JP3535812B2 - Ｄｎａ分子合成を目的とした熱サイクル反応における１種類以上の酵素活性の連続的活性化 - Google Patents
Ｄｎａ分子合成を目的とした熱サイクル反応における１種類以上の酵素活性の連続的活性化Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、例えばDNA分子の
シークエンシング、増幅または非共役的、直接的、指数
関数的な増幅およびシークエンシング、共役的逆転写お
よび増幅反応（これら全ての反応は少なくとも２つの異
なる酵素活性を含む）などの反応における、１種類以上
の酵素活性の連続的活性化を伴う方法に関する。
シークエンシング、増幅または非共役的、直接的、指数
関数的な増幅およびシークエンシング、共役的逆転写お
よび増幅反応（これら全ての反応は少なくとも２つの異
なる酵素活性を含む）などの反応における、１種類以上
の酵素活性の連続的活性化を伴う方法に関する。
【０００２】特に本発明は、熱サイクル反応によるDNA
分子の非共役的、直接的、指数関数的な増幅およびシー
クエンシングのための方法に関する。この方法では初め
に、核酸分子、第１プライマー、第２プライマー、反応
バッファー、デオキシヌクレオチドまたはその誘導体、
および少なくとも１種類のジデオキシヌクレオチドまた
は別の終結ヌクレオチドを含み、その熱サイクル反応に
おいては、ジデオキシヌクレオチドの取り込みに関して
異なる特性を有する少なくとも２種類の熱安定性DNAポ
リメラーゼを含み、その２種類の熱安定性DNAポリメラ
ーゼの一方は、熱サイクル反応において他方の熱安定性
DNAポリメラーゼよりも後のサイクルで活性化される。
本発明はさらに、「サイレントプライマー」と呼ぶ第２
のプライマー対の使用に関する。このプライマー対は第
３および最終的には第４のプライマーを含んでなり、こ
れらは標識されないか、第１のプライマー対（少なくと
もその一方が標識化またはビオチン化される）とは異な
って標識される。
分子の非共役的、直接的、指数関数的な増幅およびシー
クエンシングのための方法に関する。この方法では初め
に、核酸分子、第１プライマー、第２プライマー、反応
バッファー、デオキシヌクレオチドまたはその誘導体、
および少なくとも１種類のジデオキシヌクレオチドまた
は別の終結ヌクレオチドを含み、その熱サイクル反応に
おいては、ジデオキシヌクレオチドの取り込みに関して
異なる特性を有する少なくとも２種類の熱安定性DNAポ
リメラーゼを含み、その２種類の熱安定性DNAポリメラ
ーゼの一方は、熱サイクル反応において他方の熱安定性
DNAポリメラーゼよりも後のサイクルで活性化される。
本発明はさらに、「サイレントプライマー」と呼ぶ第２
のプライマー対の使用に関する。このプライマー対は第
３および最終的には第４のプライマーを含んでなり、こ
れらは標識されないか、第１のプライマー対（少なくと
もその一方が標識化またはビオチン化される）とは異な
って標識される。
【０００３】
【従来の技術】Sangerらにより開発されたDNA塩基配列
決定法((1977) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74, 5463-546
7)は、通常T7 DNAポリメラーゼを用いて実施される(Tab
or S.および Richardson,C.C.(1989) Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 86, 4076-4080)。この方法では比較的大量の、
精製された一本鎖DNA鋳型が必要である。近年、サイク
ルシークエンシング法が開発された(Murray, V.(1989)
Nucleic Acids Res.17, 8889)。この方法は一本鎖にし
た鋳型を必要とせず、またシークエンシング反応を比較
的少量の鋳型から開始することができる。しかしなが
ら、鋳型DNAはほぼ完全に均一になるよう精製しなけれ
ばならず、通常、プラスミドへのクローニング(Boliva
r,F.ら,(1977) Gene 2, 95-113)とこれに続くプラスミ
ドの精製(Birnboim,H.C.および Doly,J.(1979) Nucleic
Acids Res.7, 1513-1523)によって調製するか、または
PCR増幅(Mullis,K.B.および Faloona,F.A.(1987) Metho
ds Enzymol.155, 335-350)により調製する。前述の方法
は両方とも、単一のプライマーのみを用いる。
決定法((1977) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74, 5463-546
7)は、通常T7 DNAポリメラーゼを用いて実施される(Tab
or S.および Richardson,C.C.(1989) Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 86, 4076-4080)。この方法では比較的大量の、
精製された一本鎖DNA鋳型が必要である。近年、サイク
ルシークエンシング法が開発された(Murray, V.(1989)
Nucleic Acids Res.17, 8889)。この方法は一本鎖にし
た鋳型を必要とせず、またシークエンシング反応を比較
的少量の鋳型から開始することができる。しかしなが
ら、鋳型DNAはほぼ完全に均一になるよう精製しなけれ
ばならず、通常、プラスミドへのクローニング(Boliva
r,F.ら,(1977) Gene 2, 95-113)とこれに続くプラスミ
ドの精製(Birnboim,H.C.および Doly,J.(1979) Nucleic
Acids Res.7, 1513-1523)によって調製するか、または
PCR増幅(Mullis,K.B.および Faloona,F.A.(1987) Metho
ds Enzymol.155, 335-350)により調製する。前述の方法
は両方とも、単一のプライマーのみを用いる。
【０００４】サイクルシークエンシング法の一つの実施
形態であって、「共役させた増幅およびシークエンシン
グ(coupled amplification and sequencing)」すなわち
「CAS」と呼ばれるものにおいて、RuanoおよびKiddは、
DNA鋳型から配列を得るために二段階のプロトコールを
用いることができることを示した((1991)Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 88,2815-2819; 米国特許第5,427,911号)。そ
の第１工程では、ジデオキシヌクレオチドの不存在下
で、Taq DNAポリメラーゼを用いたPCRを15サイクル行な
い、十分量のシークエンシング用鋳型を調製する。第２
工程では、ジデオキシヌクレオチドおよび標識プライマ
ーを加え、CASによって標的配列のさらなる増幅だけで
なくその配列を得る。この方法の両方の工程では２種類
のプライマーが用いられる。
形態であって、「共役させた増幅およびシークエンシン
グ(coupled amplification and sequencing)」すなわち
「CAS」と呼ばれるものにおいて、RuanoおよびKiddは、
DNA鋳型から配列を得るために二段階のプロトコールを
用いることができることを示した((1991)Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 88,2815-2819; 米国特許第5,427,911号)。そ
の第１工程では、ジデオキシヌクレオチドの不存在下
で、Taq DNAポリメラーゼを用いたPCRを15サイクル行な
い、十分量のシークエンシング用鋳型を調製する。第２
工程では、ジデオキシヌクレオチドおよび標識プライマ
ーを加え、CASによって標的配列のさらなる増幅だけで
なくその配列を得る。この方法の両方の工程では２種類
のプライマーが用いられる。
【０００５】共役させたDNAシークエンシング反応に用
いる、Taq DNAポリメラーゼをはじめとする多くのDNAポ
リメラーゼは、dNTPsとddNTPsの混合物と共に与えられ
ても、ddNTPsを強力に識別し、dNTPsを好んで取り込
む。したがって、CAS工程の最適化には、ジデオキシヌ
クレオチドについての注意深い力価測定が必要である。
いる、Taq DNAポリメラーゼをはじめとする多くのDNAポ
リメラーゼは、dNTPsとddNTPsの混合物と共に与えられ
ても、ddNTPsを強力に識別し、dNTPsを好んで取り込
む。したがって、CAS工程の最適化には、ジデオキシヌ
クレオチドについての注意深い力価測定が必要である。
【０００６】さらに、共役させた増幅およびシークエン
シングは、DNAの初期量、２つのプライマー間の距離、
および互いに対するddNTPsとdNTPsの比率と濃度に依存
するので、共役させた増幅およびシークエンシング反応
(CAS)の最適化については、特定のDNA断片に対して個々
に反応条件を最適化する必要がある。
シングは、DNAの初期量、２つのプライマー間の距離、
および互いに対するddNTPsとdNTPsの比率と濃度に依存
するので、共役させた増幅およびシークエンシング反応
(CAS)の最適化については、特定のDNA断片に対して個々
に反応条件を最適化する必要がある。
【０００７】シークエンシングに用いられる他の公知の
熱安定性ポリメラーゼ、例えばThermoSequenaseおよびT
aquenaseは、「Tabor Richardson」突然変異(Tabor,S.&
Richardson,C.C.(1995) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,
6339-6343)として知られる突然変異を有する。この突然
変異では、DNA分子の重合が形成される際にデオキシヌ
クレオチドまたはジデオキシヌクレオチドのそれぞれの
取り込みを識別するはたらきをする該酵素のクレフト
(活性中心のくぼみ)に、フェニルアラニンの代わりにチ
ロシンが存在する。それらの酵素またはその機能的誘導
体は、形成されつつあるDNA断片中にジデオキシヌクレ
オチドを取り込む能力が増大しており、シークエンシン
グ反応におけるシグナルの均一性を改良するために用い
られ得る。Tabor-Richardson突然変異を有する前記DNA
ポリメラーゼはジデオキシヌクレオチドを取り込む能力
が増大しているため、形成中のDNA分子中にジデオキシ
ヌクレオチドを取り込んで連鎖終結を起こさせる統計的
確率は増加する。
熱安定性ポリメラーゼ、例えばThermoSequenaseおよびT
aquenaseは、「Tabor Richardson」突然変異(Tabor,S.&
Richardson,C.C.(1995) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,
6339-6343)として知られる突然変異を有する。この突然
変異では、DNA分子の重合が形成される際にデオキシヌ
クレオチドまたはジデオキシヌクレオチドのそれぞれの
取り込みを識別するはたらきをする該酵素のクレフト
(活性中心のくぼみ)に、フェニルアラニンの代わりにチ
ロシンが存在する。それらの酵素またはその機能的誘導
体は、形成されつつあるDNA断片中にジデオキシヌクレ
オチドを取り込む能力が増大しており、シークエンシン
グ反応におけるシグナルの均一性を改良するために用い
られ得る。Tabor-Richardson突然変異を有する前記DNA
ポリメラーゼはジデオキシヌクレオチドを取り込む能力
が増大しているため、形成中のDNA分子中にジデオキシ
ヌクレオチドを取り込んで連鎖終結を起こさせる統計的
確率は増加する。
【０００８】それゆえTabor-Richardson突然変異を有す
る熱安定性ポリメラーゼを使用することにより、シーク
エンシングすべきDNA分子上の２つのプライマーが配置
される距離間隔は、制限されるであろうことが予想され
る。これはひいては、ある特定のシークエンシング反応
に用いることのできるプライマーの選択を制限する。
る熱安定性ポリメラーゼを使用することにより、シーク
エンシングすべきDNA分子上の２つのプライマーが配置
される距離間隔は、制限されるであろうことが予想され
る。これはひいては、ある特定のシークエンシング反応
に用いることのできるプライマーの選択を制限する。
【０００９】上記の全ての方法では、鋳型DNAの指数関
数的増幅を行う第１工程と、末端短縮型DNA分子の合成
を行う第２工程の間に中断する必要があり、また特定の
DNA断片についてそれぞれの最適化が必要である。この
個々の最適化はうんざりする、そして時間のかかる作業
であり、また多数の異なるDNA分子を配列決定したり、
病院または研究室で大量のサンプルを処理したり、法医
学的または考古学的研究のためのめったにないサンプル
を配列決定したりするときには特に、誤りにつながる可
能性がある。
数的増幅を行う第１工程と、末端短縮型DNA分子の合成
を行う第２工程の間に中断する必要があり、また特定の
DNA断片についてそれぞれの最適化が必要である。この
個々の最適化はうんざりする、そして時間のかかる作業
であり、また多数の異なるDNA分子を配列決定したり、
病院または研究室で大量のサンプルを処理したり、法医
学的または考古学的研究のためのめったにないサンプル
を配列決定したりするときには特に、誤りにつながる可
能性がある。
【００１０】この理由から、核酸を配列決定する方法で
あって、完全長の分子と短くされた長さの分子の指数関
数的増幅が反応中で同時に促進され得るようにし、必要
な核酸分子の初期量を減らすことにつながり、さらに反
応全体をより速やかにより少ない操作で行うことができ
るように指数関数的増幅工程とシークエンシング工程の
中断を必要としない方法が開発された(EP 0 849 364お
よび EP 0 854 196)。
あって、完全長の分子と短くされた長さの分子の指数関
数的増幅が反応中で同時に促進され得るようにし、必要
な核酸分子の初期量を減らすことにつながり、さらに反
応全体をより速やかにより少ない操作で行うことができ
るように指数関数的増幅工程とシークエンシング工程の
中断を必要としない方法が開発された(EP 0 849 364お
よび EP 0 854 196)。
【００１１】核酸分子を配列決定する方法であって、シ
ークエンシングする核酸分子上の２つのプライマーの位
置の距離間隔を拡大することができる方法が開発された
（それぞれDEXAS、DEXTAQと呼ばれる）(EP 0 849 364お
よび EP 0 854 196)。これらの方法は前記プライマー間
の距離には比較的影響を受けず、また一般にシークエン
シングすべき各DNA断片に対して反応条件の最適化を必
要としない。
ークエンシングする核酸分子上の２つのプライマーの位
置の距離間隔を拡大することができる方法が開発された
（それぞれDEXAS、DEXTAQと呼ばれる）(EP 0 849 364お
よび EP 0 854 196)。これらの方法は前記プライマー間
の距離には比較的影響を受けず、また一般にシークエン
シングすべき各DNA断片に対して反応条件の最適化を必
要としない。
【００１２】DEXASおよびDEXTAQは、核酸分子のシーク
エンシングを、中断しない方法で、単一工程および単一
容器で行うことができる高速かつ信頼性のある方法であ
る。DEXASおよびDEXTAQでは、短くされた長さの分子だ
けでなく完全長の分子の指数関数的増幅も同時に増大さ
せ、それによってサイクル反応に必要な核酸分子の初期
量を減らすことができる。
エンシングを、中断しない方法で、単一工程および単一
容器で行うことができる高速かつ信頼性のある方法であ
る。DEXASおよびDEXTAQでは、短くされた長さの分子だ
けでなく完全長の分子の指数関数的増幅も同時に増大さ
せ、それによってサイクル反応に必要な核酸分子の初期
量を減らすことができる。
【００１３】熱サイクリングに用いられるバッファー
中、または条件下で野生型のTaq DNAポリメラーゼと比
較して、ddNTPsの識別力の低い酵素を１種類利用するDE
XAS法とは対照的に、DEXTAQは、２種類の異なる型のDNA
ポリメラーゼ（第１の熱安定性DNAポリメラーゼ、およ
びその第１熱安定性DNAポリメラーゼと比べてジデオキ
シヌクレオチドを取り込む能力が低い、第２の熱安定性
DNAポリメラーゼ）を初めにサイクルシークエンシング
反応に加えることによって実施する。該第１DNAポリメ
ラーゼは短くされた産物を主に産生するものであり、こ
の産物はサイクルの間、指数関数的に蓄積し、シークエ
ンシングラダー生成に寄与する。一方第２DNAポリメラ
ーゼは、第１DNAポリメラーゼと比較してジデオキシヌ
クレオチドの取り込み能力が低く、主として完全長の産
物を産生するものである。その完全長の産物は指数関数
的に蓄積し、後続のサイクルにおいて、シークエンシン
グ反応に寄与する伸長用の鋳型としてだけでなく、完全
長のDNA鎖をさらに産生するための鋳型としても用いら
れる。したがって２種類のポリメラーゼの異なる特性、
すなわち第１DNAポリメラーゼがジデオキシヌクレオチ
ドを効率的に取り込む能力と、第２DNAポリメラーゼが
デオキシヌクレオチドを効率的に取り込む能力の組み合
わせによって、非共役的、直接的、指数関数的な増幅お
よびシークエンシング反応の効率を大幅に増大させるこ
とができる。
中、または条件下で野生型のTaq DNAポリメラーゼと比
較して、ddNTPsの識別力の低い酵素を１種類利用するDE
XAS法とは対照的に、DEXTAQは、２種類の異なる型のDNA
ポリメラーゼ（第１の熱安定性DNAポリメラーゼ、およ
びその第１熱安定性DNAポリメラーゼと比べてジデオキ
シヌクレオチドを取り込む能力が低い、第２の熱安定性
DNAポリメラーゼ）を初めにサイクルシークエンシング
反応に加えることによって実施する。該第１DNAポリメ
ラーゼは短くされた産物を主に産生するものであり、こ
の産物はサイクルの間、指数関数的に蓄積し、シークエ
ンシングラダー生成に寄与する。一方第２DNAポリメラ
ーゼは、第１DNAポリメラーゼと比較してジデオキシヌ
クレオチドの取り込み能力が低く、主として完全長の産
物を産生するものである。その完全長の産物は指数関数
的に蓄積し、後続のサイクルにおいて、シークエンシン
グ反応に寄与する伸長用の鋳型としてだけでなく、完全
長のDNA鎖をさらに産生するための鋳型としても用いら
れる。したがって２種類のポリメラーゼの異なる特性、
すなわち第１DNAポリメラーゼがジデオキシヌクレオチ
ドを効率的に取り込む能力と、第２DNAポリメラーゼが
デオキシヌクレオチドを効率的に取り込む能力の組み合
わせによって、非共役的、直接的、指数関数的な増幅お
よびシークエンシング反応の効率を大幅に増大させるこ
とができる。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、核酸
分子を配列決定するための改良方法を提供することであ
り、この方法によって配列決定すべき核酸分子上に位置
づけられる両方のプライマー間の距離をさらに拡大する
ことができる。
分子を配列決定するための改良方法を提供することであ
り、この方法によって配列決定すべき核酸分子上に位置
づけられる両方のプライマー間の距離をさらに拡大する
ことができる。
【００１５】本発明のさらなる目的は、核酸を配列決定
するための改良方法であって、シグナル対ノイズ比（特
異的かつ正確に終結した分子対非特異的に終結した分
子）をさらに増大させ、より正確に検出できるシークエ
ンシングラダーを生じさせる方法を提供することであ
る。
するための改良方法であって、シグナル対ノイズ比（特
異的かつ正確に終結した分子対非特異的に終結した分
子）をさらに増大させ、より正確に検出できるシークエ
ンシングラダーを生じさせる方法を提供することであ
る。
【００１６】本発明のさらなる目的は、医学的診断、法
医学、集団遺伝学における配列決定に対しての本発明の
方法の適用を提供することである。
医学、集団遺伝学における配列決定に対しての本発明の
方法の適用を提供することである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明は、初めに核酸分
子、第１プライマー(i)、第２プライマー(ii)、反応バ
ッファー、デオキシヌクレオチドまたはその誘導体を含
む熱サイクル反応において核酸分子を合成する方法であ
って、その熱サイクル反応が異なる酵素活性を有する少
なくとも２種類の熱安定性酵素を含み、但し少なくとも
１種類の酵素はDNAポリメラーゼ活性を示すものであ
り、さらにその２種類の酵素の一方は熱サイクル反応に
おいて他方の熱安定性酵素より後のサイクルで活性化さ
れるものである、該方法を含んでなる。
子、第１プライマー(i)、第２プライマー(ii)、反応バ
ッファー、デオキシヌクレオチドまたはその誘導体を含
む熱サイクル反応において核酸分子を合成する方法であ
って、その熱サイクル反応が異なる酵素活性を有する少
なくとも２種類の熱安定性酵素を含み、但し少なくとも
１種類の酵素はDNAポリメラーゼ活性を示すものであ
り、さらにその２種類の酵素の一方は熱サイクル反応に
おいて他方の熱安定性酵素より後のサイクルで活性化さ
れるものである、該方法を含んでなる。
【００１８】本発明の主題は、初めに核酸分子、第１プ
ライマー、第２プライマー、反応バッファー、デオキシ
ヌクレオチドまたはその誘導体、および少なくとも１種
類のジデオキシヌクレオチドまたは別の終結用ヌクレオ
チドを含む熱サイクル反応において核酸分子をシークエ
ンシングする方法であって、その熱サイクル反応が、ジ
デオキシヌクレオチドの取り込みに関して異なる酵素活
性を有する熱安定性DNAポリメラーゼを少なくとも２種
類含み、この場合その２種類の熱安定性DNAポリメラー
ゼの一方が熱サイクル反応において他方の熱安定性DNA
ポリメラーゼよりも後のサイクルで活性化されるもので
ある、該方法をさらに提供することである。好ましく
は、その熱サイクル反応には第１ポリメラーゼ、および
その第１熱安定性DNAポリメラーゼと比較してジデオキ
シヌクレオチドを取り込む能力が低い第２熱安定性DNA
ポリメラーゼを含む。本発明の好適な実施形態において
は、第１熱安定性DNAポリメラーゼが、熱サイクル反応
において第２熱安定性DNAポリメラーゼよりも後のサイ
クルにおいて活性化され、第２熱安定性DNAポリメラー
ゼは第１熱安定性DNAポリメラーゼと比較してジデオキ
シヌクレオチドを取り込む能力が低い。言い換えれば、
本発明の好適な実施形態は、非共役的、直接的、指数関
数的および連続的な核酸分子の増幅およびシークエンシ
ングを行うための一段階の方法である。この方法に用い
る第１熱安定性DNAポリメラーゼは、例えば可逆的で除
去可能な修飾または阻害剤によって、その重合機能を阻
害されていて、ddNTPsを識別しない。さらにこの方法に
用いる第２DNAポリメラーゼはddNTPsを識別する。した
がって、第１ポリメラーゼは熱サイクル反応において、
第２DNAポリメラーゼよりも後のサイクルで解放され、
活性が最大になる。
ライマー、第２プライマー、反応バッファー、デオキシ
ヌクレオチドまたはその誘導体、および少なくとも１種
類のジデオキシヌクレオチドまたは別の終結用ヌクレオ
チドを含む熱サイクル反応において核酸分子をシークエ
ンシングする方法であって、その熱サイクル反応が、ジ
デオキシヌクレオチドの取り込みに関して異なる酵素活
性を有する熱安定性DNAポリメラーゼを少なくとも２種
類含み、この場合その２種類の熱安定性DNAポリメラー
ゼの一方が熱サイクル反応において他方の熱安定性DNA
ポリメラーゼよりも後のサイクルで活性化されるもので
ある、該方法をさらに提供することである。好ましく
は、その熱サイクル反応には第１ポリメラーゼ、および
その第１熱安定性DNAポリメラーゼと比較してジデオキ
シヌクレオチドを取り込む能力が低い第２熱安定性DNA
ポリメラーゼを含む。本発明の好適な実施形態において
は、第１熱安定性DNAポリメラーゼが、熱サイクル反応
において第２熱安定性DNAポリメラーゼよりも後のサイ
クルにおいて活性化され、第２熱安定性DNAポリメラー
ゼは第１熱安定性DNAポリメラーゼと比較してジデオキ
シヌクレオチドを取り込む能力が低い。言い換えれば、
本発明の好適な実施形態は、非共役的、直接的、指数関
数的および連続的な核酸分子の増幅およびシークエンシ
ングを行うための一段階の方法である。この方法に用い
る第１熱安定性DNAポリメラーゼは、例えば可逆的で除
去可能な修飾または阻害剤によって、その重合機能を阻
害されていて、ddNTPsを識別しない。さらにこの方法に
用いる第２DNAポリメラーゼはddNTPsを識別する。した
がって、第１ポリメラーゼは熱サイクル反応において、
第２DNAポリメラーゼよりも後のサイクルで解放され、
活性が最大になる。
【００１９】したがって、ある実施形態においては、反
応中に存在する１種類以上のポリメラーゼを阻害し得る
抗体も前記反応に含めることができる。任意には、抗体
を用いる代わりに、別のポリメラーゼ阻害剤によってポ
リメラーゼを阻害することができる（例えばEP 0771 87
0 A1を参照のこと。この開示は参照により本明細書に含
めるものとする）。
応中に存在する１種類以上のポリメラーゼを阻害し得る
抗体も前記反応に含めることができる。任意には、抗体
を用いる代わりに、別のポリメラーゼ阻害剤によってポ
リメラーゼを阻害することができる（例えばEP 0771 87
0 A1を参照のこと。この開示は参照により本明細書に含
めるものとする）。
【００２０】本発明の最も好適な実施形態は、上述した
核酸分子のシークエンシング法であって、両方のポリメ
ラーゼが阻害剤または化学修飾によって初めに阻害さ
れ、それらは熱サイクル反応の後半のサイクルで活性化
することができ、さらに一方のポリメラーゼが他方より
も後のサイクルで活性化される、該方法である。さら
に、本発明の核酸分子のシークエンシング法であって、
第１熱安定性DNAポリメラーゼは熱サイクル反応におい
て第２熱安定性DNAポリメラーゼよりも後のサイクルで
活性化され、この第２熱安定性DNAポリメラーゼは第１
熱安定性DNAポリメラーゼと比較してジデオキシヌクレ
オチドを取り込む能力が低い、該方法が好ましい。これ
に関連し本発明の特に好適な別の実施形態は、ポリメラ
ーゼに対する抗体およびポリメラーゼ阻害剤を使用する
ことである。例えば、ddNTPを識別する第２ポリメラー
ゼは第２ポリメラーゼに対する抗体によって阻害され、
第１ポリメラーゼは別のポリメラーゼ阻害剤によって阻
害される。別のポリメラーゼ阻害剤の例はジカルボン酸
無水物であり、前記化学修飾試薬はアルデヒド、好まし
くはホルムアルデヒドである(EP 0 962 526)。これによ
り、第２ポリメラーゼは前記反応の早期のサイクルで高
温にて解放され、第１ポリメラーゼは反応の後半のサイ
クルでのみ解放されることになる。
核酸分子のシークエンシング法であって、両方のポリメ
ラーゼが阻害剤または化学修飾によって初めに阻害さ
れ、それらは熱サイクル反応の後半のサイクルで活性化
することができ、さらに一方のポリメラーゼが他方より
も後のサイクルで活性化される、該方法である。さら
に、本発明の核酸分子のシークエンシング法であって、
第１熱安定性DNAポリメラーゼは熱サイクル反応におい
て第２熱安定性DNAポリメラーゼよりも後のサイクルで
活性化され、この第２熱安定性DNAポリメラーゼは第１
熱安定性DNAポリメラーゼと比較してジデオキシヌクレ
オチドを取り込む能力が低い、該方法が好ましい。これ
に関連し本発明の特に好適な別の実施形態は、ポリメラ
ーゼに対する抗体およびポリメラーゼ阻害剤を使用する
ことである。例えば、ddNTPを識別する第２ポリメラー
ゼは第２ポリメラーゼに対する抗体によって阻害され、
第１ポリメラーゼは別のポリメラーゼ阻害剤によって阻
害される。別のポリメラーゼ阻害剤の例はジカルボン酸
無水物であり、前記化学修飾試薬はアルデヒド、好まし
くはホルムアルデヒドである(EP 0 962 526)。これによ
り、第２ポリメラーゼは前記反応の早期のサイクルで高
温にて解放され、第１ポリメラーゼは反応の後半のサイ
クルでのみ解放されることになる。
【００２１】ポリメラーゼ阻害剤は、タンパク質活性領
域中のリシン残基のε-アミノ基を化学修飾することに
よってリシン残基を可逆的にブロックして阻害する。さ
らに、活性領域外のリシンの修飾は、立体的相互作用ま
たはコンホーメーション変化によってそのタンパク質の
不活性化に寄与するかもしれない。可逆的な方法でアミ
ノ基と反応する化合物が数多く文献に記載されている。
例えば、アミノ基はトリフルオロアセチル化（Goldberg
erおよびAnfinsen, 1962, Biochemistry 1 :410を参照
のこと）、アミジン化（Hunterおよび Ludwig, 1962,
J.Amer.Chem.Soc.84 :3491を参照のこと）、マレイル化
（Butlerら, 1967, Biochem.J.103 :78を参照のこ
と）、アセトアセチル化（Marzotttoら, 1967, Bioche
m,Biophys.Res.Commun.26 :517;およびMarzottoら, 196
8, Biochem.Biophys.Acta 154 :450を参照のこと）、テ
トラフルオロスクシニル化（Braunitzerら, 1968, Hopp
e-Seyler's Z.Physiol.Chem.349 :265を参照のこと）、
およびシトラコニル化（DixonおよびPerham, 1968, Bio
chem.J.109 :312-314;ならびにHabeebおよびAtassi, 19
70, Biochemistry 9(25) :4939-4944を参照のこと）に
より可逆的に修飾される。
域中のリシン残基のε-アミノ基を化学修飾することに
よってリシン残基を可逆的にブロックして阻害する。さ
らに、活性領域外のリシンの修飾は、立体的相互作用ま
たはコンホーメーション変化によってそのタンパク質の
不活性化に寄与するかもしれない。可逆的な方法でアミ
ノ基と反応する化合物が数多く文献に記載されている。
例えば、アミノ基はトリフルオロアセチル化（Goldberg
erおよびAnfinsen, 1962, Biochemistry 1 :410を参照
のこと）、アミジン化（Hunterおよび Ludwig, 1962,
J.Amer.Chem.Soc.84 :3491を参照のこと）、マレイル化
（Butlerら, 1967, Biochem.J.103 :78を参照のこ
と）、アセトアセチル化（Marzotttoら, 1967, Bioche
m,Biophys.Res.Commun.26 :517;およびMarzottoら, 196
8, Biochem.Biophys.Acta 154 :450を参照のこと）、テ
トラフルオロスクシニル化（Braunitzerら, 1968, Hopp
e-Seyler's Z.Physiol.Chem.349 :265を参照のこと）、
およびシトラコニル化（DixonおよびPerham, 1968, Bio
chem.J.109 :312-314;ならびにHabeebおよびAtassi, 19
70, Biochemistry 9(25) :4939-4944を参照のこと）に
より可逆的に修飾される。
【００２２】リシン残基のε-アミノ基の化学修飾のた
めに好適な試薬は、一般式
めに好適な試薬は、一般式
【化１】
（式中、R1およびR2は水素または有機ラジカルで、それ
らは結合していてもよい）で表されるジカルボン酸無水
物であるか、または一般式
らは結合していてもよい）で表されるジカルボン酸無水
物であるか、または一般式
【化２】
（式中、R1およびR2は有機ラジカルで、それらは結合し
ていてもよく、水素はシスである）で表されるジカルボ
ン酸無水物である。有機ラジカルは、炭素−炭素結合、
または炭素−ヘテロ原子結合、例えば炭素−酸素、炭素
−窒素、もしくは炭素−硫黄結合によりその環に直接結
合することできる。有機ラジカルは互いに結合して、例
えば3,4,5,6-テトラヒドロフタル酸無水物のような環構
造を形成していてもよい。
ていてもよく、水素はシスである）で表されるジカルボ
ン酸無水物である。有機ラジカルは、炭素−炭素結合、
または炭素−ヘテロ原子結合、例えば炭素−酸素、炭素
−窒素、もしくは炭素−硫黄結合によりその環に直接結
合することできる。有機ラジカルは互いに結合して、例
えば3,4,5,6-テトラヒドロフタル酸無水物のような環構
造を形成していてもよい。
【００２３】好適な試薬の例としては、無水マレイン
酸；シトラコン酸無水物、シス-アコニット酸無水物、
および2,3-ジメチルマレイン酸無水物などの置換された
無水マレイン酸；エキソ-シス-3,6-エンドオキソ-.DELT
A.＠4-テトラヒドロフタル酸無水物；ならびに3,4,5,6-
テトラヒドロフタル酸無水物が挙げられる。試薬は、例
えばAldrich Chemical Co.(Milwaukee, Wis.)、Sigma C
hemical Co.(St.Louis,Mo.)、またはSpectrum Chemical
Mfg. Corp(Gardena, Calif.)から市販されている。置
換された無水マレイン酸試薬としてシトラコン酸無水物
およびシス-アコニット酸無水物を用いた熱安定性DNAポ
リメラーゼの修飾は、実施例に記載されている。
酸；シトラコン酸無水物、シス-アコニット酸無水物、
および2,3-ジメチルマレイン酸無水物などの置換された
無水マレイン酸；エキソ-シス-3,6-エンドオキソ-.DELT
A.＠4-テトラヒドロフタル酸無水物；ならびに3,4,5,6-
テトラヒドロフタル酸無水物が挙げられる。試薬は、例
えばAldrich Chemical Co.(Milwaukee, Wis.)、Sigma C
hemical Co.(St.Louis,Mo.)、またはSpectrum Chemical
Mfg. Corp(Gardena, Calif.)から市販されている。置
換された無水マレイン酸試薬としてシトラコン酸無水物
およびシス-アコニット酸無水物を用いた熱安定性DNAポ
リメラーゼの修飾は、実施例に記載されている。
【００２４】上記の試薬を用いてアシル化されたアミノ
基の相対的安定性は以下の順で減少する。無水マレイン
酸、エキソ-シス-3,6-エンドオキソ-.DELTA.＠4-テトラ
ヒドロフタル酸無水物、シトラコン酸無水物、3,4,5,6-
テトラヒドロフタル酸無水物、シス-アコニット酸無水
物、および2,3-ジメチルマレイン酸無水物（前掲のPala
cianらを参照のこと）。
基の相対的安定性は以下の順で減少する。無水マレイン
酸、エキソ-シス-3,6-エンドオキソ-.DELTA.＠4-テトラ
ヒドロフタル酸無水物、シトラコン酸無水物、3,4,5,6-
テトラヒドロフタル酸無水物、シス-アコニット酸無水
物、および2,3-ジメチルマレイン酸無水物（前掲のPala
cianらを参照のこと）。
【００２５】本発明の方法は、例示した修飾剤化合物、
またはリシン残基の化学的修飾によるタンパク質の修飾
に限定されない。タンパク質と反応してその酵素活性の
全て、またはほとんど全てを可逆的に失わせ、その修飾
は増幅反応バッファー中で昇温でインキュベートするこ
とにより元に戻すことができるような、文献に記載の化
合物はいずれも、可逆的不活性化酵素の調製に適したも
のである。可逆的にタンパク質を修飾する新規化合物が
入手可能になれば、それらも本方法における使用に適し
ているであろう。したがって本発明の修飾型熱安定性酵
素を調製するための化合物は、以下の特性を満たす化合
物を包含する： (1)プライマー伸長を触媒する熱安定性酵素との反応に
よって、該酵素の実質的な不活性化をおこす； (2)水性バッファー中、室温以下の温度(25℃)でpH約8〜
9で、得られた修飾型酵素をインキュベートしても、約2
0分間以内では酵素の活性に大きな増加は起こらない；
および (3)室温でpH約8〜9に調整した増幅反応バッファー中の
得られた修飾型熱安定性酵素を、約50℃以上に温度を上
げてインキュベートすると、約20分間以内で酵素活性が
少なくとも２倍に増加する。
またはリシン残基の化学的修飾によるタンパク質の修飾
に限定されない。タンパク質と反応してその酵素活性の
全て、またはほとんど全てを可逆的に失わせ、その修飾
は増幅反応バッファー中で昇温でインキュベートするこ
とにより元に戻すことができるような、文献に記載の化
合物はいずれも、可逆的不活性化酵素の調製に適したも
のである。可逆的にタンパク質を修飾する新規化合物が
入手可能になれば、それらも本方法における使用に適し
ているであろう。したがって本発明の修飾型熱安定性酵
素を調製するための化合物は、以下の特性を満たす化合
物を包含する： (1)プライマー伸長を触媒する熱安定性酵素との反応に
よって、該酵素の実質的な不活性化をおこす； (2)水性バッファー中、室温以下の温度(25℃)でpH約8〜
9で、得られた修飾型酵素をインキュベートしても、約2
0分間以内では酵素の活性に大きな増加は起こらない；
および (3)室温でpH約8〜9に調整した増幅反応バッファー中の
得られた修飾型熱安定性酵素を、約50℃以上に温度を上
げてインキュベートすると、約20分間以内で酵素活性が
少なくとも２倍に増加する。
【００２６】この好適な方法によって、第１DNAポリメ
ラーゼはポリメラーゼ阻害剤によって阻害され、これは
一定数のサイクルの後解放されてその重合活性を回復す
ることができ、主として短くされた産物（サイクルの間
に指数関数的に蓄積し、次いでシークエンシングラダー
の生成に寄与する）を産生する。重合阻害剤は、サイク
ルシークエンシング反応時の所定の温度および所定の時
点で阻害活性を可逆的に喪失する。第１DNAポリメラー
ゼがその阻害作用物質から解放されるまで、第１熱安定
性DNAポリメラーゼよりもジデオキシヌクレオチドを取
り込む能力が低い第２ポリメラーゼは、完全長の核酸分
子産物を産生する。そのことは、第１ポリメラーゼが解
放されるより前のサイクルにて第２ポリメラーゼが活性
であることを意味している。完全長の核酸分子産物は指
数関数的に蓄積し、続いてのサイクルでは完全長のDNA
鎖をさらに産生するための鋳型としてだけではなく、伸
長用の鋳型としてもはたらく。この伸長用の鋳型は、重
合阻害剤が第１熱安定性DNAポリメラーゼから解離した
後に開始するシークエンシング反応に寄与する。２種類
の該ポリメラーゼの２つの異なる特性に、サイクル反応
の最初から所定のサイクル数までの、増幅とシークエン
シング工程を分離することを組み合わせることによっ
て、非共役的、直接的、指数関数的かつ連続的な増幅お
よびシークエンシング反応の効率は大幅に増大する。こ
こで前記２つの異なる特性とは、すなわち第１DNAポリ
メラーゼ（「１」）のジデオキシヌクレオチドを効率的
に取り込む能力、および第２DNAポリメラーゼ
（「２」）のデオキシヌクレオチドを効率的に取り込む
能力であり、前記所定のサイクル数とは、第１ポリメラ
ーゼのポリメラーゼ阻害剤が第１ポリメラーゼの重合活
性を阻害する能力を喪失する時点である。そのシークエ
ンシングラダーと完全長産物の両方のシグナルがシグナ
ル強度の著しい増加を示す。シグナル強度は第１ポリメ
ラーゼによって産生される標識分子の数と相関があり、
また標識分子の数は鋳型分子の数と相関があり、鋳型分
子の数はこの連続的DEXTAQ反応における増幅とシークエ
ンシング工程の分離によって増加させられる。それゆえ
連続DEXTAQ法が提供する核酸配列決定法は、シークエン
シング反応を開始する前に単に増幅を何サイクル行うか
を定めることによって、DNAの初期量を考慮することが
できる（図１を参照のこと）。
ラーゼはポリメラーゼ阻害剤によって阻害され、これは
一定数のサイクルの後解放されてその重合活性を回復す
ることができ、主として短くされた産物（サイクルの間
に指数関数的に蓄積し、次いでシークエンシングラダー
の生成に寄与する）を産生する。重合阻害剤は、サイク
ルシークエンシング反応時の所定の温度および所定の時
点で阻害活性を可逆的に喪失する。第１DNAポリメラー
ゼがその阻害作用物質から解放されるまで、第１熱安定
性DNAポリメラーゼよりもジデオキシヌクレオチドを取
り込む能力が低い第２ポリメラーゼは、完全長の核酸分
子産物を産生する。そのことは、第１ポリメラーゼが解
放されるより前のサイクルにて第２ポリメラーゼが活性
であることを意味している。完全長の核酸分子産物は指
数関数的に蓄積し、続いてのサイクルでは完全長のDNA
鎖をさらに産生するための鋳型としてだけではなく、伸
長用の鋳型としてもはたらく。この伸長用の鋳型は、重
合阻害剤が第１熱安定性DNAポリメラーゼから解離した
後に開始するシークエンシング反応に寄与する。２種類
の該ポリメラーゼの２つの異なる特性に、サイクル反応
の最初から所定のサイクル数までの、増幅とシークエン
シング工程を分離することを組み合わせることによっ
て、非共役的、直接的、指数関数的かつ連続的な増幅お
よびシークエンシング反応の効率は大幅に増大する。こ
こで前記２つの異なる特性とは、すなわち第１DNAポリ
メラーゼ（「１」）のジデオキシヌクレオチドを効率的
に取り込む能力、および第２DNAポリメラーゼ
（「２」）のデオキシヌクレオチドを効率的に取り込む
能力であり、前記所定のサイクル数とは、第１ポリメラ
ーゼのポリメラーゼ阻害剤が第１ポリメラーゼの重合活
性を阻害する能力を喪失する時点である。そのシークエ
ンシングラダーと完全長産物の両方のシグナルがシグナ
ル強度の著しい増加を示す。シグナル強度は第１ポリメ
ラーゼによって産生される標識分子の数と相関があり、
また標識分子の数は鋳型分子の数と相関があり、鋳型分
子の数はこの連続的DEXTAQ反応における増幅とシークエ
ンシング工程の分離によって増加させられる。それゆえ
連続DEXTAQ法が提供する核酸配列決定法は、シークエン
シング反応を開始する前に単に増幅を何サイクル行うか
を定めることによって、DNAの初期量を考慮することが
できる（図１を参照のこと）。
【００２７】第１熱安定性DNAポリメラーゼは、好まし
くは、熱サイクルに用いられる条件下またはバッファー
中で、野生型Taq DNA ポリメラーゼよりもddNTPsに対す
る識別力が低いものである。好適な実施形態において
は、前記第１熱安定性ポリメラーゼはDNA Taqポリメラ
ーゼ(-エキソ5'-3')(F667Y)またはその機能的誘導体で
ある。
くは、熱サイクルに用いられる条件下またはバッファー
中で、野生型Taq DNA ポリメラーゼよりもddNTPsに対す
る識別力が低いものである。好適な実施形態において
は、前記第１熱安定性ポリメラーゼはDNA Taqポリメラ
ーゼ(-エキソ5'-3')(F667Y)またはその機能的誘導体で
ある。
【００２８】別の好適な実施形態においては、第２熱安
定性DNAポリメラーゼはTaqポリメラーゼまたはその機能
的誘導体である。
定性DNAポリメラーゼはTaqポリメラーゼまたはその機能
的誘導体である。
【００２９】連続的ホットスタート法に用いられ得るポ
リメラーゼを以下に記載する。：DNAポリメラーゼ（DNA
ポリメラーゼ「１」）は、熱安定性第１DNAポリメラー
ゼとして用いることが好ましい。この熱安定性第１DNA
ポリメラーゼは、野生型Taq DNAポリメラーゼとは対照
的に、熱サイクルに用いられる条件下およびバッファー
中でのddNTPsに対する識別力が低く、またポリメラーゼ
阻害剤（例えばEP 0771 870 A1に開示されたポリメラー
ゼ阻害剤であり、その開示は参照により本明細書中に組
み込まれる）によって阻害されるものである。ポリメラ
ーゼ阻害剤は、増幅反応の一部またはシークエンシング
反応の間に昇温で反応混合液をインキュベートすること
によって阻害活性を喪失する。より好ましくは、DNAポ
リメラーゼは、熱安定性であり、「Tabor-Richardson」
突然変異をもつもの(F667Y)、またはその機能的誘導体
であってやはり5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有しな
いもの、例えばAmplitaq FSTM(Taq DNAポリメラーゼ(-
エキソ5'-3')(F667)、(Tabor,S. & Richardson,C.C.(19
95) Proc.Natl.Sci.USA 92,6339-6343))、Taquenase
TM(Taq DNAポリメラーゼ(272(-エキソ5'-3')(F667)、Ta
borおよびRichardson(1995)、前掲))など、またはそれ
らの混合物が用いられる。また、熱安定性である他のDN
Aポリメラーゼおよびそれらのポリメラーゼの混合物を
本発明の方法において用いることができる。ThermoSequ
enaseまたは他のいくつかのDNAポリメラーゼであって、
ddNTPsを取り込む能力がより高いものが、本発明の方法
にとって特に好適である。DNAポリメラーゼ(DNAポリメ
ラーゼ「２」)は、熱サイクルに使用される条件下およ
びバッファー中でddNTPsを識別する、熱安定性第２DNA
ポリメラーゼとして使用することが好ましい。より好ま
しくは、DNAポリメラーゼは、例えばTaq DNAポリメラー
ゼ(-エキソ5'-3')などの5'-3'エキソ-ヌクレアーゼ活性
を有しないものを用いる。好適な実施形態においては、
例えばPlatinum TaqTM(Life Technologies, Rockvill,M
D,USA)などの、抗体によって阻害されるDNAポリメラー
ゼおよびそれらの混合物が用いられ、熱安定性でかつ抗
体によって阻害される他のDNAポリメラーゼおよびそれ
らの混合物もまた、本発明の方法において用いることが
できる。
リメラーゼを以下に記載する。：DNAポリメラーゼ（DNA
ポリメラーゼ「１」）は、熱安定性第１DNAポリメラー
ゼとして用いることが好ましい。この熱安定性第１DNA
ポリメラーゼは、野生型Taq DNAポリメラーゼとは対照
的に、熱サイクルに用いられる条件下およびバッファー
中でのddNTPsに対する識別力が低く、またポリメラーゼ
阻害剤（例えばEP 0771 870 A1に開示されたポリメラー
ゼ阻害剤であり、その開示は参照により本明細書中に組
み込まれる）によって阻害されるものである。ポリメラ
ーゼ阻害剤は、増幅反応の一部またはシークエンシング
反応の間に昇温で反応混合液をインキュベートすること
によって阻害活性を喪失する。より好ましくは、DNAポ
リメラーゼは、熱安定性であり、「Tabor-Richardson」
突然変異をもつもの(F667Y)、またはその機能的誘導体
であってやはり5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有しな
いもの、例えばAmplitaq FSTM(Taq DNAポリメラーゼ(-
エキソ5'-3')(F667)、(Tabor,S. & Richardson,C.C.(19
95) Proc.Natl.Sci.USA 92,6339-6343))、Taquenase
TM(Taq DNAポリメラーゼ(272(-エキソ5'-3')(F667)、Ta
borおよびRichardson(1995)、前掲))など、またはそれ
らの混合物が用いられる。また、熱安定性である他のDN
Aポリメラーゼおよびそれらのポリメラーゼの混合物を
本発明の方法において用いることができる。ThermoSequ
enaseまたは他のいくつかのDNAポリメラーゼであって、
ddNTPsを取り込む能力がより高いものが、本発明の方法
にとって特に好適である。DNAポリメラーゼ(DNAポリメ
ラーゼ「２」)は、熱サイクルに使用される条件下およ
びバッファー中でddNTPsを識別する、熱安定性第２DNA
ポリメラーゼとして使用することが好ましい。より好ま
しくは、DNAポリメラーゼは、例えばTaq DNAポリメラー
ゼ(-エキソ5'-3')などの5'-3'エキソ-ヌクレアーゼ活性
を有しないものを用いる。好適な実施形態においては、
例えばPlatinum TaqTM(Life Technologies, Rockvill,M
D,USA)などの、抗体によって阻害されるDNAポリメラー
ゼおよびそれらの混合物が用いられ、熱安定性でかつ抗
体によって阻害される他のDNAポリメラーゼおよびそれ
らの混合物もまた、本発明の方法において用いることが
できる。
【００３０】「Tabor-Richardson」突然変異を有しない
DNAポリメラーゼ、例えばTaq DNAポリメラーゼ、Tth DN
Aポリメラーゼ、Klentaq(Taq DNAポリメラーゼ)(-エキ
ソ5'-3')、Korolevら、(1995) Proc.Natl.Acad.Sci.USA
92, 9246-9268、W.Barnes Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91
(1994),2216-2220中、およびUS 5,436,149は、好ましく
は、第１熱安定性DNAポリメラーゼよりもジデオキシヌ
クレオチドを取り込む能力が低い、熱安定性第２DNAポ
リメラーゼとして用いられる。
DNAポリメラーゼ、例えばTaq DNAポリメラーゼ、Tth DN
Aポリメラーゼ、Klentaq(Taq DNAポリメラーゼ)(-エキ
ソ5'-3')、Korolevら、(1995) Proc.Natl.Acad.Sci.USA
92, 9246-9268、W.Barnes Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91
(1994),2216-2220中、およびUS 5,436,149は、好ましく
は、第１熱安定性DNAポリメラーゼよりもジデオキシヌ
クレオチドを取り込む能力が低い、熱安定性第２DNAポ
リメラーゼとして用いられる。
【００３１】本発明はまた、本方法において３種類以上
のDNAポリメラーゼを用いることを可能にする。
のDNAポリメラーゼを用いることを可能にする。
【００３２】本発明の概念は、少なくとも２種類の酵素
活性、例えば増幅および標識化反応、逆転写、シークエ
ンシング反応、連結反応、位相操作反応(トポイソメラ
ーゼによる異性化、またはヘリカーゼによるDNA二重ら
せん鎖の解離など)および制限酵素反応などを含む温度
サイクル反応、また増幅および制限酵素／切断／連結に
関して有用である。したがって本発明の概念は、熱サイ
クル反応中の１種類以上の酵素活性の連続的活性化であ
る。連続的活性化とは、酵素のうち１種類は他の酵素よ
りも後のサイクルでのみ完全な活性を有するに至り、他
の酵素は熱サイクル反応のより早期のサイクルにて完全
な活性を有するに至ることを意味している。酵素を用い
る適用例に応じて、該酵素は異なる特性を示すことがで
き、例えば１種類以上のポリメラーゼが5'-3'-エキソ-
欠損性または3'-5'-エキソ-欠損性であるか、またはエ
キソ-活性が増大していてもよい。
活性、例えば増幅および標識化反応、逆転写、シークエ
ンシング反応、連結反応、位相操作反応(トポイソメラ
ーゼによる異性化、またはヘリカーゼによるDNA二重ら
せん鎖の解離など)および制限酵素反応などを含む温度
サイクル反応、また増幅および制限酵素／切断／連結に
関して有用である。したがって本発明の概念は、熱サイ
クル反応中の１種類以上の酵素活性の連続的活性化であ
る。連続的活性化とは、酵素のうち１種類は他の酵素よ
りも後のサイクルでのみ完全な活性を有するに至り、他
の酵素は熱サイクル反応のより早期のサイクルにて完全
な活性を有するに至ることを意味している。酵素を用い
る適用例に応じて、該酵素は異なる特性を示すことがで
き、例えば１種類以上のポリメラーゼが5'-3'-エキソ-
欠損性または3'-5'-エキソ-欠損性であるか、またはエ
キソ-活性が増大していてもよい。
【００３３】本発明の方法では、連続移動性ポリメラー
ゼを使用することが好ましく、すなわちddNTPsに対する
識別力の低いポリメラーゼがThermoSequenaseよりも高
い連続移動性を有し、さらにddNTPsを識別するポリメラ
ーゼが野生型Taq DNAポリメラーゼよりも高い連続移動
性を有することが好ましい。その連続移動性が野生型の
Taq DNAポリメラーゼの連続移動性よりも高い本発明の
ポリメラーゼは、本方法に使用することが最も好まし
い。したがって、例えばチオレドキシンと組み合わせた
ときの、T7ポリメラーゼ(遺伝子５産物)と等しい連続移
動性を有する２種類のポリメラーゼを使用することは都
合がよいであろう。
ゼを使用することが好ましく、すなわちddNTPsに対する
識別力の低いポリメラーゼがThermoSequenaseよりも高
い連続移動性を有し、さらにddNTPsを識別するポリメラ
ーゼが野生型Taq DNAポリメラーゼよりも高い連続移動
性を有することが好ましい。その連続移動性が野生型の
Taq DNAポリメラーゼの連続移動性よりも高い本発明の
ポリメラーゼは、本方法に使用することが最も好まし
い。したがって、例えばチオレドキシンと組み合わせた
ときの、T7ポリメラーゼ(遺伝子５産物)と等しい連続移
動性を有する２種類のポリメラーゼを使用することは都
合がよいであろう。
【００３４】本発明の方法のさらなる好適な実施形態に
おいて、前記プライマーの比は1:1、あるいは1:1より高
く、例えば約2:1および約3:1および最も好ましくは2:1
である。本発明の熱サイクル反応は第１プライマーおよ
び第２プライマーを含んでなり、これらのプライマー
は、核酸分子の配列決定に寄与する短くされた長さの分
子に加えて、同時に完全長の鋳型分子を十分に産生する
ために用いることができる。一方のプライマーは標識さ
れ他方は標識されないか、または両方が異なって標識さ
れる。さらに各反応は、配列決定すべき核酸鋳型、バッ
ファー溶液、および４種類のデオキシヌクレオチドまた
はその誘導体、および１種類のジデオキシヌクレオチド
または別の終結用ヌクレオチド(例えば3'-アミノヌクレ
オチドまたは3'-エステル-誘導体化ヌクレオチド)を初
めに含む。熱安定性ピロホスファターゼを任意に加える
こともできる。各塩基の決定につき１種類ずつ、４種類
の反応混合液を調製する。本方法はまた、標識プライマ
ーの代わりに標識化終結用ヌクレオチドを含む。標識プ
ライマーの場合、相補鎖を分離するために、反応中およ
び／または反応後に少なくとも１種類のプライマーを固
相に結合させる必要がある。プライマーの固相への結合
方法は、当技術分野で公知である。
おいて、前記プライマーの比は1:1、あるいは1:1より高
く、例えば約2:1および約3:1および最も好ましくは2:1
である。本発明の熱サイクル反応は第１プライマーおよ
び第２プライマーを含んでなり、これらのプライマー
は、核酸分子の配列決定に寄与する短くされた長さの分
子に加えて、同時に完全長の鋳型分子を十分に産生する
ために用いることができる。一方のプライマーは標識さ
れ他方は標識されないか、または両方が異なって標識さ
れる。さらに各反応は、配列決定すべき核酸鋳型、バッ
ファー溶液、および４種類のデオキシヌクレオチドまた
はその誘導体、および１種類のジデオキシヌクレオチド
または別の終結用ヌクレオチド(例えば3'-アミノヌクレ
オチドまたは3'-エステル-誘導体化ヌクレオチド)を初
めに含む。熱安定性ピロホスファターゼを任意に加える
こともできる。各塩基の決定につき１種類ずつ、４種類
の反応混合液を調製する。本方法はまた、標識プライマ
ーの代わりに標識化終結用ヌクレオチドを含む。標識プ
ライマーの場合、相補鎖を分離するために、反応中およ
び／または反応後に少なくとも１種類のプライマーを固
相に結合させる必要がある。プライマーの固相への結合
方法は、当技術分野で公知である。
【００３５】本発明の方法のさらなる好適な実施形態に
おいて、前記プライマーは、サイクル中の高温によって
非特異的DNA断片とのアニーリングを妨げることができ
るだけの長さである。このことは、良好なシグナル対ノ
イズ比につながる。前記プライマーの長さは、好ましく
は18ヌクレオチド以上である。
おいて、前記プライマーは、サイクル中の高温によって
非特異的DNA断片とのアニーリングを妨げることができ
るだけの長さである。このことは、良好なシグナル対ノ
イズ比につながる。前記プライマーの長さは、好ましく
は18ヌクレオチド以上である。
【００３６】プライマーは当技術分野で公知の方法によ
り合成できる。例えば、本発明の核酸シークエンシング
法を行う際の前記プライマーの安定性または機能を大き
く変化させない公知方法を用いて、プライマーを合成す
ることができる。
り合成できる。例えば、本発明の核酸シークエンシング
法を行う際の前記プライマーの安定性または機能を大き
く変化させない公知方法を用いて、プライマーを合成す
ることができる。
【００３７】さらにPNA-DNAハイブリッドオリゴヌクレ
オチドも、本発明の方法に用いるプライマーとしてみな
される(このオリゴヌクレオチドについては、Finn,P.J.
ら,N.A.R.24, 3357-3363(1996), Koch,T.ら, Tetrahedr
on Letters,36, 6933-6936(1995), Stetsenko,D.A,ら,
Tetrahedron Letters 37, 3571-3574(1996), Bergmann,
F.ら, Tetrahedron Letters,36, 6823-6826(1995)およ
びWill,D.W.ら, Tetrahedron 51, 12069-12082(1995)を
参照のこと。) 本発明の方法のさらなる好適な実施形態においては、第
１プライマーを標識化する。さらに、第１プライマーお
よび第２プライマーは異なって標識することが好まし
い。本発明のDNA配列決定法における前記プライマーの
安定性または機能を大きく変えないという条件の下に、
当技術分野で公知の試薬または方法を、単一または示差
的標識化試薬として用いることができる。例えば単一お
よび示差的標識は、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素、ならびに
酵素基質、補酵素、色素、発色団、蛍光標識、化学発光
性および生物発光性標識（例えばFITC、Cy5、Cy5.5、Cy
7、Texas-redおよびIRD40(Chenら,(1993), J.Chromato
g.A 652:355-360およびKambaraら (1992), Electrophor
esis 13 :542-546）、リガンドまたはハプテン（例えば
ビオチン、またJOE、TAMRA、5-FAM、ROX(Heinerら (199
8) genome Res.18(5):557-61)などのBig dye）、および
3H、35S、32P、125I、14Cなどの放射性同位元素を含ん
でなる群から選択することができる。
オチドも、本発明の方法に用いるプライマーとしてみな
される(このオリゴヌクレオチドについては、Finn,P.J.
ら,N.A.R.24, 3357-3363(1996), Koch,T.ら, Tetrahedr
on Letters,36, 6933-6936(1995), Stetsenko,D.A,ら,
Tetrahedron Letters 37, 3571-3574(1996), Bergmann,
F.ら, Tetrahedron Letters,36, 6823-6826(1995)およ
びWill,D.W.ら, Tetrahedron 51, 12069-12082(1995)を
参照のこと。) 本発明の方法のさらなる好適な実施形態においては、第
１プライマーを標識化する。さらに、第１プライマーお
よび第２プライマーは異なって標識することが好まし
い。本発明のDNA配列決定法における前記プライマーの
安定性または機能を大きく変えないという条件の下に、
当技術分野で公知の試薬または方法を、単一または示差
的標識化試薬として用いることができる。例えば単一お
よび示差的標識は、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素、ならびに
酵素基質、補酵素、色素、発色団、蛍光標識、化学発光
性および生物発光性標識（例えばFITC、Cy5、Cy5.5、Cy
7、Texas-redおよびIRD40(Chenら,(1993), J.Chromato
g.A 652:355-360およびKambaraら (1992), Electrophor
esis 13 :542-546）、リガンドまたはハプテン（例えば
ビオチン、またJOE、TAMRA、5-FAM、ROX(Heinerら (199
8) genome Res.18(5):557-61)などのBig dye）、および
3H、35S、32P、125I、14Cなどの放射性同位元素を含ん
でなる群から選択することができる。
【００３８】本発明の方法は、種々のバッファーならび
に様々なデオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレ
オチドの濃度には比較的不感受性である。
に様々なデオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレ
オチドの濃度には比較的不感受性である。
【００３９】熱サイクル数は、鋳型DNAの量とその純度
に応じて、約18〜約50サイクルである。
に応じて、約18〜約50サイクルである。
【００４０】用いられるバッファー成分は、Tris-HCl(p
H約7.5〜9.5、濃度約50〜500mM、好ましくは約100〜250
mM)、MgCl2(濃度約2〜6mM)、DMSO(反応液体積Mの約1〜5
%濃度)、ベタイン(濃度約0.3mM)、任意には約0.05mMの1
%メルカプトエタノール、約0.28%のTween20および／ま
たは約0.02%のNonidet40を含み得る。しかしながらバッ
ファー成分はこれらに限定されない。
H約7.5〜9.5、濃度約50〜500mM、好ましくは約100〜250
mM)、MgCl2(濃度約2〜6mM)、DMSO(反応液体積Mの約1〜5
%濃度)、ベタイン(濃度約0.3mM)、任意には約0.05mMの1
%メルカプトエタノール、約0.28%のTween20および／ま
たは約0.02%のNonidet40を含み得る。しかしながらバッ
ファー成分はこれらに限定されない。
【００４１】修飾アミノ基の脱アシル化は、温度の上昇
とそれに伴うpH値の低下の両方によって引き起こされ
る。増幅反応は、典型的には室温でpH7.5〜9.0に調製し
たTris-HClバッファー中で行う。室温では、アルカリ性
の反応バッファー条件がアミノ基のアシル化形態を促進
する。反応バッファーのpH値を室温でpH7.5〜9.0に合わ
せるが、Tris-HCl反応バッファーのpH値は温度の上昇と
共に低下する。したがって反応バッファーのpH値は、増
幅を行う昇温、特に活性化インキュベーションを行う昇
温においては低下する。反応バッファーのpH値の低下
は、アミノ基の脱アシル化を促進する。
とそれに伴うpH値の低下の両方によって引き起こされ
る。増幅反応は、典型的には室温でpH7.5〜9.0に調製し
たTris-HClバッファー中で行う。室温では、アルカリ性
の反応バッファー条件がアミノ基のアシル化形態を促進
する。反応バッファーのpH値を室温でpH7.5〜9.0に合わ
せるが、Tris-HCl反応バッファーのpH値は温度の上昇と
共に低下する。したがって反応バッファーのpH値は、増
幅を行う昇温、特に活性化インキュベーションを行う昇
温においては低下する。反応バッファーのpH値の低下
は、アミノ基の脱アシル化を促進する。
【００４２】高温反応条件によって生じるpH値の変化
は、用いたバッファーに依存する。生物学的反応に用い
るpH値の様々なバッファーの温度依存性は、Goodらの19
66, Biochemistry 5(2) :467-477に報告されている。ト
リスバッファーに関して、pKaすなわち緩衝範囲中央点
のpH値の変化は、次の通り温度と相関がある：.DELTA.p
Ka/℃=-0.031。例えば25℃で調製したTris-HClバッファ
ーは、活性化インキュベーションのために95℃に上昇さ
せた場合、pKa値が2.17に下落する。
は、用いたバッファーに依存する。生物学的反応に用い
るpH値の様々なバッファーの温度依存性は、Goodらの19
66, Biochemistry 5(2) :467-477に報告されている。ト
リスバッファーに関して、pKaすなわち緩衝範囲中央点
のpH値の変化は、次の通り温度と相関がある：.DELTA.p
Ka/℃=-0.031。例えば25℃で調製したTris-HClバッファ
ーは、活性化インキュベーションのために95℃に上昇さ
せた場合、pKa値が2.17に下落する。
【００４３】増幅反応は典型的にはTris-HClバッファー
中で行うが、温度によってpH値がより小さく、またはよ
り大きく変化するバッファー中で増幅反応を行ってもよ
い。用いたバッファーによっては、より安定または不安
定な修飾型酵素が望ましいかもしれない。例えば、不安
定な修飾型酵素をもたらす修飾試薬を用いると、バッフ
ァーのpH値を少し変えるだけで十分な酵素活性を回復で
きる。上で与えられたような種々の試薬により修飾され
た酵素の相対的安定性を経験的に比較することによっ
て、特定のバッファー中での使用に適している修飾型酵
素を選択することができる。
中で行うが、温度によってpH値がより小さく、またはよ
り大きく変化するバッファー中で増幅反応を行ってもよ
い。用いたバッファーによっては、より安定または不安
定な修飾型酵素が望ましいかもしれない。例えば、不安
定な修飾型酵素をもたらす修飾試薬を用いると、バッフ
ァーのpH値を少し変えるだけで十分な酵素活性を回復で
きる。上で与えられたような種々の試薬により修飾され
た酵素の相対的安定性を経験的に比較することによっ
て、特定のバッファー中での使用に適している修飾型酵
素を選択することができる。
【００４４】本発明の特に好適な実施形態においては、
DNAの融点を下げる試薬を反応混合液に加える。この種
の試薬は、例えばグリセリン、トレハロースおよび当技
術分野で公知のベタインやDMSOなどの他の試薬であり得
る。あるいは、２種類の異なる修飾試薬を用いることに
よって、第２ポリメラーゼを第１ポリメラーゼよりも早
期のサイクルにて解放させることができる。同じこと
は、２種類の異なるタイプの抗体を用いて行うことがで
きる。
DNAの融点を下げる試薬を反応混合液に加える。この種
の試薬は、例えばグリセリン、トレハロースおよび当技
術分野で公知のベタインやDMSOなどの他の試薬であり得
る。あるいは、２種類の異なる修飾試薬を用いることに
よって、第２ポリメラーゼを第１ポリメラーゼよりも早
期のサイクルにて解放させることができる。同じこと
は、２種類の異なるタイプの抗体を用いて行うことがで
きる。
【００４５】デオキシヌクレオチドはdGTP、dATP、dTT
P、dCTPから選択することができるが、これらに限定さ
れるものではない。しかしながら、本発明に従えば、デ
オキシヌクレオチドの誘導体を用いることもできる。デ
オキシヌクレオチド誘導体は、それらのデオキシヌクレ
オチドまたは修飾デオキシヌクレオチドであって、熱安
定性DNAポリメラーゼによって、熱サイクル反応におい
て合成される伸長中のDNA分子に取り込まれ得るものと
定義される。デオキシヌクレオチド誘導体の例として
は、チオヌクレオチド、7-デアザ-2'-dGTP、7-デアザ-
2'-dATP、そしてデオキシイノシン三リン酸(これはdAT
P、dGTP、dTTP、dCTPの代替デオキシヌクレオチドとし
ても用いることができる)が挙げられる。しかしなが
ら、デオキシヌクレオチド誘導体はこれらの例に限定さ
れない。前述のデオキシヌクレオチドおよびその誘導体
は、好ましくは約100μM〜約４mMの濃度で用いる。
P、dCTPから選択することができるが、これらに限定さ
れるものではない。しかしながら、本発明に従えば、デ
オキシヌクレオチドの誘導体を用いることもできる。デ
オキシヌクレオチド誘導体は、それらのデオキシヌクレ
オチドまたは修飾デオキシヌクレオチドであって、熱安
定性DNAポリメラーゼによって、熱サイクル反応におい
て合成される伸長中のDNA分子に取り込まれ得るものと
定義される。デオキシヌクレオチド誘導体の例として
は、チオヌクレオチド、7-デアザ-2'-dGTP、7-デアザ-
2'-dATP、そしてデオキシイノシン三リン酸(これはdAT
P、dGTP、dTTP、dCTPの代替デオキシヌクレオチドとし
ても用いることができる)が挙げられる。しかしなが
ら、デオキシヌクレオチド誘導体はこれらの例に限定さ
れない。前述のデオキシヌクレオチドおよびその誘導体
は、好ましくは約100μM〜約４mMの濃度で用いる。
【００４６】ジデオキシヌクレオチドは、限定するもの
ではないが、ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTPを含む。本発
明によれば、それらのジデオキシヌクレオチドであっ
て、熱安定性DNAポリメラーゼによって、熱サイクル反
応において合成される伸長中のDNA分子に取り込まれ得
るものと定義されるジデオキシヌクレオチド誘導体を用
いることもできる。ddNTPsの好適な濃度は約100nM〜約1
00μMである。
ではないが、ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTPを含む。本発
明によれば、それらのジデオキシヌクレオチドであっ
て、熱安定性DNAポリメラーゼによって、熱サイクル反
応において合成される伸長中のDNA分子に取り込まれ得
るものと定義されるジデオキシヌクレオチド誘導体を用
いることもできる。ddNTPsの好適な濃度は約100nM〜約1
00μMである。
【００４７】本発明の方法に用いる好ましいdNTPsとddN
TPsの比率(dNTPs:ddNTPs)は、約50:1〜約1000:1であ
り、より好ましくは約100:1〜600:1であり、特に好まし
くは100:1〜400:1である(この場合、終結ヌクレオチド
すなわちddNTPsは標識されていない)。
TPsの比率(dNTPs:ddNTPs)は、約50:1〜約1000:1であ
り、より好ましくは約100:1〜600:1であり、特に好まし
くは100:1〜400:1である(この場合、終結ヌクレオチド
すなわちddNTPsは標識されていない)。
【００４８】好適な実施形態においては、特異的な短く
されたDNA分子を非特異的DNA分子と比較したシグナル対
ノイズ比が、配列の読取りを実質的に妨げない程度に十
分大きくなる温度で、前記方法を実施する。ヒトの単一
コピーDNA配列の場合には、最大限のアニーリング温度
で、バックグラウンドを激減させることができる。
されたDNA分子を非特異的DNA分子と比較したシグナル対
ノイズ比が、配列の読取りを実質的に妨げない程度に十
分大きくなる温度で、前記方法を実施する。ヒトの単一
コピーDNA配列の場合には、最大限のアニーリング温度
で、バックグラウンドを激減させることができる。
【００４９】DNA鋳型分子のヌクレオチド配列を検出す
るための、典型的な「連続的DEXTAQ」反応温度サイクル
プロフィールは、３つの工程からなり、第１工程は変
性、アニーリング、および鎖伸長を12〜20サイクル行っ
た後、阻害された酵素を解放するための変性工程を行
い、次いでアニーリング、伸長をさらに20〜40サイクル
行う。サイクルプロフィールの第１工程の第１部分は、
二本鎖標的核酸の熱変性からなる。サンプルである核酸
の変性に必要な的確な条件は、サンプルである核酸の長
さおよび組成によって決まる。典型的には、90℃〜100
℃での約10秒〜約１分間までのインキュベーションが、
サンプルの核酸を変性させるのに有効である。「連続的
DEXTAQ」反応で用いられるアニーリング温度は、典型的
には約50℃〜75℃であり、通常は約55℃〜65℃の範囲で
あり、約15〜45秒間の範囲の時間保たれる。プライマー
の鋳型DNAへのアニーリングに引き続いて、反応混合液
はプライマー末端にヌクレオチドを重合させるのに十分
な条件に置かれるであろう。重合条件を達成するため
に、反応混合液の温度は、典型的には約65℃〜75℃、よ
り好ましくは68℃〜72℃の範囲の温度で、鋳型DNAの長
さにより約15秒〜２分間、通常は30秒〜１分間の範囲の
時間保たれるであろう。しかしながら、ddNTPsを識別せ
ずまた化学的修飾剤により修飾されるDNAポリメラーゼ
のDNAポリメラーゼ活性の回復は、最初のサイクルステ
ップの長さと温度、およびDNAポリメラーゼの不活性化
に用いる修飾剤に依存して、「連続的DEXTAQ」反応の初
めの10〜20サイクルの間は起こらず、より好ましくは12
〜15サイクルまでは起こらない。酵素活性の回復は、用
いた修飾剤に依存して約90℃〜100℃、５〜15分間、よ
り好ましくは95℃で10分間余計に反応インキュベートす
ることにより、温度プロフィールの第２工程で最大化さ
れる。この追加的インキュベーションステップに続い
て、サイクルプロフィールの第３工程を行う。これは変
性、アニーリングを含む20〜40ステップ、通常は30〜35
ステップによるものであり、そのアニーリング温度は、
DNA断片を産生するために用いられるプライマーに依存
して初めのサイクルと同じかまたは異なっており、その
産生DNA断片はシークエンシングシグナルおよび重合ス
テップとして検出されるであろう。
るための、典型的な「連続的DEXTAQ」反応温度サイクル
プロフィールは、３つの工程からなり、第１工程は変
性、アニーリング、および鎖伸長を12〜20サイクル行っ
た後、阻害された酵素を解放するための変性工程を行
い、次いでアニーリング、伸長をさらに20〜40サイクル
行う。サイクルプロフィールの第１工程の第１部分は、
二本鎖標的核酸の熱変性からなる。サンプルである核酸
の変性に必要な的確な条件は、サンプルである核酸の長
さおよび組成によって決まる。典型的には、90℃〜100
℃での約10秒〜約１分間までのインキュベーションが、
サンプルの核酸を変性させるのに有効である。「連続的
DEXTAQ」反応で用いられるアニーリング温度は、典型的
には約50℃〜75℃であり、通常は約55℃〜65℃の範囲で
あり、約15〜45秒間の範囲の時間保たれる。プライマー
の鋳型DNAへのアニーリングに引き続いて、反応混合液
はプライマー末端にヌクレオチドを重合させるのに十分
な条件に置かれるであろう。重合条件を達成するため
に、反応混合液の温度は、典型的には約65℃〜75℃、よ
り好ましくは68℃〜72℃の範囲の温度で、鋳型DNAの長
さにより約15秒〜２分間、通常は30秒〜１分間の範囲の
時間保たれるであろう。しかしながら、ddNTPsを識別せ
ずまた化学的修飾剤により修飾されるDNAポリメラーゼ
のDNAポリメラーゼ活性の回復は、最初のサイクルステ
ップの長さと温度、およびDNAポリメラーゼの不活性化
に用いる修飾剤に依存して、「連続的DEXTAQ」反応の初
めの10〜20サイクルの間は起こらず、より好ましくは12
〜15サイクルまでは起こらない。酵素活性の回復は、用
いた修飾剤に依存して約90℃〜100℃、５〜15分間、よ
り好ましくは95℃で10分間余計に反応インキュベートす
ることにより、温度プロフィールの第２工程で最大化さ
れる。この追加的インキュベーションステップに続い
て、サイクルプロフィールの第３工程を行う。これは変
性、アニーリングを含む20〜40ステップ、通常は30〜35
ステップによるものであり、そのアニーリング温度は、
DNA断片を産生するために用いられるプライマーに依存
して初めのサイクルと同じかまたは異なっており、その
産生DNA断片はシークエンシングシグナルおよび重合ス
テップとして検出されるであろう。
【００５０】本発明の方法のさらなる好適な実施形態に
おいては、配列決定すべき核酸分子が、非クローン化ま
たは未精製の状態である全ゲノムDNAとして存在してい
てもよい。連続的DEXTAQは約60ngの全ゲノムDNAを用い
て機能するが、多コピーの断片を解析するのであれば、
より少ない量のDNAでも機能する。鋳型として用いるこ
とのできる他のDNAの形態としては、精製DNA、部分精製
DNAまたは、例えば細菌コロニーに由来する未精製プラ
スミドDNAなどの未精製クローン化DNAまたはクローン化
もしくは非クローン化ミトコンドリアDNAなどが含まれ
る。本発明のさらなる方法は、鋳型の塩基組成から比較
的独立している。
おいては、配列決定すべき核酸分子が、非クローン化ま
たは未精製の状態である全ゲノムDNAとして存在してい
てもよい。連続的DEXTAQは約60ngの全ゲノムDNAを用い
て機能するが、多コピーの断片を解析するのであれば、
より少ない量のDNAでも機能する。鋳型として用いるこ
とのできる他のDNAの形態としては、精製DNA、部分精製
DNAまたは、例えば細菌コロニーに由来する未精製プラ
スミドDNAなどの未精製クローン化DNAまたはクローン化
もしくは非クローン化ミトコンドリアDNAなどが含まれ
る。本発明のさらなる方法は、鋳型の塩基組成から比較
的独立している。
【００５１】好適な実施形態においては、本発明の方法
は、DNA配列のA、G、C、Tの位置を決定するための各熱
サイクル反応を、単一工程で、単一容器、ベッセルまた
はチューブ内で行うことでさらに特徴付けられる。
は、DNA配列のA、G、C、Tの位置を決定するための各熱
サイクル反応を、単一工程で、単一容器、ベッセルまた
はチューブ内で行うことでさらに特徴付けられる。
【００５２】本発明の特に好適な実施形態においては、
熱サイクル反応はさらに熱安定性ピロホスファターゼを
含む。
熱サイクル反応はさらに熱安定性ピロホスファターゼを
含む。
【００５３】さらに、完全長の断片と短くされた断片の
指数関数的増幅に必要な全ての試薬は初めの反応混合液
中に存在しているので、本発明の方法では、単一チュー
ブ内でシークエンシング用鋳型およびシークエンスラダ
ーの並行的、指数関数的産生が達成され、熱サイクル反
応を中断する必要がない。このことは、本発明の方法を
用いれば、単一工程で核酸配列を決定できることを意味
している。
指数関数的増幅に必要な全ての試薬は初めの反応混合液
中に存在しているので、本発明の方法では、単一チュー
ブ内でシークエンシング用鋳型およびシークエンスラダ
ーの並行的、指数関数的産生が達成され、熱サイクル反
応を中断する必要がない。このことは、本発明の方法を
用いれば、単一工程で核酸配列を決定できることを意味
している。
【００５４】本発明は、配列決定すべき核酸断片を、核
酸の複合混合物(全ゲノムヒトDNAなど)から、該配列決
定すべき核酸断片の公知の方法による事前の核酸増幅を
行わずに、単一工程すなわち反応を中断することなく、
実際に明確なシークエンスラダーを読み取れるように並
行した増幅とシークエンシングを行うことが可能にな
る、非常に感度の高い方法を提供する。本発明の連続的
な経時的解放法は、EP 0854 196に記載された「通常
の」DEXTAQ法を著しく改良したものである。
酸の複合混合物(全ゲノムヒトDNAなど)から、該配列決
定すべき核酸断片の公知の方法による事前の核酸増幅を
行わずに、単一工程すなわち反応を中断することなく、
実際に明確なシークエンスラダーを読み取れるように並
行した増幅とシークエンシングを行うことが可能にな
る、非常に感度の高い方法を提供する。本発明の連続的
な経時的解放法は、EP 0854 196に記載された「通常
の」DEXTAQ法を著しく改良したものである。
【００５５】本発明の方法は、複合混合物中の核酸分子
の直接シークエンシングのために用いることができる。
複合混合物は標的核酸分子の濃縮精製を行っていない核
酸混合物である。しかしながら、その核酸はその原供給
源、例えば細胞から単離されたものでありうる。複合混
合物において、該標的核酸分子中の全ヌクレオチド数と
バックグラウンドの核酸分子中の全ヌクレオチド数との
比率は、１よりもかなり小さく、バックグラウンドの核
酸分子数に対する標的核酸分子数の比率は、１よりそれ
ほど大きくないか、または１より小さくさえあり、１よ
りかなり小さい可能性さえある。例えば、バックグラウ
ンドの核酸分子の数に対する標的核酸分子の数の比率
は、約0.0001〜約１の範囲であり得る。そのような複合
混合物は、本発明の方法により直接シークエンシングを
行う標的DNA分子として、単一コピーのヒト遺伝子(例え
ばp53遺伝子)を含む全ヒトゲノムDNAであり得る。図2c
は、複合混合物の例を示している。
の直接シークエンシングのために用いることができる。
複合混合物は標的核酸分子の濃縮精製を行っていない核
酸混合物である。しかしながら、その核酸はその原供給
源、例えば細胞から単離されたものでありうる。複合混
合物において、該標的核酸分子中の全ヌクレオチド数と
バックグラウンドの核酸分子中の全ヌクレオチド数との
比率は、１よりもかなり小さく、バックグラウンドの核
酸分子数に対する標的核酸分子数の比率は、１よりそれ
ほど大きくないか、または１より小さくさえあり、１よ
りかなり小さい可能性さえある。例えば、バックグラウ
ンドの核酸分子の数に対する標的核酸分子の数の比率
は、約0.0001〜約１の範囲であり得る。そのような複合
混合物は、本発明の方法により直接シークエンシングを
行う標的DNA分子として、単一コピーのヒト遺伝子(例え
ばp53遺伝子)を含む全ヒトゲノムDNAであり得る。図2c
は、複合混合物の例を示している。
【００５６】本発明の方法はまた、中程度複合混合物中
の核酸分子の直接シークエンシングに用いることができ
る。中程度複合混合物は核酸混合物であって、標的核酸
分子の濃縮精製を行っていないものである。しかしなが
ら、核酸はその原供給源、例えば細菌細胞から単離した
ものであっても、そうでなくてもよい。中程度複合混合
物中、該標的核酸分子中の全ヌクレオチド数とバックグ
ラウンドの核酸分子の全ヌクレオチド数との比率は１に
近いか１より小さく、バックグラウンドの核酸分子数に
対する標的核酸分子数の比率は１より大きい。例えば、
バックグラウンドの核酸分子数に対する標的核酸分子数
の比率は、約１〜約1,000の範囲であり得る。そのよう
な中程度複合混合物は、細菌コロニー由来のDNA(標的DN
A分子としてプラスミドDNAを含む)、ファージプラーク
由来のDNA(標的DNA分子としてM13DNAを含む)、または部
分精製もしくは未精製のミトコンドリアDNAであり得
る。図2bは中程度複合混合物の一例を示している。
の核酸分子の直接シークエンシングに用いることができ
る。中程度複合混合物は核酸混合物であって、標的核酸
分子の濃縮精製を行っていないものである。しかしなが
ら、核酸はその原供給源、例えば細菌細胞から単離した
ものであっても、そうでなくてもよい。中程度複合混合
物中、該標的核酸分子中の全ヌクレオチド数とバックグ
ラウンドの核酸分子の全ヌクレオチド数との比率は１に
近いか１より小さく、バックグラウンドの核酸分子数に
対する標的核酸分子数の比率は１より大きい。例えば、
バックグラウンドの核酸分子数に対する標的核酸分子数
の比率は、約１〜約1,000の範囲であり得る。そのよう
な中程度複合混合物は、細菌コロニー由来のDNA(標的DN
A分子としてプラスミドDNAを含む)、ファージプラーク
由来のDNA(標的DNA分子としてM13DNAを含む)、または部
分精製もしくは未精製のミトコンドリアDNAであり得
る。図2bは中程度複合混合物の一例を示している。
【００５７】本発明の方法はまた、非複合混合物中の鋳
型核酸分子の直接シークエンシングに用いることができ
る。非複合混合物は、鋳型核酸分子を増幅しおよび／ま
たは精製もしくは部分精製した核酸混合物である。その
増幅および精製法は、クローニングに続いてのプラスミ
ド精製、勾配遠心分離および精製であるか、またはPCR
産生(終結ヌクレオチド不存在下では、PCRサイクル数は
1〜50の範囲であろう)でありうるが、この場合PCR産物
は精製してもしなくてもよい。非複合混合物中では、標
的核酸分子数とバックグラウンドの核酸分子数との比率
は１よりかなり大きい。例えば、バックグラウンドの核
酸分子数に対する標的核酸分子数の比率は、約1,000〜
約1×1018の範囲であり得る。図2aは非複合混合物の一
例を示している。
型核酸分子の直接シークエンシングに用いることができ
る。非複合混合物は、鋳型核酸分子を増幅しおよび／ま
たは精製もしくは部分精製した核酸混合物である。その
増幅および精製法は、クローニングに続いてのプラスミ
ド精製、勾配遠心分離および精製であるか、またはPCR
産生(終結ヌクレオチド不存在下では、PCRサイクル数は
1〜50の範囲であろう)でありうるが、この場合PCR産物
は精製してもしなくてもよい。非複合混合物中では、標
的核酸分子数とバックグラウンドの核酸分子数との比率
は１よりかなり大きい。例えば、バックグラウンドの核
酸分子数に対する標的核酸分子数の比率は、約1,000〜
約1×1018の範囲であり得る。図2aは非複合混合物の一
例を示している。
【００５８】本発明の方法のさらなる好適な実施形態に
おいては、配列決定すべき核酸分子がRNAであり得る。
２種類のポリメラーゼの混合物を用いるが、本発明の第
１DNAポリメラーゼは、例えばThermoSequenaseなどの
「Tabor-Richardson」突然変異を有するもの、またはそ
の機能的誘導体（より一般的には終結ヌクレオチドを組
み込み得るDNAポリメラーゼ）であり、第２DNAポリメラ
ーゼは、RNAをDNAへ逆転写することができ、かつPCR酵
素として機能し得るものである。逆転写酵素活性を有す
る熱安定性DNAポリメラーゼは、RNAを鋳型として用いる
ような本発明の方法では、第２DNAポリメラーゼとして
用いられ得る。Taq DNAポリメラーゼ(Jonesら, Nucl.Ac
id Res.17:8387-8388(1989))またはTth DNAポリメラー
ゼ(Myersら,Biochemistry 30:7666-7672(1991))を好ま
しくは用い、より好ましくはTth DNAポリメラーゼを用
いる。Tthポリメラーゼは鋳型として用いられ得る完全
長の産物を最初に産生し、ThermoSequenaseは短くされ
た産物(ddNTP取り込み体)を生じさせ、よってシークエ
ンスラダーを生じさせるであろう。
おいては、配列決定すべき核酸分子がRNAであり得る。
２種類のポリメラーゼの混合物を用いるが、本発明の第
１DNAポリメラーゼは、例えばThermoSequenaseなどの
「Tabor-Richardson」突然変異を有するもの、またはそ
の機能的誘導体（より一般的には終結ヌクレオチドを組
み込み得るDNAポリメラーゼ）であり、第２DNAポリメラ
ーゼは、RNAをDNAへ逆転写することができ、かつPCR酵
素として機能し得るものである。逆転写酵素活性を有す
る熱安定性DNAポリメラーゼは、RNAを鋳型として用いる
ような本発明の方法では、第２DNAポリメラーゼとして
用いられ得る。Taq DNAポリメラーゼ(Jonesら, Nucl.Ac
id Res.17:8387-8388(1989))またはTth DNAポリメラー
ゼ(Myersら,Biochemistry 30:7666-7672(1991))を好ま
しくは用い、より好ましくはTth DNAポリメラーゼを用
いる。Tthポリメラーゼは鋳型として用いられ得る完全
長の産物を最初に産生し、ThermoSequenaseは短くされ
た産物(ddNTP取り込み体)を生じさせ、よってシークエ
ンスラダーを生じさせるであろう。
【００５９】好適なバッファーは、Myersらの(1991) Bi
ochemistry 30:7666-7672に記載されたものを含む。こ
のバッファー(10〜500mMのTris-HCl(pH7.5〜9.0)、10〜
100mMの KCl、約１mMの MnCl2および濃度約２mM〜６mM
のMgCl2)は、逆転写酵素活性を保証するために用いられ
るが、該逆転写酵素活性は「連続的DEXTAQ」反応へ第３
の酵素として加えられるか、または１種類のポリメラー
ゼ、好ましくはddNTPsを識別するものを、ddNTPを識別
し逆転写酵素活性を有するもので置換することにより加
えられる。
ochemistry 30:7666-7672に記載されたものを含む。こ
のバッファー(10〜500mMのTris-HCl(pH7.5〜9.0)、10〜
100mMの KCl、約１mMの MnCl2および濃度約２mM〜６mM
のMgCl2)は、逆転写酵素活性を保証するために用いられ
るが、該逆転写酵素活性は「連続的DEXTAQ」反応へ第３
の酵素として加えられるか、または１種類のポリメラー
ゼ、好ましくはddNTPsを識別するものを、ddNTPを識別
し逆転写酵素活性を有するもので置換することにより加
えられる。
【００６０】本発明の好適な実施形態においては、カル
ボキシドセルマス ハイドロジェノフォルマンズ(Carbox
ydothermus hydrogenoformans)から得たDNAポリメラー
ゼをRNAの配列決定のために用いる。この酵素はEP 0 83
4 569に開示され、Mgイオン存在下、Mnイオンの不存在
下で逆転写酵素活性を有する。本発明の実施形態の１つ
では、該ポリメラーゼはTaborおよびRichardsonに記載
されたように突然変異されており(Tabor,S. & Richards
on,C.C. (1995) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,6339-634
3; EP 0 655 506)、これはddNTPsを識別しない酵素を作
製するためである。この構成においては、Mgは初めから
0.5mM〜20mMの範囲で存在し、さらにMnを必要としな
い。適切なバッファーは、限定するものではないが、Tr
is-HCl(pH6.5〜11)、KCl(２mM〜100mM)、および熱安定
性ピロホスファターゼなどのさらなる酵素(0.1〜50U)を
さらに含むこともある。さらに、少なくとも１種類のヌ
クレオチドが含まれなければならない。その反応は上述
のように繰り返される。したがって酵素は逆転写反応、
増幅反応およびシークエンシング反応を行う活性を含み
得る。
ボキシドセルマス ハイドロジェノフォルマンズ(Carbox
ydothermus hydrogenoformans)から得たDNAポリメラー
ゼをRNAの配列決定のために用いる。この酵素はEP 0 83
4 569に開示され、Mgイオン存在下、Mnイオンの不存在
下で逆転写酵素活性を有する。本発明の実施形態の１つ
では、該ポリメラーゼはTaborおよびRichardsonに記載
されたように突然変異されており(Tabor,S. & Richards
on,C.C. (1995) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,6339-634
3; EP 0 655 506)、これはddNTPsを識別しない酵素を作
製するためである。この構成においては、Mgは初めから
0.5mM〜20mMの範囲で存在し、さらにMnを必要としな
い。適切なバッファーは、限定するものではないが、Tr
is-HCl(pH6.5〜11)、KCl(２mM〜100mM)、および熱安定
性ピロホスファターゼなどのさらなる酵素(0.1〜50U)を
さらに含むこともある。さらに、少なくとも１種類のヌ
クレオチドが含まれなければならない。その反応は上述
のように繰り返される。したがって酵素は逆転写反応、
増幅反応およびシークエンシング反応を行う活性を含み
得る。
【００６１】種々の酵素を制御の下に阻害から解放し、
したがってチューブまたは容器を開けることなく、連続
的にまたは並行してその活性を進行中の反応に付加する
ことを含む本方法論は、酵素の多くの組み合わせに適用
できる。さらなる例は、RNAの並行した増幅とシークエ
ンシングである。この時、逆転写酵素活性保有酵素は初
めから活性があり、一方増幅およびシークエンシングの
為のさらなる酵素は解放されるまで不活性なままであ
る。したがって、逆転写は他の酵素の効果を阻害する可
能性無しに行われ得る。増幅酵素とDNA修飾酵素の組み
合わせも考えられる。この場合、第１酵素は標的を増幅
し、次いで第２酵素の解放の後に修飾される。
したがってチューブまたは容器を開けることなく、連続
的にまたは並行してその活性を進行中の反応に付加する
ことを含む本方法論は、酵素の多くの組み合わせに適用
できる。さらなる例は、RNAの並行した増幅とシークエ
ンシングである。この時、逆転写酵素活性保有酵素は初
めから活性があり、一方増幅およびシークエンシングの
為のさらなる酵素は解放されるまで不活性なままであ
る。したがって、逆転写は他の酵素の効果を阻害する可
能性無しに行われ得る。増幅酵素とDNA修飾酵素の組み
合わせも考えられる。この場合、第１酵素は標的を増幅
し、次いで第２酵素の解放の後に修飾される。
【００６２】それゆえ本発明の１つの実施形態は、核酸
分子がRNAであって、２種類のポリメラーゼのうちの１
つが逆転写酵素活性を示すような発明の方法である。別
の好適な実施形態においては、逆転写酵素活性を示すさ
らなる酵素が存在する。
分子がRNAであって、２種類のポリメラーゼのうちの１
つが逆転写酵素活性を示すような発明の方法である。別
の好適な実施形態においては、逆転写酵素活性を示すさ
らなる酵素が存在する。
【００６３】連続的ホットスタート法のシークエンスラ
ダーを図３に示す。増幅とシークエンシングの両方の工
程を高効率で行い、したがってシークエンスラダーの生
成がより早く観察でき、またその精度が改善される。
ダーを図３に示す。増幅とシークエンシングの両方の工
程を高効率で行い、したがってシークエンスラダーの生
成がより早く観察でき、またその精度が改善される。
【００６４】本発明の特に好適な実施形態は、１組のプ
ライマー対より多いプライマーを使用するかまたは「サ
イレントプライマー」と呼ばれる第２のプライマー対
(図６)を使用するものである。それゆえ、本発明の１つ
の実施形態は、熱サイクル反応における核酸分子のシー
クエンシング方法であって、初めに核酸分子、第１プラ
イマー(i)および第２プライマー(ii)を含むプライマー
対（鋳型にアニーリングする際、第１プライマー(i)の
3'末端および第２プライマー(ii)の3'末端が互いに向き
合い、また第１プライマー(i)または第２プライマー(i
i)のうち少なくとも１種類のプライマーは標識され
る）、反応バッファー、デオキシヌクレオチドまたはそ
の誘導体、および少なくとも１種類のジデオキシヌクレ
オチドまたは他の終結ヌクレオチド（シークエンシング
反応の場合）、熱安定性のDNAポリメラーゼ（該バッフ
ァー中、または熱サイクルに用いられる条件下で）を含
むものであり、該反応がさらに、少なくとも１種類のさ
らなるポリメラーゼ(iii)を含み、そのプライマーは非
標識であるか、またはプライマー(i)および／もしくは
(ii)に結合した標識とは異なる方法で標識され、プライ
マー(i)および(ii)に挟まれた領域またはその外側に位
置することで特徴付けられる。該反応はさらに、例えば
DNAポリメラーゼである第２の酵素を含み得る。
ライマー対より多いプライマーを使用するかまたは「サ
イレントプライマー」と呼ばれる第２のプライマー対
(図６)を使用するものである。それゆえ、本発明の１つ
の実施形態は、熱サイクル反応における核酸分子のシー
クエンシング方法であって、初めに核酸分子、第１プラ
イマー(i)および第２プライマー(ii)を含むプライマー
対（鋳型にアニーリングする際、第１プライマー(i)の
3'末端および第２プライマー(ii)の3'末端が互いに向き
合い、また第１プライマー(i)または第２プライマー(i
i)のうち少なくとも１種類のプライマーは標識され
る）、反応バッファー、デオキシヌクレオチドまたはそ
の誘導体、および少なくとも１種類のジデオキシヌクレ
オチドまたは他の終結ヌクレオチド（シークエンシング
反応の場合）、熱安定性のDNAポリメラーゼ（該バッフ
ァー中、または熱サイクルに用いられる条件下で）を含
むものであり、該反応がさらに、少なくとも１種類のさ
らなるポリメラーゼ(iii)を含み、そのプライマーは非
標識であるか、またはプライマー(i)および／もしくは
(ii)に結合した標識とは異なる方法で標識され、プライ
マー(i)および(ii)に挟まれた領域またはその外側に位
置することで特徴付けられる。該反応はさらに、例えば
DNAポリメラーゼである第２の酵素を含み得る。
【００６５】以下のプライマーの組み合わせは、本発明
の方法のさらに好適な実施形態に用いることができる
（図６を参照のこと）。
の方法のさらに好適な実施形態に用いることができる
（図６を参照のこと）。
【００６６】図６の事例Aでは、「連続的DEXTAQ」反応
に１組のプライマー対が用いられ、両プライマーが別々
に標識されているか、または２種類のプライマーの一方
が標識されている。
に１組のプライマー対が用いられ、両プライマーが別々
に標識されているか、または２種類のプライマーの一方
が標識されている。
【００６７】図６の事例Bでは１組のプライマー対より
多いプライマーが用いられ、２種類のプライマーは標識
されずに鋳型の反対の鎖に位置し、追加的プライマーが
標識されている。この時非標識プライマーは標識プライ
マーに対するフランキングプライマーであり、標識プラ
イマーは完全にまたは部分的に重複しているか、または
２つのプライマーのうちの一方には重複していない。
多いプライマーが用いられ、２種類のプライマーは標識
されずに鋳型の反対の鎖に位置し、追加的プライマーが
標識されている。この時非標識プライマーは標識プライ
マーに対するフランキングプライマーであり、標識プラ
イマーは完全にまたは部分的に重複しているか、または
２つのプライマーのうちの一方には重複していない。
【００６８】図６の事例Cでは２組のプライマー対が用
いられ、配列決定すべき領域を増幅する１組のプライマ
ー対が標識され、また追加的プライマー対は標識されな
い。この時非標識プライマーは標識プライマーに対する
フランキングプライマーであり、標識プライマーは完全
にまたは部分的に重複しているか、または２つのプライ
マーのうちのいずれとも重複していない。
いられ、配列決定すべき領域を増幅する１組のプライマ
ー対が標識され、また追加的プライマー対は標識されな
い。この時非標識プライマーは標識プライマーに対する
フランキングプライマーであり、標識プライマーは完全
にまたは部分的に重複しているか、または２つのプライ
マーのうちのいずれとも重複していない。
【００６９】図６の事例Dでは、部分的に重複したプラ
イマーを用いた事例Cの特別な実施形態が示される。こ
の時標識プライマーはプライマー配列の一部でフランキ
ングプライマーと対合するが、そのプライマー配列の一
部は初めのサイクルの後で形成され、配列決定すべき鋳
型とは対合しないものである。
イマーを用いた事例Cの特別な実施形態が示される。こ
の時標識プライマーはプライマー配列の一部でフランキ
ングプライマーと対合するが、そのプライマー配列の一
部は初めのサイクルの後で形成され、配列決定すべき鋳
型とは対合しないものである。
【００７０】図６の事例Eでは別の特別な実施形態が示
される。この時１つのプライマーの標識が、１種類の標
識ではなく４種類の異なる標識の集合物であり、より詳
細には、各標識が異なるヌクレオチドに対してなされる
ものである。
される。この時１つのプライマーの標識が、１種類の標
識ではなく４種類の異なる標識の集合物であり、より詳
細には、各標識が異なるヌクレオチドに対してなされる
ものである。
【００７１】さらには、１組のプライマー対より多いプ
ライマーを用いる場合には、フランキングプライマーの
アニーリング条件が標識プライマーとは異なることが好
ましい。
ライマーを用いる場合には、フランキングプライマーの
アニーリング条件が標識プライマーとは異なることが好
ましい。
【００７２】「サイレントプライマー」(プライマー(ii
i)およびついには(iv))は、標識されないか異なる標識
をされ、反応のシークエンシング部分の後半のサイクル
で鋳型分子として利用されるDNA断片の産生のために用
いることができる。第２「サイレント」プライマー対を
使用すると、シークエンシング反応のための鋳型として
利用できる核酸断片を大量に産生することができ、それ
らは増幅サイクルの間にサイレントプライマーの伸長に
よって産生されたDNA鎖、および標識またはビオチン化
プライマーの伸長により産生されたDNA鎖からなる。サ
イレントプライマーを、標識またはビオチン化プライマ
ーに比べて大過剰量で用いると、サイレントプライマー
の伸長によって、シークエンシング反応用の鋳型分子が
大量に産生される。
i)およびついには(iv))は、標識されないか異なる標識
をされ、反応のシークエンシング部分の後半のサイクル
で鋳型分子として利用されるDNA断片の産生のために用
いることができる。第２「サイレント」プライマー対を
使用すると、シークエンシング反応のための鋳型として
利用できる核酸断片を大量に産生することができ、それ
らは増幅サイクルの間にサイレントプライマーの伸長に
よって産生されたDNA鎖、および標識またはビオチン化
プライマーの伸長により産生されたDNA鎖からなる。サ
イレントプライマーを、標識またはビオチン化プライマ
ーに比べて大過剰量で用いると、サイレントプライマー
の伸長によって、シークエンシング反応用の鋳型分子が
大量に産生される。
【００７３】本方法のバリエーションは、異なるアニー
リング特性を有するプライマーを使用するものとして、
本発明に包含される。
リング特性を有するプライマーを使用するものとして、
本発明に包含される。
【００７４】それゆえ、本発明の主題となるのは、熱サ
イクル反応における核酸分子のシークエンシング方法で
もあり、この反応は初めに核酸分子、第１プライマーお
よび第２プライマーを含んでなる第１のプライマー対、
反応バッファー、デオキシヌクレオチドまたはその誘導
体、および少なくとも１種類のジデオキシヌクレオチド
または他の終結ヌクレオチド、前記バッファー中または
熱サイクルに用いる条件下で野生型のTaq DNAポリメラ
ーゼよりもddNTPsに対する識別力が低い、熱安定性DNA
ポリメラーゼを含む。この反応はさらに「サイレントプ
ライマー」と呼ばれる第２のプライマー対(プライマー
(iii)およびついには(iv))を含み、該プライマーは標識
されないか、または異なる標識をされる。
イクル反応における核酸分子のシークエンシング方法で
もあり、この反応は初めに核酸分子、第１プライマーお
よび第２プライマーを含んでなる第１のプライマー対、
反応バッファー、デオキシヌクレオチドまたはその誘導
体、および少なくとも１種類のジデオキシヌクレオチド
または他の終結ヌクレオチド、前記バッファー中または
熱サイクルに用いる条件下で野生型のTaq DNAポリメラ
ーゼよりもddNTPsに対する識別力が低い、熱安定性DNA
ポリメラーゼを含む。この反応はさらに「サイレントプ
ライマー」と呼ばれる第２のプライマー対(プライマー
(iii)およびついには(iv))を含み、該プライマーは標識
されないか、または異なる標識をされる。
【００７５】さらには、上述した熱サイクル反応におけ
る核酸分子の連続的シークエンシング法の全てが、「サ
イレントプライマー」と呼ばれる第２のプライマー対を
さらに含み得る。そのプライマー対は第３およびついに
は第４プライマーからなり、それらは標識されないか、
または第１のプライマー対とは異なる標識をされる。
る核酸分子の連続的シークエンシング法の全てが、「サ
イレントプライマー」と呼ばれる第２のプライマー対を
さらに含み得る。そのプライマー対は第３およびついに
は第４プライマーからなり、それらは標識されないか、
または第１のプライマー対とは異なる標識をされる。
【００７６】本発明の最も好適な実施形態は、連続的DE
XTAQと「サイレントプライマー」法を組み合わせたもの
である。
XTAQと「サイレントプライマー」法を組み合わせたもの
である。
【００７７】相対シグナル強度は、プライマーピークの
積分値をシグナルピークの積分値で割ることにより算出
した。その比の値が小さいほどシグナル強度が高く、そ
のピークがより明確であり、したがってより正確なベー
スコーリングを行うことができる。図５は、プライマー
ピーク面積に対するシグナルピーク面積の比率について
の、連続的DEXTAQとサイレントプライマーを用いた連続
的DEXTAQの比較を示したものであり、連続的DEXTAQの場
合0.04、サイレントプライマーを用いた連続的DEXTAQの
場合0.006である。図５に示された実験の反応は実施例
３に従って行ったものである。示された比率はfragment
manager 1.1(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala,
Sweden)により処理した。この積分値は相対値であり、
絶対値ではないので、２つの値（プライマーシグナルに
対する平均的シグナルの積分値の比率など）の関係に基
づいて考える必要がある。あるピークの面積の積分値
は、蛍光シグナルの測定値であり、したがって識別可能
な大きさの標識化DNA断片の量と関連がある。それにも
かかわらず、バックグラウンドのシグナルがより低く、
ある大きさのDNA断片の微小末端短縮が存在し、隣接シ
グナルの重なり合いがなければ、積分値はより小さくな
くてはならない。平均シグナルピークとプライマーピー
クの積分値の比率は、シグナル強度が高く、ピークが正
確であるためにこの比率の値が低くなるようなシークエ
ンシングデータの特性の測定値である。連続的DEXTAQ反
応の比率は約0.04であり、追加的サイレントプライマー
を用いた連続的DEXTAQ反応の同様の比率値はずっと低
く、0.006である。この値の小数点一桁の違いは、該断
片の微小末端短縮がより多く、バックグラウンドのシグ
ナルがより低いことによって引き起こされ、またプライ
マーのより高いシグナル強度との関連がある。このこと
は、反応に鋳型分子を多く含める理由であり、それによ
って標識プライマーをあまり使用せず、より多くの末端
短縮型断片を産生し、それゆえシグナル強度が高くなる
ようにすることができる。増幅と鋳型産生を分離したた
めに、DEXTAQ系、連続的DEXTAQでは標識プライマーの減
少が先行し、連続的DEXTAQにおいて追加的にサイレント
プライマーを用いるとさらに急速な減少が起こる。
積分値をシグナルピークの積分値で割ることにより算出
した。その比の値が小さいほどシグナル強度が高く、そ
のピークがより明確であり、したがってより正確なベー
スコーリングを行うことができる。図５は、プライマー
ピーク面積に対するシグナルピーク面積の比率について
の、連続的DEXTAQとサイレントプライマーを用いた連続
的DEXTAQの比較を示したものであり、連続的DEXTAQの場
合0.04、サイレントプライマーを用いた連続的DEXTAQの
場合0.006である。図５に示された実験の反応は実施例
３に従って行ったものである。示された比率はfragment
manager 1.1(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala,
Sweden)により処理した。この積分値は相対値であり、
絶対値ではないので、２つの値（プライマーシグナルに
対する平均的シグナルの積分値の比率など）の関係に基
づいて考える必要がある。あるピークの面積の積分値
は、蛍光シグナルの測定値であり、したがって識別可能
な大きさの標識化DNA断片の量と関連がある。それにも
かかわらず、バックグラウンドのシグナルがより低く、
ある大きさのDNA断片の微小末端短縮が存在し、隣接シ
グナルの重なり合いがなければ、積分値はより小さくな
くてはならない。平均シグナルピークとプライマーピー
クの積分値の比率は、シグナル強度が高く、ピークが正
確であるためにこの比率の値が低くなるようなシークエ
ンシングデータの特性の測定値である。連続的DEXTAQ反
応の比率は約0.04であり、追加的サイレントプライマー
を用いた連続的DEXTAQ反応の同様の比率値はずっと低
く、0.006である。この値の小数点一桁の違いは、該断
片の微小末端短縮がより多く、バックグラウンドのシグ
ナルがより低いことによって引き起こされ、またプライ
マーのより高いシグナル強度との関連がある。このこと
は、反応に鋳型分子を多く含める理由であり、それによ
って標識プライマーをあまり使用せず、より多くの末端
短縮型断片を産生し、それゆえシグナル強度が高くなる
ようにすることができる。増幅と鋳型産生を分離したた
めに、DEXTAQ系、連続的DEXTAQでは標識プライマーの減
少が先行し、連続的DEXTAQにおいて追加的にサイレント
プライマーを用いるとさらに急速な減少が起こる。
【００７８】本発明の方法において核酸分子の適切な供
給源は、体液例えば***、尿、血液またはその画分、毛
髪、個々の細胞、細胞またはその画分、骨などの硬組織
および軟組織またはその画分および細胞培養物またはそ
の画分ならびに細菌、ウイルスまたはバクテリオファー
ジである。
給源は、体液例えば***、尿、血液またはその画分、毛
髪、個々の細胞、細胞またはその画分、骨などの硬組織
および軟組織またはその画分および細胞培養物またはそ
の画分ならびに細菌、ウイルスまたはバクテリオファー
ジである。
【００７９】本発明はまた、本発明の方法の、特定の核
酸分子のヌクレオチド配列の決定、例えば、大規模ゲノ
ムプロジェクトのための２種類の標識を用いたショット
ガンライブラリーの配列決定、および医学的診断、法医
学および集団遺伝学における配列決定などに対する用途
も提供することができる。本発明の方法は、遺伝的突然
変異または遺伝的多型の検出、配列決定した核酸の起源
の同定、またはサンプル中の外来性または感染物質の存
在の検出に用いることができる。
酸分子のヌクレオチド配列の決定、例えば、大規模ゲノ
ムプロジェクトのための２種類の標識を用いたショット
ガンライブラリーの配列決定、および医学的診断、法医
学および集団遺伝学における配列決定などに対する用途
も提供することができる。本発明の方法は、遺伝的突然
変異または遺伝的多型の検出、配列決定した核酸の起源
の同定、またはサンプル中の外来性または感染物質の存
在の検出に用いることができる。
【００８０】それゆえ本発明の方法の特別な利点は、核
酸の直接シークエンシングができることである。したが
って本発明の方法は、例えばヒトなどの真核生物のゲノ
ムDNA、染色体DNAまたはミトコンドリアDNA、ヒトRNA、
細菌コロニーに由来する未精製プラスミドDNA、そして
同様にバクテリオファージに由来する未精製一本鎖DNA
または二本鎖DNAなどを直接シークエンシングするため
に用いられ得る。
酸の直接シークエンシングができることである。したが
って本発明の方法は、例えばヒトなどの真核生物のゲノ
ムDNA、染色体DNAまたはミトコンドリアDNA、ヒトRNA、
細菌コロニーに由来する未精製プラスミドDNA、そして
同様にバクテリオファージに由来する未精製一本鎖DNA
または二本鎖DNAなどを直接シークエンシングするため
に用いられ得る。
【００８１】本発明は上記の方法の全ての手順の全ての
組み合わせに関する。
組み合わせに関する。
【００８２】調製の後、シークエンシング反応物は、一
般的に用いられるローディングバッファー（例えば、20
mMの EDTA(pH7.4)および６mg/mlのデキストランブルー
を含むホルムアミド）を加え、変性（例えば96℃で４分
間）した後、シークエンシングゲルに直接乗せることが
できる。そのシークエンスラダーは公知の方法に対応さ
せて読み取ることができる。本発明の方法は、自動化に
非常に適している。反応物中の少なくとも１種類のプラ
イマーが標識され、２種類のプライマーは別々に標識さ
れ、または末端短縮型断片は3'末端で異なる標識（例え
ば少なくとも２種類の異なる波長で検出できるように）
をされるために、本発明の方法は、鋳型の両鎖の同時的
配列決定および１レーンまたは数レーンでの両方の反応
物の検出を可能にする。一般に、異なる色素を用いた複
数の連続的DEXTAQ反応を同じチューブで同時に行って、
数種類のレーザーを備えた配列決定装置に乗せることが
でき、または例えばオートラジオグラフィーなどのその
他の方法によって検出することができる。
般的に用いられるローディングバッファー（例えば、20
mMの EDTA(pH7.4)および６mg/mlのデキストランブルー
を含むホルムアミド）を加え、変性（例えば96℃で４分
間）した後、シークエンシングゲルに直接乗せることが
できる。そのシークエンスラダーは公知の方法に対応さ
せて読み取ることができる。本発明の方法は、自動化に
非常に適している。反応物中の少なくとも１種類のプラ
イマーが標識され、２種類のプライマーは別々に標識さ
れ、または末端短縮型断片は3'末端で異なる標識（例え
ば少なくとも２種類の異なる波長で検出できるように）
をされるために、本発明の方法は、鋳型の両鎖の同時的
配列決定および１レーンまたは数レーンでの両方の反応
物の検出を可能にする。一般に、異なる色素を用いた複
数の連続的DEXTAQ反応を同じチューブで同時に行って、
数種類のレーザーを備えた配列決定装置に乗せることが
でき、または例えばオートラジオグラフィーなどのその
他の方法によって検出することができる。
【００８３】本発明の主題となるのは、核酸分子の合成
用キットであって、第１プライマー(i)、第２プライマ
ー(ii)、反応バッファー、デオキシヌクレオチドまたは
その誘導体を含み、熱サイクル反応においては異なる酵
素活性を有する少なくとも２種類の熱安定性酵素を含
み、但し少なくともその１種類の酵素はDNAポリメラー
ゼ活性を示し、その２種類の酵素の一方は、熱サイクル
反応において他方の熱安定性酵素よりも後のサイクルで
活性化されるような、該キットである。核酸分子を配列
決定するためのキットは、第１および第２熱安定性DNA
ポリメラーゼを含む請求項３２に記載された成分、さら
に少なくとも１種類のジデオキシヌクレオチドまたは別
の終結ヌクレオチドを含んでおり、但し該第２熱安定性
DNAポリメラーゼは第１熱安定性DNAポリメラーゼよりも
ジデオキシヌクレオチドを取り込む能力が低いものであ
る。
用キットであって、第１プライマー(i)、第２プライマ
ー(ii)、反応バッファー、デオキシヌクレオチドまたは
その誘導体を含み、熱サイクル反応においては異なる酵
素活性を有する少なくとも２種類の熱安定性酵素を含
み、但し少なくともその１種類の酵素はDNAポリメラー
ゼ活性を示し、その２種類の酵素の一方は、熱サイクル
反応において他方の熱安定性酵素よりも後のサイクルで
活性化されるような、該キットである。核酸分子を配列
決定するためのキットは、第１および第２熱安定性DNA
ポリメラーゼを含む請求項３２に記載された成分、さら
に少なくとも１種類のジデオキシヌクレオチドまたは別
の終結ヌクレオチドを含んでおり、但し該第２熱安定性
DNAポリメラーゼは第１熱安定性DNAポリメラーゼよりも
ジデオキシヌクレオチドを取り込む能力が低いものであ
る。
【００８４】特に好適なものは、核酸分子を配列決定す
るためのキットであって、両方のポリメラーゼは、初め
は阻害剤または化学修飾によって阻害され、さらに熱サ
イクルシークエンシング反応の後半のサイクルで活性さ
れることができ、そのポリメラーゼの一方は他方よりも
後のサイクルで活性化されるものである。特に好適なも
のは、本発明のキットであって、但し第１DNAポリメラ
ーゼは阻害剤によって初めは阻害され、第２ポリメラー
ゼは初め抗体によって阻害されて、第２ポリメラーゼは
第１ポリメラーゼよりも早いサイクルにて解放されるも
のである。
るためのキットであって、両方のポリメラーゼは、初め
は阻害剤または化学修飾によって阻害され、さらに熱サ
イクルシークエンシング反応の後半のサイクルで活性さ
れることができ、そのポリメラーゼの一方は他方よりも
後のサイクルで活性化されるものである。特に好適なも
のは、本発明のキットであって、但し第１DNAポリメラ
ーゼは阻害剤によって初めは阻害され、第２ポリメラー
ゼは初め抗体によって阻害されて、第２ポリメラーゼは
第１ポリメラーゼよりも早いサイクルにて解放されるも
のである。
【００８５】本発明のさらなる主題は、核酸分子を配列
決定するためのキットであって、第１プライマー、第２
プライマー、反応バッファー、デオキシヌクレオチドま
たはその誘導体、および少なくとも１種類のジデオキシ
ヌクレオチドまたは他の終結ヌクレオチド、熱安定性DN
Aポリメラーゼであって前記バッファー中または熱サイ
クルに用いる条件下で野生型のTaq DNAポリメラーゼよ
りもddNTPsに対する識別力が低いもの、を含んでなり、
またさらに図６に示されるような特徴をもつ１種類以上
のプライマーを含んでなるものである。このキットの好
適な実施形態においては、第１熱安定性DNAポリメラー
ゼよりもジデオキシヌクレオチドを取り込む能力が低
い、第２DNAポリメラーゼが含まれる。
決定するためのキットであって、第１プライマー、第２
プライマー、反応バッファー、デオキシヌクレオチドま
たはその誘導体、および少なくとも１種類のジデオキシ
ヌクレオチドまたは他の終結ヌクレオチド、熱安定性DN
Aポリメラーゼであって前記バッファー中または熱サイ
クルに用いる条件下で野生型のTaq DNAポリメラーゼよ
りもddNTPsに対する識別力が低いもの、を含んでなり、
またさらに図６に示されるような特徴をもつ１種類以上
のプライマーを含んでなるものである。このキットの好
適な実施形態においては、第１熱安定性DNAポリメラー
ゼよりもジデオキシヌクレオチドを取り込む能力が低
い、第２DNAポリメラーゼが含まれる。
【００８６】特に好適なキットは、「サイレントプライ
マー」と呼ばれる第２のプライマー対をさらに含む、核
酸分子を配列決定するための前記キットであって、この
第２プライマー対が第３および第４プライマーを含み、
標識されないか、標識化またはビオチン化された第１プ
ライマーとは異なる標識をされるものである、該キット
である。
マー」と呼ばれる第２のプライマー対をさらに含む、核
酸分子を配列決定するための前記キットであって、この
第２プライマー対が第３および第４プライマーを含み、
標識されないか、標識化またはビオチン化された第１プ
ライマーとは異なる標識をされるものである、該キット
である。
【００８７】好適な実施形態は、さらに少なくとも１種
類のプライマー(iii)を含む、請求項32〜34に記載した
核酸分子の配列決定のためのキットであって、該プライ
マーは標識されないか、またはプライマー(i)および／
または(ii)に結合した標識とは異なる方法で標識され、
さらにプライマー(i)および(ii)に挟まれる領域または
その外側に位置するものである、該キットである。第４
プライマー(iv)をさらに含む請求項35に記載の核酸分子
の配列決定用のキットであって、、このプライマー(ii
i)の3'末端およびプライマー(iv)の3'末端が鋳型にアニ
ールする際互いに向き合い、プライマー(iv)は標識され
ないか、またはプライマー(i)および／または(ii)に結
合した標識とは異なる方法で標識され、さらにプライマ
ー(i)および(ii)に挟まれる領域またはその外側に位置
するものである、該キットである。
類のプライマー(iii)を含む、請求項32〜34に記載した
核酸分子の配列決定のためのキットであって、該プライ
マーは標識されないか、またはプライマー(i)および／
または(ii)に結合した標識とは異なる方法で標識され、
さらにプライマー(i)および(ii)に挟まれる領域または
その外側に位置するものである、該キットである。第４
プライマー(iv)をさらに含む請求項35に記載の核酸分子
の配列決定用のキットであって、、このプライマー(ii
i)の3'末端およびプライマー(iv)の3'末端が鋳型にアニ
ールする際互いに向き合い、プライマー(iv)は標識され
ないか、またはプライマー(i)および／または(ii)に結
合した標識とは異なる方法で標識され、さらにプライマ
ー(i)および(ii)に挟まれる領域またはその外側に位置
するものである、該キットである。
【００８８】EP 0 849 364およびEP 0 854 196の出願、
特に実施例および図面の教示は参照により本明細書中に
含めるものとする。
特に実施例および図面の教示は参照により本明細書中に
含めるものとする。
【００８９】本発明を以下の実施例によってより正確か
つより詳細に説明するが、それらに限定されるものでは
ない。
つより詳細に説明するが、それらに限定されるものでは
ない。
【００９０】
【実施例】実施例１
MWG-biotech AG(Munich, Germany)によって合成されたI
RD700標識プライマーmtDNA1(5'-GATTCTAATTTAAACTATTCT
CTGTTC-3')およびIRD800標識プライマー mtDNA2(5'-TTA
TGACCCTGAAGTAGGAACCAGATG-3')各６pmolを用いて、200n
gのヒトゲノムDNA(Roche Molecular Biochemicals, Man
nheim, Germany)について非共役的、直接的、指数関数
的増幅およびシークエンシング反応を行った。該プライ
マーは、ヒトミトコンドリア調節領域の469塩基対（プ
ライマー長はカウントしない）の領域を増幅する。その
反応は、2.5UのTaq DNAポリメラーゼ(Roche Molecular
Biochemicals, Mannheim, Germany)、約0.5Uのピロホス
ファターゼ(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim,
Germany)および約９UのAmpliTaq(登録商標) FS DNAポ
リメラーゼ(Perkin Elmer Corporation, Foster City,
California, USA)(図3A)およびポリメラーゼ阻害剤で化
学的に修飾した９UのAmpliTaq(登録商標) FSDNAポリメ
ラーゼ(Perkin Elmer Corporation, Foster City, Cali
fornia, USA)(図3A)を用いて行った。図3Aのゲル画像は
異なるサイクル(2,4,6,8,10,12,16,20,25,30,35)で停止
した反応を示している。サイクルシークエンシング反応
はPrimus 96 Cycler(MWG-biotech AG, Munich, German
y)にて、以下のサイクル条件下で行った。サイクル条件
には、95℃で５分のインキュベートステップの後、95℃
で40秒（変性）、62℃で20秒（アニーリング）および72
℃で60秒（合成）を30サイクル行うことを適用する。A.
L.F.ソフトウェアはIRD700標識プライマーについて378
塩基と11の不明瞭部位を処理することができた。図3Bの
ゲル画像は、異なるサイクル(2,4,6,8,10,12,15,20,25,
30,35)で停止した反応を示している。このサイクルシー
クエンシング反応は以下の通りに行った。95℃ 20秒、6
2℃ 20秒、68℃ 60秒を15サイクル、次いで95℃ ７分、
次いで95℃ 40秒、62℃ 20秒、70℃ 60秒を35サイク
ル。95℃ ７分というのは、ジデオキシヌクレオチドを
効率良く取り込むためのTabor Richardson突然変異を有
するDNAポリメラーゼ「１」(EP 0 771 870)の解放ステ
ップである。Lane-trackerソフトウェア(EMBL, Heidelb
erg,Germany)はIRD700標識プライマーについて400塩基
と２の不明瞭部位を処理することができた。
RD700標識プライマーmtDNA1(5'-GATTCTAATTTAAACTATTCT
CTGTTC-3')およびIRD800標識プライマー mtDNA2(5'-TTA
TGACCCTGAAGTAGGAACCAGATG-3')各６pmolを用いて、200n
gのヒトゲノムDNA(Roche Molecular Biochemicals, Man
nheim, Germany)について非共役的、直接的、指数関数
的増幅およびシークエンシング反応を行った。該プライ
マーは、ヒトミトコンドリア調節領域の469塩基対（プ
ライマー長はカウントしない）の領域を増幅する。その
反応は、2.5UのTaq DNAポリメラーゼ(Roche Molecular
Biochemicals, Mannheim, Germany)、約0.5Uのピロホス
ファターゼ(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim,
Germany)および約９UのAmpliTaq(登録商標) FS DNAポ
リメラーゼ(Perkin Elmer Corporation, Foster City,
California, USA)(図3A)およびポリメラーゼ阻害剤で化
学的に修飾した９UのAmpliTaq(登録商標) FSDNAポリメ
ラーゼ(Perkin Elmer Corporation, Foster City, Cali
fornia, USA)(図3A)を用いて行った。図3Aのゲル画像は
異なるサイクル(2,4,6,8,10,12,16,20,25,30,35)で停止
した反応を示している。サイクルシークエンシング反応
はPrimus 96 Cycler(MWG-biotech AG, Munich, German
y)にて、以下のサイクル条件下で行った。サイクル条件
には、95℃で５分のインキュベートステップの後、95℃
で40秒（変性）、62℃で20秒（アニーリング）および72
℃で60秒（合成）を30サイクル行うことを適用する。A.
L.F.ソフトウェアはIRD700標識プライマーについて378
塩基と11の不明瞭部位を処理することができた。図3Bの
ゲル画像は、異なるサイクル(2,4,6,8,10,12,15,20,25,
30,35)で停止した反応を示している。このサイクルシー
クエンシング反応は以下の通りに行った。95℃ 20秒、6
2℃ 20秒、68℃ 60秒を15サイクル、次いで95℃ ７分、
次いで95℃ 40秒、62℃ 20秒、70℃ 60秒を35サイク
ル。95℃ ７分というのは、ジデオキシヌクレオチドを
効率良く取り込むためのTabor Richardson突然変異を有
するDNAポリメラーゼ「１」(EP 0 771 870)の解放ステ
ップである。Lane-trackerソフトウェア(EMBL, Heidelb
erg,Germany)はIRD700標識プライマーについて400塩基
と２の不明瞭部位を処理することができた。
【００９１】実施例２
IRD700標識プライマー mtDNA1およびIRD800標識プライ
マー mtDNA2（MWG-biotech AG Munich, Germanyによっ
て合成されたもの）を各６pmol用いて、200ngのヒトゲ
ノムDNA(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Ge
rmany)について非共役的、直接的、指数関数的増幅およ
びシークエンシング反応を行った。該プライマーは、ヒ
トミトコンドリア調節領域の469塩基対（プライマー長
はカウントしない）の領域を増幅する。その反応は、2.
5UのTaq DNAポリメラーゼ(Roche Molecular Biochemica
ls, Mannheim, Germany)、約0.5Uのピロホスファターゼ
(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)
および約９UのAmpliTaq(登録商標) FS DNAポリメラーゼ
(Perkin Elmer Corporation, Foster City, Californi
a, USA)(図3A)およびポリメラーゼ阻害剤で化学的に修
飾した９UのAmpliTaq(登録商標) FS DNAポリメラーゼ(P
erkin Elmer Corporation, Foster City, California,
USA)(図3A)を用いて行った。サイクルシークエンシング
反応はPrimus 96Cycler(MWG-biotech AG, Munich, Germ
any)を用いて、以下のサイクル条件下で行った。サイク
ル条件には、95℃で５分のインキュベートステップの
後、95℃で40秒（変性）、62℃で20秒（アニーリング）
および72℃で60秒（合成）を30サイクル行うことを適用
する。このステップは、ジデオキシヌクレオチドを効率
良く取り込むためのTabor Richardson突然変異を有する
DNAポリメラーゼ「１」(EP 0771 870)の解放ステップで
ある。A.L.F.ソフトウェアはIRD700標識プライマーにつ
いて、１組のプライマー対を用いた連続的DEXTAQ法の場
合432塩基と２の不明瞭部位を処理でき、一方の対は標
識されもう一方は標識されないような２組のプライマー
対を用いた連続的DEXTAQ法の場合は、432塩基と７の不
明瞭部位を処理できる。ヌクレオチドは、dNTP各1mMの
濃度で、ddNTP/dNTPが1/200の比率であるように用いら
れた。
マー mtDNA2（MWG-biotech AG Munich, Germanyによっ
て合成されたもの）を各６pmol用いて、200ngのヒトゲ
ノムDNA(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Ge
rmany)について非共役的、直接的、指数関数的増幅およ
びシークエンシング反応を行った。該プライマーは、ヒ
トミトコンドリア調節領域の469塩基対（プライマー長
はカウントしない）の領域を増幅する。その反応は、2.
5UのTaq DNAポリメラーゼ(Roche Molecular Biochemica
ls, Mannheim, Germany)、約0.5Uのピロホスファターゼ
(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)
および約９UのAmpliTaq(登録商標) FS DNAポリメラーゼ
(Perkin Elmer Corporation, Foster City, Californi
a, USA)(図3A)およびポリメラーゼ阻害剤で化学的に修
飾した９UのAmpliTaq(登録商標) FS DNAポリメラーゼ(P
erkin Elmer Corporation, Foster City, California,
USA)(図3A)を用いて行った。サイクルシークエンシング
反応はPrimus 96Cycler(MWG-biotech AG, Munich, Germ
any)を用いて、以下のサイクル条件下で行った。サイク
ル条件には、95℃で５分のインキュベートステップの
後、95℃で40秒（変性）、62℃で20秒（アニーリング）
および72℃で60秒（合成）を30サイクル行うことを適用
する。このステップは、ジデオキシヌクレオチドを効率
良く取り込むためのTabor Richardson突然変異を有する
DNAポリメラーゼ「１」(EP 0771 870)の解放ステップで
ある。A.L.F.ソフトウェアはIRD700標識プライマーにつ
いて、１組のプライマー対を用いた連続的DEXTAQ法の場
合432塩基と２の不明瞭部位を処理でき、一方の対は標
識されもう一方は標識されないような２組のプライマー
対を用いた連続的DEXTAQ法の場合は、432塩基と７の不
明瞭部位を処理できる。ヌクレオチドは、dNTP各1mMの
濃度で、ddNTP/dNTPが1/200の比率であるように用いら
れた。
【００９２】実施例３
IRD700標識プライマー p53 13011fw62およびIRD800標識
プライマー p53 13563rev62（MWG-biotech AG Munich,
Germanyによって合成されたもの）を各２pmol用いて、
またサイレントプライマー変異体を使用する場合には、
さらに15pmolの非標識プライマー（p53 12958fw57およ
びp53 13592rev57）を用いて、200ngのヒトゲノムDNA(R
oche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)に
ついて非共役的、直接的、指数関数的増幅およびシーク
エンシング反応を行った。該プライマーは580塩基対の
領域を増幅し(図５のA2およびB2部分)、第二の場合では
プライマーp53 13972fw60およびp53 14902rev59は510塩
基対の領域を増幅する(図５のA1およびB1部分)。この場
合p53遺伝子のプライマー長はカウントしていない。該
反応は、２UのTaq DNAポリメラーゼ(Roche Molecular B
iochemicals, Mannheim, Germany)、約0.5Uのピロホス
ファターゼ(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim,
Germany)および約20UのAmpliTaq(登録商標) FS DNAポ
リメラーゼ(Perkin Elmer Corporation, Foster City,
California, USA)(図3A)およびポリメラーゼ阻害剤で化
学的に修飾した20UのAmpliTaq(登録商標) FS DNAポリメ
ラーゼ(Perkin Elmer Corporation, Foster City, Cali
fornia, USA)を用いて行った。
プライマー p53 13563rev62（MWG-biotech AG Munich,
Germanyによって合成されたもの）を各２pmol用いて、
またサイレントプライマー変異体を使用する場合には、
さらに15pmolの非標識プライマー（p53 12958fw57およ
びp53 13592rev57）を用いて、200ngのヒトゲノムDNA(R
oche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)に
ついて非共役的、直接的、指数関数的増幅およびシーク
エンシング反応を行った。該プライマーは580塩基対の
領域を増幅し(図５のA2およびB2部分)、第二の場合では
プライマーp53 13972fw60およびp53 14902rev59は510塩
基対の領域を増幅する(図５のA1およびB1部分)。この場
合p53遺伝子のプライマー長はカウントしていない。該
反応は、２UのTaq DNAポリメラーゼ(Roche Molecular B
iochemicals, Mannheim, Germany)、約0.5Uのピロホス
ファターゼ(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim,
Germany)および約20UのAmpliTaq(登録商標) FS DNAポ
リメラーゼ(Perkin Elmer Corporation, Foster City,
California, USA)(図3A)およびポリメラーゼ阻害剤で化
学的に修飾した20UのAmpliTaq(登録商標) FS DNAポリメ
ラーゼ(Perkin Elmer Corporation, Foster City, Cali
fornia, USA)を用いて行った。
【００９３】
プライマー配列：
p53 13011fw62: 5'-CTTGTGCCCTGACTTTCAACTCT、標識
p53 13563rev62: 5'-CTTTGCACATCTCATGGGGTTAT、標識
p53 12958fw57: 5'-GCTTACACATGTTTGTTTCTTTG、非標識
p53 13592rev57: 5'-TTCAACTGTGCAATAGTTAAACCC、非標
識 p53 13972fw60: 5'-CTCATCTTGGGCCTGTGTTATC、標識 p53 14902rev59: 5'-TGGTATAAGTTGGTGTTCTGAAGTTAG、標
識 サイクルシークエンシング反応はPrimus 96 Cycler(MWG
-biotech AG, Munich,Germany)にて、以下のサイクル条
件下で行った。サイクル条件には、95℃で40秒（変
性）、62℃で20秒（アニーリング）、72℃で60秒（合
成）を15サイクル、次いで95℃で10分のインキュベーシ
ョンステップ、次いで95℃で40秒（変性）、60℃で20秒
（アニーリング）、72℃で60秒（合成）を30サイクル行
うことを適用する。このインキュベーションステップ
は、ジデオキシヌクレオチドを効率良く取り込むための
Tabor Richardson突然変異を有するDNAポリメラーゼ
「１」(EP 0771 870)の解放ステップである。読取り可
能な配列の解析は、fragment manager 1.1(Amersham Ph
armacia Biotech, Uppsala, Sweden)によって処理し、
図５に示す。ヌクレオチドは、dNTP各1mMの濃度で、ddN
TP/dNTPが1/200の比率であるように用いた。
識 p53 13972fw60: 5'-CTCATCTTGGGCCTGTGTTATC、標識 p53 14902rev59: 5'-TGGTATAAGTTGGTGTTCTGAAGTTAG、標
識 サイクルシークエンシング反応はPrimus 96 Cycler(MWG
-biotech AG, Munich,Germany)にて、以下のサイクル条
件下で行った。サイクル条件には、95℃で40秒（変
性）、62℃で20秒（アニーリング）、72℃で60秒（合
成）を15サイクル、次いで95℃で10分のインキュベーシ
ョンステップ、次いで95℃で40秒（変性）、60℃で20秒
（アニーリング）、72℃で60秒（合成）を30サイクル行
うことを適用する。このインキュベーションステップ
は、ジデオキシヌクレオチドを効率良く取り込むための
Tabor Richardson突然変異を有するDNAポリメラーゼ
「１」(EP 0771 870)の解放ステップである。読取り可
能な配列の解析は、fragment manager 1.1(Amersham Ph
armacia Biotech, Uppsala, Sweden)によって処理し、
図５に示す。ヌクレオチドは、dNTP各1mMの濃度で、ddN
TP/dNTPが1/200の比率であるように用いた。
【図１】２つの実験の概略図である。１つは少量のDNA
(A)を基質として用いたもの、１つはより多量の基質DNA
が存在するもの(B)である。増幅段階の後でのみ第２酵
素（図中、酵素「１」と示したもの）を活性化させるこ
とによって、後続の酵素に影響されずにこの増幅段階を
数サイクル行うことができる。したがって例えば少量の
DNA(A)から開始する場合はより多くのサイクルを、多量
のDNAから開始する場合はより少ないサイクル(B)で行う
ことができる。
(A)を基質として用いたもの、１つはより多量の基質DNA
が存在するもの(B)である。増幅段階の後でのみ第２酵
素（図中、酵素「１」と示したもの）を活性化させるこ
とによって、後続の酵素に影響されずにこの増幅段階を
数サイクル行うことができる。したがって例えば少量の
DNA(A)から開始する場合はより多くのサイクルを、多量
のDNAから開始する場合はより少ないサイクル(B)で行う
ことができる。
【図２】本発明により配列決定され得る非複合混合物、
中程度複合混合物および複合混合物の概略図である。
中程度複合混合物および複合混合物の概略図である。
【図３】DEXTAQ法(図3A)と連続的DEXTAQ法を比較する図
である。増幅とシークエンシングの工程の分離(図3B)に
より大量の鋳型分子が産生されることによって、末端短
縮されかつ標識化されたDNA断片がより早期に、つまりD
EXTAQ法では30サイクル目であるのに対して連続的DEXTA
Q法では20サイクル目に産生され、さらにそれゆえより
高精度のシークエンスラダーが得られ、その読み取り長
はより長くなり(378に対して400）、不明瞭部位が少な
くなる（11に対して2）ことが、明白に示される。
である。増幅とシークエンシングの工程の分離(図3B)に
より大量の鋳型分子が産生されることによって、末端短
縮されかつ標識化されたDNA断片がより早期に、つまりD
EXTAQ法では30サイクル目であるのに対して連続的DEXTA
Q法では20サイクル目に産生され、さらにそれゆえより
高精度のシークエンスラダーが得られ、その読み取り長
はより長くなり(378に対して400）、不明瞭部位が少な
くなる（11に対して2）ことが、明白に示される。
【図４】１組の標識プライマー対を用いて行った連続的
DEXTAQ反応と、第２の「サイレントな」プライマー対を
加えて行った第二の事例を比較する図である。読み取り
長の比較から、サイレントプライマー法では469塩基に
わたるDNA領域のうち461塩基を読むことができ、不明瞭
部位は1.5％であるが、一方１組のプライマー対を用い
た方法では29塩基少ないものを読むことができ、不明瞭
部位は0.4％であることが示される。
DEXTAQ反応と、第２の「サイレントな」プライマー対を
加えて行った第二の事例を比較する図である。読み取り
長の比較から、サイレントプライマー法では469塩基に
わたるDNA領域のうち461塩基を読むことができ、不明瞭
部位は1.5％であるが、一方１組のプライマー対を用い
た方法では29塩基少ないものを読むことができ、不明瞭
部位は0.4％であることが示される。
【図５】プライマーに対するシグナルのピークの比率を
比較する図である。 1)連続的DEXTAQ 2)連続的DEXTAQ(サイレントプライマー)
比較する図である。 1)連続的DEXTAQ 2)連続的DEXTAQ(サイレントプライマー)
【図６】サイレントプライマー法(A〜E)を示す図であ
る。
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 欧州特許出願公開854196（ＥＰ，Ａ
１)
欧州特許出願公開849364（ＥＰ，Ａ
１)
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ，1997年，Ｖｏｌ．25， Ｎ
ｏ．10，ｐ．2032−2034
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12Q 1/68
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (33)
- 【請求項１】 核酸分子、第１プライマー(i)、第２プ
ライマー(ii)、反応バッファー、デオキシヌクレオチド
またはその誘導体、および１種類以上のジデオキシヌク
レオチドを初めに含む熱サイクル反応において核酸分子
をシークエンシングする方法であって、該熱サイクル反
応が異なる酵素活性を有する２種類以上の熱安定性DNA
ポリメラーゼを含んでおり、該２種類以上の熱安定性 DN
A ポリメラーゼは、第１熱安定性 DNA ポリメラーゼ、およ
び該第１熱安定性 DNA ポリメラーゼと比較してジデオキ
シヌクレオチドを取り込む能力が低い第２熱安定性 DNA
ポリメラーゼを含んでおり、かつ該第１熱安定性DNAポ
リメラーゼは、初めにポリメラーゼ阻害剤または化学修
飾によって阻害されており、該熱サイクル反応において
該第２熱安定性DNAポリメラーゼよりも後のサイクルで
活性化されることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記熱サイクル反応がポリメラーゼ阻害
剤を含んでいて、前記第１熱安定性 DNA ポリメラーゼが
初めに該ポリメラーゼ阻害剤によって阻害されており、
かつその阻害されたDNAポリメラーゼが熱サイクル反応
において前記第２熱安定性DNAポリメラーゼよりも後の
サイクルで活性化され得るようにする、請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】 前記熱サイクル反応が化学修飾剤を含ん
でいて、前記第１熱安定性 DNA ポリメラーゼが該化学修
飾剤による化学修飾によって初めに阻害されており、か
つその阻害されたDNAポリメラーゼが熱サイクル反応に
おいて前記第２熱安定性DNAポリメラーゼよりも後のサ
イクルで活性化され得るようにする、請求項１記載の方
法。 - 【請求項４】 前記第１および第２熱安定性 DNA ポリメ
ラーゼが両方とも初めに阻害剤または化学修飾によって
阻害されており、後のサイクルで活性化され得、該第１
熱安定性 DNA ポリメラーゼは該第２熱安定性 DNA ポリメラ
ーゼよりも後のサイクルで活性化される、請求項１〜３
のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項５】 前記熱サイクル反応に用いられるバッフ
ァー中または条件下で、前記第１熱安定性DNAポリメラ
ーゼが、野生型Taq DNAポリメラーゼと比較してddNTPs
に対する識別力が低い、請求項１〜４のいずれか１項記
載の方法。 - 【請求項６】 前記第１熱安定性DNAポリメラーゼがDNA
Taqポリメラーゼ(-エキソ5'-3')(F667Y)またはAmplita
q FS TM もしくは Taquenase TM である、請求項１〜５のい
ずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】 前記第２熱安定性DNAポリメラーゼがTaq
ポリメラーゼまたはPlatinumTaq TM である、請求項１〜
６のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】 前記プライマーの比が１でない、請求項
１〜７のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】 前記方法を一段階で、単一の容器または
チューブにて行う、請求項１〜８のいずれか１項記載の
方法。 - 【請求項１０】 前記第１プライマーが標識されてい
る、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１１】 前記第１および第２プライマーが異な
って標識されている、請求項１〜１０のいずれか１項記
載の方法。 - 【請求項１２】 ddNTPsが標識されている、請求項１〜
９のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１３】 前記熱サイクル反応が熱安定性ピロホ
スファターゼをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか
１項記載の方法。 - 【請求項１４】 前記核酸分子がゲノムDNAである、請
求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１５】 前記核酸分子がRNAであり、かつ前記
第２熱安定性 DNA ポリメラーゼが逆転写酵素活性を示
す、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１６】 前記核酸分子がRNAであり、逆転写酵
素活性を示す追加の酵素が存在する、請求項１〜１３の
いずれか１項記載の方法。 - 【請求項１７】 初めに少なくとも１種類のさらなるプ
ライマー(iii)をさらに含んでなり、該プライマーは標
識されていないか、またはプライマー(i)および／もし
くは(ii)のいずれに結合した標識とも異なって標識され
ており、かつプライマー(i)および(ii)によって挟まれ
た領域またはその外側に位置する、請求項１〜１６のい
ずれか１項記載の方法。 - 【請求項１８】 初めに第４のプライマー(iv)をさらに
含んでなり、前記プライマー(iii)の３'末端および前記
プライマー(iv)の３'末端はその鋳型にアニールしたと
き互いに向き合い、該プライマー(iv)は標識されていな
いか、または前記プライマー(i)および／もしくは(ii)
のいずれに結合した標識とも異なって標識されており、
かつ前記プライマー(i)および(ii)によって挟まれた領
域またはその外側に位置するものである、請求項１７記
載の方法。 - 【請求項１９】 真核生物のゲノムDNAの直接シークエ
ンシングを目的とした、請求項１〜１８のいずれか１項
に記載の方法の使用。 - 【請求項２０】 ヒトの染色体DNAまたはミトコンドリ
アDNAの直接シークエンシングを目的とした、請求項１
〜１８のいずれか１項に記載の方法の使用。 - 【請求項２１】 ヒトRNAの直接シークエンシングを目
的とした、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法
の使用。 - 【請求項２２】 細菌コロニー由来の未精製プラスミド
DNAの直接シークエンシングを目的とした、請求項１〜
１８のいずれか１項に記載の方法の使用。 - 【請求項２３】 バクテリオファージ由来の未精製の一
本鎖または二本鎖DNAの直接シークエンシングを目的と
した、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法の使
用。 - 【請求項２４】 遺伝的突然変異または遺伝的多型の検
出を目的とした、請求項１〜１８のいずれか１項に記載
の方法の使用。 - 【請求項２５】 シークエンシングした核酸の起源を同
定することを目的とした、請求項１〜１８のいずれか１
項に記載の方法の使用。 - 【請求項２６】 サンプル中の外来性または感染性因子
の存在を検出することを目的とした、請求項１〜１８の
いずれか１項に記載の方法の使用。 - 【請求項２７】 ***、尿、血液または血液サンプルな
どの体液、毛髪、単一細胞またはその画分、組識または
その画分、細胞培養物、細菌、ウイルスまたはバクテリ
オファージに由来する核酸分子をシークエンシングする
ことを目的とした、請求項１〜１８のいずれか１項に記
載の方法の使用。 - 【請求項２８】 第１プライマー(i)、第２プライマー
(ii)、反応バッファー、デオキシヌクレオチドまたはそ
の誘導体、少なくとも１種類のジデオキシヌクレオチ
ド、初めにポリメラーゼ阻害剤または化学修飾によって
阻害されている第１熱安定性 DNA ポリメラーゼ、および
該第１熱安定性 DNA ポリメラーゼと比較してジデオキシ
ヌクレオチドを取り込む能力が低い第２熱安定性 DNA ポ
リメラーゼを含む核酸分子をシークエンシングするため
のキットであって、該第１熱安定性DNAポリメラーゼ
は、熱サイクル反応において該第２熱安定性DNAポリメ
ラーゼよりも後のサイクルで活性化されることを特徴と
する、上記キット。 - 【請求項２９】 前記第１および第２熱安定性 DNAポリ
メラーゼが両方とも初めにポリメラーゼ阻害剤または化
学修飾によって阻害されており、前記熱サイクルシーク
エンシング反応の後半のサイクルで活性化され得、該第
１熱安定性 DNA ポリメラーゼは該第２熱安定性 DNA ポリメ
ラーゼよりも後のサイクルで活性化される、請求項２８
記載のキット。 - 【請求項３０】 少なくとも１種類のさらなるプライマ
ー(iii)をさらに含んでなり、そのプライマーは標識さ
れていないかまたはプライマー(i)および／もしくは(i
i)のいずれに結合した標識とも異なって標識されてお
り、かつプライマー(i)および(ii)によって挟まれる領
域またはその外側に位置する、請求項２８または２９記
載のキット。 - 【請求項３１】 第4のプライマー(iv)をさらに含み、
前記プライマー(iii)の３'末端および該プライマー(iv)
の３'末端がその鋳型にアニールしたとき互いに向き合
い、プライマー(iv)は標識されていないかまたはプライ
マー(i)および／もしくは(ii)のいずれに結合した標識
とも異なって標識されており、かつプライマー(i)およ
び(ii)によって挟まれた領域またはその外側に位置す
る、請求項３０記載のキット。 - 【請求項３２】 前記第１熱安定性 DNAポリメラーゼは
抗体により修飾され、前記第２熱安定性 DNAポリメラー
ゼは化学的ポリメラーゼ阻害剤により化学修飾されてい
る、請求項２８〜３１のいずれか１項記載のキット。 - 【請求項３３】 前記化学的ポリメラーゼ阻害剤がジカ
ルボン酸無水物である、請求項３２記載のキット。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/339,103 US6828094B2 (en) | 1996-12-20 | 1999-06-24 | Method for the uncoupled, direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules with the addition of a second thermostable DNA polymerase and its application |
| US09/339103 | 1999-06-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001017192A JP2001017192A (ja) | 2001-01-23 |
| JP3535812B2 true JP3535812B2 (ja) | 2004-06-07 |
Family
ID=23327515
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000191940A Expired - Fee Related JP3535812B2 (ja) | 1999-06-24 | 2000-06-26 | Ｄｎａ分子合成を目的とした熱サイクル反応における１種類以上の酵素活性の連続的活性化 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6828094B2 (ja) |
| EP (1) | EP1091002A3 (ja) |
| JP (1) | JP3535812B2 (ja) |
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Non-Patent Citations (1)
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| Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７年，Ｖｏｌ．２５， Ｎｏ．１０，ｐ．２０３２−２０３４ |
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