JPH10295400A - Ｄｎａ分子の直接的な指数関数的増幅および配列決定のための方法並びにその用途 - Google Patents
Ｄｎａ分子の直接的な指数関数的増幅および配列決定のための方法並びにその用途Info
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- JPH10295400A JPH10295400A JP9351817A JP35181797A JPH10295400A JP H10295400 A JPH10295400 A JP H10295400A JP 9351817 A JP9351817 A JP 9351817A JP 35181797 A JP35181797 A JP 35181797A JP H10295400 A JPH10295400 A JP H10295400A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＤＮＡ分子、好ましくはゲノムＤＮＡを配列
決定するための改良された迅速で信頼しうる方法、およ
びその用途の提供。 【解決手段】 複雑な核酸混合物からＤＮＡ分子を直接
的に配列決定する方法であって、ＤＮＡ分子、第１プラ
イマー、第２プライマー、反応緩衝液、耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ、デオキシヌクレオチドまたはその誘導体お
よびジデオキシヌクレオチドまたは別の終結ヌクレオチ
ドを最初に含有するサーモサイクル反応で、前記ＤＮＡ
分子上の２つの位置の間で、トランケート化ＤＮＡ分子
および完全長ＤＮＡ分子を同時に合成し、４種のddNTP
に対する該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの識別性が、野生
型Taqポリメラーゼと比べて減少していることを特徴と
する方法、およびその用途。
決定するための改良された迅速で信頼しうる方法、およ
びその用途の提供。 【解決手段】 複雑な核酸混合物からＤＮＡ分子を直接
的に配列決定する方法であって、ＤＮＡ分子、第１プラ
イマー、第２プライマー、反応緩衝液、耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ、デオキシヌクレオチドまたはその誘導体お
よびジデオキシヌクレオチドまたは別の終結ヌクレオチ
ドを最初に含有するサーモサイクル反応で、前記ＤＮＡ
分子上の２つの位置の間で、トランケート化ＤＮＡ分子
および完全長ＤＮＡ分子を同時に合成し、４種のddNTP
に対する該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの識別性が、野生
型Taqポリメラーゼと比べて減少していることを特徴と
する方法、およびその用途。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ分子の直接
的な指数関数的増幅および配列決定のための方法、並び
にその方法の用途に関する。以下、ＤＮＡ分子の直接的
な指数関数的増幅および配列決定のためのこの方法を、
「DEXAS」と称することとする。
的な指数関数的増幅および配列決定のための方法、並び
にその方法の用途に関する。以下、ＤＮＡ分子の直接的
な指数関数的増幅および配列決定のためのこの方法を、
「DEXAS」と称することとする。
【０００２】
【従来の技術】Sangerら（(1977) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 74, 5463-5467）により開発されたＤＮＡ配列
決定法は、通常、T7ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われ
る（Tabor S.およびRichardson, C.C. (1989) Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 86, 4076-4080）。この方法は、比
較的多量の精製された一本鎖ＤＮＡ鋳型を必要とする。
最近、サイクルシークエンス法が開発された（Murray,
V. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 8889）。この方法
では、一本鎖鋳型が必要でなく、比較的少量の鋳型で配
列決定反応を開始することが可能である。しかしなが
ら、鋳型ＤＮＡをほとんど完全に均一になるまで精製し
なければならず、通常これは、プラスミド中へのクロー
ニング（Bolivar, F.ら, (1977) Gene 2, 95-113）およ
びそれに続くプラスミド精製（Birnboim, H.C.およびDo
ly, J. (1979) Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523）に
より、またはPCR増幅（Mullis, K.B.およびFaloona, F.
A. (1987) Methods Enzymol. 155, 335-350）により調
製される。前記のどちらの方法においても、１つのプラ
イマーしか使用しない。
ci. USA 74, 5463-5467）により開発されたＤＮＡ配列
決定法は、通常、T7ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われ
る（Tabor S.およびRichardson, C.C. (1989) Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 86, 4076-4080）。この方法は、比
較的多量の精製された一本鎖ＤＮＡ鋳型を必要とする。
最近、サイクルシークエンス法が開発された（Murray,
V. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 8889）。この方法
では、一本鎖鋳型が必要でなく、比較的少量の鋳型で配
列決定反応を開始することが可能である。しかしなが
ら、鋳型ＤＮＡをほとんど完全に均一になるまで精製し
なければならず、通常これは、プラスミド中へのクロー
ニング（Bolivar, F.ら, (1977) Gene 2, 95-113）およ
びそれに続くプラスミド精製（Birnboim, H.C.およびDo
ly, J. (1979) Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523）に
より、またはPCR増幅（Mullis, K.B.およびFaloona, F.
A. (1987) Methods Enzymol. 155, 335-350）により調
製される。前記のどちらの方法においても、１つのプラ
イマーしか使用しない。
【０００３】「共役増幅および配列決定（coupled ampl
ification and sequencing）」または「CAS」と称され
るサイクルシークエンス法の１つの態様では、ＤＮＡ鋳
型から配列を生成させるために２工程のプロトコールを
使用できることが、RuanoおよびKidd（(1991) Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 88, 2815-2819; US-5,427,911）に
より示されている。第１工程では、適量の配列決定用鋳
型を調製するために、ジデオキシヌクレオチドの不在下
でTaq ＤＮＡポリメラーゼを用いて15サイクルのPCRを
行なう。ジデオキシヌクレオチドおよび標識プライマー
を加える第２工程では、CASにより、配列の生成および
標的配列の追加的な増幅が生じる。この方法のどちらの
工程においても、２つのプライマーを使用する。
ification and sequencing）」または「CAS」と称され
るサイクルシークエンス法の１つの態様では、ＤＮＡ鋳
型から配列を生成させるために２工程のプロトコールを
使用できることが、RuanoおよびKidd（(1991) Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 88, 2815-2819; US-5,427,911）に
より示されている。第１工程では、適量の配列決定用鋳
型を調製するために、ジデオキシヌクレオチドの不在下
でTaq ＤＮＡポリメラーゼを用いて15サイクルのPCRを
行なう。ジデオキシヌクレオチドおよび標識プライマー
を加える第２工程では、CASにより、配列の生成および
標的配列の追加的な増幅が生じる。この方法のどちらの
工程においても、２つのプライマーを使用する。
【０００４】共役ＤＮＡ配列決定反応で使用するTaq Ｄ
ＮＡポリメラーゼは、ddNTPに対して強く識別し、ddNTP
とdNTPとの混合物がそれに供給されると、好ましくは、
dNTPを取込む。さらに、それは、各ddNTP、すなわちddA
TP、ddCTP、ddGTP、ddTTPを、非常に様々な効率で取込
む。したがって、CAS法の最適化には、ジデオキシヌク
レオチドの注意深い滴定が必要となる。
ＮＡポリメラーゼは、ddNTPに対して強く識別し、ddNTP
とdNTPとの混合物がそれに供給されると、好ましくは、
dNTPを取込む。さらに、それは、各ddNTP、すなわちddA
TP、ddCTP、ddGTP、ddTTPを、非常に様々な効率で取込
む。したがって、CAS法の最適化には、ジデオキシヌク
レオチドの注意深い滴定が必要となる。
【０００５】さらに、共役増幅および配列決定は、最初
のＤＮＡ量、２つのプライマー間の距離、並びにddNTP
およびdNTPの濃度やそれらの間の、およびそれらの各々
の間の比率に左右されるため、共役増幅および配列決定
反応（CAS）の最適化では、反応条件が個々のＤＮＡ断
片について別々に最適化される必要がある。
のＤＮＡ量、２つのプライマー間の距離、並びにddNTP
およびdNTPの濃度やそれらの間の、およびそれらの各々
の間の比率に左右されるため、共役増幅および配列決定
反応（CAS）の最適化では、反応条件が個々のＤＮＡ断
片について別々に最適化される必要がある。
【０００６】前記のすべての方法においては、鋳型ＤＮ
Ａの指数関数的増幅のための第１工程とトランケート化
ＤＮＡ分子合成のための第２工程との間で中断しなけれ
ばならず、また、与えられたＤＮＡ断片を別々に最適化
する必要があるため、面倒で長時間を要することがあ
り、特に、多量の異なるＤＮＡ分子を配列決定したり、
多量のサンプルを病院もしくは研究室でプロセシングし
たり、または法医学または考古学の研究のための希有サ
ンプルを配列決定する場合には誤差が生じることがあ
る。
Ａの指数関数的増幅のための第１工程とトランケート化
ＤＮＡ分子合成のための第２工程との間で中断しなけれ
ばならず、また、与えられたＤＮＡ断片を別々に最適化
する必要があるため、面倒で長時間を要することがあ
り、特に、多量の異なるＤＮＡ分子を配列決定したり、
多量のサンプルを病院もしくは研究室でプロセシングし
たり、または法医学または考古学の研究のための希有サ
ンプルを配列決定する場合には誤差が生じることがあ
る。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】このため、出発核酸分
子の必要量の減少につながり、指数関数的増幅工程と配
列決定工程との間で中断する必要がなく、そのため全反
応をより迅速に、そしてより少ない操作で行なうことが
できる反応において、完全長の分子およびトランケート
化された長さの分子の指数関数的増幅を同時に増強する
核酸配列決定方法を得ることができれば好都合であろ
う。
子の必要量の減少につながり、指数関数的増幅工程と配
列決定工程との間で中断する必要がなく、そのため全反
応をより迅速に、そしてより少ない操作で行なうことが
できる反応において、完全長の分子およびトランケート
化された長さの分子の指数関数的増幅を同時に増強する
核酸配列決定方法を得ることができれば好都合であろ
う。
【０００８】本発明の目的は、ＤＮＡ分子、好ましくは
ゲノムＤＮＡを配列決定するための改良された迅速で信
頼しうる方法を提供することである。
ゲノムＤＮＡを配列決定するための改良された迅速で信
頼しうる方法を提供することである。
【０００９】本発明のもう１つの目的は、サイクル反応
に必要な核酸分子の開始量の減少につながる反応におい
て、完全長の分子およびトランケート化された長さの分
子の指数関数的増幅を同時に増強する核酸配列決定のた
めの直接的な方法を提供することである。
に必要な核酸分子の開始量の減少につながる反応におい
て、完全長の分子およびトランケート化された長さの分
子の指数関数的増幅を同時に増強する核酸配列決定のた
めの直接的な方法を提供することである。
【００１０】本発明のもう１つの目的は、単一の容器内
で１工程で実施することができる、ＤＮＡ分子、好まし
くはゲノムＤＮＡを配列決定するための改良された迅速
で信頼しうる方法を提供することである。
で１工程で実施することができる、ＤＮＡ分子、好まし
くはゲノムＤＮＡを配列決定するための改良された迅速
で信頼しうる方法を提供することである。
【００１１】本発明のもう１つの目的は、医学的診断、
法医学および集団遺伝学における配列決定のための本発
明の用途を提供することである。
法医学および集団遺伝学における配列決定のための本発
明の用途を提供することである。
【００１２】本発明のさらに別の目的は、本明細書から
当業者には明らかである。
当業者には明らかである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】前記の「CAS」法とは異
なり、サーモサイクルに用いる緩衝液中および条件下
で、４種のddNTPに対する識別性が野生型Taq ＤＮＡポ
リメラーゼと比べて減少しているＤＮＡポリメラーゼ
を、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとして使用する。より好
ましくは、「テイバー・リチャードソン（Tabor-Richar
dson）」突然変異を保持し、また5'-3'エキソヌクレア
ーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼまたはその機能
誘導体、例えば、AmplitaqFSTM（Taq ＤＮＡポリメラー
ゼ(-エキソ5'-3')(F667Y), TaborおよびRichardson (19
95),前記引用文中）、TaquenaseTM（Taq ＤＮＡポリメ
ラーゼΔ235(-エキソ5'-3')(F667Y), TaborおよびRicha
rdson (1995),前記引用文中）並びにThermoSequenaseTM
（Taq ＤＮＡポリメラーゼ(-エキソ5'-3')(F667Y), Tab
orおよびRichardson (1995),前記引用文中）、およびこ
れらの混合物を使用するかまたは、他の耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼおよびそれらの混合物も本発明の方法で使用
することができる。
なり、サーモサイクルに用いる緩衝液中および条件下
で、４種のddNTPに対する識別性が野生型Taq ＤＮＡポ
リメラーゼと比べて減少しているＤＮＡポリメラーゼ
を、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとして使用する。より好
ましくは、「テイバー・リチャードソン（Tabor-Richar
dson）」突然変異を保持し、また5'-3'エキソヌクレア
ーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼまたはその機能
誘導体、例えば、AmplitaqFSTM（Taq ＤＮＡポリメラー
ゼ(-エキソ5'-3')(F667Y), TaborおよびRichardson (19
95),前記引用文中）、TaquenaseTM（Taq ＤＮＡポリメ
ラーゼΔ235(-エキソ5'-3')(F667Y), TaborおよびRicha
rdson (1995),前記引用文中）並びにThermoSequenaseTM
（Taq ＤＮＡポリメラーゼ(-エキソ5'-3')(F667Y), Tab
orおよびRichardson (1995),前記引用文中）、およびこ
れらの混合物を使用するかまたは、他の耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼおよびそれらの混合物も本発明の方法で使用
することができる。
【００１４】驚くべきことに、４種のddNTPに対する識
別性が野生型Taq ＤＮＡポリメラーゼと比べて減少して
いるＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、サイク
ル反応の開始時から、トランケート化断片および完全断
片の同時・指数関数的合成が可能となる。したがって、
本発明は、反応緩衝液、デオキシヌクレオチドまたはそ
の誘導体およびジデオキシヌクレオチドまたは別の終結
ヌクレオチド、およびddNTPに対する識別性が野生型Taq
ＤＮＡポリメラーゼと比べて減少している耐熱性ポリ
メラーゼを含有する核酸（例えば、全ゲノムヒトＤＮ
Ａ）の複雑な混合物から核酸分子を直接的に配列決定す
る方法に関する。本発明の定義において、直接的に配列
決定するとは、反応を中断することなく、また、配列決
定すべき核酸断片を公知の方法により前もって増幅する
ことなく、明確な配列ラダーが読み取れるよう、配列決
定すべき核酸断片の増幅および配列決定を１工程で同時
に行なうことを意味する。
別性が野生型Taq ＤＮＡポリメラーゼと比べて減少して
いるＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、サイク
ル反応の開始時から、トランケート化断片および完全断
片の同時・指数関数的合成が可能となる。したがって、
本発明は、反応緩衝液、デオキシヌクレオチドまたはそ
の誘導体およびジデオキシヌクレオチドまたは別の終結
ヌクレオチド、およびddNTPに対する識別性が野生型Taq
ＤＮＡポリメラーゼと比べて減少している耐熱性ポリ
メラーゼを含有する核酸（例えば、全ゲノムヒトＤＮ
Ａ）の複雑な混合物から核酸分子を直接的に配列決定す
る方法に関する。本発明の定義において、直接的に配列
決定するとは、反応を中断することなく、また、配列決
定すべき核酸断片を公知の方法により前もって増幅する
ことなく、明確な配列ラダーが読み取れるよう、配列決
定すべき核酸断片の増幅および配列決定を１工程で同時
に行なうことを意味する。
【００１５】DEXASの原理は、完全長の適当な鋳型分子
とＤＮＡ分子の配列決定に寄与するトランケート化分子
とを同時に産生するよう機能する好ましくは不等モル比
で存在する２つのプライマー（第１プライマー、および
第１プライマーと相補的な鎖上に位置する第２プライマ
ー）を用いて、最初のおよび後続のサイクルシークエン
ス反応を行なうことである。各反応が２つのプライマー
（それらの一方は標識を有し他方は標識を有さないか、
または両方が異なる標識を有する）を好ましくは互いに
不等モル比で含有するよう、４つの反応を調製する（１
つは各塩基の決定のための反応）。第１プライマーと第
２プライマーとの間の前記不等モル比は、サイクル反応
の開始時から、トランケート化断片および完全断片の同
時・指数関数的合成を可能とする。さらに、各反応は、
最初から、配列決定すべきＤＮＡ鋳型、緩衝溶液、耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性ピロホスファターゼ（こ
れは所望により用いる）、４種のデオキシヌクレオチド
またはその誘導体およびジデオキシヌクレオチドまたは
終結ヌクレオチド（例えば、3−アミノヌクレオチドま
たは3'−エステル−誘導体化ヌクレオチド）を含有す
る。
とＤＮＡ分子の配列決定に寄与するトランケート化分子
とを同時に産生するよう機能する好ましくは不等モル比
で存在する２つのプライマー（第１プライマー、および
第１プライマーと相補的な鎖上に位置する第２プライマ
ー）を用いて、最初のおよび後続のサイクルシークエン
ス反応を行なうことである。各反応が２つのプライマー
（それらの一方は標識を有し他方は標識を有さないか、
または両方が異なる標識を有する）を好ましくは互いに
不等モル比で含有するよう、４つの反応を調製する（１
つは各塩基の決定のための反応）。第１プライマーと第
２プライマーとの間の前記不等モル比は、サイクル反応
の開始時から、トランケート化断片および完全断片の同
時・指数関数的合成を可能とする。さらに、各反応は、
最初から、配列決定すべきＤＮＡ鋳型、緩衝溶液、耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性ピロホスファターゼ（こ
れは所望により用いる）、４種のデオキシヌクレオチド
またはその誘導体およびジデオキシヌクレオチドまたは
終結ヌクレオチド（例えば、3−アミノヌクレオチドま
たは3'−エステル−誘導体化ヌクレオチド）を含有す
る。
【００１６】ついで、これらのサイクルのそれぞれにお
いて、各プライマーから２つの型の伸長産物が産生され
るよう、変性および伸長のためのサイクルを行なう。各
プライマーの働きにより、伸長の産生が開始されるが、
この伸長産物は、他方のプライマーの位置に十分到達す
る程度の長さとなる。同時に、ジデオキシヌクレオチド
の取込みにより各プライマーにより開始される産生は、
他方のプライマーの位置に到達する前に終結する。前記
の前者の産物（完全長産物）は、後続のサイクルで、さ
らなる完全長ＤＮＡ鎖の産生のための鋳型として機能
し、また、配列決定反応に寄与する伸長のための鋳型と
して使用される。後者の産物（トランケート化産物）
は、サイクルの間に蓄積し、生成する配列ラダーに寄与
する。したがって、DEXASでは、サーモサイクル反応を
中断する必要無しに１本のチューブ中で、配列決定用鋳
型および配列ラダーの同時指数関数的産生が生じる。
いて、各プライマーから２つの型の伸長産物が産生され
るよう、変性および伸長のためのサイクルを行なう。各
プライマーの働きにより、伸長の産生が開始されるが、
この伸長産物は、他方のプライマーの位置に十分到達す
る程度の長さとなる。同時に、ジデオキシヌクレオチド
の取込みにより各プライマーにより開始される産生は、
他方のプライマーの位置に到達する前に終結する。前記
の前者の産物（完全長産物）は、後続のサイクルで、さ
らなる完全長ＤＮＡ鎖の産生のための鋳型として機能
し、また、配列決定反応に寄与する伸長のための鋳型と
して使用される。後者の産物（トランケート化産物）
は、サイクルの間に蓄積し、生成する配列ラダーに寄与
する。したがって、DEXASでは、サーモサイクル反応を
中断する必要無しに１本のチューブ中で、配列決定用鋳
型および配列ラダーの同時指数関数的産生が生じる。
【００１７】したがって、本発明を用いれば、ＤＮＡの
多コピーおよび単コピーの領域のＤＮＡ配列を１工程で
決定することができる。
多コピーおよび単コピーの領域のＤＮＡ配列を１工程で
決定することができる。
【００１８】したがって、本発明は、公知の方法により
前もって増幅することなく、１工程で、すなわち反応を
中断することなく、核酸（例えば、全ゲノムヒトＤＮ
Ａ）の複雑な混合物から、配列決定すべき核酸の増幅お
よび配列決定を同時に行なうことを可能とし、明確な配
列ラダーを読み取ることができる方法であって、少なく
とも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、核酸分子、第１
プライマー、第２プライマー、反応緩衝液、デオキシヌ
クレオチドまたはその誘導体、および少なくとも１つの
ジデオキシヌクレオチドまたは別の終結ヌクレオチドが
開始反応混合物中に存在することを特徴とする方法を初
めて提供するものである。
前もって増幅することなく、１工程で、すなわち反応を
中断することなく、核酸（例えば、全ゲノムヒトＤＮ
Ａ）の複雑な混合物から、配列決定すべき核酸の増幅お
よび配列決定を同時に行なうことを可能とし、明確な配
列ラダーを読み取ることができる方法であって、少なく
とも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、核酸分子、第１
プライマー、第２プライマー、反応緩衝液、デオキシヌ
クレオチドまたはその誘導体、および少なくとも１つの
ジデオキシヌクレオチドまたは別の終結ヌクレオチドが
開始反応混合物中に存在することを特徴とする方法を初
めて提供するものである。
【００１９】さらに、本発明の前記の目的および目標
は、ＤＮＡ分子を配列決定する方法であって、前記ＤＮ
Ａ分子上の２つの位置の間で、トランケート化ＤＮＡ分
子および完全長ＤＮＡ分子をサーモサイクル反応で同時
に指数関数的に合成し、該サーモサイクル反応が、ＤＮ
Ａ分子、第１プライマー、第２プライマー、反応緩衝
液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性ピロホスファタ
ーゼ（これは所望により使用する）、デオキシヌクレオ
チドまたはその誘導体およびジデオキシヌクレオチドま
たは別のその終結ヌクレオチドを最初に含み、前記サー
モサイクル反応における前記プライマーの最初の比率が
１でないことを特徴とする方法を提供することにより達
成される。
は、ＤＮＡ分子を配列決定する方法であって、前記ＤＮ
Ａ分子上の２つの位置の間で、トランケート化ＤＮＡ分
子および完全長ＤＮＡ分子をサーモサイクル反応で同時
に指数関数的に合成し、該サーモサイクル反応が、ＤＮ
Ａ分子、第１プライマー、第２プライマー、反応緩衝
液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性ピロホスファタ
ーゼ（これは所望により使用する）、デオキシヌクレオ
チドまたはその誘導体およびジデオキシヌクレオチドま
たは別のその終結ヌクレオチドを最初に含み、前記サー
モサイクル反応における前記プライマーの最初の比率が
１でないことを特徴とする方法を提供することにより達
成される。
【００２０】
【発明の実施の形態】本発明の方法の好ましい実施態様
では、前記プライマーの互いの比率は、約２：１〜約
３：１、最も好ましくは２：１である。
では、前記プライマーの互いの比率は、約２：１〜約
３：１、最も好ましくは２：１である。
【００２１】本発明の方法のもう１つの好ましい実施態
様では、特異的トランケート化ＤＮＡ分子と非特異的Ｄ
ＮＡ分子との間のSN比(signal-to-noise ratio)が、該
配列の読み取りが実質的に妨げられない程度に十分な大
きさとなるよう、前記プライマーが十分な長さを有す
る。前記プライマーは、好ましくは、少なくとも25ヌク
レオチドの長さを有する。
様では、特異的トランケート化ＤＮＡ分子と非特異的Ｄ
ＮＡ分子との間のSN比(signal-to-noise ratio)が、該
配列の読み取りが実質的に妨げられない程度に十分な大
きさとなるよう、前記プライマーが十分な長さを有す
る。前記プライマーは、好ましくは、少なくとも25ヌク
レオチドの長さを有する。
【００２２】プライマーは、当該分野で公知の方法によ
り合成することができる。例えば、プライマーは、本発
明の核酸配列決定方法の間に前記プライマーの安定性ま
たは機能を有意に変化させない公知の方法を用いて合成
することができる。
り合成することができる。例えば、プライマーは、本発
明の核酸配列決定方法の間に前記プライマーの安定性ま
たは機能を有意に変化させない公知の方法を用いて合成
することができる。
【００２３】さらに、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドオリ
ゴヌクレオチド（Finn, P.J.ら, N.A.R. 24, 3357-3363
(1996), Koch, T.ら, Tetrahedron Letters, 36, 6933
-6936 (1995), Stetsenko, D.A.ら, Tetrahedron Lette
rs 37, 3571-3574 (1996), Bergmann, F.ら, Tetrahedr
on Letters 36, 6823-6826 (1995)およびWill, D.W.ら,
Tetrahedron 51, 12069-12082 (1995)を参照された
し）も、本発明の方法のためのプライマーとみなされ
る。
ゴヌクレオチド（Finn, P.J.ら, N.A.R. 24, 3357-3363
(1996), Koch, T.ら, Tetrahedron Letters, 36, 6933
-6936 (1995), Stetsenko, D.A.ら, Tetrahedron Lette
rs 37, 3571-3574 (1996), Bergmann, F.ら, Tetrahedr
on Letters 36, 6823-6826 (1995)およびWill, D.W.ら,
Tetrahedron 51, 12069-12082 (1995)を参照された
し）も、本発明の方法のためのプライマーとみなされ
る。
【００２４】本発明のもう１つの好ましい実施態様で
は、前記第１プライマーは標識を有する。さらに、前記
第１プライマーおよび第２プライマーが異なる標識を有
するのが好ましい。本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法に
おいて前記プライマーの安定性または機能を有意に変化
させない限り、当該分野で公知の任意の適当な物質また
は方法を、単一または特異的標識剤および方法として使
用することができる。例えば、単一または特異的標識
は、酵素(例えばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリホス
ファターゼおよびペルオキシダーゼ)、酵素基質、補酵
素、染料、発色団、蛍光、化学発光および生物発光標識
(例えばFITC、Cy5、Cy5.5、テキサスレッドおよびIRD40
（Chenら, (1993) J. Chromatog. A 652: 355-360およ
びKambaraら,(1992), Electrophoresis 13: 542-546）)
リガンドまたはハプテン(例えばビオチン)、および放射
性同位体（例えば、3H、35S、32P、125Iおよび14C）よ
りなる群から選ぶことができる。
は、前記第１プライマーは標識を有する。さらに、前記
第１プライマーおよび第２プライマーが異なる標識を有
するのが好ましい。本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法に
おいて前記プライマーの安定性または機能を有意に変化
させない限り、当該分野で公知の任意の適当な物質また
は方法を、単一または特異的標識剤および方法として使
用することができる。例えば、単一または特異的標識
は、酵素(例えばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリホス
ファターゼおよびペルオキシダーゼ)、酵素基質、補酵
素、染料、発色団、蛍光、化学発光および生物発光標識
(例えばFITC、Cy5、Cy5.5、テキサスレッドおよびIRD40
（Chenら, (1993) J. Chromatog. A 652: 355-360およ
びKambaraら,(1992), Electrophoresis 13: 542-546）)
リガンドまたはハプテン(例えばビオチン)、および放射
性同位体（例えば、3H、35S、32P、125Iおよび14C）よ
りなる群から選ぶことができる。
【００２５】本発明の方法は、「ホットスタート」法と
して実施することもできる。この場合、より低温で非特
異的にハイブリダイズしたプライマー上での重合を抑制
するために、温度が上昇して初めてポリメラーゼの作用
が開始するようにしなければならない。１つの可能性
は、サーモサイクル反応に、さらにポリメラーゼ阻害剤
を加えることである。例えば、より高温で変性するだけ
でポリメラーゼの酵素活性を発現させるポリメラーゼ抗
体が市販されている。しかしながら、より低温では不活
性型で存在する、遺伝子工学により修飾されたポリメラ
ーゼも考えられる。
して実施することもできる。この場合、より低温で非特
異的にハイブリダイズしたプライマー上での重合を抑制
するために、温度が上昇して初めてポリメラーゼの作用
が開始するようにしなければならない。１つの可能性
は、サーモサイクル反応に、さらにポリメラーゼ阻害剤
を加えることである。例えば、より高温で変性するだけ
でポリメラーゼの酵素活性を発現させるポリメラーゼ抗
体が市販されている。しかしながら、より低温では不活
性型で存在する、遺伝子工学により修飾されたポリメラ
ーゼも考えられる。
【００２６】DEXASは、種々の緩衝液および種々のデオ
キシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチド濃度に
対して比較的低感受性であり、種々の耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼを用いて行なうことができる。
キシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチド濃度に
対して比較的低感受性であり、種々の耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼを用いて行なうことができる。
【００２７】サーモサイクル数は、鋳型ＤＮＡの量およ
びその純度に応じて、約18〜約50サイクルとなりうる。
びその純度に応じて、約18〜約50サイクルとなりうる。
【００２８】使用することができる緩衝液成分には、約
9.0〜9.5のpHで約10〜30mMの濃度のトリス−HCl、約10
〜20mM、好ましくは15mMの濃度の硫酸アンモニウム、約
3.5〜5.5mMの濃度のMgCl2、所望により約0.05mMのメル
カプトエタノール、約0.28％のTween20Rおよび／または
約0.02％の Nonidet 40Rなどが含まれるが、これらに限
定されるものではない。
9.0〜9.5のpHで約10〜30mMの濃度のトリス−HCl、約10
〜20mM、好ましくは15mMの濃度の硫酸アンモニウム、約
3.5〜5.5mMの濃度のMgCl2、所望により約0.05mMのメル
カプトエタノール、約0.28％のTween20Rおよび／または
約0.02％の Nonidet 40Rなどが含まれるが、これらに限
定されるものではない。
【００２９】デオキシヌクレオチドは、dGTP、dATP、dT
TPおよびdCTPから選ぶことができるが、これらに限定さ
れるものではない。本発明では、さらに、サーモサイク
ル反応で合成される成長しつつあるＤＮＡ分子中に耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼにより取込まれうるデオキシヌク
レオチドとして定義されるデオキシヌクレオチドの誘導
体を使用することも可能である。そのような誘導体に
は、dATP、dGTP、dTTPまたはdCTPに代わるデオキシヌク
レオチドとして使用することもできるチオヌクレオチ
ド、7−デアザ−2'−dGTP、７−デアザ−2'−dATP、お
よびデオキシイノシン三リン酸が含まれるが、これらに
限定されるものではない。前記デオキシヌクレオチドお
よびその誘導体は、好ましくは、約300μM〜２mMの濃度
で使用する。
TPおよびdCTPから選ぶことができるが、これらに限定さ
れるものではない。本発明では、さらに、サーモサイク
ル反応で合成される成長しつつあるＤＮＡ分子中に耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼにより取込まれうるデオキシヌク
レオチドとして定義されるデオキシヌクレオチドの誘導
体を使用することも可能である。そのような誘導体に
は、dATP、dGTP、dTTPまたはdCTPに代わるデオキシヌク
レオチドとして使用することもできるチオヌクレオチ
ド、7−デアザ−2'−dGTP、７−デアザ−2'−dATP、お
よびデオキシイノシン三リン酸が含まれるが、これらに
限定されるものではない。前記デオキシヌクレオチドお
よびその誘導体は、好ましくは、約300μM〜２mMの濃度
で使用する。
【００３０】ジデオキシヌクレオチドは、ddGTP、ddAT
P、ddTTPおよびddCTPから選ぶことができるが、これら
に限定されるものではない。本発明では、さらに、サー
モサイクル反応で合成される成長しつつあるＤＮＡ分子
中に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにより取込まれうるジデ
オキシヌクレオチドとして定義されるジデオキシヌクレ
オチドの誘導体を使用することも可能である。さらに、
他の終結ヌクレオチド、例えば、3'−アミノヌクレオチ
ドまたは3'−エステル−誘導体化ヌクレオチドを使用す
ることも可能である。ddNTPの好ましい濃度は、約１〜
５μMである。
P、ddTTPおよびddCTPから選ぶことができるが、これら
に限定されるものではない。本発明では、さらに、サー
モサイクル反応で合成される成長しつつあるＤＮＡ分子
中に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにより取込まれうるジデ
オキシヌクレオチドとして定義されるジデオキシヌクレ
オチドの誘導体を使用することも可能である。さらに、
他の終結ヌクレオチド、例えば、3'−アミノヌクレオチ
ドまたは3'−エステル−誘導体化ヌクレオチドを使用す
ることも可能である。ddNTPの好ましい濃度は、約１〜
５μMである。
【００３１】本発明の方法では、ddNTPに対するdNTPの
好ましい比率（dNTP：ddNTP）は、100：１〜1000：１、
好ましくは、300：１〜600：１である。
好ましい比率（dNTP：ddNTP）は、100：１〜1000：１、
好ましくは、300：１〜600：１である。
【００３２】本発明の方法のもう１つの好ましい実施態
様では、特異的トランケート化ＤＮＡ分子と非特異的Ｄ
ＮＡ分子との間のSN比が、該配列の読み取りが実質的に
妨げられない程度に十分に大きくなる温度で、前記方法
を実施する。アニーリング温度を最適化することは、そ
れほど重要ではない。ヒト単コピーＤＮＡ配列の場合、
可能な限り高いアニーリング温度は、バックグラウンド
を劇的に減少させる。この場合、サーモサイクル反応の
アニーリング工程および合成工程は、好ましくは、最低
温度62℃で、より好ましくは66℃で、最も好ましくは少
なくとも約68℃で行なう。
様では、特異的トランケート化ＤＮＡ分子と非特異的Ｄ
ＮＡ分子との間のSN比が、該配列の読み取りが実質的に
妨げられない程度に十分に大きくなる温度で、前記方法
を実施する。アニーリング温度を最適化することは、そ
れほど重要ではない。ヒト単コピーＤＮＡ配列の場合、
可能な限り高いアニーリング温度は、バックグラウンド
を劇的に減少させる。この場合、サーモサイクル反応の
アニーリング工程および合成工程は、好ましくは、最低
温度62℃で、より好ましくは66℃で、最も好ましくは少
なくとも約68℃で行なう。
【００３３】配列決定すべきＤＮＡ分子の鋳型は、好ま
しくは、クローニングも精製もする必要のない全ゲノム
ＤＮＡ分子として存在するが、これが実際のところかも
しれない。本発明の１つの実施態様では、ゲノムＤＮＡ
は、２kb以上の長さを有する。鋳型として使用すること
ができるＤＮＡの他の形態には、クローニングされたま
たはクローニングされていないミトコンドリアＤＮＡ、
部分精製されたまたは未精製のＤＮＡ(例えば、細菌コ
ロニーのプラスミドＤＮＡ)が含まれる。DEXASは、ミト
コンドリアＤＮＡ配列の決定には約250ngの鋳型ＤＮ
Ａ、および単コピーＤＮＡ配列（例えば、全ゲノムＤＮ
Ａ）の決定には約１μgの鋳型ＤＮＡで十分に機能する
が、より少量のミトコンドリアまたはゲノムＤＮＡでも
機能する。本発明の方法は、バクテリオファージからの
未精製の一本鎖または二本鎖ＤＮＡの直接的な配列決定
にも使用することができる。さらに、DEXASは、鋳型の
塩基組成にはそれほど影響されない。
しくは、クローニングも精製もする必要のない全ゲノム
ＤＮＡ分子として存在するが、これが実際のところかも
しれない。本発明の１つの実施態様では、ゲノムＤＮＡ
は、２kb以上の長さを有する。鋳型として使用すること
ができるＤＮＡの他の形態には、クローニングされたま
たはクローニングされていないミトコンドリアＤＮＡ、
部分精製されたまたは未精製のＤＮＡ(例えば、細菌コ
ロニーのプラスミドＤＮＡ)が含まれる。DEXASは、ミト
コンドリアＤＮＡ配列の決定には約250ngの鋳型ＤＮ
Ａ、および単コピーＤＮＡ配列（例えば、全ゲノムＤＮ
Ａ）の決定には約１μgの鋳型ＤＮＡで十分に機能する
が、より少量のミトコンドリアまたはゲノムＤＮＡでも
機能する。本発明の方法は、バクテリオファージからの
未精製の一本鎖または二本鎖ＤＮＡの直接的な配列決定
にも使用することができる。さらに、DEXASは、鋳型の
塩基組成にはそれほど影響されない。
【００３４】好ましい実施態様では、本発明の方法はさ
らに、前記ＤＮＡ分子中のA、G、CおよびTの位置を決定
するための各サーモサイクル反応を、１つの容器、器ま
たはチューブの中で１工程で行なうことにより特徴づけ
られる。
らに、前記ＤＮＡ分子中のA、G、CおよびTの位置を決定
するための各サーモサイクル反応を、１つの容器、器ま
たはチューブの中で１工程で行なうことにより特徴づけ
られる。
【００３５】本発明の方法における核酸分子の適当な起
源は、体液（例えば、***、尿、血液またはこれらの画
分）、毛、個々の細胞、細胞またはその画分、硬組織
（例えば、骨）または軟組織またはその画分、および細
胞培養物またはその画分である。
源は、体液（例えば、***、尿、血液またはこれらの画
分）、毛、個々の細胞、細胞またはその画分、硬組織
（例えば、骨）または軟組織またはその画分、および細
胞培養物またはその画分である。
【００３６】本発明はまた、例えば、大規模なゲノムプ
ロジェクトのための２つの標識を有するショットガンラ
イブラリーの配列決定のための、並びに医学的診断、法
医学および集団遺伝学における、与えられた核酸分子の
ヌクレオチド配列の決定のための本発明の方法の適用に
有用である。本発明の方法は、遺伝子の突然変異または
多型性を検出するため、配列決定された核酸の起源を同
定するため、またはサンプル中の外来性または感染性因
子の存在を検出するために使用することができる。
ロジェクトのための２つの標識を有するショットガンラ
イブラリーの配列決定のための、並びに医学的診断、法
医学および集団遺伝学における、与えられた核酸分子の
ヌクレオチド配列の決定のための本発明の方法の適用に
有用である。本発明の方法は、遺伝子の突然変異または
多型性を検出するため、配列決定された核酸の起源を同
定するため、またはサンプル中の外来性または感染性因
子の存在を検出するために使用することができる。
【００３７】本発明は、前記方法のあらゆる手順のあら
ゆる組み合わせに関する。
ゆる組み合わせに関する。
【００３８】該配列決定反応は、調製後、例えば、一般
に使用される適用緩衝液（例えば、20mM EDTA（pH7.4）
および６mg/mlデキストランブルーを含有するホルムア
ミド）を加え、変性（例えば、96℃で４分間）させた後
に、配列決定用ゲル上に直接ローディングすることがで
きる。配列ラダーは、公知の方法により読み取ることが
できる。本発明の方法は、自動化によく適している。該
反応における２つのプライマーは異なる標識（例えば、
２つの異なる波長で検出することができる標識）を有す
るため、本発明の方法は、１つまたは数個のゲルレーン
において、鋳型の両方の鎖の同時配列決定および両方の
反応の検出を可能とする。一般に、異なる染料を用いて
行なう多数のDEXAS反応を、同じチューブ内で同時に行
なうことができ、また、数個のレーザーを備えた配列決
定装置に適用したり、あるいは、他の方法（例えば、オ
ートラジオグラフィー）により検出することができる。
に使用される適用緩衝液（例えば、20mM EDTA（pH7.4）
および６mg/mlデキストランブルーを含有するホルムア
ミド）を加え、変性（例えば、96℃で４分間）させた後
に、配列決定用ゲル上に直接ローディングすることがで
きる。配列ラダーは、公知の方法により読み取ることが
できる。本発明の方法は、自動化によく適している。該
反応における２つのプライマーは異なる標識（例えば、
２つの異なる波長で検出することができる標識）を有す
るため、本発明の方法は、１つまたは数個のゲルレーン
において、鋳型の両方の鎖の同時配列決定および両方の
反応の検出を可能とする。一般に、異なる染料を用いて
行なう多数のDEXAS反応を、同じチューブ内で同時に行
なうことができ、また、数個のレーザーを備えた配列決
定装置に適用したり、あるいは、他の方法（例えば、オ
ートラジオグラフィー）により検出することができる。
【００３９】本発明のもう１つの主題は、反応緩衝液、
デオキシヌクレオチドまたはその誘導体およびジデオキ
シヌクレオチドまたは別の終結ヌクレオチド、およびdd
NTPに対する識別性が野生型Taq ＤＮＡポリメラーゼと
比べて減少している耐熱性ポリメラーゼを含有する、複
雑な核酸（例えば、全ゲノムヒトＤＮＡ）の混合物から
核酸分子を直接的に配列決定するためのキットである。
本発明の定義において、直接的に配列決定するとは、反
応を中断することなく、また、配列決定すべき核酸断片
を公知の方法により前もって増幅することなく、明確な
配列ラダーが読み取れるよう、配列決定すべき核酸断片
の増幅および配列決定を１工程で同時に行なうことを意
味する。
デオキシヌクレオチドまたはその誘導体およびジデオキ
シヌクレオチドまたは別の終結ヌクレオチド、およびdd
NTPに対する識別性が野生型Taq ＤＮＡポリメラーゼと
比べて減少している耐熱性ポリメラーゼを含有する、複
雑な核酸（例えば、全ゲノムヒトＤＮＡ）の混合物から
核酸分子を直接的に配列決定するためのキットである。
本発明の定義において、直接的に配列決定するとは、反
応を中断することなく、また、配列決定すべき核酸断片
を公知の方法により前もって増幅することなく、明確な
配列ラダーが読み取れるよう、配列決定すべき核酸断片
の増幅および配列決定を１工程で同時に行なうことを意
味する。
【００４０】本発明のもう１つの主題は、反応緩衝液、
デオキシヌクレオチドまたはその誘導体、ジデオキシヌ
クレオチドまたは別の終結ヌクレオチド、耐熱性ポリメ
ラーゼ、および比率が１より大きい２つのプライマーを
含有する、複雑な核酸混合物の核酸分子を直接的に配列
決定するためのキットである。このキットは、特に好ま
しくは、ddNTPに対する識別性が野生型Taq ＤＮＡポリ
メラーゼと比べて減少している耐熱性ポリメラーゼを含
有する。
デオキシヌクレオチドまたはその誘導体、ジデオキシヌ
クレオチドまたは別の終結ヌクレオチド、耐熱性ポリメ
ラーゼ、および比率が１より大きい２つのプライマーを
含有する、複雑な核酸混合物の核酸分子を直接的に配列
決定するためのキットである。このキットは、特に好ま
しくは、ddNTPに対する識別性が野生型Taq ＤＮＡポリ
メラーゼと比べて減少している耐熱性ポリメラーゼを含
有する。
【００４１】（図の説明）図１はDEXASの略図。２つの
オリゴヌクレオチド（27マー）、標識および未標識オリ
ゴヌクレオチドまたはFITCで標識されたオリゴヌクレオ
チドおよびCy5で標識されたオリゴヌクレオチドのいず
れかを（2：1の比率）、ヒトゲノムＤＮＡ（250ng〜３
μg）、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシヌ
クレオチド、およびそれぞれの場合につきジデオキシヌ
クレオチドの１つと、４本のチューブ中で混合する。変
性およびそれに続くアニーリングおよび伸長のサイクル
を行なう。各伸長の間に、該プライマーを相補的プライ
マーの位置まで伸長させるか、またはこの伸長をジデオ
キシヌクレオチドの取込みにより中断させる。後続のサ
イクルでは、これらの前者の産物は、完全長産物のさら
なる産生および終結反応のための鋳型として機能し、後
者の産物は、行なうすべてのサイクルの間に蓄積し、生
成する配列シグナルに寄与する。サイクルの後反応物を
変性させ、それらの標識に応じて、A.L.F.またはA.L.F.
発現のいずれかで分析する。
オリゴヌクレオチド（27マー）、標識および未標識オリ
ゴヌクレオチドまたはFITCで標識されたオリゴヌクレオ
チドおよびCy5で標識されたオリゴヌクレオチドのいず
れかを（2：1の比率）、ヒトゲノムＤＮＡ（250ng〜３
μg）、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシヌ
クレオチド、およびそれぞれの場合につきジデオキシヌ
クレオチドの１つと、４本のチューブ中で混合する。変
性およびそれに続くアニーリングおよび伸長のサイクル
を行なう。各伸長の間に、該プライマーを相補的プライ
マーの位置まで伸長させるか、またはこの伸長をジデオ
キシヌクレオチドの取込みにより中断させる。後続のサ
イクルでは、これらの前者の産物は、完全長産物のさら
なる産生および終結反応のための鋳型として機能し、後
者の産物は、行なうすべてのサイクルの間に蓄積し、生
成する配列シグナルに寄与する。サイクルの後反応物を
変性させ、それらの標識に応じて、A.L.F.またはA.L.F.
発現のいずれかで分析する。
【００４２】図２はヒトミトコンドリア制御領域の521b
pセグメント上で行なったDEXAS反応を示す図。８pmolの
FITC標識（mtDNA1-L16026）および４pmolの未標識プラ
イマー（mtDNA2-H16498）を、250ngの全ゲノムヒトＤＮ
Ａと共に使用する（詳しくは発明の詳細な説明を参照さ
れたし）。最初の処理塩基の前に強力なシグナルが認め
られ、約440の塩基番号で強力な終結が認められる。配
列は、A.L.F.ソフトウェアで処理し、人手による修正は
しなかった。合計433塩基を決定した。
pセグメント上で行なったDEXAS反応を示す図。８pmolの
FITC標識（mtDNA1-L16026）および４pmolの未標識プラ
イマー（mtDNA2-H16498）を、250ngの全ゲノムヒトＤＮ
Ａと共に使用する（詳しくは発明の詳細な説明を参照さ
れたし）。最初の処理塩基の前に強力なシグナルが認め
られ、約440の塩基番号で強力な終結が認められる。配
列は、A.L.F.ソフトウェアで処理し、人手による修正は
しなかった。合計433塩基を決定した。
【００４３】図３は単コピー遺伝子上で行なったDEXAS
反応を示す図。図3Aは、ヒトp53遺伝子の配列を示し、
図3Bは、ヒトCCR-5遺伝子の配列を示す（詳しくは発明
の詳細な説明を参照されたし）。配列は、A.L.F.ソフト
ウェアで処理し、人手による修正はしなかった。p53遺
伝子の場合には合計305塩基を決定し、CCR-5遺伝子の場
合には343塩基を決定した。
反応を示す図。図3Aは、ヒトp53遺伝子の配列を示し、
図3Bは、ヒトCCR-5遺伝子の配列を示す（詳しくは発明
の詳細な説明を参照されたし）。配列は、A.L.F.ソフト
ウェアで処理し、人手による修正はしなかった。p53遺
伝子の場合には合計305塩基を決定し、CCR-5遺伝子の場
合には343塩基を決定した。
【００４４】図４は種々のオリゴヌクレオチド比を用い
る２色DEXAS反応を示す図。核反応は、250ngのゲノムヒ
トＤＮＡおよび合計量が12pmolのプライマーを用いて行
なった。MtDNA1はFITC（左パネル）で標識し、MtDNA2は
Cy5（右パネル）で標識した。FITC-MtDNA1とCy5-MtDNA2
との比は、２：１（上パネル）、１：１（中央パネル）
および１：２（下パネル）の間で変化した。両プライマ
ーについての最大のSN比は、２：１の比を用いた場合に
得られる。A.L.F.およびA.L.F.発現装置の生データを示
す。塩基シグナルの帰属は、上から下へ順に、それぞれ
C、A、GおよびTである。
る２色DEXAS反応を示す図。核反応は、250ngのゲノムヒ
トＤＮＡおよび合計量が12pmolのプライマーを用いて行
なった。MtDNA1はFITC（左パネル）で標識し、MtDNA2は
Cy5（右パネル）で標識した。FITC-MtDNA1とCy5-MtDNA2
との比は、２：１（上パネル）、１：１（中央パネル）
および１：２（下パネル）の間で変化した。両プライマ
ーについての最大のSN比は、２：１の比を用いた場合に
得られる。A.L.F.およびA.L.F.発現装置の生データを示
す。塩基シグナルの帰属は、上から下へ順に、それぞれ
C、A、GおよびTである。
【００４５】図５はフルオレセイン標識「T3」プライマ
ーとCy5標識「万能(ユニバーサル)」プライマーとを同
時に使用してDEXASを行なった図。この図は、Cy5標識プ
ライマーを用いて得た配列を示す。この２つのプライマ
ーを、単一の細菌コロニーを用いる単一の反応で使用し
た。それぞれ４μgをA.L.F.およびA.L.F.発現上で分析
した。「T3」プライマーによる反応からは407塩基が得
られ、「万能」プライマーによる反応からは668塩基が
得られた。
ーとCy5標識「万能(ユニバーサル)」プライマーとを同
時に使用してDEXASを行なった図。この図は、Cy5標識プ
ライマーを用いて得た配列を示す。この２つのプライマ
ーを、単一の細菌コロニーを用いる単一の反応で使用し
た。それぞれ４μgをA.L.F.およびA.L.F.発現上で分析
した。「T3」プライマーによる反応からは407塩基が得
られ、「万能」プライマーによる反応からは668塩基が
得られた。
【００４６】図６および７はプラスミドの挿入断片を、
FITC標識「T3」プライマーとその反対側のCy5標識「万
能」プライマーとを用いる反応において、両側から配列
決定した図。異なる標識を有する２つのオリゴヌクレオ
チドをDEXASにおいて同時に使用することにより、不明
確（ambiguous）な位置を残すことなく、548塩基の挿入
断片を配列決定することができた。それらのプライマー
は、互いに670bpの間隔で位置していた。
FITC標識「T3」プライマーとその反対側のCy5標識「万
能」プライマーとを用いる反応において、両側から配列
決定した図。異なる標識を有する２つのオリゴヌクレオ
チドをDEXASにおいて同時に使用することにより、不明
確（ambiguous）な位置を残すことなく、548塩基の挿入
断片を配列決定することができた。それらのプライマー
は、互いに670bpの間隔で位置していた。
【００４７】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、これらの実施例は、本発明を限定するもので
はない。
明するが、これらの実施例は、本発明を限定するもので
はない。
【００４８】実施例１ 鋳型の調製 迅速クリーニングキット（Cambridge Molecular Techno
logies Ltd., Cambridge, UK）を用いて、２mlの血液サ
ンプルから全ゲノムヒトＤＮＡを調製した。精製された
ＤＮＡを、ddH2O中に希釈して、濃度175ng/μlとした。
logies Ltd., Cambridge, UK）を用いて、２mlの血液サ
ンプルから全ゲノムヒトＤＮＡを調製した。精製された
ＤＮＡを、ddH2O中に希釈して、濃度175ng/μlとした。
【００４９】配列決定用試薬および条件 未標識オリゴヌクレオチドおよびFITC標識オリゴヌクレ
オチドを、ABI DNA/RNAシンセサイザーモデル392で合成
した。Cy5標識オリゴヌクレオチドを、Pharmacia Biote
ch Company（Freiburg, Germany）から入手した。ミト
コンドリア制御領域（mtDNA）、p53遺伝子（p53）およ
びCCR-5遺伝子（CCR-5）を配列決定するために、それぞ
れの場合に以下のオリゴヌクレオチドを使用した： 配列番号１： （mtDNA1-L16026）: 5'-GAT TCT AAT TTA AAC TAT TCT CTG TTC-3'; 配列番号２： （mtDNA2-H16498）:5'-TTA TGA CCC TGA AGT AGG AAC CAG ATG-3'; 配列番号３： （p53-1/エキソン-7）:5'-GGA GGC ACT TGC CAC CCT GCA CAC TGG-3'; 配列番号４： （53-2/イントロン-8）:5'-CTC CTC CAC CGC TTC TTG TTC TGC TTG-3'; 配列番号５： （CCR5-1）:5'-GGC TGG TCC TGC CGC TGC TTG TCA T-3'; 配列番号６： （CCR5-2）:5'-CTG CTC CCC AGT GGA TCG GGT GTA AAC-3'。
オチドを、ABI DNA/RNAシンセサイザーモデル392で合成
した。Cy5標識オリゴヌクレオチドを、Pharmacia Biote
ch Company（Freiburg, Germany）から入手した。ミト
コンドリア制御領域（mtDNA）、p53遺伝子（p53）およ
びCCR-5遺伝子（CCR-5）を配列決定するために、それぞ
れの場合に以下のオリゴヌクレオチドを使用した： 配列番号１： （mtDNA1-L16026）: 5'-GAT TCT AAT TTA AAC TAT TCT CTG TTC-3'; 配列番号２： （mtDNA2-H16498）:5'-TTA TGA CCC TGA AGT AGG AAC CAG ATG-3'; 配列番号３： （p53-1/エキソン-7）:5'-GGA GGC ACT TGC CAC CCT GCA CAC TGG-3'; 配列番号４： （53-2/イントロン-8）:5'-CTC CTC CAC CGC TTC TTG TTC TGC TTG-3'; 配列番号５： （CCR5-1）:5'-GGC TGG TCC TGC CGC TGC TTG TCA T-3'; 配列番号６： （CCR5-2）:5'-CTG CTC CCC AGT GGA TCG GGT GTA AAC-3'。
【００５０】該mtDNAプライマーの番号は、Andersonら
（(1981) Nature 290, 457-465）による3'末端を意味
し、LおよびHは、それぞれL鎖およびH鎖を意味する。DE
XAS反応は、ThermoSequenaseTM（Tabor, S.およびRicha
rdson, C.C. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,
6339-6343）（Amersham, UK）試薬または以下の10×緩
衝液：500mMトリス−HCl（pH9.2）、160mM (NH4)2SO4、
35mM MgCl2（ScienTechCorp., St. Louis, MO）のいず
れかを使用して行なった。３つの異なるヌクレオチド混
合物を、終結に関して評価した：（i）1：333、１mM dA
TP、１mM dCTP、１mM dGTP、１mM dTTP（A、C、Gおよび
T反応のそれぞれには、３μMの対応するジデオキシヌク
レオチドが含まれていた）、（ii）1：666（それぞれの
場合、１mMの各デオキシヌクレオチドも含有し、1.5μM
の対応するジデオキシヌクレオチドを含む）、（iii）
1：1000（それぞれの場合、１mMの各デオキシヌクレオ
チドも含有し、1.0μMの対応するジデオキシヌクレオチ
ドを含む）。すべての終結混合物は、50mMトリス−HCl
（pH9.2）、16mM (NH4)2SO4、５mM MgCl2を用いて調製
した。
（(1981) Nature 290, 457-465）による3'末端を意味
し、LおよびHは、それぞれL鎖およびH鎖を意味する。DE
XAS反応は、ThermoSequenaseTM（Tabor, S.およびRicha
rdson, C.C. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,
6339-6343）（Amersham, UK）試薬または以下の10×緩
衝液：500mMトリス−HCl（pH9.2）、160mM (NH4)2SO4、
35mM MgCl2（ScienTechCorp., St. Louis, MO）のいず
れかを使用して行なった。３つの異なるヌクレオチド混
合物を、終結に関して評価した：（i）1：333、１mM dA
TP、１mM dCTP、１mM dGTP、１mM dTTP（A、C、Gおよび
T反応のそれぞれには、３μMの対応するジデオキシヌク
レオチドが含まれていた）、（ii）1：666（それぞれの
場合、１mMの各デオキシヌクレオチドも含有し、1.5μM
の対応するジデオキシヌクレオチドを含む）、（iii）
1：1000（それぞれの場合、１mMの各デオキシヌクレオ
チドも含有し、1.0μMの対応するジデオキシヌクレオチ
ドを含む）。すべての終結混合物は、50mMトリス−HCl
（pH9.2）、16mM (NH4)2SO4、５mM MgCl2を用いて調製
した。
【００５１】１μl（単位は不明）TaquenaseTM（ScienT
ech Corp., St. Louis, MO）と１単位の耐熱性ピロホス
ファターゼ（NEB, Beverly, MA）との前混合物を、各配
列決定反応について調製した。ThermoSequenase反応の
場合、該製造業者の推奨どおりに該反応液を調製した。
別の場合には、プライマー（２pmol〜12pmol）、ＤＮＡ
（15ng〜1.5μg）、配列決定用緩衝液（２μlの10×緩
衝液、前記を参照されたし）および酵素の混合物20μl
を調製し、５μlのこのアリコートを２μlの終結混合物
に加えた。配列決定反応は、加熱可能なカバーを有する
サーモサイクラー（MJ-Research, Watertown, MA）中で
行なった。該反応を、５μlのホルムアミド（20mM EDTA
（pH7.4）および６mg/mlデキストランブルー）加えるこ
とにより停止し、ついで95℃で４分間変性させた。
ech Corp., St. Louis, MO）と１単位の耐熱性ピロホス
ファターゼ（NEB, Beverly, MA）との前混合物を、各配
列決定反応について調製した。ThermoSequenase反応の
場合、該製造業者の推奨どおりに該反応液を調製した。
別の場合には、プライマー（２pmol〜12pmol）、ＤＮＡ
（15ng〜1.5μg）、配列決定用緩衝液（２μlの10×緩
衝液、前記を参照されたし）および酵素の混合物20μl
を調製し、５μlのこのアリコートを２μlの終結混合物
に加えた。配列決定反応は、加熱可能なカバーを有する
サーモサイクラー（MJ-Research, Watertown, MA）中で
行なった。該反応を、５μlのホルムアミド（20mM EDTA
（pH7.4）および６mg/mlデキストランブルー）加えるこ
とにより停止し、ついで95℃で４分間変性させた。
【００５２】配列決定反応は、FITC標識プライマーを使
用する場合にはA.L.F.上で分析し、Cy5標識プライマー
を使用する場合にはA.L.F.発現上で分析した（共にPhar
maciaBiotech, Uppsala, Sweden）。すべての場合に、H
ydroLink Long RangerTM（FMC, Rockland, ME）ゲルお
よび30cmガラス板を使用した。該ゲル条件は、該製造業
者の推奨に従った。
用する場合にはA.L.F.上で分析し、Cy5標識プライマー
を使用する場合にはA.L.F.発現上で分析した（共にPhar
maciaBiotech, Uppsala, Sweden）。すべての場合に、H
ydroLink Long RangerTM（FMC, Rockland, ME）ゲルお
よび30cmガラス板を使用した。該ゲル条件は、該製造業
者の推奨に従った。
【００５３】実施例２ ミトコンドリアＤＮＡ配列のDEXAS 共にヒトミトコンドリア制御領域の521塩基対領域に及
ぶ27ヌクレオチド長の２つのオリゴヌクレオチドを合成
した。誤ったプライマー位置にプライマーが非特異的に
アニーリングするのを最小限に抑え、すべての合成工程
中に反応温度を62℃以上に維持できるようにするため
に、27マーを使用した。その２つのオリゴヌクレオチド
の一方（mtDNA1）の5'末端をフルオレセインで標識し、
もう一方（mtDNA2）は標識しなかった。該プライマーを
各４pmol、酵素（ＤＮＡポリメラーゼおよび耐熱性ピロ
ホスファターゼ）、反応緩衝液およびデオキシヌクレオ
チドとジデオキシヌクレオチドとの混合物を含有するTh
ermoSequenseTM（Amersham,UK）試薬と混合した。種々
の量のヒトＤＮＡ（500ng、250ng、125ng、62ng、０n
g）を、この混合物の個々のアリコートに加えた。500ng
の鋳型ＤＮＡ（ただし、未標識プライマーを除く）を１
本のチューブに加えた。鋳型ＤＮＡを完全に変性出来る
ように、該反応を95℃で３分間インキュベートした。つ
いで、それぞれ62℃で30秒および95℃で40秒の35サイク
ルを行なった。A.L.F.配列決定用ゲル上にローディング
する前に、ホルムアミドを加え95℃で４分間加熱して該
反応を停止し変性させた。
ぶ27ヌクレオチド長の２つのオリゴヌクレオチドを合成
した。誤ったプライマー位置にプライマーが非特異的に
アニーリングするのを最小限に抑え、すべての合成工程
中に反応温度を62℃以上に維持できるようにするため
に、27マーを使用した。その２つのオリゴヌクレオチド
の一方（mtDNA1）の5'末端をフルオレセインで標識し、
もう一方（mtDNA2）は標識しなかった。該プライマーを
各４pmol、酵素（ＤＮＡポリメラーゼおよび耐熱性ピロ
ホスファターゼ）、反応緩衝液およびデオキシヌクレオ
チドとジデオキシヌクレオチドとの混合物を含有するTh
ermoSequenseTM（Amersham,UK）試薬と混合した。種々
の量のヒトＤＮＡ（500ng、250ng、125ng、62ng、０n
g）を、この混合物の個々のアリコートに加えた。500ng
の鋳型ＤＮＡ（ただし、未標識プライマーを除く）を１
本のチューブに加えた。鋳型ＤＮＡを完全に変性出来る
ように、該反応を95℃で３分間インキュベートした。つ
いで、それぞれ62℃で30秒および95℃で40秒の35サイク
ルを行なった。A.L.F.配列決定用ゲル上にローディング
する前に、ホルムアミドを加え95℃で４分間加熱して該
反応を停止し変性させた。
【００５４】ＤＮＡを加えなかった場合には、配列を検
出できなかった。標識プライマーだけを加え未標識プラ
イマーを加えなかった場合には、配列を検出できなかっ
た。しかしながら、62ng以上の鋳型を加えた場合には、
配列曲線が得られた。250ngおよび500ngの鋳型を使用し
た反応では、A.L.F.ソフトウェアにより400塩基以上を
決定することができた。
出できなかった。標識プライマーだけを加え未標識プラ
イマーを加えなかった場合には、配列を検出できなかっ
た。しかしながら、62ng以上の鋳型を加えた場合には、
配列曲線が得られた。250ngおよび500ngの鋳型を使用し
た反応では、A.L.F.ソフトウェアにより400塩基以上を
決定することができた。
【００５５】一定量の鋳型ＤＮＡ（500ng）およびその
２つのプライマー（合計12pmol）を用いて、標識プライ
マーと未標識プライマーとの比を、それぞれの場合に、
３：１、２：１、１：１および１：３で変化させた。該
プライマーが等モル量で存在する反応では低いシグナル
を得たにすぎなかったが、他のすべての比率では、標識
または未標識プライマーが過剰に存在するか否かにかか
わらず、より優れた結果を得た。２：１および１：２の
比率においては、最高の結果を得た。この両方の不等モ
ル比が有利であるということは、予想外で驚くべきこと
であった。本発明者らは現在、８pmolのプライマーmtDN
A1および４pmolのプライマーmtDNA2を用いて、ミトコン
ドリア制御領域の450塩基対を日常的に決定している。
２つのプライマー（合計12pmol）を用いて、標識プライ
マーと未標識プライマーとの比を、それぞれの場合に、
３：１、２：１、１：１および１：３で変化させた。該
プライマーが等モル量で存在する反応では低いシグナル
を得たにすぎなかったが、他のすべての比率では、標識
または未標識プライマーが過剰に存在するか否かにかか
わらず、より優れた結果を得た。２：１および１：２の
比率においては、最高の結果を得た。この両方の不等モ
ル比が有利であるということは、予想外で驚くべきこと
であった。本発明者らは現在、８pmolのプライマーmtDN
A1および４pmolのプライマーmtDNA2を用いて、ミトコン
ドリア制御領域の450塩基対を日常的に決定している。
【００５６】DEXAS反応では、ジデオキシヌクレオチド
（ddNTP）に対するデオキシヌクレオチド（dNTP）の比
率は、種々の値をとることができる。おそらく、dNTPの
割合が高くなるほど、各サイクルにおける鋳型産生の増
加し得るであろう。一方、ddNTPの割合が高くなるほ
ど、伸長産物が第２未標識プライマーのプライミング位
に到達する前に終結することが多くなるであろう。後者
の産物は、配列決定反応には寄与するが、さらなる鋳型
増幅には寄与しない。dNTPに対するddNTPの比率が反応
に及ぼす影響がどの程度であるかを判定するために、dd
NTPをdNTPと１：333、１：666および１：1000の比率で
混合し、８pmolのFITC標識プライマー（mtDNA1）、４pm
olの未標識プライマー（mtDNA2）および300ngのヒトＤ
ＮＡを含有するDEXAS反応で使用した。反応条件は、前
記のとおりであった。その結果、１：666（ddNTP：dNT
P）の比率で、より強力なシグナルが得られることが示
された。
（ddNTP）に対するデオキシヌクレオチド（dNTP）の比
率は、種々の値をとることができる。おそらく、dNTPの
割合が高くなるほど、各サイクルにおける鋳型産生の増
加し得るであろう。一方、ddNTPの割合が高くなるほ
ど、伸長産物が第２未標識プライマーのプライミング位
に到達する前に終結することが多くなるであろう。後者
の産物は、配列決定反応には寄与するが、さらなる鋳型
増幅には寄与しない。dNTPに対するddNTPの比率が反応
に及ぼす影響がどの程度であるかを判定するために、dd
NTPをdNTPと１：333、１：666および１：1000の比率で
混合し、８pmolのFITC標識プライマー（mtDNA1）、４pm
olの未標識プライマー（mtDNA2）および300ngのヒトＤ
ＮＡを含有するDEXAS反応で使用した。反応条件は、前
記のとおりであった。その結果、１：666（ddNTP：dNT
P）の比率で、より強力なシグナルが得られることが示
された。
【００５７】実施例３ ヒトＤＮＡ配列の単コピーのDEXAS 単コピーＤＮＡ配列に対するDEXASの適用性を評価する
ために、ヒトp53遺伝子のイントロン７およびエキソン
８の507塩基対セグメントに隣接するプライマーを合成
した。８pmolのFITC標識配列決定用プライマー（p53-
1）、４pmolの未標識（p53-2）プライマーおよび3.5μ
g、1.75μg、875ngおよび430ngのヒトＤＮＡをそれぞれ
含有するDEXAS反応を調製した。これらの反応では、95
℃で３分間変性させ、62℃で30秒および95℃で40秒より
なる40サイクルを行なった。その結果、明らかに読み取
り可能な配列が示された。この結果を改善するために、
このプロトコールの種々の改変を評価した。アニーリン
グ温度を上昇させ、配列決定用プライマーの量を減少さ
せた。さらに、サイクル数を47に増加させ、種々のプラ
イマー比および鋳型濃度を評価した。８pmolのFITC標識
プライマーおよび４pmolの未標識プライマー、および68
℃で30秒および95℃で30秒のサイクル温度を用いた場合
に、最良の結果を得た。これらの条件では、５つの実験
において、１反応あたり１〜５個のアンビギュイティー
を有する260〜320塩基の配列を得た（図3A）。約１μg
以上の鋳型を使用した場合には、自動処理を用いるA.L.
F.ソフトウェアで配列シグナル読み取った。
ために、ヒトp53遺伝子のイントロン７およびエキソン
８の507塩基対セグメントに隣接するプライマーを合成
した。８pmolのFITC標識配列決定用プライマー（p53-
1）、４pmolの未標識（p53-2）プライマーおよび3.5μ
g、1.75μg、875ngおよび430ngのヒトＤＮＡをそれぞれ
含有するDEXAS反応を調製した。これらの反応では、95
℃で３分間変性させ、62℃で30秒および95℃で40秒より
なる40サイクルを行なった。その結果、明らかに読み取
り可能な配列が示された。この結果を改善するために、
このプロトコールの種々の改変を評価した。アニーリン
グ温度を上昇させ、配列決定用プライマーの量を減少さ
せた。さらに、サイクル数を47に増加させ、種々のプラ
イマー比および鋳型濃度を評価した。８pmolのFITC標識
プライマーおよび４pmolの未標識プライマー、および68
℃で30秒および95℃で30秒のサイクル温度を用いた場合
に、最良の結果を得た。これらの条件では、５つの実験
において、１反応あたり１〜５個のアンビギュイティー
を有する260〜320塩基の配列を得た（図3A）。約１μg
以上の鋳型を使用した場合には、自動処理を用いるA.L.
F.ソフトウェアで配列シグナル読み取った。
【００５８】単コピー遺伝子に対するDEXASの一般的な
適用性をさらに評価するために、CCR-5遺伝子の382塩基
対セグメントに隣接するプライマーを合成した。３pmol
のCCR5-1、６pmolのFITC標識プライマーCCR5-2、0.5〜
1.0μgの鋳型ＤＮＡおよび45サイクルのDEXASを用い
た。40個のサンプルに対する配列決定反応では、読み取
られる長さは、230bp〜351bp（平均294bp）であった。
典型的な反応を図3Bに示す。
適用性をさらに評価するために、CCR-5遺伝子の382塩基
対セグメントに隣接するプライマーを合成した。３pmol
のCCR5-1、６pmolのFITC標識プライマーCCR5-2、0.5〜
1.0μgの鋳型ＤＮＡおよび45サイクルのDEXASを用い
た。40個のサンプルに対する配列決定反応では、読み取
られる長さは、230bp〜351bp（平均294bp）であった。
典型的な反応を図3Bに示す。
【００５９】実施例４ 両ＤＮＡ鎖の同時配列決定 異なる蛍光標識を有する２つのプライマーを用いる単一
の反応で、プラスミドＤＮＡの両方の相補的ＤＮＡ鎖を
配列決定する事が可能であることが示された（Wiemann,
S.ら, (1995) Analytical Biochemistry 224, 117-12
1）。DEXASに対するこのアプローチの適用性は、FITC標
識プライマー（mtDNA1）、Cy5標識プライマー（mtDNA
2）および鋳型として500ngのヒトＤＮＡを用いて分析し
た。前記反応条件を維持しながら、プライマーの比率
（FITC-mtDNA1：Cy5-mtDNA2）を変化させた（３：1、
２：１、１：１、１：２および１：３）。サイクル反応
および変性の後、５μgの反応液をA.L.F.またはA.L.F.
発現装置に適用した。以前の実験と同様、等モル量のプ
ライマーを使用した場合には、不等モル量を使用した反
応と比べて、得られた結果はかなり劣っていた（図
４）。12pmolの合計量で２：１の比率の場合に、最良の
SN比が得られた。こうした反応では、不明確な位置を生
じることなく、両方の鎖上で450塩基が読み取られた。C
y5標識プライマーより多量のFITC標識プライマーを用い
る方が有利であるという考察はおそらく、さらに別の遺
伝子において、２色に基づくアプローチが単コピーにも
適用できることを示すことができた（FITCに比べてCy5
はSN比において優れている）実験によるものであろう。
の反応で、プラスミドＤＮＡの両方の相補的ＤＮＡ鎖を
配列決定する事が可能であることが示された（Wiemann,
S.ら, (1995) Analytical Biochemistry 224, 117-12
1）。DEXASに対するこのアプローチの適用性は、FITC標
識プライマー（mtDNA1）、Cy5標識プライマー（mtDNA
2）および鋳型として500ngのヒトＤＮＡを用いて分析し
た。前記反応条件を維持しながら、プライマーの比率
（FITC-mtDNA1：Cy5-mtDNA2）を変化させた（３：1、
２：１、１：１、１：２および１：３）。サイクル反応
および変性の後、５μgの反応液をA.L.F.またはA.L.F.
発現装置に適用した。以前の実験と同様、等モル量のプ
ライマーを使用した場合には、不等モル量を使用した反
応と比べて、得られた結果はかなり劣っていた（図
４）。12pmolの合計量で２：１の比率の場合に、最良の
SN比が得られた。こうした反応では、不明確な位置を生
じることなく、両方の鎖上で450塩基が読み取られた。C
y5標識プライマーより多量のFITC標識プライマーを用い
る方が有利であるという考察はおそらく、さらに別の遺
伝子において、２色に基づくアプローチが単コピーにも
適用できることを示すことができた（FITCに比べてCy5
はSN比において優れている）実験によるものであろう。
【００６０】
（１）一般的情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：ベーリンガー・マンハイム・ゲー・エム・
ベー・ハー （Ｂ）通り：ザントホフェルソトル．116 （Ｃ）市：マンハイム （Ｅ）国：ドイツ （Ｆ）郵便番号（ZIP）：68305 （Ｇ）電話番号：06217595482 （Ｈ）電話ファクシミリ：06217594457 （ii）発明の名称：ＤＮＡ分子の直接的な指数関数的増
幅および配列決定のための方法並びにその用途 （iii）配列の数：６ （iv）コンピューター読み取り形式： （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：IBM PC互換機 （Ｃ）オペレーティングシステム：PC−DOS／MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース#1.0、バ
ージョン#1.30（EPO）
ベー・ハー （Ｂ）通り：ザントホフェルソトル．116 （Ｃ）市：マンハイム （Ｅ）国：ドイツ （Ｆ）郵便番号（ZIP）：68305 （Ｇ）電話番号：06217595482 （Ｈ）電話ファクシミリ：06217594457 （ii）発明の名称：ＤＮＡ分子の直接的な指数関数的増
幅および配列決定のための方法並びにその用途 （iii）配列の数：６ （iv）コンピューター読み取り形式： （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：IBM PC互換機 （Ｃ）オペレーティングシステム：PC−DOS／MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース#1.0、バ
ージョン#1.30（EPO）
【００６１】（２）配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：27塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：/desc=「オリゴヌクレオチド」 （xi）配列：配列番号１： GATTCTAATT TAAACTATTC TCTGTTC 27
【００６２】（２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：27塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：/desc=「オリゴヌクレオチド」 （xi）配列：配列番号２： TTATGACCCT GAAGTAGGAA CCAGATG 27
【００６３】（２）配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：27塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：/desc=「オリゴヌクレオチド」 （xi）配列：配列番号３： GGAGGCACTT GCCACCCTGC ACACTGG 27
【００６４】（２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：27塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：/desc=「オリゴヌクレオチド」 （xi）配列：配列番号４： CTCCTCCACC GCTTCTTGTT CTGCTTG 27
【００６５】（２）配列番号５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：25塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：/desc=「オリゴヌクレオチド」 （xi）配列：配列番号５： GGCTGGTCCT GCCGCTGCTT GTCAT 25
【００６６】（２）配列番号６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：27塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：/desc=「オリゴヌクレオチド」 （xi）配列：配列番号６： CTGCTCCCCA GTGGATCGGG TGTAAAC 27
【図１】 DEXASの略図。
【図２】 ヒトミトコンドリア制御領域の521bpセグメ
ント上で行なったDEXAS反応を示す図。
ント上で行なったDEXAS反応を示す図。
【図３】 単コピー遺伝子上で行なったDEXAS反応を示
す図。
す図。
【図４】 種々のオリゴヌクレオチド比を用いる２色DE
XAS反応を示す図。
XAS反応を示す図。
【図５】 フルオレセイン標識「T3」プライマーとCy5
標識「万能(ユニバーサル)」プライマーとを同時に使用
してDEXASを行なった図。
標識「万能(ユニバーサル)」プライマーとを同時に使用
してDEXASを行なった図。
【図６】 プラスミドの挿入断片を、FITC標識「T3」プ
ライマーとその反対側のCy5標識「万能」プライマーと
を用いる反応において、両側から配列決定した図。
ライマーとその反対側のCy5標識「万能」プライマーと
を用いる反応において、両側から配列決定した図。
【図７】 プラスミドの挿入断片を、FITC標識「T3」プ
ライマーとその反対側のCy5標識「万能」プライマーと
を用いる反応において、両側から配列決定した図。
ライマーとその反対側のCy5標識「万能」プライマーと
を用いる反応において、両側から配列決定した図。
Claims (24)
- 【請求項１】 複雑な核酸混合物からＤＮＡ分子を直接
的に配列決定する方法であって、ＤＮＡ分子、第１プラ
イマー、第２プライマー、反応緩衝液、耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ、デオキシヌクレオチドまたはその誘導体お
よびジデオキシヌクレオチドまたは別の終結ヌクレオチ
ドを最初に含有するサーモサイクル反応で、前記ＤＮＡ
分子上の２つの位置の間で、トランケート化ＤＮＡ分子
および完全長ＤＮＡ分子を同時に合成することを含んで
なり、４種のddNTPに対する該耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼの識別性が、野生型Taqポリメラーゼと比べて減少し
ていることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 ＤＮＡ分子を直接的に配列決定する方法
であって、ＤＮＡ分子、第１プライマー、第２プライマ
ー、反応緩衝液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシ
ヌクレオチドまたはその誘導体およびジデオキシヌクレ
オチドまたはその誘導体を最初に含有するサーモサイク
ル反応で、前記ＤＮＡ分子上の２つの位置の間で、トラ
ンケート化ＤＮＡ分子および完全長ＤＮＡ分子を同時に
合成することを含んでなり、前記サーモサイクル反応に
おいて、前記第１プライマーと第２プライマーの互いの
最初の比率が１より大きいことを特徴とする方法。 - 【請求項３】 前記プライマーの比率が約２：１であ
る、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記方法を１つの容器、器またはチュー
ブの中で１工程で実施する、請求項１〜３に記載の方
法。 - 【請求項５】 前記プライマーが、少なくとも25ヌクレ
オチドの長さを有する、請求項１〜４のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項６】 前記第１プライマーが標識を有する、請
求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 前記第１プライマーおよび前記第２プラ
イマーが、互いに異なる標識を有する、請求項１〜６の
いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 該サーモサイクル反応が、耐熱性ピロホ
スファターゼをさらに含有する、請求項１〜７に記載の
いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 該サーモサイクル反応のアニーリング工
程および合成工程を、少なくとも約62℃の温度で行な
う、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記ＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡであ
る、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記ゲノムＤＮＡが２kb以上の長さで
ある、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 配列決定すべき核酸分子の起源が、精
液、尿、血液、血液サンプルなどの体液、毛、一つの細
胞、複数の細胞またはその画分、組織またはその画分、
および細胞培養物から選ばれる起源である、請求項１〜
１１のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１３】 サーモサイクルに用いる緩衝液中およ
び条件下で、４種のddNTPに対する前記耐熱性ポリメラ
ーゼの識別性が、野生型Taq ＤＮＡポリメラーゼと比べ
て減少している、請求項２〜１２のいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項１４】 前記耐熱性ポリメラーゼが、5'-3'エ
キソヌクレアーゼ活性を持たないテイバー・リチャード
ソン（Tabor-Richardson）突然変異を有するTaq ＤＮＡ
ポリメラーゼまたはその機能性誘導体である、請求項１
〜１３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記耐熱性ポリメラーゼが、Taq ＤＮ
Ａポリメラーゼ（-エキソ5'-3'）（F667Y）またはその
機能性誘導体である、請求項１〜１４のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項１６】 核酸の配列を決定するための、請求項
１〜１５のいずれか１項に記載の方法の使用。 - 【請求項１７】 真核細胞ゲノムＤＮＡの直接的な配列
決定のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の
方法の使用。 - 【請求項１８】 ヒト染色体ＤＮＡまたはミトコンドリ
アＤＮＡの直接的な配列決定のための、請求項１〜１５
のいずれか１項に記載の方法の使用。 - 【請求項１９】 ヒトＲＮＡの直接的な配列決定のため
の、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法の使
用。 - 【請求項２０】 細菌コロニーからの未精製プラスミド
ＤＮＡの直接的な配列決定のための、請求項１〜１５の
いずれか１項に記載の方法の使用。 - 【請求項２１】 バクテリオファージからの未精製の一
本鎖または二本鎖ＤＮＡの直接的な配列決定のための、
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法の使用。 - 【請求項２２】 反応緩衝液、デオキシヌクレオチドま
たはその誘導体およびジデオキシヌクレオチドまたは別
の終結ヌクレオチド、およびddNTPに対する識別性が野
生型Taq ＤＮＡポリメラーゼと比べて減少している耐熱
性ポリメラーゼを含有する、複雑な核酸混合物から核酸
分子を直接的に配列決定するためのキット。 - 【請求項２３】 反応緩衝液、デオキシヌクレオチドま
たはその誘導体、ジデオキシヌクレオチドまたは別の終
結ヌクレオチド、耐熱性ポリメラーゼ、およびその比率
が１より大きい２つのプライマーを含有する、核酸分子
を直接的に配列決定するためのキット。 - 【請求項２４】 ddNTPに対する該耐熱性ポリメラーゼ
の識別性が、野生型Taq ＤＮＡポリメラーゼと比べて減
少している、請求項２３に記載の核酸分子を配列決定す
るためのキット。
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