JPH10503383A

JPH10503383A - 核酸増幅用の安定化された酵素組成物

Info

Publication number: JPH10503383A
Application number: JP8524397A
Authority: JP
Inventors: シェン，ナンシー・ラウ・リウ; カシアン，ダニエル・ルイス; プットナム，ジェイムズ・ガーフィールド; デイヴィス，ウィリアム・マイケル
Original assignee: ジェン−プローブ・インコーポレーテッド
Priority date: 1995-02-10
Filing date: 1996-02-02
Publication date: 1998-03-31
Anticipated expiration: 2016-02-02
Also published as: DE69628959D1; US5834254A; ATE244759T1; EP0726310A1; JP3282819B2; WO1996024664A1; US5614387A; US5556771A; EP0726310B1; AU699590B2; ES2202387T3; AU4916796A; CA2210584A1; KR19980702110A; DE69628959T2

Abstract

(57)【要約】核酸増幅において用いるための安定化された酵素組成物。単一の安定化された配合物中の１種類またはそれ以上の酵素の安定化のための組成物を提供する。更に別の組成物は、乾燥した安定化された酵素混合物と、必要な副因子および酵素基質とを一緒に、再水和の際に用いるための単一容器中に包含する。更に、安定化された酵素組成物の製造方法および使用方法並びに開示された組成物を包含する核酸増幅用のキットを開示する。

Description

【発明の詳細な説明】核酸増幅用の安定化された酵素組成物発明の分野本発明は、分子生物学の分野、概して、核酸増幅および安定化された生体組成物に関する。特に、本発明は、１種類またはそれ以上の核酸ポリメラーゼを含有する安定な凍結乾燥酵素組成物に関する。発明の背景デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）は、共有結合したヌクレオチドサブユニットから成る大型の直鎖状巨大分子である。ＤＮＡは、通常、２本のＤＮＡ鎖が水素結合によって逆平行様式で結合している「二本鎖」の形で見出される。ＲＮＡは、通常、１本のポリヌクレオチド鎖として天然に存在する。ヌクレオチドは、糖（デオキシリボースかまたはリボース）および含窒素塩基部分を有する分子であり、通常、ホスホジエステル結合によって互いに結合して核酸になっている。５種類の通常の含窒素塩基が存在する。３種類はＤＮＡでもＲＮＡでも見られ、これらは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）である。他の二つは、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）であり、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡに特有である。あらゆる生物遺伝情報の大部分は（全部ではないとしても）、ＤＮＡまたはＲＮＡの形で一つの世代から次の世代へと伝えられる。この情報は、遺伝コードを構成する一本の核酸鎖すなわち「鎖」に沿ったヌクレオチドの配列で伝えられる。更に、核酸鎖の含窒素塩基はそれぞれ、同じかまたは異なった核酸鎖の１種類またはそれ以上の他の含窒素塩基と特異的に水素結合する能力を有する。したがって、通常の条件下において、ＡはＴ（またはＵ）と水素結合し且つＣはＧと水素結合し、この特異的水素結合は塩基対合と称される。二本鎖ＤＮＡの場合、その２本の鎖それぞれが１本のヌクレオチド鎖から成り、それらヌクレオチドの大部分または全部がもう一方の鎖と塩基対合している。このような場合、一方のＤＮＡ鎖上のヌクレオチドの順序が、もう一方のＤＮＡ鎖上のヌクレオチドの順序を決定する。この方式で互いに「鏡像」である２本の核酸鎖は、完全に相補的であるといわれる。核酸は、それぞれの核酸鎖が完全に相補的な鎖のヌクレオチドの順序を指定するという事実を利用する機序によってインビボで合成され、このことは、所望の核酸がＲＮＡであろうとＤＮＡであろうと、そして鋳型として用いられる核酸がＲＮＡであるかＤＮＡであるかに関係なく変わることがない。ＤＮＡ複製のための独特の機序の大部分は、鋳型核酸鎖に水素結合したポリヌクレオチドプライマーの３’ヒドロキシル基に対してヌクレオチドを逐次的に加えるためにＤＮＡポリメラーゼの使用を必要とする。新たに加えられるヌクレオチドは、鋳型鎖の対応するヌクレオチドと対合するそれらの能力に基づいてＤＮＡポリメラーゼによって選択される。プライマーの一端にヌクレヌオチドを加えるこの過程は、時々、プライマー伸長と呼ばれる。ＤＮＡ合成とは異なり、ＲＮＡ合成は、通常、ポリヌクレオチドプライマーの存在を必要としない。むしろ、ＲＮＡ合成は、通常、核酸鋳型の１個またはそれ以上の特定のヌクレオチド配列を認識するＲＮＡポリメラーゼによって媒介される。プロモーターと称される、ＲＮＡポリメラーゼが結合する鋳型領域は、通常、二本鎖である。プロモーターに結合した後、ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型鎖を「読取り」、そしてその鋳型に相補的な共有結合したポリリボヌクレオチド鎖を合成する。異なる生物に由来するＲＮＡポリメラーゼは、異なるプロモーター配列を優先的に認識する。ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ酵素は、多数の異なった生物から精製されてきた。大腸菌（E.coli）ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントおよび種々のＲＮＡポリメラーゼなどのこれらの酵素のいくつかは、分子生物学および核酸生化学研究の手段としてインビトロで一般的に用いられている。一般的には、例えば、サムブルック(Sambrook)ら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第２版,コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Sp ring Harbor Press)1989)を参照されたい。核酸ポリメラーゼのもう一つの使用は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅の様々な方法の出現とともに始まった。例えば、マリス（Mullis）ら，米国特許第4,683,195号明細書、同第4,683,202号明細書および同第4,800,159 号明細書を参照されたい。ＰＣＲの最も簡単な形では、標的ヌクレオチド配列領域の内、標的核酸に関して３’側に位置した標的核酸の領域にそれぞれ相補的なプライマーである２種類のオリゴヌクレオチドプライマーが合成される。それぞれのプラマーは、２本の相補的核酸鎖の一方に相補的であり、その標的領域は、二本鎖標的核酸の両方の核酸鎖を包含するヌクレオチド配列領域を含む。これらプライマーを基質と水素結合（「ハイブリッド形成」）させ、そしてＤＮＡポリメラーゼをヌクレオチド三リン酸と一緒に反応混合物に対して加えた場合、それぞれのハイブリッド形成したプライマーは、酵素によって５’→３’方向に伸長する。次に、反応混合物を加熱してプライマー伸長生成物：鋳型ハイブリッドを融解させ、温度を低下させてプライマー／標的ハイブリダイゼーションをもう１回可能にし、そしてより多くのＤＮＡポリメラーゼを加えて、高温段階で失活したＤＮＡポリメラーゼを置換する。その過程を所望のサイクル数繰り返すことにより、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の量は指数的に増加する。更に最近、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）に由来する熱安定ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ法で首尾よく用いられて、高価な酵素を多量に繰り返し加える必要性を減少させた。Ｔａｑポリメラーゼは、９０〜９５℃での不活性化に耐えるので、各回の鎖分離後に繰り返し酵素を加える必要性をなくする。増幅過程の一段階としてＲＮＡ転写を用いるような核酸増幅の他の方法が考案されている。一つのこのような方法は、ＰＣＲ反応で用いられるプライマーの一つにプロモーター配列を包含させ、次にＰＣＲ法により増幅させた後に、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる一本鎖ＲＮＡの転写の鋳型として二本鎖ＤＮＡを用いることによって働く。例えば、ムラカワ(Murakawa)ら,DNA7:287-295(1988) を参照されたい）。他の増幅法は、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的を増幅させるのにＲＮＡ依存性ＤＮＡ合成および転写の多数のサイクルを用いる。例えば、バーグ(Burg)ら,WO 89/1050 号；ジンジェラス（Gingeras）ら，WO 88/10315号（時々、転写増幅系またはＴＡＳと称される）；カシアン（Kacian）およびフルツ（Fultz），ＥＰＯ公開第4 08,295号（本出願と同一所有権者を有する）；デイビー（Davey）およびマレク（Malek），ＥＰＯ出願第88113948.9号；マレクら，WO 91/02818号を参照されたい）。これらの方法は、相補的ＤＮＡ鎖の合成の鋳型としてＲＮＡまたはＤＮＡを用いることができる酵素である逆転写酵素（ＲＴ）を使用する。これらの方法のいくつかはまた、必須成分として細胞性ＲＮアーゼＨ活性を利用する。モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）およびトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）によってコードされるものなどの大部分のレトロウイルス逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、並びにＲＮアーゼＨ活性を有する。ＲＮアーゼＨ活性は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド核酸分子のＲＮＡ鎖を選択的に破壊するので、温度循環を必要とすることなく増幅反応を進行させる。核酸増幅は、種々の設定において独特のまたは特徴的な核酸セグメントの特異的識別および／または増幅のための益々一般的な手段である。したがって、核酸増幅は、食糧農業試験、医学的診断、ヒト遺伝子分析およびカウンセリング、考古学並びに刑事弁論で用いられる。これらの方法は全て酵素を用いるので、極めて活性な酵素を多量に製造する、包装する、輸送するおよび貯蔵する方法は、核酸増幅用酵素およびキットの製造、マーケティングおよび販売において極めて重要な問題点となっている。具体的に、転写に基づく増幅を用いる方法に関して、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの活性標品を貯蔵するための商業的に許容しうる方法および標品は、核酸増幅用キットについて成功した製造およびマーケティングに不可欠である。逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ酵素（並びに分子生物学研究で用いられる多数の他の酵素）を安定化させる一般的な方法は、５０％（ｖ／ｖ）グリセロールおよびジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはβ−メルカプトエタノール（β ＭＥ）などの還元剤を含有する溶液中のそれぞれの酵素の液体標品を−２０℃で貯蔵することによる。この方法は、酵素の活性を何か月間もほとんど活性を失うことなく保存する。対照的に、酵素を室温でまたは４℃で貯蔵する場合、酵素活性は容易に失われる。これらの標品は、概して、酵素供給者から最終使用者までドライアイス中で輸送され、このような輸送の際に、酵素標品の凍結融解のために酵素活性が３０％またはそれ以上減少することは一般的である。これらの酵素は、別個に配合され且つ供給される。冷凍を必要とすることなく逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを貯蔵し且つ輸送する方法は、ドライアイス、ウェットパック、ドライパックまたはスチロフォーム輸送容器などの冷蔵輸送および／または冷貯蔵法の必要性をなくすであろう。このような方法はまた、酵素活性を維持するこれらの方法に関係した生産経費が不必要であるので、原価効率がよりよいと考えられる。酵素標品がある限られた高温暴露に耐えることを可能にする酵素貯蔵方法は、その酵素標品が輸送中に積載ドック上またはトラック中にある場合に、起こりうる酵素活性の減少をなくすであろう。このような方法は、極めて再現可能であるべきであろう。更に、酵素が単一容器中において（任意の必要な副因子および基質の全部または大部分を含有する配合物中などの）それらの目的用途に適合した形で提供される場合、このような標品は製造するのにより経済的であり且つ使用するのにより好都合であろう。凍結乾燥(lyophilization)は、食品、生体膜、全細胞(例えば、American Society for Microbiology,Manual of Methods for General Bacteriology 210-217（198 1）を参照されたい)、および酵素を含めた生体高分子を保存するのに用いられてきた。凍結乾燥は、減圧下での昇華によって凍結試料から水を除去することを必要とする。昇華とは、液体状態を経ることなく固体を蒸発させる過程である。凍結乾燥の理論的局面は複雑である。タンパク質などの生体物質が水溶液中にある場合、その分子は、水分子を含む水和殻によって取り囲まれていると考えられ、この水和殻はタンパク質を安定させ且つその活性を維持するのに役立つ。水が除去された時、通常は水和殼で隠されているタンパク質の反応性基は自由になって互いに反応し、それによって新たに、本質的に不可逆性の結合を形成する。これらの結合は、タンパク質の自然のコンホメーションを歪めることがある。更に、水の不存在下では、新たな疎水／親水相互作用が起こるかもしれず、これもまたタンパク質のコンホメーションを歪めることがある。多数のタンパク質の三次元コンホメーションは生物学的活性を与えるので、そのコンホメーションの歪みは、乾燥時に生物学的活性を変化させることがある。同様の機序により、タンパク質の架橋および凝集が起こりうる。タンパク質試料を乾燥させる前に凍結させることは、乾燥によるコンホメーション歪度を少なくするのに役立つ。低下した初期温度は、反応物のエネルギーを奪うことによってアミノ酸反応性基間の望ましくない反応を最小限に維持するのに役立つ。同時に、凍結状態でのタンパク質は、溶液の場合よりも立体的にあまり自由ではなく且つ総体的なコンホメーション変化がほとんどない傾向がある。しかしながら、完全に乾燥された凍結乾燥物は、低百分率の水をまだ含有している不完全に乾燥された凍結乾燥物の場合よりも「保存」すなわち貯蔵寿命が短い傾向がある。このような不完全に乾燥された凍結乾燥物は、しばしば、約４〜１０℃以下の温度で貯蔵される必要があり、そしてなお、水が存在しないところでは起こりえない不活性化学反応が進行しうる。したがって、多数の不完全乾燥で凍結乾燥された生物学的活性タンパク質の保存寿命は、完全に乾燥されているものよりも長いが、活性を維持するために標品を冷蔵することはなお必要である。たとえそうでも、このような標品の活性は比較的短期間で減少する。更に、ホスホフルクトキナーゼなどの若干の酵素は、その標品が完全に乾燥されているか否かに関わりなく、凍結保護物質の不存在下では凍結乾燥後に完全に失活する。例えば、カーペンター（Carpenter）ら，Cryobiology 25:372-376（1988）を参照されたい。本明細書中で用いられる「凍結保護物質」という用語は、生物学的活性物質の凍結、乾燥および／またはその乾燥物質の再構成の際に、その活性を保護する傾向がある化合物または組成物を意味するものである。「安定化剤」という用語は、生物学的活性物質に対して加えられた場合に、その物質が安定化剤の不存在下で貯蔵されている場合と比較して、その物質の生物学的活性の経時減少を妨げるまたは遅らせる物質を意味する。特定のタンパク質を含めた生体材料を乾燥させる場合に生物学的活性を保存するのに役立つ賦形剤として用いるために各種凍結保護物質添加剤が用いられまたは提案されてきた。クレッグ（Clegg）ら，Cryobiology 19:106-316（1982）は、乾燥保存後も生存しうる状態にある海産エビアルテミア（Artemia）の嚢子の能力におけるグリセロールおよび／またはトレハロースの役割を研究してきた。カーペンターら，Cryobiology 24:455-464（1987）は、二糖マルトース、スクロース、ラクトースおよびトレハロースが、空気乾燥された精製酵素標品においてホスホフルクトキナーゼ活性の安定化を増加させる役割を果たしうるということを報告している。ＥＰＯ公開第0431882A2号は、誘導体化された後にマンニトールまたはラクトースの存在下で凍結乾燥された精製アルカリ性ホスファターゼの安定化された標品を開示している。ＥＰＯ公開第0091258A2号は、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、ヒトγグロブリンまたはサケ硫酸プロタミンなどの安定化タンパク質の存在下での精製タンパク質の貯蔵または凍結乾燥による、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を安定化させる方法を開示している。米国特許第4,451,569号明細書は、精製グルタチオンペルオキシダーゼの活性を安定化させるペントース、糖アルコールおよび若干の二糖の使用を開示している。安定化された組成物は、凍結乾燥された後、２０℃未満の温度で貯蔵することができる。ＥＰＯ公開第0448146A1 号は、ジカルボン酸塩を含有する安定化された凍結乾燥ゴナドトロピン標品を検討している。その標品は、スクロースまたはトレハロースなどの二糖を更に含むことができる。ロサー（Roser），Biopharm,47-53（1991年９月）は、トレハロースを用いて周囲温度で乾燥された種々の生体分子の生物学的活性を保存することを検討している。ＰＣＴ公開第WO87/00196号は、トレハロースの存在下の空気乾燥による単クローン性抗体およびウシ腸アルカリ性ホスファターゼの安定化を報告している。ＰＣＴ公開第WO89/00012号および同第WO89/06542号は、若干の食品および生きているウイルス粒子の抗原性を保存するためのトレハロースの使用を検討している。ＥＰＯ公開第02270799A1号は、界面活性剤またはグリセロールなどの安定化剤を含有する配合物中の組換えβ−インターフェロンの安定化を報告している。その組成物は、追加の安定化剤としてスクロースおよびトレハロースを含めた種々の糖、塘アルコール、およびタンパク質を更に含むことができ、これらの内で最も好ましいのはデキストロースである。これら添加剤のいくつかは、周囲温度においてほぼ脱水状態で貯蔵された場合、生物学的活性物質の保存寿命を何か月またはそれ以上まで延長することが判っている。しかしながら、具体的な予想される添加剤の有効性、適合性または利点は、安定化するように求められる生物学的活性物質の化学組成に依り、タンパク質の場合、これらの因子としては、限定されることなく、そのタンパク質のアミノ酸配列、並びにその二次、三次および四次構造を挙げることができる。したがって、特定の組成物が特定の生物学的活性物質の生物学的活性を保存するように働くかどうかを演繹的に予想することはできない。更に、タンパク質を凍結乾燥させる場合、緩衝液組成、凍結速度、負圧の量、凍結乾燥初期温度、作業温度および最終温度並びに凍結乾燥手順の長さを含めた追加の因子は、これらに限定されることなく、活性タンパク質の安定性および保存寿命を決定するのに重要である。若干のタンパク質は、多数の酵素活性を有することが知られている。例えば、モロニーネズミ白血病ウイルスに由来する酵素などのレトロウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮアーゼＨ活性を有する。これらの活性は同一酵素中に含まれるが、乾燥標品中のこれらの活性のいずれか一つを保存するための条件は、残りの酵素活性の一つまたは両方もまた同一の条件下で保存されることを約束するものではない。更に、カシアンおよびフルツ，上記（本出願と同一所有権者を有し且つ本明細書中に援用される）の転写に基づく核酸増幅系の場合と同様に、逆転写酵素の３種類の活性の相対比活性の均衡は、再構成後も、乾燥前のこれらの活性の均衡と同様の状態にあるということが特定の用途に要求される場合、特定の保存法は、これらの酵素活性の微妙な均衡を失わせ、それによってその酵素をこの種の使用に不適当にさせることがある。例えば、酵素のＲＮアーゼ活性がＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性より多く保存される場合、ＲＮＡ：ＤＮＡ開始複合体は、ＤＮＡ合成が開始できる前に分解されることがある。ある与えられた酵素活性の長期保存に有効な与えられた凍結保護組成物は、別の酵素活性に対して適用された場合の有効性または利点が明らかではないので、種々の酵素は、しばしば、活性安定化について全く異なった議論を必要とする。結果として、商業的に製造された凍結乾燥酵素標品の内の全部または大部分は、その特定の酵素の活性を保存するように受注生産された配合物中に、乾燥された１種類の酵素のみを含む。発明の概要本発明は、酵素活性を実質的に減少することなく周囲温度で長期間貯蔵することができる逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの乾燥配合物を含む組成物およびキットに関する。好ましくは、該配合物は、レトロウイルス逆転写酵素および／またはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼの標品を含む。更に好ましくは、該配合物は、凍結保護賦形剤中に、モロニーネズミ白血病ウイルスに由来する逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）およびバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む。なお一層好ましくは、本発明は、１種類またはそれ以上の凍結保護賦形剤中にＭＭＬＶ−ＲＴおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ両方を含有する乾燥配合物を含む単一容器に関する。最も好ましくは、本発明は、ＭＭＬＶ−ＲＴおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、トレハロースおよびポリビニルピロリドン（ＰＡＰ）のどちらかまたは両方を含む１種類またはそれ以上の凍結保護賦形剤、ヌクレオチド三リン酸、並びに前記酵素活性に必要な金属イオンおよび副因子を含有する乾燥配合物を含む単一容器であって、安定化された凍結乾燥物の再構成並びに標的核酸および１種類またはそれ以上の適当なプライマーの添加の際に、該配合物が、過度の取扱いを必要とすることなく核酸増幅に好都合で且つ原価効率がよい形である上記単一容器に関する。場合により、このような配合物は、核酸合成の開始のためのプライマーを含んでいてよい。最後に、本発明は、上記の乾燥配合物の製造方法および使用方法に関する。逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ酵素は、バーグら，上記；ジンジェラスら，上記（時々、転写増幅系またはＴＡＳと称される）；カシアンおよびフルツ，上記；デイビーおよびマレク，ＥＰＯ出願第88113948.9号；およびマレクら，ＰＣＴ公開第WO 91/02818号で記載されたような、転写媒介性核酸増幅法において重要な物質である。このような方法は、法医学および医学的診断などの分野において益々重要であり、そこでは、増幅試薬の経時安定性が、核酸増幅を用いる製品の製造、マーケティングおよび使用の費用の重要な要件である。出願人は、逆転写酵素のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮアーゼＨ活性の保存のための方法および乾燥配合物を発見した。同方法および配合物は、ＲＮＡポリメラーゼ活性の保存に適していることが発見された。更に、出願人は、意外にも、両方の酵素および４種類全部の酵素活性が、高温で長時間のインキュベーション後でさえも、かなりの期間にわたって４種類の活性をいずれもほとんど失うことなく、単一容器中の乾燥配合物として安定化され且つ保存されうることを発見した。本方法の一つの態様は、活性な精製逆転写酵素を、非還元性二糖（好ましくは、スクロースまたはトレハロース）またはポリビニルピロリドン（ＰＡＰ）を含む凍結保護賦形剤と一緒に、または逆転写酵素および該凍結保護物質を含有する溶液を、限定されるわけではないが凍結乾燥などの方法によって酵素を乾燥した後に、逆転写酵素のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮアーゼＨ活性を保護し且つ保存する物質として作用するのに有効な量のこれらの化合物の混合物と一緒に提供することを含む。第二の態様において、本発明は、活性な精製ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを、室温で９０日間を越えて実質的に安定な脱水状態で安定化させ且つ保存する方法を特徴とする。この態様において、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｍｇ⁺⁺またはＺｎ⁺⁺を含有するような金属塩；非還元性二糖、好ましくは、トレハロース、およびポリビニルピロリドン（ＰＡＰ）から成る群より選択される１種類またはそれ以上の保護安定化剤；並びにｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）などの還元剤の存在下で乾燥される。理論によって制限されることを望むものではないが、出願人は、還元剤が、酵素中に存在する任意のシステイン残基の酸化による酵素の失活を妨げるのに役立つと考えている。この態様において、ＲＮＡポリメラーゼは、好ましくは、その脱水配合物を４５℃の温度に対して少なくとも３０日間、または３５℃に少なくとも６１日間暴露後に、その元の活性の少なくとも７０％を保持している。もう一つの態様において、本発明は、逆転写酵素（好ましくは、ＭＭＬＶ−ＲＴ）、ＲＮＡポリメラーゼ（好ましくは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）、乾燥酵素の酵素活性を保存するのに有効な量の凍結保護賦形剤（好ましくは、トレハロースおよび／またはポリビニルピロリドン）、ヌクレオチド三リン酸、必要な副因子、任意のオリゴヌクレオチドプライマー、および還元剤、好ましくは、チオール化合物の混合物を含有する単一乾燥配合物を特徴とする。更にもう一つの態様において、本発明は、生物の１種類またはそれ以上の系統発生分類に属する核酸の増幅および特異的識別のための、例えば、属の中の１種類若しくはそれ以上の種、または科の中の１種類若しくはそれ以上の属の特異的検出のためのキットの成分を含む。本発明は、単一容器中に逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチド三リン酸、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、亜鉛および／またはマグネシウム塩、および還元剤を含む再構成可能な乾燥配合物を提供する。増幅プライマーおよび再構成水溶液は、キットの１種類またはそれ以上の更に別の成分として与えられることができる。或いは、増幅プライマーは、乾燥配合物中に含まれることができる。標的配列特異的核酸ハイブリダイゼーション検定プローブおよび任意の望ましい未標識ヘルパーオリゴヌクレオチドは、乾燥配合物中に含まれるかまたは別の試薬で提供されることができる。乾燥配合物の再構成およびオリゴヌクレオチドプライマー(既に存在していない場合)を添加したのち、混合物を不完全または完全な一本鎖標的核酸と接触させる。標的核酸が１個または複数のプライマー（またはプロモーター−プライマー（１個または複数の）のプライマー部分）と相補的なヌクレオチド配列を有する場合、核酸増幅に充分な温度での反応混合物のインキュベーションの際に反応が進行するであろう。もう一つの態様において、本発明は、逆転写酵素（好ましくは、ＭＭＬＶ−ＲＴ）、ＲＮＡポリメラーゼ（好ましくは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）、凍結保護賦形剤、ヌクレオチド三リン酸、必要な副因子および、好ましくはチオール基を有する還元剤の組み合わせを含有する単一凍結乾燥物を含む。該凍結乾燥物は、冷蔵を必要とすることなく輸送され且つ貯蔵されうるし、そして酵素活性を有意に減少させることなく一時的な高温暴露、例えば、限定されることなく、５５ ℃で３０日間に耐えることができる。「ヌクレオチド三リン酸」とは、それぞれＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは逆転写酵素）の基質として役立つことができるリボ−またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸およびそれらの誘導体を意味する。このような誘導体としては、限定されることなく、含窒素塩基（通常、アデニン、チミンまたはウラシル、シトシンおよびグアニン）、リボース若しくはデオキシリボース部分、またはリン酸基に包含されたメチル（または他のアルキル）および／または硫黄基を有するヌクレオチドを挙げることができる。「ヌクレオチド」とは、一つの含窒素塩基（通常、アデニン、チミンまたはウラシル、シトシンおよびグアニン）、糖部分（リボースまたはデオキシリボース）およびリン酸基を含む核酸サブユニットを意味する。本明細書中で用いられる用語は、用いられる文脈に応じて、取り込まれていないリボ−またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸およびオリゴヌクレオチドまたは核酸鎖の共有結合したヌクレオチドサブユニット両方を意味する。発明の詳細な説明本発明は、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼ酵素の酵素活性を安定化させる方法であって、凍結保護物質または安定化「増量剤」の存在下においてこれらの酵素の１種類またはそれ以上を含有する溶液から溶媒を除去することによる上記方法に関する。このような凍結保護物質としては、サッカライド、特に、非還元性二糖、および酵素と水素結合するのに利用可能な陽性および／または陰性基を有する水溶性ポリマーがある。特に好ましい凍結保護物質は、二糖のスクロースおよびトレハロース並びにポリマーのポリビニルピロリドン（ＰＡＰ）である。本発明は、更に、乾燥保存されたＤＮＡポリメラーゼ、乾燥保存されたＲＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼ両方を含有する乾燥保存された混合物を含む安定な組成物に関する。これらの組成物を含む好ましい酵素は、逆転写酵素およびバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼであり；特に好ましい酵素は、モロニーネズミ白血病ウイルス由来レトロウイルス逆転写酵素およびバクテリオファージＴ７由来ＲＮＡポリメラーゼである。本発明のＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを乾燥保存する好ましい方法は凍結乾燥による。この方法では、酵素含有溶液を凍結させ、凍結した酵素溶液に真空を適用し、そして昇華によって標品から溶媒を除去して、溶質を残す。本発明は、更に、１種類またはそれ以上の特定の核酸配列の複製のための組成物であって、ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは、逆転写酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸、および酵素活性に必要な副因子の乾燥保存された標品を含む上記組成物を特徴とする。乾燥保存された標品は、標的ヌクレオチド配列の特異的複製のめたの増幅プライマーおよび／またはハイブリダイゼーション検定プローブおよびヘルパーを更に含むことができる。好ましくは、乾燥保存組成物を凍結乾燥によって製造する。本発明の組成物は、たとえ高温で貯蔵された場合にも、長期間安定している。このような組成物は、したがって、これらの酵素の市販標品およびこれらの酵素を含む核酸増幅用キットの輸送および貯蔵において有用である。実施例以下の実施例は、本発明の現在好ましい様々な実施態様を例証するものであり、いずれにせよその範囲を制限しないということは理解されるであろう。実施態様の開示もまた、本発明によって対応することが求められる一つまたはそれ以上の目的を達成するのにより有効である本発明の他の実施態様が存在しないかもしれないということを示すものではない。実施例１：逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの凍結乾燥この実施例および以下の実施例で用いた逆転写酵素は、大腸菌（E.coli）菌株１２００で発現され且つ細胞ペーストから精製された組換えモロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素かまたは、ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカルズ（ United States Biochemicals），クリーブランド，オハイオから入手した商業的に入手可能な精製ＭＭＬＶ−ＲＴ標品であった。酵素標品は、２０〜５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ＭＮａＣｌ、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１．０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．０１％（ｖ／ｖ）TERGITOL NP -40（TERGITOL NP は、ユニオン・カーバイド・ケミカルズ・アンド・プラスティクス・カンパニー・インコーポレーテッド(Union Carbide Chemicals and Plastics Co.,Tnc.)の登録商標である）または０．１％（ｖ／ｖ）TRTTON X-100(TRITON は、ユニオン・カーバイド・ケミカルズ・アンド・プラスティクス・カンパニー・インコーポレーテッドの登録商標である)および５０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する貯蔵用緩衝液中に−２０℃で貯蔵された。精製Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、エピセントル・テクノロジーズ（Epicen tre Technologies）,マディソン,ＷＩから入手した。透析の前に、酵素を５０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ＭＮａＣｌ、１．０ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％（ｖ／ｖ）TR ITON X-100中で貯蔵した。この酵素もまた、透析の前に−２０℃で貯蔵した。３種類の酵素標品を凍結乾燥用に透析した。第一標品は、２０ｍＭＨＥＰＥＳ（［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）（ｐＨ７．５）、０．１ＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＮＡＬＣ、０．１ｍＭ硫酸亜鉛、０．２Ｍトレハロースおよび水を含有する緩衝液中に希釈されたＭＭＬＶ−ＲＴ３２４，０１２単位を含んだ。その最終容量は７２０μｌであった。これを、同緩衝液（トレハロース緩衝液（Trehalose Buffer））２５０ｍｌに対して４℃で６時間透析した。透析膜は、２％（ｗ／ｖ）重炭酸ナトリウムおよび１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で、次に、１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で、そして最後に、脱イオン水中でそれぞれ１０分間沸騰させることによって調製された。次に、その膜を、使用前に脱イオン水で充分に洗浄した。透析用緩衝液を同量の新鮮な緩衝液と交換し、そして透析を更に１０時間続けた。緩衝液を再度交換し、そして更に３時間続けた。最終容量は６５５μｌであった。第二標品は、７２０μｌ中にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ１４４，０００単位を含んだ。これを、トレハロース緩衝液に対して逆転写酵素標品と同様の計画でおよび同量で透析した。最終容量は１２７０μｌであった。第三標品は、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ両方を含み、逆転写酵素３２４，０１２単位およびＲＮＡポリメラーゼ１４４，０００単位を組合わせて、最終容量１４４０μｌとした。これを、３等量のトレハロース緩衝液に対して他の二つの標品と同様の計画で透析した。透析液の最終容量は１９７５μｌであった。透析後、各標品を１２等分のアリコートとしてバイアル中に分割した。各バイアルは、逆転写酵素２７，０００単位、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ１２，０００単位、または両酵素をこれらの量で含んだ。それらのバイアルを、ＦＣＰ−ＩＩＩ制御システムを備えたプログラム化しうるビルティス（Virtis）型凍結乾燥器１０１−ＳＲＣに入れた。バイアルを約５分間で−４０℃まで冷却した。凍結乾燥は、圧力を−１８０トルまで低下させることによって開始され、その真空は、凍結乾燥プロトコル中、一定に保たれた。次に、温度を−１０℃まで次の２時間中に直線的に上昇させ、そしてこの温度で次の６時間維持した。次に、その温度を１０℃まで次の１時間中に直線的に上昇させ、そして１０℃で４時間維持した。その温度を２５℃まで次の３０分間にわたって再度直線的に上昇させ、そして２５℃で次の１０．５時間維持した。次に、乾燥窒素の導入によって圧力を大気圧に戻し、そしてバイアルを凍結乾燥器から取出す前に、それらを窒素下において密封した。次に、バイアルを２５℃で２２日間貯蔵した。貯蔵期間後、凍結乾燥された酵素標品を、再構成用緩衝液（Reconstitution B uffer））（０．０１％（ｖ／ｖ）TRITON X-100、４１．６ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＺｎＣ₂Ｈ₃Ｏ₂、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベンおよび０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン）中に再構成し、そして核酸増幅を支持するそれらの能力について検定した。全容量９０μｌの反応混合物は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１７．５ｍＭ、２ｍＭスペルミジン、２５ｍＭＫＣｌ、各２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ、２．５ｍＭＣＴＰおよびＵＴＰ、６．５ｍＭＡＴＰおよびＧＴＰ、５ｍＭＤＴＴ、バクテリオファージＴ７遺伝子１０の一方の鎖の領域に相補的な標的結合領域を有するプロモーター−プライマー（配列番号：１）の６７５μｇ／ｍｌ溶液０．４４μｌ、バクテリオファージＴ７遺伝子１０のもう一方の鎖に相補的な標的結合領域を有するプライマー（配列番号：２）の４５１μｇ／ｍｌ溶液０．３μｌ、Ｔ７遺伝子１０標的核酸１００コピーおよび水を含んで調製された。Ｔ７遺伝子１０ＲＮＡ標的は、プラスミドｐＧＥＭＥＸ−１(プロメガ・コーポレーション（Promega Corporation），マディソン,ＷＩ)に由来するプラスミド由来Ｔ７遺伝子１０制限フラグメントの(＋)センス転写物であった。精製ＲＮＡ転写物は、０．６１ピコモル／μｌの濃度で存在した。標的核酸１００コピーを各試験管に加えた。各試験管に鉱油２００μｌを更に重層させて、検定中の試料の蒸発を防止した。試験管は全て、９５℃で５分間インキュベートし、そして上記のように再構成された酵素を加える前に室温まで冷却したが、この工程は、標的核酸がＲＮＡであるかまたは二本鎖ＤＮＡではなく一本鎖ＤＮＡである場合は不必要であり、初期加熱工程は、ＲＮＡ分子内水素結合のいずれかの領域を融解させるのに役立つ。次に、別々に凍結乾燥された酵素標品が入っている試験管に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ４００単位および凍結乾燥ＭＭＬＶ−ＲＴ６００単位かまたは９００単位を含有する溶液１０μｌを入れた。同時凍結乾燥されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＭＭＬＶ−ＲＴは、それぞれ、４００単位および９００単位／１０μｌの濃度で存在した。試験管を３７℃で３時間インキュベートした。反応中に生じた増幅核酸の量は、アーノルド(Arnold)およびネルソン(Nelson) ，米国特許第5,283,174号明細書（本出願と同一所有権者を有し且つ本明細書中に援用される）に記載の均一保護検定を用いて測定されたが、放射性標識プローブを用いることによるなどの核酸標的を検出する多数の他の検定システムおよび方法が当該技術分野において利用可能であるということは当業者に明らかであろう。増幅反応は、２００ｍＭコハク酸リチウム（ｐＨ５．２）、１７％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、３ｍＭＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）および３ｍＭＥＧＴＡ（［エチレンビス（オキシエチレニトリロ）］−四酢酸）、およびＴ７遺伝子１０ＲＮＡ転写物に相補的なアクリジニウムエステル標識プローブ（配列番号：３）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液１００μｌを各試験管に加えることで終結した。その試験管を６０℃で２０分間インキュベートした。ハイブリッド形成していないプローブと結合したアクリジニウムエステルを、３００μｌの１８２ｍＭＮａＯＨ、６００ｍＭホウ酸および１％(ｖ／ｖ)TRIT ON X-100を加えることで加水分解し、そしてその試験管を６０℃で５分間インキュベートした。残りの化学発光は、０．４ＮＨＮＯ₃中１％(ｖ／ｖ)Ｈ₂Ｏ₂ ２００μｌを加えた直後に１ＭＮａＯＨ（２００μｌ）を直ちに加えて溶液をアルカリ化した時にルミノメーターで測定された。結果は相対光単位（ＲＬＵ）で報告されるが、これは、化学発光標識によって発せられた光子の数の尺度である。結果を下記の表１に示す。これらの結果は、同時凍結乾燥されたＭＭＬＶ−ＲＴおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼが、酵素標品をもう一方の酵素の液体酵素標品と組合わせた反応混合物かまたは両酵素が凍結乾燥されていない反応混合物の場合よりも効果的にＲＮＡ遺伝子１０標的の増幅を引き起こしたことを示す。液体酵素と比較して、増幅を触媒するいずれの凍結乾燥酵素標品の能力にも有意の減少はなかった。したがって、結果は、それぞれの酵素が、単独でかまたは一緒に、トレハロースの存在下の乾燥状態での貯蔵によって効果的に安定化されうることを更に実証する。これらの条件下の核酸増幅は、逆転写酵素の３種類全部の酵素活性（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮアーゼＨ）の存在に依るので、その検定は、これらの活性が本方法によって効果的に安定化されていることおよび核酸増幅を促進するような方式で活性が調和した状態に維持されていることを有効に示すものである。追加の実験は、逆転写酵素が、同様の条件下においてトレハロースではなくスクロースの存在下で凍結乾燥されうることを示したが、トレハロースは、凍結保護安定化剤としてスクロースよりも僅かに優れていると考えられた。（実施例６を参照されたい。）ｂ．非イオン性界面活性剤の存在下での逆転写酵素およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼの凍結乾燥酵素の透析中酵素活性を維持しながら、凍結乾燥操作中のタンパク質の沈殿を最小限にすることを試みるために、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを非イオン性界面活性剤の存在下で同時透析し且つ凍結乾燥させた。６種類の透析混合物を、透析緩衝液中に０％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％および０．５％TRITON X-102を含むよう調製した。透析緩衝液は、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．１ＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＮＡＬＣ、０．１ｍＭ酢酸亜鉛および０．２Ｍトレハロースを含んだ。各透析混合物の最終容量は２５０ｍｌであった。それぞれの緩衝液４６７マイクロリットルを、ＭＭＬＶ −ＲＴ（２９００単位／μｌ）４６μｌおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（８００単位／μｌ）７４μｌと混合して、それぞれの透析液の開始容量を５８７μｌとした。試料を該当する緩衝液６０ｍｌに対して４℃で透析し、同量の緩衝液を３回取換えた。３回目の緩衝液交換後、０％、０．０１％および０．０５％TRIT ON X-102含有試料で沈殿が見られたが、このような沈殿は、０．１％、０．２％または０．５％TRITON X-102含有試料では見られなかった。透析後、各透析液の容量を測定し、そして計算された酵素濃度を適宜に調整した。それぞれの試料を４個のバイアルに分け、各バイアルには、ＭＭＬＶ−ＲＴ２４，７５０単位およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ１１，０００単位が含まれていた。凍結乾燥を上のように行った。乾燥後の界面活性剤含有凍結乾燥物の外観は、TRITON X-102の不存在下で製造された凍結乾燥物と区別できなかった。凍結乾燥後、バイアルを４℃および５５℃で３２日間貯蔵した。非イオン性界面活性剤の酵素活性に対する効果は、Ｔ７遺伝子１０増幅システムを用いる増幅検定で評価された。それぞれの凍結乾燥酵素標品を再構成用緩衝液中で再水和させ、ＭＭＬＶ−ＲＴ９００単位およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ４００単位をそれぞれの反応混合物中で評価した。ＲＮＡ遺伝子１０転写物( １００コピー／反応)を標的核酸として用いた。検定は、特に断らない限り、上記のように行われた。結果はＲＬＵで報告される。これらの結果は、TRITON X-102などの非イオン性界面活性剤が、ＭＭＬＶ− ＲＴまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼの透析後のタンパク質沈殿の形成を効果的に防止しうることを実証する。結果は、更に、TRITON X-102が、標的核酸の増幅に有害な作用を及ぼさないし、しかも凍結乾燥酵素を高温で貯蔵した場合に、経時酵素活性を一層安定させるようにも作用しうることを示している。界面活性剤は、この検定においてバックグラウンドルミネセンスの増加を引き起こさない。これらの結果はまた、界面活性剤の不存在下で凍結乾燥された試料（試料Ｂ）でも、非凍結乾燥酵素とほぼ同様の活性を残していることを実証する。結果は、更に、凍結乾燥酵素標品を高温で長期間貯蔵した場合に、凍結乾燥酵素標品では検出可能な活性の減少を生じないことを示している。これらの結果が、他の非イオン性界面活性剤、例えば、限定されるわけではないが、BRIJ系、TWEEN系、TRITON系の他の界面活性剤、TERGITOL系の界面活性剤は、酵素活性に悪影響を与えることなく、凍結乾燥中に乾燥タンパク質を可溶性状態で維持するそれらの能力について上記のように容易にスクリーニングされうるということを直接に示唆していることは当業者に明らかであろう。実施例２：逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼと増幅試薬との同時凍結乾燥モロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ酵素標品を、乾燥する前に、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、０．０１％（ｖ／ｖ）ＮＰ −４０または０．１％（ｖ／ｖ）TRITON X-100および５０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する貯蔵用緩衝液中に−２０℃で保持した。凍結乾燥用に、ＭＭＬＶＲＴ３ｘ１０⁶単位およびＴ７ポリメラーゼ１．３ｘ１０⁶単位（各標品２．５ｍｌ）を混合し、そして分画分子量１２，０００ダルトンの透析膜を用いて、２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＮＡＬＣ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭ酢酸亜鉛、０．２％（ｖ／ｖ）TRIT ON X-102および０．２Ｍトレハロースを含有する少なくとも５０容量の緩衝液に対して２〜８℃で透析し、同容量の緩衝液を少なくとも８時間の緩衝液交換間隔で３回取換えた。透析された酵素標品２０ミリリットルを、１０．０ｍＭスペルミジン、２５０ｍＭイミダゾール／１５０ｍＭグルタミン酸（ｐＨ６．８）、９９ｍＭＮＡＬＣ、１２．５％（ｗ／ｖ）ＰＡＰ、各１２．５ｍＭのｒＣＴＰおよびｒＵＴＰ、各３１．２ｍＭのｒＡＴＰおよびｒＧＴＰ、各１０．０ｍＭのｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰを含有する増幅試薬６０ｍｌと混合した(容量比６：２)。更に別の実験は、試薬を容量比７：１（増幅試薬対酵素標品）で、有意に異なった結果を伴うことなく混合しうることを示した。理論的に、透析酵素標品および増幅試薬は、等比率で混合することができ、増幅試薬対酵素の適当な比率の決定は、充分に当業者の能力の範囲内である。凍結乾燥前の混合された酵素:増幅試薬配合物の最終組成は、ＭＭＬＶＲＴ２．７ｘ１０⁶単位およびＴ７ポリメラーゼ１．２ｘ１０⁶単位、各酵素６Ｘ１０⁶ 単位、５．０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８〜７．０）、０．０２５ｍＭＥＤＴＡ、０．０２５ｍＭ酢酸亜鉛、１０．０ｍＭスペルミジン、１８７．５ｍＭイミダゾール、１１２．５ｍＭグルタミン酸、７５．６ｍＭＮＡＬＣ、０．０５％（ｖ／ｖ）TRITON X-102、９．４％（ｗ／ｖ）ＰＡＰ（平均分子量４０，０００ダルトン）、０．０５Ｍトレハロース、各９．４ｍＭのｒＣＴＰおよびｒＵＴＰ、各２３．４ｍＭのｒＡＴＰおよびｒＧＴＰ、並びに各７．５ｍＭのｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰであった。混合された酵素：増幅試薬標品（以下、酵素：増幅試薬）８００マイクロリットルを、凍結乾燥のためにそれぞれ個々のガラスバイアル中に入れた（全酵素約３９，０００単位／バイアル）。凍結乾燥は、実施例１の場合と同様に行われた。凍結乾燥後、バイアルを以下の実施例で示されたように処理した。実施例３：凍結乾燥された試薬の増幅活性検定逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼおよび増幅試薬の新たに凍結乾燥された標品を、２５℃、３５℃および４５℃において３〜６１日間の様々な時間でインキュベートした。全てのバイアルを同じ標品から全く同じに調製した。指示された時点で、凍結乾燥試薬が入っているバイアルを高温から取出し、そして最後の試料が集められるまで−３０℃で貯蔵した。それぞれの温度に関して「ゼロ」時を示す試料を、−３０℃で全実験期間中貯蔵した。最後の時点のバイアルが集められた時に、全ての試料を再構成用試薬（Reconstituting Reagent）（０．０１％（ｖ／ｖ）TRITON X-102、４１．６ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＺｎＣ₂Ｈ₃Ｏ₂、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベンおよび０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン）１．５ｍｌ中で再水和し、そして各バイアルの内容物の核酸増幅を引き起こす能力について検定した。モデル増幅システムにおける活性は、この実施例において以下の方法で測定された。各増幅反応混合物は、標的核酸としてＢ型肝炎ウイルスゲノムの一部分を有するプラスミド（Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの２．６ｋｂフラグメントを有するＰＵＣプラスミド）からの二本鎖ＤＮＡ制限フラグメント５００コピーを含んだ。標的ＤＮＡを水かまたはヒト血清２０μｌで希釈した。負の対照は、標的ＤＮＡ不含である以外は同様に作成された。これを、２Ｘプライマー溶液２０μｌに対して加えた。この溶液の最終組成は、全容量４０μｌ中に０．１ＮＫＯＨ、１７．５ｍＭＥＧＴＡ、２５ｍＭイミダゾール、２５ｍＭグルタミン酸、０．０２５％（ｗ／ｖ）フェノールレッドおよび各０．３μＭの２種類のプライマーであった。第一プライマー（（−）センス）は、ＤＮＡ標的の（＋）センス鎖に相補的な３’標的結合ヌクレオチド配列領域から成り、そして５’非相補的部分は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターのヌクレオチド配列を有する５’ 非相補的領域から下流に位置した。第二プライマー（（＋）センス）は、もう一方の（（−）センス）ＤＮＡ鎖に相補的な標的結合領域から成るヌクレオチド配列を有した。反応混合物それぞれ４０μｌを、約９５℃でインキュベートして、二本鎖ＤＮＡ標的を変性させた。次に、反応を室温まで５分間冷却し、そして３３０ｍＭイミダゾールおよび２００ｍＭグルタミン酸を含有する緩衝液１０μｌで中和した。標的核酸がＤＮＡではなくＲＮＡであるならば、この変性工程は不必要であろう。再構成された酵素：増幅試薬それぞれ５０マイクロリットルを、変性され中和されたＤＮＡ反応混合物５０μｌに加えた後、それを３７℃で３時間インキュベートした。それぞれの反応は、ＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼＩを２０μｌ（４０単位）加えることによって終結した。再構成された酵素：増幅試薬それぞれの相対増幅は、アーノルドおよびネルソン，米国特許第5,283,174号明細書に記載された均一保護検定（ＨＰＡ）を用いることによって決定されたが、放射性標識などの種々の検出手段を用いる他の検定法を用いることができることは当業者に理解されるであろう。各増幅反応に、増幅されたＲＮＡアンプリコンに相補的であるように設計された約７５フェムトモル（fmol）のアクリジニウムエステル標識オリゴヌクレオチドブローブ（（＋）センス）を含有する、１０ｍＭコハク酸リチウム（ｐＨ５．０）、２％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、１ｍＭメルカプトエタンスルホン酸、０．３％（ｗ／ｖ）ＰＡＰ−４０、２３０ｍＭＬｉＯＨ、１．２ＭＬｉＣｌ、２０ｍＭＥＧＴＡ、２０ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭコハク酸(ｐＨ４．７)および１５ｍＭ２，２’−ジピリジルジスルフィドの溶液１００μｌを加えた。各試験管を混合し、６０℃で２０分間インキュベートした後、冷却した。各反応混合物に、０．６Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、１％（ｖ／ｖ）TRITON X-100および１８２ｍＭＮａＯＨを含有する溶液３００μｌを加え、そして６０℃で６分間インキュベートして、ハイブリッド形成プローブと結合していない標識を破壊した。反応混合物を５分間冷却し、そして残りの化学発光は、０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ₂ Ｏ₂、０．１ｍＭ硝酸２００μｌを自動注入した直後に１．０ＮＮａＯＨを注入後、ルミノメーター（LEADER（登録商標）ジェン・プローブ・インコーポレーテッド（Gen-Probe Incorporated），サン・ディエゴ，ＣＡ）で測定した。引き続き発せられる光の量は、相対光単位（ＲＬＵ）で報告される。これらの条件下において、発光のバックグラウンド水準は、約２０００〜４０００ＲＬＵの範囲内であった。結果を記録し、そして下記に示されたように各貯蔵温度（２５℃、３５℃および４５℃）に関して表示した。各試料を三重反復試験で検定し且つ平均した。この平均を用いて、各温度に関するデータをグラフにプロットした。図１は表３に対応し、図２は表４に、そして図３は表５に対応する。これらのデータは、本明細書中に記載の方法によって製造された同時凍結乾燥酵素：増幅試薬が、用いられた転写媒介性増幅法にしたがって核酸増幅を行うのに必要な４種類全部（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮアーゼＨおよびＲＮＡポリメラーゼ）の酵素活性を保持していることを示す。したがって、そのデータは、試薬を逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼと一緒に同時凍結乾燥する場合、ヌクレオチド三リン酸または増幅試薬の任意の他の成分に対する顕著な有害作用が存在しないことを示す。これらの結果は、更に、増幅反応がヒト血清などの複雑な生体試料の存在下で行われる場合、逆転写酵素の酵素活性およびＲＮＡポリメラーゼ酵素活性は有意に阻害されないということを示す。したがって、凍結乾燥増幅試薬は、臨床診断設定で得られるような試料と一緒に用いるのに適していると考えられる。そのデータは多数の方法で解釈することができ、より有用な解釈手段の一つは、アレーニウス式の形式を利用して、実際に試験されるよりも長期間にわたる組成物の安定性を予測する。アレーニウス式は、化学反応の速度および種々の熱不安定性化合物の安定性を温度の関数として予測するのに当業者によって一般的に用いられている。本明細書中で用いられるように、アレーニウス式は、活性酵素（または試薬）がある与えられた温度で単一の失活速度および全試験温度で単一の失活機序を有する酵素（または試薬）失活の一次反応を仮定する。出願人が用いた等式は、ｌｎ（ｋ₂／ｋ₁）＝（−Ｅ_a／Ｒ）（（Ｔ₂−Ｔ₁）／（Ｔ₂×Ｔ₁））であり、式中、ｋ₂は実験温度（°Ｋ）での速度定数であり、ｋ₁は対照温度での反応の速度定数であり、Ｅ_aは反応の活性化エネルギーであり、Ｒは気体定数（１．９８７ｃａｌ／°Ｋ−モル）であり、Ｔ₁は対照温度（例えば、２９８．１６°Ｋ（２５℃））であり、そしてＴ₂は実験温度（°Ｋで表わされる）である。Ｅ_aが１５，０００ｃａｌ／モルであると仮定され且つ対照および実験温度が知られているならば、速度定数の比率ｋ₂／ｋ₁を決定することができる。対照および実験温度が両方とも２５℃である簡単な場合、これらの定数比は、定数が同じであるので１である。実験温度が３５℃であり且つ対照温度が２５℃である場合、予測比率は２．２７であろう。実験温度が４５℃であり且つ対照温度が２５ ℃ である場合、予測比率は４．９１であろう。同じ式を用いて、対照温度が５℃であり且つ実験温度が４５℃である場合、その比率は３０．３３である。速度定数比は、貯蔵時間が時で表わされているか、日、週等であるかいずれにせよ、実験貯蔵時間対標準貯蔵時間の「分解比率」と考えることができる。したがって、凍結乾燥酵素／増幅試薬が４５℃において３０日でその元の能力の９０％まで分解する場合、アレーニウス式は、活性が同様に低下するのに２５℃で１４７．３（３０ｘ４．９１）日を要するであろうと予想する。したがって、そのデータは、凍結乾燥標品の混合された成分が、たとえ４５℃ で３０日後でも、増幅を支持するそれらの能力を「実時間」で顕著に失うことはないことを実証する。更に、アレーニウス式を利用することにより、同データは、凍結乾燥試薬を使用前に実際に２５℃でほとんど５か月間または５℃で２．５年間（３０．３３ｘ３０日）貯蔵したとしても、その試薬は活性を有意に失わないであろうと予想する。出願人は、本発明の理解を助けるものとしてこれらのデータ分析法を示すが、理論的考察によって制限または拘束されることを望むものではない。本発明の組成物の実際の安定性は、凍結乾燥試薬の安定性の予測について一般的な指標を与えるアレーニウス式の予測とは異なることがありうる。実施例４：凍結乾燥試薬のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ検定実施例２で製造された凍結乾燥酵素：増幅試薬を、３５℃で０日、３日、９日、１６日、２１日および３０日間インキュベートした。これらの各時点で、バイアルをそのストレス温度から取出し、そして最後の試料が集められるまで−３０ ℃で貯蔵した。ＲＮＡポリメラーゼ活性は、凍結乾燥試薬の各アリコートを、再構成用緩衝液（０．０１％（ｖ／ｖ）TRITON X-100、４１．６ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＺｎＣ₂Ｈ₃Ｏ₂、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベンおよび０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン）１．５ｍｌ中で再構成することによって測定された。次に、その試薬を、２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＮＡＬＣ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＺｎＣ₂Ｈ₃Ｏ₂、０．１ＭＮａＣｌおよび０．２％（ｖ／ｖ） TRITON X-102を含有する溶液で１００倍、２００倍および４００倍に希釈した。２２ｍＭＭｇＣｌ₂、各７．８ｍＭのＡＴＰおよびＧＴＰ、各２．５ｍＭのＣＴＰおよびＵＴＰ、６２．５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭスペルミジンおよび０．５ナノモルの標的核酸を含む反応プレミックスを別個に調製した。標的は、バクテリオファージＴ７遺伝子１０から直ぐ上流に位置したＴ７プロモーターを有する直鎖状ｐＵＣＴ７Ｇ１０プラスミドであった。このプラスミドは、プラスミドｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ・コーポレーション，マディソン，ＷＩ）に由来した。反応プレミックスを４０μｌアリコートに分け、そして各アリコートを３７℃ で３分間インキュベートした。酵素：増幅試薬の各希釈液１０マイクロリットルを、温めたプレミックス試験管に加え、そして３７℃で２０分間インキュベートした。転写産物に相補的であるように設計された約７５フェムトモルのアクリジニウムエステル標識遺伝子１０オリゴヌクレオチドプローブ（（−）センス）を含有する、１０ｍＭコハク酸リチウム、２％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、１ｍＭメルカプトエタンスルホン酸、０．３％（ｗ／ｖ）ＰＡＰ−４０、２３０ｍＭＬｉＯＨ、１．２ＭＬｉＣｌ、２０ｍＭＥＧＴＡ、２０ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭコハク酸（ｐＨ４．７）および１５ｍＭ２，２’−ジピリジルジスルフィドの溶液５０μｌを、各試験管に加えた。遺伝子１０プローブに相補的な１０フェムトモル（fmol）の一本鎖ＤＮＡを含有する標準試料をＨＰＡ工程に包含させて、実験反応混合物中に生じたＲＮＡの量を定量した。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション容量が半分であったこと以外、本質的に実施例２の場合のように行われた。ハイブリッド形成されなかった標識を分解後、残りのアクリジニウムエステルを反応させ、そして発光をルミノメーターでＲＬＵとして測定した。生データは、次のように、ＲＮＡポリメラーゼ活性のμｌ当たりの単位に変換された。正対照反応について得られた原ＲＬＵを、負対照（標的ＤＮＡ不含）で得られたＲＬＵから差し引いた。この数値は、１０ fmolのＲＮＡが試料中にある場合に得られる正味発光量であり、ＲＬＵ／fmol ＲＮＡとして表わすことができる。同様に、それぞれの試料について得られたＲＬＵは、バックグラウンドルミネセンスから差し引くことができる（ＲＬＵ／２０分間）。この数値を、標準について得られた数値（ＲＬＵ／fmol ＲＮＡ）で割ると、その結果は、それぞれの反応において２０分間当たりに生じたＲＮＡのfmol数である。ＲＮＡポリメラーゼ活性１単位は、検定条件下の２０分間での１ fmol ＲＮＡの生成として定義されたので、この数値は、最初に加えられた酵素の１０μｌ容量ごとのＲＮＡポリメラーゼ活性の単位数でもある。これらの反応から得られたデータは、最初に、生成したＲＮＡのfmolを、各試験管で示された元の１．５ｍｌの再構成酵素：増幅試薬のマイクロリットル数の関数として表わすことによって、３５℃で貯蔵の各時間に関してプロットされた。簡単な一次関数が描かれた。データがプロットされたら、各時点について得られたデータに最も良く適合した線を計算し、この曲線の傾きを、Ｔ７ポリメラーゼ活性の単位／マイクロリットルとして表わした。「ゼロ時」時点を活性１００％とみなすと、それぞれの残りの時点のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの計算された単位は、残りの活性％として表わされた。図４は、３５℃で貯蔵の日数の関数としての、凍結乾燥酵素：増幅試薬中のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの単位数／マイクロリットルのプロットである。この結果は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの減少があったとしても、３５℃で３０日間のインキュベーション期間にわたってほとんど起こらないことを示している。実施例５：凍結乾燥試薬の逆転写酵素検定３５℃で３日、９日、１６日、２１日および３０日間インキュベートされた凍結乾燥ＭＭＬＶ逆転写酵素の活性を、次のように検定した。個々のバイアルを指定の時間にそのストレス温度から取出し、そして最後の試料が集められるまで− ３０℃で貯蔵した。各バイアルを、実施例４の場合と同様に、再構成用緩衝液１．５ｍｌ中で再構成し且つ１００倍、２００倍および４００倍に希釈した。別個の逆転写酵素プレミックス混合物を、５ｍＭＭｇＣｌ₂、３０ｍＭＫＣｌ、各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、６２．５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭスペルミジン、３．７５ｎＭ標的ＲＮＡおよび７５０ｎＭの増幅プライマーを含むよう製造した。標的ＲＮＡは、実施例４で生じたＴ７遺伝子１０ＲＮＡ転写物であった。プライマーは、標的ＤＮＡの３’末端に近い領域に対してハイブリッド形成するように設計された２２塩基長さオリゴヌクレオチドであった。酵素希釈液１０マイクロリットルをそれぞれ、氷上の反応プレミックス４０μｌに加えた。反応は、３７℃で１５分間のインキュベーションによって行われた。それぞれの反応は、アクリジニウムエステル標識ハイブリダイゼーションプローブ５０μｌの添加によって終止させた。プローブは、新たに合成された遺伝子１０ｃＤＮＡに相補的であるように設計された。ＨＰＡによる検出は、実施例３で記載のように行われた。結果はＲＬＵで測定された。この検定は、ＭＭＬＶ逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮアーゼＨ活性を測定した。後者の活性は、遺伝子１０プライマーの伸長によって生じたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖の分解がなければ、プローブがｃＤＮＡに対してハイブリッド形成することができないので、間接的に測定される。これら混合された酵素活性の１単位は、上記の反応条件下の１５分間での１ f mol ｃＤＮＡの検出として定義された。それぞれの時点および希釈での残りの酵素活性の単位の計算は、実施例４の場合と同様に、標準として１０ fmolの増幅ｃＤＮＡを用いて行われた。図５は、３５℃での貯蔵日数の関数としての、凍結乾燥酵素：増幅試薬中のＲＴ活性の単位数／マイクロリットルのプロットである。この結果は、ＲＴ活性の低下があったとしても、３５℃で３０日間のインキュベーション期間にわたってほとんど起こらないことを示している。実施例６：逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼとヌクレオチドおよびプライマーとの同時凍結乾燥前の実施例は、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の乾燥保存標品と、ヌクレオチド三リン酸および核酸増幅に必要な副因子とを一緒に含有する単一試薬の製造および使用を例証した。高温で長期の貯蔵後に核酸を増幅するこのような「単一バイアル」試薬の能力があれば、このような試薬を使用する方法において工程数を減少させるように且つ核酸増幅用のキットの容器数を３個（例えば、凍結乾燥酵素：増幅試薬、プライマーおよび再構成用試薬）から２個（例えば、凍結乾燥酵素／プライマー／増幅試薬および再構成用試薬）に減少させるように、凍結乾燥標品中に１種類または複数の増幅プライマーを包含させることは容易に可能なはずであるということは当業者に明らかであろう。このような標品は、最初の標的核酸がＲＮＡであり且つ増幅法が等温のもの、例えば、カシアンおよびフルツ，ＰＣＴ公開第WO91/01384号またはカシアンら，ＰＣＴ公開第WO93/22461号でのような方法である場合のように、増幅反応が、一方または両方の酵素を変性する温度を用いない場合に有用である。実施例７：逆転写酵素とスクロースとの凍結乾燥出願人は、更に、スクロースを（例えば、０．２Ｍ濃度の）、逆転写酵素の凍結乾燥において凍結保護安定化剤として用いることができることを発見した。スクロースの安定化作用は良好であると考えられ、ＭＭＬＶ−ＲＴを含有し且つ５０％（ｖ／ｖ）グリセロール中において−２０℃で同じ時間貯蔵された標準的な液体溶液と比較して、０．２Ｍスクロース中で凍結乾燥された標品は、凍結乾燥物を４℃で３０日間貯蔵後に、標準的なＭＭＬＶ−ＲＴ標品の活性の９３％を維持した。スクロースではなく０．２Ｍトレハロースを含有する同様に処理された凍結乾燥物は、同様の条件下の標準について平均１０５％の活性を示した。実施例８：ＰＡＰの存在下での凍結乾燥出願人は、更に、ポリビニルピロリドン（ＰＡＰ）が、凍結乾燥の前の緩衝液中でトレハロースと混合された場合に、酵素：増幅試薬をトレハロース単独の存在下で凍結乾燥させる場合よりも大きく、凍結乾燥Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ：ＭＭＬＶ−ＲＴ：増幅試薬標品の安定性を向上させることを発見した。この驚くべき知見は、凍結乾燥酵素：増幅試薬の安定性が、凍結保護安定化剤としてトレハロースを単独でかまたはトレハロースおよびＰＡＰの組合わせを含有する凍結乾燥組成物の場合よりもむしろＰＡＰを単独で用いることによってほぼ同じかまたは高い程度に維持されうることを示唆する。酵素の凍結乾燥は、実施例２で詳述されたように、TRITON X-100または別の非イオン性可溶化剤を含有する透析溶液に対して精製酵素を透析することによって最適化することができる。この透析溶液はトレハロースを含まない。緩衝液交換工程後、酵素溶液のアリコートを調製し、そして種々の量のＰＡＰを各アリコートに加えることができる。次に、それらのアリコートに、実施例２で詳述されたように酵素：増幅試薬を加え且つ凍結乾燥することができる。これらの凍結乾燥試料は、実施例３の場合と同様に、異なった温度で様々な時間インキュベートされ、そしてそれぞれの酵素活性についておよび核酸増幅を支持する再構成された試薬の能力について検定することができる。上の実施例は、本発明の方法および組成物の好ましい実施態様を単に記載しているだけであり、発明を制限するまたは定義するためのものではないということは当業者に理解されるであろう。他の実施態様は、これらの実施例に続く請求の範囲に包含される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者プットナム，ジェイムズ・ガーフィールドアメリカ合衆国カリフォルニア州92102, サン・ディエゴ，デイル・ストリート 1933 (72)発明者デイヴィス，ウィリアム・マイケルアメリカ合衆国カリフォルニア州92122, サン・ディエゴ，ブエナ・ヴィスタ・ストリート 3628

Claims

【特許請求の範囲】１．単一容器中の酵素組成物を貯蔵し且つ安定化させる方法であって、（ａ）（ｉ）逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ並びに逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの混合物から成る群より選択される活性酵素組成物、および（ii）非還元性二糖、ポリビニルピロリドン並びに非還元性二糖およびポリビニルピロリドンの混合物から成る群より選択される安定化剤を含む溶液を提供し、（ｂ）該溶液を凍結させ、（ｃ）該凍結した溶液の溶媒部分を真空の適用によって昇華させ、それによって該活性酵素組成物および該安定化剤を含む凍結乾燥物を生成することを含む上記方法。２．前記活性酵素組成物が、本質的に、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの混合物から成る請求項１に記載の方法。３．前記安定化剤が、本質的にトレハロースから成る請求項２に記載の方法。４．前記安定化剤が、本質的にポリビニルピロリドンから成る請求項２に記載の方法。５．前記乾燥粉末を再構成し且つ適当な核酸基質および反応物と混合した場合に、前記溶液が、ＤＮＡ重合およびＲＮＡ転写の両方を可能にするのに充分なデオキシリボヌクレオチド三リン酸、リボヌクレオチド三リン酸、金属塩および副因子を単一溶液中に更に含む、請求項２に記載の方法。６．前記溶液が、少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを更に含む請求項５に記載の方法。７．前記凍結乾燥物を室温で２か月間貯蔵した場合に、前記酵素組成物が、標的核酸を増幅するその能力を少なくとも７０％保持する請求項５に記載の方法。８．前記凍結乾燥物を３５℃で２か月間貯蔵した場合に、前記酵素組成物が、標的核酸を増幅するその能力を少なくとも７０％保持する請求項５に記載の方法。９．前記凍結乾燥物を４５℃で２か月間貯蔵した場合に、前記酵素組成物が、標的核酸を増幅するその能力を少なくとも７０％保持する請求項５に記載の方法。１０．前記凍結乾燥物を５５℃で２か月間貯蔵した場合に、前記酵素組成物が、標的核酸を増幅するその能力を少なくとも７０％保持する請求項５に記載の方法。１１．凍結乾燥された逆転写酵素を含む組成物。１２．凍結乾燥されたＲＮＡポリメラーゼを含む組成物。１３．標的核酸の増幅用組成物であって、（ａ）有効量のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮアーゼＨ活性およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性、ここにおいて、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮアーゼＨ活性は１種類またはそれ以上の別個の酵素によって与えられ、（ｂ）凍結保護活性を有する１種類またはそれ以上の安定化剤、（ｃ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸およびリボヌクレオチド三リン酸、（ｄ）金属塩、および（ｅ）還元剤を有する単一凍結乾燥物を含み、ここにおいて、水性溶媒の添加によって該凍結乾燥物を再構成する場合に、得られる溶液が、標的ヌクレオチド配列領域を有する一本鎖ＲＮＡ分子および１種類またはそれ以上の適当なオリゴヌクレオチドプライマーを該溶液に加え且つ該酵素活性を促進するのに充分な温度で該溶液をインキュベートした時に、該ＲＮＡ分子を増幅することを特徴とする上記組成物。１４．前記１種類またはそれ以上の適当なプライマーが、凍結乾燥物中に含まれている請求項１３に記載の組成物。１５．前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮアーゼＨ活性が、組換えレトロウイルス逆転写酵素によって与えられ、そして前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性がバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによって与えられる請求項１３に記載の組成物。１６．前記逆転写酵素が、モロニーネズミ白血病ウイルスに由来する請求項１５に記載の組成物。１７．前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７バクテリオファージに由来する請求項１５に記載の組成物。１８．前記安定化剤が、非還元性二糖、ポリビニルピロリドン並びに非還元性二糖およびポリビニルピロリドンの混合物から成る群より選択される請求項１３に記載の組成物。１９．スクロース、トレハロースおよびポリビニルピロリドンから成る群より選択される安定化剤を含む請求項１３に記載の組成物。２０．前記安定化剤がトレハロースを含む請求項１３に記載の組成物。２１．標的核酸の増幅用組成物であって、（ａ）有効量のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮアーゼＨ活性およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性、ここにおいて、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮアーゼＨ活性は１種類またはそれ以上の別個の酵素によって与えられ、（ｂ）凍結保護活性を有する１種類またはそれ以上の安定化剤、（ｃ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸およびリボヌクレオチド三リン酸、（ｄ）金属塩、（ｅ）還元剤、および（ｆ）緩衝液を有する単一凍結乾燥物を含み、但し、該組成物はカルボン酸を含まないという条件付きであり、ここにおいて、水性溶媒の添加によって該凍結乾燥物を再構成する場合に、得られる溶液が、標的ヌクレオチド配列領域を有する一本鎖ＲＮＡ分子および１種類またはそれ以上の適当なオリゴヌクレオチドプライマーを該溶液に加え且つ該酵素活性を促進するのに充分な温度で該溶液をインキュベートした時に、該ＲＮＡ分子を増幅することを特徴とする上記組成物。２２．前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮアーゼＨ活性が、組換えレトロウイルス逆転写酵素によって与えられ、そして前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性がバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによって与えられる請求項２１に記載の組成物。２３．前記逆転写酵素が、モロニーネズミ白血病ウイルスに由来する請求項２２に記載の組成物。２４．前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７バクテリオファージに由来する請求項２２に記載の組成物。２５．前記安定化剤が、非還元性二糖およびポリビニルピロリドン並びに非還元性二糖およびポリビニルピロリドンの混合物から成る群より選択される請求項２１に記載の組成物。２６．前記安定化剤が、非還元性二糖およびポリビニルピロリドンから成る群より選択される請求項２２に記載の組成物。２７．前記安定化剤がトレハロースを含む請求項２２に記載の組成物。２８．標的核酸の増幅用キットであって、単一凍結乾燥配合物中に組合わされた逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを、トレハロースおよびポリビニルピロリドンから成る群より選択される凍結保護安定化剤と一緒に含み、ここにおいて、該凍結乾燥配合物の再水和およびオリゴヌクレオチドプライマーの存在下での標的核酸の添加の際に、若干のまたは全部の該標的核酸が増幅される上記キット。２９．前記凍結乾燥配合物が、金属塩およびヌクレオチド三リン酸を更に含む請求項２８に記載のキット。３０．少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを更に含む請求項２８に記載のキット。３１．前記安定化剤がトレハロースを含む請求項２８に記載のキット。３２．前記安定化剤がポリビニルピロリドンを含む請求項２８に記載のキット。