JPH10215867A - Protein derivative, gene coding for the protein and production of the protein - Google Patents
Protein derivative, gene coding for the protein and production of the proteinInfo
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- JPH10215867A JPH10215867A JP2181197A JP2181197A JPH10215867A JP H10215867 A JPH10215867 A JP H10215867A JP 2181197 A JP2181197 A JP 2181197A JP 2181197 A JP2181197 A JP 2181197A JP H10215867 A JPH10215867 A JP H10215867A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、形態形成、神経分
化、細胞の癌化などに関与する新規なタンパク質、その
タンパク質をコードする遺伝子、そのタンパク質を製造
する方法、そのタンパク質の用途等に関する。[0001] The present invention relates to a novel protein involved in morphogenesis, neural differentiation, canceration of cells, etc., a gene encoding the protein, a method for producing the protein, and uses of the protein.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ヘッジホッグ（ｈｈ）はショウジョウバ
エの擬体節の形成に関与しているセグメントポラリティ
ー遺伝子の一つとして見いだされた。また、ソニックヘ
ッジホッグ（Ｓｈｈ）は脊椎動物におけるヘッジホッグ
遺伝子のホモログである。脊椎動物ではＳｈｈの他にさ
らにＤｈｈ、Ｉｈｈと呼ばれるヘッジホッグ遺伝子のホ
モログの存在が知られている。これら遺伝子はまとめて
ヘッジホッグと呼ばれている。また、以下ヘッジホッグ
から発現するタンパク質をヘッジホッグタンパク質とい
う。BACKGROUND OF THE INVENTION Hedgehog (hh) has been found as one of the segment polarity genes involved in the formation of the Drosophila pseudosomites. Sonic hedgehog (Shh) is a homolog of the hedgehog gene in vertebrates. In vertebrates, the presence of homologs of the hedgehog genes called Dhh and Ihh in addition to Shh is known. These genes are collectively called hedgehog. A protein expressed from hedgehog is hereinafter referred to as hedgehog protein.
【０００３】Ｓｈｈは脊椎動物では発生初期の脊索、Fl
oor plate 、発生後期の肢芽ＺＰＡ、脳、毛根、肺およ
び食道上皮に強く発現が認められる。すでにＳｈｈが運
動性ニューロンの生成、肢芽軟骨前後軸の形成に関与し
ていることは証明されているが、脳神経細胞の増殖分
化、毛の育成、肺などの分枝形成に関与していることも
示唆されている。さらに、Ｄｈｈは心臓に、Ｉｈｈは肝
臓と睾丸などの生殖組織に発現していることが示唆され
ている。[0003] In vertebrates, Shh is an early notochord, Fl
Strong expression is observed in oor plate, late limb bud ZPA, brain, hair root, lung and esophageal epithelium. Although Shh has already been shown to be involved in the generation of motor neurons and the formation of the anterior-posterior axis of limb bud cartilage, it is involved in the proliferation and differentiation of brain nerve cells, hair growth, and branch formation in lungs and the like. It has also been suggested. Furthermore, it has been suggested that Dhh is expressed in the heart and Ihh is expressed in reproductive tissues such as the liver and testes.
【０００４】このように、ヘッジホッグは様々な生理機
能に関与している一方、組織形成におけるヘッジホッグ
の機能およびその作用機序さらには受容体に関しては未
だ解明されていない。最近Ｓｈｈのターゲティングマウ
スが作製され、神経系形成、四肢形成異常が認められた
が詳細な結果はまだ報告されていない。今後Ｄｈｈおよ
びＩｈｈのターゲティングマウスが作製されるに従い、
その機能の全貌が明らかになると期待される。As described above, while hedgehog is involved in various physiological functions, the function of hedgehog in tissue formation, its action mechanism, and its receptor have not been elucidated yet. Recently, Shh targeting mice were produced, and nervous system formation and limb dysplasia were recognized, but detailed results have not been reported yet. As Dhh and Ihh targeting mice are created in the future,
It is expected that the whole picture of the function will be clarified.
【０００５】このようなヘッジホッグから発現するタン
パク質の機能、作用機序を明らかにするためには、ヘッ
ジホッグタンパク質を大量に精製し細胞生物学的、生化
学的解析などを行う必要があるとともに、各種動物実験
などを行うことにより生体内機能を明らかにしていく必
要がある。[0005] In order to clarify the function and mechanism of action of a protein expressed from such hedgehog, it is necessary to purify the hedgehog protein in large quantities and conduct cell biological and biochemical analyses. It is necessary to clarify in vivo functions by conducting various animal experiments.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】一方、有用タンパク質
は化学的合成法によっても作製されうるが、ヘッジホッ
グタンパク質などの高分子量タンパク質の化学的合成法
ではその合成ステップ数はきわめて多く、コスト的にも
不充分であり、現段階では工業化が困難な方法と考えら
れる。On the other hand, a useful protein can be produced by a chemical synthesis method. However, the number of synthesis steps is extremely large in the chemical synthesis method of a high molecular weight protein such as a hedgehog protein, resulting in cost reduction. Is also insufficient, and it is considered that industrialization is difficult at this stage.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者は、ヘッジホッ
グタンパク質に類するヘッジホッグ活性を有する新規な
タンパク質とそれをコードする遺伝子を見いだし、さら
にその遺伝子を用いた遺伝子組換え技術によるそのタン
パク質の生産系を見いだした。また、そのタンパク質に
対する抗体を作成するとともに、その抗体の用途につい
ても見いだした。本発明はこれらに基づく下記発明であ
る。Means for Solving the Problems The present inventors have found a novel protein having a hedgehog activity similar to a hedgehog protein and a gene encoding the same, and furthermore, have developed a gene encoding the protein by genetic recombination using the gene. I found a production system. In addition, we created antibodies against the protein and found uses for the antibodies. The present invention is the following invention based on these.
【０００８】配列番号１のアミノ酸配列で表されるタン
パク質。上記タンパク質をコードする遺伝子。上記遺伝
子を含有する組換えベクター。上記組換えベクターで宿
主細胞を形質転換してなる上記タンパク質を産生しうる
形質転換体。上記形質転換体を培養し、産生されたタン
パク質を取得することからなる上記タンパク質の製造方
法。上記タンパク質に対する抗体。上記抗体を用いる癌
の検出方法。[0008] A protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. A gene encoding the above protein. A recombinant vector containing the above gene. A transformant capable of producing the protein by transforming a host cell with the recombinant vector. A method for producing the above protein, which comprises culturing the above transformant and obtaining the produced protein. Antibodies to the above proteins. A method for detecting cancer using the above antibody.
【０００９】上記本発明のタンパク質を以下「新規ヘッ
ジホッグ系タンパク質」、それをコードする遺伝子を以
下「新規ヘッジホッグ系遺伝子」という。The protein of the present invention is hereinafter referred to as “new hedgehog protein”, and the gene encoding it is hereinafter referred to as “new hedgehog gene”.
【００１０】新規ヘッジホッグ系タンパク質は配列番号
１に示すように１７５個のアミノ酸残基からなる。この
新規ヘッジホッグ系タンパク質は前記ＳｈｈのＮ末端側
の部分配列に相当する。この新規ヘッジホッグ系タンパ
ク質は前記Ｓｈｈの部分配列を有するタンパク質ではあ
るが、Ｓｈｈと同様の活性を有している。例えば、本発
明者の実験によれば、この新規ヘッジホッグ系タンパク
質はニワトリ胚において重複肢を誘導する。また、この
新規ヘッジホッグ系タンパク質に対する抗体はこのタン
パク質は勿論Ｓｈｈにも特異的に結合する。本発明者は
この抗体を用いてある種の癌細胞はＳｈｈを特異的に発
現していることを確認した。The novel hedgehog protein consists of 175 amino acid residues as shown in SEQ ID NO: 1. This novel hedgehog protein corresponds to the partial sequence on the N-terminal side of Shh. This novel hedgehog protein is a protein having the partial sequence of Shh, but has the same activity as Shh. For example, according to experiments performed by the present inventors, this novel hedgehog protein induces overlapping limbs in chicken embryos. Further, an antibody against the novel hedgehog protein specifically binds not only to this protein but also to Shh. The present inventors have confirmed that certain types of cancer cells express Shh specifically using this antibody.
【００１１】本発明の新規ヘッジホッグ系タンパク質は
従来の公知のヘッジホッグタンパク質に比較して低分子
量であるので、その製造が容易である。特に遺伝子工学
的方法で製造する場合、そのタンパク質をコードする構
造遺伝子が短いのでより効率的に製造できる。Since the novel hedgehog protein of the present invention has a lower molecular weight than conventionally known hedgehog proteins, its production is easy. In particular, when the protein is produced by a genetic engineering method, the structural gene encoding the protein is short, so that the protein can be produced more efficiently.
【００１２】[0012]
【発明の実施の形態】新規ヘッジホッグ系遺伝子は新規
ヘッジホッグ系タンパク質をコードする遺伝子である。
新規ヘッジホッグ系遺伝子としては、配列番号２の塩基
配列で表される遺伝子が好ましい。しかし新規ヘッジホ
ッグ系遺伝子ははこれに限られず、配列番号２の塩基配
列以外の配列の新規ヘッジホッグ系タンパク質をコード
する遺伝子であってもよい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION A novel hedgehog gene is a gene encoding a novel hedgehog protein.
As the novel hedgehog gene, a gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is preferable. However, the novel hedgehog gene is not limited thereto, and may be a gene encoding a novel hedgehog protein having a sequence other than the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
【００１３】新規ヘッジホッグ系タンパク質は遺伝子組
換え技術により製造できる。そのためには新規ヘッジホ
ッグ系遺伝子を含有する組換えベクターを構築し、その
組換えベクターで宿主を形質転換した形質転換体が用い
られる。宿主としては特に限定されないが、望ましくは
培養方法が容易でかつ低コストで培養できる微生物を用
いる。この微生物としては例えば大腸菌や各種酵母類等
が挙げられる。The novel hedgehog protein can be produced by genetic recombination technology. For that purpose, a transformant obtained by constructing a recombinant vector containing a novel hedgehog gene and transforming a host with the recombinant vector is used. The host is not particularly limited, but preferably uses a microorganism which can be easily cultured at low cost. Examples of the microorganism include Escherichia coli and various yeasts.
【００１４】上記の宿主を用いて新規ヘッジホッグ系タ
ンパク質を産生させるために、まずその宿主に適応した
異種タンパク質生産用ベクターに新規ヘッジホッグ系遺
伝子を組み込んでその遺伝子が発現しうる組換えベクタ
ーを構築する。その宿主に適応した異種タンパク質生産
用ベクターとしては、特に限定されないが、宿主細胞内
で自律的に複製可能で遺伝子を組み込みうる挿入部位を
持ちさらにこの組み込んだ遺伝子を宿主細胞内で発現せ
しめることを可能とする領域を有する必要がある。その
ようなベクターとしてはその宿主用にすでに確立されて
いるベクターを使用できる。In order to produce a novel hedgehog protein using the above-mentioned host, first, a recombinant vector capable of expressing the gene by incorporating the novel hedgehog gene into a vector for heterologous protein production adapted to the host is used. To construct. The vector for producing a heterologous protein adapted to the host is not particularly limited, but it is necessary to have an insertion site capable of autonomously replicating in the host cell and incorporating the gene and expressing the inserted gene in the host cell. It is necessary to have an area that enables it. As such a vector, a vector already established for the host can be used.
【００１５】次いで、新規ヘッジホッグ系遺伝子を組み
込まれた組換えベクターを宿主に導入して形質転換体を
作製し、この形質転換体を培養してこの形質転換体菌体
や培養液などから単離して新規ヘッジホッグ系タンパク
質を得ることができる。組換えベクターの宿主細胞内へ
の導入方法は従来慣用的に用いられている方法により行
うことができ、コンピテント細胞法、プロトプラスト
法、リポソーム法等が挙げられる。Next, a recombinant vector incorporating the novel hedgehog gene is introduced into a host to prepare a transformant, and the transformant is cultured, and the transformant cells and the culture solution are used to prepare a transformant. A new hedgehog protein can be obtained by releasing. The method of introducing the recombinant vector into the host cell can be performed by a conventionally used method, and examples thereof include a competent cell method, a protoplast method, and a liposome method.
【００１６】高等生物由来のタンパク質を原核生物を宿
主として生産することは必ずしも容易ではない。また最
終製品への夾雑物としてエンドトキシンの混在の可能性
があり、好ましくない。また、動物細胞を宿主とした場
合には、その培養コストがかかり、種々のタンパク質の
生産に適用することは難しいこと、ヒトウイルスの混在
の可能性を否定する必要がある。It is not always easy to produce proteins derived from higher organisms using prokaryotes as hosts. In addition, endotoxin may be present as a contaminant in the final product, which is not preferable. In addition, when animal cells are used as hosts, culturing costs are high, it is difficult to apply them to the production of various proteins, and it is necessary to deny the possibility of mixing human viruses.
【００１７】そのため、好ましくはエンドトキシンを含
まず培養法も確立しており安価な培養法も確立した酵母
類が好ましいと考えられる。このうちでも、遺伝学的な
らびに分子生物学的に動物細胞に近い性質を持つとさ
れ、天然タンパク質に近い性質を持つタンパク質生産が
可能と考えられる***酵母（シゾサッカロマイセスポン
ベ：Schizosaccharomyces pombe ）が好ましい宿主と考
えられる。このシゾサッカロマイセスポンベの菌株とし
てはATCC38399(leu-32h-) やATCC38436(ura4-294h-) 等
としてＡＴＣＣに寄託されているものなどを使用でき
る。[0017] For this reason, it is considered that yeasts which are preferably established without endotoxin and have a well-established culture method, and which have also established an inexpensive culture method, are preferable. Among them, fission yeast (Schizosaccharomyces pombe), which is considered to have properties close to animal cells in terms of genetics and molecular biology and is considered to be capable of producing proteins having properties similar to natural proteins, is preferable. It is considered a host. As strains of Schizosaccharomyces pombe, those deposited with the ATCC as ATCC 38399 (leu-32h − ), ATCC 38436 (ura4-294h − ), and the like can be used.
【００１８】この***酵母を用いた遺伝子組換え技術に
ついては、例えば本発明者らの発明にかかる特開平５−
１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、Ｗ
Ｏ９６／２３８９０号明細書などに記載されている遺伝
子組換え技術を用いることが好ましい。***酵母を用い
るこの遺伝子組換え技術により、新規ヘッジホッグ系タ
ンパク質を効率的にかつ大量に製造できる。The gene recombination technique using the fission yeast is described, for example, in Japanese Unexamined Patent Publication No.
No. 15380, JP-A-7-163373, W
It is preferable to use the gene recombination technology described in O96 / 23890 and the like. By this gene recombination technique using fission yeast, a novel hedgehog-based protein can be produced efficiently and in large quantities.
【００１９】本発明の組換えベクターとしては、上記公
報等に記載されているマルチクローニングベクターｐＴ
Ｌ２Ｍのマルチクローニングサイトに新規ヘッジホッグ
系遺伝子を導入して構築された組換えベクターが好まし
い。本発明の形質転換体としては、この組換えベクター
を***酵母に導入することにより得らた形質転換体であ
ることが好ましい。組換えベクターの***酵母細胞内へ
の導入方法は前記のような従来慣用的に用いられている
方法により行いうるが、特に酢酸リチウム法（K.Okazak
i 等、Nucleic Acid Res.,18, 6485-6489(1990))等によ
って効率よく形質転換体を得ることができる。The recombinant vector of the present invention includes the multicloning vector pT described in the above publications and the like.
A recombinant vector constructed by introducing a novel hedgehog gene into the multicloning site of L2M is preferable. The transformant of the present invention is preferably a transformant obtained by introducing this recombinant vector into fission yeast. The method for introducing the recombinant vector into the fission yeast cells can be performed by a method conventionally used conventionally as described above. In particular, the lithium acetate method (K. Okazak
i, etc., Nucleic Acid Res., 18, 6485-6489 (1990)) and the like can efficiently obtain transformants.
【００２０】こうして得られた形質転換体を培養するこ
とにより、培養物中に新規ヘッジホッグ系タンパク質が
産生される。これをイオン交換カラム等を用いて精製す
ることにより目的とする新規ヘッジホッグ系タンパク質
を得ることができる。また、新規ヘッジホッグ系タンパ
ク質が菌体内に存在している場合は培養物から菌体を取
り出して破壊し、菌体破壊から目的タンパク質を分離精
製して単離できる。By culturing the thus obtained transformant, a novel hedgehog protein is produced in the culture. The desired hedgehog protein can be obtained by purifying it using an ion exchange column or the like. When the novel hedgehog protein is present in the cells, the cells can be taken out of the culture and destroyed, and the target protein can be separated and purified from the disrupted cells to isolate.
【００２１】形質転換体を培養するための培地は公知で
あり、ＹＰＤ培地、ＹＥＬ培地、ＭＢ培地などを使用で
きる。形質転換体の培養は、通常１６〜４２℃、好まし
くは２５〜３７℃で、８〜２００時間、好ましくは２４
〜７２時間行う。振盪培養、静置培養のいずれも可能で
あるが必要に応じて撹拌や通気を加えてもよい。A medium for culturing the transformant is known, and a YPD medium, a YEL medium, an MB medium and the like can be used. The culture of the transformant is carried out usually at 16 to 42 ° C, preferably 25 to 37 ° C, for 8 to 200 hours, preferably 24 to 42 hours.
Perform for ~ 72 hours. Both shaking culture and stationary culture are possible, but stirring or aeration may be added as necessary.
【００２２】培養物中に産生したタンパク質の単離・精
製法としては公知の方法（ゲル濾過やイオン交換カラ
ム、限外濾過、透析、塩析、アフィニティークロマトグ
ラフィーなど）を使用できる。単離精製したタンパク質
の確認法としては、公知のウエスタンブロッティング法
や活性測定、精製タンパク質のアミノ酸分析やアミノ末
端分析などで、その構造を明らかにできる。Known methods (gel filtration, ion exchange column, ultrafiltration, dialysis, salting out, affinity chromatography, etc.) can be used for the isolation and purification of the protein produced in the culture. As a method for confirming the isolated and purified protein, the structure can be clarified by a known Western blotting method, activity measurement, amino acid analysis or amino terminal analysis of the purified protein.
【００２３】本発明はまた上記の新規ヘッジホッグ系タ
ンパク質に対する抗体、およびその抗体を用いる癌の検
出方法である。新規ヘッジホッグ系タンパク質を抗原と
して周知〜公知の方法でそれに対する抗体を取得でき
る。抗体としてはポリクローナル抗体はいうまでもなく
モノクローナル抗体も取得できる。本発明者は新規ヘッ
ジホッグ系タンパク質は癌細胞、特に肺癌細胞に特異的
に発現していることを見いだした。したがって、この抗
体はこれら癌細胞を免疫学的に検出する方法に有用な抗
体である。The present invention is also an antibody against the above novel hedgehog protein, and a method for detecting cancer using the antibody. An antibody against the novel hedgehog protein can be obtained by a well-known method as an antigen. Monoclonal antibodies can be obtained as well as polyclonal antibodies. The present inventors have found that the novel hedgehog protein is specifically expressed in cancer cells, particularly lung cancer cells. Therefore, this antibody is an antibody useful for a method for immunologically detecting these cancer cells.
【００２４】[0024]
【実施例】以下の実施例により本発明をより具体的に説
明するが、これらの実施例によりその技術範囲が限定さ
れるものではない。また、実施中の各操作については特
に記載したもの以外は当該分野で常用されている方法
（J.Sambrook et al;Molecular Cloning, A laboratory
mannual.,2nd Ed., Cold Spring Harbor LaboratoryPr
ess, Cold Spring Harbor, New York, USA,1989) に従
った。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the technical scope is not limited by these examples. Except for those described in particular, each operation being performed is commonly used in the art (J. Sambrook et al; Molecular Cloning, A laboratory).
mannual., 2nd Ed., Cold Spring Harbor LaboratoryPr
ess, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989).
【００２５】［例１］ヘッジホッグ誘導体をコードする
遺伝子の作製 テンプレートとして妊娠１６日目のラット胎児の肺のｃ
ＤＮＡを用い、プライマーとして配列番号３、配列番号
４に示す２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法により
Ｓｈｈ遺伝子のシグナルペプチドを除く５’末端側の遺
伝子を増幅した。これにより配列番号２に示す遺伝子を
持つプラスミドｐＳＨＨを得た。Example 1 Preparation of Gene Encoding Hedgehog Derivative C in Rat Fetal Lung on Day 16 of Gestation as Template
Using the DNA and the two types of synthetic DNAs shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 as primers, the 5'-terminal gene excluding the signal peptide of the Shh gene was amplified by PCR. Thus, a plasmid pSHH having the gene shown in SEQ ID NO: 2 was obtained.
【００２６】［例２］配列番号２の遺伝子を持つ組換え
ベクターｐＴＬ２−ＳＨＨの作製 配列番号２に示す遺伝子を持つプラスミドｐＳＨＨ（例
１）をテンプレートとして、配列番号５および配列番号
６に示すオリゴＤＮＡプライマーとしたＰＣＲ法によっ
て新規ヘッジホッグタンパク質のＯＲＦ（オープンリー
ディングフレーム）を含む領域を増幅した。制限酵素Af
lIII（ニュー・イングランド・バイオラボ社販売）およ
びEcoRI （宝酒造社販売）による二重消化で末端を処理
し、アガロースゲル電気泳動によって、約５４０塩基対
に相当するバンドを切出し、ＤＮＡＰＲＥＰ（旭硝子社
販売）を用いたガラスビーズ法で精製し、挿入遺伝子断
片とした。Example 2 Preparation of Recombinant Vector pTL2-SHH Having the Gene of SEQ ID NO: 2 Using the plasmid pSHH (Example 1) having the gene of SEQ ID NO: 2 as a template, the oligos of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 A region containing the ORF (open reading frame) of the novel hedgehog protein was amplified by a PCR method using DNA primers. Restriction enzyme Af
The ends were treated by double digestion with lIII (sold by New England Biolabs) and EcoRI (sold by Takara Shuzo), a band corresponding to about 540 base pairs was cut out by agarose gel electrophoresis, and DNAPREP (sold by Asahi Glass) Was purified by a glass bead method using E.g. to obtain an inserted gene fragment.
【００２７】シゾサッカロミセス・ポンベ用発現ベクタ
ーｐＴＬ２Ｍ（特開平７−１６３３７３号公報記載）
を、制限酵素AflIII（ニュー・イングランド・バイオラ
ボ社販売）およびEcoRI による二重消化で末端を処理
し、アガロースゲル電気泳動によって、約５０００塩基
対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡＰＲＥＰを用いた
ガラスビーズ法で精製し、ベクター断片とした。Expression vector pTL2M for Schizosaccharomyces pombe (described in JP-A-7-163373)
Was digested with a restriction enzyme AflIII (available from New England Biolabs) and EcoRI, and a band corresponding to about 5000 base pairs was cut out by agarose gel electrophoresis, and a glass bead method using DNAPREP was performed. To obtain a vector fragment.
【００２８】これら２本の断片を、ＤＮＡライゲーショ
ンキット（宝酒造社販売）を用いて、ライゲーションし
た。大腸菌ＤＨ５株（東洋紡社販売）を形質転換した
後、制限酵素地図の作製によって、図１に示す正しく構
築された組換えベクターｐＴＬ２−ＳＨＨを保持する大
腸菌をスクリーニングした。These two fragments were ligated using a DNA ligation kit (Takara Shuzo). After transforming the Escherichia coli DH5 strain (available from Toyobo Co., Ltd.), Escherichia coli carrying the correctly constructed recombinant vector pTL2-SHH shown in FIG. 1 was screened by preparing a restriction enzyme map.
【００２９】アルカリ−ＳＤＳ法によってｐＴＬ２−Ｓ
ＨＨを大量調製し、新規ヘッジホッグタンパク質ＯＲＦ
に対応する部分の塩基配列決定を行った。その結果、塩
基配列は配列番号２に示す遺伝子の配列と完全に一致し
た。PTL2-S was prepared by the alkali-SDS method.
A large amount of HH is prepared and a novel hedgehog protein ORF
The nucleotide sequence of the portion corresponding to was determined. As a result, the nucleotide sequence completely matched the sequence of the gene shown in SEQ ID NO: 2.
【００３０】［例３］組換えベクターｐＴＬ２−ＳＨＨ
を持つ組換え酵母ＡＳＰ０８１株の作製 宿主となるシゾサッカロミセス・ポンベ（h-leu1-32
株、ATCC38399 に相当）を、ロイシン含有最少培地（Ｍ
Ｂ−Ｌｅｕ）で１ｍｌあたり１×１０7 細胞数の細胞濃
度になるまで生育させた。集菌・洗菌後、１ｍｌあたり
１×１０9 細胞数になるように１００ミリモル酢酸リチ
ウム（ｐＨ５）に懸濁した。３０℃で６０分間インキュ
ベートし、外来ＤＮＡによって形質転換可能な細胞（コ
ンピテント・セル）を得た。[Example 3] Recombinant vector pTL2-SHH
Of the recombinant yeast ASP081 strain having S. saccharomyces pombe (h-leu1-32
Strain, corresponding to ATCC 38399), in a minimal medium containing leucine (M
B-Leu) to a cell concentration of 1 × 10 7 cells / ml. After collecting and washing cells, the cells were suspended in 100 mM lithium acetate (pH 5) so as to have a cell count of 1 × 10 9 cells per ml. After incubation at 30 ° C. for 60 minutes, cells (competent cells) that can be transformed with foreign DNA were obtained.
【００３１】組換えベクターｐＴＬ２−ＳＨＨ（例３）
３μｇおよび制限酵素PstIで消化した導入ベクターpAL7
（特開平７−１６３３７３号公報記載）１μｇを、上記
細胞１００μｌに加え、さらに５０重量％ポリエチレン
グリコール４０００（フルカ社販売）２９０μｌを加え
てよく混合した。３０℃で６０分間、４３℃で１５分
間、室温で１０分間の順にインキュベートした。遠心分
離によりポリエチレングリコール４０００を除去し、1
ｍｌの１／２ＹＥＬ−Ｌｅｕに懸濁した。菌体濃度を１
／１０に希釈した後、３２℃で１時間インキュベートし
た。うち３００μｌを最少寒天培地ＭＭＡにスプレッド
した。３２℃で３日間インキュベートした。その結果約
１０００個の独立したコロニーが得られた。The recombinant vector pTL2-SHH (Example 3)
Transfer vector pAL7 digested with 3 μg and restriction enzyme PstI
1 μg (described in JP-A-7-163373) was added to 100 μl of the above cells, and 290 μl of 50% by weight polyethylene glycol 4000 (available from Fluka) was further added and mixed well. Incubation was performed at 30 ° C. for 60 minutes, 43 ° C. for 15 minutes, and room temperature for 10 minutes. The polyethylene glycol 4000 is removed by centrifugation, and 1
It was suspended in ml of 1 / 2YEL-Leu. Cell concentration of 1
After dilution to / 10, the mixture was incubated at 32 ° C. for 1 hour. 300 μl thereof was spread on a minimal agar medium MMA. Incubated at 32 ° C. for 3 days. As a result, about 1000 independent colonies were obtained.
【００３２】得られたコロニーを１ｍｌあたり１０μｇ
のネオマシシン（G418）を含むＹＥＬ液体培地（以下、
ＹＥＬ−１０という）に植菌し、３２℃で３日間培養し
た。その結果、ＯＤ600 ＝１０以上の生育が見られた。
さらにこの菌体から核酸画分を抽出し、配列番号７およ
び配列番号８に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰ
ＣＲ法によって新規ヘッジホッグタンパク質のＯＲＦを
含む領域を増幅した。その結果、約５４０塩基対に相当
するバンドの増幅が見られた。The obtained colonies were weighed at 10 μg / ml.
Liquid medium containing neomachicin (G418)
YEL-10) and cultured at 32 ° C. for 3 days. As a result, growth of OD 600 = 10 or more was observed.
Further, a nucleic acid fraction was extracted from the cells, and the oligo DNA represented by SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 was
The region containing the ORF of the novel hedgehog protein was amplified by the CR method. As a result, amplification of a band corresponding to about 540 base pairs was observed.
【００３３】以上の結果から、作製した組換え酵母が、
組換えベクターｐＴＬ２−ＳＨＨを持つ組換え酵母ＡＳ
Ｐ０８１株であることをを確認した。From the above results, the produced recombinant yeast was
Recombinant yeast AS having recombinant vector pTL2-SHH
It was confirmed that the strain was P081 strain.
【００３４】［例４］形質転換体の培養および細胞抽出
液の調製 酵母のグリセロールストックの２００μｌを５ｍｌのＹ
ＥＬ−１０にて、３２℃でＯＤ600 ＝１．０になるまで
振盪培養した。さらに２００μｌの酵母菌含有液を１０
０ｍｌのＹＥＬ−１０を用いて３２℃でＯＤ600 ＝１．
０まで振盪培養した。これをさらに１リットルスケール
で同様条件にて培養した。Example 4 Culture of Transformant and Preparation of Cell Extract 200 μl of yeast glycerol stock was added to 5 ml of Y
Shaking culture was performed with EL-10 at 32 ° C. until OD 600 = 1.0. Further, add 200 μl of the yeast-containing solution to 10
OD 600 = 1. At 32 ° C. with 0 ml YEL-10.
The cells were shake-cultured to 0. This was further cultured on a 1-liter scale under the same conditions.
【００３５】培養酵母は室温で３５００ｒｐｍ、１０分
遠心して集菌した。この酵母にバッファー（1% Triton
X100、50mM Tris-HCl,pH7.5 、150mM NaCl）を加えて懸
濁し、ソニケーションにより破砕後さらにガラスビーズ
によって破砕した。破砕液を１２０００ｒｐｍ、３０分
間の遠心によって得られた上澄み分画を酵母細胞抽出液
として得た。The cultured yeast was centrifuged at room temperature at 3500 rpm for 10 minutes to collect the cells. Buffer (1% Triton)
X100, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl) were added and suspended, and the mixture was crushed by sonication and further crushed by glass beads. The supernatant was obtained by centrifuging the crushed liquid at 12,000 rpm for 30 minutes to obtain a yeast cell extract.
【００３６】［例５］ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動による新規ヘッジホッグ系タンパク質の発現解
析 形質転換体およびヘッジホッグ遺伝子を含まないベクタ
ーのみで形質転換したコントロール酵母をそれぞれＲＩ
ＰＡバッファーに懸濁し、ソニケーションによって破
砕、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し
た。その結果、コントロール酵母の粗抽出液をチャージ
したバンドと比較して形質転換酵母の粗抽出液をチャー
ジしたバンドにはコントロール酵母の粗抽出液には含ま
れない新たなタンパク質バンドが分子量２５０００付近
に見いだされた。[Example 5] Expression analysis of a novel hedgehog protein by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis The transformant and a control yeast transformed only with a vector containing no hedgehog gene were subjected to RI.
The suspension was suspended in PA buffer, disrupted by sonication, and subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. As a result, compared to the band charged with the crude extract of the control yeast, the band charged with the crude extract of the transformed yeast contained a new protein band not included in the crude extract of the control yeast near the molecular weight of 25,000. Was found.
【００３７】［例６］ウェスタンブロッティングによる
新規ヘッジホッグ系タンパク質の確認 例５によって示された新たなタンパク質バンドが新規ヘ
ッジホッグ系タンパク質であることを確認する目的で、
公知のヘッジホッグタンパク質Ｓｈｈに対する特異抗体
を用いたウェスタンブロッティングを行った。その結
果、例５における分子量２５０００付近のタンパク質バ
ンドがこの抗体と特異的に反応した。Example 6 Confirmation of New Hedgehog Protein by Western Blotting In order to confirm that the new protein band shown in Example 5 is a novel hedgehog protein,
Western blotting was performed using a specific antibody against a known hedgehog protein Shh. As a result, the protein band having a molecular weight of about 25,000 in Example 5 specifically reacted with this antibody.
【００３８】［例７］新規ヘッジホッグ系タンパク質の
精製 例４にて得られた酵母細胞粗抽出液をバッファー（0.1%
TritonX100 、50mM Tris-HCl,pH7.5 ）で、ＤＥセルロ
ースカラムにチャージし素通り画分を集めた。この画分
をＣＭセルロースカラムにチャージし、バッファー（50
mM Tris-HCl,pH7.5 ）で洗浄後、さらに0.1M NaCl を含
む同バッファーで洗浄し、0.1M NaCl 〜0.2M NaCl の濃
度の塩を含んだ同バッファーのグラディエントにより溶
出した。この精製法により得られたタンパク質は電気泳
動解析によってほぼ単一のタンパク質と確認され、また
そのタンパク質は例６と同じウェスタンブロッティング
法により例６の抗体と特異的に反応するタンパク質であ
った。Example 7 Purification of Novel Hedgehog Protein The crude yeast cell extract obtained in Example 4 was buffered (0.1%
Triton X100, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5) was charged to a DE cellulose column, and a flow-through fraction was collected. This fraction was charged into a CM cellulose column, and the buffer (50
After washing with mM Tris-HCl (pH 7.5), the plate was further washed with the same buffer containing 0.1 M NaCl, and eluted with a gradient of the same buffer containing a salt having a concentration of 0.1 M NaCl to 0.2 M NaCl. The protein obtained by this purification method was confirmed to be almost a single protein by electrophoretic analysis, and the protein was a protein that specifically reacted with the antibody of Example 6 by the same Western blotting method as in Example 6.
【００３９】また、Ｓｈｈが特異的に有するニワトリ胚
に対する肢芽形成促進能に関して、Ｓｈｈの代わりにこ
の新規ヘッジホッグ系タンパク質について試験した。こ
の新規ヘッジホッグ系タンパク質をスポンジ小片にしみ
込ませ、このスポンジ小片をニワトリ胚の肢芽形成領域
に載置しニワトリ胚の発育を進めた。その結果、Ｓｈｈ
を用いた場合と同様に重複肢が誘導された。In addition, this novel hedgehog protein was tested in place of Shh for the ability of Shh to specifically promote limb bud formation on chicken embryos. The novel hedgehog protein was impregnated into small sponge pieces, and the small sponge pieces were placed in the limb bud formation region of the chicken embryo to promote the development of the chicken embryo. As a result, Shh
As in the case of using, overlapping limbs were induced.
【００４０】［例８］発現した新規ヘッジホッグ系タン
パク質を用いたポリクローナル抗体の作製 例７によって得られた精製新規ヘッジホッグ系タンパク
質を抗原として、従来方法に従って兎を免疫し、ポリク
ローナル抗体を得た。例６〜７に用いた抗体の代わりに
このポリクローナル抗体を用い例６〜７と同様に新規ヘ
ッジホッグ系タンパク質のウェスタンブロッティングに
よる確認を行ったところ、このポリクローナル抗体は新
規ヘッジホッグ系タンパク質と反応する特異的抗体であ
ることが確認された。Example 8 Preparation of Polyclonal Antibody Using Expressed New Hedgehog Protein The rabbit was immunized according to a conventional method using the purified novel hedgehog protein obtained in Example 7 as an antigen to obtain a polyclonal antibody. . When this polyclonal antibody was used in place of the antibody used in Examples 6 to 7 and a novel hedgehog protein was confirmed by Western blotting in the same manner as in Examples 6 to 7, the polyclonal antibody reacted with the novel hedgehog protein. The antibody was confirmed to be a specific antibody.
【００４１】［例９］抗体を用いた各種組織の免疫組織
化学によるヘッジホッグタンパク質の存在確認 例８で得られたポリクローナル抗体を用いて各種臓器、
各種癌細胞を免疫染色を行った。その結果、正常肺細胞
と肺癌細胞を免疫染色して比較したところ肺癌細胞が特
異的に染色されることがわかった。したがって、例８で
得られた抗体は肺癌細胞に特異的に結合する抗体である
ことが確認された。なお、肺癌細胞には特異的にＳｈｈ
が発現されていると考えられる。Example 9 Confirmation of the Presence of Hedgehog Protein by Immunohistochemistry of Various Tissues Using Antibodies Using the polyclonal antibody obtained in Example 8, various organs,
Various cancer cells were immunostained. As a result, when the normal lung cells and the lung cancer cells were immunostained and compared, it was found that the lung cancer cells were specifically stained. Therefore, it was confirmed that the antibody obtained in Example 8 was an antibody that specifically binds to lung cancer cells. In addition, lung cancer cells are specifically Shh
Is considered to be expressed.
【００４２】[0042]
【発明の効果】本発明では、各種生理機能に関与してい
る新規ヘッジホッグ系タンパク質を、高効率に生産する
ことに成功した。本発明により得られた形質転換体を用
いた大量培養により、目的とする新規ヘッジホッグ系タ
ンパク質を高い生産性が得られる。また、本タンパク質
を用いて作製した抗体を利用することにより、肺癌など
の各種疾患の予知、診断などを行うことを可能とする。According to the present invention, novel hedgehog proteins involved in various physiological functions have been successfully produced with high efficiency. High productivity of the desired novel hedgehog protein can be obtained by mass culture using the transformant obtained by the present invention. In addition, by using an antibody produced using the present protein, prediction and diagnosis of various diseases such as lung cancer can be performed.
【００４３】[0043]
［配列番号１］ (1) 配列の長さ：175 (2) 配列の型：ペプチド (3) 鎖の数：一本鎖 (4) トポロジー：直鎖状 (5) 配列の種類：ペプチド (6) 配列の特徴：ヘッジホッグ系タンパク質のアミノ酸
配列 (7) 配列： Met Cys Gly Pro Gly Arg Gly Phe Gly Lys Arg Gln His Pro Lys Lys 1 5 10 15 Leu Thr Pro Leu Ala Tyr Lys Gln Phe Ile Pro Asn Val Ala Glu Lys 20 25 30 Thr Leu Gly Ala Ser Gly Arg Tyr Glu Gly Lys Ile Thr Arg Asn Ser 35 40 45 Glu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Pro Asn Tyr Asn Pro Asp Ile Ile Phe 50 55 60 Lys Asp Glu Glu Asn Thr Gly Ala Asp Arg Leu Met Thr Gln Arg Cys 65 70 75 80 Lys Asp Lys Leu Asn Ala Leu Ala Ile Ser Val Met Asn Gln Thr Pro 85 90 95 Gly Val Lys Leu Arg Val Thr Glu Gly Thr Asp Glu Asp Gly His His 100 105 110 Ser Glu Glu Ser Leu His Tyr Glu Gly Arg Ala Val Asp Ile Thr Thr 115 120 125 Ser Asp Arg Asp Arg Ser Lys Tyr Gly Met Leu Ala Arg Leu Ala Val 130 135 140 Glu Ala Gly Phe Asp Thr Val Tyr Tyr Glu Ser Lys Ala His Ile His 145 150 155 160 Cys Ser Val Lys Ala Glu Asn Ser Val Ala Ala Lys Ser Asp Gly 165 170 １７５ [SEQ ID NO: 1] (1) Sequence length: 175 (2) Sequence type: peptide (3) Number of chains: single chain (4) Topology: linear (5) Sequence type: peptide (6 ) Sequence characteristics: amino acid sequence of hedgehog protein (7) Sequence: Met Cys Gly Pro Gly Arg Gly Phe Gly Lys Arg Gln His Pro Lys Lys 1 5 10 15 Leu Thr Pro Leu Ala Tyr Lys Gln Phe Ile Pro Asn Val Ala Glu Lys 20 25 30 Thr Leu Gly Ala Ser Gly Arg Tyr Glu Gly Lys Ile Thr Arg Asn Ser 35 40 45 Glu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Pro Asn Tyr Asn Pro Asp Ile Ile Phe 50 55 60 Lys Asp Glu Glu Asn Thr Gly Ala Asp Arg Leu Met Thr Gln Arg Cys 65 70 75 80 Lys Asp Lys Leu Asn Ala Leu Ala Ile Ser Val Met Asn Gln Thr Pro 85 90 95 Gly Val Lys Leu Arg Val Thr Glu Gly Thr Asp Glu Asp Gly His His 100 105 110 Ser Glu Glu Ser Leu His Tyr Glu Gly Arg Ala Val Asp Ile Thr Thr 115 120 125 Ser Asp Arg Asp Arg Ser Lys Tyr Gly Met Leu Ala Arg Leu Ala Val 130 135 140 Glu Ala Gly Phe Asp Thr Val Tyr Tyr Glu Ser Lys Ala His Ile His 145 150 155 160 Cys Ser Val Lys Ala Glu Asn Ser Val Ala Ala Lys Ser Asp Gly 165 170 175
【００４４】［配列番号２］ （１） 配列の長さ：530 (2) 配列の型：核酸 (3) 鎖の数：二本鎖 (4) トポロジー：直鎖状 (5) 配列の種類：ＤＮＡ (6) 配列の特徴：ヘッジホッグ系タンパク質をコードす
る遺伝子配列 (7) 配列： TG 2 ATG TGT GGG CCC GGC AGG GGG TTT GGA AAG AGG CGG CAC CCC AAA AAG 50 CTG ACC CCT TTA GCC TAC AAG CAG TTT ATC CCC AAC GTA GCC GAG AAG 98 ACC CTA GGG GCC AGC GGC CGA TAT GAA GGG AAG ATC ACA AGA AAC TCC 146 GAA CGA TTT AAG GAA CTC ACC CCC AAT TAC AAC CCC GAC ATC ATA TTT 194 AAG GAT GAG GAA AAC ACT GGA GCA GAC CGG CTG ATG ACT CAG AGG TGC 242 AAA GAC AAG TTA AAT GCC TTG GCC ATC TCC GTG ATG AAC CAG TGG CCA 290 GGA GTG AAG CTT CGA GTG ACT GAG GGC TGG GAT GAG GAC GGC CAT CAT 338 TCA GAG GAG TCT CTA CAC TAT GAG GGT CGA GCA GTG GAC ATC ACC ACG 386 TCT GAC AGG GAC CGC AGC AAG TAT GGC ATG CTG GCT CGC CTG GCT GTG 434 GAG GCA GGC TTC GAC TGG GTC TAC TAT GAA TCC AAA GCT CAC ATC CAC 482 TGC TCT GTG AAA GCA GAG AAC TCC GTG GCG GCC AAA TCC GAC GGC TGA 530 [SEQ ID NO: 2] (1) Sequence length: 530 (2) Sequence type: nucleic acid (3) Number of chains: double-stranded (4) Topology: linear (5) Sequence type: DNA (6) Sequence characteristics: Gene sequence encoding hedgehog protein (7) Sequence: TG 2 ATG TGT GGG CCC GGC AGG GGG TTT GGA AAG AGG CGG CAC CCC AAA AAG 50 CTG ACC CCT TTA GCC TAC AAG CAG TTT ATC CCC AAC GTA GCC GAG AAG 98 ACC CTA GGG GCC AGC GGC CGA TAT GAA GGG AAG ATC ACA AGA AAC TCC 146 GAA CGA TTT AAG GAA CTC ACC CCC AAT TAC AAC CCC GAC ATC ATA TTT 194 AAG GAT GAG GAA AAC ACT GGA GAC CGG CTG ATG ACT CAG AGG TGC 242 AAA GAC AAG TTA AAT GCC TTG GCC ATC TCC GTG ATG AAC CAG TGG CCA 290 GGA GTG AAG CTT CGA GTG ACT GAG GGC TGG GAT GAG GAC GGC CAT CAT 338 TCA GAG GAG TCT CTAC GAG GGT CGA GCA GTG GAC ATC ACC ACG 386 TCT GAC AGG GAC CGC AGC AAG TAT GGC ATG CTG GCT CGC CTG GCT GTG 434 GAG GCA GGC TTC GAC TGG GTC TAC TAT GAA TCC AAA GCT CAC ATC CAC 482 TGC TCT GTG AAA GAG AAC TCC GTG GCG GCC AAA TCC GAC GGC TGA 530
【００４５】［配列番号３］ (1) 配列の長さ：２６ (2) 配列の型：核酸 (3) 鎖の数：一本鎖 (4) トポロジー：直鎖状 (5) 配列の種類：ＤＮＡ (6) 配列の特徴：他の核酸 合成ＤＮＡ (7) 配列： TGATGTGTGG GCCCGGCAGG GGGTTT[SEQ ID NO: 3] (1) Sequence length: 26 (2) Sequence type: nucleic acid (3) Number of chains: single-stranded (4) Topology: linear (5) Sequence type: DNA (6) Sequence characteristics: Other nucleic acids Synthetic DNA (7) Sequence: TGATGTGTGG GCCCGGCAGG GGGTTT
【００４６】［配列番号４］ (1) 配列の長さ：２５ (2) 配列の型：核酸 (3) 鎖の数：一本鎖 (4) トポロジー：直鎖状 (5) 配列の種類：ＤＮＡ (6) 配列の特徴：他の核酸 合成ＤＮＡ (7) 配列： TCAGCCGTCG GATTTGGCCG CCACG[SEQ ID NO: 4] (1) Sequence length: 25 (2) Sequence type: nucleic acid (3) Number of chains: single-stranded (4) Topology: linear (5) Sequence type: DNA (6) Sequence characteristics: Other nucleic acids Synthetic DNA (7) Sequence: TCAGCCGTCG GATTTGGCCG CCACG
【００４７】［配列番号５］ (1) 配列の長さ：２８ (2) 配列の型：核酸 (3) 鎖の数：一本鎖 (4) トポロジー：直鎖状 (5) 配列の種類：ＤＮＡ (6) 配列の特徴：他の核酸 合成ＤＮＡ (7) 配列： TAAACATGTG TGGGCCCGGC AGGGGGTT[SEQ ID NO: 5] (1) Sequence length: 28 (2) Sequence type: nucleic acid (3) Number of strands: single strand (4) Topology: linear (5) Sequence type: DNA (6) Sequence characteristics: Other nucleic acids Synthetic DNA (7) Sequence: TAAACATGTG TGGGCCCGGC AGGGGGTT
【００４８】［配列番号６］ (1) 配列の長さ：２７ (2) 配列の型：核酸 (3) 鎖の数：一本鎖 (4) トポロジー：直鎖状 (5) 配列の種類：ＤＮＡ (6) 配列の特徴：他の核酸 合成ＤＮＡ (7) 配列： TTTGAATTCA GCCGTCGGAT TTGGCCG[SEQ ID NO: 6] (1) Sequence length: 27 (2) Sequence type: nucleic acid (3) Number of chains: single-stranded (4) Topology: linear (5) Sequence type: DNA (6) Sequence features: Other nucleic acids Synthetic DNA (7) Sequence: TTTGAATTCA GCCGTCGGAT TTGGCCG
【００４９】［配列番号７］ (1) 配列の長さ：２８ (2) 配列の型：核酸 (3) 鎖の数：一本鎖 (4) トポロジー：直鎖状 (5) 配列の種類：ＤＮＡ (6) 配列の特徴：他の核酸 合成ＤＮＡ (7) 配列： TAAACATGTG TGGGCCCGGC AGGGGGTT[SEQ ID NO: 7] (1) Sequence length: 28 (2) Sequence type: nucleic acid (3) Number of chains: single-stranded (4) Topology: linear (5) Sequence type: DNA (6) Sequence characteristics: Other nucleic acids Synthetic DNA (7) Sequence: TAAACATGTG TGGGCCCGGC AGGGGGTT
【００５０】［配列番号８］ (1) 配列の長さ：２７ (2) 配列の型：核酸 (3) 鎖の数：一本鎖 (4) トポロジー：直鎖状 (5) 配列の種類：ＤＮＡ (6) 配列の特徴：他の核酸 合成ＤＮＡ (7) 配列： TTTGAATTCA GCCGTCGGAT TTGGCCG[SEQ ID NO: 8] (1) Sequence length: 27 (2) Sequence type: nucleic acid (3) Number of chains: single-stranded (4) Topology: linear (5) Sequence type: DNA (6) Sequence features: Other nucleic acids Synthetic DNA (7) Sequence: TTTGAATTCA GCCGTCGGAT TTGGCCG
【図１】発現ベクターｐＴＬ２Ｓｈｈのベクター構成図FIG. 1 is a diagram showing the vector structure of an expression vector pTL2Shh.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ (72)発明者 浜 祐子 神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地 旭硝子株式会社中央研究所内──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI C12P 21/08 C12P 21/08 G01N 33/53 G01N 33/53 D (72) Inventor Yuko Hama Hazawa-machi, Kanagawa-ku, Yokohama-shi, Kanagawa 1150 Asahi Glass Co., Ltd.
Claims (8)
パク質。1. A protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
パク質をコードする遺伝子。2. A gene encoding a protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
記載の遺伝子。3. The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2
The described gene.
組換えベクター。4. A recombinant vector containing the gene according to claim 2 or 3.
を形質転換してなる請求項１記載のタンパク質を産生し
うる形質転換体。5. A transformant capable of producing the protein of claim 1 obtained by transforming a host cell with the recombinant vector of claim 4.
されたタンパク質を取得することからなる請求項１記載
のタンパク質の製造方法。6. A method for producing a protein according to claim 1, comprising culturing the transformant according to claim 5, and obtaining the produced protein.
法。8. A method for detecting cancer using the antibody according to claim 7.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2181197A JPH10215867A (en) | 1997-02-04 | 1997-02-04 | Protein derivative, gene coding for the protein and production of the protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2181197A JPH10215867A (en) | 1997-02-04 | 1997-02-04 | Protein derivative, gene coding for the protein and production of the protein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10215867A true JPH10215867A (en) | 1998-08-18 |
Family
ID=12065452
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2181197A Withdrawn JPH10215867A (en) | 1997-02-04 | 1997-02-04 | Protein derivative, gene coding for the protein and production of the protein |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10215867A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009179630A (en) * | 2000-10-13 | 2009-08-13 | Curis Inc | Hedgehog antagonist, method and use related thereto |
| EP2182060A1 (en) | 2005-08-03 | 2010-05-05 | Asahi Glass Company, Limited | Transformed yeast host cells and method of producing foreign protein |
| US8357368B2 (en) | 2000-10-13 | 2013-01-22 | Curis, Inc. | Methods of treating pancreatic or liver cancer using hedgehog antagonists |
-
1997
- 1997-02-04 JP JP2181197A patent/JPH10215867A/en not_active Withdrawn
Cited By (5)
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