HU189251B

HU189251B - Process for stabilizing tumor necrosis factor

Info

Publication number: HU189251B
Application number: HU83981A
Authority: HU
Inventors: Hajimu Sakamoto; Takao Kiyota; Hiroshi Hayashi
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo Kk,Jp; Dainippon Pharmaceutical Co Ltd,Jp
Priority date: 1982-04-07
Filing date: 1983-03-23
Publication date: 1986-06-30
Also published as: ES521266A0; IT8367372A0; EP0091258A3; FR2530472B1; EP0091258B1; DE3373628D1; KR840004365A; US4447355A; KR860000842B1; CA1187412A; ES8505546A1; CH656534A5; FR2530472A1; EP0091258B2; IT1162845B; EP0091258A2

Abstract

A method for stabilizing a Tumor Necrosis Factor (TNF), which comprises adding at least one member selected from the group consisting of an albumin, a geiatin, a globulin, a protamine and a salt of protamine to an aqueous solution or powder containing TNF, and a stable aqueous solution or powder which contains TNF and an effective amount of such a protein. The aqueous solution or powder containing TNF can be stored for a prolonged period of time without losing its activity, and is stable on freezing, thawing, lyophilization or the like.

Description

A találmány tárgya eljárás tumor nekrózis faktor stabilizálására. A találmány közelebbről eljárás tumor nekrózis faktor (a továbbiakban TNF) stabil vizes oldat vagy stabil por formában történő előál-. lítására.The present invention relates to a method for stabilizing tumor necrosis factor. More particularly, the invention provides a process for the preparation of tumor necrosis factor (hereinafter TNF) in the form of a stable aqueous solution or a stable powder. lítására.

Carswell és munkatársai fedezték fel a TNF-et. Beszámoltak róla, hogy a TNF immunpotenciátorokkal - pl. Calmette^uérin bacillus (BCG), Corynebacteriumok vagy Zymosan - előkezelt egerek, patkányok vagy nyulak szérumában jelenik meg endotoxin kezelés hatására. Beszámoltak továbbá arról is, hogy a TNF egy sor transzplantált egértumor nekrózisát idézi elő anélkül, hogy ártalmas volna a gazdaszervezetre [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72 (9), 3666-70 (1975)].Carswell and colleagues discovered TNF. It has been reported that TNF can be used with immune potentiators, e.g. Calmette ^ uerin bacillus (BCG), Corynebacteria, or Zymosan - appears in the serum of pretreated mice, rats, or rabbits upon endotoxin treatment. It has also been reported that TNF causes necrosis of a variety of transplanted mouse tumors without being harmful to the host [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72 (9), 3666-70 (1975)].

Később számos közlemény látott napvilágot az egér és nyúl TNF fizikai és biokémiai tulajdonságairól [pl.: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73 (2) 381-5 (1976); Expl. Cell. Bioi. 47 53-60 (1979); Br. J. Cancer 38 302-9 (1978), valamint uo. 42 416-22 (1980)].Later, several publications on the physical and biochemical properties of murine and rabbit TNF have been published [e.g., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73 (2) 381-5 (1976); Expl. Cell. Biol. 47: 53-60 (1979); Br. J. Cancer 38: 302-9 (1978); 42: 416-22 (1980)].

Megjegyzendő, hogy egy citotoxikus faktor, amely feltételezhetően azonos a TNF-el, szintén több közleményben szerepel [Pl.: Infect. Immun. 28 (1) 204-11 (1980)].It should be noted that a cytotoxic factor that is presumed to be identical to TNF is also reported in several publications [e.g., Infect. Immun. 28 (1) 204-11 (1980)].

A TNF in vitro előállítását is ismertették már. Például Matthews meghatározta és leírta a normál, illetve BCG-vel kezelt nyulak különböző szöveteiből származó egymagvú fagocitákkal való TNF előállítás optimális körülményeit [Br. J. Cancer 44 418-24 (1981)]. A cikk szerint optimális mennyiségű TNF endotoxin jelenlétében állítható elő az egymagvú fagocitákkal, és úgy találták, hogy a leghatásosabb TNF termelők az alveoláris és peritoneális makrofágok.In vitro production of TNF has also been described. For example, Matthews has determined and described the optimal conditions for TNF production with mononuclear phagocytes from different tissues of normal and BCG-treated rabbits [Br. J. Cancer 44: 418-24 (1981)]. According to the article, the optimum amount of TNF can be produced in the presence of endotoxin by mononuclear phagocytes and it has been found that alveolar and peritoneal macrophages are the most potent TNF producers.

A cikkből azt is megtudhatjuk, hogy a BCG-vel kezelt nyulak makrofágjai szignifikánsan több TNF-et állítanak elő, mint a kezeletlen állatokból származók. Időközben Mánnel és munkatársai közölték, hogy a BCG-vel fertőzött egerek makrofágban dúsított, hashártya váladékból származó sejtjei in vitro lipopoliszacharid (endotoxin) hatására citotoxikus faktort választanak ki [Infect. Immun. 30 (2) 523-30 (1980) és uo. 33 (1) 156-64 (1981)]. Ami a TNF jellemző tulajdonságait illeti ismertes, hogy a TNF sokféle tumorra gyakorolt nekrotizáló hatását az élőlények fajától függetlenül fejti ki. Például a nyúl TNF nekrózist idéz elő egér tumoroknál. Továbbá ismeretes az is, hogy a TNF in vitro semmilyen toxikus hatással sem rendelkezik a normális sejtekre, viszont citotoxikus hatású bizonyos fajta neoplasztikus sejtvonalakra (pl.: L-M és Meth-A sejtek).The article also shows that macrophages produced by rabbits treated with BCG produce significantly more TNF than those from untreated animals. Meanwhile, Mann et al. Reported that macrophage-enriched peritoneal secretion cells of BCG-infected mice secrete a cytotoxic factor in vitro by lipopolysaccharide (endotoxin) [Infect. Immun. 30 (2) 523-30 (1980) and i. 33 (1) 156-64 (1981)]. Regarding the intrinsic properties of TNF, it is known that TNF exerts its necrotizing effect on a variety of tumors independently of the species. For example, rabbit TNF causes necrosis in mouse tumors. It is also known that TNF has no in vitro toxic effect on normal cells but has cytotoxic effects on certain types of neoplastic cell lines (e.g., L-M and Meth-A cells).

A fentieket összefoglalva, a TNF antitúmor hatású, hatását fajtól függetlenül fejti ki, és a legkevésbé sem ártalmas a normális sejtekre. Ezért a TNF tumorellénes gyógyszerként való klinikai alkalmazásához szakmai körökben igen nagy reményeket fűznek.In conclusion, TNF has antitumor activity, regardless of species, and is no less harmful to normal cells. Therefore, there is great hope in the clinical application of TNF as an antitumor agent.

Az is ismeretes, hogy emlősökben vagy szövettenyészeteiben csak igen kevés TNF keletkezik. Ennek megfelelően ahhoz, hogy a TNF tumorellenes gyógyszerként széleskörűen és biztonságosan klinikailag alkalmazható legyen, okvetlenül szükséges az emlősökben és szövettenyészetekben keletkező ·>It is also known that very little TNF is produced in mammals or tissue cultures. Accordingly, for widespread and safe clinical use of TNF as an antitumor agent, it is imperative that mammalian and tissue culture

nyers TNF izolálása és nagymérvű tisztítása. Továbbá midőn a tumorellenes gyógyszerként alkalmazásra kerülő TNF nagyüzemi előállítása megvalósul, általában szükségessé válik a nagytisztaságú TNF hosszabb időn át való tárolása oldat vagy fagyasztott formában, illetőleg a TNF oldat fagyasztva szárítása. A találmány feltalálói azonban úgy találták, hogy a nagytisztaságú TNF aktivitása a tárolás, fagyasztás, olvasztás és fagyasztva szárítás során jelentősen csökken. A feltalálók tudomása szerint eddig még nem jelent meg a nagy tisztaságú TNF stabilitásával foglalkozó közlemény. Ilyen körülmények között a nagytisztaságú TNF-ből megfelelő és állandó ellátás - különösen kereskedelmi méretekben - nem biztosítható, annak ellenére, hogy tudjuk, hogy a TNF hatásos tumorellenes gyógyszer.Isolation and large-scale purification of crude TNF. Further, once large-scale production of TNF for use as an antitumor drug is accomplished, it will generally be necessary to store the highly purified TNF for a prolonged period in solution or frozen form, or freeze-drying the TNF solution. However, the present inventors have found that high purity TNF activity is significantly reduced during storage, freezing, thawing and freeze-drying. To the best of the inventors' knowledge, no communication on the stability of high purity TNF has been published yet. Under these circumstances, high-purity TNF cannot be adequately and continuously supplied, especially on a commercial scale, even though TNF is known to be an effective antitumor drug.

A fentiekben vázolt, a TNF instabilitására vonatkozó nehézségek leküzdésére a feltalálók kiterjedt és mélyreható kutatásokat folytattak. Meglepő módon azt tapasztalták, hogy egy bizonyos fehérje megfelelő mennyiségben stabilizáló szerként a TNF tartalmú vizes oldathoz adva lehetővé teszi a TN F aktivitásvesztés nélküli hosszabb ideig történő tárolását és stabilizálja a TNF-et a fagyasztás, olvasztás, fagyasztva szárítás és a hasonló műveletek során is.In order to overcome the above-described difficulties with TNF instability, the inventors have conducted extensive and in-depth research. Surprisingly, it has been found that adding a certain amount of a protein as a stabilizer to an aqueous solution containing TNF allows longer storage of TNF without loss of activity and stabilizes TNF during freezing, thawing, freeze-drying and the like.

A találmány tárgya eljárás TNF stabilizálására.The present invention relates to a process for stabilizing TNF.

A találmányt a következő részletes leírással és a mellékelt ábrákkal szemléltetjük:The invention is illustrated by the following detailed description and accompanying drawings:

1. ábra Az emberi szérumalbumin koncentrációjának a +4 ’C-on 7 napig tárolt TNF maradék aktivitására gyakorolt hatását bemutató grafikon.Figure 1 Graph showing the effect of human serum albumin concentration on the residual activity of TNF stored at +4 'C for 7 days.

2. ábra A részlegesen hidrolizált zselatin koncentrációjának a +4 ’C-on 7 napig tárolt TNF maradék aktivitására gyakorolt hatását bemutató grafikon.Figure 2 Graph showing the effect of partially hydrolyzed gelatin concentration on the residual activity of TNF stored at + 4 'C for 7 days.

3. ábra Az emberi gamma-globulin koncentrációjának a +4 ’C-on 7 napig tárolt TNF maradék aktivitására gyakorolt hatását bemutató grafikon.Figure 3 is a graph showing the effect of human gamma globulin concentration on the residual activity of TNF stored at + 4 'C for 7 days.

4. ábra A lazac protamin szulfát koncentrációjának a +4 ’C-on 7 napig tárolt TNF maradék aktivitására gyakorolt hatását bemutató grafikon.Figure 4 Graph showing the effect of salmon protamine sulfate concentration on the residual activity of TNF stored at + 4 'C for 7 days.

Az ábrák rovábbi részletes magyarázatára később a 2. példa kapcsán kerül sor.Further details of the figures will be explained later in Example 2.

A találmány eljárást nyújt TNF stabilizálására oly módon, hogy a TNF tartalmú vizes oldathoz legalább egy - albumin, zselatin, globulin, protamin és protaminsó közül választott - stabilizálószer megfelelő mennyiségét adjuk. ¹ The present invention provides a method for stabilizing TNF by adding to the aqueous solution of TNF an appropriate amount of at least one stabilizer selected from albumin, gelatin, globulin, protamine and protamine salts. ¹

Az itt használt TNF megnevezés fiziológiailag aktív anyagot jelent, amely egyrészt oly módon állítható elő, hogy a legalább egy reticulo-endothel ·« rendszert (RÉS) stimulálni képes anyaggal előkezelt emlősökbe Gram-negativ baktériumból származó endotoxint injektálunk, másrészt pedig úgy juthatunk hozzá, hogy emlősökből származó aktivált makrofágokat tartalmazó szövetkultúrákhoz Gram-negativ baktériumból származó endotoxint adunk. A TNF olyan anyag, amely tumoros emlősökbe passzívan bejuttatva némely tumor nekrózisát idézi elő, vagyolyan tetszőleges módon előállított anyag, amely a fentiekben ismertetett fiziológiailag aktív anyaghoz hasonló tulajdonságokkal rehdelkezik.The term TNF, as used herein, refers to a physiologically active substance that is prepared by injecting, in a mammal, pretreated with at least one substance capable of stimulating the reticulo-endothelial system (RES), a Gram-negative bacterium, and Tissue cultures containing activated macrophages from mammals are supplemented with Gram-negative bacterial endotoxin. TNF is a substance which, when passively introduced into tumorous mammals, induces necrosis of some tumors, or is a substance produced in any manner that has properties similar to the physiologically active substance described above.

189 251189,251

A találmány szerinti eljárásban alkalmazásra kerülő TNF előállítására több módszer is ismeretes, így például Matthews és munkatársainak eljárása [Br. J. Cancer 42 416-22 (1980)], valamint a Green és munkatársai által kidolgozott eljárás [J. Natl. Cancer Insti 59 (5) 1519-22 (1977)].Several methods are known for the production of TNF for use in the process of the invention, such as the method of Matthews et al., Br. J. Cancer 42: 416-22 (1980)] and Green et al. Natl. Cancer Insti 59 (5) 1519-22 (1977)].

A találmány szerinti eljárásban TNF előállítására a következő jellegzetes eljárásokat alkalmaztuk.In the process of the present invention, the following representative procedures were used to prepare TNF.

Először is legalább egy, a reticulo-endothel rendszer (RÉS) stimulálására képes anyagot injektáltunk intravénásán vagy intraperitoneálisan emlősbe (pl. egér, nyúl, tengeri malac stb.). A RES-t stimuláló anyagként általában Gram-pozitív baktériumok, protozoonok vagy élesztők alkalmasak, amelyek egyaránt lehetnek élő vagy elölt (pl. hő-, illetve formalinos kezeléssel) mikroorganizmusok, vagy mikrobasejt kivonatok. Gram-pozitív baktériumként például Propionibacteriumok így Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum) és Propionibacterium granulosum (Corynebacterium granulosum), Mycobacteriumok, így a CalmetteGuérin (BCG) bacillus és Mycobacterium smegmatis, valamint Nocardiák, így Nocardia erythropolis és Nocardia gardneri alkalmasak. Megfelelő protozoonok például a Plamodium és Toxoplasma fajok, az élesztőkre pedig egyebek között jó példa a Saccharomyces cerevisiaeből extrahált Zymosan. Erre a célra egyébként szintetikus makromolekulák (igy például pirán-kopolimer) is alkalmazhatók.First, at least one substance capable of stimulating the reticulo-endothelial system (RÉS) was injected intravenously or intraperitoneally into a mammal (e.g., mouse, rabbit, guinea pig, etc.). Gram-positive bacteria, protozoa, or yeasts, which may be living or killed (e.g., by heat or formalin treatment), or microbial cell extracts are generally suitable as RES stimulant. Examples of gram-positive bacteria are Propionibacteria such as Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum) and Propionibacterium granulosum (Corynebacterium granulosum), Mycobacteria such as CalmetteGuérin (BCG) bacillus and Mycobacterium nei, and Nocardia erythrocytes such as Nocardia erythrocytes. Suitable protozoans include Plamodium and Toxoplasma species, and Zymosan extracted from Saccharomyces cerevisiae, among others, is a good example of yeast. Otherwise, synthetic macromolecules (such as pyran copolymer) may be used for this purpose.

Másodszor, 7-15 nappal az említett RES-t stimuláló anyaggal történt kezelést követően Gramnegatív baktériumból származó endotoxint (pl. Escherichia coliból, Pseudomonas aeruginosából vagy Salmonella typhosából származó lipopoliszacharidot) injektáltunk intravénásán az emlősbe.Second, 7-15 days after treatment with said RES stimulant, an endotoxin from a gram-negative bacterium (e.g., lipopolysaccharide from Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa or Salmonella typhosa) was injected intravenously into the mammal.

Harmadszor, 1,5-2 órával az injektálás után kinyerjük az emlős testnedveit (pl. hasvíz, nyirok stb.) és/vagy szérumját vagy plazmáját; vagy pedig homogenizáltuk és fiziológiás sóoldattal extraháltuk a belső szerveket (pl. máj, lép stb.). Ezek a testnedvek, szérum, plazma és/vagy belső szerv kivonatok szolgáltak nyers TNF oldatként. Közülük mégis általában a szérum vagy a plazma használatos.Third, 1.5-2 hours after injection, mammalian body fluids (e.g., abdominal water, lymph, etc.) and / or serum or plasma are recovered; or homogenized and extracted with physiological saline (eg liver, spleen, etc.). These body fluids, serum, plasma and / or internal organ extracts served as crude TNF solutions. Of these, however, serum or plasma are generally used.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott TN F előállítási módszere azonban - mint már említettük - nem korlátozódik a fenti eljárásra. A génmanipuláción vagy a szövettenyésztésen alapuló, TNF termelő sejteket hasznosító eljárások szintén s eredményesen alkalmazhatók. Megjegyzendő, hogy ezek a módszerek humán TNF előállítására is alkalmasak.However, the method of producing TN F used in the process of the present invention is not limited to the above process, as already mentioned. Methods utilizing TNF-producing cells based on gene manipulation or tissue culture can also be used successfully. It should be noted that these methods are also suitable for the production of human TNF.

_t A nyers TNF, amint a fenti módszerek bármelyikével állítottak elő, a következő szokványos biokémiai műveletekkel külön-külön, vagy azok kombinálásával tisztítható és ennek eredményeként tisztított TNF oldatot, ezt fagyasztva szárítva pedig tisztított TNF port kapunk.The crude _t TNF, as these methods have been prepared by any of the purified separately, or by combining the following standard biochemical operations and as a result, the purified TNF solution, and freeze-dried to give a purified TNF powder.

A TNF tisztítására alkalmas biokémiai műveletekként a következők említhetők: ammónium-szulfátos kisózás, ioncserés kromatográfia anioncserélő gyantán, gélszűrés és elektroforézis. Ezeknek a módszereknek az alkalmazása során a TNF tisztasága növekszik, de fokozatos stabilitáscsökkenés észlelhető. Például egy 500 ezer egység/mg fehétje fajlagos aktivitásig tisztított (a TNF aktivitás egység fogalmát később definiáljuk) TNF minta már meglehetősen instabil, amint ezt a példákban közölt adatokból látszik. Még az ennél alacsonyabb ⁵ fajlagos aktivitású minták is némileg veszítenek aktivitásukból, ha tárolják, fagyasztják, olvasztják, fagyasztva szárítják őket, vagy egyéb műveleteket végeznek velük.Biochemical processes for purifying TNF include ammonium sulfate salting, ion exchange chromatography on anion exchange resin, gel filtration and electrophoresis. By using these methods, the purity of TNF increases, but a gradual decrease in stability is observed. For example, a protein of 500,000 units / mg is purified to specific activity (the term TNF activity unit will be defined later). The TNF sample is already quite unstable, as shown by the data in the examples. Even samples with a lower specific activity of ⁵ may lose some of their activity when stored, frozen, thawed, freeze-dried, or subjected to other operations.

Ennek megfelelően a találmány célja a nagy tisz¹⁰ taságú és igy instabillá vált TNF stabilizálása. Előnyös, ha a stabilizálandó TNF készítmény oldat.Accordingly the purpose of the invention, the high purity ¹⁰ taságú stabilize TNF and thus become unstable. Preferably, the TNF formulation to be stabilized is a solution.

A találmány értelmében előnyös, ha a stabilizálandó TNF oldat pH-ja állandóan 5- és 10 közötti érték, továbbá, ha az oldószer valamilyen alkalmas ¹⁵ puffer. Ilyen alkalmas pufferként említhető például a foszfátpuffer, valamint a trisz(hidroximetil)amino-metán (HCl puffer). Kívánt esetben sót, például nátrium- vagy kálium-kloridot adunk a TNFoldathoz. Sót adunk például a TNF oldathoz, ha ²⁰ injekció készítéséhez izotóniás oldatot kívánunk előállítani, de nem csupán e célból történhet sóadagolás. A TNF oldat sókoncentrációját a sóadagolás céljának megfelelően választjuk meg. Ha például a TNF oldatból injekció készül, akkor 0,15 mó²⁵ los izotóniás nátrium-klorid oldatot készítünk belőle.According to the invention preferred that the TNF to be stabilized pH is between 5 and 10 constantly, and when the solvent ¹⁵ in a suitable buffer. Examples of suitable buffers include phosphate buffer and tris (hydroxymethyl) aminomethane (HCl buffer). If desired, a salt such as sodium or potassium chloride is added to the TNF solution. For example, salt is added to the TNF solution to make an isotonic solution for ²⁰ injections, but not only for this purpose. The salt concentration of the TNF solution is selected according to the purpose of the salt addition. For example, if TNF solution is injected, 0.15 mol of ²⁵ l isotonic sodium chloride solution is prepared.

A találmány értelmében eljárva legalább egy albumin, zselatin, globulin, protamin és protaminsó közül választott - stabilizálószer megfelelő ³⁰ mennyiségét adjuk a TNF-et tartalmazó vizes oldathoz.Acting in accordance with the invention at least one of albumin, gelatin, globulin, protamine and protamine chosen from - ³⁰ corresponding amount of stabilizer is added to an aqueous solution containing TNF.

Alkalmas albuminként különböző állatokról (pl. marha, ló, birka, kecske, csirke) és emberből származó albuminokat említhetjük. A megfelelő albu³θ min konkrét példái a következők: marha szérumalbumin, humán szérumalbumin, csirke tojásalbumin, marha laktalbumin és humán laktalbumin. Az említett albuminok között nem észleltek számottevő különbséget a TNF stabilizáló képesség tekinte⁴⁰ tében. Injekció készítésére azonban a legelőnyösebb stabilizálószer a humán szérumalbumin.Suitable albumins include albumins from a variety of animals (e.g., cattle, horses, sheep, goats, chickens) and humans. Specific examples of suitable albu for ³ θ min are bovine serum albumin, human serum albumin, chicken egg albumin, bovine lactalbumin and human lactalbumin. They were observed between these albumins significant differences ⁴⁰ due respect of TNF stabilizing ability. However, the most preferred stabilizer for injection is human serum albumin.

Alkalmas zselatinként a szokásos módon előállított közönséges zselatint, valamint a részlegesen hidrolizált zselatint említhetjük. A zselatin moleku⁴⁵ lasúlya nem lényeges. Injekció készítéséhez azonban a részlegesen hidrolizált, vízoldható zselatin a legelőnyösebb stabilizálószer. A részlegesen hidrolizált zselatin proteolitikus enzimekkel (pl. papain) végzett enzimatikus hidrolízissel, vagy savas vagy lúgos hidrolízissel állítható elő.Suitable gelatins include common gelatine prepared in the conventional manner and partially hydrolyzed gelatine. Gelatin molecules lasúlya ⁴⁵ is not essential. However, partially hydrolyzed, water-soluble gelatin is the most preferred stabilizer for injection. The partially hydrolyzed gelatin may be prepared by enzymatic hydrolysis with proteolytic enzymes (e.g. papain) or by acidic or alkaline hydrolysis.

Alkalmas globulinként különböző emlősökből (pl. marha, ló, birka, kecske) származó, valamint emberi eredetű globulinok és származékaik említhetők. A felsorolt globulinok között a TNF stabili55 záló képesség vonatkozásában számottevő különbség nem észlelhető. Előnyösen közülük mégis gamma-globulint, illetve ennek enzimes kezeléssel vagy kémiai módosítással előállított származékát használhatjuk, injekció készítéséhez pedig stabilizátor60 ként legelőnyösebbek a humán gamma-globulin, valamint származékai, mint például a plazminnal vagy pepszinnel kezelt humán gamma-globulin vagy a szulfonált humán gamma-globulin. Alkalmas protaminként megfelelő halfajok (pl. lazac. 65 hering, makréla) protaminjai említhetők. AlkalmasSuitable globulins include globulins of various mammals (e.g., cattle, horses, sheep, goats) and human origin, and derivatives thereof. There is no significant difference between the globulins listed in terms of TNF stabilizing ability. Preferably, however, gamma-globulin or a derivative thereof obtained by enzymatic treatment or chemical modification may be used and human gamma-globulin and its derivatives, such as human gamma-globulin treated with plasmin or pepsin or sulfonated human gamma, are most preferred for injection. globulin. Suitable protamines include protamines from suitable fish species (eg salmon 65 herring, mackerel). Suitable

189 251 protamin sóként pedig a protaminok sósavas, kénsavas és foszforsavas sói jöhetnek szóba. A felsorolt protaminok és protamimók között nem észlelhető számottevő különbség a TNF stabilizáló képesség tekintetében. A találmány szerinti stabilizá- ⁵ló szerek külön-külön vagy keverékként is alkalmazhatók.189 251 Protamine salts may include hydrochloric, sulfuric, and phosphoric salts. There is no significant difference between the listed protamines and protamimos in their ability to stabilize TNF. ⁵ horse stabilization agents of the invention may be used individually or as a mixture.

A találmány értelmében a hozzáadott stabilizátor mennyisége 10 pg és 5 mg között van a TNF oldatban milliliterenként, amelynek TNF aktivitá- ¹⁰sa 10² és 10’ egység/ml közötti (az aktivitás egységét később definiáljuk).According to the invention the amount of added stabilizer is between 10 pg to 5 mg per ml of the TNF solution having a TNF aktivitá- 'units / mL between ² and ¹⁰ and the 10 to 10 (the unit of activity is defined later).

A stabilizálószer alkalmazható maximális menynyiségét a stabilizálószer oldhatósága, a keletkező oldat viszkozitása, valamint gazdasági megfontolá- ¹⁵sok szabják meg.The stabilizing agent may be used maximum amount of drug solubility of the stabilizing agent, the resulting solution has a viscosity, as well as economic considerations dictate ¹⁵ lots.

A stabilizálószer hozzáadásának módja nem lényeges. Poralakú stabilizátor például közvetlenül hozzáadható a TNF oldathoz. Úgy is eljárhatunk, · hogy a stabilizálószer porát előbb feloldjuk vízben ²⁰vagy valamilyen alkalmas puflferben és így adjuk a TNF oldathoz. A stabilizátor a tisztítási eljárás bármely lépésekor vagy a gyógyszerkészités során is hozzáadható. Ha két vagy több különböző stabilizátort alkalmazunk, akkor együttes mennyiségük- ²⁵nek kell a fentiekben ismertetett koncentráció határok közé esni.The manner in which the stabilizer is added is not critical. For example, a powder stabilizer can be added directly to the TNF solution. Alternatively, · that the stabilizing agent powders are dissolved in water or a suitable puflferben ²⁰ above and added to the TNF solution. The stabilizer may be added at any point during the purification process or during drug preparation. If two or more different stabilizers, the total combined mennyiségük- ²⁵ must fall in the above-described concentration limits.

Kívánatos, hogy a stabilizálószert tartalmazó TNF oldat tárolása, tisztítása és a belőle való gyógyszerkészítés 0 és 30 ’C, előnyösen 0 és 10 ’C ³⁰közötti hőmérsékleten történjen. Ha a TNF oldatot fagyasztva tároljuk, akkor a tárolási hőmérséklet előnyösen 0 ’C alatti, még előnyösebben pedig - 20 °C alatti legyen.It is desirable that storage TNF solution containing the stabilizing agent, the cleaning and preparation of the drug out of 0 to 30 ° C, preferably 0 to 10 ° C, carried out at a temperature between ^30th If the TNF solution is stored frozen, the storage temperature should preferably be below 0 ° C, more preferably below -20 ° C.

A TNF oldat, amely a találmány értelmében ³⁵legalább egy stabilizálószert tartalmaz, megtartja aktivitását a tárolás, tisztítás és gyógyszerkészités során, akár oldat formájában van, akár pedig fagyasztott állapotban.TNF solution containing at least one stabilizer ³⁵ according to the invention retains activity during storage, purification and pharmaceutical use either in the form of a solution or is frozen.

A találmány értelmében a TNF stabilizálására ⁴⁰szolgáló eljárás alkalmazható a fagyasztva szárítás során is. Példaként említettük, hogy a fagyasztva szárítás során a TNF oldat (különösen hogyha nagy tisztaságú TNF-ről van szó) aktivitása általában jelentősen csökken. Azok a TNF oldatok ⁴⁵azonban, amelyek a találmány értelmében legalább, egy stabilizálószer fent említett mennyiségét tartalmazzák, aktivitásveszteség nélkül fagyasztva száríthatok TNF porrá. Stabil TNF oldat készíthető az olyan TNF por vizes oldásával, amelynek ⁵⁰TNF és stabilizátor koncentrációja a fent meghatározott tartományba esik. A találmány szerint a stabilizálószert a fagyasztva szárított készítmények is tartalmazhatják. Ha a TNF poralakban kerül tárolásra, akkor a tárolási hőmérséklet előnyösen ⁵⁵25 ’C vagy alacsonyabb legyen. ·According to the invention the stabilizing TNF also ⁴⁰ useful in the method of freeze-drying. As an example, it has been mentioned that the activity of TNF solution (especially when high purity TNF) is freeze-dried is generally significantly reduced. Those TNF solution ^45, however, at least, contain a quantity of the above-mentioned stabilizing agent in the present invention, freeze-dried powder of TNF without loss of activity. A stable solution of TNF can be prepared by dissolving aqueous TNF powder having a concentration of ⁵⁰ TNF and a stabilizer within the range defined above. According to the invention, the stabilizer may also be included in freeze-dried formulations. If TNF is stored in powder form, the storage temperature should preferably be ^{55 to} 25 ° C or lower. ·

A TNF aktivitásának meghatározására általában két módszer használatos; az in vivő módszer, amelynek során a tumor nekrotizáló hatást in vivő mérik; valamint az in vitro eljárás, amelynél a neo- 60 plasztikus sejtekre gyakorolt citotoxikus hatást in vitro mérik.Two methods are generally used to determine TNF activity; an in vivo method, wherein the tumor necrotizing effect is measured in vivo; and an in vitro method wherein the cytotoxic effect on neoplastic cells is measured in vitro.

In vivő módszerként említhetjük például a Carswell és munkatársai által alkalmazott eljárást [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72 (9) 3666-70 (1975)]. 65An example of an in vivo method is Carswell et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72 (9) 3666-70 (1975)]. 65

E módszer szerint BALB/C Szarkóma Meth A sejteket (2x10* sejt) intradermálisan átültetnek (BALB/C x C57BL(6)F, egerek hónaljába, majd 7 nap elteltével a 7-8 mm átmérőjű, jó vérellátású, spontán központi nekrózistól mentes tumorral rendelkező egereket választják ki az értékeléshez. Fiziológiás sóoldattal hígított TNF mintát (0,5 ml) injektálnak mindegyik egér farokvénájába. A TNF minta aktivitását 24 óra elteltével az alábbi kritériumok szerint értékelik:According to this method, BALB / C Sarcoma Meth A cells (2x10 * cells) are transplanted intradermally (BALB / C x C57BL (6) F, into the mice 's armpit, and after 7 days with a well blooded, 7-8 mm diameter, spontaneously free central necrosis tumor. TNF specimen (0.5 ml) diluted in saline is injected into the tail vein of each mouse The activity of the TNF specimen after 24 hours is evaluated according to the following criteria:

(-): nincs változás (+): enyhe haemorrhagiás nekrózis (+ +): mérsékelt haemorrhagiás nekrózis (a tumor felületének kb. 50%-ára kiterjedő központi nekrózis) (+ + +): jelentős haemorrhagiás nekrózis (erőteljes nekrózis, amely csak a tumor peremén hagy keskeny életképes szegélyt).(-): no change (+): mild haemorrhagic necrosis (+ +): moderate haemorrhagic necrosis (central necrosis covering about 50% of the tumor surface) (+ + +): major haemorrhagic necrosis (severe necrosis only leaves a narrow viable hem at the edge of the tumor).

TNF aktivitás mérésinek in vitro módszerei közül például a RufT és munkatársai'[Lymphokines, Vol. Z. Ed. by E. Pick, Academic Press, New York, 245-8 (1980)], valamint a Kuli és munkatársai [J. Immunoi. 126 (4) 1279-83 (1981)] által alkalmazott eljárásokat említhetjük.Examples of in vitro methods for measuring TNF activity include RufT et al. (Lymphokines, Vol. Z. Ed. By E. Pick, Academic Press, New York, 245-8 (1980)) and Kuli et al., J. Med. Immunol. 126 (4): 1279-83 (1981)].

A feltalálók által használt, a TNF aktivitását in vitro mérő módszert a fent említett hagyományos módszerek tökéletesítésével fejlesztették ki. Ez az in vitro eljárás, amely az L-M sejtekre (ATCC CCLThe inventor's in vitro method of measuring TNF activity has been developed by refining the conventional methods mentioned above. This is an in vitro method for L-M cells (ATCC CCL

1. 2) gyakorolt citotoxikus TNF aktivitást méri a következőképpen végzendő el. Tenyészrésre szolgáló edényként 96 lyuku mikroliter tálcákban (Floww Laboratories Inc. USA), 10% hőinaktivált magzati borjúszérumot tartalmazó Eagle minimál táptalajon [Science 130 432-7 (1959)] szaporítjuk el az L-M sejteket. A TNF mintákból (0,1 ml) sorozathigitásokat készítünk a táptalajjal és L-M sejtszuszpenzióval (0,1 ml, 1 x 10* sejt)elegyítjük őket a tálcák lyukjaiban, majd a tálcákat 37 ’C-on, 5% széndioxid tartalmú légtérben 48 órán át inkubáljuk. A tenyésztési periódus befejeztével 20 μΐ 20%os vizes glutáraldehid oldatot adagolunk a lyukakba a sejtek rögzítésére. A rögzítés után a tálcákat desztillált vízzel mossuk, azután száradni hagyjuk őket, majd 0,05%-os metilénkék oldat (0,1 ml) hozzáadásával megfestjük az élő sejteket. A színezék feleslegét alapos, desztillált vizes mosással eltávolítjuk, majd a tálcákat száradni hagyjuk. A megfestett sejtekből ezután extraháljuk a színezéket a lyukakba 3%-os sósavoldatot (0,2 ml) juttatva. A minták adszorpcióját 665 nm-en megmérve (Titertek Multiscan, gyártja Flow Laboratories Inc.) az élő sejtek számával arányos jelet kapunk.1. 2) Measure cytotoxic TNF activity as follows. L-M cells were grown as a culture flask in 96-well microliter trays (Floww Laboratories Inc. USA) on Eagle's minimal medium (Science 130, 432-7, 1959) containing 10% heat-inactivated fetal calf serum. Serial dilutions of the TNF samples (0.1 mL) were made with the medium and mixed with LM cell suspension (0.1 mL, 1 x 10 * cells) in wells of the wells and the wells at 37 ° C in 5% CO 2 for 48 hours. incubate. At the end of the culture period, 20 μΐ of 20% aqueous glutaraldehyde solution was added to the wells to fix the cells. After fixation, the plates are washed with distilled water, allowed to dry, and stained with 0.05% methylene blue solution (0.1 mL). The excess dye was removed by thorough washing with distilled water and the trays were allowed to dry. The stained cells were then extracted with the dye and injected with 3% hydrochloric acid (0.2 mL). The adsorption of the samples at 665 nm (Titertek Multiscan, manufactured by Flow Laboratories Inc.) gives a signal proportional to the number of living cells.

A TNF aktivitást [egység (E)/ml] az 50%-os citotoxicitást eredményező hígítás reciprokaként definiáljuk és oly módon kapjuk meg grafikusan a mérési eredményekből, hogy a hígítást az adszorpció függvényében ábrázoljuk. Valamennyi, a későbbiekben közölt, in vitro módszerrel meghatározott TNF aktivitás az így definiált egységben értendő.TNF activity [units (E) / ml] is defined as the reciprocal of a dilution producing 50% cytotoxicity and is plotted from the measurement results by plotting the dilution as a function of adsorption. All in vitro TNF activity as defined below is understood to be in the unit so defined.

A találmány szerinti módszerrel a klinikailag alkalmazható hatásos antitumor gyógyszernek tartott nagytisztaságú TNF-ből megfelelő és állandó kereskedelmi ellátás biztosítható, mivel ennek alapján lehetővé válik a TNF aktivitásának megőrzése a tárolás (oldat, fagyasztott vagy fagysztva szárított készítményként), tisztítás és gyógyszerkészítés során. Ezen kívül úgy találtuk, hogy a TNF oldat vagy por, amely legalább egy - humán szérumalbumin, zselatin, humán gamma globulin vagy ennek származéka, protamin vagy protaminsó közül választott - stabilizáló szert tartalmaz, biztonsággal bejuttatható az emberi szervezetbe, és ennek következtében a találmány szerinti új összetételű készítmény különösen előnyös midőn a TNF-et antitumor gyógyszerként klinikailag kívánják alkalmazni. A találmányt a következő példákban részletesen ismertetjük, anélkül azonban, hogy a találmány tárgykörét ezzel korlátoznánk.The method of the present invention provides an adequate and consistent commercial supply of highly purified TNF, which is considered a potent antitumor drug to be used clinically, as it allows TNF activity to be preserved during storage (solution, freeze-dried, or freeze-dried), purification, and pharmaceutical preparation. In addition, it has been found that a TNF solution or powder containing at least one stabilizer selected from human serum albumin, gelatin, human gamma globulin, or a derivative thereof, protamine or protamine salt, can be safely delivered to the human body and, accordingly, a novel formulation is particularly advantageous when TNF is to be used clinically as an antitumor drug. The invention is illustrated in detail by the following examples, without, however, limiting the scope of the invention.

A példákban használt rövidítések:Abbreviations used in the examples:

A következő példákban a stabilizálószerek rövidítései:In the following examples, the following are abbreviations of stabilizers:

HSA: humán szérumalbuminHSA: human serum albumin

BSA: marha szérumalbuminBSA: bovine serum albumin

PHG-1: részlegesen hidrolizált zselatin, amelyet a zselatin lúgos hidrolízisével kaptunk (átlagmólsúly: kb. 7000)PHG-1: partially hydrolyzed gelatin obtained by alkaline hydrolysis of gelatin (average molecular weight: about 7000)

HGG: humán gamma-globulin *”HGG: Human Gamma Globulin * "

SPS: lazac protamin-szulfátSPS: salmon protamine sulfate

HPS: hering protamin-szulfátHPS: herring protamine sulfate

BGG: marha gamma-globulinBGG: Bovine gamma-globulin

CEA: csirke tojásalbuminCEA: chicken egg albumin

BLA: marha a-laktalbuminBLA: Beef a-lactalbumin

PHG-2: részlegesen hidrolizált zselatin, amelyet a zselatin savas hidrolízisével kaptunk (átlagmólsúly kb. 7000)PHG-2: partially hydrolysed gelatin obtained by acid hydrolysis of gelatin (average molecular weight about 7000)

PHG-3: alacsony polimerizációs fokú részlegesen hidrolizált zselatinPHG-3: partially hydrolysed gelatin with low degree of polymerization

PG: tisztított zselatinPG: purified gelatin

SPF: lazac protamin (szabad bázis)SPF: Salmon Protamine (Free Base)

SPP: lazac protamin-foszfát EDTA: etilén-diamin-tetraecetsavSPP: salmon protamine phosphate EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid

Referencia példaReference example

2-3 kg súlyú nőstény nyulakba 75-75 mg formaiinnal elölt Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum; Wellcome Research Laboratories, England) sejttömeget injektáltunk intravénásán. Nyolc nap elteltével a nyulakba intravénásán 100-100 pg endotoxint (Escherichia coli 026 : B6 lipopoliszacharidot, a Dífco Laboratories, USA terméke) injektáltunk. Két órával ezután a nyulaktól szívből vért vettünk, kévés heparint kevertünk hozzá, majd 3000/perc fordulaton 15 percen át centrifugáltuk. így 2500 E/ml TNF aktivitású plazmát kaptunk. Ezt a TNF tartalmú plazmát (10 liter) 5 liter mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,8) hígítottuk és 0,13 mól/1 NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,8) egyensúlyba hozott DEAE - Sepharose CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals AB , Svédország terméke) oszlopra (10 * 42 cm) vittük. Az oszlopot 2,5 liter 0,03 mól/l-es foszfátpufferrel (ph 7,8) mostuk, majd a megkötött TNF elucióját lineáris NaCl gradienssel végeztük a következő két oldattal: 5,0 liter 0,15 mól/I NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es foszfátpuffer (pH 7,8), illetve 5,0 liter 0,3 mól/1 NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es foszfátpuffer (pH 7,8). Az átfolyási sebesség 230 ml/óra volt és 45 ml-es frakciókat szedtünk. A TNF aktivitás a 0,20 és 0,24 mól/1 NaCl koncentrációtartományban lejövő frankciókban volt. Ezeket egyesítettük és éjszakán át 0,13 mól/1 NÁCI tartalmú ⁵ 0,03 mól/1 Tris/HCl pufferrel (pH 7,2) szemben dializáltuk.Female rabbits (2-3 kg) were injected intravenously with 75-75 mg of formalin-killed Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum; Wellcome Research Laboratories, England). After eight days, 100-100 µg of endotoxin (Escherichia coli 026: B6 lipopolysaccharide from Difco Laboratories, USA) was injected intravenously. Two hours later, the rabbits were harvested from the heart, mixed with bovine heparin and centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes. Plasma with TNF activity of 2500 U / ml was thus obtained. This TNF-containing plasma (10 L) was diluted with 5 L phosphate buffer, pH 7.8 and equilibrated with 0.03 M phosphate buffer, pH 7.8 containing 0.13 M NaCl. DEAE - Sepharose CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals AB, Sweden) was applied to a column (10 * 42 cm). The column was washed with 2.5 L of 0.03 M phosphate buffer (ph 7.8), and the eluted TNF was eluted with a linear NaCl gradient with the following two solutions: 5.0 L of 0.15 M NaCl. 03 M phosphate buffer (pH 7.8) and 5.0 L of 0.03 M phosphate buffer (pH 7.8) containing 0.3 M NaCl. The flow rate was 230 ml / h and fractions of 45 ml were collected. TNF activity was found in fractions falling in the range of 0.20 and 0.24 M NaCl. They were pooled and dialyzed overnight against 0.13 M NaCl ⁵ 0.03 M Tris / HCl pH 7.2.

A dializált TNF oldatot újra kromatografáltuk 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es Tris/HCI pufferrel (pH 7,2) ekvilibrált DEAE-Sepharose CL-6B oszlopon (3,0x30 cm). Az adszorbeált TNF-et lineáris NaCl gradienssel eluáltuk, a határoldatok: 500 ml ekvilibráló puffer, illetve 0,3 mól/l NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es Tris/HCl puffer (pH 7,8). Az átfolyási sebesség 40 ml/óra volt és 10 ¹⁵ ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A TNF aktivitással rendelkező frakciókat egyesítettük és töményítettük. Ezt a koncentrátumot 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 5 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,0) ekvilibrált Sephacryl S-200 (Pharmacia termék) oszlopon ²⁰ (5 x 100 cm) gélszűrtük. Az eluciót a kiegyenlítő pufferrel végeztük. Az átfolyási sebesség 80 ml/óra volt és 13 ml-es frakciókat szedtünk. A TNF aktivitást tartalmazó frakciókat egyesítettük és ultraszűréssel töményítettük.The dialyzed TNF solution was rechromatographed on a DEAE-Sepharose CL-6B column (3.0 x 30 cm) equilibrated with 0.03 M Tris / HCl buffer (pH 7.2) containing 0.15 M NaCl. The adsorbed TNF was eluted with a linear NaCl gradient with 500 mL equilibration buffer and 0.03 M Tris / HCl buffer (pH 7.8) containing 0.3 M NaCl. The flow rate was 40 ml / h and 10 ¹⁵ ml fractions were collected. Fractions with TNF activity were pooled and concentrated. This concentrate was gel-filtered through a ²⁰ (5 x 100 cm) column of Sephacryl S-200 (Pharmacia product) equilibrated with 0.15 M NaCl in 5 M phosphate buffer, pH 7.0. Elution was performed with equilibration buffer. The flow rate was 80 ml / h and fractions of 13 ml were collected. Fractions containing TNF activity were pooled and concentrated by ultrafiltration.

²⁵ Az így kapott TNF oldat 5,0 x 10^s E/mg fehérje fajlagos aktivitású és a plazmához viszonyítva tízezerszeres tisztaságú. ²⁵ The TNF solution thus obtained was 5.0 x ^10s / mg protein specific activity and purity compared to plasma to ten thousand fold.

Ezt a TNF oldatot ugyanazon az oszlopon (Sephacryl S-200) ugyanazzal a pufferrel újra kro³⁰ matografálva 1 x 10* E/mg fehérje fajlagos aktivitású TNF oldatot kaptunk.This solution was chromatographed TNF flash chromatography on ³⁰ x 10 * 1 U / mg protein specific activity of TNF was obtained with the same buffer over the same column (Sephacryl S-200).

, /. példa, /. example

5,0 x 10⁵ E/mg fajlagos aktivitású, a referencia példa szerinti módon előállított nyúl TNF-ből 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 0,1 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,0) 1200 E/ml aktivitású TNF oldatot készí⁴⁰ tünk. Az így kapott oldat alikvotjáihoz különkülön stabilizálőszereket (HSA, BSA, PHG-1, HGG és SPS) adtunk kétféle koncentrációban (0,1, illetve 1,0 mg/ml).Rabbit TNF with a specific activity of 5.0 x 10 ⁵ U / mg, prepared as described in the Reference Example, with a activity of 1200 U / ml in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.0, containing 0.15 M NaCl TNF was made up to ⁴⁰ volumes. To the aliquots of the solution thus obtained separately stabilizing agents (HSA, BSA, PHG-1, HGG and SPS) were added in two concentrations (0.1 and 1.0 mg / ml).

Az oldatok maradék aktivitását a következő ke45 zelések után meghatároztuk;Residual activity of the solutions was determined after the following treatments;

í) tárolás 4 ’C-on 2,7 illetve 30 napig;ii) storage at 4 'C for 2.7 and 30 days;

ii) fagyasztás (-70 ’C) és felolvasztás egyszer illetve háromszor;ii) freezing (-70 'C) and thawing once or three times;

iii) fagyasztás - 70 ’C-ra, fagyasztva szárítás és 50 tárolás 25 ’C-on 7 napig.iii) Freezing - to 70 'C, freeze drying and 50 storage at 25' C for 7 days.

A fenti kísérletek során a stabilizátor nélküli TNF oldat volt a kontroll. A fagyasztva szárított készítményből (iii) a TNF aktivitás meghatározásához steril desztillált vizes oldatot készítettünk. 55 A maradék aktivitás meghatározása a korábban ismertetett in vitro illetve ín vivő módszerekkel történt. Az in vitro módszerrel a maradék aktivitást (%) a mérési adatokból az alábbi képlet szerint kaptuk:TNF solution without stabilizer was the control in the above experiments. Freeze-dried preparation (iii) was prepared in sterile distilled aqueous solution to determine TNF activity. Residual activity was determined using the in vitro and tendon delivery methods described above. Residual activity (%) by in vitro method was obtained from the measurement data using the following formula:

⁶⁰ Maradék aktivitás (%) = ^x 100 ⁶⁰ % activity remaining = ^ x 100

B ahol A a TNF minta aktivitása a kezelés után,B where A is the activity of the TNF sample after treatment,

B pedig a TNF minta aktivitása a kezelés előtt.B is the activity of the TNF sample before treatment.

Az in vivő meghatározáshoz a mintákat a kezde65 tihez képest 20-szorosra töményítettük Mini-5189 251For in vivo determination, samples were concentrated 20-fold compared to initial 65 Mini-5189 251

Modulé NM-3 készülékkel (a gyártó Asahi Chemical Industiy Co. Ltd.. Japán, cég védjegye az ultraszűrő készülékre). Az így töményített oldat 0,5 miét injektáltuk 5-5 tumoros egér farokvénájába.Module with NM-3 (manufactured by Asahi Chemical Industries Co. Ltd .. Japan, a trademark of the ultrafiltration device). The concentrated solution was injected 0.5 ml into the tail vein of 5-5 tumorous mice.

A TNF aktivitást 24 óra elteltével a korábbiakban ismertetett kritérium alapján határoztuk meg. A kapott eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.After 24 hours, TNF activity was determined according to the criteria described above. The results are shown in Table 1.

I. táblásaiTables I

HSA. BSA, PHO-I, HOO 6» SPS tabiliiiló lmjaHSA. BSA, PHO-I, HOO 6 »SPS tabiliiiló lmja

Körülmények Conditions Kontroll (tárolás vagy fizikai kezelés előtt) control (before storage or physical handling) 4*C-on tárolva (oldat) Stored at 4 * C (solution) Fafyuztf·- olvtutit · Fafyuztf - olvtutit 25 *C-on tárolva lioftlizált kéadtmény Store at 25 ° C in a lyophilized condition Az aktivitás vizsgálati módszere Test method for activity ín vitro in vitro in vivő in carrier in vitro in vitro in vivő in carrier in vitro in vitro in vitro in vitro in vivő in carrier Stabilizáló stabilizing Koncentrá· · concentration napok days napok days Ismétlői Repeaters napok days napok days anyag material ció mg/ml cio mg / ml 2 2 7 7 30 30 7 7 1 1 3 3 7 7 7 7 Kontroll (stabilizáló control (stabilizer 100 100 + + + 4. ++ 4. + + I ++ I 52 52 26 26 4 4 + 3. + 3. -2 -2 30 30 8 8 40 40 + 4. + 4. -1 -1 anyag nélkül) without substance) HSA HSA 0.1 0.1 100 100 + + +4. + + +4. + + I ++ I 102 102 95 95 90 90 + + +3. + + +3. + +2 + +2 90 90 82 82 95 95 + + +3. + + +3. + +2 + +2 1.0 1.0 100 100 4 + +4. 4 + +4. + + 1 + 1 100 100 98 98 92 92 + + 4-4. ++ 4-4. + 1 +1 100 100 94 94 102 102 + + +4, + + +4, + +1 + +1 BSA BSA 1.0 1.0 100 100 + + +4, + + +4, + +1 + +1 99 99 98 98 93 93 + + +4. + + +4. + 1 +1 102 102 96 96 96 96 + + +Χ + + + Χ + +2 + +2 PHG-I PHG-I 0.1 0.1 100 100 + + +4. + + +4. + +1 + +1 96 96 94 94 88 88 + + + 3. + + + 3. + +2 + +2 95 95 85 85 97 97 + + +4. + + +4. + +1 + +1 1.0 1.0 100 100 + + + 4. ++ 4. + + 1 + 1 103 103 97 97 91 91 + + +4. + + +4. + +1 + +1 101 101 93 93 100 100 + + +5 + + +5 HGG HGG 0.1 0.1 100 100 + + +4. + + +4. + + ! + +! 94 94 90 90 87 87 + + +3. + + +3. + 2 + 2 88 88 •80 • 80 93 93 *t- + +3, * t- + +3, + +2 + +2 1.0 1.0 100 100 + + +4. + + +4. + +1 + +1 102 102 97 97 90 90 + + +3. + + +3. + +2 + +2 100 100 90 90 98 98 + + +3, + + +3, + +2 + +2 SPS SPS 0.1 0.1 100 100 + + +4. + + +4. + + 1 + 1 95 95 90 90 87 87 + + +3. + + +3. + +2 + +2 93 93 80 80 90 90 + + +3, + + +3, + +2 + +2 1.0 1.0 100 100 + + +4. + + +4. + + I ++ I 101 101 96 96 90 90 + + +4. + + +4. + 1 +1 100 100 92 92 97 97 ♦ + +4, ♦ +4, + +1 + +1

Az ..in vitrú** jelű oszlopokban szereplő számok az előbbiekben definiált maradék aktivitást jelentik. Az ..in \i\o” jelű oszlopokban szereplő értékek az egerek számát jelölik.The numbers in the columns in ..in vitrus ** represent the residual activity as defined above. The values in the columns in ..in \ i \ o represent the number of mice.

A szimbólumok 4-, + +, stb.) jelentését korábban megadtuk.The meaning of symbols 4, + +, etc.) has been given previously.

HSA: Sigma Chemical Co.. USA termékeHSA: product of Sigma Chemical Co., USA

BSA: Armour Pharmacentical Co.. USA termékeBSA: Product of Armor Pharmacentical Co .. USA

PHG-1: Nippi Co.. Ltd.. Japán terméke (Nagy polimerizáciős fokú zselatin)PHG-1: Nippi Co .. Ltd .. Japan Product (High Polymerization Gelatin)

HGG: Nutritional Biochemicals Corp.. USA termékeHGG: Nutritional Biochemicals Corp. USA

SPS: Sigma Chemical Co., USA terméke.SPS: product of Sigma Chemical Co., USA.

2. példaExample 2

Az 1. példában szereplővel megegyező aktivitású TNF oldat alikvotjaihoz külön-külön, különböző koncentrációban stabilizálószerekct adtunk (HSA, PHG-1, HGG, illetve SPS - azonosak az 1. példában szereplő fehérjekészitményekkel). Az így kapott oldatokat 7 napig4 'C-on tároltuk, majd TNF aktivitásukat az in vitro módszerrel meghatároztuk. A maradék aktivitás számítását az 1. példa szerinti módon végeztük.Aliquots of TNF solution having the same activity as in Example 1 were added separately at different concentrations (HSA, PHG-1, HGG, and SPS - identical to those in Example 1). The resulting solutions were stored at 4 ° C for 7 days and TNF activity was determined in vitro. Residual activity was calculated as in Example 1.

A kapott eredmények az 1-4. ábrákon láthatók.The results obtained are shown in Figures 1-4. .

3. példaExample 3

1,0 x 10® E/mg fajlagos aktivitású, a referencia példa szerinti módon előállított TNF-ből 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 0,1 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,0) 1000 E/ml aktivitású TNF oldatot készítettünk. Az igy kapott oldat alikvotjaihoz két különböző fajta - a különböző albuminok, globulinok, protaminok és zselatinok közül választott stabilizálószert együttesen adtunk hozzá különböző koncentrációkban, a 2. táblázatban szereplő módon. Valamennyi így kapott oldatot 4 *C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro TNF meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást (%) az 1. példa szerinti módon számítottuk.TNF from a specific activity of 1.0 x 10®E / mg, prepared from the Example Example TNF with 0.15M NaCl in 0.1M phosphate buffer, pH 7.0, with 1000U / mL solution. To the aliquots of the solution thus obtained, two different types of stabilizer, selected from different albumins, globulins, protamins and gelatins, were added together at different concentrations as shown in Table 2. All of the resulting solutions were stored at 4 ° C for 7 days and subjected to in vitro TNF determination. Residual TNF activity (%) was calculated as in Example 1.

A kapott eredményeket a 2. táblázat tartalmazza.The results are shown in Table 2.

2. táblázatTable 2

A különböző stabilizáló anyagok hatásaEffect of different stabilizers

Stabilizáló anyag (koncentráció, mg/ml) Stabilizer (concentration, mg / ml) Maradék aktivitás (<) 4 C-on. 7 napig tárolva Residual Activity (<) 4 at C. Stored for 7 days Nincs (kontroll) None (control) 5 5 BSA (0,5)+HSA (0,05) BSA (0.5) + HSA (0.05) 96 96 HSA (0,01)+PHG-1 (0,05) HSA (0.01) + PHG-1 (0.05) 90 90 HPS (0,1) +PHG-1 (0,05) HPS (0.1) + PHG-1 (0.05) 95 95 BGG (1,0)+CEA (1,0) BGG (1.0) + CEA (1.0) 93 93 HGG (0.1) +SPS (0.1) HGG (0.1) + SPS (0.1) 94 94

Megjegyzés:Comment:

BSA, HSA, PHG-1, HGG és SPS megegyeznek az ⁴⁵ 1. példában használt anyagokkal.BSA, HSA, PHG-1, HGG and SPS are the same as those used in Example ⁴⁵ .

HPS: Sigma Chemical Co. termékeHPS: product of Sigma Chemical Co.

BGG: Sigma Chemical Co. termékeBGG: product of Sigma Chemical Co.

CEA: Nutritional Biochemicals Corp. terméke.CEA: Product of Nutritional Biochemicals Corp.

4. példaExample 4

A 3. példában szereplővel megegyező TNF aktivitású oldat alikvotjaihoz stabilizálószerként kü55 lönbözö albuminokat adtunk 1,0 mg/ml koncentrációban. Az így kapott oldatokat 4 °C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék aktivitást (%) az 1. példa szerinti módon számítottuk.Aliquots of a solution having the same TNF activity as in Example 3 were mixed with different albumin at a concentration of 1.0 mg / ml as stabilizing agent. The resulting solutions were stored at 4 ° C for 7 days and then assayed for TNF activity in vitro. Residual activity (%) was calculated as in Example 1.

A kapott eredményeket a 3. táblázat tartalmazza.The results are shown in Table 3.

189 251189,251

J. táblázatTable J.

Λ különböző albuminok stabilizáló hatásaΛ stabilizing effect of various albumins

Stabilizáló anyag Stabilizer Maradék TNF aktivitás (%) 4 ’C-on 7 napig tárolva Residual TNF activity (%) Stored at 4 'C for 7 days nincs (kontroll) none (control) 5 5 HSA HSA 98 98 USA frakció US faction 97 97 BSA BSA 98 98 BSA frakció BSA fraction 98 98 CEA CEA 90 90 BLA BLA 91 91

Megjegyzés:Comment:

HSA, BSA és CEA az 1. és 3. példában szereplő anyagokkal megegyeznek.HSA, BSA and CEA are the same as in Examples 1 and 3.

HSA frakció: emberi szérum albumin frakció (Chon frakció V.) Sigma Chemical Co. termékeHSA fraction: human serum albumin fraction (Chon fraction V.) from Sigma Chemical Co.

BSA frakció: ökör szérum albumin frakció (Chon frakció V.), Sigma Chemical Co. termékeBSA fraction: ox serum albumin fraction (Chon fraction V), product of Sigma Chemical Co.

BLA: Sigma Chemical Co. terméke.BLA: Product of Sigma Chemical Co.

5. példaExample 5

A 3. példában szereplővel megegyező TNF aktivitású oldat alikvotjaihoz stabilizálószerként különféle zselatinokat adtunk, a 4. táblázatban közöltek szerint. 1,0 mg/ml koncentrációban. Az így kapott oldatokat 4 °C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro módszerrel végzett TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást („) az 1. példában ismertetett módon számítottuk. A kapott eredményeket a 4. táblázat tartalmazza.Aliquots of a solution having the same TNF activity as in Example 3 were added with various gelatins as a stabilizer, as shown in Table 4. At a concentration of 1.0 mg / ml. The resulting solutions were stored at 4 ° C for 7 days and then assayed for TNF activity in vitro. Residual TNF activity (") was calculated as in Example 1. The results are shown in Table 4.

4. táblázatTable 4

Különböző zselatinok stabilizáló hatásaStabilizing effect of various gelatins

Stabilizáló anyag Stabilizer Maradék TNF aktivitás (%) 4 ’C-on 7 napig tárolva Residual TNF activity (%) Stored at 4 'C for 7 days Nincs (kontroll) None (control) 4 4 PHG-1 PHG-1 97 97 PHG-2 PHG-2 99 99 PHG-3 PHG-3 99 99 PG PG 96 96

Megjegyzés:Comment:

PHG-I az 1. példában szereplő anyaggal azonos.PHG-I is the same as in Example 1.

PHG-2: Nippi Co., Ltd, termékePHG-2: Product of Nippi Co., Ltd

PHG-3: Sigma Chemical Co. terméke (Gelatin Type IV.: Approx. 60 Bloom)PHG-3: product of Sigma Chemical Co. (Gelatin Type IV .: Approx. 60 Bloom)

PG: Nakarai Chemicals Co., Ltd., Japán terméke.PG: Product of Nakarai Chemicals Co., Ltd., Japan.

6. példaExample 6

A 3. példában szereplővel megegyező TNF aktivitású oldat alikvotjaihoz stabilizálószerként különféle globulinokat adtunk az 5. táblázatban közöltek szerint 1,0 mg/ml koncentrációban. Az így kapott oldatokat 4 ’C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro módszerrel végzett TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást (%) az 1. példában ismertetett módon számítottuk. A kapott eredményeket az 5. táblázat tartalmazza.Aliquots of a solution having the same TNF activity as in Example 3 were mixed with various globulins at a concentration of 1.0 mg / ml as shown in Table 5. The resulting solutions were stored at 4 'C for 7 days and then assayed for TNF activity in vitro. Residual TNF activity (%) was calculated as in Example 1. The results are shown in Table 5.

5. táblázatTable 5

Különböző globulinok stabilizáló hatásaStabilizing effect of various globulins

Stabilizáló anyag Stabilizer Maradék TNF aktivitás („) 4 ’C-on 7 napig tárolva Residual TNF activity (") Stored at 4 'C for 7 days Nincs (kontroll) None (control) 4 4 HGG HGG 97 97 BGG BGG 95 95 Plazmin-kezelt HGG Plasmin-treated HGG 93 93 Pepszin-kezelt HGG Pepsin-treated HGG 94 94 Szulfonált HGG Sulfonated HGG 91 91 HGG frakció HGG fraction 99 99

Megjegyzés:Comment:

HGG és BGG az 1. és 3. példában szereplő anyagokkal azonosak.HGG and BGG are the same as in Examples 1 and 3.

Plazmin-kezelt HGG: Venoglobulin (márkanév), The Green Cross Corporation, Japán termékePlasmin-treated HGG: Venoglobulin (brand name), a product of The Green Cross Corporation, Japan

Pepszin-kezelt HGG: Gamma-Venin (márkanév) HOECHST Japán Ltd termékePepsin-Treated HGG: Gamma-Venin (Brand Name) by HOECHST Japan Ltd

Szulfonált HGG: Venilon (márkanév), ChemoSero-Therapeutic Research Institute, Japán termékeSulfonated HGG: Venilon (brand name), a product of ChemoSero-Therapeutic Research Institute, Japan

HGG. frakció: emberi gamma globulin frakció (Cohn frakció II.), Sigma Chemical Co. terméke.HGG. fraction: human gamma globulin fraction (Cohn fraction II), product of Sigma Chemical Co.

7. példaExample 7

A 3. példában szereplővel megegyező TNF aktivitású oldat alikvotjaihoz stabilizálószerként különféle protaminokat adtunk, a 6. táblázatban közöltek szerint, 1,0 mg/ml koncentrációban. Az így kapott oldatokat 4 *C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro módszerrel végzett TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást (%) az 1. példában ismertetett módon számítottuk. A kapott eredményeket a 6. táblázat tartalmazza.Aliquots of a solution having the same TNF activity as in Example 3 were added with various protamines as a stabilizer at a concentration of 1.0 mg / ml as shown in Table 6. The resulting solutions were stored at 4 ° C for 7 days and then assayed for TNF activity in vitro. Residual TNF activity (%) was calculated as in Example 1. The results are shown in Table 6.

6. táblázatTable 6

Különböző protaminok stabilizáló hatásaStabilizing effect of various protamines

Stabilizáló anyag Stabilizer Maradék TNF aktivitás (%) 4 ’C-on 7 napig tárolva Residual TNF activity (%) Stored at 4 'C for 7 days Nincs (kontroll) None (control) 6 6 SPS SPS 96 96 SPF SPF 93 93 SPP SPP 95 95 HPS HPS 93 93

Megjegyzés:Comment:

SPS és HPS az 1. és 3. példában szereplő anyaggal megegyezik.SPS and HPS are the same as in Examples 1 and 3.

SPF: Sigma Chemical Co. terméke SPP: Sigma Chemical Co. terméke.SPF: product of Sigma Chemical Co. SPP: product of Sigma Chemical Co.

-7189 251-7189 251

8. példaExample 8

1,0 x 10® E/mg fajlagos aktivitású, a referencia példa szerinti módon előállított nyúl TNF-ből 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 0,1 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,0) 100,1000,10 000 és 100 000 E/ml aktivitású oldatokat készítettünk. Az oldatok alikvotjaihoz stabilizálószerként HSA-t adtunk 1,0 mg/ml koncentrációban. Az így kapott oldatokat 4 ’C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro módszerrel végzett TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást (%) az 1. példában ismertetett módon számítottuk. Kontrollként HSA nélküli TNF oldattal is elvégeztük a meghatározást. A kapott eredményeket a 7. táblázat tartalmazza.Rabbit TNF, prepared as described in the Reference Example, having a specific activity of 1.0 x 10®E / mg, in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.0, containing 0.15 M NaCl 100.1000.10 Solutions of 000 and 100,000 U / ml were prepared. Aliquots of the solutions were added with HSA at a concentration of 1.0 mg / ml as a stabilizer. The resulting solutions were stored at 4 'C for 7 days and then assayed for TNF activity in vitro. Residual TNF activity (%) was calculated as in Example 1. As a control, TNF without HSA was also assayed. The results are shown in Table 7.

7. táblásatTable 7

HSA stabilizáló hatásaStabilizing effect of HSA

TN F koncentrációja E ml TN F concentration E ml HSA koncentrációja, mg/ml HSA concentration in mg / ml 0 (kontroll) 0 (control) 1,0 1.0 100 100 3 3 85 85 1000 1000 5 5 98 98 10000 10000 45 45 101 101 100000 100000 48 48 99 99

(A számok a TNF maradék aktivitását fejezik ki %-ban.) összehasonlító példa(Numbers represent% TNF residual activity.) Comparative Example

Az 1. példában szereplővel megegyező TNF aktivitású oldat alikvotjaihoz különféle aminosavakat, fémsókat és kelátképző szereket - amelyek közismert stabilizátorai a közönséges fiziológiailag aktív anyagok oldatainak - adtunk különböző koncentrációban, a 8. táblázatban közöltek szerint. Az igy kapott oldatokat 4 ’C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro módszerrel végzett TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást (%) az 1. példában ismertetett módon számítottuk. A kapott eredményeket a 8. táblázat tartalmazza.Aliquots of a solution having the same TNF activity as in Example 1 were added at various concentrations of various amino acids, metal salts and chelating agents, known as stabilizers of solutions of common physiologically active substances, as shown in Table 8. The resulting solutions were stored at 4 'C for 7 days and subjected to in vitro TNF activity assay. Residual TNF activity (%) was calculated as in Example 1. The results are shown in Table 8.

8. táblázatTable 8

Különböző stabilizáló anyagok stabilizáló hatásuk alapján történő összehasonlításaComparison of different stabilizers based on their stabilizing effect

Maradék TNFResidual TNF

Stabilizáló anyag Koncentráció (/°\ tárolvaStabilizer Concentration (/ ° \ stored

Nincs (kontroll) None (control) 26 26 HSA HSA 1.0 (mg/ml) 1.0 (mg / ml) 98 98 PHG-1 PHG-1 1.0 (mg/ml) 1.0 (mg / ml) 97 97 HGG HGG 1,0 (mg/ml) 1.0 (mg / ml) 97 97 SPS SPS 1,0 (mg/ml) 1.0 (mg / ml) 90 90 Glicin glycine 0,1 (mól/1) 0.1 (mol / l) 30 30 L-Lyzin L-lysine 0,1 (mól/1) 0.1 (mol / l) 28 28 L-Arginin L-Arginine 0,1 (mól/1) 0.1 (mol / l) 24 24 L-Glutamin sav L-Glutamine Sav 0,1 (mól/1) 0.1 (mol / l) 23 23 CaCl₂ CaCl ₂ 1 (nmól/1) 1 (nmol / l) 32 32 MgCl₂ MgCl ₂ 1 (nmól/1) 1 (nmol / l) 32 32 EDTA EDTA 1 (nmól/1) 1 (nmol / l) 26 26

Szabadalmi igénypontokClaims

Claims

Szabadalmi igénypontokClaims

1. Eljárás tumor nekrózis faktor stabil vizes oldat vagy stabil por formában történő előállítására, azzal jellemezve, hogy tumor nekrózis faktorból 10²—10’ TNF-aktivitás-egység/ml-es 5-10 pH-ra pufferolt vizes oldatot készítünk, az oldathoz annak 1 ml-ére számítva 10 gg és 5 mg közötti menynyiségű albumínt vagy zselatint adunk, majd kívánt esetben az igy kapott oldatot liofilizáljuk. (Elsőbbsége: 1982. 04. .07.)CLAIMS 1. A process for preparing tumor necrosis factor in a stable aqueous solution or stable powder, wherein the tumor necrosis factor is prepared in 10 ^{2 to} 10 'TNF activity units / ml buffered to pH 5-10. 10 g to 5 mg of albumin or gelatin per ml thereof are added and the solution thus obtained is lyophilized if desired. (Priority: 04-07-1982)

2. Eljárás tumor nekrózis faktor stabil vizes oldat vagy stabil por formában történő előállítására, azzal jellemezve, hogy tumor nekrózis faktorból 10²-10⁹ TNF-aktivitás-egység/ml-es 5-10 pH-ra pufferolt vizes oldatot készítünk, az oldathoz annak 1 ml-ére számítva 10 gg és 5 mg közötti menynyiségű globulint, protamint vagy protaminsót adunk, majd kívánt esetben az így kapott oldatot liofilizáljuk. (Elsőbbsége: 1982. 07. 27.)2. A process for the preparation of tumor necrosis factor in the form of a stable aqueous solution or a stable powder, wherein the tumor necrosis factor is prepared in an aqueous solution of 10 ^{2 to} 10 ⁹ TNF activity units / ml buffered to pH 5-10. 10 µg to 5 mg of globulin, protamine or protamine salt are added per ml thereof and the solution thus obtained is lyophilized if desired. (Priority: July 27, 1982)

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy stabilizálószerként albumint használunk. (Elsőbbsége: 1982. 04. 07.)3. The process of claim 1, wherein the stabilizer is albumin. (Priority: April 4, 1982)

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy albuminként humán szérum albumint használunk. (Elsőbbsége: 1982. 04. 07.)4. The method of claim 3, wherein the albumin is human serum albumin. (Priority: April 4, 1982)

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy stabilizálószerként zselatint használunk. (Elsőbbsége: 1982. 04. 07.)5. A process according to claim 1 wherein the stabilizer is gelatin. (Priority: April 4, 1982)

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy zselatinként részben hidrolizált, vízben oldódó zselatint használunk. (Elsőbbsége: 1982.04. 07.)6. The process according to claim 5, wherein the gelatin is partially hydrolyzed, water-soluble gelatin. (Priority: 07.04.1982)

7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy stabilizálószerként globulint használunk. (Elsőbbsége: 1982. 07. 27.)7. The process of claim 2, wherein the stabilizer is globulin. (Priority: July 27, 1982)

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy globulinként humán gamma globulint vagy annak valamilyen származékát használjuk. (Elsőbbsége: 1982. 07. 27.)8. The method of claim 7, wherein the globulin is human gamma globulin or a derivative thereof. (Priority: July 27, 1982)

9. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy stabilizálószerként protamint vagy valamilyen protaminsót használunk. (Elsőbbsége: 1982. 07. 27.)9. The process of claim 2, wherein the stabilizer is protamine or a protamine salt. (Priority: July 27, 1982)

10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a stabilizálószert 100 gg és 5 mg közötti mennyiségben adjuk a tumor nekrózis faktor 10²-10^Q egység/ml aktivitású vizes oldatához, annak egy milliliterére számítva. (Elsőbbsége: 1982. 04. 07.)10. A method according to claim 1, characterized in that the stabilizer is added in an amount between 5 mg and 100 gg of the tumor necrosis factor of 10 ² -10 ^Q units / ml of activity in aqueous solution, in per milliliter. (Priority: April 4, 1982)