JP4745583B2 - Partner, manufacture and use of PTB1 domain of FEB65 - Google Patents

Description

【０００１】
アルツハイマー病（ＡＤ）は多くの高齢者に発症する神経変性病である。この疾病の特徴は臨床面では認識機能低下であり、神経病理面では細胞内原線維沈着とアミロイド斑を形成するβアミロイド（Ａβ）ペプチドの細胞外沈着が脳に存在することである（Ｙａｎｋｎｅｒ，１９９６）。アミロイド斑は主にβアミロイドペプチドの前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク分解プロセスにより生成される４０〜４２アミノ酸のＡβペプチドから構成される（Ｇｏｌｄｅら，１９９２）。Ａβの細胞外沈着はＡＤに特異的である。これは家族性を含む全種ＡＤに共通する早期特徴である。家族性アルツハイマー病は比較的早期（４０〜６０歳）に発症し、ＡＰＰ遺伝子とプレセニリン−１（ＰＳ１）及びプレセニリン−２（ＰＳ２）遺伝子の突然変異に起因する。これらの３種の遺伝子の突然変異はＡＰＰのタンパク分解を変質させ、Ａβの過剰生産をもたらすと共に、病変と散発性ＡＤに似た症状の早期発症をもたらす。
【０００２】
膜ＡＰＰのインターナリゼーションはその細胞質領域に依存するＡＰＰのタンパク分解プロセスに必要な段階である（ＫｏｏとＳｑｕａｚｚｏ，１９９４）。即ち、タンパク質のこの領域が欠失するか又はＡＰＰの細胞質領域でＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ配列のレベルに点突然変異が存在すると、βアミロイドペプチドの生産は著しく低下する（Ｐｅｒｅｚら，１９９９）。ＡＰＰの細胞質領域と相互作用するタンパク質は数種のものが同定されており、従って、これらはＡＰＰのタンパク分解プロセスの調節とβアミロイドペプチドの生産に関与するのではないかと考えられる。ＡＰＰの細胞質領域のＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ配列と相互作用するタンパク質ファミリーとしてＦＥ６５及びＸ１１の２種が挙げられる（Ｂｏｒｇら，１９９６，１９９８；Ｂｒｅｓｓｌｅｒら，１９９６；Ｄｕｉｌｉｏら，１９９８；Ｆｉｏｒｅら，１９９５；Ｇｕｅｎｅｔｔｅら，１９９６；ＭｃＬｏｕｇｈｌｉｎとＭｉｌｌｅｒ，１９９６；Ｍｅｒｃｋｅｎら，１９９８；ＴａｎａｈａｓｈｉとＴａｂｉｒａ，１９９９ａ，１９９９ｂ及び１９９９ｃ）。ＦＥ６５タンパク質ファミリーはＦＥ６５、ＣＯＦＥ６５／ＦＥ６５Ｌ１及びＦＥ６５Ｌ２と呼ばれる３種から構成される。Ｘ１１タンパク質ファミリーもＸ１１α、Ｘ１１β及びＸ１１γと呼ばれる３種から構成される。これらの２種のタンパク質ファミリーはβアミロイドペプチドの生産の調節に相反する効果をもつ。本発明者らや他の研究室はＦＥ６５の過剰発現がＡβペプチドの生産増加を誘導し（Ｍｅｒｃｋｅｎら，１９９８；Ｓａｂｏら，１９９９）、Ｘ１１の過剰発現がＡβペプチドの生産低下を誘導する（Ｂｏｒｇら，１９９８；Ｓａｓｔｒｅら，１９９８）ことを明らかにした。
【０００３】
ＦＥ６５の一次構造を分析すると、このタンパク質はアダプターの役割を果たすように思われる。即ち、ＦＥ６５はタンパク質−タンパク質相互作用に関与する３つのタンパク質ドメインを含み、即ちアミノ末端部分の１個のＷＷドメインとカルボキシ末端部分の２つのＰＴＢドメイン（ＰｈｏｓｐｈｏＴｙｒｏｓｉｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ：ホスホチロシン結合ドメイン）ＰＴＢ１及びＰＴＢ２を含む。欠失を作製した処、ＰＴＢ２及びＦＥ６５ドメインはＡＰＰの細胞質領域との相互作用に関与していることが判明した。ＷＷドメインは少なくとも５種のタンパク質と相互作用し、そのうちの２種はＭｅｎａ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｅｎａｂｌｅｄ：イネーブルド哺乳動物ホモログ）タンパク質であると同定された（Ｅｒｍｅｋｏｖａら，１９９７）。更に、ＰＴＢ１及びＦＥ６５ドメインはＣＰ２／ＬＳＦ／ＬＢＰ１転写因子（Ｚａｍｂｒａｎｏら，１９９７）及びＬＲＰ（ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＬＤＬレセプター関連タンパク質）レセプター（Ｔｒｏｍｍｓｄｏｒｆｆら，１９９８）と相互作用する。しかし、ＦＥ６５の生理機能におけるこれらのタンパク質の役割はまだ分かっていない。
【０００４】
従って、βアミロイドペプチドの生産プロセスにおけるＦＥ６５タンパク質の厳密な役割の解明は、アルツハイマー病と神経変性病一般の理解と治療アプローチに重要な課題である。
【０００５】
本発明は生理的条件下でＦＥ６５タンパク質と相互作用するこのタンパク質のパートナーの同定を主眼とする。これらのパートナーはＦＥ６５の活性、特にβアミロイドペプチドの生産に関するその活性を調節することが可能な化合物の製造又は研究の新規薬理ターゲットである。これらのタンパク質、抗体、対応する核酸及び特異的プローブ又はプライマーは生体試料、特に神経組織試料でこれらのタンパク質を検出又は定量するためにも有用である。これらのタンパク質又は核酸はＦＥ６５及びＦＥ６５と本発明のポリペプチドの相互作用を調節することが可能な本発明の任意化合物の活性を調節するために治療アプローチでも有用である。
【０００６】
本発明は特に本発明者らがＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと相互作用する２種のヒトタンパク質（配列番号１及び２の配列に示す）を発見した結果である。即ち、本発明はｈｎＲＮＰＬタンパク質の中心領域がＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと相互作用することを立証する。本発明は更にＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと相互作用することが可能なＦＥＢＰ１（ＦＥ６５ Ｂｉｎｄｉｎｇ ＰＴＢ１：ＦＥ６５結合ＰＴＢ１ドメインタンパク質）と呼ぶ新規タンパク質の同定にも関する。
【０００７】
本発明はＦＥ６５タンパク質の機能の調節に関与する上記ｈｎＲＮＰＬ及びＦＥＢＰ１タンパク質の特定領域の同定と特性決定の結果でもある。これらのタンパク質とその機能に関与する領域の存在を解明することにより、特に薬剤として有用な新規化合物及び／又は組成物を製造し、このような化合物の工業的スクリーニング方法を開発することが可能になる。
【０００８】
従って、本発明の第１の目的はｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質（又はそのホモログ）とＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用を少なくとも部分的に調節するか又はこの相互作用のレベルに作用することが可能な化合物に関する。
【０００９】
本発明の化合物の作用は種々の側面で発現することができる。本発明の化合物はｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質（又はそのホモログ）とＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用を少なくとも部分的に抑制、阻害又は刺激することができる。例えば二重ハイブリッド型系や２種のポリペプチド間の相互作用の任意無細胞検出系でこの相互作用をｉｎ ｖｉｔｒｏ調節することが可能な化合物が好ましい。本発明の化合物はこの相互作用を少なくとも部分的に調節し、好ましくは化合物の不在下の対照に比較してこの相互作用を少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％増加又は阻害することが可能な化合物が好ましい。
【００１０】
本発明の趣旨では、ｈｎＲＮＰＬ及びＦＥＢＰ１タンパク質とはこれらのタンパク質自体とその全ホモログ形を意味する。ホモログ形とは該当タンパク質に等価であり、種々の細胞起源、特にヒト又は他の生物起源の細胞に由来し、同一型の活性をもつ全タンパク質を意味する。このようなホモログは指定タンパク質の天然変異体、特に多形又はスプライシング変異体も含む。ホモログタンパク質（又はポリペプチド）は例えばコーディング核酸間のハイブリダイゼーション実験により取得することができる。本発明の趣旨では、請求するようなｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質に類似の生理的機能を生じるためにはこの種の配列が有意一致度百分率を示せば十分である。
【００１１】
特定実施態様によると、本発明の化合物はｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用ドメインのレベルに結合することができる。
【００１２】
本発明の化合物は種々の型及び起源のものでよい。特に、ペプチド、核酸（即ち塩基鎖、特にＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む）、脂質、糖、抗体等の型の化合物とすることができ、一般には全有機又は無機分子とすることができる。
【００１３】
第１の変形例によると、本発明の化合物はペプチド種である。ペプチドなる用語は例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体（又は抗体フラグメントもしくは誘導体）等のアミノ酸鎖を含む任意分子を意味し、場合により修飾されていてもよいし、別の化合物又は化学基と結合していてもよい。この点で、「ペプチド」なる用語は特に最大５０アミノ酸、より好ましくは最大４０アミノ酸の鎖を含む分子を意味する。ポリペプチドは５０〜５００アミノ酸又はそれ以上を含むものが好ましい。タンパク質は天然分子に対応するポリペプチドである。
【００１４】
第１の好適実施態様によると、本発明のペプチド化合物はｈｎＲＮＰＬタンパク質及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質及び／又はその誘導体のペプチド配列の一部を含む。夫々配列番号７及び配列番号９の配列を含むことを特徴とするｈｎＲＮＰＬタンパク質及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質の配列の一部がより好ましい。
【００１５】
本発明のペプチド化合物はｈｎＲＮＰＬタンパク質及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用部位の全部又は機能的部分に対応する配列をもつ領域を含む化合物がより好ましい。このような化合物、特にペプチドはｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１の競合体を構成し、ｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質（又はそのホモログ形）とＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用を少なくとも部分的に調節することができる。配列番号７の配列の残基１〜３４９又は配列番号９の配列の残基１〜３３７を含むペプチド化合物がより好ましい。実施例に示すように、これらの配列はｈｎＲＮＰＬタンパク質の中心領域（残基１１６〜４６４）及びＦＥＢＰ１タンパク質の少なくとも一部を含み、ＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと特異的に相互作用することができるが、ＦＥ６５のＰＴＢ２ドメインとは相互作用することができない。
【００１６】
特定実施態様において、化合物はＡｓｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ配列（残基５５〜５８）を含む少なくとも５アミノ酸、好ましくは少なくとも９アミノ酸からなる配列番号７の配列のフラグメントである。
【００１７】
別の好適実施態様によると、本発明のペプチド化合物は非機能的になったエフェクター領域をもつｈｎＲＮＰＬタンパク質又はＦＥＢＰ１タンパク質（及び／又はホモログ形）から誘導される化合物である。このようなペプチド化合物はｈｎＲＮＰＬタンパク質及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質及び／又はホモログ形の少なくともこのエフェクター領域の欠失、突然変異又は破壊により取得することができる。このような変異は例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、付加エレメントもしくは合成配列の導入、又は元のエレメントの欠失もしくは置換により実施することができる。従って、これらのポリペプチドはＦＥ６５タンパク質に結合することができるが、少なくとも天然タンパク質と同程度の機能シグナルを誘導することはできない。
【００１８】
特定実施態様によると、本発明の化合物は配列番号７又は配列番号９の配列を含み、少なくともエフェクター領域に突然変異をもつポリペプチドである。
【００１９】
特定実施態様によると、本発明の化合物は配列番号７又は配列番号９の配列を含み、少なくともエフェクター領域に欠失をもつポリペプチドである。
【００２０】
特定実施態様によると、本発明の化合物は配列番号７又は配列番号９の配列を含み、少なくともエフェクター領域に挿入をもつポリペプチドである。
【００２１】
本発明の別の目的はＦＥＢＰ１タンパク質又はその任意フラグメントもしくは誘導体である。特に、配列番号９の配列又はその誘導体もしくはフラグメントを含む任意ポリペプチドであり、配列番号９の配列又はその誘導体の少なくとも１０個の連続残基を含む任意ポリペプチドがより好ましく、少なくともＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインとの結合に関与する残基を含むものが更に好ましい。
【００２２】
本発明の別の目的は配列番号７の配列を含むポリペプチドである。
【００２３】
誘導体なる用語は特に本発明の趣旨では１カ所以上の遺伝及び／又は化学修飾により得られる遺伝コードの縮重により該当配列と異なる任意配列と、配列番号６又は８の核酸配列又はそのフラグメントとハイブリダイズする配列によりコードされ、ｈｎＲＮＰＬタンパク質及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質及び／又はそのホモログとＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用のレベルに作用することが可能な任意ペプチドを意味する。遺伝及び／又は化学修飾とは、１個以上の残基の任意突然変異、置換、欠失、付加及び／又は修飾を意味する。誘導体なる用語は該当配列に相同であり、他の細胞起源、特にヒト又は他の生物起源の細胞に由来し、同一型の活性をもつ配列も含む。このような相同配列はハイブリダイゼーション実験により取得することができる。ハイブリダイゼーションは核酸ライブラリーを使用し、種々のハイブリダイゼーション条件下で天然配列又はそのフラグメントをプローブとして使用することにより実施できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，一般分子生物学技術参照）。更に、「フラグメント」又は「部分」なる用語は少なくとも５個の連続残基、好ましくは少なくとも９個の連続残基、より好ましくは少なくとも１５個の連続残基を含む該当分子の任意部分を意味する。
【００２４】
このような誘導体又はフラグメントは種々の目的で作製することができ、例えば、特にその治療効果を増したり、その副作用を減らしたり、新規薬物動態学的及び／又は生物学的性質を付与する目的で作製することができる。
【００２５】
上記のような誘導体又はフラグメントを作製すると、ｈｎＲＮＰＬタンパク質及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質及び／又はそのホモログ形とＦＥ６５のＰＴＢ１ドメイン結合部位との結合に及ぼすその生物活性を解明することができる。当然のことながら、このためには実験の項に説明するような当業者に公知の任意技術を利用することができる（二重ハイブリッド、カラム結合、無細胞系、細胞系、等）。
【００２６】
一般に、本発明の化合物はｈｎＲＮＰＬ又はＦＥＢＰ１タンパク質又は上記ペプチド化合物の任意フラグメントとすることができる。このようなフラグメントは種々の方法で作製することができる。特に、当業者に公知のペプチド合成機を使用することにより本明細書に記載する配列に基づいて化学的に合成することができる。所望ペプチドをコードするヌクレオチド配列を細胞宿主で発現させることにより遺伝子工学的に合成することもできる。この場合には、ヌクレオチド配列はオリゴヌクレオチド合成機を使用することにより、本明細書に記載するペプチド配列と遺伝コードに基づいて化学的に作製することができる。ヌクレオチド配列は本明細書に記載する配列から当業者に公知の方法で酵素切断、ライゲーション、クローニング等により作製してもよいし、これらの配列から作製したプローブでＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより作製してもよい。
【００２７】
本発明の他のペプチドはそれらの細胞ターゲットとの相互作用に関して上記ペプチドと競合することが可能なペプチドである。このようなペプチドは特に該当ペプチドの配列に基づいて合成することができ、上記ペプチドと競合できるか否かを調べることができる。
【００２８】
別の特定実施態様によると、本発明の化合物は抗体又は抗体フラグメントもしくは誘導体である。即ち、本発明の別の目的は上記のようなペプチド化合物又はタンパク質に対するポリクローナル又はモノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。このような抗体は当業者に公知の方法により作製することができる。特に、これらの抗体は動物を本発明のペプチドに対して免疫し、採血して抗体を分離することにより作製することができる。これらの抗体は当業者に公知の方法によりハイブリドーマ作製により作製することもできる。
【００２９】
本発明の抗体又は抗体フラグメントは上記ペプチド化合物又はｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用を少なくとも部分的に調節することができ、ＦＥ６５の活性を調節するために使用できることがより好ましい。
【００３０】
更に、これらの抗体は生体試料における本発明のペプチドの発現を検出及び／又は定量するため、従って、その活性化状態について調べるためにも使用することができる。
【００３１】
抗体フラグメント又は誘導体は例えばＦａｂ、Ｆａｂ’２、１本鎖抗体（ＳｃＦｖ）等である。特に元の抗体の抗原特異性を維持する任意フラグメント又は誘導体が挙げられる。
【００３２】
本発明の抗体は夫々配列番号７又は９の配列を含むｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質、特にＦＥ６５との相互作用に関与するこれらのタンパク質の領域と結合できることがより好ましい。これらの抗体（又はフラグメントもしくは誘導体）は配列番号７の残基１〜３４９又は配列番号６の残基１〜３３７に含まれる配列中に存在するエピトープと結合できることがより好ましい。
【００３３】
本発明は上記相互作用を抑制することが可能な非ペプチド又は非排他的ペプチド化合物と、薬剤としてのその使用にも関する。即ち、特にペプチドの活性モチーフを非ペプチド又は非排他的ペプチド種構造と組合せることにより、本明細書に記載する活性タンパク質モチーフからｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質の活性の調節分子として医薬用途に適合可能な非排他的ペプチド分子を作製することができる。
【００３４】
本発明は本発明のペプチド化合物をコードする任意核酸にも関する。特に配列番号６及び配列番号８に示す配列又はその誘導体の全部又は一部を含む配列が挙げられる。誘導配列とは、本発明の趣旨では配列番号６及び配列番号８に示す配列又は本発明のペプチドをコードするそのフラグメントとハイブリダイズする任意配列と、遺伝コードの縮重によりこれらの配列から得られる配列を意味する。本発明の種々のヌクレオチド配列は人工起源でもよいし、そうでなくてもよい。ゲノム配列、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ハイブリッド配列又は合成もしくは半合成配列が挙げられる。これらの配列はＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー）のスクリーニング、化学的合成、ライブラリースクリーニングにより得られた配列の化学又は酵素修飾を含む混合法により得ることができる。上記ハイブリダイゼーションは高ストリンジェント条件下、特にクエン酸三ナトリウム−２Ｈ_２Ｏ ８．８２３ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１７．５３２ｇ／ｌ及びドデシル硫酸ナトリウム１％を含む溶液中で５０℃の温度で１時間の条件下、又はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，９．５２〜９．５５頁）に記載の条件下で実施することが好ましい。
【００３５】
本発明の趣旨で特定核酸は配列番号９の配列を含むポリペプチド又はそのフラグメントもしくは誘導体、特にヒトＦＥＢＰ１タンパク質をコードする。配列番号８の核酸配列を含む核酸が有利である。
【００３６】
本発明の核酸は本発明のペプチド化合物の製造に使用することができる。従って、本願はペプチド化合物の製造方法として、本発明の核酸を含む細胞を前記核酸の発現条件下で培養し、生産されたペプチド化合物を回収する方法にも関する。この場合には、一般に前記ポリペプチドをコードする部分を、細胞宿主でのその発現を可能にするシグナルの制御下におく。これらのシグナル（プロモーター、ターミネーター、分泌「リーダー」配列等）の選択は使用する細胞宿主により異なる。更に、本発明の核酸はベクターの一部でもよく、ベクターは自律複製型でも組込み型でもよい。特に、自律複製ベクターは選択した宿主で自律複製配列を使用することにより作製することができる。組込みベクターについては、例えば宿主のゲノムの所定領域に相同であり、相同組換えによりベクターの組込みが可能な配列を使用することにより作製することができる。ベクターとしてはプラスミド、エピソーム、染色体、ウイルス等の型のベクターが挙げられる。
【００３７】
組換えによる本発明のペプチドの製造に使用可能な細胞宿主は真核宿主でも原核宿主でもよい。適切な真核宿主としては、動物細胞、酵母、又は真菌類を挙げることができる。特に、酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ又はＨａｎｓｅｎｕｌａ属の酵母を挙げることができる。動物細胞としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７、ＰＣ１２等の細胞を挙げることができる。真菌類としては、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種又はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種を挙げることができる。原核宿主としては大腸菌、バチラス又はストレプトミセス等の細菌を使用することが好ましい。
【００３８】
本発明の核酸は薬剤又は診断薬として使用可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド又は遺伝子アンチセンスの作製にも使用することができる。アンチセンス配列は所定遺伝子のコーディング鎖に相補的な小寸法のオリゴヌクレオチドであり、従って、転写ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしてそのタンパク質翻訳を阻害することができる。従って、本発明はｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用を少なくとも部分的に阻害することが可能なアンチセンス配列にも関する。このような配列は上記ヌクレオチド配列の全部又は一部から構成することができる。このような配列は一般にＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと相互作用するペプチドをコードする配列に相補的な配列又は配列フラグメントである。このようなオリゴヌクレオチドは分画又は化学的合成等により取得することができる。
【００３９】
核酸配列はｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用を調節することが可能なアンチセンス配列又はペプチドを転写及びｉｎ ｖｉｖｏ発現させるために治療範囲内で使用することもできる。この点では、ウイルス又は非ウイルスベクターに配列を組込むと、ｉｎ ｖｉｖｏ投与することができる（Ｋａｈｎ，Ａ．ら，１９９１）。本発明のウイルスベクターとしては、特にアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はヘルペスウイルス型のベクターを挙げることができる。本願は本発明の（ポリ）ペプチドをコードする核酸を含む組換え欠損ウイルスにも関する。
【００４０】
本発明によると、上記核酸又はその相補鎖とハイブリダイズすることが可能な合成又は非合成ヌクレオチドプローブを作製することもできる。このようなプローブはｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質の発現もしくは過剰発現の検出、又は遺伝異常（スプライシング異常、多形、点突然変異等）の検出用診断ツールとしてｉｎ ｖｉｔｒｏ使用することができる。これらのプローブは他の細胞起源、好ましくはヒト起源細胞から上記のようなペプチドをコードする相同核酸配列を検出及び単離するためにも使用することができる。本発明のプローブは一般に少なくとも１０塩基を含み、例えば上記配列又はその相補鎖の１種の全体までを含むことができる。これらのプローブはその使用前に標識することが好ましい。このためには、当業者に公知の種々の方法（放射能、蛍光、酵素、化学標識等）を利用することができる。
【００４１】
本発明は少なくとも１種の上記のような化合物、特にペプチド化合物を有効成分として含む任意医薬組成物にも関する。
【００４２】
本発明は特に少なくとも１種の上記のような抗体及び／又は抗体フラグメントを有効成分として含む任意医薬組成物と、少なくとも１種の上記のような核酸又はベクターを有効成分として含む任意医薬組成物に関する。
【００４３】
本発明はｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５タンパク質の相互作用を増減することが可能な化学分子を有効成分として含む任意医薬組成物にも関する。
【００４４】
更に、本発明は上記ペプチド、抗体、化学分子及びヌクレオチド配列を併有するか又は他の有効成分と併有する医薬組成物にも関する。
【００４５】
本発明の医薬組成物はｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質の活性を調節し、従って、ＡＰＰの機能、その細胞内輸送、その成熟及びβアミロイドペプチドへのその変換を調節するために使用することができる。特に、これらの医薬組成物はｈｎＲＮＰＬ又はＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５タンパク質の相互作用を調節するために使用される。例えばアルツハイマー病等の神経変性病を治療するための医薬組成物がより好ましい。本発明の組成物（又は化合物）は特にＦＥ６５タンパク質とｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質の相互作用を少なくとも部分的に阻害するために使用される。
【００４６】
本発明はＦＥ６５タンパク質の活性を調節するため又は神経変性病の型別のための上記分子の使用にも関する。特に、本発明はＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの活性を少なくとも部分的に調節するためのこれらの分子の使用に関する。
【００４７】
本発明はＦＥ６５タンパク質の機能に関して活性な分子のスクリーニング又は特性決定方法として、配列番号７の配列又は配列番号９の配列又はそのフラグメント（又は誘導体）と結合することが可能な分子を選択する方法にも関する。本方法は、配列番号７の配列又は配列番号９の配列又はそのフラグメント（又は誘導体）を含むポリペプチドと試験分子をｉｎ ｖｉｔｒｏ接触させ、配列番号７の配列（特に残基１〜３４９に含まれる領域）又は配列番号９の配列（特に残基１〜３３７に含まれる領域）と結合することが可能な分子を選択すると有利である。試験分子は種々のものとすることができる（ペプチド、核酸、脂質、糖等、又はこれらの分子の混合物、例えば組合わせライブラリー等）。上述のように、こうして同定された分子はＦＥ６５タンパク質の活性を調節するために使用することができ、神経変性病の治療の潜在的治療剤となる。
【００４８】
本発明の他の利点は以下の実施例から理解されよう。これらの実施例は例示であり、発明を制限するものではない。
【００４９】
使用した材料と方法
１）使用した酵母株：
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ属Ｌ４０株（Ｍａｔａ，ｈｉｓ３Ｄ２００，ｔｒｐ１−９０１，ｌｅｕ２−３，１１２，ａｄｅ２，ＬＹＳ２：：（ｌｅｘＡｏｐ）４−ＨＩＳ３，ＵＲＡ３：：（ｌｅｘＡｏｐ）８−ＬａｃＺ，ＧＡＬ４，ＧＡＬ８０）を二重ハイブリッド系により脳融合ライブラリーのスクリーニングツールとして使用した。この株はタンパク質パートナーの一方をＬｅｘＡタンパク質に融合するとタンパク質−タンパク質相互作用を検出することができる（Ｖｏｊｔｅｋら，１９９３）。この株を以下の培地、即ち、
−酵母窒素ベース（無アミノ酸）（６．７ｇ／ｌ）（Ｄｉｆｃｏ）、
−グルコース（２０ｇ／ｌ）（Ｍｅｒｃｋ）
からなる最少ＮＹＢ培地で培養した。
【００５０】
この培地は寒天（Ｄｉｆｃｏ）２０ｇ／ｌを加えて固体にすることができる。
【００５１】
この培地で栄養要求性酵母を増殖させるためには、酵母が依存するアミノ酸又は窒素塩基５０ｍｇ／ｍｌを加える必要がある。細菌汚染を避けるためにアンピシリン１００μｇ／ｍｌを加える。
【００５２】
２）使用した細菌株：
遺伝子型ｓｕｐＥ，ｈｓｄΔ５，ｔｈｉ，Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ），Ｆ’［ｔｒａ Ｄ３６ Ａ^＋Ｂ^＋ｌａｃＩ^ｑｌａｃＺΔＭ１５］の大腸菌ＴＧ１株をプラスミド構築、増幅及びプラスミド単離に使用した。この株を以下の培地、即ち−ＮａＣｌ（５ｇ／ｌ）（Ｓｉｇｍａ）、
−バクトトリプトン（１０ｇ／ｌ）（Ｄｉｆｃｏ）、
−酵母抽出物（５ｇ／ｌ）（Ｄｉｆｃｏ）
からなるＬＢ培地で培養した。
【００５３】
この培地は寒天（Ｄｉｆｃｏ）２０ｇ／ｌを加えて固体にすることができる。
【００５４】
アンピシリン１００μｇ／ｍｌを使用し、この抗生物質に耐性の遺伝子をマーカーとしてもつプラスミドが組込まれた細菌を選択した。
【００５５】
３）使用したプラスミド：
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）から市販されているベクターｐＧＡＤ１０を使用し、ＧＡＬ４のトランスアクチベータードメインと脳ライブラリーからのｃＤＮＡによりコードされるタンパク質の融合タンパク質を酵母で発現させる。
【００５６】
ベクターｐＬｅｘ９（ｐＢＴＭ１１６）（Ｂａｒｔｅｌら，１９９３）を使用し、タンパク質ＬｅｘＡとの融合タンパク質を酵母で発現させる。
【００５７】
ベクターｐＧＡＤ４２４（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））を使用し、ＧＡＬ４のトランスアクチベータードメインとの融合タンパク質を酵母で発現させる。
【００５８】
ｐＬｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ１はＦＥ６５タンパク質のＰＴＢ１ドメイン（アミノ酸３９５〜５４３）をコードする配列を含むプラスミドｐＬｅｘ９である。このプラスミドを使用してＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインのタンパク質パートナーをスクリーニングした。
【００５９】
ｐＬｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ２はＡＰＰ（βアミロイドペプチドの前駆体）の細胞質領域と相互作用するとして知られるＦＥ６５タンパク質のＰＴＢ２ドメイン（アミノ酸５６５〜６９８）をコードする配列を含むプラスミドｐＬｅｘ９である。このプラスミドを使用してｈｎＲＮＰＬ及びＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５のＰＴＢドメインの相互作用の特異性を試験した。
【００６０】
ｐＬｅｘ−ＨａＲａｓＶａｌ１２は哺乳動物のＲａｆタンパク質と相互作用するとして知られるＶａｌ１２位に突然変異をもつＨａＲａｓタンパク質をコードする配列を含むプラスミドｐＬｅｘ９である（Ｖｏｊｔｅｋら，１９９３）。このプラスミドを使用してｈｎＲＮＰＬ及びＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５の相互作用の特異性を試験した。
【００６１】
ｐＧＡＤ−ＲａｆはＲａｆタンパク質をコードする配列を含むプラスミドｐＧＡＤ４２４である（Ｖｏｊｔｅｋら，１９９３）。このプラスミドを使用してｈｎＲＮＰＬ及びＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５の相互作用の特異性を試験した。
【００６２】
ｐＧＡＤ−ＡｐｐはＦＥ６５のＰＴＢ２ドメインと相互作用するとして知られるＡＰＰタンパク質の細胞質ドメインをコードする配列を含むプラスミドｐＧＡＤ１０である（Ｍｅｒｃｋｅｎら，１９９８）。このプラスミドを使用してｈｎＲＮＰＬ及びＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５の相互作用の特異性を試験した。
【００６３】
４）使用した合成オリゴヌクレオチド：
オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ ＡＢＩ３９４−０８装置で合成する。アンモニアで合成担体から分離し、ｎ−ブタノール１０倍容量で２回沈殿させた後、水に取る。光学密度の測定により定量する。
【００６４】
配列番号３：ＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＣＣＣＣＡＣＧＧＡＡＴＡＣＣＡＡＣ
配列番号４：ＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＧＣＡＴＴＡＣＧＣＣＧＴＴＣＧＧＣ。
【００６５】
これらのオリゴヌクレオチドを使用し、末端にＸｍａＩ及びＳａｌＩ部位（下線）を導入したＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインに対応するＰＣＲフラグメント（配列番号１の配列に示す）を得た。
【００６６】
配列番号５：ＣＣＡＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ。
【００６７】
このオリゴヌクレオチド（ＧＡＬ４ＴＡ）を使用して脳ｃＤＮＡ二重ハイブリッドライブラリーのプラスミドに含まれるインサートを配列決定した。
【００６８】
５）プラスミドＤＮＡの作製
ＤＮＡ精製キット：
−Ｑｕｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット、ｒｅｆ：２７１０６、
−Ｑｕｉａｐｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐキット、ｒｅｆ：１２１６３
の製造業者であるＱｕｉａｇｅｎにより推奨されているプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡの少量及び大量生産を行った。
【００６９】
６）ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によるＤＮＡの酵素増幅
ＤＮＡ鋳型、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭ）、ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，１ｍＭ ＭｇＣｌ_２，５ｍＭ ＫＣｌ，０．０１％ゼラチン）、オリゴヌクレオチド各０．５μｇ及びＡｍｐｌｉ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）２．５ＩＵの存在下でホルムアミド（５％）を加えるか又は加えずに終容量５０μｌでＰＣＲ反応を行う。混合物をパラフィン油２滴で覆い、試料の蒸発を抑える。使用した装置はＡｐｐｌｉｇｅｎｅの「Ｃｒｏｃｏｄｉｌｅ ＩＩ」である。
【００７０】
鋳型変性温度９０℃、ハイブリダイゼーション温度５０℃及び酵素伸長温度７２℃を使用した。
【００７１】
７）ライゲーション
全ライゲーション反応はベクター１００〜２００ｎｇ、インサート０．５〜２μｇ、酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）４０ＩＵ及びライゲーション緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８，１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１０ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ）の存在下に終容量１０μｌで一晩＋１４℃で実施する。
【００７２】
８）細菌形質転換：
プラスミドによる細菌の形質転換は以下のプロトコールに従って実施する。総ライゲーション容量（１０μｌ）を使用し、Ｃｈｕｎｇら（１９８８）の方法によりコンピテントにした細菌ＴＧ１を形質転換する。
【００７３】
９）ＤＮＡの分離と抽出：
ＤＮＡフラグメントの分離と抽出はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に従って実施する。
【００７４】
１０）プラスミドＤＮＡの蛍光シーケンシング
使用したシーケンシング法はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより開発され、Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）の方法を蛍光シーケンシングに合うように改変した方法である。使用したプロトコールはシステム設計者（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により記載されているものである。
【００７５】
１１）脳ライブラリーのプラスミド作製
この作製は製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））の指示に従って行った。
【００７６】
１２）プラスミドによる酵母の形質転換
Ｇｉｅｔｚら（１９９５）により記載されている方法に従ってＬｉＡＣ／ＰＥＧ処理により酵母をコンピテントにする。
【００７７】
脳ｃＤＮＡライブラリーにより酵母を形質転換する特定例では、プラスミドｐＬｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ１を含む酵母を最少培地ＹＮＢ＋Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ＋Ａｄｅ＋Ｌｅｕで培養した培養液２５０ｍｌ（細胞１０^７個／ｍｌ）を使用する。上記プロトコールに従ってコンピテントにした酵母を脳ライブラリーのｃＤＮＡ３０μｇで形質転換する。形質転換段階後に酵母を２８℃でＹＮＢ＋Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ＋Ａｄｅ＋Ｌｅｕ２５０ｍｌ中で１６時間再培養した後、遠心分離により回収し、ＹＮＢ＋Ｌｙｓ＋Ａｄｅ培地にプレーティングし、３日間２８℃で培養する。形質転換効率と増幅率の測定はＣｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）のプロトコールに従って実施した。
【００７８】
１３）酵母ＤＮＡ（ゲノム及びプラスミド）の抽出
３０℃で１６時間培養した酵母培養液３ｍｌを遠心分離し、溶解用緩衝液（１Ｍソルビトール，０．１Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｋ_２ＨＰＯ_４，ｐＨ７．４，１２．５ｍｇ／ｍｌサイモリアーゼ）２００μｌにとり、３７℃で１時間培養する。次に、ＤＮＡ精製キットＱｕｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット、ｒｅｆ：２７１０６の製造業者であるＱｕｉａｇｅｎにより推奨されているプロトコールに従って溶解液を処理する。
【００７９】
１４）β−ガラクトシダーゼの活性試験
各酵母クローンを含むペトリ皿にまずニトロセルロースシートを載せる。このシートを次に液体窒素に３０秒間浸して酵母を破砕し、こうしてβ−ガラクトシダーゼ活性を放出させる。解凍後、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）（４０ｍｇ／ｍｌ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）１５μｌを加えたＰＢＳ溶液（６０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４，４０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４，１０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ_４，ｐＨ７）１．５ｍｌに予め浸したＷｈａｔｍａｎ紙を入れた別のペトリ皿にコロニーを上にしてニトロセルロースシートを載せる。次に、ペトリ皿を３７℃のオーブンに入れる。コロニーが６時間後に膜上で青色に変色した場合に試験は陽性であると言う。
【００８０】
実施例１：ＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインとＬｅｘＡタンパク質の融合タンパク質の発現ベクターの構築
二重ハイブリッド系を使用してライブラリーをスクリーニングするには、ＦＥ６５のＰＴＢ１ドメイン（ＦＥ６５ＰＴＢ１）をＬｅｘＡタンパク質に融合する必要がある。この融合タンパク質は、ＬｅｘＡタンパク質に対応する配列と同一のオープンリーディングフレームにＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインをコードする配列（配列番号１〜２）を導入したベクターｐＬｅｘ９により発現される。
【００８１】
配列番号３及び配列番号４のオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲによりヒトＦＥ６５タンパク質のアミノ酸３９５〜５４３に対応する４４８ｂｐのＤＮＡフラグメント（配列番号２）を得ると共に、配列の末端にＸｍａＩ及びＳａｌＩ部位を導入した。ＬｅｘＡに対応する配列の下流でプラスミドｐｌｅｘ９の多重クローニング部位のＸｍａＩ及びＳａｌＩ部位間にこのＰＣＲフラグメントを導入し、ベクターｐＬｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ１を得た。
【００８２】
構築物をＤＮＡシーケンシングにより確認した。この確認の結果、このフラグメントはＰＣＲ反応中に突然変異が発生しておらず、ＬｅｘＡに対応するフラグメントと同一のオープンリーディングフレームに融合していることが判明した。
【００８３】
実施例２：脳ｃＤＮＡ融合ライブラリーの二重ハイブリッド法によるスクリーニング
二重ハイブリッド法（ＦｉｅｌｄｓとＳｏｎｇ，１９８９）を使用した。融合ライブラリーをスクリーニングし、ＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと相互作用することが可能なＧＡＬ４のトランスアクチベータードメインに融合したタンパク質を生産するクローンを同定することができた。この相互作用により、Ｌ４０株でリポーター遺伝子Ｈｉｓ３及びＬａｃＺの発現を誘導することが可能なトランスアクチベーターを再構成することができる。このスクリーニングを行うために、ヒト脳ｃＤＮＡから作製した融合ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））を選択した。
【００８４】
スクリーニング中は、融合ライブラリーの各独立プラスミドがプラスミドｐＬｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ１と同時に少なくとも１個の酵母に存在するように保つことが必要である。このように保つためには、酵母の形質転換効率を上げることが重要である。このために、ＤＮＡ１μｇ当たり形質転換細胞１０^５個の効率を与える酵母形質転換プロトコールを選択した。更に、２種の異なるプラスミドによる酵母の同時形質転換はこの効率を下げるので、プラスミドｐＬｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ１により予め形質転換した酵母を使用した。表現型Ｈｉｓ−，Ｌｙｓ−，Ａｄｅ−，Ｌｅｕ−のこのＬ４０−Ｆｅ６５ＰＴＢ１株を融合ライブラリーのプラスミドＤＮＡ３０μｇで形質転換した。このＤＮＡ量から推定後に２．８×１０^６個の形質転換細胞が得られ、これはライブラリーを構成する独立プラスミド数よりもやや大きい数に対応する。この結果、ライブラリーのプラスミドのほぼ全体が酵母の形質転換に使用されたと考えられる。機能的ＧＡＬ４トランスアクチベーターを再構成することが可能な形質転換細胞をＹＮＢ＋Ｌｙｓ＋Ａｄｅ培地で選択した。
【００８５】
この選択後に表現型Ｈｉｓ＋のクローン９７個が得られた。これらの形質転換体でβ−ガラクトシダーゼ活性試験を実施し、他方のリポーター遺伝子ＬａｃＺを発現するクローン数を調べた。得られた９７個のクローンのうち、２７個がＨｉｓ＋，βＧａｌ＋二重表現型であり、ＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと相互作用することが可能なタンパク質を発現することが判明した。
【００８６】
実施例３：選択した酵母クローンからの脳ライブラリープラスミドの単離
ＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと相互作用することが可能なタンパク質を同定するために、二重ハイブリッドスクリーニング時に選択した酵母に含まれる融合ライブラリーのプラスミドを抽出した。プラスミドが大量に得られるようにするためには、単離の前に陽性酵母株のＤＮＡ抽出物で大腸菌を予め形質転換する必要がある。この抽出物に含まれるライブラリーのプラスミドは酵母／大腸菌シャトルプラスミドであるので、細菌で容易に複製することができる。
【００８７】
酵母ＤＮＡ抽出物による形質転換後に得られた細菌コロニーのプラスミドＤＮＡを制限酵素消化とアガロースゲルでのＤＮＡフラグメントの分離により分析した。２３個のクローンを分析した処、６種の異なる制限プロフィルが得られ、そのうちの２種は高度に発現された。これらの結果から明らかなように、このスクリーニング中に少なくとも６種の異なるプラスミドが単離され、本発明者らは最高発現レベルの２種のプラスミド（８及び４倍）に含まれるｃＤＮＡライブラリーに由来するＤＮＡフラグメントに特に注目した。
【００８８】
実施例４：同定されたプラスミドのインサートの配列決定
脳ｃＤＮＡライブラリーの挿入部位近傍でＥｃｏＲＩ部位から５２ｂｐのＧＡＬ４ＴＡ領域に相補的なＧＡＬ４ＴＡオリゴヌクレオチド（配列番号５）を使用して、最高発現レベルの２種のプラスミドの配列決定を行った。
【００８９】
選択した第１のプラスミドの配列をデータバンクＧＥＮＢａｎｋ及びＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂ）に含まれる配列と比較した処、この第１のプラスミドに存在するｃＤＮＡ配列は受託番号ＮＰ＿００１５２４／ｇ４５５７６４５のｈｎＲＮＰＬタンパク質をコードするヒト遺伝子とヌクレオチドレベルで９９％を越える一致度を示すことが判明した。二重ハイブリッド系によりクローニングしたこの遺伝子の配列はｈｎＲＮＰＬタンパク質の１１６番目のアミノ酸に対応するヌクレオチド３４６から開始し、最後の５８アミノ酸に位置する４６４番目のアミノ酸に対応するヌクレオチド１３９２で終結している（配列番号６及び７）。この結果から明らかなように、ｈｎＲＮＰＬとヒトＦＥ６５タンパク質の相互作用ドメインはｈｎＲＮＰＬの中心領域に含まれる。この領域はＰＴＢドメインの結合コンセンサス部位であるとして知られるＮＰＸＹ型の配列を含む（Ｂｏｒｇら，１９９６）。クローニングしたｈｎＲＮＰＬ配列（配列番号６及び７）は、７４８位のグアニンがチミジンに置換し、その結果、完全ｈｎＲＮＰＬタンパク質のヌクレオチド１０９３とアミノ酸３６５に対応する配列番号６の配列の２５０番目のアミノ酸のレベルでグリシンがシステインに置換している点が公開配列（Ｐｉｎｏｌ−Ｒｏｍａら，１９８９）と異なる。
【００９０】
選択した第２のプラスミドの配列をデータバンクＧＥＮＢａｎｋ及びＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂ）に含まれる配列と比較した処、このプラスミドに含まれるｃＤＮＡ配列はこれらのデータバンクに含まれる配列と有意相同を示さないことが判明した。
【００９１】
特許出願ＷＯ９９／２６９６１の配列番号４の配列のタンパク質とは有意相同が認められた。しかし、本願の主題である配列番号９の配列のタンパク質は特許出願ＷＯ９９／２６９６１の配列番号４の配列のタンパク質と異なる。特に、配列番号９の配列のタンパク質のほうが４２アミノ酸短い。配列の他の部分では多少の相同が存在するが、顕著な相違もある。特に、１、４８、６１、３０５位アミノ酸は特許出願ＷＯ９９／２６９６１の配列番号４の配列のタンパク質の所定相同を示す部分で対応位置のアミノ酸と異なる。
【００９２】
この１２７５ヌクレオチドの配列（配列番号８〜９）は１０１２位に終結コドンをもち、３３７アミノ酸のペプチドをコードする。この配列に対応するタンパク質をＦＥ６５ Ｂｉｎｄｉｎｇ ＰＴＢ１（ＦＥ６５結合ＰＴＢ１）ドメインタンパク質の意でＦＥＢＰ１と命名した。
【００９３】
実施例５：ＦＥ６５のＰＴＢドメインとｈｎＲＮＰＬ及びＦＥＢＰ１タンパク質の相互作用特異性の分析
ヒトＦＥ６５タンパク質のＰＴＢ１及びＰＴＢ２ドメインとｈｎＲＮＰＬ及びＦＥＢＰ１タンパク質の相互作用の特異性を調べるために、プラスミドｐＬｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ１の代わりにＬｅｘＡタンパク質に融合したＦＥ６５のＰＴＢ２ドメインをコードするプラスミドｐＬｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ２を使用して二重ハイブリッド法により相互作用試験を行った。ＰＴＢ２ドメインとこれらの２種のタンパク質が相互作用しないならば、ＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと相互作用特異性があると考えられる。
【００９４】
この試験を実施するために、脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング中に単離したプラスミドとプラスミドｐＬｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ２によりＬ４０株を形質転換した。表１に示すように種々のプラスミドでこの株を形質転換することにより相互作用特異性比較試験も実施した。種々のプラスミドで形質転換した細胞でβＧａｌ活性試験を実施し、タンパク質−タンパク質相互作用を検出した。二重ハイブリッド系で試験したプラスミド組合せ、従って、相互作用の全体を表１に示す。プラスミド組合せと対応ベクター種（ｐＬｅｘ又はｐＧＡＤ）を「プラスミド組合せ」の欄に示す。「相互作用」の欄の＋と−の符号はβＧａｌ試験の結果に対応し、夫々タンパク質−タンパク質相互作用が検出されたか否かを示す。
【００９５】
試験結果（表１参照）によると、脳ｃＤＮＡライブラリーから単離した２種のプラスミドとプラスミドｐＬｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ１で形質転換した酵母のみがβＧａｌ＋活性を示し、従って、ＦＥ６５の２種のＰＴＢドメインのうちでＰＴＢ１ドメインのみがｈｎＲＮＰＬの中心部分又はＦＥＢＰ１タンパク質のフラグメントと相互作用することが判明した。ＨａＲａｓＶａｌ１２タンパク質又はＡＰＰのＣ末端ドメインとは二重ハイブリッド法により相互作用を検出できなかったので、ＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインはｈｎＲＮＰＬ及びＦＥＢＰ１と特異的に相互作用すると思われる。
【００９６】
【表１】

【００９７】
【表２】

【配列表】

[0001]
Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that occurs in many elderly people. The feature of this disease is a reduction in cognitive function in the clinical aspect, and in the neuropathological aspect, there is intracellular fibril deposition and extracellular deposition of β-amyloid (Aβ) peptide forming amyloid plaques (Yanker, 1996). ). Amyloid plaques are composed mainly of 40-42 amino acid Aβ peptides produced by the proteolytic process of β-amyloid peptide precursor protein (APP) (Golde et al., 1992). Extracellular deposition of Aβ is specific for AD. This is an early feature common to all species AD including familiality. Familial Alzheimer's disease develops relatively early (40-60 years) and results from mutations in the APP gene and presenilin-1 (PS1) and presenilin-2 (PS2) genes. Mutations in these three genes alter APP proteolysis, leading to Aβ overproduction and early onset of lesions and symptoms similar to sporadic AD.
[0002]
Membrane APP internalization is a necessary step in the proteolytic process of APP that depends on its cytoplasmic region (Koo and Squazzo, 1994). That is, if this region of the protein is deleted or a point mutation is present at the level of the Tyr-Glu-Asn-Pro-Thr-Tyr sequence in the cytoplasmic region of APP, the production of β-amyloid peptide is significantly reduced (Perez). Et al., 1999). Several types of proteins that interact with the cytoplasmic region of APP have been identified, and therefore, they may be involved in the regulation of the proteolytic process of APP and the production of β-amyloid peptide. Two protein families that interact with the Tyr-Glu-Asn-Pro-Thr-Tyr sequence in the cytoplasmic region of APP include FE65 and X11 (Borg et al., 1996, 1998; Bressler et al., 1996; Dulio et al., 1998). Fiore et al., 1995; Guenette et al., 1996; McLoughlin and Miller, 1996; Mercken et al., 1998; Tanahashi and Tabira, 1999a, 1999b and 1999c). The FE65 protein family is composed of three types called FE65, COFE65 / FE65L1 and FE65L2. The X11 protein family is also composed of three types called X11α, X11β and X11γ. These two protein families have the opposite effect on the regulation of β-amyloid peptide production. We and other laboratories have shown that overexpression of FE65 induces increased production of Aβ peptide (Mercken et al., 1998; Sabo et al., 1999), and overexpression of X11 induces decreased production of Aβ peptide (Borg 1998; Sastre et al., 1998).
[0003]
When analyzing the primary structure of FE65, this protein appears to act as an adapter. That is, FE65 contains three protein domains involved in protein-protein interactions, ie, one WW domain in the amino terminal portion and two PTB domains in the carboxy terminal portion (phosphotyrosine binding domain) PTB1 and PTB2 including. When the deletion was made, it was found that the PTB2 and FE65 domains are involved in the interaction with the cytoplasmic region of APP. The WW domain interacted with at least five proteins, two of which were identified as Mena (Mammalian homologue of Enabled) proteins (Ermekova et al., 1997). Furthermore, the PTB1 and FE65 domains interact with the CP2 / LSF / LBP1 transcription factor (Zambrano et al., 1997) and the LRP (LDL receptor-Related Proteins: LDL receptor-related protein) receptor (Tromsdorff et al., 1998). However, the role of these proteins in the physiological function of FE65 is not yet understood.
[0004]
Therefore, elucidation of the exact role of the FE65 protein in the production process of β-amyloid peptide is an important issue for understanding and treating approaches in general to Alzheimer's disease and neurodegenerative diseases.
[0005]
The present invention focuses on the identification of partners of this protein that interact with the FE65 protein under physiological conditions. These partners are novel pharmacological targets for the production or research of compounds capable of modulating the activity of FE65, in particular its activity with respect to the production of β-amyloid peptide. These proteins, antibodies, corresponding nucleic acids and specific probes or primers are also useful for detecting or quantifying these proteins in biological samples, particularly neural tissue samples. These proteins or nucleic acids are also useful in therapeutic approaches to modulate the activity of FE65 and any compound of the present invention capable of modulating the interaction of FE65 with a polypeptide of the present invention.
[0006]
The present invention is the result of the discovery of two human proteins (shown in SEQ ID NOs: 1 and 2) that interact with the PTB1 domain of FE65. That is, the present invention demonstrates that the central region of the hnRNPL protein interacts with the PTB1 domain of FE65. The present invention further provides FEBP1 (which can interact with the PTB1 domain of FE65). FE 65 B inding P TB 1 : FE65 binding PTB1 domain protein).
[0007]
The present invention is also the result of identification and characterization of specific regions of the hnRNPL and FEBP1 proteins that are involved in the regulation of FE65 protein function. By elucidating the existence of these proteins and regions involved in their functions, it is possible to produce novel compounds and / or compositions that are particularly useful as drugs and to develop industrial screening methods for such compounds. Become.
[0008]
Accordingly, a first object of the present invention is capable of at least partially modulating or affecting the level of this interaction between hnRNPL and / or FEBP1 protein (or its homolog) and the PTB1 domain of FE65. Relates to compounds.
[0009]
The action of the compound of the present invention can be expressed in various aspects. The compounds of the present invention can at least partially suppress, inhibit or stimulate the interaction of hnRNPL and / or FEBP1 protein (or homologs thereof) with the PTB1 domain of FE65. For example, compounds that can modulate this interaction in vitro in a double hybrid system or any cell-free detection system for the interaction between two polypeptides are preferred. The compounds of the invention can at least partially modulate this interaction and preferably increase or inhibit this interaction by at least 20%, more preferably at least 50% compared to a control in the absence of compound. Compounds are preferred.
[0010]
For the purposes of the present invention, hnRNPL and FEBP1 proteins refer to these proteins themselves and their homologues. The homologous form is equivalent to the protein of interest and means all proteins derived from cells of various cellular origin, in particular human or other biological origin, and having the same type of activity. Such homologs also include natural variants of the designated protein, particularly polymorphs or splicing variants. A homologous protein (or polypeptide) can be obtained, for example, by a hybridization experiment between coding nucleic acids. For the purposes of the present invention, it is sufficient for this type of sequence to show a significant percent identity to produce a physiological function similar to the claimed hnRNPL and / or FEBP1 protein.
[0011]
According to a particular embodiment, the compounds of the invention can bind to the level of the interaction domain of hnRNPL and / or the FEBP1 protein and the PTB1 domain of FE65.
[0012]
The compounds of the present invention may be of various types and origins. In particular, it can be a compound of a type such as a peptide, nucleic acid (ie including a base chain, in particular a DNA or RNA molecule), lipid, sugar, antibody, etc., and can generally be an all organic or inorganic molecule.
[0013]
According to a first variant, the compounds of the invention are peptide species. The term peptide refers to any molecule comprising an amino acid chain, such as a peptide, polypeptide, protein, antibody (or antibody fragment or derivative), which may optionally be modified and attached to another compound or chemical group. You may do it. In this regard, the term “peptide” refers in particular to a molecule comprising a chain of up to 50 amino acids, more preferably up to 40 amino acids. The polypeptide preferably contains 50 to 500 amino acids or more. A protein is a polypeptide corresponding to a natural molecule.
[0014]
According to a first preferred embodiment, the peptide compound of the invention comprises part of the peptide sequence of the hnRNPL protein and / or FEBP1 protein and / or its derivatives. Part of the sequence of hnRNPL protein and / or FEBP1 protein characterized by comprising the sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9, respectively, is more preferred.
[0015]
The peptide compound of the present invention is more preferably a compound containing a region having a sequence corresponding to all or a functional part of the interaction site of the PTB1 domain of hnRNPL protein and / or FEBP1 protein and FE65. Such compounds, in particular peptides, constitute competitors of hnRNPL and / or FEBP1, and can at least partially modulate the interaction of hnRNPL and / or FEBP1 protein (or its homologue) with the PTB1 domain of FE65. . Peptide compounds comprising residues 1 to 349 of the sequence of SEQ ID NO: 7 or residues 1 to 337 of the sequence of SEQ ID NO: 9 are more preferred. As shown in the Examples, these sequences include the central region of the hnRNPL protein (residues 116-464) and at least a portion of the FEBP1 protein, and can specifically interact with the PTB1 domain of FE65, Cannot interact with the PTB2 domain of.
[0016]
In a particular embodiment, the compound is a fragment of the sequence SEQ ID NO: 7 consisting of at least 5 amino acids, preferably at least 9 amino acids, comprising the Asn-Pro-Ile-Tyr sequence (residues 55-58).
[0017]
According to another preferred embodiment, the peptide compound of the invention is a compound derived from an hnRNPL protein or FEBP1 protein (and / or homologue form) with a non-functional effector region. Such a peptide compound can be obtained by deletion, mutation or destruction of at least this effector region in the form of hnRNPL protein and / or FEBP1 protein and / or homologue. Such mutations can be performed, for example, by in vitro mutagenesis, introduction of additional elements or synthetic sequences, or deletion or substitution of the original elements. Thus, these polypeptides can bind to the FE65 protein but cannot induce a functional signal at least as high as that of the natural protein.
[0018]
According to a particular embodiment, the compound of the invention is a polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9 and having a mutation at least in the effector region.
[0019]
According to a particular embodiment, the compound of the invention is a polypeptide comprising the sequence SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9 and having a deletion in at least the effector region.
[0020]
According to a particular embodiment, the compound of the invention is a polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9 and having an insertion at least in the effector region.
[0021]
Another object of the invention is the FEBP1 protein or any fragment or derivative thereof. In particular, any polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 9 or a derivative or fragment thereof, more preferably any polypeptide comprising at least 10 consecutive residues of the sequence of SEQ ID NO: 9 or a derivative thereof, and at least a PTB1 domain of FE65 More preferred are those containing a residue involved in the binding.
[0022]
Another object of the invention is a polypeptide comprising the sequence SEQ ID NO: 7.
[0023]
The term “derivative” is used in the meaning of the present invention to hybridize with an arbitrary sequence that differs from the corresponding sequence due to the degeneracy of the genetic code obtained by one or more genetic and / or chemical modifications, and with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 6 or 8, or a fragment thereof. By any soy sequence is meant any peptide capable of affecting the level of interaction of the FE65 PTB1 domain with the hnRNPL protein and / or FEBP1 protein and / or its homologue. Genetic and / or chemical modification means any mutation, substitution, deletion, addition and / or modification of one or more residues. The term derivative is homologous to the relevant sequence and also includes sequences derived from other cellular sources, in particular cells of human or other biological origin and having the same type of activity. Such homologous sequences can be obtained by hybridization experiments. Hybridization can be performed using nucleic acid libraries and using native sequences or fragments thereof as probes under various hybridization conditions (see Sambrook et al., General Molecular Biology Technology). Furthermore, the term “fragment” or “portion” means any portion of the molecule of interest comprising at least 5 consecutive residues, preferably at least 9 consecutive residues, more preferably at least 15 consecutive residues. .
[0024]
Such derivatives or fragments can be made for a variety of purposes, for example, for the purpose of increasing their therapeutic effects, reducing their side effects, and imparting new pharmacokinetic and / or biological properties. Can be produced.
[0025]
When a derivative or fragment as described above is prepared, its biological activity on the binding of the hnRNPL protein and / or FEBP1 protein and / or its homologue to the PTB1 domain binding site of FE65 can be elucidated. Of course, any technique known to those skilled in the art as described in the experimental section can be used for this purpose (double hybrid, column binding, cell-free system, cell system, etc.).
[0026]
In general, the compounds of the invention can be hnRNPL or FEBP1 protein or any fragment of the above peptide compounds. Such fragments can be produced by various methods. In particular, it can be chemically synthesized based on the sequences described herein by using a peptide synthesizer known to those skilled in the art. It can also be synthesized by genetic engineering by expressing a nucleotide sequence encoding the desired peptide in a cellular host. In this case, the nucleotide sequence can be chemically created based on the peptide sequence and genetic code described herein by using an oligonucleotide synthesizer. Nucleotide sequences may be prepared from the sequences described herein by enzymatic cleavage, ligation, cloning, etc. by methods known to those skilled in the art, or by screening a DNA library with probes prepared from these sequences. May be.
[0027]
Other peptides of the invention are peptides capable of competing with the above peptides for their interaction with cellular targets. Such a peptide can be synthesized especially based on the sequence of the corresponding peptide, and it can be examined whether or not it can compete with the peptide.
[0028]
According to another particular embodiment, the compounds of the invention are antibodies or antibody fragments or derivatives. That is, another object of the present invention is a polyclonal or monoclonal antibody or antibody fragment against the peptide compound or protein as described above. Such antibodies can be prepared by methods known to those skilled in the art. In particular, these antibodies can be prepared by immunizing an animal against the peptide of the present invention, collecting blood and separating the antibodies. These antibodies can also be produced by hybridoma production by methods known to those skilled in the art.
[0029]
More preferably, the antibody or antibody fragment of the present invention can at least partially modulate the interaction of the peptide compound or hnRNPL and / or FEBP1 protein with the PTB1 domain of FE65, and can be used to modulate the activity of FE65. .
[0030]
Furthermore, these antibodies can be used for detecting and / or quantifying the expression of the peptides of the invention in a biological sample and thus for examining their activation state.
[0031]
The antibody fragment or derivative is, for example, Fab, Fab′2, single chain antibody (ScFv) or the like. In particular, any fragment or derivative that maintains the antigen specificity of the original antibody.
[0032]
More preferably, the antibodies of the invention are capable of binding to regions of these proteins involved in interaction with hnRNPL and / or FEBP1 proteins, particularly FE65, comprising the sequence of SEQ ID NO: 7 or 9, respectively. More preferably, these antibodies (or fragments or derivatives) can bind to an epitope present in the sequence contained in residues 1 to 349 of SEQ ID NO: 7 or residues 1 to 337 of SEQ ID NO: 6.
[0033]
The present invention also relates to a non-peptide or non-exclusive peptide compound capable of suppressing the above interaction and its use as a medicament. That is, by combining the active motif of a peptide with a non-peptide or non-exclusive peptide species structure, it can be adapted for pharmaceutical use as a modulator of the activity of hnRNPL and / or FEBP1 protein from the active protein motif described herein Non-exclusive peptide molecules can be made.
[0034]
The invention also relates to any nucleic acid encoding the peptide compound of the invention. In particular, examples include sequences including all or part of the sequences shown in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8 or derivatives thereof. Induced sequences are derived from these sequences by the degeneracy of the genetic code and, for the purposes of the present invention, any sequence that hybridizes with the sequences shown in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8 or fragments thereof encoding the peptides of the present invention. Means an array. The various nucleotide sequences of the present invention may or may not be of artificial origin. Examples include genomic sequences, cDNA, RNA, hybrid sequences, or synthetic or semi-synthetic sequences. These sequences can be obtained by a DNA library (cDNA library, genomic DNA library) screening, chemical synthesis, mixed method including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by library screening. The hybridization is performed under high stringency conditions, particularly trisodium citrate-2H. ₂ O in a solution containing 8.823 g / l of sodium chloride, 17.532 g / l of sodium chloride and 1% sodium dodecyl sulfate at a temperature of 50 ° C. for 1 hour, or Sambrook et al. (1989, pages 9.52-9.55). It is preferable to carry out under the conditions described in (1).
[0035]
For the purposes of the present invention, the specific nucleic acid encodes a polypeptide comprising the sequence SEQ ID NO: 9, or a fragment or derivative thereof, in particular a human FEBP1 protein. A nucleic acid comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 8 is advantageous.
[0036]
The nucleic acid of the present invention can be used for the production of the peptide compound of the present invention. Therefore, the present application also relates to a method for producing a peptide compound, comprising culturing cells containing the nucleic acid of the present invention under the expression conditions of the nucleic acid and recovering the produced peptide compound. In this case, the portion encoding the polypeptide is generally under the control of a signal that allows its expression in a cellular host. The selection of these signals (promoter, terminator, secreted “leader” sequence, etc.) depends on the cell host used. Furthermore, the nucleic acid of the present invention may be part of a vector, and the vector may be autonomously replicating or integrating. In particular, autonomously replicating vectors can be made by using autonomously replicating sequences in a selected host. The integration vector can be prepared, for example, by using a sequence that is homologous to a predetermined region of the host genome and can be integrated by homologous recombination. Examples of the vector include plasmids, episomes, chromosomes, viruses, and other types of vectors.
[0037]
The cell host that can be used for recombinant production of the peptide of the present invention may be a eukaryotic host or a prokaryotic host. Suitable eukaryotic hosts can include animal cells, yeast, or fungi. In particular, examples of the yeast include yeasts of the genus Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwannomycins or Hansenula. Examples of animal cells include COS, CHO, C127, and PC12 cells. As fungi, mention may be made in particular of Aspergillus species or Trichoderma species. As the prokaryotic host, it is preferable to use bacteria such as Escherichia coli, Bacillus or Streptomyces.
[0038]
The nucleic acids of the present invention can also be used to make antisense oligonucleotides or gene antisenses that can be used as drugs or diagnostics. Antisense sequences are small sized oligonucleotides that are complementary to the coding strand of a given gene and can therefore specifically hybridize with the transcribed mRNA to inhibit its protein translation. Accordingly, the present invention also relates to an antisense sequence capable of at least partially inhibiting the interaction of hnRNPL and / or FEBP1 protein with the PTB1 domain of FE65. Such a sequence can consist of all or part of the above nucleotide sequence. Such sequences are generally sequences or sequence fragments complementary to sequences encoding peptides that interact with the PTB1 domain of FE65. Such an oligonucleotide can be obtained by fractionation or chemical synthesis.
[0039]
The nucleic acid sequence can also be used within the therapeutic range to transcribe and in vivo express an antisense sequence or peptide capable of regulating the interaction of hnRNPL and / or FEBP1 protein with the PTB1 domain of FE65. In this regard, incorporation of sequences into viral or non-viral vectors can be administered in vivo (Kahn, A. et al., 1991). As viral vectors of the present invention, mention may be made in particular of adenovirus, retrovirus, adeno-associated virus (AAV) or herpesvirus type vectors. The present application also relates to a recombination deficient virus comprising a nucleic acid encoding the (poly) peptide of the invention.
[0040]
According to the present invention, a synthetic or non-synthetic nucleotide probe capable of hybridizing with the nucleic acid or its complementary strand can also be produced. Such probes can be used in vitro as diagnostic tools for detecting the expression or overexpression of hnRNPL and / or FEBP1 protein, or detecting genetic abnormalities (splicing abnormalities, polymorphisms, point mutations, etc.). These probes can also be used to detect and isolate homologous nucleic acid sequences encoding such peptides from other cell sources, preferably cells of human origin. The probe of the present invention generally comprises at least 10 bases, and can contain, for example, up to one of the above sequences or one of its complementary strands. These probes are preferably labeled before use. For this purpose, various methods (radioactivity, fluorescence, enzyme, chemical labeling, etc.) known to those skilled in the art can be used.
[0041]
The invention also relates to any pharmaceutical composition comprising as an active ingredient at least one compound as described above, in particular a peptide compound.
[0042]
The invention particularly relates to any pharmaceutical composition comprising as an active ingredient at least one antibody and / or antibody fragment as described above and to any pharmaceutical composition comprising as an active ingredient at least one nucleic acid or vector as described above. .
[0043]
The present invention also relates to any pharmaceutical composition comprising as an active ingredient a chemical molecule capable of increasing or decreasing the interaction between hnRNPL and / or FEBP1 protein and FE65 protein.
[0044]
Furthermore, the present invention also relates to a pharmaceutical composition having the above peptide, antibody, chemical molecule and nucleotide sequence together or with other active ingredients.
[0045]
The pharmaceutical composition of the invention modulates the activity of hnRNPL and / or FEBP1 protein and can therefore be used to regulate the function of APP, its intracellular transport, its maturation and its conversion to β-amyloid peptide . In particular, these pharmaceutical compositions are used to modulate the interaction of hnRNPL or FEBP1 protein with FE65 protein. For example, a pharmaceutical composition for treating neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease is more preferable. The compositions (or compounds) of the invention are used in particular to at least partially inhibit the interaction of FE65 protein with hnRNPL and / or FEBP1 protein.
[0046]
The invention also relates to the use of the above molecules for modulating the activity of the FE65 protein or for the typing of neurodegenerative diseases. In particular, the invention relates to the use of these molecules to at least partially modulate the activity of the PTB1 domain of FE65.
[0047]
The present invention relates to a method for selecting a molecule capable of binding to the sequence of SEQ ID NO: 7 or the sequence of SEQ ID NO: 9 or a fragment (or derivative) thereof as a method for screening or characterizing molecules active for the function of the FE65 protein. Also related. The method comprises contacting the test molecule with a polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 7 or the sequence of SEQ ID NO: 9 or a fragment (or derivative thereof) in vitro, and comprising the sequence of SEQ ID NO: 7 (particularly contained in residues 1 to 349). It is advantageous to select a molecule capable of binding to the region) or the sequence of SEQ ID NO: 9 (particularly the region contained in residues 1 to 337). The test molecules can be various (peptides, nucleic acids, lipids, sugars, etc., or mixtures of these molecules, such as combinatorial libraries). As mentioned above, the molecules thus identified can be used to modulate the activity of the FE65 protein, making them potential therapeutic agents for the treatment of neurodegenerative diseases.
[0048]
Other advantages of the present invention will be appreciated from the following examples. These examples are illustrative and do not limit the invention.
[0049]
Materials and methods used
1) Yeast strain used:
S. cerevisiae genus L40 strain (Mata, his3D200, trp1-901, leu2-3, 112, ade2, LYS2: :( lexAop) 4-HIS3, URA3: :( lexAop) 8-LacZ, GAL4, GAL80) Used as a screening tool for brain fusion library. This strain can detect protein-protein interactions when one of the protein partners is fused to the LexA protein (Vojtek et al., 1993). This strain is transformed into the following medium:
-Yeast nitrogen-based (no amino acids) (6.7 g / l) (Difco),
-Glucose (20 g / l) (Merck)
In a minimal NYB medium consisting of
[0050]
This medium can be made solid by adding 20 g / l of agar (Difco).
[0051]
In order to grow auxotrophic yeast in this medium, it is necessary to add 50 mg / ml of amino acid or nitrogen base on which the yeast depends. Add 100 μg / ml ampicillin to avoid bacterial contamination.
[0052]
2) Bacterial strain used:
Genotype supE, hsdΔ5, thi, Δ (lac-proAB), F ′ [tra D36 A ⁺ B ⁺ lacI ^q lacZΔM15] was used for plasmid construction, amplification and plasmid isolation. This strain was transformed into the following medium: -NaCl (5 g / l) (Sigma),
-Bactotryptone (10 g / l) (Difco),
-Yeast extract (5 g / l) (Difco)
It was cultured in an LB medium consisting of
[0053]
This medium can be made solid by adding 20 g / l of agar (Difco).
[0054]
Ampicillin 100 μg / ml was used to select bacteria in which a plasmid having a gene having a gene resistant to this antibiotic as a marker was incorporated.
[0055]
3) Plasmid used:
Using the vector pGAD10 commercially available from Clontech®, a fusion protein of the GAL4 transactivator domain and the protein encoded by the cDNA from the brain library is expressed in yeast.
[0056]
The vector pLex9 (pBTM116) (Bartel et al., 1993) is used to express a fusion protein with the protein LexA in yeast.
[0057]
The vector pGAD424 (Clontech®) is used to express a fusion protein with the transactivator domain of GAL4 in yeast.
[0058]
pLex-FE65PTB1 is a plasmid pLex9 containing a sequence encoding the PTB1 domain (amino acids 395 to 543) of the FE65 protein. This plasmid was used to screen for protein partners of the PTB1 domain of FE65.
[0059]
pLex-FE65PTB2 is a plasmid pLex9 containing a sequence encoding the PTB2 domain (amino acids 565-698) of the FE65 protein known to interact with the cytoplasmic region of APP (a precursor of β amyloid peptide). This plasmid was used to test the specificity of the interaction of hnRNPL and FEBP1 proteins with the PTB domain of FE65.
[0060]
pLex-HaRasVal12 is a plasmid pLex9 containing a sequence encoding a HaRas protein with a mutation at position Val12 known to interact with mammalian Raf protein (Vojtek et al., 1993). This plasmid was used to test the specificity of the interaction of hnRNPL and FEBP1 proteins with FE65.
[0061]
pGAD-Raf is the plasmid pGAD424 containing the sequence encoding the Raf protein (Vojtek et al., 1993). This plasmid was used to test the specificity of the interaction of hnRNPL and FEBP1 proteins with FE65.
[0062]
pGAD-App is a plasmid pGAD10 containing a sequence encoding the cytoplasmic domain of the APP protein known to interact with the PTB2 domain of FE65 (Mercken et al., 1998). This plasmid was used to test the specificity of the interaction of hnRNPL and FEBP1 proteins with FE65.
[0063]
4) Synthetic oligonucleotides used:
Oligonucleotides are synthesized on an Applied System ABI 394-08 instrument. After separating from the synthetic carrier with ammonia and precipitating twice with 10 volumes of n-butanol, it is taken up in water. Quantify by measuring optical density.
[0064]
Sequence number 3: CTT CCCGGG TCCCCCACGGGAATACCAAC
SEQ ID NO: 4: GGG GTCGAC GGCATTACGCCGGTTCGCC.
[0065]
Using these oligonucleotides, a PCR fragment (shown in the sequence of SEQ ID NO: 1) corresponding to the PTB1 domain of FE65 into which XmaI and SalI sites (underlined) were introduced at the ends was obtained.
[0066]
Sequence number 5: CCACTACAATGGATGATG.
[0067]
This oligonucleotide (GAL4TA) was used to sequence the insert contained in the plasmid of the brain cDNA double hybrid library.
[0068]
5) Preparation of plasmid DNA
DNA purification kit:
-Quiaprep Spin Miniprep kit, ref: 27106,
-Quiaprep Plasmid Maxiprep kit, ref: 12163
Small and large quantities of plasmid DNA were produced according to the protocol recommended by Qiagen, the manufacturer of
[0069]
6) Enzymatic amplification of DNA by PCR (polymerase chain reaction)
DNA template, dNTP (0.2 mM), PCR buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.5, 1 mM MgCl ₂ , 5 mM KCl, 0.01% gelatin), 0.5 μg of each oligonucleotide and PCR in a final volume of 50 μl with or without formamide (5%) in the presence of 2.5 IU of Ampli Taq DNA polymerase (Perkin Elmer) Perform the reaction. Cover the mixture with 2 drops of paraffin oil to prevent sample evaporation. The device used is the “Cropile II” from Applied.
[0070]
A template denaturation temperature of 90 ° C, a hybridization temperature of 50 ° C and an enzyme extension temperature of 72 ° C were used.
[0071]
7) Ligation
All ligation reactions consisted of 100-200 ng vector, 0.5-2 μg insert, enzyme T4 DNA ligase (Biolabs) 40 IU and ligation buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 10 mM MgCl ₂ , 10 mM DTT, 1 mM ATP) in a final volume of 10 μl overnight at + 14 ° C.
[0072]
8) Bacterial transformation:
Bacterial transformation with a plasmid is performed according to the following protocol. The total ligation volume (10 μl) is used to transform competent bacterial TG1 by the method of Chung et al. (1988).
[0073]
9) DNA separation and extraction:
Isolation and extraction of DNA fragments is performed according to Sambrook et al. (1989).
[0074]
10) Fluorescent sequencing of plasmid DNA
The sequencing method used was developed by Applied Biosystems and is a modification of the method of Sanger et al. (1977) to suit fluorescence sequencing. The protocol used is that described by the system designer (Perkin Elmer).
[0075]
11) Brain library plasmid preparation
This preparation was performed according to the manufacturer's instructions (Clontech®).
[0076]
12) Transformation of yeast with plasmid
Yeast is made competent by LiAC / PEG treatment according to the method described by Gietz et al. (1995).
[0077]
In a specific example of transforming yeast with a brain cDNA library, 250 ml of a culture solution in which yeast containing plasmid pLex-FE65PTB1 is cultured in minimal medium YNB + His + Lys + Ade + Leu (cell 10 ⁷ Per ml). Competent yeast according to the above protocol is transformed with 30 μg brain library cDNA. After the transformation step, the yeast is re-cultured in YNB + His + Lys + Ade + Leu 250 ml for 16 hours at 28 ° C., collected by centrifugation, plated on YNB + Lys + Ade medium, and cultured at 28 ° C. for 3 days. The transformation efficiency and amplification rate were measured according to the Clontech (registered trademark) protocol.
[0078]
13) Extraction of yeast DNA (genome and plasmid)
Centrifugation of 3 ml of yeast culture solution cultured at 30 ° C. for 16 hours was carried out, and a lysis buffer (1M sorbitol, 0.1M KH ₂ PO ₄ / K ₂ HPO ₄ , PH 7.4, 12.5 mg / ml thymolyase) in 200 μl and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The lysate is then processed according to the protocol recommended by Qiagen, the manufacturer of the DNA purification kit Quiaprep Spin Miniprep kit, ref: 27106.
[0079]
14) β-galactosidase activity test
First, a nitrocellulose sheet is placed on a Petri dish containing each yeast clone. This sheet is then soaked in liquid nitrogen for 30 seconds to disrupt the yeast, thus releasing β-galactosidase activity. After thawing, PBS solution (60 mM Na) containing 15 μl of X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) (40 mg / ml N, N-dimethylformamide) was added. ₂ HPO ₄ , 40 mM NaH ₂ PO ₄ , 10 mM KCl, 1 mM MgSO ₄ , PH 7) Place the nitrocellulose sheet with the colonies up in another Petri dish containing Whatman paper presoaked in 1.5 ml. The petri dish is then placed in an oven at 37 ° C. The test is said to be positive if the colony turns blue on the membrane after 6 hours.
[0080]
Example 1: Construction of an expression vector for a fusion protein of PTB1 domain of FE65 and LexA protein
To screen a library using a dual hybrid system, it is necessary to fuse the PTB1 domain of FE65 (FE65PTB1) to the LexA protein. This fusion protein is expressed by the vector pLex9 in which a sequence (SEQ ID NO: 1-2) encoding the PTB1 domain of FE65 is introduced into the same open reading frame as the sequence corresponding to the LexA protein.
[0081]
A 448 bp DNA fragment (SEQ ID NO: 2) corresponding to amino acids 395 to 543 of human FE65 protein is obtained by PCR using the oligonucleotides of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and XmaI and SalI sites are introduced at the ends of the sequence. did. This PCR fragment was introduced between the XmaI and SalI sites of the multiple cloning site of plasmid plex9 downstream of the sequence corresponding to LexA to obtain vector pLex-FE65PTB1.
[0082]
The construct was confirmed by DNA sequencing. As a result of this confirmation, it was found that this fragment was not mutated during the PCR reaction and fused to the same open reading frame as the fragment corresponding to LexA.
[0083]
Example 2: Screening of brain cDNA fusion library by double hybrid method
The double hybrid method (Fields and Song, 1989) was used. The fusion library could be screened to identify clones that produced proteins fused to the transactivator domain of GAL4 capable of interacting with the PTB1 domain of FE65. By this interaction, a transactivator capable of inducing the expression of reporter genes His3 and LacZ in the L40 strain can be reconstituted. In order to perform this screening, a fusion library (Clontech®) made from human brain cDNA was selected.
[0084]
During screening it is necessary to keep each independent plasmid of the fusion library present in at least one yeast simultaneously with the plasmid pLex-FE65PTB1. In order to keep in this way, it is important to increase the transformation efficiency of yeast. To this end, 10 transformed cells per μg of DNA ⁵ A yeast transformation protocol giving individual efficiency was selected. In addition, yeast that had been previously transformed with plasmid pLex-FE65PTB1 was used because co-transformation of yeast with two different plasmids reduces this efficiency. This L40-Fe65PTB1 strain of phenotype His-, Lys-, Ade-, Leu- was transformed with 30 μg of plasmid DNA of the fusion library. After estimation from this DNA amount, 2.8 × 10 ⁶ Individual transformed cells are obtained, corresponding to a number slightly larger than the number of independent plasmids comprising the library. As a result, it is considered that almost the entire library plasmid was used for yeast transformation. Transformants capable of reconstitution of functional GAL4 transactivator were selected with YNB + Lys + Ade medium.
[0085]
After this selection, 97 phenotype His + clones were obtained. A β-galactosidase activity test was performed on these transformants, and the number of clones expressing the other reporter gene LacZ was examined. Of the 97 clones obtained, 27 were His +, βGal + double phenotypes and were found to express proteins capable of interacting with the PTB1 domain of FE65.
[0086]
Example 3: Isolation of a brain library plasmid from selected yeast clones
In order to identify proteins capable of interacting with the PTB1 domain of FE65, plasmids of the fusion library contained in the yeast selected during the double hybrid screening were extracted. In order to obtain a large amount of plasmid, it is necessary to transform Escherichia coli in advance with a DNA extract of a positive yeast strain before isolation. Since the library plasmid contained in this extract is a yeast / E. Coli shuttle plasmid, it can be easily replicated in bacteria.
[0087]
Plasmid DNA of bacterial colonies obtained after transformation with a yeast DNA extract was analyzed by restriction enzyme digestion and DNA fragment separation on an agarose gel. Analysis of 23 clones yielded 6 different restriction profiles, 2 of which were highly expressed. As is apparent from these results, at least 6 different plasmids were isolated during this screening, and we were able to construct a cDNA library contained in 2 plasmids (8 and 4 fold) with the highest expression level. Particular attention was paid to the derived DNA fragment.
[0088]
Example 4: Sequencing of identified plasmid inserts
Two plasmids with the highest expression levels were sequenced using a GAL4TA oligonucleotide (SEQ ID NO: 5) complementary to the 52 bp GAL4TA region from the EcoRI site near the insertion site of the brain cDNA library.
[0089]
When the sequence of the selected first plasmid was compared with the sequences contained in the data banks GENBank and EMBL (European Molecular Biology Lab), the cDNA sequence present in this first plasmid encoded the hnRNPL protein with the accession number NP_001524 / g45557645. It was found that the human gene has a degree of agreement exceeding 99% at the nucleotide level. The sequence of this gene cloned by the double hybrid system starts at nucleotide 346 corresponding to the 116th amino acid of the hnRNPL protein and ends at nucleotide 1392 corresponding to the 464th amino acid located at the last 58 amino acids ( SEQ ID NO: 6 and 7). As is clear from this result, the interaction domain of hnRNPL and human FE65 protein is contained in the central region of hnRNPL. This region contains an NPXY-type sequence known to be a binding consensus site for the PTB domain (Borg et al., 1996). The cloned hnRNPL sequence (SEQ ID NOs: 6 and 7) replaces guanine at position 748 with thymidine, resulting in the 250 th amino acid level of the sequence of SEQ ID NO: 6 corresponding to nucleotide 1093 and amino acid 365 of the complete hnRNPL protein. And glycine is replaced with cysteine, which differs from the published sequence (Pinol-Roma et al., 1989).
[0090]
When the sequence of the selected second plasmid was compared with the sequences contained in the data banks GENBank and EMBL (European Molecular Biology Lab), the cDNA sequences contained in this plasmid showed significant homology with the sequences contained in these data banks. Not found out.
[0091]
Significant homology was found with the protein of the sequence of SEQ ID NO: 4 of the patent application WO99 / 26961. However, the protein of the sequence of SEQ ID NO: 9, which is the subject of the present application, is different from the protein of the sequence of SEQ ID NO: 4 of the patent application WO99 / 26961. In particular, the protein of the sequence of SEQ ID NO: 9 is 42 amino acids shorter. There is some homology in other parts of the sequence, but there are also significant differences. In particular, amino acids 1, 48, 61, and 305 are different from the corresponding amino acids in the portion showing the predetermined homology of the protein of the sequence of SEQ ID NO: 4 of patent application WO99 / 26961.
[0092]
This 1275 nucleotide sequence (SEQ ID NOs: 8-9) has a termination codon at position 1012 and encodes a 337 amino acid peptide. Protein corresponding to this sequence FE 65 B inding P TB 1 (FE65 binding PTB1) The domain protein was named FEBP1.
[0093]
Example 5: Analysis of interaction specificity between PTB domain of FE65 and hnRNPL and FEBP1 proteins
To examine the specificity of the interaction between the PTB1 and PTB2 domains of the human FE65 protein and the hnRNPL and FEBP1 proteins, the plasmid pLex-FE65PTB2 encoding the PTB2 domain of FE65 fused to the LexA protein was used instead of the plasmid pLex-FE65PTB1. The interaction test was performed by the double hybrid method. If the PTB2 domain does not interact with these two proteins, it is considered to have interaction specificity with the PTB1 domain of FE65.
[0094]
To carry out this test, the L40 strain was transformed with the plasmid isolated during screening of the brain cDNA library and the plasmid pLex-FE65PTB2. An interaction specificity comparison test was also performed by transforming this strain with various plasmids as shown in Table 1. ΒGal activity tests were performed on cells transformed with various plasmids to detect protein-protein interactions. The plasmid combinations tested in the double hybrid system and thus the overall interaction is shown in Table 1. Plasmid combinations and corresponding vector species (pLex or pGAD) are shown in the “Plasmid combinations” column. The symbols “+” and “−” in the “interaction” column correspond to the result of the βGal test, and indicate whether or not a protein-protein interaction is detected, respectively.
[0095]
According to the test results (see Table 1), only the two plasmids isolated from the brain cDNA library and the yeast transformed with the plasmid pLex-FE65PTB1 show βGal + activity, and therefore, of the two PTB domains of FE65. It was found that only the PTB1 domain interacts with the central part of hnRNPL or a fragment of the FEBP1 protein. Since no interaction could be detected with the HaRasVal12 protein or the C-terminal domain of APP by the double hybrid method, the PTB1 domain of FE65 appears to interact specifically with hnRNPL and FEBP1.
[0096]
[Table 1]

[0097]
[Table 2]

[Sequence Listing]

Claims (12)

配列番号９の配列をもつポリペプチド。Polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: 9. 請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸。A nucleic acid encoding the polypeptide of claim 1 . 配列番号８の配列を含むことを特徴とする請求項２に記載の核酸。The nucleic acid of claim 2, characterized in that it comprises a sequence of SEQ ID NO: 8. 請求項２または３に記載の核酸を含むベクター。A vector comprising the nucleic acid according to claim 2 or 3 . 請求項２または３に記載の核酸を含む組換え欠損ウイルス。A recombination-defective virus comprising the nucleic acid according to claim 2 or 3 . 請求項１に記載のポリペプチドに対する抗体又は抗体フラグメント。 Antibody or antibody fragment preparative against the polypeptide of claim 1. 請求項１に記載の少なくとも１種のポリペプチド又は請求項６に記載の抗体を含む医薬組成物。At least one polypeptide or claim 6 pharmaceutical composition comprising an antibody according to the claim 1. 請求項２または３に記載の少なくとも１種の核酸もしくは請求項４または５に記載のベクターを含む医薬組成物。A pharmaceutical composition comprising at least one nucleic acid according to claim 2 or 3 or a vector according to claim 4 or 5 . ＦＥ６５タンパク質とｈｎＲＮＰＬタンパク質又は配列番号９の配列をもつポリペプチドの相互作用を少なくとも部分的に調節するための請求項７または８に記載の組成物。9. A composition according to claim 7 or 8 for at least partially modulating the interaction of FE65 protein and hnRNPL protein or polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: 9 . 神経変性病の治療に用いる請求項７または８に記載の組成物。The composition according to claim 7 or 8 , which is used for treatment of a neurodegenerative disease. 配列番号７の配列又は配列番号９の配列又はＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと相互作用できるそれらのフラグメントと結合することが可能な分子を選択する段階を含む、神経変性病の治療に有効である分子のスクリーニング又は特性決定方法。Screening for molecules that are effective in the treatment of neurodegenerative diseases, comprising selecting molecules capable of binding to the sequence of SEQ ID NO: 7 or the sequence of SEQ ID NO: 9 or fragments thereof that can interact with the PTB1 domain of FE65 Or a characterization method. 請求項１に記載のポリペプチドの製造方法であって、請求項２または３に記載の核酸又はウイルス、もしくは請求項４または３に記載のベクターを含む細胞を前記核酸の発現条件下で培養し、生産されたポリペプチドを回収する前記方法。 A method for producing the polypeptide according to claim 1 , wherein the cell containing the nucleic acid or virus according to claim 2 or 3 or the vector according to claim 4 or 3 is cultured under the expression conditions of the nucleic acid. The method for recovering the produced polypeptide .