JP6434014B2 - 球状軟骨細胞治療剤の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、球状軟骨細胞治療剤の製造方法に関する。さらに詳しくは、ａ）軟骨細胞及び／又は軟骨分化能を有する細胞をＶ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレート（deep well plate）に分注し、ｂ）上記プレートを遠心分離し、ｃ）上記プレートをインキュベーター内で三次元培養し、そしてｄ）各ウェルからペレットを回収する工程を含むことによって、繰り返して再現可能であり、均一な良質の軟骨組織を容易かつ安定的に大量に製造できる、支持体(scaffold)のない球状軟骨細胞治療剤の製造方法、及び上記方法で製造された軟骨損傷に注入式で簡単に移植し、損傷を修復する効果を有する支持体のない球状軟骨細胞治療剤に関するものである。

軟骨組織は、無血管組織であり、組織内の細胞密度が顕著に低いため、自然的再生は非常に限定的である。1994年Brittbergら（非特許文献１）が患者自身の関節軟骨細胞を分離、増殖させ、軟骨損傷部に移植する自己軟骨細胞移植術（ＡＣＩ；autologous articular chondrocyte implantation）方法を報告して以来、ＡＣＩ法は、関節軟骨損傷治療に使用され、臓器観察においても成功裏の結果が報告されている。しかしながら、高齢の患者および大きなサイズの損傷では、正常な関節軟骨の構造的特徴又は構成を再現することはできなかった。伝統的なＡＣＩ（第１世代のＡＣＩ）の制限は、骨膜をカバーとして懸濁液状態の細胞を損傷部位に固定する相当に浸潤的な移植方法、移植後細胞の生存率減少及び軟骨細胞の表現型（phenotype）が保持されない点、物理的な強度脆弱などがその原因として指摘されている。このような制限を克服するために、ゲル、膜、三次元支持体を細胞運搬システムとして利用する第２世代のＡＣＩ技術である組織工学的軟骨が開発されている（Hutmacher et al., 2000; Adkisson et al., 2001; Ochi et al., 2001; 及びCancedda et al., 2003）（非特許文献２、３、４、５）。

組織工学的軟骨製造において、支持体は、軟骨細胞に三次元システムを提供して軟骨細胞の表現型を保持し、硝子軟骨の細胞外基質（ＥＣＭ）生産を促進させる。さらに、細胞を軟骨損傷部位に運搬し、移植部位に物理的支持を提供して負荷される力から細胞を保護する。現在、多くの合成又は天然成分の材料を利用して組織工学のための支持体が開発されてきた。しかしながら、臨床に適用する側面から見れば、異種及び同種由来の天然材料は免疫反応を誘発することがあり、合成材料の場合、害になる分解産物が生じることもあるため、安全性側面から問題がある。また、軟骨細胞を支持体に接種すれば、ほとんどが支持体の外郭に分布するようになり、軟骨細胞が合成、分泌した細胞外基質が支持体の外郭でシェルを形成し、栄養分、老廃物及びガスの拡散及び交換を阻害し、結果的に内部細胞の死滅などを引き起こす。幾つかの研究で支持体を用いて成功裏に組織工学的軟骨を製造したが、細胞と生体材料との相互作用、生体材料の不規則な分解性、生体適合性、均一ではない細胞分布、移植後組織工学的軟骨と周辺軟骨の連結（結合）不足などが未だに解決しなければならない課題として残っている（Hutmacher et al., 2000; Ochi et al., 2001; Sittinger et al., 1996; Grande et al., 1997; Nehrer et al., 1998; Sims et al., 1998; Naumann et al., 2004; Park et al., 2006; 及びWolf et al., 2008）（非特許文献２、４、６、７、８、９、１０、１１、１２）。

支持体を用いず、三次元的軟骨組織を製造する方法に対する研究は、継続して行われてきたが、このような方法は、細胞と細胞のＥＣＭ合成能力にのみ依存して組織を形成するため、移植が必要な損傷サイズに合う組織作りが難しく、直接臨床適用することは非常に制限的と報告されてきた（Adkisson et al., 2001; Grogan et al., 2003; 及びMarlovits et al., 2003）（非特許文献３、１３、１４）。軟骨は、無血管組織であるので、低酸素及び低栄養状態でよく耐える。しかしながら、Jainら（2005）及びRouwkemaら（2008）（非特許文献１５及び１６）は、体内のあらゆる細胞は、血管から１００〜２００μｍ以上離れていないため、実験室で移植のための組織を作る際にも、制限された栄養成分、老廃物及びガスの拡散を考慮し、その大きさを決定しなければならないとした。その上、軟骨損傷の形状と深さは均一ではない（図１Ａ）ため、実験室で製造した三次元的軟骨が損傷部位より大きい場合、損傷の形状に合わせて移植物（implant）を整えなければならなく、また、軟骨移植物が損傷部位より小さいときには、損傷形状に合わせてモザイクのように嵌め込む方法で移植しなければならなかった。現在までに開発された組織工学的軟骨製品はこのような方式で移植されているが、損傷の厚さは合わせるのが難しく、関節軟骨で移植物が周辺の軟骨より高くはみ出すか、陥没されれば、異常な体重負荷により移植物又は周辺正常軟骨に追加的損傷を誘発する虞がある（図１Ｂ）。

従って、小さな球状の軟骨組織が作られれば、培養過程中の潅流（perfusion）の問題による内部細胞の死滅が生じず、損傷部位に幾つかの小さな球状組織を詰め込むことで、軟骨損傷部位の形状及び厚さに関係なく、欠損部位を修復することができる。さらに、大きく切開することなく、小さな切開又は関節鏡を通して損傷部位に注入式で移植が可能である（図１Ｃ）。しかし、治療剤として開発するためには、繰り返して再現可能で、均一化された軟骨性組織を作ることができる技術が必要であり、広い部位損傷に使用するためには、相当多数の軟骨性組織を製造することができる大量培養システムが求められる。

支持体を使用することなく、硝子軟骨性組織を製造する方法は、軟骨細胞又は軟骨分化能を有する細胞の高密度三次元培養に基づいている。高密度で三次元状態を維持することは、軟骨細胞の表現型発現において最も重要な要素である。発生過程で見れば、軟骨前駆細胞の凝集（aggregation）以後、初期細胞−細胞及び細胞−基質付着分子の増加により軟骨分化は促進される（Tavella et al., 1997； Stewart et al., 2000； Anderer et al., 2002；及びZhang et al., 2004）（非特許文献１７、１８、１９、２０）。

支持体のない小さな軟骨構造物を製造する方法のうち、まず、ペレット培養は、比較的少ない数の細胞を遠心分離し、細胞凝集（condensation）をなして、三次元培養開始工程から人為的に細胞の超高密度培養システムを製造する方法である。ペレット形成過程は、簡単に容易に再現可能であり、軟骨形成能力を有する細胞は、このシステム下で軟骨性基質を合成、分泌して、軟骨性組織を作るようになる（Zhang et al., 2004）（非特許文献２０）。ペレット培養法は、幹細胞の軟骨分化能力を評価する時に最も多く使用される方法であり（Pittenger et al., 1999）（非特許文献２１）、軟骨細胞に及ぼす外来因子等の影響を評価する用途にも利用されている（Stewart et al., 2000；Croucher et al., 2000； Graff et al., 2000；及び Larson et al., 2002）（非特許文献１８、２２、２３、２４）。しかしながら、ペレット培養で作る軟骨構造体の細胞治療剤への利用可能性に対する評価は行われていない。なぜなら、ペレットシステムは良質の軟骨性組織を作るのに有用な方法であるが、十分な大きさのペレットを作ることが難しいという問題から軟骨損傷再生に適用には難しいと考えられていたからである。また、一般的なペレット培養は、蓋付きチューブ（円錐チューブ、貯蔵チューブ、マイクロ遠心分離チューブ等）に、細胞懸濁液を入れ、遠心分離後、三次元培養して、チューブ１個当たり一個のペレットを作ることができる方法を利用するため、大量培養への適用は難しい（図２Ａ）。

支持体のない小さな軟骨構造物を製造する方法としては、自然的に細胞の凝集を誘導する方法がある。Mosconaら（1961）（非特許文献２５）は、回転技術を利用して“aggregation pattern（凝集パターン）”と命名した細胞集合体を作製した。彼らは、細胞を培養液に浮遊した状態で動的培養（dynamic culture）するとき、細胞間の作用により自然的に細胞集合体（aggregate）が形成されたことを報告した（図２Ｂ）。Landryら（1985；1984）（非特許文献２６、２７）は、非付着性プラスチック表面上で細胞を操作して三次元細胞集合体を作製し、これを“スフェロイド（spheroid）”と名前付けた。Reginatoら(1994); Stewartら(2000); Andererら(2000);及び、Wolfら(2008)（非特許文献１２、１８、１９、２８）は、軟骨細胞をアガロースやヒドロゲルでコーティングした非付着性培養皿で培養し、自然的な細胞集合体形成を誘導した（図２Ｃ）。このような自然的なスフェロイドシステムにおいて、細胞は、三次元的な細胞集合体を形成し、硝子軟骨の自然的な基質と類似な自己の細胞外基質（ＥＣＭ）を生産する。しかし、この培養方法は、一個の細胞集合体を作る細胞数を調節することができず、形成された軟骨性組織間の融合（fusion）が引き起こされる虞があるため、それぞれ軟骨性組織の大きさ及び軟骨化の変動が存在するので、組織工学的／細胞治療剤として規格化することができないという短所がある。

さらに別の自然的に細胞凝集を誘導する方法には、付着性培養皿を使用する方法がある。Imabayashiら(2003)（非特許文献２９）は、軟骨分化能を有する細胞の高濃度懸濁液を付着性培養皿に滴下し、３７℃インキュベーター中に静置すれば、数時間〜数日以内に細胞が凝集し、これを培養培地で浮遊させた後、非付着性培養皿又は動的培養条件で三次元培養した方法を記載している（図２Ｄ）。マイクロマス／コンドロスフィア（chondrosphere）培養と呼ばれるこの方法は、軟骨性組織を形成する細胞数を調節することができるという長所がある。しかしながら、自然的に細胞集合体を形成し得る能力は細胞の状態によって差があるため、均一化された軟骨性組織を安定的に得ることができる保障はない。また、ＥＣＭが硬くなる前に、細胞集合体を一度に培養する場合、形成された軟骨性組織間の融合が生じる虞があった。

自然的な細胞集合体を形成する細胞数を同じにするために、マイクロウェルを使用する研究も行われている。肝細胞の三次元培養で、へパトスフィア（Hepatosphere）が大きい場合、内部コアの壊死が生じ得る。その結果、所望の大きさで多量の均一化されたへパトスフィアを作ることができる三次元培養システムの開発が必要とされていた。Fukutaら(2006) （非特許文献３０）は、そのような方法の一つとして、微小成形技術（micromolding techniques）のような方法を開発した。Wongら (2011)及びChoiら(2010)（非特許文献３１及び３２）も、薄いポリ−ジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）膜に基づいた直径３００〜５００μｍの凹状のマイクロモールドを作製し、肝細胞を平たなＰＤＭＳ、シリンダー形又は凹状のマイクロウェルで培養し、スフェロイドを形成させたとき、凹状のマイクロウェルで形成された球体の大きさと形状は均一にされ、大きさは凹状のマイクロウェルの直径により完璧に調節され、凹状のマイクロウェルで培養した細胞は、シリンダー状マイクロウェルや平たな表面でより速く球体を形成しており、細胞を回収しやすいため、安定した球体を得るのに大きい長所となると報告した（図２Ｅ）。マイクロモールドを用いたマイクロ−組織製造方法は、モールドが商品化され、様々な細胞で評価されてはいるが、これもまた、自然的な細胞凝集を誘導する方法であるため、均一化された軟骨性組織を安定的に得ることができる保障はなく、作られた細胞集合体の大きさが小さすぎるため、物理的強度が脆く、取扱い難く、三次元軟骨細胞治療剤として使用するには限界があった。

このように、支持体を用いずに三次元的軟骨組織を製造する方法として、現在までに公知の方法は、十分なペレットの大きさを形成することができないか、大量生産に適しないか、繰り返して再現可能な均一な軟骨組織を形成することができないか、形成された細胞集合体の大きさが小さすぎて、強度が低いという問題点がある。故に、これらの方法は支持体のない球状軟骨細胞治療剤を生産するには適しない。

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そこで、本発明は、支持体を用いず、三次元的軟骨組織を製造する方法として、特に球状軟骨組織を生産するのに適した新しい方法を提供しようとするものであり、容易に購入可能なＶ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートを利用する簡単な方法により、繰り返して再現可能であり、均一な良質の軟骨組織を容易に安定的に大量に作ることができる球状軟骨細胞治療剤の製造方法を提供することを技術的課題とする。また、本発明者らは、上記方法で製造した支持体のない球状軟骨細胞治療剤が実際軟骨損傷に注入式で簡単に移植され、損傷を修復する効果を有することを確認しており、本発明は、上記製造方法で製造された支持体のない球状軟骨細胞治療剤を提供することをさらに別の技術的課題とする。

上記の技術的課題を解決するために、本発明は、ａ）軟骨細胞及び／又は軟骨分化能を有する細胞をＶ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートに分注し、ｂ）上記プレートを遠心分離し、ｃ）上記プレートをインキュベーター内で三次元培養し、そしてｄ）各ウェルからペレットを回収する、工程を含む球状軟骨細胞治療剤の製造方法を提供する。

また、本発明は、上記方法で製造された軟骨損傷に注入式で簡単に移植し、損傷を修復する効果を有する支持体のない球状軟骨細胞治療剤を提供する。

さらに、本発明は、上記球状軟骨細胞治療剤と、骨及び／又は骨移植材料と、を含む骨軟骨損傷治療用軟骨−骨二層構造物を提供する。

本発明は、支持体を用いず、三次元的軟骨組織を製造する際に、Ｖ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートを使用することによって、従来の培養方法と比較して、繰り返して再現可能であり、均一な良質の球状軟骨組織を容易に安定的に大量に作ることができ、自動化が可能であり、実際患者の軟骨損傷に注入式で簡単に移植され、損傷を修復する効果を有する球状軟骨細胞治療剤を製造することができる。

球状軟骨組織移植物の必要性を概略的に示した図であり、Ａは軟骨損傷の不規則な形状及び様々な膝軟骨厚さを示し、Ｂは単一規格（厚さ）の移植物の場合、軟骨厚さに応じて軟骨面からはみ出されるか、陥没される形態で移植され、移植物又は周辺正常軟骨に異常な体重負荷がかかる現象を示し、Ｃは小さな球状の移植物の場合、注入式で軟骨損傷の形状／厚さに関係なく、移植可能であることを示している。 軟骨細胞又は幹細胞から支持体のない三次元軟骨組織を作る様々な製造方法を概略的に示した図である。 ９６ウェル ディープウェルプレートと一般的な９６ウェル プレートのウェルの深さ（高さ）の差を示す写真である。 様々な形態のＶ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートとそれぞれのウェルで球状軟骨組織（ペレット）の形成模式図である。 Ｖ字状の底部を有する９６ウェル プレート（３００μＬウェル容量）で、三次元ペレット培養した軟骨細胞の組織学的染色（ＧＡＧ染色）結果を示す写真である。 平たな底部を有する９６ウェル プレート（３００μＬウェル容量）で、三次元ペレット培養した軟骨細胞の写真である。 凹状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートで、三次元ペレット培養した軟骨細胞の写真である。 Ｖ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートで、三次元ペレット培養した軟骨細胞の写真である。 ウサギの軟骨細胞をＶ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートで、三次元ペレット培養して製造した球状軟骨組織（ペレット）の初期接種細胞数及び培養時間による特性を評価した結果である。 ウサギの軟骨細胞をＶ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートで、１ウェル当たり１．０×１０^５細胞で、１０日間、三次元ペレット培養して製造した球状軟骨組織（ペレット）の特性を分析した結果である。 ヒトの軟骨細胞をＶ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートで、１ウェル当たり１．０×１０^５細胞で、１０日間、三次元ペレット培養して製造した球状軟骨組織（ペレット）の特性を分析した結果である。 ９６ウェル ディープウェルプレートの各ウェルに、同時に細胞を接種し、培地を交換し得る装置及び適用可能な自動化システムを示した写真である。 持ち運び可能なペレット収集装置の模式図である。 図７のヒトの軟骨細胞から製造したペレットをヌードマウスの皮下に移植し、４週、８週、１６週及び２０週後に観察した結果の写真である。 図６のウサギの軟骨細胞から作ったペレットをウサギの膝軟骨損傷部に移植し、６週、１２週、２４週後に移植部位再生組織を観察した結果である。

以下、本発明を詳しく説明する。
本発明の球状軟骨細胞治療剤の製造方法は、下記工程を含むことを特徴とする。
ａ）軟骨細胞及び／又は軟骨分化能を有する細胞をＶ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートに分注し、
ｂ）上記プレートを遠心分離し、
ｃ）上記プレートをインキュベーター内で三次元培養し、そして
ｄ）各ウェルからペレットを回収する工程。

一側面で、本発明の球状軟骨細胞治療剤の製造方法は下記工程を含んでいてもよい。
ａ）軟骨細胞及び／又は軟骨分化能を有する細胞をＶ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートに分注し、
ｂ）上記プレートを遠心分離し、
ｃ）上記プレートをインキュベーター内で三次元培養し、
ｃ−１）培地を交換し、そして
ｄ）各ウェルからペレットを回収する工程。

驚くべきことに、本発明者らは、商業的に利用可能なＶ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートを利用する簡単な方法により、繰り返して再現可能であり、均一な良質の球状軟骨組織を容易に安定的に大量に製造できることを見出した。

本発明の製造方法の第一の工程は、軟骨細胞及び／又は軟骨分化能を有する細胞をＶ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートに分注することである。本発明の製造方法に使われるＶ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートは、商業的に利用可能であるものであれば、いずれであってもよく、４００μＬ以上の培地を添加するのに適するようにウェル容量が５００μＬ以上であることが好ましい。下記実施例では、Ａｘｙｇｅｎ社製（Corning Life Science, USA）のＶ字状の底部を有するウェル容量が６００μＬである９６ウェル ディープウェルプレートを使用したが、これに限定されない。

本発明の製造方法において、Ｖ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートの各ウェルに、同時に細胞を接種し得る装置は、既に商業的に利用可能である。その一例に、図８ａ及び図８ｂに、９６ウェル ディープウェルプレートの各ウェルに、同時に細胞を接種し、培地を交換し得る装置及び適用可能な自動化システムが示されている。好ましくは、マルチ−チャネルピペット、マルチ−ピペット、マイクロプレートワォッシャー及びマイクロプレートディスペンサーからなる群より選択される装置を用いて遂行することができる。

本発明において、軟骨細胞又は軟骨分化能を有する細胞は、哺乳動物由来のものを用いる。例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ヤギ、ウサギ、マウスなどを含むが、これに限定されない。好ましくは、ヒト、ウサギ又はヤギから単離した軟骨細胞及び／又は軟骨分化能を有する細胞を使用する。

本発明において、用語「軟骨細胞（chondrocyte）」とは、既に軟骨細胞に分化方向が決定された細胞である軟骨前駆細胞（chondroblast）までも含む概念である。用語「軟骨分化能を有する細胞」とは、適切な培養条件で軟骨細胞に分化する能力を有する細胞を意味する。好ましくは、軟骨分化能を有する細胞は、間葉系幹細胞、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞よりなる群から選ばれ、上記間葉系幹細胞は、脂肪由来、骨髄由来、臍帯由来、臍帯血由来、胎盤由来、滑膜由来、骨膜由来又は軟骨膜由来細胞であることを特徴とする。

Ｖ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートに分注される軟骨細胞又は軟骨分化能を有する細胞の量は、０．１×１０^５細胞／ウェル〜５．０×１０^５細胞／ウェルの範囲であり、好ましくは、０．５×１０^５細胞／ウェル〜２．０×１０^５細胞／ウェルの範囲である。このとき、培養培地の量は、３００μＬ／ウェル〜２，０００μＬ／ウェルの範囲であり、好ましくは、４００μＬ／ウェル〜６００μＬ／ウェルの範囲である。下記実施例では、細胞をそれぞれ０．５×１０^５細胞／４００μＬ／ウェル、１．０×１０^５細胞／４００μＬ／ウェル又は２．０×１０^５細胞／４００μＬ／ウェルで分注した後、ペレット培養し、２８日間評価した。その結果、球状ペレットの形成において、いずれも満足できる結果が得られた。ただし、ペレットの大きさが接種された細胞数に正比例して連続的に増加するのではなく、特に２．０×１０^５細胞／４００μＬ／ウェルは１．０×１０^５細胞／４００μＬ／ウェルと比較して、接種細胞数は２倍であるが、形成されたペレットの大きさは、ある時点（例えば、２８日目）に達すれば、それほど差がないか、二次元的な面積も約１．１〜１．３倍程度に止まった。

本発明の製造方法の第二の工程は、細胞を分注した上記９６ウェル ディープウェルプレートを遠心分離することである。遠心分離は、２００〜３０００ｒｐｍで５〜１５分間、好ましくは、５００〜２０００ｒｐｍで５分〜１０分間行う。遠心分離条件の具体的な例示には、５００ｒｐｍで１５分間、１０００ｒｐｍで１０分間、１０００ｒｐｍで５分間、１５００ｒｐｍで５分間、２０００ｒｐｍで５分間、遠心分離する方法などが挙げられるが、必ずこれらに限定されるものではない。最も好ましくは、１２００ｒｐｍで５分間、遠心分離すればよい。

本発明の製造方法の第三の工程は、遠心分離した９６ウェル ディープウェルプレートをインキュベーター内で三次元培養することである。インキュベーターでの三次元培養条件は、この技術分野における通常的に使用する条件をそのまま使用することができる。一態様で、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで細胞を三次元培養してもよい。培地の種類には限定がないが、無血清培地を使用するのが好ましい。一態様で、上記培地は軟骨分化用培地である。

本発明において、三次元培養は、少なくとも３日以上行うことを特徴とする。好ましくは、３日〜３０日間、最も好ましくは、３日〜２０日間行ってもよい。３日未満培養する場合、十分な大きさのペレットが得られないだけでなく、ペレットが硬く凝集されず、解けてしまう特性を示す。また、３０日を超えて培養する場合、死滅細胞及び肥大軟骨細胞が過多出現し、良質の軟骨組織を収得するのに望ましくない。

一側面で、本発明の製造方法は、この工程で培地を交換する工程をさらに含むことを特徴とする。好ましくは、３〜４日間隔で培地を交換しながら細胞を三次元培養することができる。このような培地交換には、上記の第一の工程で、９６ウェル ディープウェルプレートの各ウェルに、同時に細胞を接種するのに使用した装置をそのまま使用することができる。これらの装置は、既に商業的に利用可能である。培地を交換し得る装置及び適用可能な自動化システムの例が、図８ａ及び図８ｂに示されている。好ましくは、マルチ−チャネルピペット、マルチ−ピペット、マイクロプレートワォッシャー及びマイクロプレートディスペンサーからなる群より選択される装置を用いて遂行することができる。

培養が完了すれば、本発明の製造方法の最後の工程により、各ウェルからペレットを回収する。ペレットを回収する方法には、特に限定がなく、この技術分野における通常的に使用する真空吸入ポンプを用いた方法を使用することができる。例えば、図８ｃに示されるような持ち運び可能なペレット収集装置を使用することができる。

下記実施例で確認されるように、本発明の製造方法により作られた構造体は、三次元培養３日目から硝子軟骨のように表面が滑らかで、白く半透明の特性を示した。

大きさに関して、０．５×１０^５細胞／ウェルの場合、３日目には直径が約０．５ｍｍであり、培養期間の増加に伴ってその大きさがゆっくり増加し、２８日目には、直径が約１ｍｍであった。１．０×１０^５細胞／ウェルの場合、３日目には直径約１ｍｍの球体を形成し、培養期間の増加に伴い、その大きさがゆっくり増加し、２８日目には直径が約１．５ｍｍで、三次元培養全般に亘って、０．５×１０^５細胞／ウェルと比較して、約２倍大きさの球体を形成した。しかし、２．０×１０^５細胞／ウェルで作られた三次元構造体の場合、３日目には直径約１ｍｍの球体を形成し、培養期間の増加に伴い、その大きさがゆっくり増加し、２８日目には直径が約１．５ｍｍであったが、１．０×１０^５細胞／ウェルで作られた三次元構造体と大きさの差は観察されなかった。

顕微鏡写真で測定した二次元的面積において、０．５×１０^５細胞／ウェルでは、三次元培養３日目に、約０．２８ｍｍ^２であり、７日、１４日、２１日及び２８日目には、それぞれ０．７１、０．９２、１．２５、及び１．１２ｍｍ^２であり、培養期間の増加に伴い、ゆっくり増加したが、２１日目と比較し、２８日目には約１０％面積が減少した。１．０×１０^５細胞／ウェルでは、三次元培養３日目に、約１．０６ｍｍ^２で、７日、１４日、２１日及び２８日目には、それぞれ１．４３、１．６６、１．９１及び１．７４ｍｍ^２と培養期間の増加に伴い、ゆっくり増加したが、２１日目と比較し、２８日目には約１０％面積が減少した。１．０×１０^５細胞／ウェルでは、０．５×１０^５細胞／ウェルで作られた三次元組織と比較し、培養１４日目までは約２〜３．８倍大きさの構造体を形成し、その以降には約１．５倍大きさであった。２．０×１０^５細胞／ウェルでは、三次元培養３日、７日、１４日、２１日及び２８日目に、それぞれ１．２５、１．６８、２．０１、２．１３及び２．３３ｍｍ^２と培養期間の増加に伴い、その大きさがゆっくり増加したが、１．０×１０^５細胞／ウェルが比較し、接種細胞数は２倍であったが、構造体の大きさは１．１〜１．３倍であった。

また、ウサギの肋軟骨細胞を１．０×１０^５細胞／４００μＬ／ウェルで分注し、１０日間ペレット培養した結果、肉眼で、白く滑らかな表面の半透明な直径１．０〜１．５ｍｍの球状の三次元的組織が観察され、その平面大きさは、１.６ｍｍ^２±２０％範囲と細胞供給対象に関係なく、９６ウェル ディープウェルプレートの各ウェルで均一なペレット形成が観察された。

また、ヒトの肋軟骨細胞を１．０×１０^５細胞／４００μＬ／ウェルで分注し、１０日間ペレット培養した結果、直径１．０〜１.５ｍｍの表面が滑らかで、白い、半透明の小さな球状の構造物を得ることができ、ロット当たり３０個の球の大きさを測定した結果、均一な大きさを有していることが分かった。

一方、本発明は、上記の製造方法で製造された支持体のない球状軟骨細胞治療剤に関するものである。本発明の球状軟骨細胞治療剤は、上記の製造方法で製造されたペレットを有効成分として含み、必要に応じて、当技術分野で公知の１種またはそれ以上の薬学的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。本発明の球状軟骨細胞治療剤を損傷部位に挿入することによって、軟骨損傷部位の形状及び厚さに関係なく、欠損部位を修復することができ、大きな切開のない、小さな切開又は関節鏡を通して損傷部位に注入式で移植が可能である。従って、本発明の球状軟骨細胞治療剤は、軟骨損傷に注入式で簡単に移植され、損傷を修復する効果を示す。

一態様で、本発明の球状軟骨細胞治療剤を軟骨損傷部位に注入する前、これらのペレット間の接着のために、フィブリン接着剤又は血液で遠心分離して得た自己多血小板血漿（ＰＲＰ）などを使用することができる。

また、本発明は、上記球状軟骨細胞治療剤；及び骨及び／又は骨移植材料を含む骨軟骨損傷治療用軟骨−骨二層構造物に関するものである。ヒドロキシアパタイトは、歯牙や骨等の生体内で石灰化された組織を構成する無機物質であり、リン酸カルシウム化合物の中で最も高い結晶性を有している。従って、分解される速度もそれだけ遅いが、生体内に存在する物質であるので、生体親和性が高く、いろいろな骨移植材料中でも、最も優れた骨再生効果を示すものと知られている。従って、好ましい骨移植材料は、ＨＡ−ＴＣＰ（ヒドロキシアパタイト−トリカルシウムホスフェート）であるが、これに限定されるものではない。一態様で、複数個のペレットとフィブリン接着剤を混合して軟骨部分を作製し、その下に、ＨＡ−ＴＣＰ（ヒドロキシアパタイト−トリカルシウムホスフェート）と骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）を混合して作製した骨部分を位置させ、骨と再生軟骨と間の連結を評価できるようにサンドウィッチ形態の軟骨−骨二層構造物を作製することができる。このような軟骨−骨二層構造物は、特に骨軟骨損傷の修復に適している。

以下、実施例を通して本発明を更に詳しく説明する。しかし、下記実施例は本発明の理解を助けるためのものであり、本発明の範囲がこれらにより限定されるものではない。

実施例１
軟骨細胞の単離及び増殖
肋軟骨組織を抗生剤が含まれたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３〜５回洗浄し、血液と汚染物を除去した。軟骨を１〜２ｍｍ^３程度の大きさに細かく切断した後、０．５％プロナーゼ（pronase）及び０．２％タイプＩＩコラゲナーゼ処理で細胞外基質を消化し、細胞を単離した。単離した細胞は、２〜４×１０^４個／ｃｍ^２の密度で培養皿に接種し、細胞増殖用培地（１ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２が含まれた間葉系幹細胞培養培地（ＭＳＣＧＭ））を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで細胞が過密になるまで培養した。トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で、培養皿で脱着させた細胞を１〜２×１０^４個／ｃｍ^２の密度で培養皿に接種し、６〜８継代まで継代培養した。

様々な種類の９６ウェル プレート又は９６ウェル ディープウェルプレートで軟骨細胞の三次元ペレット培養
増殖が完了された６〜８継代目の細胞は、軟骨分化用培地（ＤＭＥＭ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−ｂｅｔａ３、１％ ＩＴＳ＋３、１００ｎＭ デキサメタゾン、５０μg／ｍＬ アスコルビン酸、４０μｇ／ｍＬ Ｌ−プロリン）に懸濁し、（１）Ｖ字状の底部を有する９６ウェル プレート（３００μＬウェル容量）に、ウェル当たり１．０×１０^５細胞／２００μＬになるように分注し、（２）平たな底部を有する９６ウェル プレート（３００μＬウェル容量）に、ウェル当たり１．０×１０^５細胞／２００μＬになるように分注し、（３）凹状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレート（６００μＬウェル容量）に、ウェル当たり１．０×１０^５細胞／４００μＬになるように分注し、（４）Ｖ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレート（６００μＬウェル容量）に、ウェル当たり１．０×１０^５細胞／４００μＬになるように分注した後、プレートを１２００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、その後、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３〜４日間隔で培地を交換しながら２８日間三次元培養した。

結果
Ｖ字状の底部を有する９６ウェル プレート（３００μＬウェル容量）では、球体形成はうまくいったが、後述する実施例２の（４）組織学的特性及び免疫染色のサフラニンＯ（Safranin O）ＧＡＧ染色方法によって評価した結果、細胞形状と軟骨性基質発現可否に基づいて軟骨分化が進んでいないことを確認することができた（図４ａ）。平たな底部を有する９６ウェル プレート（３００μＬウェル容量）を用いた三次元培養では、安定的に正常な形状の球体が形成されなかった（図４ｂ）。９６ウェル ディープウェルプレート（６００μＬウェル容量）を用いた三次元培養でウェルの底形状が凹状の場合には、遠心分離過程にもかかわらず安定的に正常な形状の球体が形成されなかったが（図４ｃ）、ウェルの底形状がＶ字状の場合には、安定的に均一な大きさを有する球体がウェル当たり１つずつ観察され、三次元培養３日目にはある程度硬い構造を形成した（図４ｄ）。

実施例２
球状三次元軟骨組織の製造
細胞増殖用培地で継代６〜８代目まで培養したウサギの軟骨細胞をＶ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートに０．５×１０^５細胞／４００μＬ／ウェル、１．０×１０^５細胞／４００μＬ／ウェル又は２．０×１０^５細胞／４００μＬ／ウェルでペレット培養し、２８日間評価した。

球状三次元軟骨組織の特性評価方法
（１）外観及び大きさ
三次元培養過程中、それぞれのウェルでペレットを収集し、その特性を評価した。まず、肉眼観察を通して外観を評価し、スライドガラス上にペレットをマウントし、４０倍の倍率で顕微鏡に取り付けられたデジタルカメラで写真を撮った後、その面積を測定した。

（２）ＤＮＡ量
ペレット中のＤＮＡ量は、ペレットに１２５μｇ／ｍＬのパパインを添加して均質化（homogenization）し、６５℃で、一晩処理後、試料を用意して、ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎキット（Bio−Rad Laboratories）のＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８ｄｙｅと混合し、吸光度を測定した。仔牛胸腺（Calf thymus）ＤＮＡをスタンダード（２０ｎｇ〜１０μｇ）にして定量的に計算した。

（３）グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）量
ペレット中のＧＡＧ量を測定するために、ペレットをパパイン溶液（１２５μｇ／ｍＬ）で、６５℃で、一晩処理して、ＧＡＧ成分を抽出し、遠心分離後上清を採取し、試験試料を用意した。ここに、Ｂｌｙｓｃａｎ染料（dyere agent）（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社製、英国）を添加し、硫酸（sulfated）ＧＡＧ成分と染料が結合するよう反応させた後、遠心分離して、上清を除去した。残ったＧＡＧ−染料の塊を染料分離試薬（dye dissociation reagent）で溶かした後、６５６ｎｍで吸光度を測定した。このように測定した吸光度はス、タンダード（コンドロイチン硫酸、１．０〜５．０μg）を基準に定量化した。

（４）組織学的特性及び免疫染色
組織学的評価のために、ペレットをホルマリンで固定し、脱水、パラフィン包埋過程を経て、ミクロトームで４〜６μｍ厚さに薄切し、ヘマトキシリンで核染色実施後、サフラニンＯを染色薬でＧＡＧを染色した。対照染色としては、ファーストグリーン（Fast green）を用いてＧＡＧ発現及び細胞の形態学的評価を実施した。

三次元培養過程中の軟骨の特性を評価するために、ペレット超薄切片（ultrathin−section）を０．２％とリトンＸ−１００で透過化し、ヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）で処理した後、抗−タイプＩコラーゲン抗体、抗−タイプＩＩコラーゲン抗体又は抗−タイプＸコラーゲン抗体を適用し、その後２次抗体及びストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを処理した。ＤＡＢで発色を誘導し、核染色のためにファーストレッド（fast red）を使用した。

蛍光染色には、ペレットを丸ごと又はペレット超薄切片を０．２％トリトンＸ−１００で透過化し、２０％正常ヤギ血清を処理し、非特異的反応を遮断し、抗−アグリカン抗体又は抗−タイプＩＩコラーゲン抗体を１次抗体として使用し、ＦＩＴＣ標識２次抗体を使用した後、超薄切片の場合、ＤＡＰＩで核染色し、蛍光顕微鏡（Olympus Optical Co.；日本）下で観察した。

（５）アポトーシス（apoptosis）
三次元培養過程で、ペレット中の細胞の死滅を評価するために、４μｍ厚さの切片でＴＵＮＥＬアッセイ（Roche社製、ドイツ）を実施した。ＤＡＰＩで核を染色し、蛍光顕微鏡下で死滅細胞の存在を評価した。

（６）コラーゲン量
ペレット中のコラーゲン量は、ペレットをペプシン溶液で処理して、コラーゲン成分を抽出した。この試料溶液にＳｉｒｃｏｌ Ｋｉｔ（Biocolor社製）の染料溶液を添加し、室温で振とうして反応し、遠心分離して、色素と結合したコラーゲンを沈殿させた。上清を完全に除去し、沈澱物を１Ｎ ＮａＯＨ溶液に溶解し、５４０ｎｍでの吸光度を測定した。標準曲線（０〜５０μｇ）を得た後、上記の方法で測定した吸光度を基準に定量化した。

ペレット中に新しく合成されたコラーゲンプロ−Ｃ−ペプチドの定量的測定のためにプロ−コラーゲンタイプＩ Ｃ−ペプチド（ＰＩＰ）ＥＩＡキット（TakaraBio,Inc.,日本）を使用した。ペレットをペプシン溶液で処理して、コラーゲン成分を抽出した。残りの工程は製造者の指示に従って行った。測定されたペプチド量を０〜６４０ｎｇ ＰＩＰ／ｍＬ範囲で標準曲線を基準に定量化した。

（７）遺伝学的特性
細胞の遺伝学的特性を評価するために、ペレットからＲＮＡを抽出し、逆転写し、ｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡに対して下記表１に示された遺伝子のプライマーを使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）が含まれたアガロースゲルで電気泳動した後、ＵＶ下で各増幅産物の大きさに該当するバンドを確認し、評価した。

結果
（１）外観及び大きさ
作製された構造体は、三次元培養３日目から硝子軟骨のように表面が滑らかで、白い、半透明の性状を示した。その大きさは０．５×１０^５細胞／ウェルの場合、３日目には直径が約０．５ｍｍであり、培養期間の増加に伴いその大きさがゆっくり増加し、２８日目には直径が約１ｍｍであった。１．０×１０^５細胞／ウェルの場合、３日目には直径約１ｍｍの球体を形成しており、培養期間の増加に伴いその大きさがゆっくり増加し、２８日目には直径が約１．５ｍｍと三次元培養全般にかけて、０．５×１０^５細胞／ウェルと比較して、約２倍大きさの球体を形成した。しかし、２．０×１０^５細胞／ウェルで作製された三次元構造体の場合、３日目には直径約１ｍｍの球体を形成しており、培養期間の増加に伴いその大きさがゆっくり増加し、２８日目には直径が約１．５ｍｍであったが、１．０×１０^５細胞／ウェルで作製された三次元構造体と大きさの差は観察されなかった（図５ａ及び５ｂ）。

２８日間の三次元培養期間の軟骨細胞から形成した支持体のない三次元構造体の顕微鏡上の写真で測定した二次元的面積は、０．５×１０^５細胞／ウェルでは三次元培養３日目に、約０．２８ｍｍ^２であり、７日、１４日、２１日及び２８日目には、それぞれ０．７１、０．９２、１.２５、及び１.１２ｍｍ^２と培養期間の増加に伴いゆっくり増加したが、２１日目と比較して、２８日目には約１０％面積が減少した。１．０×１０^５細胞／ウェルでは三次元培養３日目に、約１．０６ｍｍ^２であり、７日、１４日、２１日及び２８日目には、それぞれ１．４３、１．６６、１．９１及び１．７４ｍｍ^２と培養期間の増加に伴いゆっくり増加したが、２１日目と比較して２８日目には、約１０％面積が減少した。１．０×１０^５細胞／ウェルでは０．５×１０^５細胞／ウェルで作製された三次元組織と比較し、培養１４日までは約２〜３．８倍大きさの構造体を形成し、その以降には約１．５倍大きさであった。２．０×１０^５細胞／ウェルでは三次元培養３日、７日、１４日、２１日及び２８日目に、それぞれ１．２５、１．６８、２．０１、２．１３及び２．３３ｍｍ^２と培養期間の増加に伴いその大きさがゆっくりしたが、１．０×１０^５細胞／ウェルと比較して、接種細胞数は２倍であったが、構造体の大きさは１．１〜１．３倍であった（図５ｃ）。

（２）ＤＮＡ量
三次元培養期間中のペレット中の細胞数をＤＮＡ含量で評価した結果、培養期間中、０．５×１０^５細胞／ウェルでは約８０ｎｇ、１．０×１０^５細胞／ウェルでは約１７０ｎｇ、２．０×１０^５細胞／ウェルでは約２００ｎｇと一定であった。接種細胞数は２倍であったが、ＤＮＡ含量はそれぞれ２倍及び１．２倍であった（図５ｄ）。

（３）ＧＡＧ量
硝子軟骨特異的細胞外基質であるＧＡＧ成分は、培養期間の増加に伴い増加した。１．０×１０^５細胞／ウェルでは０．５×１０^５細胞／ウェルと比較して、約２倍の量であったが、２．０×１０^５細胞／ウェルでは１．０×１０^５細胞／ウェルと同様のＧＡＧ含量を示した（図５ｅ）。

（４）組織学的特性
三次元培養中の硝子軟骨性組織の形成の有無を、サフラニンＯ染色でＧＡＧの発現を評価した結果、Ｖ字状の底部のウェルで０．５×１０^５細胞／ウェル及び１．０×１０^５細胞／ウェル細胞が形成された三次元構造体は、培養３日目から構造体全般に亘って強いサフラニンＯ染色が観察された。２．０×１０^５細胞／ウェルでは３日及び７日目にサフラニンＯ染色に陰性の部分が構造体中心部から観察されており、その後には構造体全般に亘って強いサフラニンＯ染色が観察された。三次元培養３日目に、ペレットで細胞はぎっしり密集され、丸い形状であったが、小腔（lacunae）の形態は観察されなかった。７日目に、１．０×１０^５細胞／ウェルのペレットで細胞は明確な小腔内に存在した。１４日目以降には全ての細胞数のペレットで小腔に包まれている細胞が観察され、経時間によって成熟した硝子軟骨の形態を示した（図５ｆ）。

（５）アポトーシス
三次元培養中の細胞の死滅有無をＴＵＮＥＬアッセイで評価した結果、２．０×１０^５細胞／ウェルでは３日目から培養終了時までペレットの中心部及び外郭でアポトーシス細胞が多数観察された。０．５×１０^５細胞／ウェル及び１．０×１０^５細胞／ウェルでは２８日目にのみアポトーシス細胞が観察された（図５ｇ）。

（６）免疫染色
１．０×１０^５細胞／ウェルのペレットで三次元培養中、タイプＩコラーゲン、タイプＩＩコラーゲン及びタイプＸコラーゲンの発現を免疫染色で評価した結果、タイプＩコラーゲンは培養２８日目に表面の外郭でのみ発現しており、タイプＩＩコラーゲンは２８日目に外郭を除いたペレット全体で強く染色された。肥大軟骨細胞（hypertrophic chondrocyte）のマーカーであるタイプＸコラーゲンは１４日目に発現細胞が観察され、経時的に発現割合が増加した（図５ｈ）。

実施例３
細胞増殖用培地で継代６〜８代目まで培養したウサギの肋軟骨細胞を分化用培地に懸濁し、Ｖ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートにウェル当たり１．０×１０^５個／４００μＬずつ分注した。以降、プレートを１２００ｒｐｍで、５分間遠心分離した後、ペレットを３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで３〜４日間隔で培地を交換しながら１０日間培養して、関節軟骨損傷に移植するための支持体のない球状軟骨組織を製造した。培養が終わった球状軟骨組織を、持ち運び可能なペレット収集装置を利用して収集し（図８ｃ）、実施例２に記載された方法によりその特性を評価した。

その結果、肉眼的に白くて、滑らかな表面の半透明な直径１．０〜１．５ｍｍの球状の三次元的組織が観察された（図６ａ）。その平面の大きさは１．６ｍｍ^２±２０%範囲と細胞供給対象に関係なく、９６ウェル ディープウェルプレートそれぞれのウェルで均一なペレット形成が観察された（図６ｂ）。細胞は、小腔内に存在し、ペレット全体的に強いＧＡＧ発現が観察された（図６ｃ）。免疫蛍光染色結果、アグリカンはペレット全体的に強く染色されたが、タイプＩＩコラーゲンはペレット全般に亘って弱く染色され、タイプＸコラーゲンの発現はほとんど観察されなかった（図６ｄ）。ＲＴ―ＰＣＲでタイプＩＩコラーゲンに対する遺伝子発現を評価した結果、３ロット全てで発現することが観察された（図６ｅ）。ペレット中の細胞生存率は９５％以上であったし、ＧＡＧ含量は１５〜３０μｇ／ペレットであった（図６ｆ）。

実施例４
細胞増殖用培地で継代６〜８代目まで培養したヒトの肋軟骨細胞を分化用培地に懸濁し、Ｖ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートにウェル当たり１．０×１０^５個／４００μＬずつ分注した。以降、プレートを１２００ｒｐｍで、５分間遠心分離した後、ペレットを３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで３〜４日間隔で培地を交換しながら１０日間培養して、関節軟骨損傷に移植するための支持体のない球状軟骨組織を製造した。培養が終わった球状軟骨組織を、持ち運び可能なペレット収集装置を利用して収集し（図８ｃ）、実施例２に記載された方法によりその特性を評価した。

その結果、直径１．０〜１.５ｍｍの表面が滑らかで、白い、半透明の小さな球状の構造物を得ることができた。ロット当たり３０個の球の大きさを測定した結果、均一な大きさを有していることが分かった（図７ａ）。組織学的には、細胞は、ＧＡＧを強く発現する基質に包まれており、細胞は高い密度で存在し、未成熟軟骨細胞の形状を示した（図７ｂ）。三次元培養を追加的に1７日まで進めた結果、ＧＡＧ及びコラーゲン含量は継続増加したが、プロ−コラーゲンタイプＩＣ−ペプチド（ＰＩＰ）の量は１０日目以降減少した（図７ｃ）。蛍光染色で硝子軟骨細胞特異マーカーであるタイプＩＩコラーゲンとアグリカンの発現を評価した結果、弱い発現であったが、ペレット全体に亘ってタイプＩＩコラーゲンの発現が観察され、アグリカンはペレット全体的に強く発現された（図７ｄ）。ペレットの薄切片（thin−section）で硝子軟骨細胞特異マーカーであるタイプＩＩコラーゲンとアグリカン、未成熟軟骨細胞のマーカーリであるタイプＩコラーゲン、肥大軟骨細胞の特異マーカーであるタイプＸコラーゲンの発現を評価した結果、それぞれ約５４％、９９％、８１％及び０％の発現割合を示した（図７ｅ）。ＲＴ−ＰＣＲで遺伝子発現を評価した結果、軟骨細胞特異マーカーであるタイプＩＩコラーゲン、タイプＩＸコラーゲン及びアグリカンの強い発現が観察され、軟骨細胞転写因子であるｓｏｘ−９の発現も観察された。さらに、未成熟軟骨細胞のマーカーであるタイプＩコラーゲンの発現と肥大軟骨細胞の特異マーカーであるタイプＸコラーゲンの弱い発現度観察された（図７ｆ）。

実施例５
球状軟骨組織の動物移植評価：ヌードマウス皮下移植
ヒト肋軟骨細胞を継代６〜８代目まで増殖後、Ｖ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートにウェル当たり細胞１．０×１０^５個／４００μＬずつ分注した後、遠心分離し、軟骨分化用培地で１０日間ペレット培養した。ペレット４０個とペレット固定のためのフィブリン接着剤（Ｇｒｅｅｎｐｌａｓｔ（登録商標）、緑十字製）を混合して、軟骨部分を作製した。その下にＨＡ−ＴＣＰ（ヒドロキシアパタイト−トリカルシウムホスフェート；PURUGO社製、韓国）と骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）を混合して作製した骨部分を位置させ、骨と再生軟骨間の連結を評価できるようにサンドウィッチ形態の軟骨−骨二層構造物を製作した（図９ａ）。

動物の麻酔は、キシラジン及びケタミンで誘導し、手術部位はアルコールとポビドン−ヨードで用意した。用意されたヌードマウス肩甲骨下の皮膚中央部を約１ｃｍ切開し、左、右側に鈍性分離して、移植空間を作った後、左右の皮下に二層構造物をそれぞれ移植した。移植後、４週、８週、１６週及び２０週目に動物を安楽死させ、背中及び肩部位皮膚を切開した後、移植物を肉眼で観察した。また、鉗子で骨部分と軟骨部分を引っ張り、これらの連結程度を評価した。移植物を１０％中性緩衝ホルマリン溶液に固定し、脱灰後、パラフィンに包埋して６μｍの厚さで切開した。スライドに付着した切片は、ヘマトキシリン／エオシン染色を行い、組織学的な評価及びタイプＩＩコラーゲン及びアグリカンに対する免疫染色を行った。また、組織の終末分化を評価するために、肥大軟骨細胞マーカーであるタイプＸコラーゲンに対する免疫染色を実施した。

その結果、移植構造物は、二つの層が強く連結されており、軟骨層は肉眼的に硝子軟骨のように表面が滑らかで白い、半透明であった。血管の浸透は確認されなかった。反面、骨層には血管の流入が観察された（図９ｂ）。組織学的にペレットは互いによく連結され、骨基質との連結も観察された（図９ｃ）。硝子軟骨の特異マーカーであるタイプＩＩコラーゲンは、移植後４週から２０週まで強く発現され、アグリカン発現は減少した後、再び増加する傾向を示した。肥大軟骨細胞のマーカーであるタイプＸコラーゲンの発現は移植後、２０週まで観察されなかった（図９ｄ）。

実施例６
球状軟骨組織の動物移植評価：ウサギ膝軟骨損傷部移植
ウサギ肋軟骨細胞を継代６〜８代目まで増殖後、Ｖ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートにウェル当たり細胞１．０×１０^５個／４００μＬずつ分注した後、遠心分離して、軟骨分化用培地で１０日間ペレット培養した。ウサギ膝の膝蓋骨内側を切開して膝蓋窩を露出し、直径５ｍｍ、深さ約２ｍｍの軟骨損傷を、歯科用マイクロドリルを使用して作製した。損傷部を冷たい生理食塩水で強く洗浄し、落ちた断片を除去した後、ペレット１８〜２０個をフィブリノーゲンと希釈したトロンビン（約１０ＩＵ）と均一に混合した後、直ちに膝損傷溝部位に詰め込んだ。その上を高濃度のトロンビンを含むフィブリン接着剤で塗布した。対照欠陥には、フィブリン接着剤（Ｇｒｅｅｎｐｌａｓｔ（登録商標）、緑十字社製、大韓民国）のみを使用した。十分に固化した後、膝蓋骨を再び元位置させ、関節カプセルと皮膚を縫合した。移植６週、１２週及び２４週後、手術した膝を切開し、関節嚢と膝軟骨を肉眼で観察した後、大腿骨の遠位骨端を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリン溶液に固定した後、脱灰後、パラフィンに包埋して６μmの厚さに切断し、サフラニンＯ染色及びタイプＩコラーゲン又はタイプＩＩコラーゲンに対する免疫染色を実施した。その結果、損傷部位を硝子軟骨性軟骨層で修復されるのを肉眼、組織学的及び免疫化学的に確認することができた（図１０）。

実施例７
球状軟骨組織の動物移植評価：ヤギ膝軟骨損傷部移植
ヤギ肋軟骨細胞を継代６〜８代目まで増殖後、Ｖ字状の底部を有する９６ウェル ディープウェルプレートにウェル当たり細胞１．０×１０^５個／４００μＬずつ分注した後、遠心分離して、軟骨分化用培地で１０日間ペレット培養した。ヤギ膝の膝蓋骨内側を切開し、膝蓋窩（patellar groove）と大腿骨の内側顆（medial femoral condyle）は露出させ、それぞれ直径８ｍｍ、深さ約２ｍｍの軟骨損傷を、歯科用マイクロドリルを使用して作製した。損傷部を冷たい生理食塩水で強く洗浄し、落ちた断片を除去した後、ペレット約４８個をフィブリン接着剤（トロンビン約１０ＩＵ）又は血液で遠心分離して得た自己多血小板血漿（ＰＲＰ）とトロンビン（約１０ＩＵ）で損傷部に固定した。そして、その表面を高濃度のトロンビンを含むフィブリン接着剤又は自己ＰＲＰを塗布した。十分に固化後、膝蓋骨を再び元置させ、関節カプセルと皮膚を縫合した。細胞移植後、欠損部位での細胞固定を確認するために、手術後２週目、ヤギのヤギ両側膝に対してＭＲＩ（Magnus 2.1 for Magnum 3.0T MRI system; Medinus, Korea）評価を実施した。移植直後と移植１２週及び２４週後、再生組織の物理学的特性を評価するために、万能物性計測機ＪＴＭ（H5K−T, H.T.E., Salfords, UK）を利用して押し込み試験（indentation test）を実施した。再生組織を含む膝部位を鋸で切断した後、再生組織の中心部を５Ｎロード細胞（load cell）と直径３ｍｍの圧子プローブ（indenter probe）を使用して、０．１Ｓ−１速度で４００μｍ深さまで押し込みながら剛性度（stiffness）及び弾性係数（elastic modulus）を測定した。その結果を下記表２に示した。

上記表２に示されるように、移植直後にも正常軟骨の約１／８程度の強度を示し、移植後１２週及び２４週目に再生組織の剛性度及び弾性係数はそれぞれ正常軟骨の約１／２及び同じ水準であった。

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Claims (10)

1. ａ）軟骨細胞及び／又は軟骨分化能を有する細胞をＶ字状の底部を有するウェル容量が５００μＬ以上である９６ウェル ディープウェルプレートに０．５×１０ ^５ 〜２．０×１０ ^５ 細胞／４００〜６００μＬ／ウェルで分注し、
   ｂ）上記プレートを遠心分離し、
   ｃ）上記プレートをインキュベーター内で三次元培養し、そして
   ｄ）各ウェルからペレットを回収する、
   工程を含む、球状軟骨細胞治療剤の製造方法。
2. 工程ａ）で、軟骨分化能を有する細胞が間葉系幹細胞、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の球状軟骨細胞治療剤の製造方法。
3. 間葉系幹細胞が、脂肪由来、骨髄由来、臍帯由来、臍帯血由来、胎盤由来、滑膜由来、骨膜由来又は軟骨膜由来の細胞である、請求項２に記載の球状軟骨細胞治療剤の製造方法。
4. 工程ａ）で、軟骨細胞又は軟骨分化能を有する細胞を０．５×１０^５〜２．０×１０^５細胞／４００μＬ／ウェルで分注する、請求項１に記載の球状軟骨細胞治療剤の製造方法。
5. 工程ａ）で、マルチ−チャネルピペット、マルチ−ピペット、マイクロプレートワォッシャー及びマイクロプレートディスペンサーからなる群より選択される装置を用いて軟骨細胞又は軟骨分化能を有する細胞を分注する、請求項１に記載の球状軟骨細胞治療剤の製造方法。
6. 工程ｂ）で、５００〜２０００ｒｐｍで５分〜１０分間遠心分離する、請求項１に記載の球状軟骨細胞治療剤の製造方法。
7. 工程ｃ）で、無血清培地で三次元培養する、請求項１に記載の球状軟骨細胞治療剤の製造方法。
8. 工程ｃ）で、３日〜３０日間三次元培養する、請求項１に記載の球状軟骨細胞治療剤の製造方法。
9. 工程ｃ）で、培地を交換する工程をさらに含む、請求項１に記載の球状軟骨細胞治療剤の製造方法。
10. マルチ−チャネルピペット、マルチ−ピペット、マイクロプレートワォッシャー及びマイクロプレートディスペンサーからなる群より選択される装置を用いて培地を交換する、請求項９に記載の球状軟骨細胞治療剤の製造方法。