JP3870248B2 - Lactic acid non-utilizing killer yeast - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サイレージの好気的変敗を防止するための乳酸非資化性キラー酵母、その酵母の作出のために用いられるプラスミド、およびその酵母を用いるサイレージの変敗防止方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
サイレージは、草を乳酸発酵して保存性を高めた反芻家畜の飼料である。サイレージの保存性のためには「酸性」および「嫌気」の両条件が必要である。この一方が崩れた場合、サイレージは変質する。
【０００３】
サイロが開封されると、サイレージは好気的条件に曝される。この好気条件により、好気性微生物が乳酸および水溶性炭水化物をＣＯ₂ガスに分解し、タンパク質およびアミノ酸をアミン、アミド、およびアンモニアに分解し、そして呼吸熱を発生し、その結果、温度およびｐＨが上昇する。酵母およびカビ（糸状菌）はサイレージ中の乳酸を資化することによりｐＨを上昇させる。その結果腐敗の原因となる細菌類が急増し、サイレージを腐敗させる。変敗飼料は栄養価および家畜の嗜好性が低下するため、家畜飼養上大きな問題となっている。
【０００４】
このようなサイレージの好気的変敗は、酵母の乳酸代謝が第一の原因であると考えられる。サイロ開封時にサイレージ中に乳酸資化性酵母が１０⁵細胞／ｇ（乾燥重量）以上存在すると好気的変敗が急速に進むが、乳酸資化性酵母が存在しない場合、乳酸非資化性酵母の数がそれ以上存在しても好気的変敗は起こらないことが報告されている（Jonsson, A.およびG. Pahlow, Anim. Res. Dev. 20(1984)7）。
【０００５】
本発明者は、キラー酵母を用いて、変敗の原因となる乳酸資化性の野生酵母類の増殖を抑制することによりサイレージの好気的変敗を防止することを提案した。キラー酵母には、それ自身が生産するタンパク性物質により他の酵母の生育を抑制する作用がある。このキラー酵母をサイレージに用いた場合の模式図を図１に示す。しかし、このキラー酵母自体もまた乳酸資化性であり、サイレージのｐＨを上昇させ得ることが分かった（J. Dairy Sci., 76(1993)803-811）。従って、サイレージの好気的変敗を防ぐための具体的な方法がないのが現状である。
【０００６】
好気条件下における酵母の糖代謝の略図を図２に示す。酵母の乳酸代謝系では、乳酸が乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）によってピルビン酸に変換され、ＴＣＡサイクルを通って炭酸ガスと水に分解される。従って、ＬＤＨ活性を失った酵母は乳酸を炭素源として利用できない。しかし、ＬＤＨには複数のアイソザイムが存在しており、ＬＤＨの欠損株を作製することは困難である。
【０００７】
他方、酵母は、グルコースを炭素源とした場合は、解糖系、ＴＣＡサイクルを経てエネルギーを得る。乳酸を炭素源とした場合、菌体が生育するにはグルコースを再合成して細胞骨格を合成する必要がある。このグルコースの再合成は解糖系の逆行であり、糖新生系として知られている。糖新生系は、オキサロ酢酸からホスホエノールピルビン酸を生成するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（以下、ＰＥＰＣＫと称する）によって制御される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このＰＥＰＣＫに注目し、ＰＥＰＣＫの作用を破壊させることにより糖新生系をブロックし、乳酸を炭素源として生育しないキラー酵母を得、サイレージの好気的変敗を防止することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＰＥＰＣＫ遺伝子を欠損する乳酸非資化性キラー酵母を提供する。
【００１０】
好ましい実施態様では、上記キラー酵母は、K. lactisである。
【００１１】
好ましい実施態様では、上記乳酸非資化性キラー酵母は遺伝子工学的に得られる。
【００１２】
本発明はまた、乳酸非資化性キラー酵母を作製する方法を提供する。この方法は、ＰＥＰＣＫ遺伝子をクローニングする工程；ＰＥＰＣＫ遺伝子を改変する工程；および上記改変ＰＥＰＣＫ遺伝子をキラー酵母に導入する工程を包含する。
【００１３】
本発明はまた、宿主に乳酸非資化性を与えるプラスミドを提供する。このプラスミドは改変されたＰＥＰＣＫ遺伝子を有する。
【００１４】
好ましい実施態様では、上記改変されたＰＥＰＣＫ遺伝子は、該ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢａｍＨＩ部位にマーカー遺伝子が挿入されることにより得られる。
【００１５】
別の好ましい実施態様では、上記改変されたＰＥＰＣＫ遺伝子は、該ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢｇｌＩＩ断片が欠失されて、代わりにマーカー遺伝子が挿入されることにより得られる。
【００１６】
本発明はまた、サイレージの好気的変敗を防止する方法を提供する。この方法は、上記乳酸非資化性キラー酵母をサイレージに添加する工程を包含する。
【００１７】
好ましい実施態様では、上記方法は、サイレージにさらにラクトースを添加する工程を包含する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、サイレージの好気的変敗を防止するための乳酸非資化性キラー酵母を提供する。本発明における「乳酸非資化性」酵母とは、厳密に言うと乳酸を炭素源として生育できない酵母である。この酵母は、糖新生系がブロックされているが乳酸→ＴＣＡ回路は働くので自らは乳酸を資化し得るが、乳酸を炭素源として生育することができない。
【００１９】
キラー酵母とは、他の酵母の生育を選択的に抑制するタンパク性（糖タンパク質もまた包含する）のキラートキシンを生産する酵母をいう。本発明で用いられるキラー酵母は、サイレージの好気的変敗に関わる野生酵母類の増殖を抑制する菌株であればいずれでも用いられ得る。例えば、Ｋ₁タイプキラー酵母菌株、Kluyvelomyces lactis IFO1267株、Hansenula mrakii IFO0895株、Hansenula mrakii IFO0897株などが挙げられる。好ましくは、K. lactis IFO1267株およびHansenula mrakii IFO0897株が用いられ、この２株は、野生酵母類に関して幅広いスペクトルを有し、そしてキラー活性が共に酸性側で強く働く。最も好ましくは、K. lactis IFO1267株が用いられる。その理由は以下の通りである。このK. lactis IFO1267株は、キラースペクトルの幅が広いだけでなく、即効性である。さらに、このK. lactis IFO 1267株は、ラクトースを資化および発酵する。K. lactis IFO 1267株は、炭素源としてラクトースを用いることにより、ラクトース非資化性酵母に対するキラー活性が増大することが知られている（J. Dairy Sci. 76(1993)803-811）。他方、酵母の多くはラクトースを炭素源として利用できない。サイレージの詰め込み時にラクトースとラクトース資化性キラー酵母を添加すれば、ラクトースによる乳酸菌の活性化が期待され、同時に野生酵母の増殖を選択的に抑制することが可能であると考えられる。
【００２０】
以下、本発明をK. lactis IFO1267株を例にして説明する。まずＰＥＰＣＫ遺伝子のクローニングを行う。Saccharomyces cerevisiaeのＰＥＰＣＫ遺伝子ＰＣＫ１の塩基配列（R. Stuckaら、Nucleic Acids Res. 16(1988)10926）に基づいてＰＣＲで拡大したプローブを用い、K. lactis IFO1267株のゲノミックサザンハイブリダイゼーションを行う。得られたバンドを切り出して、これを酵母ｐＹＣ型ベクターに挿入したプラスミドをＰＣＫ１欠損S. cerevisiaeに形質転換する。これにより、乳酸を唯一の炭素源とする培地に生育する形質転換体が得られる。この形質転換体はＰＥＰＣＫ活性を回復する。S. cerevisiaeで相補したことにより、このDNA断片はK. lactis IFO1267株のＰＥＰＣＫ遺伝子ＫｌＰＣＫ１を含むことが確認される。
【００２１】
次に、ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊を行う。ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊は、以下のようにして行われ得る。上記のようにクローニングしたＰＥＰＣＫ遺伝子ＫｌＰＣＫ１を、挿入、欠失などの変異を生じさせて遺伝子として働き得ないように改変する。この改変遺伝子を保有するプラスミド（ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラスミド）を作製し、これをK. lactisに遺伝子導入する。この遺伝子の導入は、例えば、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法などのいずれの公知の方法によっても行われ得る。改変遺伝子を導入すると、ＰＥＰＣＫ遺伝子の部分で染色体相同組換えが起こり、その結果遺伝子破壊を生じる。得られた形質転換酵母は乳酸を炭素源として利用し得ない。
【００２２】
ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラスミドとしては、ｐＫＰ１およびｐＫＰ２の２つのプラスミドが挙げられる。この両プラスミドは、K. lactisのＰＥＰＣＫ遺伝子の内部にマーカー遺伝子が挿入されているプラスミドである。ｐＫＰ１は、ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢａｍＨＩ部位にマーカー遺伝子が挿入されている挿入型プラスミドである。ｐＫＰ２は、ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢｇｌＩＩ断片が欠失されて、代わりにマーカー遺伝子が挿入されている欠失型プラスミドである。本発明で用いられ得るマーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質Ｇ４１８耐性、セルレニン耐性、シクロヘキシミド耐性、またはエチオニン耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。これらのＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラスミドを用いることにより、安定した遺伝子破壊が得られ得る。
【００２３】
上記のようにして得られたＰＥＰＣＫ欠損キラー酵母は、乳酸を炭素源として生育しないが、キラー活性および糖を炭素源とした生育は元のキラー酵母と変わりがない。従って、このキラー酵母を用いることにより、サイレージの好気的変敗は十分に防止され得る。
【００２４】
本発明によるサイレージの好気的変敗を防止する方法は、上記の乳酸非資化性キラー酵母をサイレージに添加する工程を包含する。サイレージは、酸性および嫌気条件下で調製され得るので、乳酸非資化性キラー酵母は、サイレージの調製開始時に添加され得る。好ましくは、上記サイレージに、乳酸非資化性キラー酵母とラクトースとを添加する工程を包含する。サイレージの酸性および嫌気条件を維持するために、ラクトースおよびラクトース資化性キラー酵母は、サイレージの調製開始時に同時に添加され得る。多くの野生酵母はラクトース非資化性である。従って、サイレージの詰め込み時にラクトースとラクトース資化性キラー酵母とを添加すれば、ラクトースによる乳酸菌の活性化が期待され、同時に野生酵母の増殖を選択的に抑制し得る。
【００２５】
本発明に従えば、サイレージの好気的変敗が好都合に防止され得る。キラー酵母の乳酸発酵が抑制されるため、好気的変敗の原因となる野生酵母類の増殖は、乳酸非資化性キラー酵母によって適切に抑制され得る。キラー酵母に加えてラクトースをサイレージに添加することにより、キラー酵母のキラー活性が強まり、そして乳酸菌の活動が活性化され得る。
【００２６】
以下、本発明を実施例によって説明するが、本発明は実施例に限定されない。
【００２７】
【実施例】
（実施例１ K. lactis IFO1267株ＰＥＰＣＫ遺伝子のクローニング）
プローブは、S. cerevisiaeのＰＥＰＣＫ遺伝子ＰＣＫ１の塩基配列（R. Stuckaら、Nucleic Acids Res. 16(1988)10926）に基づいて、S. cerevisiae YNN27株ゲノムDNAをテンプレートとし、プライマー１ 5' ATAGGGCCCATGTCCCCTTCTAAAATGAATGCTA 3'およびプライマー２ 5' CGCAAGCTTCTAACATGTTTCGTTTACTCGAATT 3'を用いてＰＣＲにより作製した。作製したプローブを用い、常法に従って（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第２版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press）、ECL direct nucleic acid labelling and detection system (Amersham) によりK. lactis IFO1267株のゲノミックサザンハイブリダイゼーションを行った。得られたバンドを切り出して、プラスミドベクターBluescriptII KS⁺（ストラタジーン社製）にライゲーションした。ＰＣＫ１をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション（DIG標識核酸検出キット；ベーリンガーマンハイム製：Colliquium 2(1992)8）でＰＣＫ１と相同性の高い遺伝子断片ＫｌＰＣＫ１がサブクローニングされたプラスミドを含むコロニーをスクリーニングした。ＫｌＰＣＫ１を切り出して、これを酵母ｐＹＣ型ベクターに挿入したプラスミドをＰＣＫ１欠損S. cerevisiaeに酢酸リチウム法（Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K.およびKimura, A., Journal of Bacteriology 153(1983)163）で形質転換した。形質転換株を乳酸カルシウム（０．５ｇ／Ｌ）を炭素源として含有する最少培地に接種して増殖させたところ、この株は、乳酸を唯一の炭素源とする培地で生育した。さらに、得られた形質転換株の酵素活性を測定した。この形質転換株を、グルコースを炭素源とした培地（イーストナイトロジェンベースｗ／ｏアミノ酸６．７ｇ／Ｌ）において３０℃で二夜振盪培養し、次いで滅菌水で洗浄した。この菌体を、ＰＥＰＣＫ遺伝子の発現を誘導する条件である、エタノール（２％ｗ／ｖ）を炭素源とした培地（イーストナイトロジェンベースｗ／ｏアミノ酸６．７ｇ／Ｌ）中で培養し、次に菌体をガラスビーズで破砕した後遠心分離して、細胞抽出液を得た。コントロールとして、エタノールの代わりにグルコースを用いた培地中での培養もまた行った。得られた細胞抽出液中のタンパク質量をプロテインアッセイキット（BioRad）を用いて定量した。細胞抽出液中のＰＥＰＣＫ活性はJavier PereaおよびCarlos Gancedo, Arch Microbiol 132(1982)141-143に記載の方法の改法に従い、以下のように測定した。イミダゾール溶液（ｐＨ７．０）（１００ｍＭ イミダゾール、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ₃、４ｍＭ ＭｎＣｌ₂、および４ｍＭ グルコースを含有する）２８３８μＬ、還元グルタチオン溶液（１μmol還元グルタチオン、１μmolＡＤＰ、０．５μmolＮＡＤＨ、および0.1μmolＰＥＰを含有する）１００μＬ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー１２７２４８）４μＬ（４．８ｕ）、およびヘキソキナーゼ（ベーリンガー１２７１７５）８μＬ（２．４ｕ）を３０℃で３分間混合した。次いで、この混合液に５０μＬの細胞抽出液を添加し、ＰＥＰＣＫ活性を、３４０ｎｍでの吸光度を３０℃で３０分間経時的に測定することにより得た。この形質転換体はＰＥＰＣＫ活性を回復した。S. cerevisiaeで相補したことにより、このDNA断片はK. lactis IFO1267株のＰＥＰＣＫ遺伝子ＫｌＰＣＫ１を含むことが分かった。
【００２８】
（実施例２ ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラスミドの構築）
ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラスミドを以下のように構築した。実施例１により得られたK. lactis IFO1267株由来のＰＥＰＣＫ遺伝子ＫｌＰＣＫ１をコードする約４．８Ｋｂ ＥｃｏＲＩゲノムフラグメントを、あらかじめマルチクローニング部位内のＢａｍＨＩ部位を欠失させた、またはもとのままのプラスミドベクターBluescript II KS+（ストラタジーン社製）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。次に、これらの組換えプラスミドを挿入断片内のＢａｍＨＩ部位（上記ＥｃｏＲＩフラグメント内に１ヶ所存在する）またはＢｇｌＩＩ部位（同フラグメント内に２ヶ所存在する）で切断し、そこにプラスミドｐＹＣＤＥ−ΔＧ１１（T. Ogataら, J. Gen. Appl. Microbiol., 39(1993)285-294）中の、Saccharomyces cerevisiae由来のＡＤＨ１プロモーターおよびEscerichia coli由来のカナマイシン耐性遺伝子（ＡＰＴ２）を含む３．４ＫｂのＢａｍＨＩ断片を挿入することにより、ｐＫＰ１およびｐＫＰ２を得た。図３に示すように、前者はマーカー遺伝子としてのＡＰＴ２フラグメントがK. lactis由来のフラグメントに挿入された形になっており、また後者はK. lactis由来のフラグメントの一部が欠失してＡＰＴ２フラグメントで置換された形となっている。
【００２９】
（実施例３ 遺伝子破壊用プラスミドをキラー酵母K. lactisへの導入）
実施例２で構築したプラスミドＤＮＡを、エレクトロポーレーション法は、Manuel Sanchezら, Appl. Environ. Microbiol., 59(1993)2087-2092に記載の方法の改法に従い、K. lactis IFO1267株に形質転換した。すなわち、試験管内で菌体をＹＥＤ培地５ｍＬにおいて３０℃で一夜振盪培養し、次いでこの菌体を３００ｍＬ容三角フラスコ中でＹＥＤ培地３０ｍＬにおいて３０℃で３．５時間振盪培養した。次いでこの菌体を冷水で２回洗浄した後、ＹＥＤ、２５ｍＭ ＤＴＴ（ＹＥＤ７８０ｍＬ、１Ｍ ＤＴＴ ２０μＬ）を含む培地で３０℃で３０分間、１００ｒｐｍで振盪した。得られた菌体を冷水で２回、次いでエレクトロポーレーション緩衝液（１ｍＭ Tris ＨＣｌ(ｐＨ７．５）、２７０ｍＭスクロース、および１ｍＭ ＬｉＯＡｃを含有する）で洗浄し、そしてこのエレクトロポーレーション緩衝液２００μＬに懸濁した。この懸濁液に実施例１で構築したプラスミドＤＮＡ１μＬを添加し、氷上で１５分間静置した。細胞／ＤＮＡ混合液を、４ＫＶ／ｃｍ（２００Ｖ／０．５ｍｍ）、１６ｍＳの条件でエレクトロポーレーションにかけた。処理した菌体を１ｍＬのＹＰＤ培地中に懸濁して氷上で１５分間静置し、次いで３０℃で６時間インキュベートした後、Ｇ４１８（０．１ｍｇ／ｍＬ）および寒天（２０ｇ／Ｌ）を含むＹＰＤ培地上に広げ、３０℃で７２時間インキュベートした。出現したＧ４１８耐性コロニーを、乳酸カルシウム（５ｇ／Ｌ）を含有する最少寒天培地（イーストナイトロジェンベースｗ／ｏアミノ酸６．７ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ）にレプリカし、そこで生育しない形質転換株を選択した。形質転換実験の結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】

【００３１】
これらの形質転換体の中から各シリーズについて１株ずつ選択し、それらを遺伝子破壊が導入された候補株として、以下でより詳細な検討を実施した。
【００３２】
（実施例４ 形質転換体の特徴付け）
１）ゲノムサザン解析：実施例３で導入された改変ＰＥＰＣＫ遺伝子の存在様式を調べる目的で下記のようにサザン解析を実施した。２種の形質転換体および野生株K.lactis IFO1267株から抽出したゲノムＤＮＡ各１０μｇならびに形質転換に使用した２種のプラスミドＤＮＡ各１０ｎｇを、ＥｃｏＲＩで切断後アガロースゲル電気泳動し、ペルオキシダーゼで標識したＰＥＰＣＫ遺伝子を含む約４．８Ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントをプローブとして、常法に従って（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第２版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press）、ECL direct nucleic acid labelling and detection system (Amersham) によりサザン解析を実施した。図４に示すように、形質転換体由来のゲノムＤＮＡは、それぞれ遺伝子破壊に使用したプラスミドＤＮＡと同じハイブリダイゼーションパターンを示し、このことから、遺伝子破壊用プラスミド内の挿入フラグメントがK. lactisゲノムに導入前の形態を維持して導入されていることが確認された。
【００３３】
２）染色体解析：導入された改変遺伝子の染色体上の位置を、以下の手順で検討した。野生株および２種の形質転換体について、２×１０⁹細胞／ｍＬのプロトプラストを含むアガロースプラグを、１％低融点ゲル（BioRad 162-0102）、１５ｃｍのウエルに充填し、パルスフィールド電気泳動装置（BioRad社製、CHEF-DRII）を用いて、９〜１０℃、１３０Ｖで、パルス時間１００秒で１６時間、次いでイニシャルパルス時間１８０秒およびファイナルパルス時間３６０秒で５１時間、そしてパルス時間３６０秒で６時間電気泳動した。電気泳動後、ＰＥＰＣＫ遺伝子を含む４．８Ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントまたはＡＰＴ２遺伝子を含む３．４Ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントをプローブとして上記１）のようにサザン解析した。図５に示すように、ＡＰＴ２遺伝子を含むフラグメントは、形質転換体由来のゲノムＤＮＡではＰＥＰＣＫ遺伝子を含むフラグメントと同じ１番染色体にハイブリダイズしたが、野生株由来のＤＮＡにはハイブリダイズしなかった。この結果および上記１）の結果から、ＡＰＴ２遺伝子フラグメントによる挿入または欠失（置換）がK.lactisゲノムのＰＥＰＣＫ遺伝子内に導入されていることが確認された。
【００３４】
３）ＰＥＰＣＫ活性の測定：試験管内でのＰＥＰＣＫ遺伝子フラグメント中の挿入または欠失（置換）の、キラー酵母K.lactis宿主のＰＥＰＣＫ遺伝子の発現に及ぼす影響を、形質転換体の産生するＰＥＰＣＫ活性を測定することにより検討した。ＰＥＰＣＫ活性は、上述の実施例１と同様にして測定した。以下の表２に示すように、野生株に比較して形質転換株ではＰＥＰＣＫ活性はほとんど発現されなかった。
【００３５】
【表２】

【００３６】
４）炭素源資化性：ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊の乳酸資化性に及ぼす影響を下記のように調べた。２種の形質転換体および野生株を乳酸またはラクトース（それぞれ２０ｇ／Ｌ）を炭素源として含有する最少培地に接種して、増殖させた。この結果を図６に示す。図中、▲は野生株の乳酸培地培養、●は野生株のラクトース培地培養、△は形質転換体の乳酸培地培養、そして○は形質転換体のラクトース培地培養を表す。図６に示すように、糖であるラクトースを含有する培地中では、形質転換体は野生株と同様に増殖した。一方、乳酸を炭素源として含有する培地中では、野生株は良好な増殖を示すのに対して、形質転換体は増殖しなかった。また形質転換体をＹＰＤ培地中で非選択条件下で約２０世代培養した後、乳酸非資化性およびＧ４１８耐性の形質について調べたところ、それぞれの株は両形質を安定に１００％維持していた。これらの結果は、形質転換体ゲノム中のＰＥＰＣＫ遺伝子破壊によりこれらの株の乳酸資化性が失われ、また遺伝子破壊が安定に維持されていることを示唆した。
【００３７】
５）キラー活性の確認：形質転換体および野生株のキラー活性を、検定菌としてSaccharomyces cerevisiae IFO0304株を使用して、緩衝化メチレンブルー培地（ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、メチレンブルー０．３ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、１／１０McIlvaine緩衝液（McIlvaine, T.C., J. Biol. Chem. 49(1921)183））上で２５℃２日間好気的に培養した後観察することにより確認した。図７に示すように、形質転換体のキラー活性は宿主である野生株と同程度に維持されていることが確認された。
【００３８】
【発明の効果】
本発明に従えば、サイレージの好気的変敗が好都合に防止され得る。キラー酵母の乳酸発酵が抑制されるため、好気的変敗の原因となる野生酵母類の増殖は、乳酸非資化性キラー酵母によって適切に抑制され得る。キラー酵母に加えてラクトースをサイレージに添加することにより、キラー酵母のキラー活性が強まり、そして乳酸菌の活動が活性化され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、サイレージの好気的変敗およびキラー酵母による防止を示す模式図である。
【図２】図２は、好気条件における酵母の糖代謝を示す模式図である。
【図３】図３は、遺伝子破壊用プラスミド中の挿入フラグメントの構造を示す模式図である。
【図４】図４は、形質転換体および野生株ゲノムＤＮＡ内での改変ＰＥＰＣＫ遺伝子の存在状態を調べるためのサザン解析を示す電気泳動写真である。
【図５】図５は、形質転換体および野生株染色体における改変ＰＥＰＣＫ遺伝子の存在位置を調べるためのサザン解析を示す電気泳動写真である。
【図６】図６は、形質転換体および野生株のラクトースおよび乳酸を炭素源とした場合の増殖を示すグラフである。
【図７】図７は、形質転換体および野生株の検定菌に対するキラー活性を示す生物形態写真である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a lactic acid non-utilizing killer yeast for preventing aerobic degradation of silage, a plasmid used for producing the yeast, and a method for preventing silage degradation using the yeast.
[0002]
[Prior art]
Silage is a feed for ruminants that has been preserved by lactic fermentation of grass. Both “acidic” and “anaerobic” conditions are necessary for preserving silage. If one of these collapses, the silage will be altered.
[0003]
When the silo is opened, the silage is exposed to aerobic conditions. This aerobic condition causes aerobic microorganisms to break down lactic acid and water-soluble carbohydrates into CO ₂ gas, break down proteins and amino acids into amines, amides, and ammonia, and generate respiratory fever, resulting in temperature and pH Rises. Yeast and mold (filamentous fungi) raise the pH by assimilating lactic acid in silage. As a result, the number of bacteria causing rot increases rapidly, causing silage to rot. Deteriorated feed has become a major problem for livestock breeding because of reduced nutritional value and preference for livestock.
[0004]
Such aerobic degradation of silage is considered to be mainly caused by lactic acid metabolism in yeast. When lactic acid-assimilating yeast is present in silage at 10 ⁵ cells / g (dry weight) or more at the time of opening the silo, aerobic degradation progresses rapidly, but in the absence of lactic acid-assimilating yeast, lactic acid non-assimilating ability It has been reported that aerobic degradation does not occur in the presence of more yeast (Jonsson, A. and G. Pahlow, Anim. Res. Dev. 20 (1984) 7).
[0005]
The present inventor has proposed that killer yeast is used to prevent silage aerobic degradation by inhibiting the growth of lactic acid-assimilating wild yeasts that cause degradation. Killer yeast has an action of suppressing the growth of other yeasts by a protein substance produced by itself. A schematic diagram when this killer yeast is used for silage is shown in FIG. However, it has been found that this killer yeast itself is also lactic acid assimilating and can raise the pH of silage (J. Dairy Sci., 76 (1993) 803-811). Therefore, there is currently no specific method for preventing silage aerobic degradation.
[0006]
A schematic diagram of yeast sugar metabolism under aerobic conditions is shown in FIG. In the lactic acid metabolism system of yeast, lactic acid is converted into pyruvic acid by lactate dehydrogenase (LDH), and decomposed into carbon dioxide and water through the TCA cycle. Therefore, yeast that has lost LDH activity cannot use lactic acid as a carbon source. However, LDH has a plurality of isozymes, and it is difficult to produce an LDH-deficient strain.
[0007]
On the other hand, when glucose is used as a carbon source, yeast obtains energy through a glycolytic system and a TCA cycle. When lactic acid is used as a carbon source, it is necessary to re-synthesize glucose to synthesize cytoskeleton in order for the cells to grow. This resynthesis of glucose is the reverse of glycolysis and is known as gluconeogenesis. The gluconeogenic system is controlled by phosphoenolpyruvate carboxykinase (hereinafter referred to as PEPCK) that generates phosphoenolpyruvate from oxaloacetate.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention focuses on this PEPCK and aims to block the gluconeogenic system by destroying the action of PEPCK, to obtain killer yeast that does not grow using lactic acid as a carbon source, and to prevent aerobic degradation of silage. And
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides a lactic acid non-assimilating killer yeast lacking the PEPCK gene.
[0010]
In a preferred embodiment, the killer yeast is K. lactis.
[0011]
In a preferred embodiment, the lactic acid non-assimilating killer yeast is obtained by genetic engineering.
[0012]
The present invention also provides a method for producing a lactic acid non-assimilating killer yeast. This method includes the steps of cloning the PEPCK gene; modifying the PEPCK gene; and introducing the modified PEPCK gene into killer yeast.
[0013]
The present invention also provides a plasmid that confers lactate non-assimilability to a host. This plasmid has a modified PEPCK gene.
[0014]
In a preferred embodiment, the modified PEPCK gene is obtained by inserting a marker gene into the BamHI site of the PEPCK gene.
[0015]
In another preferred embodiment, the modified PEPCK gene is obtained by deleting the BglII fragment of the PEPCK gene and inserting a marker gene instead.
[0016]
The present invention also provides a method for preventing aerobic degradation of silage. This method includes the step of adding the lactic acid non-assimilating killer yeast to silage.
[0017]
In a preferred embodiment, the method includes adding additional lactose to the silage.
[0018]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention provides a lactic acid non-assimilating killer yeast for preventing aerobic deterioration of silage. Strictly speaking, the “lactic acid non-assimilating” yeast in the present invention is a yeast that cannot grow using lactic acid as a carbon source. Although this yeast has a gluconeogenic system blocked, the lactic acid → TCA circuit works, so that it can assimilate lactic acid by itself, but cannot grow using lactic acid as a carbon source.
[0019]
Killer yeast refers to yeast that produces proteinaceous (including glycoproteins) killer toxin that selectively inhibits the growth of other yeasts. The killer yeast used in the present invention may be any strain as long as it suppresses the growth of wild yeasts involved in silage aerobic degradation. For example, K ₁ type killer yeast strain, Kluyvelomyces lactis IFO1267 strain, Hansenula mrakii IFO0895 strain, and the like Hansenula mrakii IFO0897 strain. Preferably, the strains K. lactis IFO1267 and Hansenula mrakii IFO0897 are used, these two strains have a broad spectrum with respect to wild yeasts, and both killer activities work strongly on the acidic side. Most preferably, K. lactis IFO1267 strain is used. The reason is as follows. This K. lactis IFO1267 strain not only has a wide killer spectrum, but also has an immediate effect. Furthermore, this K. lactis IFO 1267 strain assimilate and ferment lactose. K. lactis IFO 1267 strain is known to increase killer activity against lactose non-assimilating yeast by using lactose as a carbon source (J. Dairy Sci. 76 (1993) 803-811). On the other hand, many yeasts cannot use lactose as a carbon source. If lactose and lactose-utilizing killer yeast are added at the time of silage packing, activation of lactic acid bacteria by lactose is expected, and at the same time, growth of wild yeast can be selectively suppressed.
[0020]
Hereinafter, the present invention will be described by taking the K. lactis IFO1267 strain as an example. First, the PEPCK gene is cloned. Genomic Southern hybridization of K. lactis IFO1267 strain is carried out using a probe expanded by PCR based on the nucleotide sequence of PEPCK gene PCK1 of Saccharomyces cerevisiae (R. Stucka et al., Nucleic Acids Res. 16 (1988) 10926). The obtained band is cut out and a plasmid in which this band is inserted into a yeast pYC type vector is transformed into PCK1-deficient S. cerevisiae. Thereby, a transformant that grows on a medium containing lactic acid as the sole carbon source is obtained. This transformant restores PEPCK activity. Complementation with S. cerevisiae confirms that this DNA fragment contains the PEPCK gene KlPCK1 of the K. lactis IFO1267 strain.
[0021]
Next, PEPCK gene disruption is performed. PEPCK gene disruption can be performed as follows. The PEPCK gene KlPCK1 cloned as described above is modified so that it cannot function as a gene by causing mutations such as insertion and deletion. A plasmid carrying the modified gene (PEPCK gene disruption plasmid) is prepared and introduced into K. lactis. This gene can be introduced by any known method such as the spheroplast method, the lithium acetate method, the electroporation method, or the particle gun method. When a modified gene is introduced, chromosomal homologous recombination occurs at the PEPCK gene portion, resulting in gene disruption. The resulting transformed yeast cannot use lactic acid as a carbon source.
[0022]
Examples of PEPCK gene disruption plasmids include two plasmids, pKP1 and pKP2. Both of these plasmids are plasmids in which a marker gene is inserted into the PEPCK gene of K. lactis. pKP1 is an insertion type plasmid in which a marker gene is inserted into the BamHI site of the PEPCK gene. pKP2 is a deletion plasmid in which the BglII fragment of the PEPCK gene is deleted and a marker gene is inserted instead. Examples of marker genes that can be used in the present invention include, but are not limited to, antibiotic G418 resistance, cerulenin resistance, cycloheximide resistance, or ethionine resistance genes. Stable gene disruption can be obtained by using these plasmids for PEPCK gene disruption.
[0023]
The PEPCK-deficient killer yeast obtained as described above does not grow using lactic acid as a carbon source, but killer activity and growth using sugar as a carbon source are the same as the original killer yeast. Therefore, aerobic deterioration of silage can be sufficiently prevented by using this killer yeast.
[0024]
The method for preventing aerobic deterioration of silage according to the present invention includes the step of adding the above-mentioned non-lactic acid-assimilating killer yeast to silage. Since silage can be prepared under acidic and anaerobic conditions, lactic acid non-utilizing killer yeast can be added at the start of silage preparation. Preferably, the method includes the step of adding lactic acid non-assimilating killer yeast and lactose to the silage. In order to maintain silage acidity and anaerobic conditions, lactose and lactose-utilizing killer yeast can be added simultaneously at the start of silage preparation. Many wild yeasts are lactose non-assimilable. Therefore, if lactose and lactose-utilizing killer yeast are added at the time of silage packing, activation of lactic acid bacteria by lactose can be expected, and at the same time, growth of wild yeast can be selectively suppressed.
[0025]
According to the present invention, aerobic degradation of silage can be advantageously prevented. Since lactic acid fermentation of killer yeast is suppressed, the growth of wild yeasts that cause aerobic degradation can be appropriately suppressed by lactic acid non-assimilating killer yeast. By adding lactose to silage in addition to killer yeast, the killer activity of killer yeast is enhanced and the activity of lactic acid bacteria can be activated.
[0026]
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not limited to an Example.
[0027]
【Example】
(Example 1 Cloning of K. lactis IFO1267 strain PEPCK gene)
Based on the nucleotide sequence of the PEPCK gene PCK1 of S. cerevisiae (R. Stucka et al., Nucleic Acids Res. 16 (1988) 10926), the probe was used as a template for the primer 1 5 ′ ATAGGGCCCATGTCCCCTTCTAAAATGAATGCTA 3 'And primer 25' were prepared by PCR using CGCAAGCTTCTAACATGTTTCGTTTACTCGAATT 3 '. Using the prepared probe and according to a conventional method (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press), ECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham) Genomic Southern hybridization of the strain was performed. The obtained band was cut out and ligated to the plasmid vector BluescriptII KS ⁺ (Stratagene). Using PCK1 as a probe, colonies containing a plasmid in which a gene fragment KlPCK1 having a high homology with PCK1 was subcloned were screened by colony hybridization (DIG-labeled nucleic acid detection kit; manufactured by Boehringer Mannheim: Colliquium 2 (1992) 8). A plasmid in which KlPCK1 was cut out and inserted into a yeast pYC type vector was transformed into PCK1-deficient S. cerevisiae using the lithium acetate method (Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. and Kimura, A., Journal of Bacteriology 153 (1983) 163). When the transformed strain was inoculated and grown in a minimal medium containing calcium lactate (0.5 g / L) as a carbon source, the strain grew on a medium containing lactic acid as the sole carbon source. Furthermore, the enzyme activity of the obtained transformant was measured. This transformed strain was cultured by shaking at 30 ° C. overnight in a medium containing glucose as a carbon source (east nitrogen base w / o amino acid 6.7 g / L) and then washed with sterilized water. The cells are cultured in a medium (east nitrogen base w / o amino acid 6.7 g / L) using ethanol (2% w / v) as a carbon source, which is a condition for inducing the expression of the PEPCK gene. Next, the cells were crushed with glass beads and centrifuged to obtain a cell extract. As a control, culture in a medium using glucose instead of ethanol was also performed. The amount of protein in the obtained cell extract was quantified using a protein assay kit (BioRad). PEPCK activity in the cell extract was measured as follows according to a modification of the method described in Javier Perea and Carlos Gancedo, Arch Microbiol 132 (1982) 141-143. 2838 μL of imidazole solution (pH 7.0) (containing 100 mM imidazole, 100 mM NaHCO ₃ , 4 mM MnCl ₂ and 4 mM glucose), reduced glutathione solution (containing 1 μmol reduced glutathione, 1 μmol ADP, 0.5 μmol NADH, and 0.1 μmol PEP) 100 μL , 4 μL (4.8 u) of malate dehydrogenase (Boehringer 127248) and 8 μL (2.4 u) of hexokinase (Boehringer 127175) were mixed at 30 ° C. for 3 minutes. Subsequently, 50 μL of the cell extract was added to this mixed solution, and PEPCK activity was obtained by measuring the absorbance at 340 nm over 30 minutes at 30 ° C. This transformant restored PEPCK activity. Complementation with S. cerevisiae revealed that this DNA fragment contained the PEPCK gene KlPCK1 of K. lactis IFO1267 strain.
[0028]
(Example 2 Construction of a plasmid for PEPCK gene disruption)
A plasmid for PEPCK gene disruption was constructed as follows. About 4.8 Kb EcoRI genomic fragment encoding PEPCK gene KlPCK1 derived from K. lactis IFO1267 strain obtained in Example 1 was previously deleted from the BamHI site in the multicloning site, or the original plasmid The vector Bluescript II KS + (Stratagene) was subcloned into the EcoRI site. Next, these recombinant plasmids were cleaved at the BamHI site (existing in the EcoRI fragment) or BglII site (existing in the fragment) in the insert, and the plasmid pYCDE-ΔG11 ( T. Ogata et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 39 (1993) 285-294), a 3.4 Kb BamHI fragment containing the ADH1 promoter from Saccharomyces cerevisiae and the kanamycin resistance gene from Escherichia coli (APT2). PKP1 and pKP2 were obtained by inserting. As shown in FIG. 3, the former is a form in which an APT2 fragment as a marker gene is inserted into a fragment derived from K. lactis, and the latter has a part of the fragment derived from K. lactis deleted. It is in the form of being replaced with a fragment.
[0029]
(Example 3 Introduction of gene disruption plasmid into killer yeast K. lactis)
The plasmid DNA constructed in Example 2 was transformed into K. lactis IFO1267 strain according to a modification of the method described in Manuel Sanchez et al., Appl. Environ. Microbiol., 59 (1993) 2087-2092. Converted. That is, the bacterial cells were shake-cultured overnight at 30 ° C. in 5 mL of YED medium in a test tube, and then the bacterial cells were cultured at 30 ° C. in 30 mL of YED medium for 3.5 hours in a 300 mL Erlenmeyer flask. The cells were then washed twice with cold water, and then shaken at 30 ° C. for 30 minutes at 100 rpm in a medium containing YED and 25 mM DTT (YED 780 mL, 1 M DTT 20 μL). The resulting cells were washed twice with cold water and then with electroporation buffer (containing 1 mM Tris HCl (pH 7.5), 270 mM sucrose, and 1 mM LiOAc) and made up to 200 μL of this electroporation buffer. Suspended. 1 μL of the plasmid DNA constructed in Example 1 was added to this suspension and allowed to stand on ice for 15 minutes. The cell / DNA mixture was subjected to electroporation under the conditions of 4 KV / cm (200 V / 0.5 mm) and 16 mS. The treated cells were suspended in 1 mL of YPD medium, allowed to stand on ice for 15 minutes, and then incubated at 30 ° C. for 6 hours, after which YPD containing G418 (0.1 mg / mL) and agar (20 g / L) was added. Spread on medium and incubate at 30 ° C. for 72 hours. The transformed G418-resistant colony is replicated on a minimal agar medium (east nitrogen base w / o amino acid 6.7 g / L, agar 20 g / L) containing calcium lactate (5 g / L) and does not grow there. Selected. The results of the transformation experiment are shown in Table 1.
[0030]
[Table 1]

[0031]
One strain was selected for each series from these transformants, and these were selected as candidate strains into which gene disruption was introduced, and a more detailed study was performed below.
[0032]
(Example 4 Characterization of transformants)
1) Genomic Southern Analysis: Southern analysis was performed as follows for the purpose of examining the existence pattern of the modified PEPCK gene introduced in Example 3. 10 μg each of genomic DNA extracted from the two transformants and the wild strain K.lactis IFO1267 and 10 ng of each of the two plasmid DNAs used for transformation were digested with EcoRI, agarose gel electrophoresed, and labeled with peroxidase According to a conventional method (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press), an ECL direct nucleic acid labeling and detection system using an approximately 4.8 Kb EcoRI fragment containing the PEPCK gene as a probe. Southern analysis was performed by (Amersham). As shown in FIG. 4, each of the transformant-derived genomic DNAs showed the same hybridization pattern as that of the plasmid DNA used for gene disruption. From this, the inserted fragment in the gene disruption plasmid was found in the K. lactis genome. It was confirmed that it was introduced while maintaining the form before the introduction.
[0033]
2) Chromosome analysis: The position of the introduced modified gene on the chromosome was examined by the following procedure. For a wild type strain and two types of transformants, agarose plugs containing 2 × 10 ⁹ cells / mL protoplasts were filled in a 1% low melting point gel (BioRad 162-0102), 15 cm wells, and a pulse field electrophoresis apparatus (BioRad, CHEF-DRII), 9 to 10 ° C., 130 V, pulse time 100 seconds, 16 hours, then initial pulse time 180 seconds and final pulse time 360 seconds, 51 hours, and pulse time 360 seconds For 6 hours. After electrophoresis, Southern analysis was performed as described in 1) above using a 4.8 Kb EcoRI fragment containing the PEPCK gene or a 3.4 Kb BamHI fragment containing the APT2 gene as a probe. As shown in FIG. 5, the fragment containing the APT2 gene hybridized to the same chromosome 1 as the fragment containing the PEPCK gene in the genomic DNA derived from the transformant, but did not hybridize to the DNA derived from the wild strain. . From this result and the result of 1) above, it was confirmed that insertion or deletion (substitution) by the APT2 gene fragment was introduced into the PEPCK gene of the K. lactis genome.
[0034]
3) Measurement of PEPCK activity: The effect of the insertion or deletion (substitution) in the PEPCK gene fragment in vitro on the expression of the PEPCK gene in the killer yeast K. lactis host was measured using the PEPCK activity produced by the transformant. It examined by measuring. PEPCK activity was measured in the same manner as in Example 1 above. As shown in Table 2 below, PEPCK activity was hardly expressed in the transformed strain compared to the wild strain.
[0035]
[Table 2]

[0036]
4) Carbon source utilization: The effect of PEPCK gene disruption on lactic acid utilization was examined as follows. Two transformants and wild strains were inoculated into a minimal medium containing lactic acid or lactose (20 g / L each) as a carbon source and allowed to grow. The result is shown in FIG. In the figure, ▲ represents wild-type lactic acid medium culture, ● represents wild-type lactose medium culture, Δ represents transformant lactic acid medium culture, and ◯ represents transformant lactose medium culture. As shown in FIG. 6, in the medium containing lactose which is a sugar, the transformant grew in the same manner as the wild type. On the other hand, in the medium containing lactic acid as a carbon source, the wild strain showed good growth, whereas the transformant did not grow. Further, after transformants were cultured in YPD medium under non-selective conditions for about 20 generations, and examined for lactic acid non-assimilability and G418 resistance traits, each strain stably maintained both traits at 100%. It was. These results suggested that disruption of the PEPCK gene in the transformant genome lost the lactic acid assimilation of these strains and maintained the gene disruption stably.
[0037]
5) Confirmation of killer activity: The killer activity of the transformant and the wild strain was determined using a buffered methylene blue medium (peptone 20 g / L, yeast extract 10 g / L, glucose 20 g / L, using Saccharomyces cerevisiae IFO0304 strain as a test bacterium. Observation after aerobic culture at 25 ° C. for 2 days on methylene blue 0.3 g / L, agar 20 g / L, 1/10 McIlvaine buffer (McIlvaine, TC, J. Biol. Chem. 49 (1921) 183)) It was confirmed by doing. As shown in FIG. 7, it was confirmed that the killer activity of the transformant was maintained at the same level as the host wild strain.
[0038]
【The invention's effect】
According to the present invention, aerobic degradation of silage can be advantageously prevented. Since lactic acid fermentation of killer yeast is suppressed, the growth of wild yeasts that cause aerobic degradation can be appropriately suppressed by lactic acid non-assimilating killer yeast. By adding lactose to silage in addition to killer yeast, the killer activity of killer yeast is enhanced and the activity of lactic acid bacteria can be activated.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing silage aerobic degradation and prevention by killer yeast.
FIG. 2 is a schematic diagram showing the sugar metabolism of yeast under aerobic conditions.
FIG. 3 is a schematic diagram showing the structure of an insert fragment in a plasmid for gene disruption.
FIG. 4 is an electrophoresis photograph showing Southern analysis for examining the presence of the modified PEPCK gene in transformants and wild-type genomic DNA.
FIG. 5 is an electrophoresis photograph showing Southern analysis for examining the location of the modified PEPCK gene in transformants and wild-type chromosomes.
FIG. 6 is a graph showing growth when transformants and wild-type lactose and lactic acid are used as carbon sources.
FIG. 7 is a photograph of a biomorphism showing killer activity against transformants and test strains of wild strains.

Claims (6)

ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子を欠損する乳酸非資化性キラー酵母を含有する、サイレージの好気的変敗を防止するための組成物。 A composition for preventing aerobic degradation of silage, comprising lactic acid non-utilizing killer yeast lacking a phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) gene . 前記キラー酵母が、K. lactisである、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the killer yeast is K. lactis . 前記キラー酵母が遺伝子工学的に得られる、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the killer yeast is obtained by genetic engineering . さらにラクトースを含有する、請求項１に記載の組成物。The composition according to claim 1, further comprising lactose. ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子を欠損する乳酸非資化性キラー酵母をサイレージに添加する工程を包含する、サイレージの好気的変敗を防止する方法。A method for preventing aerobic deterioration of silage, comprising a step of adding a lactate-non-utilizing killer yeast lacking a phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) gene to silage. 前記サイレージにさらにラクトースを添加する工程を包含する、請求項５に記載の方法。The method according to claim 5 , further comprising adding lactose to the silage.

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