JP5352462B2 - 二本鎖オリゴヌクレオチド複合体、rna干渉による遺伝子サイレンシング方法、および医薬品組成物 - Google Patents
二本鎖オリゴヌクレオチド複合体、rna干渉による遺伝子サイレンシング方法、および医薬品組成物 Download PDFInfo
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Description
a.約18個から30個のヌクレオチドよりなるセンス鎖;
b.約18個から30個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖;
c.細胞輸送を促進するコンジュゲート部;
d.長さが約3個から約9個の原子数からなり、前記コンジュゲート部を前記センス鎖と結合させるリンカ分子より構成され、
前記アンチセンス鎖は前記センス鎖および標的遺伝子双方に対して高い相補性を有し、前記センス鎖ならびに前記アンチセンス鎖は二本鎖を形成する。
a.約18個から30個のヌクレオチドよりなるセンス鎖;
b.約18個から30個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖;
c.C5リンカ分子を介して前記センス鎖3’末端に結合したコレステロール分子;
d.前記アンチセンス鎖の5’末端にホスフェート基を有し、
前記アンチセンス鎖は前記センス鎖および標的遺伝子双方に対して高い相補性を有し、前記センス鎖ならびに前記アンチセンス鎖は二本鎖を形成し、
前記コレステロール−リンカ分子−センス鎖は(式3)に示す構造を有する。
本発明の更なる側面および実施形態を、以下の記載によって明らかにする。
用語「アルキル」とは、飽和または不飽和、さらに置換または未置換型であるヒドロカルビル部分のことをいう。それは、直鎖状、分岐状、環状、および/または複素環状であり、かつエーテル、ケトン、アルデヒド、カルボン酸塩等の官能基を含む部分から構成されるものであってもよい。
「2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド」という成句は、糖部分を有するヌクレオチド単位のことをいい、例えば、該ヌクレオチド単位は糖部分、該糖の2’位に位置した炭素原子とアルキル基との両方に酸素原子が結合するようにして2’位で修飾されるデオキシリボシル部分が挙げられる。種々の実施形態において、前記アルキル部分は炭素および水素から構成されるが、特に好ましい実施形態としては、メチル基が挙げられる。
本明細書で用いられる成句であり、「AS」と表わされることもある「アンチセンス鎖」は、目的とするところの標的核酸に対して、実質的に(例えば80%以上)または100%相補的であるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一領域のことをいう。アンチセンス鎖は、ポリヌクレオチド領域、すなわちRNA、DNA、またはキメラRNA/DNAから構成可能である。例えば、アンチセンス鎖は、一分子の伝令RNA(mRNA)、mRNAではないRNA配列(例えば、tRNA、rRNA、およびhnRNA)、あるいはコードまたは非コードのDNA配列に対して全体的または部分的に相補的であってもよい。前記「アンチセンス鎖」としては、2本の異なる鎖から形成されるポリヌクレオチドのアンチセンス領域と、ヘアピン構造を形成することができる単分子のsiRNAとが挙げられる。「アンチセンス鎖」および「アンチセンス領域」という成句は、等価であることを意図しており、同義的に使われる。前記アンチセンス鎖は、低分子および/またはコンジュゲートの多様な群によって修飾することができる。
「2’炭素修飾」とは、糖サブユニット2’位が修飾された糖部分を有するヌクレオチド単位のことをいう。この位置で、糖の2’位に位置した炭素原子と、2’−O−メチル、2’−O−エチル、2’−O−プロピル、2’−O−イソプロピル、2’−O−ブチル、2’−O−イソブチル、2’−O−エチル−O−メチル(−OCH2CH2OCH3)、および2’−O−エチル−OH(−OCH2CH2OH)等のアルキル基との両方に、酸素原子が結合するようにして、「2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド」は修飾される。「2’炭素センス修飾」とは、センス鎖上またはポリヌクレオチドのセンス領域内にあるヌクレオチドの2’炭素位における修飾のことをいう。「2’炭素アンチセンス修飾」とはアンチセンス鎖上またはポリヌクレオチドのアンチセンス領域内にあるヌクレオチドの2’炭素位における修飾のことをいう。
用語「相補性」とは、互いに塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力のことをいう。塩基対は、逆平行ポリヌクレオチド鎖または領域内のヌクレオチド単位間の水素結合によって、一般的に形成される。相補性ポリヌクレオチド鎖または相補性ポリヌクレオチド領域は、ワトソン・クリック方式(A対T、A対U、C対Gなど)で塩基対を形成することができ、あるいは安定な二本鎖を形成することが可能な他の任意の方法で塩基対を形成することができる。
用語「二本鎖」とは、鎖と鎖とが塩基対をなす結果、2本の非平行なポリヌクレオチドによって形成された二本鎖構造を有する領域のことをいう。二本鎖は、2本の異なるポリヌクレオチドで形成されてもよいし、単一のポリヌクレオチド配列をもつ鎖、例えばヘパリンの「ループ」部分によって2本の鎖が互いに非平行な構造をとることができるヘパリン構造など、で形成されてもよい。更に、二本鎖構造をミスマッチやループとして解釈してもよい。例えば、非平行な2本の鎖が同じ長ではあるが配列では100%の相補性ではないところでは、二本鎖領域はミスマッチがあるために塩基対をしない領域として解釈される。
用語「デオキシヌクレオチド」とは、2’および/または3’炭素に結合した水素を持つ代わりに、適当な結合および/または2’、3’末端ジデオキシを持つ糖部分の2’または3’位で、OH基を欠いているヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。
用語「デオキシリボヌクレオチド」および「DNA」は、リボシル部分の2’位にHを持つ少なくとも1つのリボシル部分を含むヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。
用語「遺伝子」とは、転写および非転写両要素を有するものとして定義される。例えば、遺伝子には、特定のmRNA形質移入、または非コーディングRNA発現のレベル、タイミング、組織特異性を決定する役割を持つ任意の非転写エンハンサーおよび/またはプロモーター(例えばゲノミックDNA)を含めることができる。更に、miRNA、piRNA、tRNA、rRNAなどの非コーディングRNA、および5’UTR、ORF、3’UTR、イントロン等が遺伝子の要素として含まれる。
用語「脂質非依存型輸送剤」とは、技術的に認められた核酸輸送剤(リポフェクタミン、リポフェクタミン2000、ダーマFECTなど)を用いることなく輸送能を高めるために用いる、核酸にコンジュゲート可能な任意の数の分子のことをいう。このようなコンジュゲートは、天然の脂質であるか、あるいはタンパク質、炭水化物などで構成される。
用語「ミスマッチ」とは、センス鎖ヌクレオチドとアンチセンス鎖ヌクレオチドの間でワトソン−クリック型塩基対が形成されないことをいう。ミスマッチの例としては、A対G、C対A、U対C、A対A、G対G、C対Cなどが挙げられるが、同じく、非塩基残基対ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、非環状残基対ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、ギャップ、または非対ループも含まれる。広い意味において、ここで用いられるミスマッチには、特定の位置における二本鎖の熱力学的安定性がその位置におけるワトソン−クリック型塩基対の熱力学的安定性よりも低くなるように、前記の位置またはその近傍での熱力学的安定性を減少させる、その位置での任意の変換も含まれる。
用語「ヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、あるいはそれらの修飾された形態、さらにはそれらの類似体のことをいう。ヌクレオチドとして、プリン、例えばアダニン、ヒポキサンチン、グアニン、およびそれらの誘導体および類似体が挙げられ、さらにピリミジンとして、例えばシトシン、ウラシル、チミン、およびそれらの誘導体および類似体が挙げられる。「ヌクレオチド」は、好ましくは、シトシン、ウラシル、チミン、アデニン、またはグアニン部分を有する。
用語「オフ・ターゲット」および成句「オフ・ターゲット効果」とは、所定の標的に向けられたsiRNAおよびshRNAが、別のmRNA配列、DNA配列、または細胞タンパク質もしくは他の部分と直接あるいは間接的に相互作用することによって、意図されない効果を生ずるという任意の事例のことをいう。例えば、「オフ・ターゲット効果」は、siRNAまたはshRNAのセンスおよび/またはアンチセンス鎖と他の転写産物との間の部分的相同性または相補性によって、他の転写産物が同時に分解する時に、生ずる可能性があるものである。
用語「オーバーハング」とは、第1の鎖または領域が二本鎖を形成する相補性鎖の末端を越えて延びる1本の鎖または領域から生ずる、末端塩基対非形成型ヌクレオチドのことをいう。水素結合によって二本鎖を形成することが可能な1つ以上のポリヌクレオチドがオーバーハングを持つことができる。二本鎖の3’位および/または5’位末端を越えて伸張する単一鎖領域もオーバーハングである。
用語「リボヌクレオチド」およびフレーズ「リボ核酸」(RNA)は、少なくとも1つのリボヌクレオチド単位を含む修飾または未修飾のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。リボヌクレオチド単位は、N−グリコシド連結部においてリボシル部分1’位で結合した窒素塩基を持つリボシル部分の2’位に結合する酸素を有する。さらに、別のヌクレオチドに対する連結を可能にするか、もしくは連結を不可能にするリボシル部分の2’位に結合する酸素を含む。
成句「RNA干渉」および用語「RNAi」は同義であり、Drosha、RISC、Dicer等を含むが、これらに限定されるわけではなく、siRNA、shRNA、miRNA、piRNAなどの、単一の、2つ、または3つの分子が、RNAi経路における1つ以上の過程で相互作用して生物学的プロセスに影響を与えるプロセスを表す。このプロセスは、限定されるものではないが、mRNAを分解し、翻訳能を弱める作用、tRNA、rRNA、hnRNA、cDNA、およびゲノムDNAとの相互作用、付加的なタンパク質によりDNAメチル化が阻害されることによって引き起こされる遺伝子サイレンシングプロセスを含む。更に、siRNA、piRNA、miRNA阻害剤などのRNAi調整分子が、RNAi経路を増強させる分子として挙げられる(Tomari,Y等、Genes Dev.2005,19(5)、517−529)。
成句「センス鎖」とは、伝令RNAまたはDNA配列等の標的核酸として、部分的または全体的に、同一のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドまたは領域のことをいう。ある配列が与えられた場合、慣例によって特に明記しない限り、その配列はセンス鎖(または領域)を表すが、それと相補的なアンチセンス鎖(または領域)が存在していることも意味している。
成句「サイレンシング」とは、PCR法、ノーザンブロット分析、分岐DNA,ウエスタンブロット分析、およびその他技術的に認められた技術を含む任意の数の方法によって測定される、RNAi媒介による遺伝子発現の減少として定義される。
用語「siRNA」および句「短干渉RNA)」とは、単分子の核酸のことをいい、またはRNAiを行うことが可能であり、かつ塩基対の長さが約18から30である二本鎖を持つ、2本の異なる鎖から構成される核酸のことをいう。また、用語「siRNA」および句「短干渉RNA」としては、リボヌクレオチド部分以外の部分も含む核酸が挙げられ、該部分としては、限定されるものでないが、修飾ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド間連結部、非ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、および上記ヌクレオチドの類縁体が挙げられる。
成句「医薬的に許容される担体」とは、動物またはヒトに本発明の組成物を輸送するための医薬的に許容される塩、溶媒、分散剤、またはビークルをいう。前記担体は、液体、半固体または固体であってよく、しばしば希釈液、賦形剤、または塩と同義に用いられる。成句「医薬的に許容される」とは、成分、賦形剤、担体、希釈液が、合理的な利益/危険率(比)をもち、毒性、刺激、アレルギー反応などの副作用を起こすことなくヒトおよび/または動物に用いることができることを表す。Remington’s Pahrmaceutical Science 第16版、Osol,A 編集(1980)参照。
1.約18個から30個のヌクレオチドよりなるセンス鎖;
2.約18個から30個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖;
3.細胞輸送を促進するコンジュゲート部;
4.長さが約3個から約9個の原子数からなるリンカ分子より構成され、
前記アンチセンス鎖は標的遺伝子と同じく前記センス鎖に対して高い相補性を有し、前記センス鎖ならびに前記アンチセンス鎖は二本鎖を形成し、前記リンカ分子は前記コンジュゲート部を前記センス鎖と結合させる。
本発明のコンジュゲート部(単に「コンジュゲート」とも呼ぶ)は、色々な構造を持つことが可能で、様々な手段による細胞内への導入を対象にできる。例えば、コンジュゲート部を天然の脂質とすることが可能であり、siRNAまたは他の核酸といった被輸送物を、エンドサイトシスを含む作用機序によって膜に挿入して細胞に吸収させることで、細胞内に輸送することが可能である。例えば、脂質型コンジュゲート部は、カチオン性脂質、中性脂質、スフィンゴ脂質、ならびにステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノレイン酸、リノレアイジン酸、リノレン酸、およびミリスチン酸を含む脂肪酸を含むことが可能である。他方、コンジュゲート部を、TAT、ペネトレイン、MAPなどの膜貫通型タンパク質、またはポリ(Lys)、ポリ(Arg)、ポリ(His)、ポリ(Lys/Arg/His)、プロタミンなどのカチオン性タンパク質を含む天然のタンパク質とすることも可能である。
定義や規定よって限定されるものではないが、本発明におけるリンカ分子の長さは、コンジュゲート部をリンカ分子に結合する原子と、リンカ分子がオリゴヌクレオチドに結合するのに用いられ、オリゴヌクレオチドに結合する末端ホスフェート部の酸素原子との間が、最短距離として表される原子の数として記述される。例えば、コンジュゲート部がカルバメート連結部を介してリンカ分子に結合している実施形態では、リンカ分子の長さは、カルバメート連結部の窒素原子とホスフェート連結部の酸素原子との間が、最短距離として表わされる原子の数として記述される。環状構造がある場合には、最短距離となる環周りの原子の数で表すことが好ましい。
二本鎖オリゴヌクレオチド複合体におけるコンジュゲート−リンカ分子の位置は、コンジュゲートされた一本または複数鎖(センス鎖、アンチセンス鎖、あるいはセンス鎖アンチセンス鎖の両方)や、修飾されるセンス鎖上の一つまたは複数の位置(例えば、一本または複数鎖上でのヌクレオチドの位置)、または糖、塩基などのヌクレオチドの修飾位置、などによって変わりえる。コンジュゲート−リンカ分子は、本発明の一本または複数鎖上の5’末端および/または3’末端に置くことが可能である。例えば、コンジュゲート−リンカ分子は、センス鎖5’末端、および/またはセンス鎖3’末端、および/またはアンチセンス鎖5’末端、および/またはアンチセンス鎖3’末端に位置してよい。また、コンジュゲート−リンカ分子は、ホスフォジエステル結合を介して鎖の5’および/または3’末端に結合できる。好ましくは、本実施形態のコンジュゲート−リンカ分子は、ホスフォジエステル結合を介してセンス鎖の一方の端または両端に結合でき、より好ましくは、センス鎖3’末端に結合される。
センス鎖およびアンチセンス鎖の大きさは、約18個から約30個つながったヌクレオチドの大きさに相当し、具体的には、ヌクレオチドが、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個つながった長さになる。好ましいセンス鎖およびアンチセンス鎖の長さは、ヌクレオチド19個から23個の長さになるが、更に好ましくは、以下に示したようにヌクレオチド19個の長さになる。二本鎖オリゴヌクレオチド複合体のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の配列は、前記配列がオフ・ターゲット作用または有害な作用を全くまたは最小限しか示さずに標的遺伝子を効率的にサイレンシングさせる場合には、当業者に知られる様々な方法、即ち、遺伝子配列に基づくランダムセレクションや、合理的設計法(多くの技術的に認められたアルゴリズムおよび/または神経ネットワークのうちの任意の方法を用いる)といった様々な方法によって、選定することが可能である。効率的な遺伝子サイレンシングに用いられるアンチセンス鎖の合理的設計法の基準の詳細に関しては、下記の文献、WO2004/045543、WO2006/006948、WO2005/078095、WO2005/097992、ならびにWO2005/090606に記載される。
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を提供するために、センス鎖およびアンチセンス鎖によって形成される二本鎖の設計、リンカ分子の属性、コンジュゲート部の属性、コンジュゲート−リンカ分子の位置、化学的修飾を受けたヌクレオチドの位置など、先に述べたような本発明の特徴の組み合わせ方には数多くの組み合わせ方があるということは、当業者にとっては容易に認識されることである。あらゆる可能な組み合わせ方は明確に想定される。以下に挙げた二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、新規特徴が組み合わされた実施例として示されるものであり、これによって限定されるものではない。
1.約18個から約30個のヌクレオチドよりなるセンス鎖であって、5’末端より数えて1番目と2番目のヌクレオチドは2’−O−メチル修飾ヌクレオチドであり、全てのCヌクレオチドおよびUヌクレオチドは2’−O−メチル修飾ヌクレオチドであり、
2.約18個から約30個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖であって、全てのCヌクレオチドおよびUヌクレオチドは2’−F修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖は前記センス鎖および標的遺伝子双方に対して高い相補性を有し、前記センス鎖ならびに前記アンチセンス鎖は二本鎖を形成し、
3.前記アンチセンス鎖3’末端に位置する2ヌクレオチドオーバーハングはホスフォロチオエート連結部を有し、
4. C5リンカ分子を介して前記センス鎖3’末端に結合するコレスタノール分子を有し、コレスタノール−リンカ分子−センス鎖は(式10)の構造を持ち、
6.さらに前記アンチセンス鎖中の5’末端より数えて14番目のヌクレオチドと前記センス鎖中相対するヌクレオチドとの間のミスマッチを有していてもよい。
1. 約18個から約30個のヌクレオチドよりなるセンス鎖であって、5’末端より数えて1番目と2番目のヌクレオチドは2’−O−メチル修飾ヌクレオチドであり、全てのCヌクレオチドおよびUヌクレオチドは2’−O−メチル修飾ヌクレオチドであり、
2. 約18個から約30個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖であって、全てのCヌクレオチドおよびUヌクレオチドは2’−F修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖は前記センス鎖および標的遺伝子双方に対して高い相補性を有し、前記センス鎖ならびに前記アンチセンス鎖は二本鎖を形成し、
3. 前記アンチセンス鎖3’末端に位置する2ヌクレオチドオーバーハングはホスフォロチオエート結合部を有し、
4. C5リンカ分子を介して前記センス鎖3’末端に結合するスチグマステロール分子を有し、スチグマステロール−リンカ分子−センス鎖は(式11)の構造を持ち、
6.前記アンチセンス鎖中の5’末端より数えて14番目のヌクレオチドと前記センス鎖中相対するヌクレオチドとの間に、ミスマッチを随意に有する。
1. 約18個から約30個のヌクレオチドよりなるセンス鎖であって、5’末端より数えて1番目と2番目のヌクレオチドは2’−O−メチル修飾ヌクレオチドであり、全てのCヌクレオチドおよびUヌクレオチドは2’−O−メチル修飾ヌクレオチドであり、
2.約18個から約30個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖であって、全てのCヌクレオチドおよびUヌクレオチドは2’−F修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖は前記センス鎖および標的遺伝子双方に対して高い相補性を有し、前記センス鎖ならびに前記アンチセンス鎖は二本鎖を形成し、
3.前記アンチセンス鎖3’末端に位置する2ヌクレオチドオーバーハングはホスフォロチオエート連結部を有し、
C5リンカ分子を介して前記センス鎖3’末端に結合するエルゴステロール分子を有し、エルゴステロール−リンカ分子−センス鎖は(式12)の構造を持ち、
5.前記アンチセンス鎖中の5’末端より数えて14番目のヌクレオチドと前記センス鎖中相対するヌクレオチドとの間に、ミスマッチを随意に有する。
1. 約18個から約30個のヌクレオチドよりなるセンス鎖であって、5’末端より数えて1番目と2番目のヌクレオチドは2’−O−メチル修飾ヌクレオチドであり、全てのCヌクレオチドおよびUヌクレオチドは2’−O−メチル修飾ヌクレオチドであり、
2.約18個から約30個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖であって、全てのCヌクレオチドおよびUヌクレオチドは2’−F修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖は前記センス鎖および標的遺伝子双方に対して高い相補性を有し、前記センス鎖ならびに前記アンチセンス鎖は二本鎖を形成し、
3.前記アンチセンス鎖3’末端に位置する2ヌクレオチドオーバーハングはホスフォロチオエート連結部を有し、
C5リンカ分子を介して前記センス鎖3’末端に結合するコレステロール分子を有し、コレステロール−リンカ分子−センス鎖は(式13)の構造を持ち、
5.前記アンチセンス鎖中の5’末端より数えて14番目のヌクレオチドと前記センス鎖中相対するヌクレオチドとの間に、ミスマッチを随意に有する。
数多くの間接的コンジュゲートを、本発明の任意の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体と連結するために用いることが可能である。従って、前記したG4などの任意の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を、抗体などのタンパク質の融合物や、ポリカチオン、カチオン性ペプチド、ジンクフィンガー、アプタマー、ヒストン、dsRNA結合タンパク質、単鎖核酸結合タンパク質、ヘパリン結合ドメイン、KHドメイン、PAZドメイン、ウイルス性カプシドタンパク質、形質移入因子またはドメインとともに用いることができる。また、ペプチド、リポまたはポリプレックス、デンドリマー、ヘパリン、コレステロール、アルブミン、LDL阻害分子、受容体阻害分子、エンドゾーマル破壊化合物または混合物、天然脂質、ポリヒスチジン、プロタミン、アミノ酸、タキソール、徐方処方、ナノ粒子に基づいた処方は、本願の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体に全て適用可能である。
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、先に述べたように、RNA干渉方法に用いられる。RNA干渉方法としては、siRNA、shRNA、miRNA、またはpiRNAによる一つあるいは複数の遺伝子標的化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、阻害剤によるsiRNA、shRNA、miRNA、またはpiRNAの標的化も、RNA干渉方法に含まれる。
また、本発明はG4などの二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の合成方法を提供するものである。ある実施形態では、コンジュゲート部誘導体を、固相合成用担体に結合したままでオリゴヌクレオチド鎖の所望の位置に導入することが可能である。好ましくは、ホスフォラミデート、H−ホスホネートなどといったオリゴヌクレオチド合成に用いたのと同じ合成法、またはオリゴヌクレオチド合成の開始部位として所望のコンジュゲート部を有する固相合成法を用いて実施される。別法として、オリゴヌクレオチド合成中に保護基を持つ官能基をオリゴヌクレオチドに導入し、オリゴヌクレオチド保護基と固体担体連結部と併用可能な反応条件で合成中適当な段階で脱保護し、コンジュゲート部の活性化体と共有結合させてもよい。
実施例1から実施例51において、全ての原料および溶媒は市販品または当業者にとって公知な方法によって調製されたものである。実施例1から実施例51の全ての反応によって得られた生成物は分析され、1HNMR分析法およびESI−TOF質量分析法によって構造を確認した。
3−(ベンジルオキシカルボニルアミノ)プロパン酸 [N−Cbz−b−アラニン] (5.0g、22.4mmol)を塩化メチレン(100mL)に懸濁させ、2,2‘−ジメチル−1,3−ジオキサン−4,6−ジオン(3.3g、22.9mmol)、トリエチルアミン(8.5mL、61.0mmol)、およびジエチルシアノホスフォナート(3.7mM,22.8mmol)を加えた。全ての固体は速やかに溶解し、反応液は黄色になった。この反応溶液を室温にて16時間撹拌した後、塩化メチレン(100mL)で希釈し、塩酸水溶液(3M,各50mL)で3回、水(各50mL)で3回、および飽和食塩水(50mL)にて洗浄した。反応混合物溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、溶媒を留去して橙色のシロップを得た。この油状物を無水エタノール(200mL)に溶かし、16時間加熱還流した。メタノールを留去して得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル:150mL)を用い、溶出液に塩化メチレン(500mL)、塩化メチレン/メタノール(500mL、99.5:0.5v/v)、塩化メチレン/メタノール(1000mL、99:1v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して淡黄色油状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は4.5g(収率68%)である。
メチル 5−(ベンジルオキシカルボニルアミノ)−3−オキソペンタノエート(4.5g、15.5mmol)を無水テトラヒドロフラン(25mL)に溶解し、氷冷下、水素化ホウ素リチウム無水テトラヒドロフラン溶液(2M、25mL、50mmol)に徐々に滴下した。滴下終了後、氷浴を除去し、反応液を室温にて更に16時間撹拌した。無色透明な反応溶液を再び氷浴にて冷却し、塩酸水溶液(1M、50mL)を徐々に滴下して過剰の還元剤を分解した(この時ガスが発生する)。均一な溶液になった反応混合物を濃縮し、テトラヒドロフランを除去した。混合物に酢酸エチル(100mM)を加えて十分に振蕩し、分液ロートに移し、下層の水層と分離した。水層を2回以上酢酸エチル(各100mL)と振蕩し、得られた酢酸エチル溶液を合して飽和食塩水(50mL)で洗浄した。酢酸エチル溶液を、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、溶媒留去して淡褐色のシロップを得た。この粗精物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、200mL)を用い、溶出液に酢酸エチル(500mL)、酢酸エチル/メタノール(500mL、99:1v/v)、更に、酢酸エチル/メタノール(1000mL、95:5v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して淡黄色油状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は3.6g(収率92%)である。
ベンジル 3,5−ジヒドロキシカルバメート(7.3g、28.8mmol)を無水ピリジン(各100mL)と2回共沸留去し、無水ピリジン(300mL)に溶解した。氷浴冷却下、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(9.8g、28,9mmol)を加え、室温にて16時間撹拌した。得られた黄色反応溶液から溶媒を留去し、残渣を無水トルエン(250mL)に溶解した。このトルエン溶液を4℃にて1時間冷却した後、ろ過した。得られた固体をトルエン(50mL)で洗い、洗液をろ液と合わせて溶媒を留去し、暗黄色のシロップを得た。このシロップを室温にて少なくとも24時間真空中乾燥した。粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、500mL)を用い、溶出液にヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン(300mL、90:5:5v/v/v)、ヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン(1000mL、85:10:5v/v/v)、更にヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン(1000mL、80:15:5v/v/v)、更にヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン(1000mL、75:20:5v/v/v)、更にヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン(2000mL、70:25:5v/v/v)、更にヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン(2000mL、50:45:5v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して淡黄色油状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は15.4g(収率96%)である。
ベンジル 5−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)−3−ヒドロキシペンチルカルバメート(15.4g、27.7mmol)をメタノール(250mL)に溶解し、水素添加用フラスコに入れた。10%パラジウムカーボン(1.5g、50%水/重量)を加え、フラスコを密閉した。ダイアフラムポンプを用いて空気を除いた後、乾燥アルゴンガスで置換し10psiとした。この置換操作を4回以上行った。反応フラスコを再度減圧し、水素を充填して30psiとした。反応懸濁を室温にて16時間激しく振蕩して撹拌した。反応開始後4時間は、必要に応じて水素を再置換して30psiとした。反応終了後、減圧下水素を除去し、アルゴンガスで再置換して大気圧に戻した。触媒を0.45mmナイロン膜でろ別し、更にメタノール(100mL)で洗浄した。このメタノール洗液を母液と合し、溶媒を乾固するまで留去し、無色のガラス状泡状物を得た。このものを更に真空中で乾燥させた。収量は11.4g(収率98%)である。
ω−アミノ−1,3−ジオール リンカ分子にコンジュゲート部を共有結合でつなげるためには、リンカ分子上のアミノ基と反応しうるコンジュゲート部誘導体が必要である。好ましい反応活性を持つ誘導体としては、カルボン酸無水物、カルボン酸クロリド、N−ヒドロキシスクシイミドイル、N−ヒドロキシベンゾトリアゾリルなどのカルボン酸活性エステル、または、ペンタフルオロフェニル、クロロホルメート、4−ニトロフェニルカルボナート、スルホニルクロリドなどが例としてあげられる。このような、反応活性誘導体は、精製物として合成・単離することもできるが、使用前に速やかにin situで合成して用いることもできる。一般的方法としては、当量の反応活性コンジュゲート誘導体とアミノ化リンカ分子とをともに好適な溶媒に溶かし、室温にて1ないし24時間反応させる。なお、好適な溶媒は、反応試剤の溶解性および反応のタイプによって異なる。例えば、N,N−ジメチルホルムアミドは、カルボン酸活性エステルとω−アミノ−1,3−ジオール リンカ分子との縮合反応においてよく使われる溶媒である。一方、ピリジンは、カルボン酸無水物、カルボン酸クロリド、またはクロトホルメートなど、酸副生成物が生成する場合に、より適している溶媒である。
1−アミノ−5−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ペンタン−3−オール(4.3g、10.3mmol)を無水ピリジン(各50mL)と2回共沸させた後、無水ピリジン(70mL)に溶解した。この溶液を氷浴にて冷却し、無水トルエン(15mL)に溶かしたコレステリル クロロホルメート(4.8g、10.8mmol)をゆっくり滴下した。更に、反応液を室温にて1時間撹拌した。メタノール(25mL)を加えた後、反応混合物から溶媒を留去し乾固させた。得られた残渣は、無水トルエン(各50mL)と2回共沸させて粗製物を得た。この粗製物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、250mL)、溶出液にヘキサン/アセトン/トリエチルアミン(500mL、93:5:2v/v/v)、同(1000mL、88:10:2v/v/v)、更に同(1000mL、78:20:2v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して淡黄色樹脂状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は6.6g(収率76%)である。
5a−コレスタン−3b−オール(3.9g、10.0mmol)を無水トルエン(50mL)と共沸させた後、無水トルエン(100mL)に溶解した。トルエン溶液を室温にて撹拌させながら、トリエチルアミン(1.4mL、10.0mmol)を加え、続いて、4−ニトロフェニル クロロホルメート(2.0g、9.9mmol)を加え、反応混合物を終夜撹拌した。撹拌中、トリエチルアミン塩酸塩の無色沈殿物が生成した。反応混合物を、乾固するまで溶媒留去し粗製物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、200mL)、溶出液にヘキサン/酢酸エチル(2000mL、95:5v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去してアモルファス状の無色固体を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は3.5g(収率63%)である。
1−アミノ−5−(ビス(4−メトキシフェニル(フェニル)メトキシペンタン−3−オール(1.2g、2.8mmol)を無水トルエン(20mL)に溶解した。トルエン溶液を室温にて撹拌させながら、トリエチルアミン(0.4mL、2.9mmol)を加え、続いて、5α−コレスタン−3β−オール 4−ニトロフェニル カルボナート(1.6g、2.8mmol)のトルエン溶液(25mmol)を加え、反応混合物を終夜撹拌した。反応混合物を、乾固するまで溶媒留去し黄色ガラス状の泡状粗製物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、150mL)、溶出液にヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン(700mL、80:20:2v/v/v)、続いて同(1000mL、70:30:2v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去してアモルファス状の無色ガラス状泡状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は2.0g(収率87%)である。
コラン酸(3.6g、10.0mmol)を塩化メチレン(200mL)に懸濁し、室温にて激しく撹拌した。4−ニトロフェノール(1.4g、10.1mmol)およびN,N‘−ジシクロヘキシルカルボジイミド(2.1g、10.2mmol)を加え、反応混合物を終夜撹拌した。反応混合物をろ過し、固体を少量の塩化メチレンにて洗浄し、ろ液を乾固するまで減圧留去して、黄色固体を得た。粗製物を酢酸エチル(100mL)に溶かし、ろ過した。ろ液を減圧留去して白色がかった固体を得、ヘキサンより再結晶した。収量は3.9g(収率80%)である。
1−アミノ−5−(ビス(4−メトキシフェニル(フェニル)メトキシペンタン−3−オール(1.2g、2.8mmol)を無水トルエン(20mL)に溶解した。トルエン溶液を室温にて撹拌させながら、トリエチルアミン(0.4mL、2.9mmol)を加え、続いて、コラン酸 4−ニトロフェニル エステル(1.4g、2.9mmol)のトルエン溶液(25mmol)を加え、反応混合物を終夜撹拌した。反応混合物を、乾固するまで溶媒留去し黄色液状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、200mL)、溶出液にヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン(1500mL、60:40:2v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して淡黄色ガラス状の泡状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量1.7gは(収率80%)である。
実施例12で得られた混合物(4.3g)を塩化メチレン(100mL)に溶かし、室温にて撹拌した。4−ニトロフェノール(1.4g、10.1mmol)およびN,N‘−ジシクロヘキシルカルボジイミド(2.1g、10.2mmol)を加え、終夜撹拌した。反応混合物をろ過し、固体を少量の塩化メチレンで洗い、ろ液を減圧留去して黄色液状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、200mL)、溶出液にヘキサン/酢酸エチル(1500mL、90:10:v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して無色の固体を得た。この粗製物をアセトニトリルより再結晶した収量3.9g。この生成物は、目的物の4−ニトロフェニルエステルとメチルエステルの70:30(モル比)であった。この混合物を精製せずにこのまま次の工程に使用した。
1−アミノ−5−(ビス(4−メトキシフェニル(フェニル)メトキシペンタン−3−オール(1.0g、2.4mmol)を無水トルエン(20mL)に溶解した。トルエン溶液を室温にて撹拌させながら、トリエチルアミン(0.4mL、2.9mmol)を加え、続いて、3-O-アセチルリトコール酸 4−ニトロフェニル エステル(実施例13の生成物、1.8g、2.4mmol)のトルエン溶液(25mmol)を加え、反応混合物を終夜撹拌した。反応混合物を、乾固するまで溶媒留去し黄色液状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、200mL)、溶出液にヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン(600mL、60:40:2v/v/v)、続いて、ヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン(1500mL、50:50:2v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して無色ガラス状の泡状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は1.4g(収率71%)である。
実施例13で得られた3‘−O−アセチルリトコール酸 4−ニトロフェニルエステル(2.0g)を冷却した33%(w/v)メチルアミン/エタノールに懸濁し、塩化メチレン(20mL)を加えた。反応フラスコを密栓にて固く密封し、室温にて3日間撹拌した。黄色になった反応溶液を乾固するまで減圧留去し、残渣を塩化メチレン(300mL)および1M水酸化ナトリウム水溶液(200mL)で分液した。液層を分離し、塩化メチレン溶液をさらに1M水酸化ナトリウム水溶液(200mL),飽和食塩水(200mL)にて洗浄した。塩化メチレン溶液を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧留去して淡黄色泡状物を得た。1HNMR(CDCl3)測定にて、アセチル基の除去が不十分であると認められたため、粗製物をクロロホルム(30mL)およびメタノール(10mL)混合溶液に溶かし、10M水酸化ナトリウム水溶液(1mL)を加えた。混合溶液を室温にて4時間撹拌し、その後、氷酢酸(1mL)、続いて酢酸エチル(50mL)を加えた。反応溶液を水(各50mL)にて3回洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧留去して無色の固体を得た。収量1.9g。上記メチルアミンエタノール溶液との反応では、4−ニトロフェニルエステルのみならず、メチルエステルもメチルアミドに変換された。
リトコール酸メチルアミド(1.4g、3.6mmol)を無水トルエン(50mL)と共沸した後、無水トルエン(50mL)およびクロロホルム(50mL)の混合溶液に溶かした。反応溶液を室温にて撹拌下、トリエチルアミン(0.6mL、4.3mmol)、続いて、4−ニトロフェニル クロロホルメート(0.7g、3.5mmol)を加えた。この反応溶液を室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて(塩化メチレン:酢酸エチル、1:1、v/v)反応が完結していないことが認められたため、更にトリエチルアミン(0.6mL、4.3mmol)および4−ニトロフェニル カルボナート(0.7g)を加え、更に反応を2日間続けた。反応溶液を、ほぼ乾固するまで減圧留去し、得られた粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、200mL)、溶出液に塩化メチレン(500mL)、続いて、塩化メチレン/酢酸エチル(1000mL、3:1v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して無色の固体を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は1.7g(収率85%)である。
1−アミノ−5−(ビス(4−メトキシフェニル(フェニル)メトキシペンタン−3−オール(1.2g、2.8mmol)を無水トルエン(20mL)に溶解した。トルエン溶液を室温にて撹拌させながら、トリエチルアミン(0.4mL、2.9mmol)を加え、続いて、リトコール酸メチルアミド 4−ニトロフェニル カルボナート(1.4g、2.9mmol)およびトルエン(25mL)を加えた。その後、反応混合物を3日間撹拌した。反応混合物を、ほぼ乾固するまで溶媒留去し黄色液状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、200mL)、溶出液に塩化メチレン/トリエチルアミン(500mL、100:2v/v)、続いて、塩化メチレン/酢酸エチル/トリエチルアミン(1000mL、80:20:2v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して無色ガラス状の泡状物を得た。更に真空中十分に乾燥した。収量2.5g。1HNMR(CDCl3)によれば、この生成物には約25%(モル比)の出発原料であるリトコール酸メチルアミド 4−ニトロフェニル カルボナートが含まれていた。この混合物をこのまま精製せずに次の工程に使用した。
コンジュゲート部−ω−アミノ−1,3−ジオールリンカ分子は、固相合成用の担体に分子鎖を用いて結合することができる。先に述べたように、分子鎖としてはジカルボン酸が汎用される。先ず、環状酸無水物を形成しやすいジカルボン酸を用いる場合は、ほぼ当量のコンジュゲート部−ω−アミノ−1,3−ジオールリンカ分子および環状酸無水物を、トリエチルアミン、1−メチルイミダゾールを含む塩化メチレンに溶解し、この反応溶液を室温にて12時間ないし数日間撹拌した。また、環状酸無水物を生成しにくいジカルボン酸を用いる場合には、カルボジイミド試剤により先ずカルボン酸を活性化させ、小過剰のコンジュゲート部−ω−アミノ−1,3−ジオールリンカ分子と、触媒量のN,N−ジメチルアミノピリジンの存在下、室温にて12時間ないし数日間反応させた。どちらの場合においても、ジカルボン酸分子鎖を含むコンジュゲート部−ω−アミノ−1,3−ジオールリンカ分子を、クロマトグラフィーの後にトリエチルアミン塩として単離した。
コレステリル 5−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)−3−ヒドロキシペンチルカルバメート(6.6g、7.9mmol)、コハク酸無水物(0.8g、8.0mmol)、トリエチルアミン(3.3mL、23.7mmol)および1−メチルイミダゾール(0.3mL、3.9mmol)を塩化メチレン溶液(60mL)に溶解した。反応溶液を室温にて3日間撹拌した。この間、反応溶液は暗色になった。次に、反応溶液を塩化メチレン(100mL)にて稀釈し、氷冷したクエン酸水溶液(10%w/v、各50mL)にて2回洗浄、飽和食塩水(50mL)にて1回洗浄した。塩化メチレン溶液を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧留去して暗色の樹脂を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、175mL)、溶出液に塩化メチレン/トリエチルアミン(1000mL、95:5v/v)、続いて、塩化メチレン/メタノール/トリエチルアミン(1000mL、90:5:5v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して淡黄色の樹脂を得た。更に真空中十分に乾燥して白色がかったガラス状の泡状物を得た。収量は6.3g(収率85%)である。
AM−ポリスチレン(5.0g、約33μmolアミノ基/g;Applied Biosystem社)を、ラバーセプタムで栓をした一口丸底フラスコ(250mL)中、遊離アミンを含まない無水N,N−ジメチルホルムアミド(37.5mL)に懸濁させた。反応フラスコを振騰器に取り付け、室温にて固体が十分撹拌する程度に振騰した。また、別のフラスコ(50mL)に、4−(1−(コレステリルオキシカルボニルアミノ)−5−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ペンタン−3−イルオキシ)−4−オキソブタン酸 トリエチルアミン塩酸塩(105mg、113μmol)、遊離アミンを含まない無水N,N−ジメチルホルムアミド(25.0mL)、トリエチルアミン(31μL、225.0μmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(18mg、117.5μmol)およびBPO(55mg、124μmol)を加えた。この混合物を固体が溶けるまでよく振騰し、カルボン酸を活性化させるために室温にて5分間放置した。こうして活性化したカルボン酸溶液(4.5mL、20.3μmol)の一部を、振騰中の固相用担体にシリンジにて加えた。反応混合物を1.5時間振騰し、固相用担体の一部40mgを取り出した。先に述べた測定方法により充填を測定した結果、11.0μmol/gであった。更に活性化したカルボン酸溶液(4.5mL、20.3μmol)を固相懸濁液に加え、1時間振騰した。充填は14.5μmol/gであった。固相懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空下除去した。固体をN,N−ジメチルホルムアミド(200mL)、アセトン(200mL)、アセトニトリル(200mL)で十分に洗浄し、更に真空中乾燥させた。担体に残留したアミノ基は、無水酢酸アセトニトリル溶液(10%v/v、25mL)および1−メチルイミダゾールアセトニトリル溶液(10%v/v、25mL)混合溶液中に固相用担体を懸濁させ、室温にて2.5時間振騰させてキャップした。次に、固相用担体の懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空にて除去した。固相担体を、アセトニトリル(500mL)にて十分に洗い、真空中で終夜乾燥させた。
コレスタニル 5−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)−3−ヒドロキシペンチルカルバメート(2.0g、2.4mmol)、ジグリコール酸無水物(0.4g、3.6mmol)、トリエチルアミン(1.0mL、7.2mmol)および1−メチルイミダゾール(0.2mL、2.4mmol)を塩化メチレン溶液(25mL)に溶解した。反応溶液を室温にて3日間撹拌した。この間、反応溶液は暗色になった。次に、反応溶液を塩化メチレン(200mL)にて稀釈し、5%(w/v)リン酸二カリウム水溶液(50mL)にて洗浄した。塩化メチレン溶液を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧留去して褐色の油状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、100mL)、溶出液に塩化メチレン/トリエチルアミン(400mL、95:5v/v)、続いて、塩化メチレン/メタノール/トリエチルアミン(1000mL、93:2:5v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して淡黄褐色のガラス状の泡状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は2.0g(収率79%)である。
AM−ポリスチレン(5.0g、約33μmolアミノ基/g;Applied Biosystem社)を、ラバーセプタムで栓をした一口丸底フラスコ(250mL)中、遊離アミンを含まない無水N,N−ジメチルホルムアミド(37.5mL)に懸濁させた。反応フラスコを振騰器に取り付け、室温にて固体が十分撹拌する程度に振騰した。また、別のフラスコ(50mL)に、4−(1−(コレステリルオキシカルボニルアミノ)−5−((ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ペンタン−3−イルオキシ−2−オキソエトキシ)酢酸 トリエチルアミン塩(50mg、50μmol)、遊離アミンを含まない無水N,N−ジメチルホルムアミド(12.5mL)、トリエチルアミン(10μL、90μmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(10mg、50μmol)およびBPO(20mg、50μmol)を加えた。この混合物を固体が溶けるまでよく振騰し、カルボン酸を活性化させるために室温にて5分間放置した。こうして活性化したカルボン酸溶液の一部(9.0mL、36μmol)を、振騰中の固相用担体にシリンジにて加えた。反応混合物を1.5時間振騰し、固相用担体の一部40mgを取り出した。先に述べた測定方法により充填量を測定した結果、5.2μmol/gであった。更に活性化したカルボン酸溶液(1.3mL、5.2μmol)を固相懸濁液に加え、1時間振騰した。充填量は6.0μmol/gであった。固相懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空下除去した。固体をN,N−ジメチルホルムアミド(200mL)、アセトン(200mL)、アセトニトリル(200mL)で十分に洗浄し、更に真空中乾燥させた。担体に残留したアミノ基は、無水酢酸アセトニトリル溶液(10%v/v、25mL)および1−メチルイミダゾールアセトニトリル溶液(10%v/v、25mL)混合溶液中に固相用担体を懸濁させ、室温にて2.5時間振騰させてキャップした。次に、固相用担体の懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空にて除去した。固相用担体を、アセトニトリル(500mL)にて十分に洗い、真空中で終夜乾燥させた。
ω−アミノ−1,3−ジオール リンカ分子にコンジュゲート部は、当業者によく知られた方法を用いてホスホラミダイト誘導体に変換することができる。
コレステリル 5−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)−3−ヒドロキシペンチルカルバメート(1.3g、1.6mmol)をN,N−ジイソプロピルアミン(224μL、1.6mmol)を含む無水塩化メチレン(3.2mL)に溶解した。別のフラスコに、メチル N,N,N‘,N’−テトライソプロピルホスフォロジアミジト(0.6g、2.4mmol)を、塩化メチレン(3.2mL)、N,N−ジイソプロピルアミン(224μL、1.6mmol)テトラゾール アセトニトリル溶液(0.5M、1.6mL、0.8mmol)の混合溶液に溶かした。この溶液を室温にて5分撹拌し、先に調製した溶液に一回で加えた。この反応混合物を6時間撹拌した。反応混合物にメタノール(5mL)を加え、溶媒留去して濃厚な油状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、75mL)、溶出液にヘキサン/アセトン/トリエチルアミン(500mL、95:5:2v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して透明無色の油状物を得た。更に、トルエンと2回共騰して無色のガラス状泡状物を得、これを真空中で十分に乾燥した。収量は1.4g(収率88%)である。
コンジュゲート部をω−アミノアルコールリンカ分子に共有結合でつなげるためには、リンカ分子のアミノ基と反応性に富むコンジュゲ−ト部誘導体が必要である。好適な反応性誘導体としては、実施例で示したように、カルボン酸無水物、カルボン酸クロリド、N−ヒドロキシスクシイミド、N−ヒドロキシベンゾトリアゾール、またはペンタフルオロフェニル基などで活性化したカルボン酸エステル、クロロホルメート、4−ニトロフェニルカルボナート、および塩化スルホニルなどがあげられる。これらの反応性誘導体は、純粋な化合物として合成、単離できるが、または反応直前にin situで合成してもよい。一般的な合成方法としては、当量の活性コンジュゲート誘導体とw−アミノアルコールリンカ分子とを、好適な溶媒に溶解し、室温にて1ないし24時間反応させる。好適な溶媒としては、例えば、N,N−ジメチルホルムアミドが活性カルボン酸エステルとω−アミノアルコールリンカ分子との縮合に用いられるが、反応時に酸副生成物が生じるような、カルボン酸無水物、カルボン酸クロリド、クロロホルメートなどの場合には、ピリジンがより好ましい溶媒である。
2−アミノエタノール(0.4mL、6.7mmol)を無水ピリジン(150mL)に溶かし、コレステリル クロロホルメート(3.0g、6.7mmol)を加えた。反応混合物を室温にて終夜撹拌した。反応混合物から溶媒を留去し、得られた粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、500mL)、溶出液に塩化メチレン/メタノール(2000mL、100:4v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して無色ガラス状の泡状物を得た。これを更に真空中で十分に乾燥した。収量は2.8g(収率87%)である。
同様にして以下の化合物を合成した。
コンジュゲート部−ω−アミノアルコールリンカ分子は、当業者によく知られた方法を用いてホスホラミダイト誘導体に変換することができる。
コレステリル 2−ヒドロキシエチルカルバメート(2.8g、5.8mmol)を、N,N−ジイソプロピルアミン(810μL、5.8mmol)を含む無水塩化メチレン(11.6mL)に溶かし、室温にて撹拌した。別のフラスコに、メチル N,N,N‘,N’−テトライソプロピルホスフォロジアミジト(2.3g、8.7mmol)を、塩化メチレン(11.6mL)およびN,N−ジイソプロピルアミン(810μL、5.8mmol)、5−エチルチオ−1H−テトラゾール アセトニトリル溶液(0.5M、5.8mL、2.9mmol)の混合溶液に溶かした。この溶液を室温にて5分間撹拌し、先に調製した溶液に一度に加えた。この反応混合物を室温にて終夜撹拌し、溶媒留去して濃厚な液体を得た。得られた粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、400mL)、溶出液にヘキサン/アセトン/トリエチルアミン(1000mL、94:3:3 v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して透明な無色の液体を得た。これを更に真空中で十分に乾燥した。収量は3.1g(収率85%)である。
図4に、ヒドロキシメチルプロパンジオールを用いたリンカ分子類合成の一般的合成スキームを示した。なお、当業者においては、ここで説明される具体的な方法、試薬を変更しても、同じ化合物を得ることができることは明らかである。先ず、ヒドロキシプロリン化合物に適当なN−保護基(例えば、Fmoc、BocおよびCbzなど)を作用させてN−保護ヒドロキシプロリンとした。この化合物を、ボラン−メチルスルフィド錯体と無水テトラヒドロフラン中1時間加熱還流することにより還元し、N−保護ヒドロキシメチルピロリジノールとした。次に、4,4‘−ジメトキシトリチルクロリドと、ピリジン中室温にて12ないし18時間反応させて、N−保護 O−DMT−保護ヒドロキシメチルピロリジノールへと誘導した。前記N−保護基を、適当な脱保護反応を用い、所望のヒドロキシメチルピロリジノリンカ分子を得た。
トランス−4−ヒドロキシプロリン(5.0g、38.1mmol)を、ジオキサン(75mL)および水(75mL)の混合溶媒に懸濁させ、室温にて激しく撹拌した。炭酸水素ナトリウム(8.0g、95.2mmol)を加え、固体が溶解するまで撹拌した。次に、9−フルオレニルメチル クロロホルメート(11.4g、44.0mmol)のトルエン(25mL)溶液を、徐々に滴下して加え、16時間撹拌した。この反応混合物に、水(50mL)および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(50mL)を加えた。分液ロートに移した後、ジエチルエーテル(100mL)にて洗浄した。有機層と分離後、水層を濃塩酸にてpH試験紙を指標に約pH2に調整した。この溶液に酢酸エチル(150mL9を加え、よく振騰した後に、分液ローとで分液した。水層を再度酢酸エチル(150mL)にて抽出し、酢酸エチル層を合して無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、溶媒留去して無色のガラス状泡状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、400mL)、溶出液に酢酸エチル/酢酸(1800mL、100:2 v/v)、続いて、酢酸エチル/メタノール/酢酸(1000mL、95:5:2 v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して透明な無色の液体を得た。この液体をトルエン(各150mL)と3回共沸させて、残留酢酸を留去した。得られた無色の固体を真空中で十分に乾燥した。収量は12.0g(収率89%)である。
1−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニル)−4−ヒドロキシピロリジン−2−カルボン酸(13.3g、37.6mmol)を無水テトラヒドロフラン(250mL)に溶かした。この溶液を室温にて撹拌し、ボラン−メチルスルフィド錯体テトラヒドロフラン溶液(2M、40mL、80mmol)を、ゆっくりと先の溶液にシリンジにて加えた。気体の発生が収まった後、反応フラスコに冷却器およびドライライト乾燥管を付け、1時間加熱還流した。この間に無色の沈殿物が生じた。次に、メタノール(15mL)をまだ熱い反応混合物に注意深く加え、更に15分加熱還流させた。この間に、先の固体は溶解した。反応混合物を放冷後、溶媒留去して透明な液状物を得た。ホウ酸塩を除くために、この液状物をメタノール(各100mL)と3回共沸させた。得られた無色の固体を真空中で乾燥した。収量は12.7g(収率99%)である。
(9H−フルオレン−9−イル)メチル 4−ヒドロキシ−2−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−1−カルボキシレート(10.6g、31.2mmol)を無水ピリジン(各50mL)と2回共沸させた後、無水ピリジン(200mL)に溶かした。反応溶液を氷浴にて冷却し、4,4‘−ジメトキシトリチルクロリド(11.0g、32.5mmol)を、各3回に分けて30分間隔で加えた。添加終了後、フラスコを密栓し、4℃にて16時間保存した。次に、反応混合物を溶媒留去し、濃厚な黄色の液状物を得た。これをトルエン(100mL)に溶かし、ろ過した後に溶媒留去した。残渣を塩化メチレン(350mL)に溶かし、冷却したクエン酸水溶液(10% v/v、150mL)、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(150mL),飽和食塩水(150mL)にて洗浄した。塩化メチレン溶液を、無水硫酸にて乾燥し、ろ過、溶媒留去して黄色の泡状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、500mL)、溶出液に酢酸エチル/ヘキサン/トリエチルアミン(1300mL、50:50:1 v/ v/v)、続いて、同(1800mL、67:33:1 v/v/v)、更に、酢酸エチル/トリエチルアミン(1000mL、99:1 v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して白みがかったアモルファス状の固体を得た。更に、真空中で十分に乾燥した。収量は17.7(収率88%)である。
(9H−フルオレン−9−イル)メチル 2−((ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル−4−ヒドロキシピロリジン−1−カルボキシレート(3.4g、5.3mmol)を無水N,N−ジホルムアミド(15mL)に溶かした。反応溶液を室温にて撹拌し、ピペリジン(1.1mL、11mmol)を加えた。1時間後、多量の無色沈殿物が生成した。水(100mL)および酢酸エチル(75mL)を加え、先の固体がすべて溶解するまで撹拌した。2層を分離後、水層を酢酸エチル(75mL)で抽出した。酢酸エチル層を合して、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(50mL)、飽和食塩水(50mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過した。ろ液の溶媒を留去して、アモルファス状の無色固体を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、150mL)、溶出液に塩化メチレン/メタノール/トリエチルアミン(700mL、94:1:5 v/ v/v)、続いて、塩化メチレン/メタノール/トリエチルアミン(700mL、90:5:5 v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して無色ガラス状の泡状物を得た。更に、真空中で十分に乾燥した。収量は2.2(収率99%)である。
以下に述べる化合物の合成方法は、先に述べたコンジュゲート部−ω−アミノ−1,3−ジオールリンカ分子の場合と同様である。
6−アミノヘキサン酸(3.9g、29.7mmol)を無水ピリジン(60mL)に懸濁させ、氷浴にて冷却しながら撹拌した。塩化トリメチルシラン(15mL、118.6mmol)をシリンジにて加え、反応混合物を1時間撹拌した。この間に固体は全て溶解した。次に、コレステリル クロロホルメート(7.0g、15.6mmol)を先の冷却溶液に加え、1時間後に更にコレステリル クロロホルメート(6.5g、14.5mmol)を加えた。氷浴を取り除き、反応混合物を室温にて3時間撹拌した。再び反応混合物を氷浴にて冷却、冷却した塩酸水溶液(0.7M、150mL)をゆっくりと加えた。15分後、反応混合物を分液ロートに注ぎ、塩化メチレン(200mL)を加えた。フラスコの内容物を十分振騰し、水層、有機層を分離した。水層は、更に塩化メチレン(200mL)にて抽出した。塩化メチレン層を合し、塩酸水溶液(0.7M、200mL)、飽和食塩水(200mL)にて洗い、無水硫酸にて乾燥、ろ過した。ろ液をから溶媒を留去して、アモルファス状の無色固体を得た。この固体をアセトン(150mL)に溶かし、塩酸水溶液(1M、200mL)を加えて生成物を沈殿させた。この固体をろ過、水で洗浄、真空中で乾燥した。収量は15.8g(収率97%)である。
6−コレステリルオキシカルボニルアミノヘキサン酸(2.9g、5.3mmol)を塩化メチレン(50mL)に溶かし、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(0.9g、5.6mmol)、続いてN,N‘−ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.1g、5.3mmol)を加えた。この反応混合物を室温にて1時間撹拌した。この間、N,N’−ジシクロヘキシルウレアの無色沈殿が生成した。次に、5−((ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ピロリジン−3−オール(2.2g、5.2mmol)加え、反応混合物を4時間撹拌した。反応混合物をろ過し、少量(約25mL)まで濃縮した。酢酸エチル(200mL)を加え、溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(各100mL)にて3回洗浄し、飽和食塩水(100mL)で洗浄した。この酢酸エチル溶液を、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、溶媒留去して淡黄色のガラス状泡状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、250mL)、溶出液に塩化メチレン/ヘキサン/トリエチルアミン(1000mL、75:20:5 v/v/v)、続いて、塩化メチレン/トリエチルアミン(500mL、95:5 v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して白みがかったガラス状の泡状物を得た。更に、真空中で十分に乾燥した。収量は4.4(収率88%)である。
以下に述べる化合物の合成方法は、先に述べたコンジュゲート部−ω−アミノ−1,3−ジオールリンカ分子の場合と同様である。
コレステリル 6−(2−((ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)−4−ヒドロキシピロリジン−1−イル)−6−オキソヘキシルカルバメート(4.3g、4.6mmol)、コハク酸無水物(0.5g、5.0mmol)、トリエチルアミン(1.9mL、13.6mmol)および1−メチルイミダゾール(0.2mL、2.3mmol)を塩化メチレン溶液(50mL)に溶解した。反応溶液を室温にて24時間撹拌した。次に、反応溶液を塩化メチレン(100mL)にて稀釈し、氷冷した10%(w/v)クエン酸水溶液(50mL)にて2回、更に飽和食塩水(50mL)にて洗浄した。塩化メチレン溶液を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧留去して黄色の樹脂を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、150mL)、溶出液に塩化メチレン/トリエチルアミン(500mL、95:5 v/v)、続いて、塩化メチレン/メタノール/トリエチルアミン(1000mL、90:5:5 v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して白みがかったガラス状の泡状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は4.3g(収率82%)である。
AM−ポリスチレン(5.0g、約33μmolアミノ基/g;Applied Biosystem社)を、ラバーセプタムで栓をした一口丸底フラスコ(250mL)中、遊離アミンを含まない無水N,N−ジメチルホルムアミド(37.5mL)に懸濁させた。反応フラスコを振騰器に取り付け、室温にて固体が十分撹拌する程度に振騰した。また、別のフラスコ(50mL)に、4−(5−((ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)−1−(6−((コレステリルオキシ)カルボニルアミノ)ヘキサノイル)ピロリジン−3−イルオキシ)−4−オキソブタン酸 トリエチルアミン塩(241mg、210μmol)、遊離アミンを含まない無水N,N−ジメチルホルムアミド(25.0mL)、トリエチルアミン(58μL、420μmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(34mg、252μmol)およびBPO(102mg、231μmol)を加えた。この混合物を固体が溶けるまでよく振騰し、カルボン酸を活性化させるために室温にて5分間放置した。こうして活性化したカルボン酸溶液の一部(9.0mL、75.6μmol)を、振騰中の固相用担体にシリンジにて加えた。反応混合物を2.5時間振騰し、固相用担体の一部40mgを取り出した。先に述べた測定方法により充填量を測定した結果、12.2μmol/gであった。更に活性化したカルボン酸溶液(2.5mL、21.0μmol)を固相懸濁液に加え、2時間振騰した。充填量は15.0μmol/gであった。固相用担体の懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空下除去した。固体をN,N−ジメチルホルムアミド(200mL)、アセトン(200mL)、アセトニトリル(200mL)で十分に洗浄し、更に真空中終夜乾燥させた。担体に残留したアミノ基は、無水酢酸 アセトニトリル溶液(10%v/v、25mL)および1−メチルイミダゾール アセトニトリル溶液(10% v/v、25mL)混合溶液中に固相用担体を懸濁させ、室温にて2.5時間振騰させてキャップした。次に、固相用担体の懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空にて除去した。固相用担体を、アセトニトリル(500mL)にて十分に洗い、真空中で終夜乾燥させた。
以下の化合物は、先に説明したコンジュゲート部−ω−アミノ−1,3−ジオールリンカ分子と同様にして合成した。
3−アミノ−1,2−プロパンジオール(2.0g、22.0mmol)を無水ピリジン(各50mL)と2回共沸し、その後無水ピリジン(147mL)に溶かした。反応溶液を氷浴にて撹拌しながら、コレステリル クロロホルメート(10.4g、23.1mmol)のトルエン(50mL)溶液を、30分かけて滴下した。滴下終了後、反応溶液から氷浴を取り除き、室温にて16時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をトルエン(各50mL)と2回共沸させた。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、300mL)、溶出液にヘキサン/アセトン(1000mL、90:10 v/v)、続いて、ヘキサン/アセトン(1000mL、85:15 v/v)、ヘキサン/アセトン(1000mL、70:30 v/v)、ヘキサン/アセトン(1000mL、65:35 v/v)、を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して液状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は5.7g(収率51%)である。
コレステリル 2,3−ジヒドロキシプロピルカルバメート(5.7g、11.4mmol)を無水ピリジン(50mL)に溶かし、氷浴にて撹拌した。4,4‘−ジメトキシトリチルクロリド(4.1g、12.1mmol)のピリジン(26mL)溶液をゆっくりと滴下した。滴下終了後、反応溶液から氷浴を取り除き、室温にて16時間撹拌した。溶媒を留去し、濃厚な黄色液状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、250mL)、溶出液にヘキサン/アセトン/トリエチルアミン(1000mL、95:5:2 v/v/v)、続いて、ヘキサン/アセトン/トリエチルアミン(2000mL、90:10:2 v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して樹脂を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は8.1g(収率88%)である。
以下に述べる化合物の合成方法は、先に述べたコンジュゲート部−ω−アミノ−1,3−ジオール リンカ分子の場合と同様である。
コレステリル 3−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)−2−ヒドロキシプロピルカルバメート(8.1g、10.0mmol)、コハク酸無水物(1.0g、10.0mmol)、トリエチルアミン(4.2mL、30.0mmol)および1−メチルイミダゾール(0.4mL、5.0mmol)を塩化メチレン(81mL)に溶解した。反応溶液を室温にて24時間撹拌した。次に、反応溶液を塩化メチレン(100mL)にて稀釈し、氷冷した10%(w/v)クエン酸水溶液(50mL)にて2回、更に飽和食塩水(50mL)にて洗浄した。塩化メチレン溶液を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧留去して黄色の樹脂を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、200mL)、溶出液に塩化メチレン/トリエチルアミン(1000mL、95:5 v/v)、続いて、塩化メチレン/メタノール/トリエチルアミン(1000mL、93:2:5 v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去してガラス状の泡状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は8.6g(収率94%)である。
AM−ポリスチレン(5.0g、約33μmolアミノ基/g;Applied Biosystem社)を、ラバーセプタムで栓をした一口丸底フラスコ(250mL)中、遊離アミンを含まない無水N,N−ジメチルホルムアミド(37.5mL)に懸濁させた。反応フラスコを振騰器に取り付け、室温にて固体が十分撹拌する程度に振騰した。また、別のフラスコ(50mL)に、4−(1−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)−3−((コレステリルオキシ)カルボニルアミノ)プロパン−2−イルオキシ)−4−オキソブタン酸 トリエチルアミン塩(113mg、113μmol)、遊離アミンを含まない無水N,N−ジメチルホルムアミド(25.0mL)、トリエチルアミン(31μL、225μmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(18mg、135μmol)およびBPO(55mg、124μmol)を加えた。この混合物を固体が溶けるまでよく振騰し、カルボン酸を活性化させるために室温にて5分間放置した。こうして活性化したカルボン酸溶液の一部(16.7mL、75.4μmol)を、振騰中の固相用担体にシリンジにて加えた。反応混合物を1.5時間振騰し、固相用担体の一部40mgを取り出した。先に述べた測定方法により充填量を測定した結果、12.5μmol/gであった。更に活性化したカルボン酸溶液(2.7mL、12.2μmol)を固相懸濁液に加え、2時間振騰した。充填量は14.7μmol/gであった。固相用担体の懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空下除去した。固体をN,N−ジメチルホルムアミド(200mL)、アセトン(200mL)、アセトニトリル(200mL)で十分に洗浄し、更に真空中終夜乾燥させた。担体に残留したアミノ基は、無水酢酸 アセトニトリル溶液(10% v/v、25mL)および1−メチルイミダゾール アセトニトリル溶液(10% v/v、25mL)混合溶液中に固相用担体を懸濁させ、室温にて2.5時間振騰させてキャップした。次に、固相用担体の懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空にて除去した。固相用担体を、アセトニトリル(500mL)にて十分に洗い、真空中で終夜乾燥させた。
本発明の好適なコンジュゲート部は、直接リンカ分子として機能しうるように変換される官能基を構造中に有する。例えば、コンジュゲート部の機能を妨げないようなカルボキシル基をもつコンジュゲート部は、先にω−アミノ1,3−ジオール リンカ分子の合成で述べたのと同様な化学変換によって、コンジュゲート部−リンカ分子へと直接変換される。同様に、コンジュゲート部の機能を妨げないような水酸基をもつコンジュゲート部は、先に述べたのと同様な化学変換によって、ホスホラミダイト誘導体へと直接変換される。
ステアリン酸(5.0g、17.6mmol)を塩化メチレン(88mL)に懸濁し、2,2−ジメチル1,3−ジオキサン−4,6−ジオン(2.7g、18.5mmol)、トリエチルアミン(6.7mL、48.0mmol)、およびジエチルシアノホスホナート(2.7mL、17.6mmol)を加えた。固体はすべて速やかに溶けた。反応溶液を室温にて16時間撹拌した。次に、塩化メチレン(100mL)にて稀釈し、注意深く、塩酸水溶液(3M、各50mL)で3回洗浄した。更に、水(各50mL)と3回、飽和食塩水(50mL)で1回洗浄した。この反応混合物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過、溶媒を留去した。得られた液体を無水メタノール(100mL)に溶かし、16時間加熱還流した。メタノールを留去し、得られた粗製物をヘキサを温めて溶かし、シリカゲルに充填した(シリカゲル、150mL)。溶出液にヘキサン(500mL)、続いて、ヘキサン/アセトン(1000mL、98:2 v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して油状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は5.2g(収率87%)である。
メチル 3−オキソエイコサノエート(5.2g、15.3mmol)を無水テトラヒドロフラン(31mL)に溶かし、この溶液を氷冷した水素化ホウ素リチウムの無水テトラヒドロフラン溶液(2M、31mL、61.2mmol)にゆっくりと滴下した。滴下終了後、氷浴を取り除き、反応溶液を室温にて16時間撹拌した。この透明無色の溶液を再び氷浴にて冷却し、過剰の還元剤を分解するために、塩酸水溶液(1M、62mL)をゆっくりと滴下した(ガスが発生した)。均一な溶液になった後に、この反応混合物を濃縮してテトラヒドロフランを留去した。次に、塩化メチレン(100mL)を加え、よく振騰後、分液ロートに入れた。層が分離した後に、水層を取り出した。この水層を塩化メチレン(100mL)で抽出し、先の塩化メチレン層と合し、飽和食塩水(50mL)にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、メタノール(各50mL)と5回共沸、得られた油状物を真空中で十分に乾燥した。収量は3.7g(収率77%)である。
エイコサン−1,3−ジオール(3.7g、11.8mmol)を無水ピリジン(各50mL)と2回共沸し、無水ピリジン(60mL)に溶解した。この溶液を氷浴にて冷却し、4,4‘−ジメトキシトリチルクロリド(4.2g、12.4mmol)を加えた。反応溶液を室温にもどし、16時間撹拌した。残留する4,4’ジメトキシトリチルクロリドをメタノール(10mL)で処理し、得られた黄色溶液をほぼ乾固するまで溶媒留去した。残渣を無水トルエン(50mL)と2回共沸し、得られた粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い、溶出液にヘキサン/アセトン/トリエチルアミン(500mL 95.5:5:0.5 v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して淡黄色液状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は6.8g(収率93%)である。
1−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)エイコサン−3−オール(6.8g、11.0mmol)、コハク酸無水物(1.1g、11.0mmol)、トリエチルアミン(4.6mL、33.0mmol)および1−メチルイミダゾール(0.44mL、5.5mmol)を塩化メチレン(68mL)に溶解した。反応溶液を室温にて5日間撹拌した。この間、反応溶液は暗色になった。次に、反応溶液を塩化メチレン(100mL)にて稀釈し、氷冷した10%(w/v)クエン酸水溶液(50mL)にて2回、更に飽和食塩水(50mL)にて洗浄した。塩化メチレン溶液を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧留去して暗色の樹脂を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い(シリカゲル、200mL)、溶出液に塩化メチレン/トリエチルアミン(500mL、95:5 v/v)、続いて、塩化メチレン/メタノール/トリエチルアミン(1000mL、93:2:5 v/v/v)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して樹脂を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は2.4g(収率30%)である。
AM−ポリスチレン(5.0g、約33μmolアミノ基/g;Applied Biosystem社)を、ラバーセプタムで栓をした一口丸底フラスコ(250mL)中、遊離アミンを含まない無水N,N−ジメチルホルムアミド(37.5mL)に懸濁させた。反応フラスコを振騰器に取り付け、室温にて固体が十分撹拌する程度に振騰した。また、別のフラスコ(50mL)に、4−(1−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)エイコサン−3−イルオキシ)−4−オキソブタン酸 トリエチルアミン塩(49mg、60μmol)、遊離アミンを含まない無水N,N−ジメチルホルムアミド(25.0mL)、トリエチルアミン(17μL、120.0μmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(10mg、72μmol)およびBPO(29mg、66μmol)を加えた。この混合物を固体が溶けるまでよく振騰し、カルボン酸を活性化させるために室温にて5分間放置した。こうして活性化したカルボン酸溶液の一部(16.7mL、40.0μmol)を、振騰中の固相用担体にシリンジにて加えた。反応混合物を1.5時間振騰し、固相用担体の一部40mgを取り出した。先に述べた測定方法により充填量を測定した結果、11.9μmol/gであった。更に活性化したカルボン酸溶液(1.0mL、2.4μmol)を固相懸濁液に加え、1時間振騰した。充填量は16μmol/gであった。固相用担体の懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空下除去した。固体をN,N−ジメチルホルムアミド(200mL)、アセトン(200mL)、アセトニトリル(200mL)で十分に洗浄し、更に真空中終夜乾燥させた。担体に残留したアミノ基は、無水酢酸 アセトニトリル溶液(10% v/v、25mL)および1−メチルイミダゾール アセトニトリル溶液(10% v/v、25mL)混合溶液中に固相用担体を懸濁させ、室温にて2.5時間振騰させてキャップした。次に、固相用担体の懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空にて除去した。固相用担体を、アセトニトリル(500mL)にて十分に洗い、真空中で終夜乾燥させた。
siRNAをトランスフェクトした細胞の遺伝子プロファイルを評価するのに、以下のプロトコールを用いた。
マイクロアレイ分析用のウェルプレートを減圧して培地を除去した。70μLのRLTバッファー(Qiagen、Cat.#79216)を用い、業者の手引書に従ってベータ−メルカプトエタノールの1:100希釈液で細胞を添加した。その日のうちに全RNA精製を行わない場合は、同じウェルプレートをプールして試料を−80℃で保存した。
Qiagen社のDNaseを有するRNeasy Miniカラムを用い、業者のプロトコール(http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/PDF/RNAStabilization AndPurification/FromAnimalAndPlantTissuesBacteriaYeastAndFungi/RNY_Mini/1035969_HB_BenchProtocol.pdf)に従って、全RNAをライセートから単離した。全RNA濃度は、NanoDrop(NanoDrop社、ウイルミントン、デラウエア)によりアッセイし、試料を100ng/μL(一般的な収量>100ng/μL)に希釈した。必要に応じて、試料は−80℃で保存可能である。全RNAの品質は、2100Bioanalyzer(Agilent社、サンタクララ、カリフォルニア)を用い、6000NanoLabChipにて評価した。試料として許容されるものは、少なくとも9のRNA Integrity Number(RIN)を有し、−80℃で保存可能である。
全RNAを増殖し、Low Input RNA Fluorescent Linear Amplification Kit(Agilent社、サンタクララ、カリフォルニア)を用い、業者のプロトコール(http://www.chem.agilent.com/)に従ってラベルした。Cy5CTPおよびCy3CTPは、Perkin Elmer社(ウエルズリー、マサチューセッツ)より入手した。一般に、一回の処理には650ngの全RNAを使用した。実験試料はCy5でラベル化し、偽試料(脂質処理の)はCy5とCy3で別々にラベル化した。非トランスフェクト試料はCy3でラベル化した。過剰の色素をラベル化した試料からQiagen RNeasy Miniカラムで、Agilentのプロトコールに記載されるように、2回1分「ドライ」スピンをかけて除いた。
ヒト1A(V2)マイクロアレイ(Agilent)へのハイブリダイゼーションは、一アレイごとのCy5およびCy3ラベル化試料各750ngを用い、業者の手引書に従って行った。試料は以下の通りである:
i)siRNAで形質移入した試料(Cy5)は、それぞれ偽トランスフェクト試料(Cy3)をレファレンスにおいてハイブリダイズした。
ii)形質移入による遺伝子発現効果を調べるためのコントロ−ルアレイを、偽形質移入(Cy5)および非形質移入(Cy3)試料を用いて組み入れた。
iii)色素偏向標的を検知するのみならず、非siRNA処理のシグナル/発現レベルを評価するためのコントロ−ルアレイを、偽形質移入(Cy5)および偽形質移入(Cy3)試料(自アレイ−自アレイ)を用いて組み入れた。
データ分析は、先ずマイクロソフト社製のエクセルを用いて行った。ファイルは、特徴識別をする列(識別番号、並、列、コントロ−ルタイプ、遺伝子名、系統名、および利用可能ならば記述子)、および試料ごとに選ばれたデータ列(Log比、P値、LogRatio、gProcessedSignal、rProcessedSignal、gIsWellAboveBG、rIsWellAboveBG)で構成した。偽アレイ−偽アレイからとった飽和シグナルの処理データは、偽アレイ−偽アレイから計算した赤色および緑色シグナルの合計の対数値(gProcessedSignal+rProcessedSignal)を示した列とともに、別の列に、飽和した緑色のシグナルを(gIsSaturated)として、また、飽和した赤色のシグナルを(rIsSaturated)のように記録した。
先ず、コレステロール基結合が、siRNAセンス鎖の5’位または3’位末端に対してどのように影響を与えるのかを試験した。マウス3T3NIH細胞を先に述べた方法によって培養し、3種類の濃度(500んM、1μM、および5μM)でコレステロールコンジュゲートsiRNA(二本鎖、mGAPDH20:5’−CACUCAAGAUUGUCAGCAA−3’)(SEQUID No:3)と試験を行った。これら試験に使用されたリンカ分子は、オリゴヌクレオチドおよびコレステロールコンジュゲート部の間に16原子入ったPEGリンカ分子である。
好適なコレステロール媒介型核酸輸送用リンカ分子長を同定するために、種種のリンカ分子長を有する3’センス鎖コレステロールコンジュゲートを持つマウスGAPDH標的siRNA二本鎖を合成した。そのリンカ分子配列を表1‐1から表1‐4に示した(上記参照)。配列どうしの比較は、受動、脂質媒介、およびエレクトロポレーションプロトコールに従って細胞に形質移入させて行った。更に、リンカ分子単独に比較して受動形質移入に対するコレステロールの寄与を測定するために、C14−アセチル基リンカ分子をこの試験に含めた。
受動輸送におけるオーバーハング安定化効果を試験するために、マウスGAPDA標的およびコレステロールにコンジュゲートするセンス鎖3’末端にC8リンカ分子を有するsiRNAを、オーバーハングのホスフォロチオエートヌクレオチド間連結部を有するもの、有さないもので合成した。次に、マウス3T3NIH細胞(2,500細胞/ウエル)を、0.5および1マイクロモル濃度で希釈血清培地にて上記合成分子に暴露した。
先に観測したリンカ分子とコレステロール含有二本鎖の脂質非依存型輸送が、リンカ分子単独の結果であるか否かを決定するために、GADPH標的かつC8−コレステロール(センス鎖3’末端における)保有のsiRNAの機能を、アセチル基(つまり、コレステロール無しの)を末端とするC8またはC14リンカ分子保有の同じsiRNAと比較した。形質移入の条件は、先に述べた方法と同様(2.5k3T3NIH、72時間、Hy−MEM−RS)であり、遺伝子ノックダウンの測定は、標準化にACTBを用いた分岐DNAによって行った。
siRNA機能を増強することのできる化学修飾の特有の組み合わせ方法を同定するために、PPIBおよびGAPDH標的かつセンス鎖3’末端C8−コレステロール保有の二本鎖を、図13Aに示したセンスおよび/又はアンチセンス修飾パターンのリストに基づいて合成した。次に、これら合成分子を適当なタイプの細胞(例えば、HeLa又はNIH3T3細胞)に、0.5マイクロモル濃度、脂質非存在下で導入し、72時間後に遺伝子ノックダウン評価を行った。
受動輸送媒介G4siRNAによる遺伝子ノックダウンの動力学を明らかにするために、以下の実験を行った。第一の実験では、HeLa細胞(2.5k細胞/ウエル/96穴プレート)を、無血清培地(センス鎖5’GCUUCGAGAUGUUCCGAGA3’)(SEQ ID NO:4)中、P53(0.1、1.0μM)を標的とするG4siRNA(具体的には、G4(−mm)siRNA)に、暴露した(回数は後記)。続いて、P53遺伝子ノックダウンのレベルを、24、48および72時間後に測定し、遺伝子ノックダウンが最適に見られる時間を同定した。
脂質媒介形質移入による細胞へのsiRNA導入は、非特異的(内在的免疫性)および特異的(オフ・ターゲット媒介)応答の両方を誘発することが示された。実験データの解釈に際しこの効果が悪影響を与える可能性があるために、包括的遺伝子プロファイリングおよびサーチライトサイトカインアレイを用い、脂質媒介輸送siRNAを受動輸送G4siRNAと比較検討した。
PPIB(具体的にG4(−mm))標的G4siRNAを、0.1および1.0μM濃度にて受動的に細胞に導入した。72時間後、細胞を採取しmRNAを包括的遺伝子プロファイリング用に(上記プロトコール参照)精製した。平行して、同一の配列をコレステロール−C5無しで合成し、リポフェクタミン2000(脂質)を用いて細胞(0.1μM)に形質移入した。形質移入24時間後に、mRNA試料を同様にして調整しゲノムプロファイリングにより評価した。
受動輸送G4siRNAおよび脂質媒介輸送siRNAによるオフ・ターゲットの影響を比較する目的で、PPIB標的二本鎖を、1)G4siRNA受動輸送(G4(−mm)複合体を使用)、または、2)リポフェクタミン2000媒介輸送(G4siRNAの場合と同じ二本鎖オリゴヌクレオチドを使用、但し、コレステロール−C5無し)によってHeLa細胞に導入した。続いて、細胞を採取し、上で述べたように包括的遺伝子プロファイリング用に処理した。各実験には、対照試料として、1)G4−siRNA用として希釈血清培地(無siRNA)にて同様に処理した細胞、2)脂質処理試料用として、脂質処理した試料(無siRNA)を、加えた。
希釈血清培地でのG4siRNAの安定性を試験する目的で、PPIB・標的G4siRNA(5’−ACAGCAAAUUCCAUCGUGU)(SEQ ID NO:12)センス鎖保有G4(−mm)または非標的コントロール(5’−UAAGGCUAUGAAGAGAUAC)(SEQ ID NO:13センス鎖)siRNAの保存溶液を、希釈血清培地(HyClone)にて調製し、+4℃にて保存した(G4siRNA濃度:1.0、0.5および0.1μM)。この+4℃G4保存溶液調製から、1、6、13、20、および27日後に、HeLa細胞をDMEM+10%FCS培地にプレーティングした。次の日に、培地を除去して+4℃保存溶液に交換した。コントロールには、20℃にてバファー保存されたG4siRNAを用いた。次に細胞を3日間培養し、遺伝子ノックダウンを評価した。
G4siRNAが標的遺伝子に対し長期間ノックダウンを起こすために使用できるか否かを評価するために連続投与の実験を行った。この試験を行うために、以下のプロトコールを用いた(図17A参照)。
1日目:HeLa細胞をDMEM培地+10%FCSにプレーティングする。
2日目:培地を、PPIB標的、GAPDH標的、または、非標的コントロールG4siRNA(具体的に、G4(−mm)siRNA)含有、0.1−1.0μM濃度、希釈血清培地に置換する。
3日目:培地をDMEM+血清に戻す。
5日目:細胞を分け再びプレーティングする。
6日目:細胞を無血清培地にて再度G4siRNA処理する。
3’センス鎖C5リンカ分子を持つsiRNAと、別のコンジュゲート部を持つsiRNAとの互換性を試験する目的で、PPIBまたはGAPDHを標的にする機能二本鎖を、コレスタノール、スチグマステロール、プレグネノロン、アンドステロン、エルゴステロール、またはコラン酸をコンジュゲート部として(図18A参照)合成した。各分子は、先に述べた方法で合成した。こうして得られた複合体は、G4のコレステロールがコレスタノール、スチグマステロール、プレグネノロン、アンドステロン、エルゴステロール、またはコラン酸に置き換えられていることを除いて、G4複合体(具体的に、G4(−mm)複合体)と同じ修飾パターンを示した。
コレステロールコンジュゲートsiRNAの受動輸送に様々な組織培養の条件が及ぼす影響を明らかにする目的で、2種類の実験を行った。第1の実験では、受動輸送中、血清濃度を変化させたときの遺伝子ノックダウンレベルを測定した。このために、2.5k 3T3NIH、HeLa、およびSHSY−5Y細胞を、10%FCSで懸濁させたDMEM培地にて先ず終夜培養した。翌日、培地を除去し、(1)GAPDHまたはPPIB(センス鎖PPIB69 5’UCACGACAGUCAAGACAGC3’(SEQ ID NO:14)およびPPIB39センス鎖5’CAGCAAAUUCCAUCGUGUA3’(SEQ ID NO:15))標的のG4 siRNAを0.1−1μM濃度で含む、または(2)ウシ胎仔血清(FCS)を0−10%(v/v)の濃度範囲で含む、希釈血清培地と交換した。更に48時間細胞を上記条件下で保ち、分岐DNAを用いて遺伝子ノックダウンを評価した。G4 siRNAには全てG4(−mm)を用いた。
遺伝子サイレンシングを起こすG4siRNAの生体内での効果を試験する目的で、以下のように設計されたsiRNAを合成した。
1.非標的コントロールG4(−mm)、(5’UAAGGCUAUGAAGAGAUAC、センス鎖)(SEQ ID NO:16)
2.PPAR−γ・標的G4(−mm)、(5’GACAUGAAUUCCUUAAUGA、センス鎖)(SEQ ID NO:17)
3.アポB標的G4(−mm)(5’GUCAUCACACUGAAUACCA、センス鎖)(SEQ ID NO:18)
4.HP6リンカ分子を介するコレステロールコンジュゲート含有アポB標的siRNA(C5リンカ分子の代わりにHP6リンカ分子である点を除いて上記3に同じ)
二次的構造の導入によって、全体の機能を増強させ得るか否かを明らかにする目的で、異なる位置でミスマッチを有するG4siRNAを合成した。このために、センス鎖6位から10位でミスマッチとなる全ての可能なセンス−アンチセンス鎖を有する、低機能GAPDH標的siRNAを合成した。続いて、これら分子の各々が、受動輸送を介してGAPDHノックダウンを誘発する能力を、分岐DNAを用いて評価した(受動輸送の条件:2.5k HeLa細胞をプレーティング、siRNA濃度=0.1μM、または1μM、希釈血清培地、72時間後ノックダウンを評価)。
広範な標的mRNAをノックダウンするミスマッチ含有G4siRNAの効果を試験する目的で、ラットおよびマウス遺伝子(PPIBおよびGAPDH)とともに、ヒト遺伝子(LMNA、CDC2、TP53、AKT1、RB1、HRI、MET、およびPLK)を標的にするG4(+mm)siRNAを合成し(配列およびアクセス番号のリストは以下の表5を参照)、先に述べたプロトコールに従い、個々のsiRNAまたは集団のsiRNAとして、HeLa細胞に受動的に1μMで導入した。
Claims (9)
- 二本鎖オリゴヌクレオチド複合体であって、前記二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、
1)1番目および2番目のヌクレオチド、全Cヌクレオチドおよび全Uヌクレオチドが、2’−O−メチル修飾される18個から30個のヌクレオチドよりなるセンス鎖と、
2)18個から30個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖であって、
ア)全Cヌクレオチドおよび全Uヌクレオチドは2’F修飾ヌクレオチドであり、
イ)前記アンチセンス鎖は標的遺伝子に対して少なくとも80%の相補性を有し、
ウ)前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は二本鎖を形成し、前記アンチセンス鎖の3’末端に2ヌクレオチドオーバーハングを有し、前記オーバーハングはホスホロチオエート連結部を有する、アンチセンス鎖と、
3)コンジュゲート部であって、前記コンジュゲート部は前記センス鎖3’末端にC5リンカ分子を介して結合したコレステロール分子であり、前記センス鎖に結合したコレステロール−リンカ分子は(式1)に示す構造を有する、コレステロール分子と、
5)前記アンチセンス鎖の14番目のヌクレオチドと前記センス鎖の相対するヌクレオチドとの間にあるミスマッチと、
から構成されることを特徴とする二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。 - 前記アンチセンス鎖の14番目のヌクレオチドと、前記センス鎖の6番目のヌクレオチドとが同一であることを特徴とする、請求項1に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
- 前記アンチセンス鎖の3’末端に2ヌクレオチドオーバーハングを有し、前記2ヌクレオチドオーバーハングはUUオーバーハングであることを特徴とする、請求項2に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
- 前記センス鎖の5’末端に結合した色素分子を少なくとも一つ有する、請求項1に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
- 細胞内の標的遺伝子の発現阻害に用いられる、請求項1から請求項4までの任意の請求項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
- 逆形質移入により前記細胞中に輸送される二本鎖オリゴヌクレオチド複合体であることを特徴とする請求項5に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
- 生体中前記細胞内に輸送される二本鎖オリゴヌクレオチド複合体であることを特徴とする請求項6に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
- 請求項1から請求項7までの任意の請求項に記載される二本鎖オリゴヌクレオチド複合体と、医薬品として許容される担体または希釈液の少なくとも一つとを含有する医薬品組成物。
- コンテナから構成されるキットであって、請求項1乃至請求項4に記載される二本鎖オリゴヌクレオチド複合体および希釈血清組織培養培地を含有するキット。
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