒ，５’ＣＨ₂，ＣＨ₂ＯＰ，Ｃ−５ ＣＨ₃） ，４．２−４．３（ｍ，１Ｈ，４’），４．３−４．７（ｍ，１Ｈ，３’），５ ．０−５．２（ｍ，１Ｈ，２’），６．０−６．２（ｄｄ，１Ｈ，１’），６． ８−６．９（ｍ，４Ｈ，ＤＭＴ），７．２−７．６（ｍ，１３Ｈ，ＤＭＴ，Ｂｚ ），７．８２−７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｃ−６），８．２−８．３（ｄ，２Ｈ，Ｂ ｚ）。³¹Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：ｂｓ，１５１．７０６；ｂｓ，１５１．９ ４１。実施例１１ １−（２，３−ジ−Ｏ−ブチルスズ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）− ５−メチルウリジン ５−メチルウリジン（７．８ｇ，３０．２ｍｍｏｌ）および酸化ジブチルスズ （７．７ｇ，３０．９ｍｍｏｌ）をメタノール（１５０ｍＬ）に懸濁し、１６時 間加熱還流した。反応混合物を室温まで冷却して濾過し、固形物をメタノール( ２ｘ１５０ｍＬ)で洗浄した。得られた固形物を乾燥させると１２．２ｇ（８０ ．３％）の表記化合物が得られた。この物質は続いての反応に更に精製すること なく使用された。ＮＭＲは構造と一致した。実施例１２ １−（２−Ｏ−プロピル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチル ウリジン １−（２，３−ジ−Ｏ−ブチルスズ−β−Ｄ−エリスロ−ベントフラノシル） −５−メチルウリジン（５．０ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）およびヨードプロパン（ １４．７ｇ，７２．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中、１００℃で２日攪拌した。反応混 合物を室温まで冷却し、濾過後濃縮した。残っているＤＭＦはアセトニトリルと 共蒸留した。残渣を乾燥させると２．４０ｇ（７８％）の表記化合物および３’ −Ｏ−プロピル異性体が粗混合物として得られた。この物質は更に精製すること なく続いての反応に使用された。実施例１３ １−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペ ントフラノシル）−５−メチルウリジン 粗混合物としての１−（２−Ｏ−プロピル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノ シル）−５−メチルウリジンおよび３’−Ｏ−プロピル異性体（２．４ｇ，８． ４ｍｍｏｌ）をピリジン（２ｘ４０ｍＬ）と共蒸留し、ピリジン（６０ｍＬ）に 溶解した。溶液はアルゴン下、１５分間室温で攪拌し、ジメトキシトリチルクロ リロ（４．２７ｇ，１２．６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を周期的にｔｌｃで検 査し、３時間で反応が完了した。メタノール（１０ｍＬ）を加え、混合物を１０ 分間攪拌した。反応混合物は真空下で濃縮し、得られた残渣は１％トリエチルア ミンを含むヘキサン／酢酸エチル（６０：４０）を用いるシリカゲルカラムクロ マトグラフィーにより精製した。適切な分画を集めて濃縮すると１．３２ｇ（２ ６％）の表記化合物が得られた。実施例１４ １−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノ エチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペント フラノシル）−５−メチルウリジン １−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ− ペントフラノシル）−５−メチルウリジン（５０．０ｇ，８６ｍｍｏｌ）、２− シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト （３８ｍＬ，８６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルアミンテトラゾリド（４．４ ５ｇ，２５．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解し、室温で４ ０時間攪拌した。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２ｘ４００ｍＬ） および食塩水（１ｘ４００ｍＬ）で洗浄した。水溶液層はジクロロメタンで逆抽 出した。ジクロロメタン層を合併し、硫酸ナトリウムで乾燥し濾過後、真空下濃 縮した。得られた残渣は酢酸エチル／ヘキサン（４０：６０）および１％トリエ チルアミンを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。適切 な分画を集めて濃縮し、高真空下で乾燥すると４３ｇ（６７％）の生成物が得ら れた。実施例１５ １−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β −Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン １−（２−Ｏ−プロピル−５−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペン トフラノシル）−５−メチルウリジン（１０．０ｇ，１６．６ｍｍｏｌ）をピリ ジン（５０ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（４．７ ｍｌ，５２．７ｍｍｏｌ）を加 えた。反応混合物は１８時間攪拌し、過剰の無水酢酸はメタノール（１０ｍＬ） で中和した。混合物は真空下で濃縮し、得られた残渣は酢酸エチル（１５０ｍＬ ）に溶解した。酢酸エチルは飽和ＮａＨＣＯ₃（１５０ｍＬ）で洗浄し、飽和Ｎ ａＨＣＯ₃は酢酸エチル（５０ｍＬ）で逆抽出した。酢酸エチル層を合併し、真 空下で濃縮すると１１．３ｇの白色あわ状物が得られた。粗収率は１００％以上 であり、ＮＭＲは表記化合物の構造から予期されるものと一致した。この物質は 更に精製されることなく続いての反応に使用された。実施例１６ １−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β −Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−４−トリアゾロ−５−メチルピリミジン トリアゾール（１０．５ｇ，１５２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１２０ｍｌ ）およびトリエチルアミン（２３ｍＬ）に溶解し、無水条件下で攪拌した。得ら れた溶液をドライアイスアセトン浴で冷却し、５分以上かけてオキシ塩化リン（ ３．９ｍＬ，４１ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。混合物を更に１０分攪拌すると、 生成物形成の指標となる薄いスラリー状となった。１−（２−Ｏ−プロピル−３ −Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラ ノシル）−５−メチルウリジン（１１．２ｇ，１６５ｍｍｏｌ）をアセトニトリ ル１５０ｍＬに溶解し、ドライアイスアセトン浴の温度を保ちながら上記スラリ ーへ加えた。反応混合物を３０分攪拌し次に放置して室温まで温め、更に２時間 撹拌した。混合物はフリーザー中、０℃で１８時間放置した後取り出し室温まで 温めた。混合物の酢酸エチル／ヘキサン（１：１）でのｔｌｃは出発物質の完全 な変換を示した。反応混合物は真空下で濃縮し酢酸エチル（３００ｍＬ）に再溶 解しし、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２ｘ４００ｍＬ）および食塩水（４００ ｍＬ）で抽出した。水溶液層は酢酸エチル（２００ｍＬ）で逆抽出した。酢酸エ チル層を合併し、硫酸ナトリウムで乾燥し真空下で濃縮した。粗収率は１１．３ ｇ（９５％）であった。ＮＭＲは表記化合物の構造から予期されるものと一致し た。この物質は更に精製されることなく続いての反応に使用された。実施例１７ １−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペ ントフラノシル）−５−メチルシチジン １−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル− β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−４−トリアゾロ−５−メチルピリミジ ン（１１．２ｇ，１６．１ｍｍｏｌ）をドライアイスアセトン温度で１００ｍＬ の高圧容器中で液体アンモニア（５０ｍＬ）に溶解した。高圧容器は放置して室 温まで温め、１８時間後ドライアイスアセトン温度まで再冷却した。高圧容器内 容物をビーカーに移し、メタノール（５０ｍＬ）を加えた。混合物は放置してほ とんど乾固するまで蒸発させた。酢酸エチル（３００ｍＬ）を加え、飽和炭酸水 素ナトリウム溶液（２ｘ２５０ｍＬ）での洗浄に先立ち固形物を濾過して除いた 。酢酸エチル層は硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して先ほど濾過して除いた固 形物と合わせ、真空下濃縮すると１０．１ｇの物質が得られた。粗収率は１００ ％以上であり、ＮＭＲは表記化合物の構造から予期されるものと一致した。この 物質は更に精製されることなく続いての反応に使用された。実施例１８ １−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペ ントフラノシル）−４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシチジン １−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ− ペントフラノシル）−５−メチルシチジン（７．２８ｇ，１０．１ｍｍｏｌ）お よび無水安息香酸（４．５ｇ，２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６０ｍＬ）に溶解し室 温で１８時間攪拌した。反応混合物は真空下で濃縮し、酢酸エチル（３００ｍＬ ）に再溶解した。酢酸エチル溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２ｘ４００ｍ Ｌ）で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥して濾過し、真空下濃縮した。残渣は酢酸エ チル／ヘキサン（１：２）および１％トリエチルアミンを用いるシリカゲルカラ ムクロマトグラフィーにより精製した。適切な分画を集めて濃縮し、高真空下で 乾燥させると５．１ｇ（１−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル −β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジンから出発する４ 工程に対して５９％）の生成物を得た。実施例１９ １−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノ エチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペント フラノシル）−４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシチジン １−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ− ペントフラノシル）−４−Ｎ−ベンゾイル-５−メチルシチジン（５．０ｇ，７ ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ−イソプロピルホ スホロジアミダイト（３．６ｍＬ，１１．３ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルア ミノテトラゾリド（０．４２ｇ，２．４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（８０ｍＬ ）に溶解し、室温で４０時間攪拌した。反応混合物は飽和炭酸水素ナトリウム溶 液（２ｘ４０ｍＬ）および食塩水（１ｘ４０ｍＬ）で洗浄した。ジクロロメタン 層を合併し、硫酸ナトリウムで乾燥して濾過し、真空下で濃縮した。得られた残 渣は酢酸エチル／ヘキサン（４０：６０）および１％トリエチルアミンを用いる シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。適切な分画を集めて濃縮 し、高真空下で乾燥させると７．３ｇ（９８％）の生成物を得た。実施例２０ ２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン 方法１ ： ステンレス鋼製高圧容器（１００ｍＬ容量）内で粗２，２’−アンヒドロ−５ −メチルウリジン（１０．０ｇ，０．０４１６ｍｏｌ）をメタノール（８０ｍＬ ）に溶解した。ホウ酸トリメチル（５．６ ｍＬ，０．０４９ｍｏｌ）を加えた （注１）。高圧容器を密封し１５０℃の油浴に浸すと約５気圧の圧力を発生した 。４０時間後、高圧容器を氷で冷やして開いた後、内容物を減圧下で濃縮すると 黄褐色のあわ状物が１２ｇ得られた。粗生成物のＮＭＲは出発物質中の不純物が 混入した生成物および痕跡量のチミンおよび出発物質と一致した（注２）。生成 物はそのまま次の工程で使用された。 ホウ酸トリアルキルは水素化ホウ素の溶液（例えば１Ｍ ＴＨＦ溶液）に所望 のアルコールを加え水素ガスを発生させることにより都合よく生じさせることが できることに注目されたい。また、ヌクレオシドはこの時点で酢酸エチル中のメ タノールノ濃度勾配（０−１０％）を用いたカラムクロマトグラフィーおよび無 水エタノールからの生成物の再結晶により精製でき、白色針状晶、ｍｐ１９２− １９３ー°（ｍｐ１９７−１９８°）が得られることに注目されたい。この化合 物の融点に関する参考文献はＯｏｔｓｕｋａ，Ｈ．Ｉｎｏｕｅ，日本特許第８９ −８５４５６号（１９８９年４月４日）に含まれている。方法２ ： ステンレス鋼製高圧容器（１００ｍＬ容量）内で、純粋な２，２’−アンヒド ロ−５−メチルウリジン（１．０ｇ，４．１６ｍｍｏｌ）およびホウ酸トリメチ ル（０．５６ｍＬ，４．９ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解した。高 圧容器は１５０℃の油浴に浸した。８０時間後、ＴＬＣは反応がほとんど完全で あることを示している。溶媒を除去すると白色のあわ状物が得られた．ＮＭＲは 生成物と出発物質の比が９３：７であり、他の不純物が含まれていないことを示 した。残渣は酢酸エチル中メタノールの濃度勾配（０−１０％）を用いるシリカ ゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、８５０ｍｇ（７５％）の純粋な 生成物および２５０ｍｇの未だに不純な生成物が得られた。分析的に純粋な試料 がＮＭＲのために調製された。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）：δ １．７９（ ｓ，３Ｈ，５−ＣＨ₃），３．３５（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ₃），３．５−３．７（ｍ ，２Ｈ，Ｈ−５’），３．７−３．９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３’，４’），４．１５ （ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），５．１７（ｍ，２Ｈ，３’，５’−ＯＨ），５．８７ （ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’），７．８０（ｓ，１Ｈ，Ｈ−６），１１． ３７（ｂｒ ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）。元素分析：Ｃ₁₁Ｈ₁₆Ｎ₂Ｏ₆（２７２．２６） として計算値：Ｃ，４８．５２；Ｈ，５．９２；Ｎ，１０．２９。実測値：Ｃ， ４８．５６：Ｈ，５．８８；Ｎ，１０．２２。方法３ ： 純粋な２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１０．０ｇ，４１．６ｍ ｍｏｌ）、ホウ酸トリメチル（１０．０ｍＬ，８５ｍｍｏｌ）、ＮａＨＣＯ₃（ ３ ０ｍｇ）およびＭｅＯＨ（７０ｍＬ）を高圧容器中、約１７５℃で６０時間加熱 した。高圧容器を室温まで冷却し、内容物を真空下で蒸発させると白色あわ状物 が得られた。得られたあわ状物はエーテル（１００ｍＬ）で磨砕し、生じる白色 固形物を濾過により集め,５０℃で４時間真空下で乾燥させると表記化合物１０ ７ｇ（１００％）が得られた。ＮＭＲ分析は約３％の不純物が出発物質チミンお よびアラ−５−メチルウリジンとして同定されることを示している。実施例２１ ５’−Ｏ−ジメトキシトリフェニルメチル−２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリ シン 粗２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン（１２ｇ）をピリジン（２ｘ５０ｍ Ｌ）と共沸させ、乾燥ピリジン（５０ｍＬ）に溶解した。ジメトキシトリフェニ ルメチルクロリド（１８．１ｇ，０．０５４ｍｏｌ）を加えた。フラスコに栓を し４５分間室温で放置した。反応停止させるためにメタノール（１０ｍＬ）を加 え溶液は減圧下で油状物となるまで濃縮した。残渣を酢酸エチル（２ｘ４００ｍ Ｌ）および飽和炭酸水素ナトリウム溶液（５００ｍＬ）に分配した。有機層を合 併し乾燥後（硫酸ナトリウム）濾過して黄色泡状物となるまで濃縮した。泡状物 はメチレンクロリド（６０ｍＬ）に溶解し、シリカゲルカラム（３００ｇ）上に のせ、酢酸エチル−ヘキサン−トリエチルアミン（６０：４０：１）で溶出した 。生成物含有分画を合併し、濃縮して乾燥アセトニトリル（２ｘ５０ｍＬ）と共 沸した。得られた残渣は１ｍｍＨｇで２４時間乾燥させると堅くてもろい白色泡 状物を得た、１７．０ｇ（５−メチルウリジンからの三工程で６０．４％）。実施例２２ ２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−チオ−５−メチルウリジン ２５０ｍｌの３頸丸底フラスコ中で１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ −ベンゾイルリボース（０．５００ｇ，１ｍｍｏｌ）および５−メチル−２−チ オ−ウラシル（０．１５６ｇ，１．１ｍｍｏｌ）を真空下一夜乾燥させた。これ らの成分を１０ｍＬの乾燥アセトニトリルに溶解し８０℃まで加熱した。この温 かい溶液にＮ−Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（０．５０９ｇ，２ ．５ｍｍｏｌ）を加え、反応液は８０℃で１時間攪拌した。反応混合物の加熱を 止め放置して室温まで冷却し、トリメチルシリルトリフレート（０．３３４ｇ， １．５ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物は次に５０℃まで加熱し、４時間攪拌 した。反応混合物は酢酸エチル／ヘキサン（１：１）を用いるＴＬＣにより検査 され、反応が完了していることが示された。溶液を室温まで冷却し、５０ｍＬジ クロロメタンのおよび５０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液に分配した。水溶 液層はジクロロメタンで２回以上抽出し、有機層を合併し、硫酸マグネシウムで 乾燥させ、濃縮すると淡黄色の泡状物が得られた。この泡状物は更に精製するこ となく使用された。実施例２３ ２−チオ−５−メチルウリジン 粗２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−チオ−５−メチルウリジン（２０ ｇ，３７ｍｍｏｌ）を５００ｍＬのメタノールに溶解した。この溶液にナトリウ ムメトキシド（２．０ｇ，３７ｍｍｏｌ）を加え、反応液は２時間攪拌した。反 応液を酢酸エチル／ヘキサン（１：１）および酢酸エチル／メタノール（９：１ ）を用いるＴＬＣにより検査すると、反応が完了していることが示された。溶液 がｐＨ試験紙により溶液が中性になるまでＤｏｗｅｘ ５０ Ｈ⁺樹脂を加え、 樹脂は濾過した。樹脂は次に１００ｍｌの別のメタノールで洗浄し、合併した濾 液を濃縮すると表記化合物８．５ｇ（８４％）を淡黄色泡状物として得た。実施例２４ ２’−Ｏ−メチル−５−メチル−２−チオウリジン ５−メチル-２−チオウリジン（０．５００ｇ，１．８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（ １０ｍｌ）溶液を攪拌し、酸化ジブチルスズ（０．５００ｇ，２．０ｍｍｏｌ） 、ヨウ化テトラブチルアンモニウム（０．７３８ｇ，２ｍｍｏｌ）およびヨウ化 メチル（１．０２２ｇ，７．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応フラスコを封じ５０℃ で１６時間加熱した。混合物を冷却し更にヨウ化メチルを加え（１．０２２ｇ， ７． ２ｍｍｏｌ）反応液は更に１６時間加熱した。この時間が終了すると反応混合物 を室温まで冷却し、メチレンクロリドで希釈し、メチレンクロリド／メタノール 濃度勾配を用いてクロマトグラフィーを行った。適切な分画を集めて濃縮すると ２’−Ｏ−メチル−５−メチル-２−チオウリジンが得られた。実施例２５ ２’−Ｏ−プロピル−５−メチル−２−チオウリジン 表記化合物はヨウ化メチルをヨウ化プロピル（１．２２ｇ，７．２ ｍｍｏｌ ）に置換することにより実施例２４の方法に従って製造される。実施例２６ ２’−Ｏ−フタルイミドプロピル−５−メチル-２−チオウリジン 表記化合物はヨウ化メチルをブロモ−プロピルフタルイミド（０．６７ｇ，２ ．５ｍｍｏｌ）に置換し、２日目に追加（０．３００ｇ）を加える実施例２４の 方法従って製造される。実施例２７ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルアミン−５−メチル−２− チオウリジン ２’−ｏ−フタルイミドプロピル−５−メチル-２−チオウリジン（２．６ｇ ，３．６ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンに溶解し２回共沸させた。得られた泡状物は ２５ｍＬの乾燥ピリジンに溶解し、ジメトキシトリチルクロリド（１．８ｇ，５ ．５ｍｍｏｌ）および続いて４，４−ジメチルアミノピリジン（０．０５０ｇ， ０．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応液は室温で一夜攪拌させた。反応混合物へ１ｍ Ｌのメタノールを加えた。この溶液は７５ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液お よび５０ｍＬのクロロホルムに分配した。水溶液層を２回新しいクロロホルムで 抽出し、有機層を併せて硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過して乾燥剤を除去し た後、濾液を濃縮するとオレンジ色の油状物となり、シリカゲルを中和するため に加えられた０．５％のピリジンを含むメタノール／クロロホルム濃度勾配を用 いるシ リカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製された。実施例２８ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルアミン−５−メチル−２Ｓ −トルオイル−２−チオウリジン ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルアミン−５−メチル−２ −チオウリジン（１ｇ，１．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し０℃まで冷却した。 この溶液にトリエチルアミン（０．３００ｇ，３ｍｍｏｌ）を加え、続いてトル オイルクロリド（０．３００ｇ，１．９２ｍｍｏｌ）を５分以上かけて滴加する 。反応液は次に放置して室温まで温め、一夜攪拌する。反応が完了したらメタノ ールで反応を停止させ、油状物になるまで濃縮する。この油状物は次に２５０ｍ Ｌの飽和炭酸水素ナトリウム／クロロホルム（１：１）の溶液に分配する。水溶 液層を更に７５ｍＬのクロロホルムで２回抽出し、有機層を乾燥して油状物を得 るまで乾燥する。保護ヌクレオシドはヘキサン／酢酸エチル濃度勾配を用いるシ リカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製する。所望の生成物はＮ−３トル オイルおよびＳ−２トルオイル化合物の混合物として集められる。この混合物は ホスフィチル化工程に使用される。実施例２９ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルアミン−３’−Ｏ−［（Ｎ ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシホスファイト］−５−メチ ル−２−Ｓ−トルオイル−２−チオウリジン ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルアミン−５−メチル−２ Ｓ−トルオイル-２−チオウリジン（１６．０１ｇ，２２ｍｍｏｌ）およびジイ ソプロピルエチルアミン（１０ｍｌ）のＴＨＦ（２００ｍｌ）溶液に、０℃でク ロロ−β−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィン（５．６ ｍｌ，２５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は室温で２４時間攪拌する。反応液 を濃縮し、残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製される。酢酸 エチル／ヘキサン濃度勾配により溶出し（その間１％トリエチルアミンを維持す る）、適切な分画を集めて蒸発させると、表記化合物が得られるであろう。実施例３０ ２’−Ｏ−アミノプロピル−５−メチル-２−チオウリジン ５００ｍＬのフラスコ中で、２’−Ｏ−フタルイミドプロピル−５−メチル− ２−チオウリジン（５．０ｇ，１５．８ｍｍｏｌ）を１００ｍｌノメタノールに 溶解した。ヒドラジン（２．０２ｇ，６３．２ｍｍｏｌ）を加え、混合物は撹拌 しながら１４時間加熱還流（６０−６５℃）する。溶媒を真空下蒸発させ、残渣 をジクロロメタン（１５０ｍＬ）に溶解し、等量のＮＨ₄ＯＨで２回抽出する。 有機層を蒸発させると粗生成物が得られる。ＮＭＲが生成物純度の検定に使用さ れる。本生成物は更に精製することなく続いての反応に使用される。実施例３１ ２’−Ｏ−トリフルオロアセチルアミノプロピル−５−メチル-２−チオウリジ ン ２’−Ｏ−アミノプロピル−５−メチル−２−チオウリジンをＭｅＯＨに溶解 し５当量のトリエチルアミン、続いて１０当量のエチルトリフルオロ酢酸を加え る。表記化合物が精製後に単離される。実施例３２ ２’−Ｏ−トリフルオロアセチルアミノプロピル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ ル−５−メチル−２−チオウリジン ２’−Ｏ−トリフルオロアセチルアミノプロピル−５−メチル−２−チオウリ ジン（２．５ｇ，３．６ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンに溶解して２回共沸させる。 得られた黄色泡状物を２５ｍＬの乾燥ピリジンに溶解しジメトキシトリチルクロ リド（１．８ｇ，５．５ｍｍｏｌ）および続いて４，４−ジメチルアミノピリジ ン（０．０５０ｇ，０．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応液は室温で一夜攪拌させた 。反応混合物へ１ｍＬのメタノールを加えた。この溶液は７５ｍＬの飽和炭酸水 素ナトリウム溶液および５０ｍＬのクロロホルムに分配した。水溶液層を２回新 し いクロロホルムで抽出し、有機層を併せて硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過し て乾燥剤を除去した後、濾液を濃縮すると油状物となり、シリカゲルを中和する ために加えられた０．５％のピリジンを含むメタノール／クロロホルム濃度勾配 を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、表記化合物が得 られる。実施例３３ ２’−Ｏ−トリフルオロアセチルアミノプロピル−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイ ソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシホスファイト］−５’−Ｏ−ジメトキ シトリチル-５−メチル−２−チオウリジン 表記化合物は実施例３２の表記化合物を用いて実施例２９の方法に従って製造 される。実施例３４ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−チオ-５−メチルウリジン ２−チオ−５−メチルウリジン（１ｇ，３．６ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンに溶 解して２回共沸させた。得られた黄色泡状物を２５ｍＬの乾燥ピリジンに溶解し ジメトキシトリチルクロリド（１．８ｇ，５．５ｍｍｏｌ）および続いて４，４ −ジメチルアミノピリジン（０．０５０ｇ，０．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応液 は室温で一夜攪拌させた。反応混合物へ１ｍＬのメタノールを加えた。この溶液 は７５ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液および５０ｍＬのクロロホルムに分配 した。水溶液層を２回新しいクロロホルムで抽出し、有機層を併せて硫酸マグネ シウムで乾燥した。濾過して乾燥剤を除去した後、濾液を濃縮するとオレンジ色 の油状物となり、シリカゲルを中和するために加えられた０．５％のピリジンを 含むメタノール／クロロホルム濃度勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラ フィーにより精製される。実施例３５ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−メチル −２−チオウリジン ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−チオ−５−メチルウリジン（１ｇ，１． ７３ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦと２回共沸し、乾燥ＤＭＦに溶解してイミダゾール （０．１４１ｇ，２．０８ｍｍｏｌ）続いてｔ−ブチルジメチルシリルクロリド （０．３１３ｇ，２．０８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は一夜攪拌した。反 応液は酢酸エチル／ヘキサン１：１を用いるＴＬＣで検査すると、反応がすでに 完了していることを示した。反応混合物を５％炭酸水素ナトリウム内へ注ぎクロ ロホルムで３回抽出した。合併した有機溶液は硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮 すると油状物が得られた。得られた油状物はメタノール／クロロホルム濃度勾配 を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、２’および３’ シリル保護ヌクレオシドが別々に単離された。実施例３６ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−２’−メタ ンスルホニル−５−メチル−２−チオウリジン ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−メチ ル−２−チオウリジン（１．０ｇ，１．４５ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し０℃ まで冷却した。この溶液にメタンスルホニルクロリド（０．１８３ｇ，１．６ｍ ｍｏｌ）を滴加した。反応液はＴＬＣにより反応の完了が示されるまで攪拌した 。反応混合物はメタノールで中和し、濃縮して油状物とした。表記化合物は続い ての反応にそのまま使用された。実施例３７ ５’−ＤＭＴ−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−２，２’チオアンヒドロ−５ −メチル−２−チオウリジン 実施例３６で観察されたメチル化ヌクレオシドを５当量のナトリウムムメトキ シドを用いて室温で処理し、チオアンヒドロ化合物の形成が完了するまで攪拌し た。溶液は次にＤｏｗｅｘ ５０Ｗ（Ｈ⁺型）で中和し、樹脂は濾過して除き、 得られた溶液を濃縮すると表記化合物が得られる。実施例３８ ２’−フルオロ−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−５’−ＤＭＴ−５−メチル −２−チオウリジン 実施例３７のチオアンヒドロヌクレオシドを無水ジオキサンに溶解した。この 溶液に６当量のＨＦ／ピリジン複合体を加え、反応液はＴＬＣにより反応が完了 するまで攪拌した。反応混合物は次に等量の氷に注ぎ、中性になるまで炭酸カル シウムを加えた。固形物を濾過して除き、炉液を濃縮した。残渣はシリカゲルカ ラムクロマトグラフィーにより精製され、表記化合物が得られる。実施例３９ ２’−フルオロ−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノ エトキシホスファイト］−５’−ＤＭＴ−５−メチル−２−チオウリジン ２’−フルオロ−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−５’−ＤＭＴ−５−メチ ル−２−チオウリジンを実施例２９の方法に従って処理すると表記化合物が得ら れる。実施例４０ ２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラロシル）−５−メチルウリ ジン］ ５−メチルウリジン（リボシルチミン Ｙａｍａｓａ，Ｃｈｏｓｈｉ，Ｊａｐ ａｎを通して市販品として入手可能）（７２．０ｇ，０．２７９ｍｏｌ）ジフェ ニルカーボネート（９０．０ｇ，０．４２０ｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム （２．０ｇ，０．０２４ｍｏｌ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に加えた。混合物は攪 拌しながら加熱還流し、攪拌することにより放出されるべき二酸化炭素ガスの発 生を制御された様式に抑えた。一時間後、わずかに色が濃くなった溶液は減圧下 で濃縮した。得られたシロップは攪拌しながらジエチルエーテル（２．５Ｌ）に 注いだ。エーテルはデカントし、残渣は最少量のメタノール（約４００ｍＬ）に 溶解した。この溶液を新しいエーテル（２．５Ｌ）に注ぐと堅いゴム状物が得ら れた。エーテルをデカントしゴム状物を真空オーブン中で乾燥すると（６０℃、 １ｍｍＨｇで２４時間）固形物が得られ、それを粉砕するとうすい黄褐色の粉末 （５７ｇ，８５％の粗収率）が得られた。この物質は続いての反応にそのまま使 用された。実施例４１ ２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン ２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ，０．８１Ｍ）、トリ ス（２−メトキシエチル）ボレート（２３１ｇ，０．９８Ｍ）および２−メトキ シエタノール（１．２Ｌ）を２Ｌのステンレス鋼製圧力容器に加え、１６０℃の 前もって加熱されている油浴に浸した。１５５−１６０℃で４８時間加熱した後 、容器を開け、溶液を蒸発乾固させてＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で摩砕した。残渣 は熱アセトン（１Ｌ）に懸濁した。不溶性塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ） で洗浄した後、濾液を蒸発させた。残渣（２８０ｇ）をＣＨ₃ＣＮ（６００ｍＬ ）に溶解し、蒸発させた。０．５％のＥｔ₃ＮＨを含むＣＨ₂Ｃｌ₂／アセトン／ ＭｅＯＨ（２０：５：３）でシリカゲルカラム（３ｋｇ）を充填した。カラムに 加える前に残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（２５０ｍＬ）に溶解してシリカ（１５０ｇ）に吸 着させた。生成物を充填溶媒で溶出すると１６０ｇ（６３％）の生成物が得られ た。実施例４２ ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジ ン ２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ，０．５０６Ｍ） をピリジン（２５０ｍＬ）と共蒸留し、乾燥残渣をピリジン（１．３Ｌ）に溶解 した。最初のジメトキシトリチルクロリド（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え 室温で１時間攪拌した。第二のジメトキシトリチルクロリド（９４．３ｇ，０． ２７８Ｍ）を加え、さらに室温で１時間攪拌した。次に反応を停止させるために メタノール（１７０ｍＬ）を加えた。ＨＰＬＣは約７０％の生成物の存在を示し た。溶媒を留去し、ＣＨ₃ＣＮ（２００ｍＬ）と摩砕した。残渣はＣＨＣｌ₃（１ ． ５Ｌ）に溶解して２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ₃および２ｘ５００ｍＬの飽 和ＮａＣｌで抽出した。有機相はＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過後蒸発させた。２７ ５ｇの残渣が得られた。残渣は０．５％のＥｔ₃ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサ ン／アセトン（５：５：１）で充填および溶出するシリカゲルカラム（３．５ｋ ｇ）で精製した。純粋な分画を蒸発させると１６４ｇの生成物が得られた。約２ ０ｇの追加の生成物が不純な分画から得られ、全収量は１８３ｇ（５７％）であ った。実施例４３ ３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ ル−５−メチルウリジン ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリ ジン（１０６ｇ，０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦおよ び１８８ｍＬのピリジンから作製された７５０ｍＬの３：１混合物）および無水 酢酸（２４．３８ｍＬ，０．２５８Ｍ）を混ぜ、室温で２４時間攪拌した。ｔｌ ｃ試料を最初にＭｅＯＨで反応停止させることによりｔｌｃで反応をモニターし た。反応完了後（ｔｌｃで判断された）、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加え、３５℃ で混合物を蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ₃（８００ｍＬ）に溶解し、２ｘ２００ ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムおよび２ｘ２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した 。水層は２００ｍＬのＣＨＣｌ₃で逆抽出した。合併した有機層は硫酸ナトリウ ムで乾燥し、蒸発させると１２２ｇの残渣（約９０％の生成物）を与えた。残渣 は３．５ｋｇのシリカゲルカラムで精製され、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１） で溶出した。純粋な分画を蒸発させると９６ｇ（８４％）が得られた。実施例４４ ３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ ル-５−メチル−４−トリアゾールウリジン 第一の溶液として３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ −ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ，０．１４４Ｍ）をＣＨ₃ ＣＮ（７００ｍＬ）に溶解して取っておく。トリエチルアミン（１８９ｍＬ，１ ．４４Ｍ）をトリアゾール（９０ｇ，１．３Ｍ）のＣＨ₃ＣＮ（１Ｌ）溶液に加 え、−５℃に冷却してオーバーヘッド攪拌機を用いて０．５時間攪拌した。０− １０℃に維持されている攪拌溶液に３０分以上かけてＰＯＣｌ₃を滴加し、得ら れた混合物はさらに２時間攪拌した。この溶液に４５分以上かけて第一の溶液を 滴加した。得られた反応混合物は低温室に一夜貯蔵した。反応混合物から塩を濾 去し、溶液は蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解し、不溶性固形物は 濾過して除いた。濾液は１ｘ３００ｍＬのＮａＨＣＯ₃および２ｘ３００ｍＬの 飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して蒸発させた。残渣をＥｔＯＡ ｃと摩砕すると表記化合物が得られた。実施例４５ ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジ ン ３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリ チル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ，０．１４１Ｍ）のジ オキサン（５００ｍＬ）およびＮＨ₄ＯＨ（３０ｍＬ）溶液を室温で２時間攪拌 した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣はＭｅＯＨ（２ｘ２００ｍＬ）と共沸さ せた．残渣はＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解し２リットルのステンレス鋼圧力容 器に移した。ＮＨ₃ガスで飽和させたＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を加え、容器は１ ００℃で２時間加熱した（ｔｌｃは完全な変換を示した）。容器内容物を蒸発乾 固させ、残渣はＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ ）で一度洗浄した。有機層は硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させると８５ ｇ（９５％）の表記化合物が得られた。実施例４６ Ｎ⁴−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル −５−メチルシチジン ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチ ジン（８５ｇ，０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶解し、無水安息香酸 （３７．２ｇ，０．１６５Ｍ）を攪拌しながら加えた。３時間攪拌後、ｔｌｃは 反応が約９５％完了していることを示した。溶媒を蒸発させ、残渣はＭｅＯＨ（ ２００ ｍＬ）と共沸させた。残渣をＣＨＣｌ₃（７００ｍＬ）に溶解し、飽和 ＮａＨＣＯ₃（２ｘ３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２ｘ３００ｍＬ）で抽出 し、ＭｇＳＯ₄で乾燥してて蒸発させると残渣（９６ｇ）が得られた。残渣には ０．５％のＥｔ₃ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を用いる１．５ｋ ｇのシリカカラムでクロマトグラフィーを行った。純粋な生成物分画を蒸発させ ると９０ｇ（９０％）の表記化合物が得られた。実施例４７ Ｎ⁴−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル −５−メチルシチジン−３’−アミダイト Ｎ⁴−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ ル−５−メチルシチジン（７４ｇ，０．１０Ｍ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（１Ｌ）に溶解し た。テトラゾール ジイソプロピルアミン（７．１ｇ）および２−シアノエトキ シ−テトラ（イソプロピル）ホスファイト（４０．５ｍＬ，０．１２３Ｍ）を窒 素雰囲気下で攪拌しながら加えた。得られた混合物は室温で２０時間攪拌した（ ｔｌｃは反応が約９５％完了していることを示した）。反応混合物は飽和ＮａＨ ＣＯ₃（１ｘ３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（１ｘ３００ｍＬ）で抽出した。 水性洗浄液はＣＨ₂Ｃｌ₂（３００ｍＬ）で逆抽出し、抽出物を合併してＭｇＳＯ₄ で乾燥して濃縮した。得られた残渣はＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を溶出 溶媒として用いる１．５ｋｇのシリカカラムでクロマトグラフィーを行った。純 粋な分画を蒸発させると９０．６ｇ（８７％）の表記化合物が得られた。評価 方法１ ２’−Ｏ−置換オリゴリボヌクレオチド ヌクレアーゼ安定性 ２’−Ｏ−メチルホスホロアミダイトはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅ ｒｌｉｎｇ，ＶＡから購入された。２’−Ｏ−プロピルおよび２’−Ｏ−ペンチ ルホスホロアミダイトはＬｅｓｎｉｋ， Ｅ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ ，１９９３，３２，７８３２−７８３８；Ｇｕｉｎｏｓｓｏら、Ｎｕｃｌｅｏ ｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ，１９９１，１０，２５９−２６ ２に記載されているように製造した。２’−Ｏ−置換ヌクレオシドで誘導体化さ れたＣＰＧはＤａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．，Ｇｉａｎｎａｒｉｓ，Ｐ．Ａ．およびＺａ ｂａｒｙｌｏ，Ｓ．Ｖ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８， ３８１３−３８２１により記載されているように製造した。固相ＤＮＡ合成のた めのその他の試薬は市販品が購入された。オリゴマーはＡＢＩモデル３８０Ｂ ＤＮＡ合成機により固相化学を用いて合成された。オリゴマーはポリアクリルア ミドゲル電気泳動により精製され、続いてＰｏｌｙ−ｐａｋカートリッジ（Ｇｌ ｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）で脱塩された。オリゴリボ ヌクレオチドは［ｇ−³²Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチド キナーゼを用 いて５’末端標識された。標識反応後、Ｔ４ボリヌクレオチド キナーゼは３分 間９５℃で熱不活性化され、オリゴマーはさらに精製することなく使用された。 ヌクレアーゼ耐性研究のために合成されたオリゴリボヌクレオチド配列は表１ に示されている。１２−ｍｅｒ系列内への異なった２’−Ｏ−アルキル残基の取 り込みはエレクトロスプレー質量分析法により確認され、計算された質量と測定 された質量は０．０１％以内で一致した。 蛇毒ホスホジエステラーゼ（μｇＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）アッセイ は１μＭオリゴマーを用い、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、７２ｍＭＮ ａＣｌおよび１４ｍＭ ＭｇＣｌ₂の緩衝液中、３７℃にて酵素濃度５ｘ１０^-2 μｇ／ｍｌまたは５ｘ１０^-3μｇ／ｍｌで実施された。本酵素はこれらの条件下 、少なくとも２４時間その活性を維持することが示された。ヌクレアーゼＳ１（ Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）アッセイは、１μＭの オリゴマーを用い、３７℃にて３０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ４．５、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＺｎＣｌ₂中で実施された。ヌクレアーゼＳ１は１．９ μｇ／ｍｌまたは１．９ｘ１０⁶μｇ／ｍｌで使用された。ヌクレアーゼ安定 性試験反応液の一部を指定された時間に採り、探知色素を含む等量の８０％ホル ムアミドゲル負荷緩衝液の添加により反応を停止させ、９５℃で２分間加熱し、 変性ポリアクリルアミド電気泳動による分析まで−２０℃で保存した。定量はＭ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ（Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で実施した。 １７−ｍeｒ系列のヌクレアーゼ安定性が蛇毒ホスホジエステラーゼを用いて 試験された。完全長物質の量をその最初の値の５０％へ減少させるのに必要な時 間（ｔ_1/2）が表４に示されている。相対的ヌクレアーゼ安定性は観察されたｔ_{1 /2} 値を非修飾化合物のｔ_1/2時間で割ることにより計算された。１７−ｍeｒ系列 の２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−プロピル類似体の両方とも５ｘ１０^-3μｇ ／ｍｌの酵素濃度で非修飾対照物よりも７４倍安定であった。この系列の２’ −Ｏ−メチルと２’−Ｏ−プロピル類似体とのヌクレアーゼ安定性の相違を区別 するため酵素濃度を増加させた。５ｘ１０^-2μｇ／ｍｌの酵素濃度でＳＶＰＤア ッセイを実施すると、約２．５分で完全長２’−デオキシホスホジエステルオリ ゴマーの５０％の分解が起こった。同一の反応条件下、２’−Ｏ−メチルホスホ ジエステル、２’−Ｏ−プロピルホスホジエステルおよび２’デオキシホスホロ チオエート類似体は２’−デオキシホスホジエステル対照物より１２０、１６０ および３５０倍安定であった（表２）。これらの類似体の変性ポリアクリルアミ ドゲル分析は、完全に修飾されたオリゴリボヌクレオチドは最初のいくつかの３ ’−ヌクレオチドを著しく超えては分解が進行しないことを示し、一方、非修飾 オリゴマーは分解生成物のラダーを示した。定性的には、本分析は２’−Ｏ−ペ ンチル類似体が２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−プロピルオリゴマーよりもエ キソヌクレアーゼ分解に対してより耐性があることを示唆している（データは示 されていない）。２’−Ｏ−ペンチル類似体の定量的分析は二つの理由により困 難であった。第一に、２’−Ｏ−ペンチルオリゴマーはポリヌクレオチドキナー ゼには適さない基質であるため、有効な標識ができない。第二に、非常にたびた び標識２’−Ｏ−ペンチルオリゴマーの大部分はゲルの頂上で捕捉される。１７ −ｍｅｒのこの系列については、安定性の順序は以下のように思われる：２’− デオキシホスホロチオエート＞２’−Ｏ−ペンチルホスホジエステル＞２’−Ｏ −プロピルホスホジエステル＞２’−Ｏ−メチルホスホジエステル＞２’−デオ キシホスホジエステル。 １２−ｍｅｒ系列の相対的ヌクレアーゼ安定性もまた蛇毒ホスホジエステラー ゼを用いて決定された。この１２−ｍｅｒ系列は３’末端残基を含む全ての位置 に２’−Ｏ−アルキル糖修飾を含む。２’−Ｏ−メチルホスホジエステル、２’ −Ｏ−プロピルホスホジエステルおよび２’デオキシホスホロチオエート類似体 は非修飾対照体より７、１０および８９倍安定であった（表２）。完全修飾２’ −Ｏ−ペンチル１２−ｍｅｒオリゴリボヌクレオチドについて観察された安定性 は定性的には１７−ｍｅｒ ２’−Ｏ−ペンチル類似体と同程度である。安定性 の順序は１７−ｍｅｒ系列と同じであった。しかしながら１７−ｍｅｒ ２’− Ｏ−アルキル類似体の単純な分解パターンとは対照的に、１２−ｍeｒ系列は分 解生成物のラダーを示した（データは示されていない）。１２−ｍeｒの安定性 の整列順は１７−ｍｅｒと同一であるが、定量的な相対安定性は二つの系列で異 なっていた。１２−ｍｅｒ系列の２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−プロピル類 似体は非修飾対照より３から１０倍以上蛇毒ホスホジエステラーゼに耐性であり 、１７−ｍｅｒ系列ではこれらの類似体は非修飾対照と比較して７０から１６０ 倍の安定性の増加を示した。 ２’−Ｏ−修飾オリゴマーの１２−ｍｅｒ系列の安定性もまたＳ１ヌクレアー ゼ（一本鎖エンドヌクレアーゼ）を用いて調べられた。１．９μｇ／ｍｌの酵素 濃度では２’−Ｏ−メチルホスホジエステルまたは２’−Ｏ−プロピルホスホジ エステルの１２−ｍｅｒでは分解は観察されなかった。同一条件下、２’デオキ シホスホジエステルおよび２’デオキシポスホロチオエートは各々２および１３ 分のｔ_1/2を持っていた（表２）。２’−Ｏ−メチル対２’−Ｏ−プロピル修飾 の安定性における相違は１０⁵倍高いＳ１ヌクレアーゼ濃度で観察された。１． ９ｘ１０⁵μｇ／ｍｌの酵素濃度では、２’−Ｏ−メチル類似体のｔ_1/2は９０分 であったが、２’−Ｏ−プロピルオリゴマーの分解は観察されなかった。 方法２ ハイブリダイゼーション安定性の決定 Ｍｏｎｉａ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７，１ ９９５４−１９９６２に記載されているように、デュープレックスの吸光度対温 度の曲線が１００ｍＭ Ｎａ⁺、１０ ｍＭリン酸、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐ Ｈ ７中４ｍＭの鎖濃度（デュープレックス）または６ｍＭ鎖濃度（一本鎖の研 究）で測定された。融解温度（Ｔ_m）およびデュープレックス形成の自由エネル ギーが直線勾配ベースラインを用いた二状態モデルへデータを適合させて得られ た（Ｆｒｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍ．，Ａｌｂｅｒｇｏ，Ｄ．Ｄ．，ａｎｄ Ｔｕｒｎｅ ｒ，Ｄ．Ｈ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１９８３，２２，１１０７−１１３１ ）。デュープレックス形成の自由エネルギーは、Ｆｒｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｇ ｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲ ＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ ，Ｃ．Ｆ．Ｆｏｘ編者，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１，１９９２，ｐｐ．９５−１０７により示されているように、Ｔ_m より熱力学的安定性のより正当な測定である。しかしながら、実験誤差はＴ_mよ りＤＧ°₃₇における方がより大きい。従って、表３にはＴ_m値が報告されている 。 研究された配列： 方法３ ｒａｓ ＲＮＡによるＲＮａｓｅ ＯＮＥフットプリンティング アッセイ ｒａｓ ４７−ｍｅｒステム／ループＲＮＡを３−３０ｐＭの濃度で標的上の 好適なハイブリダイゼーション部位に相補的であるオリゴヌクレオチドとインキ ュベートした。これらのオリゴヌクレオチドは市販品として入手可能な（Ｇｌｅ ｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２’−Ｏ−メチルアミダイトを５０ｍＭ ＮａＣｌおよ び５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ ８）中、１０μＭ の濃度で用いて合成した。ハイブリダイゼーションは３７℃にて少なくとも１６ 時間実施した。ＲＮａｓｅ ＯＮＥ（１０μｇ／μＬ，Ｐｒｏｍｅｇａ）は１： ２０００から１：１００，０００の希釈で加え、２５℃で５分間インキュベート し、急速冷凍により反応を停止させた。ＲＮａｓｅ Ｔ１を用いる”Ｇ”マップ および５０ｍＭ Ｎａ₂ＣＯ₃緩衝液（ｐＨ ９）を用いる塩基ラダーを調製した 。分解生成物は、１０μＭでのＲＮａｓｅ ＯＮＥフットプリントを示す少なく とも一つのオリゴヌクレオチドを同定するためシークエンシングＰＡＧＥにより 分離された。次に問題とするオリゴヌクレオチドのＫ_dが、そのオリゴヌクレオ チド（１００ｐＭから１０μＭの範囲の濃度で）をＲＮａｓｅ ＯＮＥで滴定す ることにより決定された。分解生成物はシークエンシングＰＡＧＥにより分離さ れ、オリゴヌクレオチドにより与えられた保護のパーセントがオリゴヌクレオチ ド濃度の関数としてプロットされた。５０％保護が観察されるオリゴヌクレオチ ド濃度が問題とするオリゴヌクレオチドのＫ_dである。この方法を用い、標的ｒ ａｓ ＲＮＡに対して増強された親和性および特異性を持つオリゴヌクレオチド が同定された。方法４ ｒａｓ−ルシフェラーゼ レポーター遺伝子組立て この研究で記載されるｒａｓ−ルシフェラーゼ レポーター遺伝子はＰＣＲ技 術を用いて組み立てられた。突然変異体（コドン１２）および非突然変異体（野 生型）ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子両方のエキソン１の５’領域のＰＣＲクローニング のプライマーとして使用するため、オリゴヌクレオチドプライマーが合成された 。ｃ−Ｈ−ｒａｓｌ活性化癌遺伝子（コドン１２、ＧＧＣ→ＧＴＣ）を含むｐＴ ２４−Ｃ３、およびｃ−Ｈ−ｒａｓ原癌遺伝子を含むｐｂｃ−Ｎ１はＡｍｅｒｉ ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ ，ＭＤ）から得られた。１．９ｋｂホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミ ド ｐＴ３／Ｔ７ ＩｕｃはＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌ ｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から得られた。オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーは、 鋳型として突然変異体および非突然変異体Ｈ−ｒａｓ遺伝子を用いる標準ＰＣＲ 反応で使用された。これらのプライマーはＮｈｅＩおよびＨｉｎｄIII制限エン ドヌクレアーゼ部位が隣接する、正常および突然変異体Ｈ−ｒａｓの配列−５３ から＋６５（翻訳開始部位に関して）に対応する１４５塩基対のＤＮＡ生成物を 生成する。ＰＣＲ生成物は標準法を用いてゲルで精製し、沈澱させ、洗浄して水 に再懸濁した。 Ｐ．ピラリス（ｐｙｒａｌｉｓ）（ホタル）ルシフェラーゼ遺伝子のクローニ ングのためのＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ生成物がアミノ末端メチオニン残基を 除いて（それは二つのアミノ酸で置き換えられるであろう、アミノ末端リジンお よび続いてロイシン残基）完全長ルシフェラーゼ蛋白質をコードするように設計 された。このルシフェラーゼ遺伝子のクローニングのために用いられたオリゴヌ クレオチドＰＣＲプライマーは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む市販品 として入手可能なプラスミド（ｐＴ３／Ｔ７−Ｌｕｃ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を 用いる標準ＰＣＲ反応において鋳型として使用された。これらのプライマーは独 特のＨｉｎｄIIIおよびＢｓｓＨII制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接し、ルシ フェラーゼ遺伝子に対応する約１．９ｋｂの生成物を与える。この断片は標準法 を用いてゲルで精製し、沈澱させ、洗浄して水に再懸濁した。 ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合レポーター遺伝子の組立を完成させるため、ｒａ ｓおよびルシフェラーゼＰＣＲ生成物は適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し 、制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ、ＨｉｎｄIIIおよびＢｓｓＨIIを用いてス テロイド−誘導可能マウス乳癌ウイルスプロモーターＭＭＴＶを含む発現ベクタ ー内への三部分連結によりクローン化した。得られたクローンではホタルルシフ ェラーゼ遺伝子の読み枠内へ融合されたＨ−ｒａｓ５’配列（−５３から＋６５ ）の挿入がもたらされる。得られた発現ベクターはステロイド−誘導可能ＭＭＴ Ｖプロモーターの制御下で発現されるｒａｓ−ルシフェラーゼ融合生成物をコー ドしている。これらのプラスミド構築物はホタルルシフェラーゼをコードする配 列の読み枠内へ融合された活性化（ＲＡ２）または正常（ＲＡ４）Ｈ−ｒａs蛋 白質 のアミノ酸１−２２をコードしている配列を含む。ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合 ｍＲＮＡの翻訳開始は天然のＨ−ｒａｓ ＡＵＧコドンに依存する。突然変異体 および正常Ｈ−ｒａｓルシフェラーゼ融合構築物の両方が標準法を用いるＤＮＡ 配列分析により確認された。方法５ プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフエクション トランスフェクションは以下の修正を加えＧｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．，Ｃ ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ ｙ ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ， Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．ＳｅｉｄｍａｎおよびＫ． Ｓｔｒａｈｌ，編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載さ れているように実施した。ヒーラー細胞を６０ｍｍの培養皿に５ｘ１０⁵細胞／ 皿で播種した。各々の皿に全部で１０μｇまたは１２μｇのＤＮＡを加え、その １μｇは構成性ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターの制御下のグルココ ルチコイドレヤプターを発現するベクターであり、残りはｒａｓ−ルシフェラー ゼレポータープラスミド（実施例４３）であった。リン酸カルシウム−ＤＮＡ共 沈澱物は、３ｍＭ ＥＧＴＡを含むトリス緩衝食塩水［５０ｍＭ トリス−Ｃｌ （ｐＨ ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ］で洗浄することにより１６−２０時 間後に除去した。次に１０％ウシ胎児血清を補給した新鮮な培地を細胞に加えた 。この時点で、デキサメタゾンによるレポーター遺伝子発現の活性化に先だって 細胞はオリゴヌクレオチドで前もって処理された。方法６ 細胞のオリゴヌクレオチド処理 プラスミドトランスフェクション（実施例４４）に続いて、細胞は前もって３ ７℃に温めたリン酸緩衝食塩水で洗浄し、５μｇ／ｍＬのＮ−［１−（２，３− ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチルアンモニウムクロリ ド（ＤＯＴＭＡ）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭを各々のプレートに添加した（ウェル 当たり１．０ ｍｌ）。５０μＭ貯蔵液からオリゴヌクレオチドを各々のプレー トに加え、３７℃で４時間インキュベートした。培地を除き、１０％ウシ胎児血 清および指定された濃度の適当なオリゴヌクレオチドを含むＤＭＥＭで置換し、 細胞は３７℃で２時間さらにインキュベートしたのち、０．２μＭの最終濃度の デキサメタゾンで細胞を処理することによりレポーター遺伝子発現を活性化した 。デキサメタゾン刺激１５時間後に細胞を採取し、ルシフェラーゼ活性をアッセ イした。方法７ ルシフェラーゼアッセイ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ,Ｍ．Ｅ.,Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅ ｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ， Ｊ．Ｇ．ＳｅｉｄｍａｎおよびＫ．Ｓｔｒａｈｌ編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載されているように、界面活性剤トリトンＸ−１０ ０で溶解させることにより細胞からルシフェラーゼを抽出した。Ｄｙｎａｔｅｃ ｈ ＭＬ１０００ルミノメーターを使用して６２５μＭのルシフェリン（Ｓｉｇ ｍａ）の添加によるピークルミネセンスを測定した。各々の抽出物について、デ ータがアッセイの直線的範囲に集まることを確かにするため異なった量の抽出物 を使用して多数回ルシフェラーゼアッセイを実施した。方法８ 融解曲線 ＩＢＭ ＰＣコンピューターと接続したＧｉｌｆｏｒｄ ２６０分光光度計お よびＧｉ１ｆｏｒｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＩＩ分光光度計を用いて２６０ｎｍで 吸光度対温度の曲線を測定した。緩衝液は１００ｍＭＮａ⁺、１０ｍＭリン酸お よび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７を有した。オリゴヌクレオチド濃度は各々 の鎖で４μＭであり、８５℃での吸光度および、ＰｕｇｌｉｓｉおよびＴｉｎｏ ｃｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８９，１８０，３０４−３ ２５に従って計算された吸光係数から決定された。Ｔ_m値、デュープレックス形 成の自由エネルギーおよび付随する定数は直線状スロープ基線の二状態モデルへ のデータの適合から得られた。Ｐｅｔｅｒｓｈｅｉｍ，Ｍ．およびＴｕｒｎｅｒ ，Ｄ．Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８３，２２，２５６−２６３。報 告されているパラメーターは少なくとも３回の実験の平均である。いくつかのオ リゴヌクレオチドに対し、Ｔ_m ^-1対ｌｏｇ₁₀（濃度）のプロットからデュープレ ックス形成の自由エネルギーも得られた。Ｂｏｒｅｒ，Ｐ．Ｎ．，Ｄｅｎｇｌｅ ｒ，Ｂ．，Ｔｉｎｏｃｏ，Ｉ．，Ｊｒ．およびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ．，１９７４，８６，８４３−８５３。方法９ ２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドを持つオリゴヌクレオチドの活性 方法５−８を用いて、オリゴマー化合物の相補的ＲＮＡへのハイブリダイゼー ション親和性および細胞内でのＨａ−ｒａs癌遺伝子に対する活性が試験された 。均一に２’−Ｏ−修飾されたオリゴマーおよび２’−Ｏ−修飾領域および２’ −デオキシ領域の両方を持つキメラオリゴマーが試験された。２’−Ｏ−メチル 、２’−Ｏ−プロピルおよび２’−Ｏ−ベンチルを含む均一に２’−Ｏ−修飾さ れたオリゴマーは非修飾２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりもＲＮＡへの高 い親和性を示した。２’−Ｏ−修飾領域および２’−デオキシ領域の両方を持つ キメラオリゴマーは非修飾２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりもＲＮＡに対 する高い親和性を示し、また非修飾均一デオキシホスホロチオエートと比較して 著しいＨａ−ｒａｓ遺伝子発現の阻害も示した（Ｍｏｎｉａ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，２６８，１４５１４−１４５２２を参照され たい）。実施例４８ ＰＫＣ−α ｍＲＮＡ発現のオリゴヌクレオチド阻害アッセイ Ａ５４９細胞をＴ−７５フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｌｉｎｃ ｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）に播種し、２４−４８時間後（この時８０−９０％コ ンフルエント）以下の組成を持つ３つのオリゴヌクレオチドで処理した。 配列ＩＤ番号：２７は完全に修飾されたデオキシホスホロチオエートであり、配 列ＩＤ番号：２８は１−６および１５−２０位に２’−フルオロを持つ完全に修 飾されたデオキシホスホロチオエートであり、および配列ＩＤ番号：２９は２、 ３、５および１６−１８位に２’−フルオロ−５−メチルウリジンおよび１、４ 、６、１５、１９および２０位に２’−フルオロを持つ完全に修飾されたデオキ シホスホロチオエートである。 細胞は１０ｍｌのＤＭＥＭで２回洗浄し、２０μｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡ／ＤＯ ＰＥ溶液（リポフェクチン）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む５ｍｌのＤＭＥＭを加えた。次に１０μＭの貯蔵溶液 から必要とされる濃度までオリゴマー化合物を加え、皿を渦まかせることにより 溶液を混合させた。細胞は３７℃で４時間インキュベートし、ＤＯＴＭＡ／ＤＯ ＰＥ溶液を除くために１回ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで洗浄し、続いて追加の２０ ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ ＦＣＳを加え、細胞はさらに２０時間放置して回復さ せた。 Ａ５４９細胞を２５、５０、１００、２００および４００ｎＭ濃度のオリゴマ ー化合物で処理し、全細胞ＲＮＡを４Ｍグアニジウムイソチオシアネート中での 溶解、続いての塩化セシウム濃度勾配により単離した。全ＲＮＡ（１５−３０μ ｇ）を１．１％ホルムアルデヒド含有１．２％アガロースゲルで分離し、ナイロ ン膜へ移した。ブロットは次にＡＴＣＣ（Ｂｅｔｈｓｄａ，ＭＤ）から得られた ウシＰＫＣ−α ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、１９ ８６）。ｃＤＮＡプローブは市販品として入手可能なキット（Ｐｒｏｍｅｇａ） を用い、その使用説明書に従うランダムプライマー標識により［α−³²Ｐ］ｄＣ ＴＰで³²Ｐ放射標識された。フィルターはＱｕｉｋｈｙｂ溶液（Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ）中、６８℃で６０分ハイブリダイズされた。続いて室温で弱いストリン ジェンシー洗浄が２回（２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）、および６０℃で強いス トリンジェンシー洗浄が２回（０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）行われた。ハ イブリダイズしたバンドはＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて可視化および 定量された。ブロットは次に沸騰させることにより放射活性を取り除き、等量の ＲＮＡが負荷されたことを確認するため³²Ｐ標識グリセロール−３−リン酸デヒ ドロゲナーゼプローブ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で再探査された。 ２’−フルオロ−５−メチルウリジン含有オリゴマー化合物である配列ＩＤ番 号:２９は、同一の場所にチミジンを含むオリゴマー化合物である配列ＩＤ番号 ：２７と比較すると１０倍の効力の増加を示した。配列ＩＤ番号：２９はまた配 列ＩＤ番号：２８と比較すると測定できるほどの効力の増加を示した。実施例４９ インビトロＨＩＶ阻害アッセイ ＨＩＶ ｒｅｖ蛋白質の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを同定するために インビトロトランスフェクションアッセイが使用された。このアッセイの時間は ４日間である。マウス胎児線維芽細胞株（３Ｔ３）を１０％ウシ胎児血清、グル タミンおよび抗生物質を補充したＤＭＥＭ（高グルコース）中で対数増殖期に維 持した。 プラスミド構築：ｐＨＩＶ ｅｎｖ−ｌｕｃは以下のように構築された。ヒト 免疫不全ウイルス タイプ１エンベロープ遺伝子を含むｐＢＨ１０（２０）の３ ．１Ｋｂ Ｓａｌｌ／Ｘｈｏｌ断片（単離物ＢＨ１０）（ヌクレオチド５１２０ −８２６０）をｐＭＡＭＢａｍプラスミドのＸｈｏｌ部位へ結合させてｐＭＡＭ ＨＩＶｅｎｖを得た。ｐＭＡＭＢａｍベクターは８．３Ｋｂ ｐＭＡＭｎｅｏプ ラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＢａｍＨＩ消化物をゲル精製することにより得 られた。ＢａｍＨＩ部位は４つのｄＮＴＰ全ての存在下でクレノーポリメラーゼ で末端を充填し、続いて結合させることにより破壊された。ｐＭＡＭＨＩＶ−ｅ ｎｖは独特のＢａｍＨＩ部位で切断され、４つのｄＮＴＰ全ての存在下でクレノ ー ポリメラーゼで末端が充填され、再結合された。この過程はｅｎｖ遺伝子のＲｅ ｖコード部分を不活性化するフレームシフト突然変異を導入する。最後に、Ｓａ ｌＩ／ＳａｌＩルシフェラーゼコード化レポーター遺伝子がＨＩＶ配列の上流の 独特なＳａｌＩ部位へクローン化され、突然変異したｒｅｖ遺伝子を有する最終 構築物ｐＨＩＶ ｅｎｖ−ｌｕｃが得られた。 Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼで哺乳類細胞およびインビトロの両方でｒｅｖ蛋白 質を発現するｐＳＧ５−ｒｅｖプラスミドの構築のため、ｐＣＶ１からのＰＣＲ によりＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ ｒｅｖ ｃＤＮＡが調製された。ＰＣＲ断片は ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで切断され、ベクターｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ）のＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ部位へサブクローン化された。ＰＣＲプライマ ーは下記のものであった： Ｒｅｐ ６は、構成性ＲＳＶ ＬＴＲの制御下で完全長グルココルチコイド レセプターを発現するプラスミドであり、Ｍｉｅｓｆｅｌｄ，Ｒ．ら、Ｃｅｌｌ ，１９８６，４６，３８９−３９９にしたがって調製された。 １日目：３Ｔ３細胞を洗浄し、トリパンブルー排除により計数し、６−ウェル マイクロタイタープレートの各々のウェルにウェル当たり８．５Ｘ１０⁴細胞で 播種した。 ２日目：三つの組換え体プラスミド、ｐＳＧ５、ｐＨＩＶ ｅｎｖ−ｌｕｃお よびＲｅｐ０６を標準ＣａＰＯ₄沈澱プロトコール（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．お よびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９７３，５２，４５ ６−４６７）を用いて沈澱させた。ＣａＰＯ₄沈澱ＤＮＡはマウス胎児線維芽細 胞へ加え、細胞は３７℃で７時間インキュベートした。細胞をリン酸緩衝食塩水 で洗浄し、１０％ウシ胎児血清、グルタミンおよび抗生物質を補充したＤＭＥＭ 、および決められた濃度のオリゴヌクレオチドおよび一連の半対数希釈で３７℃ にて一夜インキュベートした。 ３日目：細胞をＯＰＴｉｍｅｎ培地で２回洗浄し、ウェル当たりＯＰｔｉｍｅ ｍ培地中２．５ｍｇ／ｍｌのリポフェクチンおよびオリゴヌクレオチドで３７℃ にて４時間処理した。リポフェクチン／オリゴヌクレオチド溶液を完全培地に置 き換え、細胞は３７℃にて２時間回復させた。オリゴヌクレオチド処理細胞は次 にデキサメタゾンで処理された。 ４日目：デキサメタゾン処理して２４時間後、細胞を溶解させルシフェラーゼ アッセイが実施される（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ） 。溶解試料の蛋白質濃度はブラッドフォード蛋白質アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ，Ｍ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７６，７２，２４８）を用いて決定さ れる。実施例５０ オリゴヌクレオチド８４６９のインビボ活性 皮下（ｓ．ｃ．）移植ヒト肺腺癌Ａ５４９を持つメスＢａｌｂ／ｃヌードマウ スがオリゴヌクレオチド８４６９−３、配列ＩＤ番号：３およびベヒクル（食塩 水）で処理された。処理は９日で始め、一日一回３３日間続けられた。二つの用 量投与計画で研究された：一つは６．０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．およびもう一つは ０．６ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．である。 連続的に経過した（３＋回）皮下腫瘍の生存能力のある断片（２５−５０ｍｇ ）を套管針により一つのわき腹に皮下で研究動物内へ再移植する。断片が約１０ ０ｍｇに達したら（５−１５日後）処理を始める。対照腫瘍が１グラムの大きさ に達するまで（すなわち、２−４週間）動物を週当たり３から７回静脈内（ｉ． ｖ．）で処理する。腫瘍の大きさは週に１または２回、カリパスで測定する。 結果は二つの用量投与計画で腫瘍増殖の著しい減少を示しており、６．０ｍｇ ／ｋｇは０．６ｍｇ／ｋｇよりも遅い増殖速度を与える。実施例５１ ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに対するオリゴマー化合物の影響 Ａ５４９細胞を上記のようにオリゴマー配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２ および配列ＩＤ番号：３を用い、陽イオン性脂質ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ存在下、 １００から４００Ｎｍの用量で４時間処理し、洗浄してさらに２０時間回復させ る。全ＲＮＡを抽出し、各々の２０ｐｇを１．２％ゲルで分離し、ナイロン膜へ 移した。これらのブロットは³²Ｐ放射性標識ＰＫＣ−α ｃＤＮＡプローブで探 査し、次に取り除き、等量のＲＮＡ負荷を確認するため放射性標識Ｇ３ＰＤＨプ ローブで再探査した。ＰＫＣ−α転写体はＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）で試験し定量 した。ＰＫＣ−αに対して活性であることが知られているホスホロチオエートオ リゴヌクレオチド標品はこのアッセイにおいて約１７５ｎＭのＩＣ₅₀を持ってい る。改良された活性を示す化合物は試験標品よりも高い活性、例えば１７５ｎＭ より低いＩＣ₅₀を持つであろう。ＰＫＣ−α配列への試験化合物の高い特異的結 合はまた、ベータ、ガンマおよびデルタアイソザイムのような他のＰＫＣアイソ ザイムのｍＲＮＡからＰＫＣ−α ｍＲＮＡを区別するのに使用できる。実施例５２ インビボでのｒａｓ発現のノーザンブロット分析 上記のように２．５μＬのＤＯＴＭＡを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ減少血清培地中 で、細胞をオリゴマー配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２および配列ＩＤ番号 ：３で処理する。オリゴマーは所望の濃度まで加えられる。処理して４時間後、 培地をオリゴヌクレオチドを含まない培地に置き換える。オリゴマー処理して４ ８時間後に細胞を採取し、標準ＣｓＣｌ精製法を用いてＲＮＡを単離する。Ｋｉ ｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ， Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ ．ＳｅｉｄｍａｎおよびＫ．Ｓｔｒａｈｌ編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ。 ＲＮＡは各々のＲＮＡの１０μｇを用いるノーザンハイブリダイゼーション分 析により分析する。ＲＮＡは１．２％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電気 泳動され、標準法を用いて一夜ＧｅｎｅＢｉｎｄ ４５ナイロン膜（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）へ移される。Ｋｉｎｇｓｔｏ ｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋ ｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄ ｍａｎおよびＫ．Ｓｔｒａｈｌ編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ ，ＮＹ。ＲＮＡは膜へＵＶ−架橋された。二本鎖³²Ｐ標識プローブがＰｒｉｍｅ ａ Ｇｅｎｅ標識キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて 合成される。ｒａｓプローブは活性化（突然変異体）Ｈ−ｒａｓ ｍＲＮＡのｃ ＤＮＡクローンのＳａｉＩ−ＮｈｅＩ断片であり、コドン１２でのＧＧＣ−から −ＧＴＣの突然変異を持っている。対照プローブはＧ３ＰＤＨである。ブロット は６８℃にて１５分、ＱｕｉｃｋＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で前ハイブリダイゼーションさせた。 １００μＬの１０ｍｇ／ｍｌサケ***ＤＮＡと混合した熱変性放射活性プローブ （２．５ｘ１０⁶カウント／２ｍｌハイブリダイゼーション溶液）を加え、膜は ６８℃にて１時間ハイブリダイズさせた。ブロットは２回室温で１５分２ｘＳＳ Ｃ／０．１％ＳＤＳで、および１回６０℃で３０分０．１ｘＳＳＣ／０．１％Ｓ ＤＳで洗浄した。ブロットのオートラジオグラフィーを行い、ＩｍａｇｅＱｕａ ｎｔ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて信号の強度を定量した。ノーザンブロッ トはｒａｓプローブと最初にハイブリダイズされ、０．１ｘＳＳＣ／０．１％Ｓ ＤＳ中で１５分煮沸することにより取り除いた後、正確な試料負荷を検査するた めに対照Ｇ３ＰＤＨプローブで再ハイブリダイズされた。 本明細書で述べられている公表された文献は、本明細書においてその全文が援 用される。 当業者は本発明の好適な態様に対して多くの変更および修正ができること、お よびそのような変更および修正が本発明の精神から離れることなくなされること を理解するであろう。従って、付随する特許請求の範囲はすべての均等な変形を 本発明の真の精神および範囲にあるとして包摂することが意図されている。

【手続補正書】 【提出日】１９９７年１０月３日 【補正内容】 請求の範囲 １． 少なくとも一つの構造Ｉの単量体サブユニット： ［式中： Ｘはヒドロキシルまたはアミノであり； ＲはハロまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルまたは置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキルであり、ここで 該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテル であり； Ｌは酸素または硫黄であり； ＺはフルオロまたはＯ−Ｒ₁Ｘ₁（式中、Ｒ₁はＣ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₆−Ｃ₁₀ア リール、Ｃ₇−Ｃ₁₈アルカリールであり、およびＸ₁はＨ、ＮＨ₂またはイミダゾ ールである）であり；および Ｑ₁およびＱ₂の一つは連結残基を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、 ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該Ｑ₁および Ｑ₂の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、ヌクレオチ ド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴ−ヌクレ オチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスファイ トまたはホスファイトである］ を含むオリゴマー化合物。 ２． ＬがＯである請求項第１項に記載のオリゴマー化合物。 ３． ＺがＦである請求項第１項に記載のオリゴマー化合物。 ４． ５から２００のサブユニットを含む請求項第１項に記載のオリゴマー化 合物。 ５． ５から５０のサブユニットを含む請求項第１項に記載のオリゴマー化合 物。 ６． １０から２０のサブユニットを含む請求項第１項に記載のオリゴマー化 合物。 ７． 該連結残基がホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジエン ホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリール ホスホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホ ロアミデートを含む請求項第１項に記載のオリゴマー化合物。 ８． 複数の構造Ｉの単量体サブユニットを持つ請求項第１項に記載のオリゴ マー化合物。 ９． 該単量体サブユニットが前もって選択された場所に位置している請求項 第８項に記載のオリゴマー化合物。 １０． 少なくとも一つの構造IIの単量体サブユニット： ［式中： Ｘはヒドロキシルまたはアミノであり； ＲはハロまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルまたは置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキル（ここで該置換 はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルである ）であり； Ｌは酸素または硫黄であり；および Ｑ₁およびＱ₂の一つは連結残基を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、 ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該Ｑ₁および Ｑ₂の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、ヌクレオチ ド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴーヌクレ オチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスファイ トまたはホスファイトである］ を含むオリゴマー化合物。 １１． ＬがＯである請求項第１０項に記載のオリゴマー化合物。 １２． ５から５０のサブユニットを含む請求項第１０項に記載のオリゴマー 化合物。 １３． １０から２０のサブユニットを含む請求項第１０項に記載のオリゴマ ー化合物。 １４． 該連結残基がホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェ ンホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリー ルホスホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホス ホロアミデートを含む請求項第１０項に記載のオリゴマー化合物。 １５． 複数の構造IIの単量体サブユニットを持つ請求項第１０項に記載のオ リゴマー化合物。 １６． 該単量体サブユニットが前もって選択された場所に位置している請求 項第１５項に記載のオリゴマー化合物。 １７． 少なくとも一つの構造IIIの単量体サブユニット： ［式中： Ｘはヒドロキシルまたはアミノであり； ＲはハロまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルまたは置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキルであり、ここで 該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテル であり； Ｌは酸素または硫黄であり； Ｒ₁はＣ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₆−Ｃ₁₀アリール、Ｃ₇−Ｃ₁₈アルカリールであり 、およびＸ₁はＨ、ＮＨ₂またはイミダゾールであり；および Ｑ₁およびＱ₂の一つは連結残基を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、 ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該Ｑ₁および Ｑ₂の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、ヌクレオチ ド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴ−ヌクレ オチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスフアイ トまたはホスファイトである］ を含むオリゴマー化合物。 １８． ＬがＯである請求項第１７項に記載のオリゴマー化合物。 １９． ５から５０のサブユニットを含む請求項第１７項に記載のオリゴマー 化合物。 ２０． １０から２０のサブユニットを含む請求項第１７項に記載のオリゴマ ー化合物、 ２１． 該連結残基がホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェ ンホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリー ルホスホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホス ホロアミデートを含む請求項第１７項に記載のオリゴマー化合物。 ２２． 複数の構造IIIの単量体サブユニットを持つ請求項第１７項に記載の オリゴマー化合物。 ２３． 該単量体サブユニットが前もって選択された場所に位置している請求 項第２２項に記載のオリゴマー化合物。 ２４． 式： ［式中： Ｑはピリミジン塩基または２−Ｓピリミジン塩基であり； Ｒ¹は置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₁−Ｃ₃₀アルケニル、Ｃ₁−Ｃ₃₀ アルキニル、Ｃ₆−Ｃ₁₄アリールまたはＣ₇−Ｃ₃₀アラルキルであり、ここで該置 換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルであ る；および Ｒ²およびＲ³は独立して水素またはヒドロキシル保護基である］ の２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドの合成法であって、 ２−２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドを提供し； 式Ｒ¹−ＯＨのアルコールを選択し；そして 該２−２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドおよび該アルコールを 該２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドを得るのに有効な時間、温度および圧 力の条件下、ルイス酸で処理する； の各工程を含む方法。 ２５． 該２−２’−アンヒドロビリミジンヌクレオシドおよび該アルコール が圧力封入容器内で処理される請求項第２４項に記載の方法。 ２６． 該ルイス酸がホウ酸エステルである請求項第２４項に記載の方法。 ２７． 該ホウ酸エステルがホウ酸トリアルキルである請求項第２６項に記載 の方法。 ２８． 該ホウ酸トリアルキルの式がＢ（ＯＲ¹）₃である請求項第２７項に記 載の方法。 ２９． 該ホウ酸トリアルキルが水素化ホウ素をアルコールで処理して製造さ れる請求項第２８項に記載の方法。 ３０． 該ホウ酸トリアルキルが水素化ホウ素を式ＨＯ−Ｒ¹のアルコールで 処理して製造される請求項第２９項に記載の方法。 ３１． Ｒ¹がＣ₁−Ｃ₁₀アルキルである請求項第２４項に記載の方法、。 ３２． Ｒ¹がＣ₆−Ｃ₁₄アリールである請求項第２４項に記載の方法。 ３３． 該処理が約１２０℃から約２００℃での加熱を含む請求項第２４項に 記載の方法。 ３４． 該ピリミジンヌクレオシドがウリジンまたは５−メチルウリジンであ る請求項第２４項に記載の方法。 ３５． 式： ［式中： Ｘ’はＯまたはＳであり； Ｒ¹は置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₁−Ｃ₃₀アルケニル、Ｃ₁−Ｃ_{3 0} アルキニル、Ｃ₆−Ｃ₁₄アリールまたはＣ₇−Ｃ₃₀アラルキルであり、ここで該 置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルで ある； Ｒ²およびＲ³は独立して水素またはヒドロキシル保護基であり； Ｒ⁵およびＲ⁶は独立してＨ、Ｃ₁−Ｃ₃₀ヒドロカルビルまたは置換Ｃ₁−Ｃ₃₀ヒ ドロカルビルである］ の２’−Ｏ−置換シチジンヌクレオシドの合成法であって、 式： の２−２’−アンヒドロウリジンヌクレオシドを提供し； 式Ｒ¹−ＯＨのアルコールを選択し； 該２−２’−アンヒドロウリジンヌクレオシドおよび該アルコールを該２ ’−Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドを得るのに有効な時間、温度および圧力の条 件下、ルイス酸で処理し；そして 該２’−Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドを該２’−Ｏ−置換シチジンヌク レオシドヘアミノ化する； の各工程を含む方法。 ３６． 該２−２’−アンヒドロウリジンヌクレオシドおよび該アルコールが 圧力封入容器内で処理される請求項第３５項に記載の方法。 ３７． 該ルイス酸がホウ酸エステルである請求項第３５項に記載の方法。 ３８． 該ホウ酸エステルがホウ酸トリアルキルである請求項第３７項に記載 の方法。 ３９． 該ホウ酸トリアルキルの式がＢ（ＯＲ¹）₃である請求項第３８項に記 載の方法。 ４０． 該ホウ酸トリアルキルが水素化ホウ素をアルコールで処理して製造さ れる請求項第３８項に記載の方法。 ４１． 該ホウ酸トリアルキルが水素化ホウ素を式ＨＯ−Ｒ¹のアルコールで 処理して製造される請求項第４０項に記載の方法。 ４２． Ｒ¹がＣ₁−Ｃ₁₀アルキルである請求項第３５項に記載の方法。 ４３． Ｒ¹がＣ₆−Ｃ₁₄アリールである請求項第３５項に記載の方法。 ４４． 該処理が約１２０℃から約２００℃での加熱を含む請求項第３５項に 記載の方法。 ４５． 該２’−Ｏ−置換シチジンヌクレオシドが２’−Ｏ−メチル−５−メ チルシチジンである請求項第３５項に記載の方法。 ４６． 少なくとも一つの式： ［式中： Ａはヒドロキシルまたはアミノであり； ＲはハロまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルまたは置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキルであり、ここで 該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテル であり； Ｌは酸素または硫黄であり； Ｚ’は置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₁−Ｃ₃₀アルケニル、Ｃ₁−Ｃ_{3 0} アルキニル、Ｃ₆−Ｃ₁₄アリールまたはＣ₇−Ｃ₃₀アラルキルであり、ここで該 置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルで あり：および Ｑ₁およびＱ₂の一つは連結残基を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、 ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該Ｑ₁および Ｑ₂の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、ヌクレオチ ド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴ−ヌクレ オチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスファイ トまたはホスファイトである］ の単量体サブユニットを含むオリゴマー化合物。 ４７． ＬがＯである請求項第４６項に記載のオリゴマー化合物。 ４８． Ｚが−（ＣＨ₂）_n−Ｏ−（ＣＨ₂）_m−ＣＨ₃である請求項第４６項に 記載のオリゴマー化合物。 ４９． ｎが２であり、およびｍが０である請求項第４８項に記載のオリゴマ ー化合物。 ５０． ５から２００のサブユニットを含む請求項第４６項に記載のオリゴマ ー化合物。 ５１． ５から５０のサブユニットを含む請求項第４６項に記載のオリゴマー 化合物。 ５２． １０から２０のサブユニットを含む請求項第４６項に記載のオリゴマ ー化合物。 ５３． 該連結残基がホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェ ンホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリー ルホスホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホス ホロアミデートを含む請求項第４６項に記載のオリゴマー化合物。 ５４． 複数の該式の単量体サブユニットを持つ請求項第４６項に記載のオリ ゴマー化合物。 ５５． 該単量体サブユニットが前もって選択された場所に位置している請求 項第５４項に記載のオリゴマー化合物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 スプランクル，ケリー・ジー アメリカ合衆国カリフォルニア州92083, ヴィスタ，シカモア・アベニュー 920, アパートメント ナンバー61 (72)発明者 ロス，ブルース・エス アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールズバッド，ラス・ミエンテス・レー ン 7942 (72)発明者 グリフィー，リッチ・エイチ アメリカ合衆国カリフォルニア州92084, ヴィスタ，バースビー・ストリート 360 (72)発明者 スプリンガー，ロバート・エイチ アメリカ合衆国カリフォルニア州92008, カールズバッド，サウザンプトン 2719

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 少なくとも一つの構造Ｉの単量体サブユニット： ［式中： Ｘはヒドロキシルまたはアミノであり； ＲはハロまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルまたは置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキルであり、ここで 該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテル であり； Ｌは酸素または硫黄であり； ＺはフルオロまたはＯ−Ｒ₁Ｘ₁（式中、Ｒ₁はＣ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₆−Ｃ₁₀ア リール、Ｃ₇−Ｃ₁₈アルカリールであり、およびＸ₁はＨ、ＮＨ₂またはイミダゾ ールである）であり；および Ｑ₁およびＱ₂の一つは連結残基を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、 ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該Ｑ₁および Ｑ₂の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、ヌクレオチ ド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴーヌクレ オチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスファイ トまたはホスファイトである］ を含むオリゴマー化合物。 ２． ＬがＯである請求項第１項に記載のオリゴマー化合物。 ３． ＺがＦである請求項第１項に記載のオリゴマー化合物。 ４． ５から２００のサブユニットを含む請求項第１項に記載のオリゴマー化 合物。 ５． ５から５０のサブユニットを含む請求項第１項に記載のオリゴマー化合 物。 ６． １０から２０のサブユニットを含む請求項第１項に記載のオリゴマー化 合物。 ７． 該連結残基がホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェン ホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリール ホスホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホ ロアミデートを含む請求項第１項に記載のオリゴマー化合物。 ８． 複数の構造Ｉの単量体サブユニットを持つ請求項第１項に記載のオリゴ マー化合物。 ９． 該単量体サブユニットが前もって選択された場所に位置している請求項 第８項に記載のオリゴマー化合物。 １０． 少なくとも一つの構造IIの単量体サブユニット： ［式中： Ｘはヒドロキシルまたはアミノであり； ＲはハロまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルまたは置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキル（ここで該置換 はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルである ）であり； Ｌは酸素または硫黄であり；および Ｑ₁およびＱ₂の一つは連結残基を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、 ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該Ｑ₁および Ｑ₂の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、ヌクレオチ ド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴ−ヌクレ オチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスファイ トまたはホスファイトである］ を含むオリゴマー化合物。 １１． ＬがＯである請求項第１０項に記載のオリゴマー化合物。 １２． ５から５０のサブユニットを含む請求項第１０項に記載のオリゴマー 化合物。 １３． １０から２０のサブユニットを含む請求項第１０項に記載のオリゴマ ー化合物。 １４． 該連結残基がホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェ ンホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリー ルホスホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホス ホロアミデートを含む請求項第１０項に記載のオリゴマー化合物。 １５． 複数の構造IIの単量体サブユニットを持つ請求項第１０項に記載のオ リゴマー化合物。 １６． 該単量体サブユニットが前もって選択された場所に位置している請求 項第１５項に記載のオリゴマー化合物。 １７． 少なくとも一つの構造IIIの単量体サブユニット： ［式中： Ｘはヒドロキシルまたはアミノであり； ＲはハロまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルまたは置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキルであり、ここで 該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテル であり； Ｌは酸素または硫黄であり； Ｒ₁はＣ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₆−Ｃ₁₀アリール、Ｃ₇−Ｃ₁₈アルカリールであり 、およびＸ₁はＨ、ＮＨ₂またはイミダゾールであり；および Ｑ₁およびＱ₂の一つは連結残基を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、 ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該Ｑ₁および Ｑ₂の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、ヌクレオチ ド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴ−ヌクレ オチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスファイ トまたはホスファイトである］ を含むオリゴマー化合物。 １８． ＬがＯである請求項第１７項に記載のオリゴマー化合物。 １９． ５から５０のサブユニットを含む請求項第１７項に記載のオリゴマー 化合物。 ２０． ５から５０のサブユニットを含む請求項第１７項に記載のオリゴマー 化合物。 ２１． 該連結残基がホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェ ンホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリー ルホスホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホス ホロアミデートを含む請求項第１７項に記載のオリゴマー化合物。 ２２． 複数の構造Ｉの単量体サブユニットを持つ請求項第１７項に記載のオ リゴマー化合物。 ２３． 該単量体サブユニットが前もって選択された場所に位置している請求 項第２２項に記載のオリゴマー化合物。 ２４． 式： ［式中： Ｑはピリミジン塩基または２−Ｓピリミジン塩基であり； Ｒ¹は置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₁−Ｃ₃₀アルケニル、Ｃ₁−Ｃ₃₀ アルキニル、Ｃ₆−Ｃ₁₄アリールまたはＣ₇−Ｃ₃₀アラルキルであり、ここで該置 換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルであ る；および Ｒ²およびＲ³は独立して水素またはヒドロキシル保護基である］ の２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドの合成法であって、 ２−２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドを提供し； 式Ｒ¹−ＯＨのアルコールを選択し；そして 該２−２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドおよび該アルコールを 該２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドを得るのに有効な時間、温度および圧 力の条件下、ルイス酸で処理する； の各工程を含む方法。 ２５． 該２−２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドおよび該アルコール が圧力封入容器内で処理される請求項第２４項に記載の方法。 ２６． 該ルイス酸がホウ酸エステルである請求項第２４項に記載の方法。 ２７． 該ホウ酸エステルがホウ酸トリアルキルである請求項第２６項に記載 の方法。 ２８． 該ホウ酸トリアルキルの式がＢ（ＯＲ¹）₃である請求項第２７項に記 載の方法。 ２９． 該ホウ酸トリアルキルが水素化ホウ素をアルコールで処理して製造さ れる請求項第２８項に記載の方法。 ３０． 該ホウ酸トリアルキルが水素化ホウ素を式ＨＯ−Ｒ¹のアルコールで 処理して製造される請求項第２９項に記載の方法。 ３１． Ｒ¹がＣ₁−Ｃ₁₀アルキルである請求項第２４項に記載の方法。 ３２． Ｒ¹がＣ₆−Ｃ₁₄アリールである請求項第２４項に記載の方法。 ３３． 該処理が約１２０℃から約２００℃での加熱を含む請求項第２４項に 記載の方法。 ３４． 該ピリミジンヌクレオシドがウリジンまたは５−メチルウリジンであ る請求項第２４項に記載の方法。 ３５． 式： ［式中： Ｘ’はＯまたはＳであり； Ｒ¹は置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₁−Ｃ₃₀アルケニル、Ｃ₁−Ｃ₃₀ アルキニル、Ｃ₆−Ｃ₁₄アリールまたはＣ₇−Ｃ₃₀アラルキルであり、ここで該置 換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルで ある； Ｒ²およびＲ³は独立して水素またはヒドロキシル保護基であり； Ｒ⁵およびＲ⁶は独立してＨ、Ｃ₁−Ｃ₃₀ヒドロカルビルまたは置換Ｃ₁−Ｃ₃₀ヒ ドロカルビルである］ の２’−Ｏ−置換シチジンヌクレオシドの合成法であって、 式： の２−２’−アンヒドロウリジンヌクレオシドを提供し； 式Ｒ¹−ＯＨのアルコールを選択し； 該２−２’−アンヒドロウリジンヌクレオシドおよび該アルコールを該２ ’−Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドを得るのに有効な時間、温度および圧力の条 件下、ルイス酸で処理し；そして 該２’−Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドを該２’−Ｏ−置換シチジンヌク レオシドヘアミノ化する； の各工程を含む方法。 ３６． 該２−２’−アンヒドロウリジンヌクレオシドおよび該アルコールが 圧力封入容器内で処理される請求項第３５項に記載の方法。 ３７． 該ルイス酸がホウ酸エステルである請求項第３５項に記載の方法。 ３８． 該ホウ酸エステルがホウ酸トリアルキルである請求項第３７項に記載 の方法。 ３９． 該ホウ酸トリアルキルの式がＢ（ＯＲ¹）₃である請求項第３８項に記 載の方法。 ４０． 該ホウ酸トリアルキルが水素化ホウ素をアルコールで処理して製造さ れる請求項第３８項に記載の方法。 ４１． 該ホウ酸トリアルキルが水素化ホウ素を式ＨＯ−Ｒ¹のアルコールで 処理して製造される請求項第４０項に記載の方法。 ４２． Ｒ¹がＣ₁−Ｃ₁₀アルキルである請求項第３５項に記載の方法。 ４３． Ｒ¹がＣ₆−Ｃ₁₄アリールである請求項第３５項に記載の方法。 ４４． 該処理が約１２０℃から約２００℃での加熱を含む請求項第３５項に 記載の方法。 ４５． 該２’−Ｏ−置換シチジンヌクレオシドが２’−Ｏ−メチル-５−メ チルシチジンである請求項第３５項に記載の方法。 ４６． 少なくとも一つの式： ［式中： Ａはヒドロキシルまたはアミノであり； ＲはハロまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルまたは置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキルであり、ここで 該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテル であり； Ｌは酸素または硫黄であり； Ｚ’は置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₁−Ｃ₃₀アルケニル、Ｃ₁−Ｃ_{3 0} アルキニル、Ｃ₆−Ｃ₁₄アリールまたはＣ₇−Ｃ₃₀アラルキルであり、ここで該 置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーデルで あり；および Ｑ₁およびＱ₂の一つは連結残基を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、 ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該Ｑ₁および Ｑ₂の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、ヌクレオチ ド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴ−ヌクレ オチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスファイ トまたはホスファイトである］ の単量体サブユニットを含むオリゴマー化合物。 ４７． ＬがＯである請求項第４６項に記載のオリゴマー化合物。 ４８． Ｚが−（ＣＨ₂）_n−Ｏ−（ＣＨ₂）_m−ＣＨ₃である請求項第４６項に 記載のオリゴマー化合物。 ４９． ｎが２であり、およびｍが０である請求項第４８項に記載のオリゴマ ー化合物。 ５０． ５から２００のサブユニットを含む請求項第４６項に記載のオリゴマ ー化合物。 ５１． ５から５０のサブユニットを含む請求項第４６項に記載のオリゴマー 化合物。 ５２． １０から２０のサブユニットを含む請求項第４６項に記載のオリゴマ ー化合物。 ５３． 該連結残基がホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェ ンホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリー ルホスホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホス ホロアミデートを含む請求項第４６項に記載のオリゴマー化合物。 ５４． 複数の該式の単量体サブユニットを持つ請求項第４６項に記載のオリ ゴマー化合物。 ５５． 該単量体サブユニットが前もって選択された場所に位置している請求 項第５４項に記載のオリゴマー化合物。