JPH10511884A - 新規人工組織、その製法およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は架橋可能な構造物中の三次元細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、人工的な三次元組織を誘導するための細胞相互作用系からなり、そして免疫抑制因子または細胞分化因子を放出する遺伝子操作された細胞を包含する新規人工組織に関する。本発明によるこの組織、生きている移植片の製造のためおよび疾病モデルを樹立するために好適である。

Description

【発明の詳細な説明】 新規人工組織、その製法およびその使用 本発明は新規人工組織、その製法およびその使用ならびに生きている移植片の 製造目的のためおよび疾病モデル樹立のための人工組織誘導用細胞相互作用系に 関する。in vitroの臓器および組織モデル用のかかる細胞相互作用培養系は、細 胞外マトリックス（ＥＣＭ）の形成を可能にするが、しかし最初にＥＣＭを有し ない三次元担体構造物を用いる三次元細胞組織の調製に適する。人工組織の制限 された相互作用により疾病モデルの構築が可能となり、その場合境界ゾーンで外 部的影響、例えば薬剤投与による細胞およびマトリックス変化を検査できる。 細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が記載されている多数の細胞培養系が知られて いる。従って、DE3,410,631 号特許の明細書には、ゲル形または天然または人工 の骨材料中に埋め込まれて存在する、欠陥のある軟骨または骨の再生用のインプ ラント材が示されている。このゲルは胚性の種特異的な軟骨細胞または間葉細胞 を含有し、そして好適には軟骨細胞の細胞外マトリックスおよび成長ホルモンを も含有する。米国特許第4,801,299 号には、コラーゲンをベースとする細胞外マ トリックスの形態の体内インプラント材が提案されている。 米国特許第4,935,000 号には、細胞外マトリックス−誘導による組織再生方法 が記載されている。細胞外マトリックスは、さらにヒトの皮膚の再生と、化粧用 組成物（米国特許第 5,055,298号）に関して、ならびにＴ細胞が付着するための コラーゲンまたはフィブロネクチン基底に（米国特許第 5,188,959および5,354, 686 号）使用されている。細胞培養物の双極性の付着性肝細胞の定常期培養のた めの基礎マトリックスとしてのコラーゲン（タイプ１）はDE 4,336,399号に記載 されている。 固体の表面被覆と固定化すべき吸着物との間の静電相互作用による、固体の生 体適合性担体物質上への酵素、タンパク質および全細胞の機能的固定化はDE 432 3487号に記載されている。WO 92/20780(DE 4,116,727)号には、種々の哺乳類細 胞の同時培養、種々の哺乳類細胞産物の別々の産生、ならびに体液レベルでの臓 器相互作用のモデル形成が記載されている。 インプラント材の製造においては、吸収性物質からできたポリマー繊維束から 出発し、その上に単離され増殖された細胞を置き、そしてこの束を移植する方法 が知られている。WO 90/12603 号では、置き換えるべき臓器の形態に形成され所 望の細胞を加えられた三次元支持体構造物が報告されている。しかしながら、三 次元支持体構造物では、インプラント材の内部の細胞に栄養物質を充分に供給す るという課題が存在する。 DE 4,306,661号では、細胞培養物からのインプラント材の製造が請求の範囲に 記載されている。それによれば、軟骨細胞を吸収性の、予備成形した三次元支持 体構造物（インプラント材の所望される構造に相当する）上に置き、そしてこの 構造物をそれを通して栄養溶液が拡散できる物質で覆う。この方法で、細胞の相 互結合により細胞間マトリックスが形成されうる。この人工的に調製された軟骨 組織は移植中および移植後のその組織の長期安定性を危うくする多くの負の影響 にさらされる(Buja J．ら、Ann.Rheum.Dis.，1994 Apr.53(4):229-34)。これは 、例えば、関節症またはリウマチ様関節炎に罹っている患者で特に重要である。 ここで移植された組織は、病気による退化性および炎症性の経過に対する局所的 な効果を有していなければならない。 移植可能な軟骨置換組織の製造法は、いくつか知られている(Vacanti C.A．ら 、Plastic and Reconstructive Surgery，8:753-759，1991; Sittinger M．ら、 Biomaterials 1994,15:451-456）。 exo vivoで主に抗炎症性遺伝子を有する滑膜の細胞を提供し、そして次に再び それらを移植することも記載されている(Evans，C.H．and P.D．Robbins，1994; Gene Therapy for Arthritis．in Gene Therapeutics: Methods and applicati 本発明は、新規人工組織の提供、その製法の開発、およびその医療上の使用を 可能にするという目的に基づくものである。 この目的は、架橋可能な構造物中における新規な三次元細胞外マトリックス（ ＥＣＭ）、人工的な三次元組織を誘導するための細胞相互作用系、ならびに免疫 抑制因子または細胞分化因子を放出する遺伝子操作された細胞からなる、新規な 人工的な相互作用性(interagierender)組織を提供することにより解決された。 本発明によれば、細胞外マトリックスを有するかまたはつくり出す培養物を、 膜を上介して相互に結合させるか、または互いに直接接触させるか、または相互 に混合するやりかたで、人工的な三次元組織を誘導するための細胞相互作用系が 用いられる。従って、例えば軟骨組織または骨組織への人工的な細胞組織の誘導 は、トランスフェクションされた細胞培養物または骨膜細胞または軟骨膜細胞の 三次元培養物によって影響される。移植片の安定化を達成するという目的は細胞 の遺伝子操作により、特に所定の遺伝子、例えば、骨形態形成タンパク質、イン ターロイキン−１レセプターアンタゴニストまたはTGF-βを有するヒト細胞を供 給し、そして次に新規な軟骨組織となるまで培養することにより、解決された。 本発明は、新規で改善された性質を有する産物を生成するように共同作用する 新規な要素と公知の要素との組み合わせからなる。本発明による細胞相互作用系 （図１）は、栄養溶液／冷却容器１、液滴形成室２、混合室３、潅流室４（加熱 プレート具備）、定量測定ユニット５（光学制御）、試料採取ユニット６、媒体 流出室７およびインターフェース／PC８からなる。本発明によれば、三次元支持 体構造物、例えば、吸収性ポリマーフリース(Vlies)を用いて三次元細胞組織が 製造される。軟骨組織の製造には、例えば、分化しない（増殖した）軟骨細胞ま たは未分化間葉前駆体細胞が使用される。一般的には、患者からの分化した軟骨 細胞は、わずかな量でしか（手術によることが必要）入手できない。 分化性ミクロ培地を作り出すためには、a)未分化細胞懸濁液を定義された（分 化した）表現型の内因性細胞または細胞凝集物と混合する、b)定義された（例え ば分化した）または遺伝子操作された外因性細胞をゲルまたはフリース中で懸濁 させ、そして分化すべき組織の回りにまたは分化すべき組織上に直接に付着させ る。 この方法の設計では、２つの人工的な三次元細胞組織の間に定義された接触ゾ ーンをつくる。この接触ゾーンは疾病の試験系として作用する。境界ゾーンでは 、例えば薬剤の投与時の細胞およびマトリックスの変化を検査できる。 本発明による相互作用細胞培養系は、in vitro臓器および組織モデルとしての 使用に好適である。 驚くべきことに、例えば、トランスフェクションした細胞培養物または細胞外 マトリックスを生成するかまたはそれを有する骨膜細胞または軟骨膜細胞の三次 元培養物を軟骨組織または骨組織へ人工的に細胞組織を誘導することは、特に細 胞外マトリックスが重要な役割を果たしている疾病モデルの構築を可能にするこ とが判明した。これらの新規な相互作用性人工組織の使用は、病原性および感染 過程のin vitroシュミレーション、疾病モデルの樹立、および活性物質の試験に 適する生きている移植片の調製にある。 図２は細胞および組織配置を示す。 連続培養：組織からの因子（左）が右の組織に作用する。右の組織からのこの 因子は左の組織には作用しない。 サンドイッチ培養：２つまたはそれ以上の人工組織が重なっているかまたは近 接している（接触ゾーン）。 組み込み培養：これは組織の分化のための異なる細胞の混合物である。 潅流細胞：混合物中の懸濁された細胞（例えば、リンパ球または微生物）が人 工組織（例えば内皮）に沿って流れ、そしてそれら細胞が適切なレセプターを発 現する場合はそこに付着する。 図３： 上の図：細胞混合の目的は、わずかな分化したかまたは分化している細胞を用 いて、できるだけ多くの未分化細胞を分化させることにある。80％の未分化間葉 細胞および20％の分化した軟骨細胞が一つの組織中に一緒に存在する（組織１） 。外因性のまたは遺伝子操作された細胞は、それらが分化性因子を生産する場合 は、組織１の回りに配置される。 下の図（接触ゾーン）：リウマチ様関節炎においては、滑膜細胞が患者の関節 中の関節軟骨表面および細胞外マトリックスを破壊することによって関節軟骨を 破壊し、結局滑膜細胞が軟骨中に浸潤する。 本発明により安定化される移植可能な軟骨組織は、三次元構造物中の新規細胞 外マトリックス（ＥＣＭ）、増殖した軟骨細胞、架橋可能／重合可能なポリペプ チドまたはポリサッカライド、および遺伝子操作によりマトリックス分子、免疫 抑因子のまたは細胞分化因子を放出する細胞、からなる。それらの構造は、三次 元繊維構造、三次元組織、フィブリンおよび人工的な軟骨系を取りまく半透膜か ら構成される。 所望の形態は、例えば、シリコーンを含まない、ウール繊維の、またはα−ヒ ドロキシ酸のような吸収性ポリマー製繊維からなる構造物、およびポリリジンま たはヒアルロン酸のようなポリ電解質複合体からなる半透膜から組み立てられる 。 移植可能な軟骨組織の製法は、重合性溶液を含有する軟骨細胞懸濁液および遺 伝子治療的に改変した細胞を三次元構造物中に充填する工程と、トロンビンまた は重合誘発因子を用いてそれらを凝固させる工程と、この三次元構造物中の細胞 が新しい細胞外マトリックス（ＥＣＭ）をつくる工程と、そして軟骨系を半透膜 で包囲する工程とを備える。 重合性溶液は架橋可能／重合可能なポリペプチドまたはポリサッカライド、お よび遺伝子操作によりマトリックス分子、免疫抑制因子または細胞分化因子を放 出するように改変した細胞からなる。 フィブリノーゲン含有細胞懸濁液を三次元繊維構造または三次元組織から作ら れた構造物中に充填し、そしてトロンビンを用いて凝固させる方法において、ポ リペプチドとしては、フィブリノーゲンが用いられる。 フィブリノーゲンは、その細胞が由来する患者からおよび／またはその三次元 軟骨組織を移植すべき患者から回収する。 本発明によれば、細胞の全部または一部を以下の遺伝子の１種以上を用いて遺 伝子治療的に改変する。このような遺伝子としては、TGF-β、骨形成タンパク質 、モルフォゲン(Morphogene)、モルフォゲンのレセプター、抗炎症性サイトカイ ン、サイトカインアンタゴニスト、例えばIL-1- アンタゴニスト、IL-1- レセプ ターアンタゴニスト、TNF-アンタゴニスト、またはプロテアーゼインヒビター(T IMP,PAI)がある。 その場合、１種の遺伝子操作を行なった細胞または種々の遺伝子操作を行なっ た数種の細胞を、未改変の細胞と組み合わせることができる。取り込まれた遺伝 子は、一時的にまたは永久に発現される。驚くべきことに、形づけ(Formgebung) および遺伝子操作は、遺伝子操作された細胞と未改変の細胞の不均等な分布に基 づく分極を達成するのに使用できる。 本発明のもう一つの特徴は、遺伝子操作された細胞および未改変の細胞が別々 の人工組織中にとり込まれ、そして形作られ、そして組み合わされて一つの組織 を完成するか、または形作られた組織を遺伝子操作された細胞および未改変の細 胞と層中で組み合わせるか、もしくは包み込むことによって組み合わせ、または 異なる遺伝子操作をされた２種またはそれ以上の組織を層中でもしくは包み込む ことにより組み合わせることにある。 遺伝子操作された細胞を含有する組織は、遺伝子的に未改変の細胞を含有する 組織と組み合わせることができる。 本発明により製造された軟骨組織は、特に、免疫抑制特性を有する。 驚くべきことに、本発明による方法はin vitroで製造された軟骨組織のin viv o での保護およびin vivo での維持に適すること、および本発明による軟骨組織 がリウマチ様関節炎患者における治療のために使用できることが見出された。さ らに、本発明により使用された半透膜が移植の前、移植中および移植後しばらく たった後に、製造された軟骨組織によって包囲され、免疫学的および分化反応性 に対する保護を提供することも驚くべきことである。 本発明を実施例により、詳細に説明する。 実施例実施例１ ：三次元胞組織 三次元細胞組織を三次元支持体構造物（吸収性ポリマーフリース）を用いて製 造する。軟骨組織の製造には、(a)分化した（増殖した）軟骨細胞または(b)未分 化間葉前駆体細胞が使用される。その際、フリース構造中に分布すべき細胞をは じめにフィブリノーゲン溶液中に懸濁する。この細胞懸濁液をフリース支持体中 に充填し、そしてトロンビンの添加により凝固させる。実施例２ ：分化性ミクロ培地 分化性ミクロ培地を作り出すために、(A)未分化細胞懸濁液を分化した表現型 の内因性の細胞または細胞凝集体と５：１で混合する、(B)分化したが外因性の 細胞をゲルまたはポリマーフリース中で懸濁させ、そして分化すべき組織の回り にまたは分化すべき組織上に直接付加させる。 分化性ミクロ培地は、 １．分化した軟骨胞、 ２．BMP （骨形成タンパク質）でトランスフェクションされた胞、 ３．傍分泌(parakrin)様式で軟骨分化因子を生産するかまたは放出するすべての 細胞（骨膜および軟骨膜細胞）、組織（骨膜、滑膜）または組織構成分（マトリ ックス）を用いて、作り出されうる。 目下のところ知られている因子は、例えば、骨形態形成タンパク質、軟骨由来 形態発育タンパク質、トランスフォーミング成長因子βである(Luyten，F．P.ら 、Acta Orthop．Belg.，58 Suppl．1（1992）263-267; Exp．Cell Res．1994，2 10:224-9; Chang，S．C.ら、J．Biol．Chem．1994，269:28227-28234)。 これら方法の配置により、２つの人工的な三次元細胞組織の間の定義された接 触ゾーンが作り出される。実施例３ ：リウマチ様関節炎モデル リウマチ様関節炎患者の滑液からの攻撃的な細胞（３Ｄ組織１）は軟骨細胞組 織（３Ｄ組織２）をin vitroで侵襲する。実施例４ ：軟骨組織 異なる成熟度および分化度の増殖した軟骨細胞または間葉前駆体細胞をフィブ リノーゲン溶液中に懸濁し、この細胞懸濁液を吸収性ポリマーフリース中に分布 させ、成長および分化過程を促進する因子または適当な細胞外マトリックスの構 成分を加え、そしてトロンビンの添加により凝固させ、分化性ミクロ培地に曝す 。実施例５ ：骨組織 異なる成熟度および分化度の骨形成起源の細胞または間葉前駆体細胞をフィブ リノーゲン溶液中に懸濁させ、この細胞懸濁液を吸収性ポリマー構造物中に分布 させ、成長および分化過程を促進する因子または適切な細胞外マトリックスの構 成分を加え、そしてトロンビン添加により凝固させ分化性ミクロ培地に曝す。実施例６ ：”リウマチ様関節炎／in vitroパンヌス組織”モデル リウマチ様関節炎患者の滑膜の細胞（３Ｄ組織１）が、実施例３におけるよう に軟骨細胞組織（３Ｄ組織２）とin vitroで相互作用する。実施例７ ：リウマチ様関節炎患者の軟骨損傷を治療するために人工的に製造され た軟骨組織の移植 患者の組織試料由来の間葉細胞をin vitroで充分に単層培養で増殖させ、そし て部分的にBMP （骨形態形成タンパク質）遺伝子を用いてトランスフェクション する。この細胞をフィブリノーゲン含有溶液中に懸濁させ、次に支持体構造物（ 例えば、ポリラクチドおよびポリグリコリド製の吸収性ポリマーフリース）中に 加える。次にこの懸濁液を、トロンビン添加により構造物中で凝固させる。この 組織は直ちにまたはin vitro成熟後に患者の関節に移植されうる。実施例８ ：他の人工組織−骨、肝臓、腎臓、脈管、皮膚 実施例１と同様に、細胞の一部を所望の遺伝子で操作し、そしてこの遺伝子治 療的に改変した集団を支持体構造物およびフィブリンを使用して、所定の形態と なす。次に、同様に形状を付与する構造物を使用して、遺伝子的に改変していな い細胞をこの構造物に付加させ、それにより遺伝的にとり込まれた活性物質にと っての拡散勾配および活性勾配が、未処理細胞に作用することができる。これは 天然の関節軟骨における分極に匹敵する、in vitro製造された組織構造物の分極 化のために働く。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 47/48 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 48/00 ＡＢＧ Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 5/10 Ｅ 15/09 15/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (71)出願人 ホープル，トーマス ドイツ連邦共和国 ディー−15537 エル クナー，アム シュッツェンヴェルトヒェ ン 59 (72)発明者 ジッティンガー，マイケル ドイツ連邦共和国 ディー−12349 ベル リン，アルト−バッコウ 42シー （番地 なし) (72)発明者 シュルツ，オーラフ ドイツ連邦共和国 ディー−10119 ベル リン，シュタインシュトラーセ 10 (72)発明者 バーメスター，ゲルト アール. ドイツ連邦共和国 ディー−12277 ベル リン，トゥラーヴェーク ７ (72)発明者 ホープル，トーマス ドイツ連邦共和国 ディー−15537 エル クナー，アム シュッツェンヴェルトヒェ ン 59

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．架橋しうる構造物中における新規三次元細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、人 工的な三次元組織を誘導するための細胞相互作用系、ならびに免疫抑制因子また は細胞分化因子を放出する遺伝子操作された細胞からなる新規な人工組織。 ２．人工的な三次元組織を誘導するための細胞相互作用系が、細胞外マトリック スを有するかまたは生成するか培養物からなり、相互に膜を介して結合されてい るか、または直接接触しているかまたは相互に混合されていることを特徴とする 、請求項１記載の組織。 ３．遺伝子操作された細胞または骨膜細胞または軟骨膜細胞の三次元培養物を分 化性ミクロ培地中で使用し、軟骨組織または骨組織へと人工的な細胞複合体を誘 導することを特徴とする、請求項１および２記載の組織および細胞相互作用系。 ４．異なる成熟度および分化度の増殖可能な細胞を懸濁させ、この懸濁液を吸収 性のポリマーフリース中に分布させ、成長および分化過程を促進する因子または 適切な細胞外マトリックスの構成分を加え、そして分化性ミクロ培地に曝すこと を特徴とする、細胞相互作用系を用いる新規な人工組織の製造製法。 ５．細胞相互作用系を用いる軟骨組織の製造にあたり、異なる成熟度および分化 度の増殖した軟骨細胞または間葉前駆体細胞をフィブリノーゲン溶液中に懸濁さ せ、この細胞懸濁液を吸収性のポリマーフリース中に分布させ、成長および分化 過程を促進する因子または適切な細胞外マトリックスの構成分を加え、トロンビ ン添加により凝固させ、そして分化性ミクロ培地に曝すことを特徴とする、請求 項４記載の新規組織の製造方法。 ６．細胞相互作用系を用いる骨組織の製造にあたり、異なる成熟度および分化度 の骨形成起源の細胞または間葉前駆体細胞をフィブリノーゲン溶液中に懸濁させ 、この細胞懸濁液を吸収性のポリマー構造物中で分布させ、成長および分化過程 を促進する因子または適切な細胞外マトリックスの構成分を加え、トロンビンの 添加により凝固させ、そして分化性ミクロ培地に曝すことを特徴とする、請求項 ４記載の新規組織の製法。 ７．分化性ミクロ培地を生成させるにあたり、予め増殖させた、未分化細胞の懸 濁液を定義された表現型を有する自己由来の細胞または細胞凝集物と混合し、そ して分化した外因性細胞を含有するゲルまたはポリマーフリースと直接接触させ ることを特徴とする、請求項４記載の製造方法。 ８．分化性ミクロ培地が、 a)分化した軟骨胞と、 b)BMP（骨形態形成タンパク質）、TGF または関連因子を生産する細胞（ここで これらは異なる方法で目的に相当して遺伝子操作されうる）、 c)軟骨分化因子を生産するかまたは放出するすべての細胞（例えば、骨膜細胞ま たは軟骨膜細胞）、組織（骨膜、滑膜）または組織構成分（マトリックス）、を 用いて生成されることを特徴とする、請求項４−７記載の製造方法。 ９．生きている移植片の調製のため、病原性および感染性過程のin vitroシュミ レーションのため、疾病モデルを樹立するため、および活性物質を試験するため の、請求項１−８記載の新規相互作用性人工組織の使用。 １０．”リウマチ様関節炎／in vitroパンヌス組織”モデルを樹立にあたり、リ ウマチ様関節炎を有する患者の滑液膜の細胞（３Ｄ組織１）を軟骨細胞組織（３ Ｄ組織２）とin vitroで相互作用させることを特徴とする、請求項９記載の使用 。