JPH10179178A - ヒト７回膜貫通型レセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】ヒト７回膜貫通型レセプター（以下「ＨＢＭＵ
１４」と称す）の提供。 【解決手段】ヒトＨＢＭＢＵ１４ポリペプチドおよびそ
のようなＨＢＭＢＵ１４をコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）
ならびにそのようなポリペプチドを組み換え技術で製造
する方法を開示する。また、そのようなＨＢＭＢＵ１４
を細菌、糸状菌、原生動物およびウイルス感染症のよう
な感染症の治療に利用する方法も開示する。さらに、該
ポリペプチドの核酸配列における突然変異および濃度の
変化を検出する診断検定法も開示する。さらに、宿主に
おけるＨＢＭＢＵ１４をコードするポリヌクレオチドに
おける突然変異の検出およびポリペプチドのレベルの変
化の検出のための診断検定法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一部、新たに同定
されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチド、このようなポリヌク
レオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体、この
ようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドならびにそ
れらの変種および誘導体の産生法、このようなポリペプ
チドのアゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにこの
ようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、変種、誘導
体、アゴニストおよびアンタゴニストの使用に関する。
特に、これらおよびその他の点で、本発明は、ヒト７−
回膜貫通型（７−トランスメンブラン：７ＴＭ）レセプ
ター、ことに、以下で「ＨＢＭＢＵ１４」と称するレセ
プターのポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関す
る。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用の阻
害または活性化に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】多く
の医学的に重要な生物学的プロセスには、Ｇ−蛋白質お
よび／または第二のメッセンジャー、例えば、ｃＡＭＰ
が関係するシグナル導入経路に関与する蛋白質が介在す
ることが十分に確立されている［Lefkowitz，Nature，3
51：353-354(1991)］。本明細書において、これらの蛋
白質を、Ｇ−蛋白質を伴う経路に関与する蛋白質または
ＰＰＧ蛋白質と称する。これらの蛋白質の例は、ＧＰＣ
レセプター、例えば、アドレナリン作動物質およびドー
パミンに対するもの［Kobilka，B.K. et al.，Proc．Na
tl．Acad．Sci．USA，84：46-50(1987)；Kobilka，B.K.
et al.，Science, 238：650-656(1987)；Bunzow，J.R.
et al.，Nature、336：783-787(1988)］、Ｇ−蛋白質
それ自体、エフェクター蛋白質、例えば、ホスホリパー
ゼＣ、アデニル酸シクラーゼ、およびホスホジエステラ
ーゼ、および作動蛋白質、例えば、蛋白キナーゼＡおよ
び蛋白キナーゼＣを包含する［Simon，M.I.，Science，
252：802-808(1991)］。

【０００３】例えば、シグナル導入の一形態において、
ホルモンの結合した結果が、細胞内の酵素、アデニルシ
クラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素活性化は
ヌクレオチドＧＴＰの存在に依存し、ＧＴＰもホルモン
結合に影響を与える。Ｇ−蛋白質はホルモンレセプター
をアデニル酸シクラーゼと結合させる。Ｇ−蛋白質はホ
ルモンレセプターにより活性化された場合にＧＴＰと結
合ＧＤＰを交換することが判明した。ＧＴＰを有する形
態が今度は活性化アデニル酸シクラーゼと結合する。Ｇ
−蛋白質自身により触媒されるＧＴＰのＧＤＰへの加水
分解はＧ−蛋白質をその基底不活性状態に戻す。このよ
うに、Ｇ−蛋白質は、レセプターからエフェクターへの
シグナルを中継する中間体として、またシグナルの存続
期間を調節する時計としての２つの役割を果たす。

【０００４】Ｇ−蛋白質結合レセプターの膜蛋白遺伝子
の超科（スパーファミリー）は７つの推定トランスメン
ブラン・ドメインを有するものとして特徴付けられてい
る。該ドメインは細胞外または細胞質ループにより結合
するトランスメンブランα−ヘリックスを表すと考えら
れている。約２０ないし３０個のアミノ酸のこれら７個
の保存疎水性鎖は、少なくとも８個の分岐する親水性ル
ープと結合する。ほとんどのＧ−蛋白質結合レセプター
は、機能的蛋白質構造を安定化させると考えられるジス
ルフィド結合を形成する最初の２個の細胞外ループのそ
れぞれに１個の保存システイン残基を有する。７個のト
ランスメンブラン領域は、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、Ｔ
Ｍ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と命名されている。
ＴＭ３はシグナル導入に関与する。

【０００５】Ｇ−蛋白質結合レセプターは、ホルモンレ
セプター、ウイルスレセプター、成長因子レセプターお
よび神経レセプターのような広範な生物学的に活性なレ
セプターを包含する。結合レセプターのＧ−蛋白質科は
精神病および神経学的障害の治療に用いられる神経弛緩
薬と結合するドーパミンレセプターを包含する。この科
に属する構成要素の他の例は、限定するものではない
が、カルシトニン、アドレナリン、エンドセリン、 ｃ
ＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン、アセチルコリン、セ
ロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵巣刺激
ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−１レセプター、
ロドプシン、臭物質、サイトメガロウイルスレセプター
などを包含する。

【０００６】システイン残基のホスホリル化および脂質
化（パルミチル化またはファルネシル化）はいくつかの
Ｇ−蛋白質結合レセプターのシグナル導入に影響を与え
うる。ほとんどのＧ−蛋白質結合レセプターは第三の細
胞質ループおよび／またはカルボキシ末端内に潜在的な
ホスホリル化部位を含有する。β−アドレノレセプター
などのいくつかのＧ−蛋白質結合レセプターについて、
蛋白質キナーゼＡおよび／または特異性レセプターキナ
ーゼによるホスホリル化はレセプター脱感作を媒介す
る。

【０００７】いくつかのレセプターに関して、Ｇ−蛋白
質結合レセプターのリガンド結合部位はいくつかのＧ−
蛋白質結合レセプタートランスメンブラン・ドメインに
より形成される親水性ソケットを含み、このソケットは
Ｇ−蛋白質結合レセプターの疎水性残基により囲まれて
いる。各Ｇ−蛋白質結合レセプタートランスメンブラン
ヘリックスの親水性部位は内側に向き、極性リガンド結
合部位を形成すると考えられる。ＴＭ３はＴＭ３アスパ
ラギン酸塩残基を含むなどリガンド結合部位を有するの
でいくつかのＧ−蛋白結合レセプターに関与する。ＴＭ
５セリン、ＴＭ６アスパラギンおよびＴＭ６またはＴＭ
７フェニルアラニンまたはチロシンもリガンド結合に関
与する。

【０００８】Ｇ−蛋白質結合レセプターは細胞内でヘテ
ロトリマーＧ−蛋白質により種々の細胞内酵素、イオン
チャンネルおよびトランスポーターと結合しうる［John
son，et al.，Endoc.，Rev.，10：317-331(1989)参
照］。異なるＧ−蛋白質α−サブユニットは特定のエフ
ェクターを優先的に刺激して、細胞内の種々の生物学的
機能を調節する。Ｇ−蛋白質結合レセプターの細胞質残
基のホスホリル化はいくつかのＧ−蛋白質結合レセプタ
ーのＧ−蛋白質結合の調節についての重要なメカニズム
と見なされている。Ｇ−蛋白質結合レセプターは哺乳動
物宿主内の多数の部位において見出される。

【０００９】過去１５年にわたり、７−トランスメンブ
ラン（７−ＴＭ）レセプターを標的とした１５０近くの
治療剤が成功裏に上市されている。これは、これらのレ
セプターが治療標的としての確立、証明された歴史を有
していることを示している。明らかに、機能不全または
疾患の予防、改善または矯正において役割を果たす、さ
らなるレセプターの同定および特徴付についての必要性
がある。これらの機能不全、疾患には、限定するもので
はないが、とりわけ、細菌、糸状菌、原生動物およびウ
イルス感染、特に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２によっ
て起こる感染症のような感染症、疼痛、癌、食欲不振、
病的飢餓、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血
圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰
瘍、アレルギー、良性前立腺肥大症および、不安、***
症、躁鬱病、せん妄、痴呆または重度精神薄弱のような
精神病および神経疾患ならびにハンチントン病、ジルド
ゥラトゥーレット症候群のような運動異常が包含され
る。本発明のポリペプチドは保存７−トランスメンブラ
ン残基を有し、公知のＧ−蛋白質レセプターに相同なア
ミノ酸配列を有する。

【００１０】

【課題を解決するための手段】かくして、本発明の一つ
の目的は、ポリペプチド、とりわけ、図１〜図４に示す
アミノ酸配列と、ＨＴＤＡＦ８８レセプター（ジーンバ
ンクより入手）や単球化学誘因物質蛋白質−１（ＭＣＰ
−１）レセプターのような他の蛋白質の公知アミノ酸配
列の間の相同性によって新規ＨＢＭＢＵ１４として同定
されたポリペプチドを提供することである。推定ＨＢＭ
ＢＵ１４レセプター蛋白質はＧ−蛋白質結合レセプター
に共通するいくつかの特徴を有している。もっとも卓越
したものは、各々約２０〜３０個のアミノ酸の７個の疎
水性領域の存在であり、これはレセプターのＧ−蛋白質
結合超科に見られる７−トランスメンブラン構造トポロ
ジーを与える膜スパンニング・ドメインを表すようであ
る。本発明のさらなる目的は、ＨＢＭＢＵ１４をコード
するポリヌクレオチド、特に、本明細書でＨＢＭＢＵ１
４と命名するポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを提供するものである。本発明のこの態様の特に好ま
しい具体例は、図１〜図４（配列番号１および２）に示
す配列におけるヒトＨＢＭＢＵ１４をコードする領域か
らなるポリヌクレオチドである。本発明のこの態様によ
れば、ＡＴＣＣ受託番号９８２２６に含まれるヒトｃＤ
ＮＡから発現できるマチュア・ポリペプチドをコードす
る単離された核酸分子が提供される。本発明のこの態様
によれば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびそ
のフラグメンを含むヒトＨＢＭＢＵ１４をコードする単
離された核酸分子が提供され、この態様のさらなる具体
例では、生物学的、診断的、臨床的または治療的に有用
なそれらの変種、類縁体または誘導体あるいは変種、類
縁体または誘導体のフラグメンを含むこれらのフラグメ
ントが提供される。本発明のこの態様の特に好ましい具
体例は、ヒトＨＢＭＢＵ１４の天然の対立遺伝子変種で
ある。

【００１１】また、本発明の目的は、治療目的、例え
ば、限定するものではないが、とりわけ、細菌、糸状
菌、原生動物およびウイルス感染、特に、ＨＩＶ−１お
よびＨＩＶ−２によって起こる感染症のような感染症、
疼痛、癌、食欲不振、病的飢餓、喘息、パーキンソン
病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、狭
心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大症
および、不安、***症、躁鬱病、せん妄、痴呆または重
度精神薄弱のような精神病および神経疾患ならびにハン
チントン病、ジルドゥラトゥーレット症候群のような運
動異常が包含される機能不全または疾患の治療に使用で
きるＨＢＭＢＵ１４ポリペプチド、特に、ヒトＨＢＭＢ
Ｕ１４ポリペプチドを提供することである。本発明のこ
の態様に従い、本明細書でＨＢＭＢＵ１４と称されるヒ
ト由来の新規ポリペプチドならびにその生物学的、診断
的または治療的に有用なフラグメント、変種および誘導
体、フラグメントの変種および誘導体、これらの類縁体
が提供される。本発明のこの態様の特に好ましい具体例
は、ヒトＨＢＭＢＵ１４遺伝子の天然の対立遺伝子によ
ってコードされるヒトＨＢＭＢＵ１４の変種である。本
発明の他の態様においては、本発明のレセプターポリペ
プチドと結合し、それを活性化するかまたは抑制する化
合物およびレセプターリガンドのスクリーニング法が提
供される。本発明のさらに別の目的は、前記のポリペプ
チド、ポリペプチドフラグメント、変種および誘導体、
変種および誘導体のフラグメントならびに類縁体の産生
法を提供することである。この態様の好ましい具体例に
おいては、発現可能に組み込まれた外因的に誘導された
ヒトＨＢＭＢＵ１４をコードする塩基配列を含む宿主細
胞を、宿主中でのヒトＨＢＭＢＵ１４の発現のための条
件下で培養し、発現された該ポリペプチドを回収するこ
とからなる前記のＨＢＭＢＵ１４ポリペプチドの産生法
が提供される。本発明のさらに別の目的により、前記ポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドを、とりわけ、研
究、生物学的、臨床的および治療目的に利用する生産
物、組成物、プロセスおよび方法が提供される。

【００１２】本発明のこの態様の好ましい具体例によれ
ば、とりわけ、ＨＢＭＢＵ１４ポリペプチドまたはＨＢ
ＭＢＵ１４コード用ｍＲＮＡの測定による細胞における
ＨＢＭＢＵ１４発現の評価；本明細書に開示されるＨＢ
ＭＢＵ１４ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに細胞
を曝すことによる、限定するものではないが、とりわ
け、細菌、糸状菌、原生動物およびウイルス感染、特
に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２によって起こる感染症
のような感染症、疼痛、癌、食欲不振、病的飢餓、喘
息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿
閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、
良性前立腺肥大症および、不安、***症、躁鬱病、せん
妄、痴呆または重度精神薄弱のような精神病および神経
疾患ならびにハンチントン病、ジルドゥラトゥーレット
症候群のような運動異常が包含される機能不全または疾
患のin vitro、ex vivoまたはin vivoにおける処置；Ｈ
ＢＭＢＵ１４遺伝子における欠損のような遺伝的変形お
よび欠陥の分析；および生物にＨＢＭＢＵ１４ポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドを投与するＨＢＭＢＵ１４
機能の増大またはＨＢＭＢＵ１４機能不全の改善のため
の生産物、組成物および方法が提供される。本発明のさ
らに別の具体例により、ＨＢＭＢＵ１４の過少発現に関
連する症状の治療に、本発明のレセプターポリペプチド
を刺激するための活性化化合物を用いる方法が提供され
る。本発明のさらに別の態様により、ＨＢＭＢＵ１４の
過剰発現に伴う症状の治療に、そのための抑制化合物を
用いる方法が提供される。

【００１３】本発明のさらに別の態様により、天然に存
在しない合成、単離および／または組み換えＨＢＭＢＵ
１４レセプターポリペプチドであって、少なくとも１つ
の本発明のＨＢＭＢＵ１４の少なくとも１つのドメイン
のフラグメント、コンセンサスフラグメントおよび／ま
たは保存アミノ酸置換を有する配列であって、レセプタ
ーがＨＢＭＢＵ１４リガンドと結合するか、またはＨＢ
ＭＢＵ１４リガンド結合を定量的または定性的に調節す
るようなポリペプチドが提供される。本発明のさらに別
の態様により、診断、治療および／または研究用に用い
られる、合成または組み換えＨＢＭＢＵ１４ポリペプチ
ド、その保存的置換および誘導体、それに対する抗体、
抗イディオタイプ抗体、リガンドと結合させるかまたは
その予想される生物学的性質によりリガンド結合を調節
することによりＨＢＭＢＵ１４機能の潜在的モジュレー
ターとして有用な組成物および方法が提供される。

【００１４】本発明のさらに別の目的は、レセプタータ
イプおよびサブタイプとして、種々のＨＢＭＢＵ１４ま
たはそのフラグメントを抑制または模倣するように設計
された、合成、単離または組換えポリペプチドを提供す
ることである。本発明のこれらの、またさらに別の態様
の具体例により、ヒトＨＢＭＢＵ１４配列にハイブリダ
イズするプローブが提供される。本発明のこの態様のさ
らなる好ましい態様においては、ＨＢＭＢＵ１４ポリペ
プチドに対する抗体を提供する。この点で特に好ましい
具体例においては、抗体はヒトＨＢＭＢＵ１４に対して
非常に選択的である。本発明のもう一つ別の態様におい
ては、ＨＢＭＢＵ１４アゴニストが提供される。好まし
いアゴニストは、ＨＢＭＢＵ１４を模倣する分子、ＨＢ
ＭＢＵ１４結合分子またはレセプター分子に結合する分
子およびＨＢＭＢＵ１４誘発応答の引き出しまたは増大
をする分子である。また、好ましいアゴニストは、ＨＢ
ＭＢＵ１４またはＨＢＭＢＵ１４ポリペプチド、または
ＨＢＭＢＵ１４活性の他のモジュレーターと相互反応
し、それによりＨＢＭＢＵ１４の１つの効果またはＨＢ
ＭＢＵ１４の１つ以上の効果を発効または増大させる分
子である。本発明の他の態様によれば、ＨＢＭＢＵ１４
アンタゴニストが提供される。好ましいアンタゴニスト
は、ＨＢＭＢＵ１４を模倣し、ＨＢＭＢＵ１４レセプタ
ーまたは結合分子に結合するが、１つまたは１つ以上の
ＨＢＭＢＵ１４誘発応答を引き出さないものである。ま
た、好ましいアンタゴニストは、ＨＢＭＢＵ１４と結合
し、または相互反応し、１つまたは１つ以上のＨＢＭＢ
Ｕ１４の効果を阻害するか、ＨＢＭＢＵ１４の発現を防
止する分子である。本発明のさらなる態様においては、
細胞にin vitro、ex vivoおよびin vivoで、あるいは多
細胞生物に投与するＨＢＭＢＵ１４ポリヌクレオチドま
たはＨＢＭＢＵ１４ポリペプチドからなる組成物を提供
する。本発明のこの態様の特に好ましい具体例において
は、該組成物は、疾患の治療のために宿主生物において
ＨＢＭＢＵ１４ポリペプチドを発現させるためのＨＢＭ
ＢＵ１４ポリヌクレオチドからなる。この点で特にこの
ましいのは、ＨＢＭＢＵ１４の異常な内因性活性に伴う
機能不全治療用のヒト患者における発現である。本発明
の他の目的、特徴、利点および態様は本明細書の以下の
記載から当業者に自明である。しかし、以下の記載、実
施例は本発明の好ましい具体例であり、例示だけのもの
である。以下の記載および本明細書の他の開示から、本
明細書に記載の精神および範囲内において、種々の変形
および修正ができることは当業者に自明であろう。図面
も本発明の具体例を示すもので、例示であり、本明細書
に開示の発明をそれに限定するものではない。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下の説明は、本明細書でよく使
用する用語、特に実施例で使用する用語の理解を容易に
するためのもので、便宜のためのものであって、発明を
限定するものではない。ＤＮＡの「消化」は、限定する
ものではないが、ＤＮＡのある配列のみに作用する制限
酵素のような酵素によるＤＮＡの接触切断を言う。本明
細書で述べる種々の制限酵素は商業的に入手でき、その
反応条件、コファクターおよび使用のための他の要件は
当業者に公知であり、日常的である。分析目的には、典
型的には、プラスミドまたはＤＮＡの１μｇを、約２０
μｌの反応緩衝液中、約２単位の酵素で消化する。プラ
スミド構築用のＤＮＡフラグメントの単離の目的には、
典型的には、５〜５０μｇのＤＮＡを比較的大容量中、
２０〜２５０単位の酵素で消化する。個々の制限酵素に
ついての適当な緩衝液および基質の量は、以下に挙げる
ような標準的な実験室マニュアルに記載されており、ま
た、商業的供給者により特定されている。通常、３７℃
で約１時間のインキュベーション時間が使用されるが、
条件は、標準的操作、供給者の指示および反応の詳細に
従って変更できる。消化後、当業者に日常的な、よく知
られた方法を使用し、アガロースまたはポリアクリルア
ミドゲルでの電気泳動により、反応を分析し、フラグメ
ントを精製できる。

【００１６】「遺伝要素」は、一般に、ポリペプチドを
コードする領域または、複製、転写または翻訳を調節す
る領域からなるポリヌクレオチドまたは宿主において該
ポリペプチドを発現するために重要なその他の方法、あ
るいは該ポリペプチドをコードする領域およびそれに機
能可能に連結した発現を調節する領域からなるポリヌク
レオチドを意味する。遺伝要素は、エピソーム要素とし
て、すなわち、宿主細胞ゲノムとは物理的に独立した分
子として複製するベクターに含まれていてもよい。これ
らは、真核細胞でのメトトレキセート選択によるトラン
スフェクトされたＤＮＡの増幅の間に起こるようなミニ
クロモソームに含まれていてもよい。また、遺伝要素
は、天然状態ではなく、むしろ、単離、クローニングお
よび精製されたＤＮＡ、とりわけ、ベクターの形での宿
主細胞への導入のような操作された後の宿主細胞に含ま
れていてもよい。「単離」は、その天然の状態から「ヒ
トの手により」変えられこと、すなわち、天然に存在す
る場合、その最初の環境から変えられ、もしくは取り出
され、または両方を意味する。例えば、生体に天然に存
在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」
されていないが、その天然系における共存物質から分離
された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本
明細書で使用する用語として、「単離」されている。例
えば、ポリヌクレオチドに関し、「単離」なる用語は天
然のクロモソームおよび細胞から分離されていることを
意味する。

【００１７】単離の一部または単離に続いて、かかるポ
リヌクレオチドは、突然変異誘発のために、および、例
えば、宿主における増殖または発現のために、ＤＮＡの
ような他のポリヌクレオチドと結合して融合蛋白質を形
成することができる。単離されたポリヌクレオチドは、
単独でまたはベクターのような他のポリヌクレオチドと
結合させて培養中の宿主細胞または生物全体に導入でき
る。培養中の宿主細胞または生物全体へ導入した宿主細
胞は、それらが天然の形態または環境にないので、本明
細書で使用するように、そのＤＮＡもやはり、単離され
ている。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
は、培地、処方、例えば、化学または酵素反応用の細
胞、組成物または溶液へのポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチド導入のための溶液のような組成物にあってもよ
く、これらも天然の組成物ではなく、本明細書で使用す
るような用語の意味における単離されたポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドがそのなかに存在する。「連結」
は、２つ以上のポリヌクレオチド、最も頻繁には二本鎖
ＤＮＡ間のホスホジエステル結合の形成方法を言う。連
結の技術はよく知られており、連結のためのプロトコー
ルは、例えば、Sambrook et al.，Molecular Cloning：
A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor，
N.Y.(1989)（以下、サムブルックらと称する）のような
標準的な実験室マニュアルや文献に記載されている。

【００１８】「オリゴヌクレオチド」とは、比較的短い
ポリヌクレオチドを言う。しばしば、この用語は、一本
鎖ＤＮＡを言うが、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、ＲＮ
Ａ：ＤＮＡハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡ等も言うこ
とができる。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチド
のようなオリゴヌクレオチドは、しばしば、自動化オリ
ゴヌクレオチド・シンセサイザーで実施されるような化
学的方法により合成される。しかし、オリゴヌクレオチ
ドは、in vitro組み換えＤＮＡ介在技術、細胞や生物に
おけるＤＮＡの発現を含む他の種々の方法で作成でき
る。最初に、化学的合成ＤＮＡは、典型的には５'ホス
フェートなしに得られる。かかるオリゴヌクレオチドの
５'末端は、典型的には組み換えＤＮＡ分子の形成に使
用されるＤＮＡリガーゼをしようする連結反応によるホ
スホジエステル結合形成用の基質ではない。そのような
オリゴヌクレオチドの連結が所望の場合は、キナーゼお
よびＡＴＰを使用するような標準的な技術によってホス
フェートを付加することができる。化学的合成オリゴヌ
クレオチドの３'末端は、一般に遊離のヒドロキシル基
を有し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼの存在
下、他のオリゴヌクレオチドのような他のポリヌクレオ
チドと容易にホスホジエステル結合を形成する。よく知
られているごとく、この反応は、所望により、連結前に
該他のポリヌクレオチドの５'ホスフェートを除去する
ことにより選択的に防止できる。

【００１９】「プラスミド」は、それらの宿主細胞の染
色体の一部でなしに、安定に受け継がれる遺伝要素であ
る。それらはＤＮＡまたはＲＮＡからなってよく、鎖状
でも環状でもよい。プラスミドは、細胞複製の間に分子
の複製と安定な受け継ぎを確保するそれら分子をコード
し、医学的、農業的および環境的にかなり重要な産物を
コードしうる。例えば、プラスミドは、病原性細菌の毒
性を大いに増加させるトキシンをコードする。また、プ
ラスミドは、抗生物質に耐性を与える遺伝子もコードす
る。プラスミドは、組み換え遺伝子のクローンおよび発
現にベクターとして分子生物学において広く使用されて
いる。プラスミドは、一般に、本明細書では、当業者に
なじみのある標準的な命名法に従い、前に付く小文字の
ｐおよび／またはそれに続く大文字および／または数字
で命名される。本明細書に開示の出発プラスミドは、商
業的に入手可能なもの、未制限ベースで公に入手可能な
ものであり、またはよく知られた、文献記載の日常的方
法により、入手可能なプラスミドから構築できる。本発
明により使用できる多くのプラスミドおよび他のクロー
ニングまたは発現ベクターは、当業者によく知られてお
り、容易に入手できる。さらに、当業者は、本発明で使
用するのに適した他のプラスミドをいくらでも容易に構
築できる。本発明において、かかるプラスミドならびに
他のベクターの性質、構築および使用は、以下の開示か
ら、当業者に容易に明らかとなろう。

【００２０】「ポリヌクレオチド」は、一般に、いずれ
ものポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌク
レオチドを言い、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修
飾ＲＮＡまたはＤＮＡでよい。すなわち、例えば、本明
細書で使用するポリヌクレオチドは、とりわけ、一本鎖
および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合し
たＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二
本鎖領域の混合したＲＮＡ、一本鎖でも、典型的には二
本鎖でもまたは一本鎖および二本鎖領域が混合してもよ
いＤＮＡおよびＲＮＡからなるハイブリッド分子を言
う。また、本明細書で使用するポリヌクレオチドは、Ｒ
ＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方か
らなる三本鎖領域も言う。そのような領域の鎖は同じ分
子からでも、異なる分子からでもよい。該領域には、１
つ以上の分子の全てが含まれてもよいが、より典型的に
は、いくつかの分子の領域のみが含まれる。トリプルヘ
リックス領域の分子の１つは、しばしば、オリゴヌクレ
オチドである。本明細書で使用するように、ポリヌクレ
オチドなる用語には、前記のごとく、１つ以上の修飾塩
基を含むＤＮＡおよびＲＮＡが包含される。すなわち、
安定性またはその他の理由で修飾された主鎖を有するＤ
ＮＡまたはＲＮＡは、本明細書で言うポリヌクレオチド
である。さらに、例えば、イノシンのような通常でない
塩基またはトリチル化塩基のような修飾塩基を含むＤＮ
ＡまたはＲＮＡも、本明細書で言うポリヌクレオチドで
ある。明らかなごとく、当業者に公知の多くの有用な目
的に供すことができるように、非常に多くの修飾がＤＮ
ＡおよびＲＮＡに加えられている。本明細書で使用する
ポリヌクレオチドなる用語には、化学的、酵素的または
代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチドや、とりわ
け、単純な、および複雑な細胞を包含するウイルスおよ
び細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特徴の化学的形態が含まれ
る。

【００２１】本明細書で使用する「ポリペプチド」に
は、以下に記載するような全てのポリペプチドが包含さ
れる。ポリペプチドの基本構造はよく知られており、当
該分野の多数の教科書および他の刊行物に記載されてい
る。この点で、本明細書で用いるこの用語は、ペプチド
結合で直鎖状に相互に結合した２つ以上のアミノ酸から
なるいずれものペプチドまたは蛋白質を言う。ここで使
用するごとく、この用語は、例えば、ペプチドの分野で
通常、オリゴペプチドおよびオリゴマーと称される短鎖
および、当該分野で蛋白質と総称される多くの型のある
長鎖の両方を言う。明らかなごとく、ポリペプチドは、
しばしば、通常２０個の天然アミノ酸と称される２０個
のアミノ酸以外のアミノ酸を含み、末端アミノ酸を含
め、それらの多くのアミノ酸は、与えられたポリペプチ
ドにおいて、プロセッシングやその他のポスト翻訳修飾
のような天然のプロセスまたは当該分野でよく知られた
化学的修飾技術によって修飾されていてもよい。ポリペ
プチドにおいて天然に起こる普通の修飾ですら、ここに
全て記載するのには多すぎるが、それらは基本的な教科
書、より詳細な論文および多くの研究文献によく記載さ
れており、当該分野でよく知られている。本発明のポリ
ペプチドに存在してもよい公知の修飾のいくつかの名前
を挙げると、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル
化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム基の共有結
合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結
合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイ
ノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合
形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、
ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシ
ル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシ
ル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋
白分解プロセッシング、ホスホリル化、プレニル化、ラ
セミ化、セレノイル化、硫化、アルギニル化のような蛋
白質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ介在付加およびユビキチ
ン化がある。

【００２２】このような修飾は当業者によく知られてお
り、科学文献に非常に詳細に記載されている。例えば、
いくつかの特に普通の修飾であるグリコシル化、脂質結
合、硫化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒ
ドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化は、例えば、PR
OTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，2ndE
d.，T．E．Creighton，W．H．Freeman and Company，Ne
w York，1993のような最も基本的な教科書に記載されて
いる。この主題についての多くの詳細な総説が入手可能
であり、例えば、POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFIC
ATION OF PROTEINS，B．C．Johnson，Ed.，Academic Pr
ess，New York，1983のWold，F.，"Posttranslational
Protein Modifications：Perspectives and Prospect
s"，pp.1-12；Seifter et al.，"Analysis for protein
modifications and nonprotein cofactors", Meth．En
zymol.，1990，182:626-646；Rattan et al.，"Protein
Synthesis：Posttranslational Modifications and A
ging"，Ann. N.Y．Acad．Sci.，1992，663:48-62にあ
る。明らかなごとく、よく知られているように、また、
前記したように、ポリペプチドは必ずしも全部が直鎖状
ではない。例えば、ユビキチン化によるごとく、分岐し
ていてもよく、また一般に天然のプロセッシング事象や
天然には生じないヒトの操作によりもたらされた事象を
含むポスト翻訳事象の結果としての分岐した、または、
分岐しない環状でもよい。環状、分岐および分岐した環
状ポリペプチドは、非翻訳天然プロセスよっても、全く
の合成法によっても合成できる。

【００２３】ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ
またはカルボキシ末端を含め、修飾は、ポリペプチドの
いずれの部位でも起こり得る。事実、共有修飾によるポ
リペプチドにおけるアミノまたはカルボキシ基または両
方のブロックは天然に、また、合成ポリペプチドに普通
に起きるもので、そのような修飾が本発明のポリペプチ
ドに存在していえてもよい。例えば、プロセッシング前
にイー・コリ（E．coli）で作られるポリペプチドのア
ミノ末端残基は、ほぼ変わりなくＮ−ホルミルメチオニ
ンである。ポリペプチドにしばしば起きる修飾は、それ
がいかに作られたかの関数となる。例えば、宿主中でク
ローンした遺伝子の発現により作られたポリペプチドに
ついて、大部分の修飾の性質および程度は、宿主細胞の
ポスト翻訳修飾能およびポリペプチドアミノ酸配列に存
在する修飾シグナルによって決定される。例えば、よく
知られているごとく、グリコシル化は、イー・コリのよ
うな細菌宿主においては、しばしば生じない。したがっ
て、グリコシル化が所望の場合は、ポリペプチドはグリ
コシル化宿主、一般には真核細胞で発現させるべきであ
る。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物細胞と同様のポス
ト翻訳グリコシル化を行うので、その理由で、とりわ
け、グリコシル化の天然のパターンを有する哺乳動物蛋
白質を効率よく発現させるために昆虫細胞発現系が開発
されている。同様な考慮が他の修飾にも適用される。

【００２４】明らかなごとく、同じタイプの修飾が、与
えられたポリペプチドにおいて、同じまたは異なる程度
にいくつかの部位に存在してもよい。また、与えられた
ポリペプチドが多くのタイプの修飾を含んでもよい。一
般に、本明細書で使用するように、ポリペプチドなる用
語は、全てのこのような修飾、特に、宿主細胞中でポリ
ヌクレオチドの発現により合成されたポリペプチドに存
在する修飾を包含する。本明細書で使用するポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの「変種」なる用語は、各
々、対照となるポリヌクレオチドまたはポリペプチドと
は異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。
この感覚での変種は、以下および本明細書のあらゆる部
分に詳細に記載されている。

【００２５】（１）対照ポリヌクレオチドとは塩基配列
の異なるポリヌクレオチド 一般に、対照および変種の塩基配列が全体として非常に
類似しており、多くの領域で同一となる程に相違が限定
されている。以下に示すように、変種における塩基配列
の変化はサイレントでありうる。すなわち、ポリヌクレ
オチドによってコードされるアミノ酸を変化させえな
い。変化がこのタイプのサイレント変化に限定される場
合、変種は対照と同じアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードする。また、以下に示すごとく、変種の塩基
配列は、対照ポリヌクレオチドによりコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列を変えうる。このようなヌクレ
オチドの変化は、以下に議論するように、対照配列によ
ってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置
換、付加、欠失、融合および短縮をもたらす。

【００２６】（２）対照ポリペプチドとアミノ酸配列の
異なるポリペプチド 一般に、対照および変種の配列が全体として非常に類似
しており、多くの領域で同一のなる程に相違が限定され
ている。変種および対照ポリペプチドは、１つ以上の置
換、付加、欠失、融合および短縮、またはこれらのいず
れかの組み合わせにより、アミノ酸配列が相違しうる。
本明細書で使用する「融合蛋白質」なる用語は、２つ
の、しばしば関係のない融合した遺伝子またはそのフラ
グメントによりコードされる蛋白質である。欧州特許出
願公開ＥＰ−Ａ−０４６４５３３（カナダ特許出願第２
０４５８６９号の対応出願）はイムノグロブリン分子の
ある領域の種々の部分と、他のヒト蛋白質またはその部
分とからなる融合蛋白質を開示している。多くの場合、
融合蛋白質の一部としてイムノグロブリンＦc領域を使
用することが治療および診断に使用するのに有利であ
り、例えば、薬物動態学的性質の改善をもたらす（ＥＰ
−Ａ−０２３２２６２参照）。したがって、融合蛋白質
の２つの成分を化学的または酵素的に切断できる連結領
域で連結することが要望されうる。一方、ある用途に
は、融合蛋白質が発現され、検出され、精製された後に
Ｆc部分を除くことができるよう望まれる。したがっ
て、融合蛋白質の２つの成分を化学的または酵素的に切
断できる連結領域で連結することが望まれうる。Ｆc部
分が治療または診断に使用するのに障害となることが証
明された場合、例えば、融合蛋白質を免疫用の抗体とし
て使用する場合に、これが問題となる。医薬の発見にお
いて、例えば、hＩＬ−５のようなヒト蛋白質が、hＩＬ
−５のアンタゴニスト同定のための高処理量スクリーニ
ング検定において使用するためＦc部分と融合された。
D．Bennette et al.，Journal of Molecular Recogniti
on，8:52-58(1995)およびK．Johanson et al.，The Jou
rnal of Biological Chemistry，270(16):9459-9471(19
95)参照。

【００２７】かくして、本発明はまた、ＨＢＭＢＵ１４
またはその一部、およびその種々のサブクラスのイムノ
グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖
または軽鎖の定常部の種々の部分からなる遺伝子操作し
た可溶性融合蛋白質にも関する。イムノグロブリンとし
て好ましいのは、そのヒンジ部で融合が起こるヒトＩｇ
Ｇ、特にＩｇＧ１の重鎖の定常部である。１つの具体例
では、Ｆｃ部分は、血液凝固因子Ｘａで切断できる切断
配列の組み込みで簡単に除去できる。さらに、本発明
は、遺伝子工学によるこれらの融合蛋白質の製造方法お
よびそれらの診断、治療への使用に関する。本発明のさ
らなる態様はまた、そのような融合蛋白質をコードする
ポリヌクレオチドにも関する。膜結合レセプターは融合
蛋白質の形成に特に有用である。そのようレセプター
は、一般に、３つの明瞭な構造領域、細胞外ドメイン、
トランスメンブラン・ドメインおよび細胞質ドメインの
３つの明瞭な構造領域を有することにより特徴付けられ
る。本発明は、融合蛋白質の成分として、これらの領域
の１つ以上を使用するものである。そのような融合蛋白
質技術の他の例は、国際公開公報ＷＯ９４／２９４５８
およびＷＯ９４／２２９１４に見られる。「結合分子」
（あるいは「分子相互反応」または「レセプター成分因
子」）なる用語は、リガンド以外のものを含め、本発明
のレセプターポリペプチドに特異的に結合するか、相互
反応する分子を言う。かかる結合分子も本発明の一部で
ある。結合分子はまた、本発明のポリペプチドに特異的
に結合する抗体または抗体誘導試薬のような非天然のも
のでもよい。

【００２８】公知のごとく、２つのポリペプチドの「類
似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびそ
の保存構成アミノ酸を第２のポリペプチドの配列と比較
することにより決定される。さらに、公知のごとく、
「同一性」は、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌ
クレオチド配列間の、それら配列の２つの長さの間のマ
ッチの同一性によって決定される配列の関連の度合を意
味する。同一性および類似性は両方共に、容易に計算で
きる［COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk，A．
M.，ed.，Oxford，University Press，New York, (198
8)；BIOCOMPUTING：INFORMATICS AND GENOME PROJECTS,
Smith，D．W.，ed.，Academic Press，NewYork，(199
3)；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，PART I，Gr
iffin，A．M.，およびGriffin，H．G.，eds.，Humana P
ress，New Jersy，(1994)；SEQUENCEANALYSIS IN MOLEC
ULAR BIOLOGY，von Heinje，G.，Academic Press，(198
7)；SEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gribskov，M．およびD
evereux，Ｊ.，eds.，M Stockton Press，New York，(1
991)］。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間
の同一性および類似性を測定する多くの方法があるが、
「同一性」および「類似性」なる用語は当業者によく知
られている［H．CarilloおよびD．Lipton，SIAM J．App
lied Math.，48：1073(1988)］。２つの鎖間の同一性お
よび類似性の決定に一般に使用される方法は、限定する
ものではないが、Guide to Huge Computers，Martin
J．Bishop，ed.，Academic Press，San Diego，1994お
よびH．CarilloおよびD．Lipton，SIAM J．Applied Mat
h.，48：1073(1988)に開示されているものが挙げられ
る。同一性決定のための好ましい方法は、試験する２つ
の配列の間の最大のマッチを与えるように設計されてい
る。同一性および類似性の決定方法は、コンピュータ・
プログラムに組み込むことができる。２つの配列の間の
同一性および類似性を決定する好ましいコンピュータ・
プログラム法としては、限定するものではないが、ＧＣ
Ｓプログラム・パッケージ［J．Devereux et al.，Nucl
eic Acids Research，12(1)：387(1984)］、ＢＬＡＳ
Ｔ、ＦＡＳＴ［S．F．Atcshul et al.，J．Molec．Bio
l.，215：403(1990)］が挙げられる。

【００２９】本発明は、とりわけ、以下に詳細に記載す
る、新規ＨＢＭＢＵ１４Ｅポリペプチドおよびポリヌク
レオチドに関する。特に、本発明は、アミノ酸配列の相
同性という点でＨＴＤＡＦ８８レセプター（それについ
ての配列はGENBANKで入手できる）およびＭＣＰ−１レ
セプター［I．Charo et al，Proc．Natl．Acad．Sci.，
USA，91：2752，2756(1994)］に関連している、新規ヒ
トＨＢＭＢＵ１４のポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドに関する。本発明は特に図１〜図４に示す塩基配列お
よびアミノ酸配列（各々、配列番号１および２）を有す
るＨＢＭＢＵ１４、ＡＴＣＣ受託番号９８２２６中のヒ
トｃＤＮＡのＨＢＭＢＵ１４塩基配列およびアミノ酸配
列（以下、「寄託クローン」または「寄託クローンのｃ
ＤＮＡ」と称する）およびそれによってコードされるア
ミノ酸配列に関する。図１〜図４に示す塩基配列および
アミノ酸配列は、寄託クローンのｃＤＮＡの配列決定に
よって得られる。かくして、寄託クローンの配列は、寄
託クローンのヒトｃＤＮＡの配列のついての言及を含
め、図１〜図４の配列についての２つまたはいずれかの
言及の間の矛盾を調節するものである。

【００３０】ポリペプチド 本発明の１つの態様により、図１〜図４（配列番号２）
の推定アミノ酸配列を有するＨＢＭＢＵ１４ポリペプチ
ドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され
る。ＨＢＭＢＵ１４レセプターの塩基配列は、ＨＴＤＡ
Ｆ８８レセプター（GENBANK）と８９２ｂｐにおいて５
８．５６％の同一性を示す。ＨＢＭＢＵ１４レセプター
の塩基配列はヒトＣ−Ｃキモカインレセプター・タイプ
１（GENBANK受託番号Ｌ０９２３０）と５８４ｂｐにお
いて５５．７％の同一性を示す。ＨＢＭＢＵ１４レセプ
ターの塩基配列は、ヒトＭＣＰ−１レセプター（GENBAN
K受託番号Ｕ０３９０５）と７５２ｂｐにおいて５６．
４％の同一性を示す。ＨＢＭＢＵ１４の塩基配列は、他
のキモカインレセプターと相同性も示す。図１〜図４
（配列番号１）に示すポリヌクレオチド配列のような本
明細書の情報を用い、出発物質としてヒト骨髄からの細
胞のｍＲＮＡを使用するｃＤＮＡのクローニングのよう
な、標準的なクローニングおよびスクリーニング操作を
使用して本発明のヒトＨＢＭＢＵ１４をコードするポリ
ヌクレオチドを得ることができる。さらに詳しくは、図
１〜図４に示すポリヌクレオチド（配列番号１）は、発
現配列タグ（ＥＳＴ）分析［M．D．Adams et al.，Scie
nce，252：1651-1656(1991)；M．D．Adams et al.，Nat
ure，355：632-634(1992)；M．D．Adams et al.，Natur
e，377，Supp：3-174(1995)］を用いてヒト骨髄の細胞
から誘導されるｃＤＮＡ中に見いだされる。

【００３１】本発明のヒトＨＢＭＢＵ１４は、寄託クロ
ーンのヒトＨＢＭＢＵ１４コードｃＤＮＡの配列決定の
結果によって示されるように、７−ＴＭレセプターファ
ミリーの他の蛋白質と構造的に関係する。ＨＢＭＢＵ１
４は、Ｇ−蛋白質結合レセプターに共通するいくつかの
特徴を含む。最も顕著なものは、各々、約２０〜３０ア
ミノ酸の７つの疎水性領域の存在であり、これらは、レ
セプターのＧ−蛋白質結合スーパーファミリーの７−ト
ランスメンブラン構造トポロジーを与える膜スパンニン
グ・ドメインを表すようである。得られたｃＤＮＡ配列
は図１〜図４および配列番号１に示す。推定分子量約３
７６２０を有する３４２個のアミノ酸の蛋白質をコード
するオープンリーディングフレームを含む。図１〜図４
のＨＢＭＢＵ１４はＨＴＤＡＦ８８レセプター（GENBAN
K）と３４２個のアミノ酸残基において３８．２％の同
一性を有し、ヒトＭＣＰ−１レセプター（GENBANK受託
番号Ｕ０３９０５）と２９５個のアミノ酸において３４
％の同一性を有する。図１〜図４のＨＢＭＢＵ１４はヒ
トＣ−Ｃキモカインレセプター・タイプ３（GENBANK受
託番号Ｘ８５７４０）と３１５アミノ酸残基において３
４％の同一性、ヒトＣ−Ｃキモカインレセプター・タイ
プ１（GENBANK受託番号Ｌ０９２３０）と３１３アミノ
酸残基において３３．９％の同一性を有する。図１〜図
４のＨＢＭＢＵ１４歯、ヒトＧ−蛋白質結合レセプター
Ｖ２８（GENBANK受託番号Ｕ２０３５０）と３１３アミ
ノ酸残基において３３．２％の同一性、ヒトＧ−蛋白質
結合レセプターＧＰＲ５（GENBANK受託番号Ｌ３６１４
９）と３１１アミノ酸残基において３０．２％の同一性
を有する。

【００３２】本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの
ようなＲＮＡまたは、例えば、クローニング、化学合成
技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮ
ＡおよびゲノムＤＮＡを包含するＤＮＡの形態でよい。
ＤＮＡは二本鎖でも、一本鎖でもよい。一本鎖ＤＮＡ
は、センス鎖としても知られるコーディング鎖でも、ア
ンチセンス鎖とも称される非コーディング鎖でもよい。
ポリヌクレオチドをコードするコーディング鎖は図１〜
図４（配列番号１）に示すポリヌクレオチドのコーディ
ング配列と同じでよい。また、遺伝コードの重複性（縮
重）の結果として、図１〜図４（配列番号２）のポリペ
プチドをコードする異なる配列を有するポリヌクレオチ
ドでもよい。

【００３３】図１〜図４のポリペプチドをコードする本
発明のポリヌクレオチドは、限定するものではないが、
それ自体がマチュア・ポリペプチドのコーディング配
列；プレ−、プロ−またはプレプロ−蛋白質配列のよう
な、マチュア・ポリペプチドのコード配列と、リーダー
または分泌配列をコードする配列のような、付加的コー
ディング配列；ならびに上記の付加的配列を有するか、
または有しないマチュア・ポリペプチドのコーディング
配列と、限定するものではないが、転写、スプライシン
グやポリアデニレーション・シグナルを包含するｍＲＮ
Ａのリボソーム結合および安定性についてのｍＲＮＡプ
ロセッシングにおいて役割を果たす、転写される非翻訳
配列のようなイントロンおよび非コーディング５'およ
び３'配列を包含する付加的な非コーディング配列とか
らなる配列を包含する。さらなる機能性を与えるコーデ
ィング配列も該ポリペプチドに組み込んでよい。すなわ
ち、例えば、ポリペプチドは、融合ポリペプチドの精製
を容易にするような、ペプチドのごときマーカー配列と
融合させてもよい。本発明のこの態様のある種の好まし
い具体例において、マーカー配列はｐＱＥベクター（Qi
agen，Inc.）に付与されたタグのようなヘキサヒスチジ
ンペプチドである。例えば、Gentz et al.，Proc. Nat
l. Acad. Sci.，USA，1989，86：821-824に記載されて
いるように、ヘキサヒスチジンは融合蛋白質の都合よい
精製を提供する。ＨＡタグはインフルエンザ赤血球凝集
蛋白質から由来するエピトープで、例えば、Wilson et
al., Cell, 1984，37：767に記載されている。他の多く
のタグが商業的に入手できる。

【００３４】上記に従って、本明細書で使用する「ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる語は、遺
伝コードの重複性から、本発明のポリペプチド、特に、
図１〜図４（配列番号２）に示すアミノ酸配列を有する
ヒトＨＢＭＢＵ１４をコードするいずれかの配列を含む
ポリヌクレオチドを包含する。この用語はまた、該ポリ
ペプチドをコードする単一の連続領域または不連続領域
（例えば、イントロンで中断されている）と、コーディ
ングおよび／または非コーディング配列を含んでいてよ
い付加的領域とを含むポリヌクレオチドも包含する。本
発明はさらに、図１〜図４の推定アミノ酸配列を有する
ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体を
コードする上記ポリヌクレオチドの変種にも関する。該
ポリヌクレオチドの変種は、天然の対立遺伝子変種のよ
うな天然の変種でも、天然には知られていない変種でも
よい。そのような非天然のポリヌクレオチドの変種は、
ポリヌクレオチド、細胞または生物に適用されるものを
含め、突然変異誘発技術により作出できる。

【００３５】この点で、変種には、上記ポリヌクレオチ
ドとは、塩基の置換、欠失または付加によって異なる変
種がある。この置換、欠失または付加には、１つ以上の
塩基が含まれ得る。変種は、コーディングまたは非コー
ディング領域あるいは両方において変化してよい。コー
ディング領域における変化は、保存または非保存アミノ
酸置換、欠失または付加を生じ得る。この点で、本発明
の特に好ましい具体例は、図１〜図４（配列番号２）に
示すＨＢＭＢＵ１４のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド、その変種、アナロ
グ、誘導体およびフラグメントおよび該変種、アナログ
および誘導体のフラグメントである。さらに、この点で
特に好ましいものは、図１〜図４のＨＢＭＢＵ１４ポリ
ペプチドのアミノ酸配列において、数個、５〜１０、１
〜５、１〜３、２、１または０個のアミノ酸残基が置
換、欠失または付加あるいはそれらの何れかの組み合わ
せであるＨＢＭＢＵ１４変種、アナログ、誘導体および
フラグメントならびにフラグメントの変種、アナログお
よび誘導体をコードするポリヌクレオチドである。これ
らのうちで、特に好ましいものは、ＨＢＭＢＵ１４の性
質および活性を変化させないサイレント置換、付加およ
び欠失である。また、この点で保存置換も特に好まし
い。最も好ましくは、置換のない図１〜図４のアミノ酸
配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドである。

【００３６】本発明のさらに好ましい具体例は、図１〜
図４に示すアミノ酸配列を有するＨＢＭＢＵ１４ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約７
０％の同一性であるポリヌクレオチド、およびそのよう
なポリヌクレオチドに相補性のポリヌクレオチドであ
る。最も好ましくは、寄託クローンのヒトｃＤＮＡのＨ
ＢＭＢＵ１４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドと少なくとも８０％の同一性を有する領域を含むポリ
ヌクレオチド、およびそれに相補性のポリヌクレオチド
である。この点で、該ポリヌクレオチドに対して少なく
とも９０％の同一性を有するものが非常に好ましく、少
なくとも９５％の同一性を有するものが殊に好ましい。
さらにまた、少なくとも９７％がより好ましく、少なく
とも９８〜９９％、最も好ましくは少なくとも９９％の
同一性を有するものである。さらにまた、この点で特に
好ましい具体例は、図１〜図４のｃＤＮＡによってコー
ドされるマチュア・ポリペプチドと、実質的に同じ生物
学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドである。

【００３７】本発明はまた、上記の配列とハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドに関する。この点で、本発明
は、特に、上記のポリヌクレオチドにストリンジェント
な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書で使用する「ストリンジェントな条件」と
は、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも
９７％の同一性がある場合にのみハイブリダイゼーショ
ンが起こることを意味する。本発明のポリヌクレオチド
分析に関してさらに検討するように、例えば、上記の本
発明のポリヌクレオチドは、ＨＢＭＢＵ１４をコードす
る完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するた
め、また、ヒトＨＢＭＢＵ１４遺伝子に対して高い配列
類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクロ
ーンを単離するためのｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用の
ハイブリダイゼーション・プローブとして使用できる。
そのようなプローブは一般に少なくとも１５塩基からな
る。好ましくは、そのようなプローブは、少なくとも３
０塩基を有し、少なくとも５０塩基を有してもよい。特
に好ましくいプローブは、３０〜５０塩基の範囲であ
る。

【００３８】例えば、ＨＢＭＢＵ１４遺伝子のコーティ
ング領域は、公知の配列をオリゴヌクレオチドプローブ
合成に使用してスクリーニングすることにより単離でき
る。ついで、本発明の遺伝子の配列に相補性を有するラ
ベルしたオリゴヌクレオチドを使用し、ヒトｃＤＮＡ、
ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラリーをスクリーニ
ングし、プローブがハイブリダイズするものを決定す
る。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、
本明細書において、ポリヌクレオチド分析に関してさら
に検討するとおり、ヒトの疾患の治療および診断の発見
用の研究試薬および材料として使用できる。ポリヌクレ
オチドは、マチュア蛋白質に、付加的アミノまたはカル
ボキシル末端アミノ酸またはマチュア・ポリペプチドに
対する内部アミノ酸（例えば、マチュア形が２つ以上の
ポリペプチド鎖を有する場合）が加わったポリペプチド
をコードしてよい。このような配列は、とりわけ、蛋白
質を前駆体からマチュア形へプロセッシングする際に役
割を果たし得、蛋白質トラフィッキングを容易にし得、
蛋白質の半減期を延長または短縮し得、あるいは分析ま
たは製造のために蛋白質の操作を容易にし得る。ここ
で、一般的には、付加的アミノ酸配列はin situで細胞
酵素によりマチュア蛋白質から外れるようにプロセッシ
ングされ得る。

【００３９】１つ以上のプロ配列に融合したポリペプチ
ドのマチュア形を有する前駆体蛋白質は、該ポリペプチ
ドの不活性形であってよい。プロ配列を除去すると、一
般に、不活性前駆体は活性化される。プロ配列のいくつ
か、または全部は、活性化前に除去してよい。一般に、
そのような前駆体をプロ蛋白質と言う。総じて、本発明
のポリヌクレオチドはマチュア蛋白質、マチュア蛋白質
とリーダー配列（プレ蛋白質とも称することができ
る）、プレ蛋白質のリーダー配列ではない１つ以上のプ
ロ配列を有するマチュア蛋白質の前駆体、または、ポリ
ペプチドの活性形もしくはマチュア形を製造するプロセ
ッシング工程の間に除去されるリーダー配列および１つ
以上のプロ配列を有するプロ蛋白質の前駆体であるプレ
プロ蛋白質をコードできる。

【００４０】寄託材料 ヒトＨＢＭＢＵ１４ｃＤＮＡを含有する寄託物は、アメ
リカン・タイプ・カルチュアー・コレクション（ＡＴＣ
Ｃ；12301 Parklawn Drive，Rockville, Maryland 2085
2，USA）に、１９９６年１０月１６日に寄託し、ＡＴＣ
Ｃ受託番号９８２２６が付与された。寄託したヒトｃＤ
ＮＡを、本明細書では「寄託クローン」または「寄託ク
ローンのｃＤＮＡ」と称する。寄託材料はＨＢＭＢＵ１
４ｃＤＮＡの全長を含有する組み換えイー・コリ（E．c
oli）プラスミドで、寄託に関して「pHBMBU14(6)-pCDN/
InvalphaF'」と称している。この寄託は、特許手続き上
の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件
下でなされている。特許が発行されると何らの制限また
は条件もなく、最終的に株は分譲される。寄託は当業者
の便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２の
下に要求されるような、寄託が実施可能要件であること
を承認するものではない。本明細書の配列に関する任意
の記載に矛盾する事象は、寄託物質に含まれるポリヌク
レオチド配列、およびそれらによってコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の配列に関する任
意の記載に矛盾する事象を調整するものである。寄託物
を製造、使用または販売するためにはライセンスが必要
であるが、そのようなライセンスはここでは賦与してい
ない。

【００４１】ポリペプチド 本発明はさらに、図１〜図４（配列番号２）の推定アミ
ノ酸配列を有するヒトＨＢＭＢＵ１４ポリペプチドに関
する。また、本発明はこれらのポリペプチドのフラグメ
ント、アナログおよび誘導体にも関する。図１〜図４の
ポリペプチドに言及する場合、「フラグメント」、「誘
導体」および「アナログ」なる用語は、実質的にこのよ
うなポリペプチドと同じ生物学的機能または活性、すな
わちＨＢＭＢＵ１４としての機能を有するか、またはポ
リペプチドがＨＢＭＢＵ１４、例えば、可溶形のレセプ
ターとして機能しないが、リガンドまたはレセプターと
の結合能を有するポリペプチドを意味する。アナログ
は、例えば、プロ蛋白質部の開裂により活性化され、活
性なマチュア・ポリペプチドを産生しうるプロ蛋白質を
包含する。本発明のポリペプチドは、組み換えポリペプ
チド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドでよ
く、好ましくは組み換えポリペプチドである。図１〜図
４のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナロ
グは、（ｉ）１またはそれ以上のアミノ酸残基が保存ま
たは非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ残基）
で置換されていて、このような置換アミノ酸残基が遺伝
コードによりコードされているかまたはコードされてい
ないもの；（ii）１またはそれ以上のアミノ酸残基が置
換基を包含するもの、（iii）マチュア・ポリペプチド
が他の化合物、例えば、ポリペプチドの半減期を増加さ
せるような化合物（例えば、ポリエチレングリコール）
と融合しているもの、または（iv）リーダーまたは分泌
配列またはマチュア・ポリペプチドまたはプロ蛋白質配
列の精製に使用される配列のような付加的のアミノ酸が
マチュア・ポリペプチドと融合したものであり得る。こ
のようなフラグメント、誘導体およびアナログは本明細
書の記載から当業者の範囲内と考えられる。

【００４２】この点で、本発明の特に好ましい具体例
は、図１〜図４（配列番号２）に示すＨＢＭＢＵ１４の
アミノ酸配列を有するポリペプチド、その変種、アナロ
グ、誘導体およびフラグメント、ならびにフラグメント
の変種、アナログおよび誘導体である。さらに、この点
で特に好ましい本発明の具体例は、ＨＢＭＢＵ１４のア
ミノ酸配列を有するポリペプチド、ＨＢＭＢＵ１４の活
性／機能を保持するその変種、アナログおよび誘導体、
ならびにフラグメントの変種、アナログおよび誘導体で
ある。好ましい変種は、保存アミノ酸置換によって対象
物と変化しているものである。かかる置換は、同様な特
性の他のアミノ酸によってポリペプチドの所定アミノ酸
が置換されているものである。典型的な保存置換は、脂
肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ相互
の置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの相互交
換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基Ａ
ｓｎおよびＧｌｎ間の置換、塩基残基ＬｙｓおよびＡｒ
ｇ間の交換ならびに芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間の
置換である。

【００４３】さらに、この点で特に好ましいものは、図
１〜図４のＨＢＭＢＵ１４ポリペプチドのアミノ酸配列
において、数個、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１ま
たは０個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加あるい
はそれらの何れかの組み合わせであるＨＢＭＢＵ１４変
種、アナログ、誘導体およびフラグメントならびにフラ
グメントの変種、アナログおよび誘導体である。これら
のうちで、特に好ましいものは、ＨＢＭＢＵ１４の性質
および活性を変化させないサイレント置換、付加および
欠失である。また、この点で保存置換も特に好ましい。
最も好ましくは、置換のない図１〜図４のアミノ酸配列
（配列番号２）を有するポリペプチドである。本発明の
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、
単離された形で、好ましくは均質に精製された形で提供
される。

【００４４】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（特に、マチュア・ポリペプチド）ならび
に、配列番号２のポリペプチドと少なくとも約７０％の
同一性を有するポリペプチド、さらに好ましくは配列番
号２のポリペプチドに対して少なくとも８０〜９０％の
類似性（さらに好ましくは、少なくとも９０％の同一
性）を有するポリペプチド、さらに好ましくは配列番号
２のポリペプチドに対して少なくとも９５％の類似性
（さらに好ましくは、少なくとも９５％の同一性）を有
するポリペプチドを包含し、また、そのようなポリペプ
チドの、一般に、少なくとも３０アミノ酸、より好まし
くは少なくとも５０アミノ酸を含有する部分も包含す
る。２つのポリペプチド間の類似性は、上記したごとく
定義され、測定される。

【００４５】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分はペプチド合成による対応する完全長ポリペプチ
ドの産生に用いられる；したがって、フラグメントは完
全長ポリペプチドを産生するための中間体として用いら
れる。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは
部分は本発明の完全長ポリヌクレオチドの合成に用いら
れる。フラグメントは、「自立」、すなわち、他のアミ
ノ酸またはポリペプチドの一部またはそれに融合したも
のでなくても、大きなポリペプチド内に含まれ、その一
部または領域を形成しているものでもよい。より大きな
ポリペプチド内に含まれる場合、ここで議論するフラグ
メントは、最も好ましくは、単一の連続した領域を形成
する。しかし、数個のフラグメントが、単一のより大き
いポリペプチドに含まれていてもよい。例えば、ある好
ましい具体例は、宿主中での発現用に設計された前駆体
ポリペプチド内に含まれ、ＨＢＭＢＵ１４フラグメント
のアミノ末端に融合した異種プレおよびプロポリペプチ
ド領域と、当該フラグメントのカルボキシ末端に融合し
た付加的領域を有する本発明のＨＢＭＢＵ１４ポリペプ
チドのフラグメントである。したがって、本明細書で意
図する意味の１つの態様におけるフラグメントは、ＨＢ
ＭＢＵ１４から由来する融合ポリペプチドまたは融合蛋
白質の部分を言う。

【００４６】本発明のポリペプチドフラグメントの代表
的な例としては、長さが約５〜１５、１０〜２０、１５
〜４０、３０〜５５、４１〜７５、４１〜８０、４１〜
９０、５０〜１００、７５〜１００、９０〜１１５、１
００〜１２５および１１０〜１１３個のアミノ酸のもの
が挙げられる。ここに、「約」には、特に、言及した範
囲が、一方または両方の極限で、数個、５、４、３、２
または１アミノ酸残基だけ大きいまたは小さい範囲を含
むことである。例えば、約４０〜９０アミノ酸とは、４
０±数個、５、４、３、２または１アミノ酸残基〜９０
±数個、５、４、３、２または１アミノ酸残基、すなわ
ち、広くは４０−数個のアミノ酸〜９０＋数個のアミノ
酸の範囲から、狭くは４０＋数個のアミノ酸〜９０−数
個のアミノ酸の範囲を意味する。この点で非常に好まし
いのは、一方または両方の極限で、言及した範囲の５ア
ミノ酸だけ＋または−のものである。特に好ましいもの
は、一方または両方の極限で、言及した範囲の３アミノ
酸だけ＋または−のものである。特に非常に好ましいも
のは、一方または両方の極限で、言及した範囲の１アミ
ノ酸だけ＋または−のものである。これら全ての点か
ら、最も好ましいものは、長さ、約５〜１５、１０〜２
０、１５〜４０、３０〜５５、４１〜７５、４１〜８
０、４１〜９０、５０〜１００、７５〜１００、９０〜
１１５、１００〜１２５および１１０〜１１３個のアミ
ノ酸のものである。

【００４７】本発明の特に好ましいフラグメントは、Ｈ
ＢＭＢＵ１４のトランケーション変異体である。トラン
ケーション変異体には、図１〜図４のアミノ酸配列を有
するＨＢＭＢＵ１４ポリペプチド、あるいはその変種ま
たは誘導体が包含される。ただし、ダブルトランケーシ
ョン変異体におけるような、アミノ末端を含む連続した
一連の残渣（すなわち、連続領域、部分、部位）、また
はカルボキシ末端を含む連続した一連の残基のような欠
失、１つがアミノ末端を含み、他のものがカルボキシ末
端を含むような２つの連続した一連の残基の欠失は除か
れる。本発明の膜結合レセプターの特に好ましいフラグ
メントには、付属したトランスメンブランドメインおよ
び細胞質ドメインのない細胞外ドメインからなるレセプ
ターの可溶形またはトランスメンブラン領域の欠失によ
り、細胞外ドメインが細胞質ドメインと直接融合したレ
セプターが包含される。例えば、国際公開公報ＷＯ９４
／０３６２０参照。上記の範囲のサイズを有するフラグ
メントもトランケーションフラグメントの好ましい具体
例であり、一般に、フラグメントのうちで特に好まし
い。

【００４８】また、本発明のこの態様で好ましいもの
は、ＨＢＭＢＵ１４の構造的または機能的特質により特
徴付けられるフラグメントである。この点で、本発明の
好ましい態様には、ＨＢＭＢＵ１４のα−ヘリックスお
よびα−ヘリックス形成領域（α−領域）、β−シート
およびβ−シート形成領域（β−領域）、ターンおよび
ターン形成領域（ターン領域）、親水性領域、疎水性領
域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、フレキシブル領
域、表面形成領域および高抗原性インデックス領域が包
含される。この点で特に好ましいフラグメントは、上記
した特徴の幾つかのごとき、幾つかの構造的特徴を組み
合わせたＨＢＭＢＵ１４の領域からなるフラグメントで
ある。この点で、いずれも、ターン領域、親水性領域、
フレキシブル領域、表面形成領域および高抗原性インデ
ックス領域の特徴を有するアミノ酸組成によって特徴付
けられる、図１〜図４の約１０〜２０、約４０〜５０、
約７０〜９０および約１００〜１１３の残基によって規
定される領域が、特に好ましい領域である。このような
領域は、より大きいポリペプチドに含まれるか、上記し
たように、それ自体、本発明の好ましいフラグメントで
ある。ここにおける「約」なる語は、フラグメントにつ
いて上記で一般的に記載したと同様な意味で使用する。

【００４９】さらに好ましい領域は、ＨＢＭＢＵ１４の
活性を伝達するものである。この点で最も好ましいもの
は、同様なまたは向上した活性あるいは望ましくない活
性の低下したものを含め、ＨＢＭＢＵ１４の化学的、生
物学的またはその他の活性を有するフラグメントであ
る。この点で好ましいものは、ＨＴＤＡＦ８８レセプタ
ーおよびＨＳＡＥＵ６８レセプターのような関連するポ
リペプチドの活性領域に対し、配列または位置または配
列および位置の両方におけるホモログである領域を含む
フラグメントである。この点での特に好ましいフラグメ
ントは、上記したトランケーション変異体または細胞
質、トランスメンブランまたは細胞外ドメインからなる
フラグメントである。本発明のフラグメントには、トラ
ンスメンブランドメインのみ欠失し、少なくともそれ自
体の細胞質ドメインが保持されているか、国際公開公報
ＷＯ９６／０４３８２に記載のごとく、少なくとも別の
細胞質ドメインと融合していることにより形成されるフ
ラグメントが包含される。とりわけ、本発明は、上記の
フラグメントをコードするポリヌクレオチド、該フラグ
メントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズ
するポリヌクレオチド、特に、ストリンジェントな条件
下でハイブリダイズするポリヌクレオチドおよびＰＣＲ
プライマーのような、該フラグメントを増幅するポリヌ
クレオチドも関する。この点で、好ましいポリヌクレオ
チドは、上記の好ましいフラグメントに対応するフラグ
メントである。

【００５０】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌ
クレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子
操作される宿主細胞および組み換え技法による本発明の
ポリペプチドの製造にも関する。宿主細胞を遺伝子操作
して、本発明のポリヌクレオチドを組み込み、本発明の
ポリペプチドを発現させることができる。例えば、ポリ
ヌクレオチドは、よく知られたインフェクション、トラ
ンスダクション、トランスフェクション、トランスベク
ションおよびトランスフォーメーションの技術を用いて
宿主細胞に組み込むことができる。ポリヌクレオチド
は、単独でも他のポリヌクレオチドと共に組み込むこと
ができる。このような他のポリヌクレオチドは独立して
組み込むことも、一緒または本発明のポリヌクレオチド
に連結して組み込むこともできる。例えば、本発明のポ
リヌクレオチドは、他の、選択可能なマーカーをコード
する別のポリヌクレオチドと共に、例えば、哺乳動物細
胞における共トランスフェクションおよび選択のための
標準的な方法を用いて宿主細胞にトランスフェクション
できる。この場合、ポリヌクレオチドは一般に、宿主細
胞ゲノムに安定に組み込むことができる。

【００５１】別法として、ポリヌクレオチドは、宿主中
で、増殖用の選択可能なマーカーを含むベクターと連結
できる。該ベクター構築物は、上記の技術によって宿主
細胞に組み込むことができる。一般に、リン酸カルシウ
ム沈殿物のような沈殿物中または荷電脂質との複合体の
ＤＮＡとしてプラスミドベクターに組み込まれる。ポリ
ヌクレオチドを宿主中に組み込むために、電気穿孔法も
使用できる。ベクターがウイルスの場合、in vitroでパ
ッケージするか、パッケージ細胞に組み込み、パッケー
ジしたウイルスを細胞にトランスダクションすることが
できる。本発明のこの態様に従って、ポリヌクレオチド
を作成し、ポリヌクレオチドを細胞に組み込むために適
した種々の技術がよく知られており、当業者に日常的の
仕事となっている。そのような技術は上記のサムブルッ
クらの文献に詳細に説明されており、これはこれらの技
術の詳細を示す多くの実験室マニュアルを説明してい
る。本発明のこの態様によれば、ベクターは、例えば、
プラスミドベクター、一本鎖もしくは二本鎖ファージベ
クターまたは一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮ
Ａウイルスベクターでよい。そのようなベクターは、Ｄ
ＮＡおよびＲＮＡを細胞に組み込むためによく知られて
いる技術により、ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡ
として細胞中に組み込むことができる。ファージおよび
ウイルスベクターの場合、ベクターは、インフェクショ
ンおよびトランスダクションのためのよく知られた技術
によりパッケージまたはカプセル化ウイルスとして細胞
に組み込みことができ、好ましい。ウイルスベクターは
複製成分または複製欠損でもよい。後者の場合、ウイル
ス増殖は、一般に、宿主細胞を相補した場合のみ起こ
る。

【００５２】この点で、好ましいベクターは本発明のポ
リヌクレオチドおよびポリペプチド発現用のベクターで
ある。一般に、そのようなベクターは、発現させるべき
ポリヌクレオチドに機能できるように連結した、宿主細
胞における発現に有効なシス−作用調節領域からなる。
適当な、トランス−作用因子は宿主から供給されるか、
相補ベクターによって供給されるか、宿主に組み込んだ
場合にベクター自体によって供給される。この点の好ま
しい具体例においては、ベクターは特異的発現に供され
る。そのような特異的発現は、誘導発現またはある種の
タイプの細胞のみでの発現あるいは誘導および細胞特異
的発現の両方であり得る。誘導ベクターのうちで、特に
好ましいものは、温度や、栄養添加剤のような、操作の
容易な環境因子によって発現が誘導できるベクターであ
る。本発明のこの態様に適した種々のベクターは、原核
および真核宿主において使用するための構成性および誘
導性発現ベクターを含め、よく知られており、当業者に
日常的に使用されている。

【００５３】操作した宿主細胞は、通常の栄養培地で培
養でき、培地は、とりわけ、プロモーターを活性化する
ため、形質転換体を選択するため、また、遺伝子を増幅
するために適宜修飾することができる。発現のために宿
主細胞の選択のために前に使用した、温度、ｐＨ等の培
養条件が、一般に、本発明のポリペプチドの発現に適当
であり、当業者に自明である。本発明のポリペプチドの
発現には種々の発現ベクターが使用できる。このような
ベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス誘導
ベクター、例えば、細菌性プラスミド、バクテリオファ
ージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメントから誘導
されるベクター、バキュロウイルス、パポーバウイル
ス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、
鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスの
ようなウイルスならびにプラスミドとバクテリオファー
ジの遺伝エレメントから誘導されるベクター、コスミド
およびファージミドのようなこれらの組み合わせから誘
導されるベクターが包含される。一般に、ポリヌクレオ
チドを維持し、増殖し、発現させてポリペプチドを製造
するのに適したいずれのベクターも発現ベクターとして
使用できる。

【００５４】適当なＤＮＡ配列を、種々の公知の、日常
的な操作によりベクター中に挿入できる。一般に、発現
用のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列および発現ベクターを１
つ以上の制限エンドヌクレアーゼで切断し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを使用して制限フラグメントを一緒に連結する
ことにより発現ベクターに連結される。この目的に使用
される制限および連結用の操作は当業者によく知られて
おり、日常的である。この点で適当な操作および当業者
によく知られた、日常的な発現ベクター構築に用いる別
法は、サムブルックらに詳細に記載されている。発現ベ
クター中のＤＮＡ配列を、例えば、ｍＲＮＡ翻訳を指示
するプロモーターを包含する適当な発現調節配列に操作
可能に結合させる。このようなプロモーターの代表例と
して、ファージラムダＰＬプロモーター、イー・コリｌ
ａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期
および後期プロモーター、レトロウイルスＬＴＲがよく
知られているプロモーターのうちのいくつかとして挙げ
られる。本発明において有用な多くの他のプロモーター
は、よく知られており、本明細書および実施例に説明す
る方法に、当業者が日常的に使用できる。

【００５５】一般に、発現構築物は、転写開始および終
止部位を有し、翻訳領域には、翻訳のためのリボソーム
結合部位を有する。該構築物によって発現されるマチュ
ア転写物のコーディング部分は、翻訳されるポリペプチ
ドの始めに翻訳開始ＡＵＧおよび終わりに適当に位置す
る翻訳終止コドンを含む。加えて、構築物は発現を調節
し、起こさせる制御領域を含んでよい。一般に、多くの
共通して実施される操作に従い、そのような配列は、転
写を制御することにより操作される。例として、とりわ
け、レプレッサー結合部位およびエンハンサーが挙げら
れる。増殖および発現ベクターには、一般に、選択可能
なマーカーが含まれる。選択可能なマーカーは、形質転
換された宿主細胞の選択のための表現型特徴を与える。
好ましいマーカーには、限定するものではないが、真核
細胞培養についてジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイ
シン耐性、およびイー・コリおよびその他の細菌におけ
るテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性などが挙げ
られる。 前記した適当なＤＮＡ配列、ならびに適当な
プロモーターまたは調節配列有するベクターを用い、適
当な宿主を形質転換させ、宿主が蛋白質を発現させるよ
うにしてもよい。このようなマーカーは、増幅にも適し
ている。別法として、この目的に、さらなるマーカーを
含んでもよい。

【００５６】本明細書に記載した適当なＤＮＡ配列、な
らびに適当なプロモーターおよび他の適当な制御配列
は、所望のポリペプチドをその中で発現させるのに適し
た種々のよく知られた方法を用いて適当な宿主中に導入
される。適当な宿主の代表例には、イー・コリ、ストレ
プトマイセスおよびサルモネラ・チフィムリウム細胞な
どの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ショウジョウ
バエＳ２およびシロナヨトウＳｆ９細胞などの昆虫細
胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫細胞などの
動物細胞；および植物細胞が挙げられる。種々の発現構
築物の宿主は、よく知られており、当業者であれば、本
明細書の記載から、本発明の態様に従ってポリペプチド
の発現に日常的に選択することができる。

【００５７】特に、本発明はすでに広範囲にわたり記載
したような１またはそれ以上の配列を含む発現構築物の
ような組換え構築物も包含する。構築物は、本発明の配
列が正または逆の向きでその中に挿入される、プラスミ
ドまたはウイルスベクターなどのベクターを有してな
る。本発明の好ましい態様において、構築物はさらに、
例えば、該配列に操作可能に結合したプロモーターを含
む調節配列を有してなる。多数の適当なベクターおよび
プロモーターが当業者に公知であり、商業的に入手可能
である。以下に、商業的に入手可能なベクターを例示の
ために挙げる。細菌において使用するのに好ましいベク
ターは、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑiage
n製）、ｐＢＳベクター、ファージスクリプトベクタ
ー、ブルースクリプトベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１
６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓtratagene
製）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３
３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐharmacia製）で
ある。好ましい真核細胞用ベクターは、ｐＷＬＮＥＯ、
ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓtr
atagene製）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳ
ＶＬ（Ｐharmacia製）である。これらは、多くの商業的
に入手可能な、本発明に使用できるよく知られたベクタ
ーの単なる例示であり、他のプラスミドまたはベクター
も、例えば、宿主に導入でき、維持、増殖または本発明
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを発現するのに
適しておれば、本発明に使用できる。

【００５８】プロモーター領域は、クロラムフェニコー
ルトアセチルランスフェラーゼ（ＣＡＴ）転写ユニッ
ト、候補プロモーターフラグメント導入用の制限部位の
下流、すなわち、プロモーターを含むことのできるフラ
グメントのような、プロモーター領域を欠く、レポータ
ー転写ユニットを含むベクターを用いて、望ましいいず
れの遺伝子からも選択できる。よく知られるごとく、Ｃ
ＡＴ遺伝子の制限部位上流にプロモーターを含有するフ
ラグメントのベクターを導入すると、ＣＡＴ活性の産生
が起こり、標準的なＣＡＴ分析で検出できる。この目的
に適したベクターは、よく知られており、容易に入手で
きる。このようなベクターの２つの適当な例はｐＫＫ２
３２−８およびｐＣＭ７である。すなわち、本発明のポ
リヌクレオチドの発現用のプロモーターは、よく知られ
ていて、容易に入手可能なものであるばかりでなく、レ
ポーター遺伝子を用いて上記の方法によって容易に得ら
れるものでもよい。本発明に従って、ポリヌクレオチド
およびポリペプチドの発現に適した公知の細菌性プロモ
ーターは、イー・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモー
ター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモータ
ー、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロモ
ーターである。

【００５９】この点で適当な公知の真核細胞プロモータ
ーは、ＣＭＶ即時初期型プロモーター、ＨＳＶチミジン
キナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモ
ーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲのよう
なレトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチ
オネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプ
ロモーターである。宿主での発現に適当なベクターおよ
びプロモーターの選択は、よく知られた操作であり、発
現ベクター、ベクターの宿主への導入および宿主での発
現に必要な技術は当業者の日常的なものである。本発明
は上記の構築物を含有する宿主細胞にも関する。宿主細
胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞の
ような下等真核細胞または細菌細胞のような原核細胞と
することができる。構築物の宿主細胞への導入は、リン
酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキス
トラン介在トランスフェクション、カチオン性リピド介
在トラスフェクション、電気穿孔法、トランスダクショ
ン、インフェクション等により行うことができる。これ
らの方法は、デイビスら（Davis, et al.）のベーシッ
ク・メソッズ・イン・モレキュラ・バイオロジー（Basi
c Methods in Molecular Biology，1986）のような、多
くの標準的実験室マニュアルに記載されている。

【００６０】宿主細胞中の構築物を常法にて用い、組換
え体配列によりコードされる遺伝子産物を産生すること
ができる。別法として、本発明のポリペプチドは通常の
ペプチド・シンセサイザーにより合成できる。マチュア
蛋白質は哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞に
おいて適当なプロモーターの調節下で発現できる。無細
胞翻訳系もまた使用して、本発明のＤＮＡ構築物由来の
ＲＮＡを用いてこのような蛋白質を産生することができ
る。原核および真核宿主について用いられる適当なクロ
ーニングおよび発現ベクターは、上記サムブルックら、
に記載されている。

【００６１】一般に、組換え体発現ベクターは複製の開
始点、下流構造配列の転写を指令する高度発現遺伝子か
ら由来するプロモーターおよびベクターへの暴露後、ベ
クター含有細胞の単離を可能にする選択可能なマーカー
を含む。適当なプロモーターは、３−ホスホグリセレー
トキナーゼ（ＰＧＫ）、α−ファクター、酸ホスファタ
ーゼまたは熱ショック蛋白質などの解糖酵素をコードす
る遺伝子から誘導できる。適当なマーカーには、イー・
コリのアンピシリン耐性遺伝子およびサッカロミセス・
セレビシアエのｔｒｐ１遺伝子が包含される。高等な真
核細胞による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の転写はエンハンサー配列をベクター中に挿入すること
に増加できる。エンハンサーはＤＮＡシス−作用エレメ
ントで、通常約１０ないし３００ｂｐの、所定の宿主細
胞で作用してプロモーターの転写活性を増加させるもの
である。例えば、複製開始点ｂｐ１００ないし２７０の
後側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初
期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後側のポリ
オーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサ
ーが挙げられる。

【００６２】本発明のポリペプチドのヘテロローガスな
構造配列をコードする本発明のポリヌクレオチドは、一
般に、発現のために操作可能にプロモーターに連結する
ように、標準的な技術を使用してベクターに挿入され
る。ポリヌクレオチドは、転写開始部位がリボソーム結
合部位に対して適当な５’に存在するように位置され
る。リボソーム結合部位は、発現されるべきポリペプチ
ドの翻訳を開始するＡＵＧに対して５’にある。一般
に、通常ＡＵＧである開始コドンと共に始まり、リボソ
ーム結合部位と開始コドンの間に存在する、他のオープ
ンリーディングフレームはない。また、一般に、ポリペ
プチドの最後には翻訳終止コドンがあり、ポリアデニレ
ーションシグナルおよび転写終止シグナルが転写領域の
３’末端に適宜に配置される。翻訳タンパク質を、小胞
体内腔、ペリプラズム腔または細胞外環境へ分泌するた
めに、適当な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組
み込むことができる。これらのシグナルはポリペプチド
に対して内在性であってもよく、あるいは異種性のシグ
ナルでもよい。ポリペプチドは、融合蛋白質のような修
飾形で発現されてもよく、また、分泌シグナルのみなら
ず、さらなるヘテロローガスな機能性領域を含んでいて
もよい。すなわち、例えば、付加的なアミノ酸、特に、
荷電アミノ酸の領域とポリペプチドのＮ−末端に付加し
て、精製の間またはその後の取り扱いおよび貯蔵におけ
る宿主細胞での安定性および持続性を改善することがで
きる。精製を容易にするために領域をポリペプチドに付
加することもできる。そのような領域は、ポリペプチド
の最終製造前に除去できる。とりわけ、ポリペプチドへ
ペプチド部分を付加して分泌を起こさせ、安定性を向上
させ、精製を容易にすることは、当該分野でよく知られ
ており、日常的な技術である。

【００６３】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの増殖、維持または発現用の適当な原核宿主として
は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、バチル
ス・ズブチリス（Bacillus subtiis）およびサルモネラ
・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）が挙げら
れる。シウドモナス（Pseudomonas）属、ストレプトマ
イセス（Streptomyces）属およびスタフィロコッカス
（Staphylococcus）属の種々の種も、この点で適当な宿
主である。さらに、当業者に公知の他の宿主も使用でき
る。限定するものではないが、代表的な例として、有用
な、細菌用の発現ベクターは、選択可能なマーカーと、
よく知られたクローニングベクターであるｐＢＲ３２２
（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝的エレメントからなる商
業的に入手できるプラスミドから由来する細菌性複製開
始点からなる。そのような商業的なベクターとしては、
例えば、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemical
s，Uppsala，Sweden）およびＧＥＭ１（Promega Biote
c，Madions，WI，USA）が挙げられる。これらのベクタ
ーにおいて、ｐＢＲ３２２「主鎖」部分と、適当なプロ
モーターおよび発現させるべき構造配列とを組み合わ
す。適当な宿主株の形質転換についで、宿主株を適当な
細胞密度まで増殖させる。選択したプロモーターを導入
できる場合は、適当な手段（例、温度シフトまたは化学
的導入剤への暴露）で導入し、細胞をさらなる期間、培
養する。ついで、典型的には、細胞を遠心分離で収集
し、物理的または化学的手段せ破壊し、得られた粗抽出
物を、さらに精製するために保持する。蛋白質の発現に
使用した微生物細胞は、凍結−解凍の繰り返し、音波処
理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む、いずれ
の通常の方法によっても破壊できる。そのような方法も
当業者によく知られている。

【００６４】種々の哺乳動物細胞培養系も同様に発現に
使用できる。哺乳動物発現系の例としては、限定するも
のではないが、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、
ヒト腎臓２９３およびＢＨＫセルラインや、Glunzman
ら，Cell，1981，23：175に記載されるサル腎臓線維芽
細胞のＣＯＳ−７ラインが挙げられる。哺乳動物発現ベ
クターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエン
ハンサー、ならびにいずれかの必要なリボソーム結合部
位、ポリアデニレーション部位、スプライスドナーおよ
びアクセプター部位、転写終止配列および発現に必要な
５’フランキング非転写配列からなる。好ましい具体例
においては、ＳＶ４０スプライス部位およびＳＶ４０ポ
リアデニレーション部位から由来するＤＮＡ配列が必要
な非転写遺伝エレメントとして使用される。ＨＢＭＢＵ
１４ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノー
ル沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマト
グラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎
水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロ
マトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラ
フィーおよびレクチンクロマトグラフィーのようなよく
知られた方法により、組み換え細胞培養から回収および
精製できる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬ
Ｃ」）を精製に用いるのが最も好ましい。ポリペプチド
が単離および／または精製中に変性した場合、再び活性
な立体配座にするために、蛋白質再生のための周知の技
法を用いることができる。本発明のポリペプチドには、
天然の精製ポリペプチド、化学合成法により得られたポ
リペプチドおよび、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆
虫および哺乳動物細胞のような原核または真核宿主から
組み換え技術で製造されたポリペプチドが包含される。
組み換え製造操作において用いた宿主により、本発明の
ポリペプチドは、グリコシル化または非グリコシル化さ
れ得る。さらに、本発明のポリペプチドには、宿主介在
方法の結果、いくつかの場合には開始の修飾メチオニン
残基を含んでよい。ＨＢＭＢＵ１４ポリヌクレオチドお
よびポリペプチドは、本発明により、種々の用途、特
に、ＨＢＭＢＵ１４を化学的および生物学的に使用する
用途に使用できる。さらなる用途は、細胞、組織および
器官の障害の診断および治療である。

【００６５】ポリヌクレオチド分析 本発明はまた、例えば、診断試薬として使用するため
の、相補性ポリヌクレオチド検出のためのＨＢＭＢＵ１
４ポリヌクレオチドの使用に関する。機能不全に伴うＨ
ＢＭＢＵ１４の突然変異形の検出は、ＨＢＭＢＵ１４の
発現不足、過剰発現または変更発現からもたらされる疾
患または疾患の罹病しやすさの診断または診断に加える
ことのできる診断道具を提供する。ヒトＨＢＭＢＵ１４
遺伝子に突然変異を有する個々の人々が、種々の技術に
よりＤＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸は、血
液、尿、唾液、組織生検または剖検材料のような患者の
細胞から得ることができる。ゲノムＤＮＡは直接的に検
出するのに使用できるか、または分析の前にＰＣＲ（Sa
ikiら，Nature，324：163-166（1986））もしくはその
他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅できる。同
様に、ＲＮＡまたはｃＤＮＡも使用できる。例えば、欠
失および挿入は、正常遺伝子型と比較して増幅生成物の
大きさの変化により検出できる。点突然変異は、増幅Ｄ
ＮＡを放射線標識ＨＢＭＢＵ１４ＲＮＡまたは放射線標
識アンチセンスＤＮＡ配列に対してハイブリダイゼーシ
ョンすることにより同定できる。完全に対合した配列は
ＲＮアーゼＡ消化または融解温度の差により、誤対合二
重螺旋から区別できる。

【００６６】対照遺伝子と突然変異を有する遺伝子の配
列相違も直接ＤＮＡシーケンシングで示すことができ
る。さらに、クローンしたＤＮＡセグメントをプローブ
として、特定的ＤＮＡセグメントを検出できる。これら
の方法の感度はＰＣＲまたは他の増幅方法の適当な使用
により大いに増強できる。例えば、シーケンシングプラ
イマーは、修飾ＰＣＲにより生じた二本鎖ＰＣＲ生成物
または一本鎖鋳型分子と共に使用する。配列決定は、放
射線標識核酸を用いる常法または蛍光タグを用いる自動
シーケンシング操作によって行うことができる。ＤＮＡ
配列の差に基づく遺伝的テストは、変性剤と共にまたは
無しでゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動度
の変化により検出できる。小さな配列の欠失および挿入
は、高分離ゲル電気泳動で明視化できる。異なる配列の
ＤＮＡフラグメントは、異なるＤＮＡフラグメントの移
動度が、それらの特異的または部分的溶融温度に従っ
て、異なる位置のゲル中で遅滞する変性ホルムアミドグ
ラディエントゲルによって区別できる（Meyersら，Scie
nce，230:1242（1985）参照）。特異的な位置での配列
の変化はまた、ヌクレアーゼ保護分析、例えば、ＲＮア
ーゼおよびＳ１保護または化学的切断法によっても明ら
かにすることができる（例えば、Cottonら，Proc．Nat
l.Acad.Sci.,USA，85:4397-4401（1985）参照）。かく
して、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーシ
ョン、ＲＮアーゼ保護、化学的切断、直接シーケンシン
グまたは制限酵素の使用（例、制限断片長多形（ＲＦＬ
Ｐ））およびゲノムＤＮＡのサザーンブロッティングに
より行うことができる。

【００６７】本発明のさらなる態様においては、限定す
るものではないが、細菌、糸状菌、原生動物およびウイ
ルス感染、特に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２によって
起こる感染症のような感染症、疼痛、癌、食欲不振、病
的飢餓、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、
高血圧、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、ア
レルギー、良性前立腺肥大症および、不安、***症、躁
鬱病、せん妄、痴呆または重度精神薄弱のような精神病
および神経疾患ならびにハンチントン病、ジルドゥラト
ゥーレット症候群のような運動異常を包含する機能不全
または疾患の診断または罹病しやすさの測定方法が提供
される。ＨＢＭＢＵ１４遺伝子における突然変異はかか
る機能不全または疾患の罹病しやさの指標であり、上記
の核酸配列は、そのような罹病しやすさの分析に使用で
きる。すなわち、例えば、分析は本明細書に記載したヒ
トＨＢＭＢＵ１４遺伝子における、欠失、トランケーシ
ョン、挿入、フレームシフトなどのような突然変異の測
定に使用でき、そのような突然変異は上記の機能不全ま
たは疾患のいずれかの罹病しやすさの指標である。本発
明は、とりわけ、図１〜図４（配列番号１）の配列を有
するポリヌクレオチドの以上に増加または減少した発現
レベルの患者からの試料から測定することからなる、特
に、限定するものではないが、細菌、糸状菌、原生動物
およびウイルス感染、特に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−
２によって起こる感染症のような感染症、疼痛、癌、食
欲不振、病的飢餓、喘息、パーキンソン病、急性心不
全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗
塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大症および、不
安、***症、躁鬱病、せん妄、痴呆または重度精神薄弱
のような精神病および神経疾患ならびにハンチントン
病、ジルドゥラトゥーレット症候群のような運動異常を
包含する機能不全または疾患のような疾患の診断方法を
提供するものである。ポリヌクレオチドの増加または減
少した発現は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保
護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼ
ーション方法のような、当該分野でよく知られたポリヌ
クレオチドの定量方法の何れかを使用して測定できる。
通常のゲル電気泳動およびＤＮＡシーケンシングに加
え、突然変異もin situ分析によって検出できる。

【００６８】染色体分析 本発明の配列はまた、染色体の同定にも有用である。該
配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を特異的に標的
とし、ハイブリダイゼーションできる。さらに、最近、
染色体上の特定の部位の同定が要求されている。現在、
実際の配列データ（繰り返し多形）に基づいて染色***
置のマーキングに利用できる染色体マーキング試薬はほ
とんどない。本発明による染色体上のＤＮＡマッピング
は、これらの配列を遺伝子に伴う疾患と関連付ける重要
な第一の段階である。要するに、ｃＤＮＡからＰＣＲプ
ライマー（好ましくは１５〜３０ｂｐ）を調製して配列
を染色体上にマッピングできる。１つ以上のエクソンを
スパンするプライマーは増幅方法を複雑にし得るので、
３’非翻訳領域おコンピュータ分析を使用して、ゲノム
ＤＮＡにおける１つ以上のエクソンをスパンしないプラ
イマーを迅速に選択する。これらのプライマーを使用し
て、個々のヒトの染色体を含有する体細胞ハイブリッド
のＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応
するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅フラ
グメントを産生し得る。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマ
ッピングは、個々の染色体上に個々のＤＮＡを割り当て
るための迅速な操作である。同じオリゴヌクレオチドプ
ライマーによる本発明を用い、特定の染色体または多数
のゲノムクローンのプールからのパネルについてサブロ
ーカライゼーションを、同様な方法で行うことができ
る。染色体のマッピングに同様に使用できる他のマッピ
ング方法には、染色体特異性ｃＤＮＡライブラリー構築
のためのin situハイブリダイゼーション、標識化した
フローソーティング染色体を使用するプレスクリーニン
グおよびハイブリダイゼーションによるプレ選択が包含
される。

【００６９】中期染色体塗抹についてのｃＤＮＡクロー
ンの蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
を使用し、一工程で正確な染色***置付けを行うことが
できる。この技術は５０〜６０塩基もの短いｃＤＮＡに
使用できる。この技術の論説については、Vermaら，HUM
AN CHROMOSOMES：A MANUFAL OF BASIC TECHNIQUES，PER
GEMON PRESS, NEW YORK，1988参照。この技術を実施す
る例として、ＨＢＭＢＵ１４ＤＮＡをQIAEX II ＤＮＡ
精製キット（QIAGEN，Inc.，Chastworth，CA）で消化お
よび精製し、スーパーＣｏｓ１コスミドベクター（STRA
TAGENE，La Jolla，CA）に連結する。ＤＮＡを、Qiagen
プラスミド精製キット（QIAGEN，Inc.，Chastworth，C
A）を使用してＤＮＡを精製でき、１ｍｇを、BioNickラ
ベルキット（GibcoBRL，Life Technologies Inc.，Gait
hersburg，MD）を用いて、ビオチン−ｄＡＴＰの存在下
にニック翻訳によりラベルする。ビオチニル化はＧＥＮ
Ｅ−ＴＥＣＴ検出システム（CLONTECH Laboratories，I
nc．Polo Alto，CA）で検出する。In situハイブリダイ
ゼーションをONCOR Lightハイブリダイゼーションキッ
ト（ONCOR，Gaithersburg，MD）を用いてスライド上で
行い、中期染色体上の単一コピー配列を検出する。正常
ドナーの末梢血を２０％ＦＣＳ、３％ＰＨＡおよびペニ
シリン／ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４
０で３日間培養し、１０^-7Ｍメトトレキセートで１７時
間同調させ、非補足ＲＰＭで２回洗浄する。ついで、細
胞を１０^-3Ｍチミジンと共に７時間インキュベートす
る。コルセミド（０．５ｍｇ／ｍｌ）と共に２０分間イ
ンキュベーションした後、細胞を中期で休止させ、つい
で３７℃にて１５分間、７５ｍＭ ＫＣl中で低張溶解
する。細胞ペレットを取り出し、Carnoyの固定液（３：
１メタノール／酢酸）中で固定する。

【００７０】中期塗抹は、懸濁液をスライド上に滴下
し、風乾することにより調製できる。ハイブリダイゼー
ションは、ブロッキング・ヒト胎盤ＤＮＡ（１ｍｇ／ｍ
ｌ）と共に１０ｍｌのハイブリダイゼーションミックス
（５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、１％デキストラン
硫酸塩）に懸濁した１００ｎｇのプローブを添加するこ
とにより行う。先に、７０％ホルムアミド／２×ＳＳ
Ｃ、７０℃にて変性し、エタノールで脱水し、４℃に冷
却し、予め加温した（３７℃）したスライドに載せる前
に、プローブ混合物を、７０℃の水浴中で１０分間変性
し、３７℃で１時間インキュベーションする。スライド
を、加湿チャンバー中、３７℃で１６時間インキュベー
ションする。スライドを５０％ホルムアミド／２×ＳＳ
Ｃ中、４１℃で１０分間、２×ＳＳＣ中、３７℃で７分
間洗浄する。ハイブリダイゼーションプローブは、ＦＩ
ＴＣ−アビジン（ONCOR，Gaithersburg，MD）と共に、
スライドを製造者のプロトコールに従ってインキュベー
ションすることにより検出される。封入媒体に懸濁した
ヨウ化プロプリジウムで染色体を対比染色する。Leitz
ORTHOPLAN ２−エピフルオレッセンス顕微鏡を使用して
スライドを明視化し、Imageneticsコンピュータおよび
マッキントッシュプリンターを使用して５つのコンピュ
ータイメージを取る。

【００７１】一旦、染色体上の正確な位置に配列がマッ
ピングできたら、染色体上の該配列の物理的位置を、遺
伝的な地図データと関連付けることができる。そのよう
なデータは、例えば、V．Mckusick，Mendelian Inherit
ance in Man（John HopkinsUniversity Welch Medical
Libraryを通じてオンラインで利用できる）にある。つ
いで、同じ染色体領域上でマッピングされた遺伝子と疾
患の関係を、連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の共同
相続）を介して同定する。ついで、影響された個体と影
響されない個体の間でのｃＤＮＡまたはゲノム配列にお
ける差異を決定することが必要である。影響された個体
の幾つかまたは全部に突然変性が見られるが、正常な個
体には何ら見られない場合は、その突然変性が、おそら
く当該疾患の原因因子である。物理的マッピングおよび
遺伝的マッピング技術の最近の分離能をもってすれば、
当該疾患に伴う染色体領域に正確に位置付けされたｃＤ
ＮＡは、１メガベースのマッピング分離能で、２０ｋｂ
当たり１遺伝子として、５０〜５００個の可能性のある
原因因子の１つとすることができる。

【００７２】ポリペプチド分析 本発明はまた、細胞および組織におけるＨＢＭＢＵ１４
蛋白質のレベルを検出するための診断分析にも関する。
そのような分析は、定量的でも、定性的でもよい。すな
わち、例えば、正常な対照組織試料に対してＨＢＭＢＵ
１４の過剰発現を検出する本発明の診断分析は、上記の
疾患／疾病の存在を検出するために使用できる。宿主か
ら由来する試料中の、本発明のＨＢＭＢＵ１４蛋白質の
ような蛋白質のレベルの測定に使用できる分析技術は、
当業者によく知られている。そのような分析方法には、
ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタ
ンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが包含され
る。とりわけ、ＥＬＩＳＡアッセイが好ましい。ＥＬＩ
ＳＡアッセイは、まず、ＨＢＭＢＵ１４に特異的な抗
体、好ましくはモノクローナル抗体の調製を含む。さら
に、該モノクローナル抗体と結合するリポーター抗体が
一般に調製される。該リポーター抗体は、放射能、蛍光
または酵素試薬、例えば、ここでは西洋ワサビパーオキ
シダーゼ酵素のような検出可能な試薬と結合させる。

【００７３】ＥＬＩＳＡを行うには、宿主から試料を取
り出し、例えば、ポリスチレン皿のような、試料中の蛋
白質と結合する固体担体上でインキュベーションする。
皿上のいずれの遊離蛋白質結合部位も、ウシ血清アルブ
ミンのような非特異性蛋白質と共にインキュベーション
して被覆する。ついで、モノクローナル抗体を皿中でイ
ンキュベーションする。この間に、モノクローナル抗体
は、ポリスチレン皿に結合したいずれのＨＢＭＢＵ１４
蛋白質とも結合する。結合しないモノクローナル抗体を
緩衝液で洗い流す。西洋ワサビパーオキシダーゼに結合
したリポーター抗体を皿に入れ、ＨＢＭＢＵ１４と結合
したいずれものモノクローナル抗体と結合させる。つい
で、結合しなかったリポーター抗体を洗い流す。次い
で、比色測定用の基質を含むパーオキシダーゼ活性用の
試薬を皿に加える。一次および二次抗体を介してＨＢＭ
ＢＵ１４に結合した、固定化されたパーオキシダーゼは
呈色反応生成物を生成する。所定の時間内に発色した色
の量が試料中に存在するＨＢＭＢＵ１４蛋白質の量の指
標となる。定量的結果は、典型的には、標準曲線との対
比により得られる。競合分析も使用でき、ＨＢＭＢＵ１
４に特異的な抗体を固体担体に結合させ、標識したＨＢ
ＭＢＵ１４および宿主から由来する試料を固体担体に通
す。固体担体に結合した検出したラベルは試料中のＨＢ
ＭＢＵ１４の量と相関させることができる。

【００７４】抗体 本発明のポリペプチド、それらのフラグメントまたはそ
の他の誘導体、またはそれらのアナログ、またはそれら
を発現する細胞は、これらに対する抗体を産生する免疫
原として用いることができる。これらの抗体は、例え
ば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体である。
本発明にはまた、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、な
らびにＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラリ
ーの生成物が包含される。当該分野に公知の種々の方法
がこのような抗体およびフラグメントの製造に使用でき
る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生じ
る抗体は、好ましくはヒト以外の動物に、該ポリペプチ
ドを直接注射するか、投与することにより得ることがで
きる。得られた抗体はポリペプチドそのものと結合す
る。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみ
をコードする配列でさえも、全体の天然ポリペプチドと
結合する抗体の産生に使用できる。そのような抗体は、
そのポリペプチドを発現する組織から該ポリペプチドを
単離するのに使用できる。連続的セルライン培養により
産生される抗体を提供する当業者によく知られた技術を
用いて、モノクローナル抗体を調製することができる。
例えば、ハイブリドーマ法（Kohler，G.およびMilstei
n,C.，Nature，256:495-497（1975））、トリオーマ
法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozborら、Immuno
logy Today，4:72（1983））およびＥＢＶ−ハイブリド
ーマ法（Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer T
herapy，Alan R Liss,Inc.、77-96頁（1985））が挙げ
られる。

【００７５】一本鎖抗体の製造のために記載された技術
（米国特許第４９４６７７８号）を用いて、本発明のポ
リペプチドに対する一本鎖抗体を産生することができ
る。また、トランスジェニックマウスまたはその他の生
物、例えばその他の哺乳動物を用いて、本発明のヒト化
抗体を発現させることができる。上記の抗体を用いて該
ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定する
ことができ、アフィニティークロマトグラフィーによ
り、単離および／または精製用の固体担体に抗体を結合
させて本発明のポリペプチドを精製することができる。
ＨＢＭＢＵ１４に対する抗体は、限定するものではない
が、細菌、糸状菌、原生動物およびウイルス感染、特
に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２によって起こる感染症
のような感染症、疼痛、癌、食欲不振、病的飢餓、喘
息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿
閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、
良性前立腺肥大症および、不安、***症、躁鬱病、せん
妄、痴呆または重度精神薄弱のような精神病および神経
疾患ならびにハンチントン病、ジルドゥラトゥーレット
症候群のような運動異常を包含する機能不全または疾患
の抑制に使用できる。

【００７６】ＨＢＭＢＵ１４結合分子および分析 ＨＢＭＢＵ１４は、相互反応する蛋白質の単離に使用で
き、この相互反応を、干渉の標的とすることができる。
ＨＢＭＢＵ１４と他の因子との間の蛋白質−蛋白質相互
反応の阻害剤は、ＨＢＭＢＵ１４活性調節用の医薬の開
発に通じる。かくして、本発明はまた、ＨＢＭＢＵ１４
への結合分子の同定方法も提供する。ＨＢＭＢＵ１４に
結合する分子についての蛋白質をコードする遺伝子は、
例えば、リガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティン
グのような多くの公知の方法により同定できる。そよう
な方法は、例えば、Coliganら、Current Protocols in
Immunology 1(2):第5章（1991）のような多くの実験室
マニュアルに記載されている。例えば、酵母二ハイブリ
ッドシステムは、転写アクチベーターの活性の再構築を
使用する、第一のテスト蛋白質と第二のテスト蛋白質の
in vivoにおける相互反応検出のための方法を提供す
る。この方法は米国特許５２８３１７３号に開示されて
おり、試薬はClontechおよびStratageneから入手でき
る。要約すると、ＨＢＭＢＵ１４ｃＤＮＡをＧａｌ４転
写因子ＤＮＡ結合ドメインと融合させ、酵母細胞で発現
させる。関心のある細胞から得られたｃＤＮＡライブラ
リーメンバーをＧａｌ４のトランス活性化ドメインに融
合させる。ＨＢＭＢＵ１４と相互反応できる蛋白質を発
現するｃＤＮＡクローンは、Ｇａｌ４の再構築およびＧ
ａｌ１−ｌａｃＺのようなリポーター遺伝子のトランス
活性化をもたらす。

【００７７】別法として、組み換えＨＢＭＢＵ１４によ
るラムダｇｔ１１またはラムダＺＡＰ（Stratagene）ま
たは均等なｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニング
がある。組み換えＨＢＭＢＵ１４蛋白質またはそのフラ
グメントを、ＦＬＡＧ、ＨＳＶまたはＧＳＴのような小
さなペプチドタグと融合させる。該ペプチドタグは、心
筋クレアチンキナーゼのようなキナーゼに対する好都合
なホスホリル化部位を有することができ、または、ビオ
チニル化できる。組み換えＨＢＭＢＵ１４は、³²［Ｐ］
でホスホリル化でき、また、ラベルなしで使用して、ス
トレプトアビジンまたはタグに対する抗体で検出でき
る。ラムダｇｔ１１ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、関心
ある細胞から作成され、組み換えＨＢＭＢＵ１４と共に
インキュベーションし、洗浄し、ＨＢＭＢＵ１４と相互
反応するｃＤＮＡクローンを単離する。このような方法
は当業者に日常的であり、例えば、上記サムブルックら
参照。他の方法は、哺乳動物の発現ライブラリーのスク
リーニングである。この方法では、ｃＤＮＡを、哺乳動
物プロモータとポリアデニレーション部位の間でベクタ
ーにクローンし、一時的にＣＯＳまたは２９３細胞にト
ランスフェクトする。４８時間後、固定化し、洗浄した
細胞をラベルしたＨＢＭＢＵ１４と共にインキュベーシ
ョンし、結合する蛋白質を検出する。好ましい具体例で
は、ＨＢＭＢＵ１４をヨー素化し、結合したＨＢＭＢＵ
１４をオートラジオグラフィーで検出する。Simsら，Sc
ience，1988，241：585-589およびMcMahanら，EMBO．
J.，1991，10：2821-2831参照。この方法においては、
関心ある結合蛋白質をコードするｃＤＮＡを含むｃＤＮ
Ａのプールを選択し、さらに各プールを分割し、ついで
一時的なトランスフェクション、結合およびオートラジ
オグラフィーのサイクルを繰り返し、関心あるｃＤＮＡ
を単離できる。別法として、全ｃＤＮＡライブラリーを
哺乳動物細胞にトランスフェクションし、プレートに結
合したＨＢＭＢＵ１４を含む皿で細胞をパンニングする
ことにより関心あるｃＤＮＡを単離できる。洗浄後に結
合している細胞を溶解し、プラスミドＤＮＡを単離し、
細菌中で増幅し、単一のｃＤＮＡクローンが得られるま
で、トランスフェクションおよびパンニングのサイクル
を繰り返す。Seedら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，19
87，84：3365およびAruffoら，EMBO J.，1987，6：3313
参照。結合蛋白質が分泌される場合、一旦、結合または
中和分析が一時的なトランスフェクション細胞からの上
澄液の分析ように確立されたら、そのｃＤＮＡを同様な
プール法で得ることができる。上澄液のスクリーニング
の一般的な方法はWongら，Science，1985，228：810-81
5に開示されている。

【００７８】もう一つの他の方法には、細胞からのＨＢ
ＭＢＵ１４と直接、相互反応する蛋白質の単離が包含さ
れる。ＨＢＭＢＵ１４とＧＳＴまたは小さいタグとの融
合蛋白質を作成し、ビーズに固定化する。関心ある細胞
からの生合成的にラベルした、またはラベルしない蛋白
質の抽出物を調製し、ビーズと共にインキュベーション
し、緩衝液で洗浄する。ＨＢＭＢＵ１４と相互反応した
蛋白質をビーズから特異的に溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で分析する。結合相手の一次アミノ酸配列データはマイ
クロシーケンシングによって得られる。所望により、細
胞蛋白質のチロシンホスホリレーションのような機能的
応答を導く試薬で細胞を処理してもよい。そのような試
薬の例は、成長因子またはインターロイキン−２のよう
なサイトカインである。他の方法は、イムノアフィニテ
ィー精製である。組み換えＨＢＭＢＵ１４をラベルし
た、またはしない細胞抽出物と共にインキュベーション
し、抗ＨＢＭＢＵ１４抗体で免疫沈降させる。免疫沈降
物をプロテインＡ−セファロースで回収し、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで分析する。ラベルしない蛋白質は、ビオチニル
化によりラベルし、ストレプトアビジンでＳＤＳゲル上
で検出する。結合相手の蛋白質を、マイクロシーケンシ
ングで分析する。さらに、公知の標準的な生化学精製工
程をマイクロシーケンシング前に使用してもよい。

【００７９】さらに別の方法は、ペプチドライブラリー
における結合相手のスクリーニングである。タグを付す
か、ラベルした組み換えＨＢＭＢＵ１４を用い、ペプチ
ドまたはホスホペプチドライブラリーから、ＨＢＭＢＵ
１４と相互反応するペプチドを選択する。ペプチドのシ
ーケンシングで、相互反応蛋白質に見いだされ得るコン
センサスペプチド配列の同定できる。これらの方法また
は他の公知の方法のいずれかで同定されたＨＢＭＢＵ１
４結合相手ならびに上記した推定結合相手は本発明の分
析方法に使用できる。ＨＢＭＢＵ１４／結合相手複合体
の存在の分析は、例えば、酵母二ハイブリッドシステ
ム、ＥＬＩＳＡまたは該複合体に特異的な抗体を使用す
るイムノアッセイにより行うことができる。ＨＢＭＢＵ
１４／結合相手複合体の形成を妨害または阻害する試験
物質の存在下、試験物質を欠く対照に対する複合体の量
の減少を測定する。遊離ＨＢＭＢＵ１４または結合相手
の分析は、例えば、ＥＬＩＳＡまたは特異抗体を用いる
イムノアッセイにより、または、放射ラベルされてたＨ
ＢＭＢＵ１４を細胞または細胞膜と共にインキュベーシ
ョンし、ついで遠心分離またはフィルター分離すること
により行える。ＨＢＭＢＵ１４／結合相手複合体の形成
を妨害または阻害する試験物質の存在下、試験物質を欠
く対照に対する遊離ＨＢＭＢＵ１４または遊離結合相手
の量の増加を測定する。本発明のポリペプチドはまた、
細胞中または無細胞調製物中のＨＢＭＢＵ１４結合分子
のＨＢＭＢＵ１４結合能の評価にも使用できる。

【００８０】アンタゴニストおよびアゴニスト−分析お
よび分子 本発明のＨＢＭＢＵ１４は、本発明のレセプターポリペ
プチド作用を活性化（アゴニスト）または阻害（アンタ
ゴニスト）する化合物をスクリーニングする方法にも使
用できる。一般に、そのようなスクリーニング操作に
は、その表面に本発明のレセプターポリペプチドを発現
する適当な細胞の製造を包含する。そのような細胞に
は、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエまたはイー・コ
リからの細胞が包含される。特に、本発明のレセプター
をコードするポリヌクレオチドは、細胞をトランスフェ
クトし、それによりＨＢＭＢＵ１４を発現させるために
使用できる。レセプターを発現する細胞を、ついで試験
化合物と接触させ、結合、刺激または機能性応答の抑制
を観察する。そのようなスクリーニング操作の一つに
は、本発明のＨＢＭＢＵ１４発現のためにトランスフェ
クトされるメラニン細胞の使用が含まれる。そのような
スクリーニング技術は国際公開公報ＷＯ９２／０１８１
０に記載されている。一つの具体例において、この技術
は、レセプターをコードするメラニン細胞をレセプター
リガンドとスクリーニングすべき化合物との両方と接触
させて、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻
害する化合物のスクリーニングに使用される。リガンド
によるシグナル発生の阻害は、化合物がレセプターに対
する潜在的なアンタゴニストであること、すなわち、レ
セプターの活性化を阻害することを示す。この技術はま
た、そのような細胞をスクリーニングすべき化合物と接
触させ、そのような化合物がシグナルを発生するか、否
か、すなわち、レセプターを活性化するか、否かを測定
することにより、レセプターを活性化する化合物のスク
リーニングにも使用できる。

【００８１】他のスクリーニング技術には、レセプター
の活性化によって起こった細胞外ｐＨ変化を測定するシ
ステムにおけるＨＢＭＢＵ１４を発現する細胞（例え
ば、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞）の使用が包含
される（例えば、Science，246：181-296(1989)参
照）。この技術においては、化合物を、本発明のレセプ
ターポリペプチドを発現する細胞と接触させることがで
きる。ついで、第二メッセンジャー応答、例えば、シグ
ナルトランスダクションまたはｐＨ変化を測定し、該潜
在的化合物がレセプターを活性化するか阻害する測定す
る。もう一つのスクリーニング技術には、ＨＢＭＢＵ１
４をコードするＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞へ
導入し、一時的にレセプターを発現させることが包含さ
れる。ついで、レセプター卵母細胞をレセプターリガン
ドおよびスクリーニングすべき化合物と接触させる。レ
セプターの活性化阻害を、例えば、レセプターの活性化
を阻害すると考えられる化合物のスクリーニングの場合
には、カルシウム、プロトンまたは他のイオンのような
シグナルの検出により測定する。他のスクリーニング技
術には、ＨＢＭＢＵ１４の発現が包含され、レセプター
はホスホリパーゼＣまたはＤと結合する。そのような細
胞の代表的な例には、限定するものではないが、内皮細
胞、平滑筋細胞、胎児性腎臓細胞がある。このスクリー
ニングは、上記のごとく、ホスホリパーゼ第二シグナル
からレセプターの活性化またはレセプター活性化の阻害
を検出することにより行うことができる。

【００８２】他の方法には、表面にレセプターを有する
細胞に対するラベルしたリガンドの結合の阻害を測定す
ることによる、アンタゴニストであり、したがって、本
発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合
物のスクリーニングが包含される。そのような方法に
は、真核細胞を、ＨＢＭＢＵ１４をコードするＤＮＡで
トランスフェクトし、細胞がその表面にレセプターを発
現できるようにすることが包含される。細胞をラベルし
た公知のリガンドの存在下で化合物と接触させる。リガ
ンドは、例えば、放射能でラベルできる。レセプターと
結合したラベルしたリガンドの量は、例えば、トランス
フェクトした細胞またはそれからの膜に伴う放射能を測
定する。化合物がレセプターに結合すると、ラベルした
リガンドのレセプターへの結合は、ラベルしたリガンド
の減少により測定されるように、阻害される。他の方法
には、ＨＢＭＢＵ１４介在ｃＡＭＰおよび／またはアデ
ニレートサイクラーゼの蓄積の阻害または刺激を測定す
ることによるＨＢＭＢＵ１４阻害剤のスクリーニングが
包含される。このような方法は、真核細胞をＨＢＭＢＵ
１４レセプターでトランスフェクトし、レセプターを細
胞表面に発現させることが包含される。ついで、細胞を
ＨＢＭＢＵ１４の存在下、潜在的アンタゴニストに暴露
し、ｃＡＭＰ蓄積量を測定する。潜在的アンタゴニスト
がレセプターと結合すると、すなわち、ＨＢＭＢＵ１４
の結合を阻害すると、ＨＢＭＢＵ１４介在ｃＡＭＰまた
はアデニレートサイクラーゼ活性のレベルが減少または
増加する。

【００８３】本発明のレセプターについてのアゴニスト
またはアンタゴニストを検出する他の方法には、米国特
許５,４８２,８３５号に記載される酵母をベースとする
技術が包含される。本発明はまた、ＨＢＭＢＵ１４レセ
プターに対する結合能が未知のリガンドがそのようなレ
セプターに結合するか、否かを測定する方法を提供す
る。この方法は、ＨＢＭＢＵ１４レセプターを発現する
哺乳動物細胞を、リガンドがＨＢＭＢＵ１４レセプター
に結合できる条件下に、リガンドと接触させ、レセプタ
ーに結合したリガンドの存在を検出し、それにより、リ
ガンドがＨＢＭＢＵ１４レセプターと結合するか、否か
を測定することからなる。アゴニストおよび／またはア
ゴニストを測定する上記したシステムはまた、レセプタ
ーへ結合するリガンドの測定にも使用できる。潜在的Ｈ
ＢＭＢＵ１４レセプターアンタゴニストの例には、レセ
プターに結合するが、第二メッセンジャー応答によりレ
セプターの活性化を妨げない抗体または、いくつかの場
合には、オリゴヌクレオチドが包含される。また、潜在
的アンタゴニストには、ＨＢＭＢＵ１４レセプターのリ
ガンドに密接に関係する蛋白質、すなわち、リガンドの
フラグメントも包含され、このような蛋白質は、生物学
的機能を失い、ＨＢＭＢＵ１４レセプターと結合する
と、何の応答も生じない。

【００８４】潜在的アンタゴニストには、アンチセンス
技術を使用して調製したアンチセンス構築物も包含され
る。アンチセンス技術は、三重螺旋形成またはアンチセ
ンスＤＮＡまたはＲＮＡにより遺伝子発現を調節するの
に用いることができ、両方法ともポリヌクレオチドのＤ
ＮＡまたはＲＮＡに対する結合に基づく。例えば、本発
明のマチュアポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド配列の５'コーディング領域は約１０ないし４０ｂｐ
の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドをデザ
インするのに用いられる。ＤＮＡオリゴヌクレオチド
は、転写に関与する遺伝子の領域に相補的になるように
デザインされ（三重螺旋）（Ｌeeら，Nucl.Acids Ｒe
s.，6：3073(1979)；Cooneyら，Science，241：456(198
8)；およびDervanら，Science，251：1360(1991)参
照）、これによりＨＢＭＢＵ１４レセプターの転写およ
び産生を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドは、invivoでｍＲＮＡとハイブリッド形成し、ｍＲ
ＮＡ分子のＨＢＭＢＵ１４レセプター中への転写をブロ
ックする（アンチセンス）（Okano，J．Neurochem.，5
6:560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense In
hibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Rato
n，FL(1988)）。上記オリゴヌクレオチドはまた、細胞
から誘導でき、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを、Ｈ
ＢＭＢＵ１４レセプターの産生を抑制するようにin viv
oで発現できる。他の潜在的アンタゴニストは、ＨＢＭ
ＢＵ１４レセプターと結合してリガンドと接近しにくく
なるようにして正常な生物学的活性を防止する小分子で
ある。小分子の例は、限定するものではないが、小ペプ
チドまたはペプチド様分子である。 他の潜在的アンタ
ゴニストには、可溶性形態のＨＢＭＢＵ１４レセプタ
ー、例えば、レセプターのフラグメントが含まれ、リガ
ンドと結合させ、リガンドが膜結合ＨＢＭＢＵ１４レセ
プターと相互反応するのを防止する。

【００８５】ＨＢＭＢＵ１４レセプターは哺乳動物宿主
において遍在し、多くの病理を含む多くの生物学的機能
に関与する。したがって、一方でＨＢＭＢＵ１４レセプ
ターを刺激し、他方でＨＢＭＢＵ１４レセプターの機能
を抑制できる化合物および試薬を見出すことが望まし
い。一般に、ＨＢＭＢＵ１４レセプターのアゴニスト
は、細菌、糸状菌、原生動物およびウイルス感染、特
に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２によって起こる感染症
のような感染症、疼痛、癌、食欲不振、病的飢餓、喘
息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿
閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、
良性前立腺肥大症および、不安、***症、躁鬱病、せん
妄、痴呆または重度精神薄弱のような精神病および神経
疾患ならびにハンチントン病、ジルドゥラトゥーレット
症候群のような運動異常を包含する機能不全または疾患
の治療または予防に使用できる。ＨＢＭＢＵ１４のアン
タゴニストは、上記の疾患または疾病の種々の治療およ
び予防に使用できる。本発明はさらに過剰のＨＢＭＢＵ
１４活性と関連した異常な状態の治療法であって、患者
に上記阻害化合物（アンタゴニスト）を医薬上許容され
る担体とともに、リガンドのＨＢＭＢＵ１４レセプター
との結合をブロックすることによるか、または第二のシ
グナルを抑制することにより活性化を抑制するのに有効
な量で投与し、それにより異常な症状を軽減することか
らなうる方法を提供する。本発明はまたＨＢＭＢＵ１４
およびその活性の発現不足と関連した異常な症状の治療
法であって、患者に有効量の上記の本発明のレセプター
ポリペプチドを活性化する化合物（アゴニスト）を医薬
上許容される担体とともに投与して、異常な症状を軽減
することからなる方法も提供する。

【００８６】組成物およびキット 可溶性形態のＨＢＭＢＵ１４、およびこのようなレセプ
ターを活性化または抑制する化合物を適当な医薬担体と
組み合わせて用いることができる。このような組成物は
治療上有効量のポリペプチドまたは化合物と医薬上許容
される担体または賦形剤とを含んでなる。このような担
体は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリ
セロール、エタノール、およびその組み合わせを包含す
るが、これに限定されない。処方は投与方法に適合する
ものでなければならない。投与方法に合った適当な担体
の選択は当業者が日常行うことである。本発明はまた、
１またはそれ以上の上記した本発明の医薬組成物の成分
を充填した１またはそれ以上の容器からなる医薬パック
またはキットを提供する。

【００８７】投与 本発明のポリペプチドおよびその他の化合物は、単独
で、または薬効を有する他の化合物と組み合わせて使用
できる。該医薬組成物は、とりわけ、局所、経口、経肛
門、経膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内また
は皮内経路によるなどを包含する、有効で、都合のよい
方法で投与される。医薬組成物は、一般に、具体的な適
応症の治療および予防に有効な量で投与される。一般
に、医薬組成物は、少なくとも１０μｇ／体重ｋｇの量
で投与され、ほとんどの場合、一日あたり約８ｍｇ／体
重ｋｇを超えない量で投与される。好ましくは、ほとん
どの場合、用量は、投与経路、症状などを考慮して毎日
約１０μｇ／体重ｋｇないし約１ｍｇ／ｋｇである。明
らかなごとく、最適用量は、適応症、その重篤度、投与
経路、合併症などを考慮し、個々の治療モダリティーお
よび適応症のための標準的な方法によって決定される。

【００８８】遺伝子療法 ＨＢＭＢＵ１４ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリ
ペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストは、し
ばしば「遺伝子療法」と称される治療モダリティーにお
いてそのようなポリペプチドを発現させることにより本
発明に従って使用できる。すなわち、例えば、患者から
の細胞をex vivoでポリペプチドをコードする、ＤＮＡ
またはＲＮＡのようなポリヌクレオチドで遺伝子操作す
る。遺伝子操作した細胞をついで、ポリペプチドで治療
すべき患者に与える。この具体例においては、例えば、
本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレ
トロウイルスプラスミドベクターを使用することによ
り、細胞をex vivoで遺伝子操作できる。このような方
法は当該分野でよく知られており、本発明におけるそれ
らの使用は、本明細書の記載から明らかであろう。同様
に、細胞をin vivoで遺伝子操作して、当該分野で公知
の操作によりin vivoでポリペプチドを発現できる。例
えば、本発明のポリヌクレオチドは、上記のごとく、複
製欠損レトロウイルスベクター中で発現するように操作
できる。レトロウイルス発現構築物を単離し、本発明の
ポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイ
ルスプラスミドベクターを形質導入したバッケージング
細胞に入れ、パッケージング細胞が関心のある遺伝子を
含有する感染性ウイルス粒子を新たに産生できるように
する。このような産生細胞を、患者に投与し、in vivo
で細胞を操作し、in vivoでポリペプチドを発現させ
る。本発明のポリペプチドを投与するためのこれら、お
よび他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであ
ろう。

【００８９】上記のレトロウイルスプラスミドベクター
を誘導できるレトロウイルスには、限定するものではな
いが、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾壊死ウイル
ス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワ
トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト
免疫不全症ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫
ウイルスおよび乳癌ウイルスが包含される。好ましい態
様においては、レトロウイルスプラスミドベクターは、
モロニーネズミ白血病ウイルスから誘導される。そのよ
うなベクターは、該ポリペプチド発現用の１つ以上のプ
ロモーターを含む。使用できる適当なプロモーターに
は、限定するものではないが、レトロウイルスＬＴＲ、
ＳＶ４０プロモーターおよびMillerら，Biotechnique
s，1989，7：980-990に記載されるヒトサイトメガロウ
イルス（ＣＭＶ）プロモーターが包含される。限定する
ものではないが、ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ
およびβ−アクチンプロモーターを包含する真核細胞プ
ロモーターのような細胞プロモーターも使用できる。さ
らに、使用できるウイルスプロモーターには、限定する
ものではないが、アデノウイルスプロモーター、チミジ
ンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＢ１９パルボウ
イルスプロモーターが包含される。適当なプロモーター
の選択は本明細書の教示から当業者に明らかであろう。

【００９０】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適当なプロモーターの制御下に置かれる。使用で
きる適当なプロモーターには、限定するものではない
が、アデノウイルス主後期プロモーターのようなアデノ
ウイルスプロモーター；サイトメガロウイウス（ＣＭ
Ｖ）プロモーターのようなヘテロローガスプロモータ
ー；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロ
モーター、メタロチオネインプロモーターのような誘導
できるプロモーター；ヒートショックプロモーター；ア
ルブミンプロモーター；ApoAIプロモーター；ヒトグロ
ビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロ
モーターのようなウイルス性チミジンキナーゼプロモー
ター；レトロウイルスＬＴＲ（上記した修飾レトロウイ
ルスＬＴＲを含む）；β−アクチンプロモーターおよび
ヒト成長ホルモンプロモーターが包含される。プロモー
ターはまた、ポリペプチドのコード遺伝子を制御できる
天然のプロモーターでもよい。レトロウイルスプラスミ
ドベクターを、パッケージングセルラインの形質導入に
使用して産生セルラインを形成する。トランスフェクト
できるパッケージング細胞の例としては、限定するもの
ではないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ψ−２、Ψ−Ａ
Ｍ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ
２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅ
ｎｖＡｍ１２およびMiller，A.，HumanGene Therapy，1
990，1：5-14に記載されるＤＮＡセルラインが挙げられ
る。ベクターは、公知のいずれかの方法によりパッケー
ジング細胞に形質導入できる。そのような方法には、限
定するものではないが、電気穿孔法、リポソームの使用
およぎＣaＰＯ₄沈殿が包含される。別法の１つとして、
レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソームに封
入するか、脂質に結合させ、ついで宿主に投与できる。

【００９１】産生セルラインは、該ポリペプチドをコー
ドする核酸配列を含む感染性のレトロウイルスベクター
粒子を生じさせる。そのようなレトロウイルスベクター
粒子を使用してin vitroまたはin vivoで真核細胞に形
質導入できる。形質導入された真核細胞は、該ポリペプ
チドをコードする核酸配列を発現させる。形質導入され
る真核細胞には、限定するものではないが、胎児性幹細
胞、胎児性癌細胞ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽
細胞、筋芽細胞、角化細胞、内皮細胞および気管支上皮
細胞が包含される。

【００９２】

【実施例】以下の実施例により、本発明をさらに説明す
る。以下の実施例は、特定の具体例による例示目的のみ
である。これらの例示は、本発明の、ある種の具体的な
態様を説明するものであるが、本発明の範囲をなんら制
限するものではない。ここで使用する用語については、
上記で既に説明した。全ての実施例は、特に詳細に説明
しない限り、当業者によく知られた、日常的な標準的技
術を用いて行われる。以下の実施例の日常的な分子生物
学技術は、上記サムブルックらのような標準的実験室マ
ニュアルの記載に従って行うことができる。以下の実施
例における全ての部または量は、特に断らない限り、重
量基準である。特に断らない限り、以下の実施例におけ
るフラグメントのサイズ分離は、サムブルックらや、Go
eddel，D.ら，Nucleic Acids Res.，8：4057(1980)のよ
うな他の多くの文献に記載されているアガロースおよび
ポリアクリルアミドゲルを用いる標準的な技術を用いて
行う。特に断らない限り、連結は、標準的な緩衝液、イ
ンキュベーション温度および時間、略等モル量の連結す
べきＤＮＡフラグメントおよびＤＮＡ０．５μ当たり約
１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用い
て行う。

【００９３】実施例１ 哺乳動物細胞におけるレセプターの発現 ＨＢＭＢＵ１４をコードするｃＤＮＡを、発現ベクター
ｐＣＤＮ（N．Aiyarら，Mol．Cell．Biochem，131：75-
86(1994)、この記載を本明細書に組み込む）にクローニ
ングすることにより、発現プラスミドｐＨＢＭＢＵ１４
（６）−ｐＣＤＮ／InvalphaＦ^-を作成する。適当な制
限酵素の選択およびクローニング技術は当業者に公知で
ある。ｐＣＤＮ発現ベクターは以下のものを含む。 （１）ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ー、ウシ成長ホルモン３’フランキング配列、ポリリン
カー、ＳＶ４０イントロン、ｃＤＮＡがＣＭＶプロモー
ターのは発現制御下に都合よく位置でき、ポリリンカー
中の制限部位によりＳＶ４０イントロンとポリアデニレ
ーションシグナルに作動可能に連結できるように配置さ
れたポリアデニレーションシグナル； （２）イー・コリおよび他の原核細胞中での増殖に有効
なイー・コリ複製開始点； （３）ジェネチシン（Ｇ４１８）分泌用の細菌性ネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥＯ）発現
カセット； （４）メトトレキセート（ＭＴＸ）増幅用のネズミジヒ
ドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）発現カセット； （５）プラスミド含有原核細胞の分泌用アンピシリン耐
性遺伝子；および （６）真核細胞での増殖用ＳＶ４０複製開始点。

【００９４】全ＨＢＭＢＵ１４前駆体をコードするＤＮ
Ａフラグメントを該ベクターのポリリンカー領域にクロ
ーニングし、ＣＭＶプロモーターにより組み換え蛋白質
の発現を指示させる。プラスミドの構築法はつぎのとお
りである。得られたプラスミドのＨＢＭＢＵ１４ｃＤＮ
Ａを、特有の制限部位を含むプライマーを使用して増幅
する。レセプター発現を最大にするため、５’および
３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を、ベクターｐＣＤＮに挿入
前に、該特有の制限酵素を使用してレセプターｃＤＮＡ
から除去する。ＰＣＲを使用してｃＤＮＡを切り取るの
で、ＤＮＡ配列を発現前に確認する。適当なプライマー
をこの例で使用する。５’プライマーは長さ約３０ｂｐ
であり、特異的な制限部位とＡＵＧ開始コドンを含む。
３’プライマーは約３０ｂｐの適当な終止コドンを含
む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびｐＣＤＮベク
ターを、この配列に特有の制限酵素で消化し、ついで連
結する。連結混合物をイー・コリ株ＳＵＲＥ（Stratage
ne Cloning Systems，La Jolla，CA92037）に形質転換
し、形質転換培養物をアンピシリン培地平板に接種し、
インキュベーションしてアンピシリン耐性コロニーを増
殖させる。耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを単離
し、ＨＢＭＢＵ１４コーディングフラグメントの存在に
ついて制限分析およびゲルサイジングにより試験する。

【００９５】ヘテロローガスな７ＴＭレセプターの発現
に通常使用されるセルラインであるヒト胎児性腎臓２９
３（ＨＥＫ２９３）細胞を選択してＨＢＭＢＵ１４レセ
プターを発現させる。組み換え体ＨＢＭＢＵ１４の発現
のため、２×１０⁵ＨＥＫ２９３細胞を平板培地に接種
し、５％加湿インキュベーター中、３７℃で一夜インキ
ュベーションした。つぎの日、上記のごとく、２０μ／
平板の発現ベクターＤＮＡを、製造者の指示に従って哺
乳動物トラスフェクションキットを使用し、または、例
えば、上記サムブルックらに記載のＤＥＡＥ−ＤＥＸＴ
ＲＡＮを使用し、リン酸カルシウム法により細胞に導入
する。トランスフェクションについで、３％ＣＯ₂中、
細胞を３７℃で２４時間インキュベーションし、温ダル
ベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄し、新たな
培地を加え、５％ＣＯ₂中、３７℃に維持した。一夜イ
ンキュベーションした後、培地を除き、４００μｇ／ｍ
ｌのＧ４１８を含む新たな選択培地と置換して、発現ベ
クターによって安定に形質転換された細胞を選択する。
選択培地を、独立した細胞コロニーが皿に現れるまで、
２〜４週間、毎週２回交換する。細胞コロニーを個々に
取り上げ、限外希釈により精製し、さらなる分析のため
増殖させる。コロニーを６ウエルプレート中で増殖さ
せ、ヒトＨＢＭＢＵ１４を発現しているクローンセルラ
インを同定する。発現はノーサンブロッティング分析で
検出する。期待したサイズの発現生成物は細胞溶解物に
見られ、陰性対照には見られない（陰性対照としてｐＣ
ＤＮベクターのみをトランスフェクションしたＨＥＫ２
９３細胞クローンを使用）。

【００９６】実施例２ リガンドまたはアンタゴニストの同定 実施例１に記載した発現したレセプターを、以下のリガ
ンドまたはアンタゴニストについてスクリーニングす
る。 Ａ．リガンド／組織バンク 発現したレセプターを、化合物バンク、複合生物学的液
体、組み合わせ有機およびペプチドライブライリーなど
のスクリーニングに使用してリガンドまたはアンタゴニ
ストの活性化を同定する。例えば、ＨＢＭＢＵ１４発現
レセプターを用いて、（ａ）５ＨＴ、バソプレッシン、
ＩＬ−８等のヒト７ＴＭレセプターを介して作用するこ
との知られる伝達物質、ホルモンおよびケンモカイン、
（ｂ）アナンダミド、グリシン、Ｍｇ²⁺等の７ＴＭに対
する推定アゴニストであり得る天然化合物、（ｃ）サバ
ジン、ウロテンシンＩのような哺乳動物いおける対応ペ
プチドが未発見であり得る非哺乳動物性の生物学的に活
性なペプチド、（ｄ）未知の天然リガンドによって７Ｔ
Ｍレセプターを活性化するらしい天然には見だされてい
ない化合物（例、デルタ９ＴＨＣ）などからなる１５０
以上の推定オーファン・レセプターリガンドのバンクを
スクリーニングする。同様に、レセプターをヒト、他の
哺乳動物種の組織、例えば、ブタ組織の組織抽出物につ
いてスクリーニングする。具体的なそのような組織抽出
物には、肺、肝臓、内臓、心臓、腎臓、副腎、虚血脳、
血漿、尿および胎盤が包含される。始めの抽出操作は、
酸またはエタノール沈殿によりバルク蛋白質を除去し、
分離を７ＴＭに対する公知の天然リガンドの高い割合を
占めるペプチドおよび小分子に片寄らせる。ついで、温
和な抽出操作を使用して蛋白質を同定する。これらの組
織バンクの形成に使用する抽出技術は公知である。

【００９７】Ｂ．機能分析 １．アフリカツメガエル卵母細胞分析 細胞表面レセプターの特徴付にはアフリカツメガエル卵
母細胞系を使用する。なぜなら、これらの細胞は、ｍＲ
ＮＡを正確に翻訳し、シグナルペプチド開裂、グリコシ
ル化、ホスホリレーションおよびサブユニットアセンブ
リーを包含する多数のポスト翻訳修飾を行うことができ
るからである。機能分析は以下のようにして行う。in v
itroキャップＲＮＡ転写物を、標準的な方法を用いて、
ＲＮＡポリメラーゼで、ＨＢＭＢＵ１４レセプターｃＤ
ＮＡをコードする鎖状化した鋳型プラスミドから調製す
る。in vitro転写物を最終濃度０．２μｇ／ｍｌで水に
懸濁する。卵巣葉を成熟雌カエルから取り出し、ステー
ジＶ脱嚢卵母細胞を得、ＲＮＡ転写物（１０ｎｇ／卵母
細胞）をDrummondマイクロインジェクション装置を使用
し、５０ｎｌ塊に注射する。２つの電極クランプ（Warn
er Instrument）を使用して、個々のアフリカツメガエ
ル卵母細胞からの電流を測定する。記録は、室温にて、
Ｃa²⁺フリーのバース培地中で行う。

【００９８】２．マイクロフィジオメーター分析 これらのバンクのスクリーニングを、マイクロフィジオ
メーター（例えば、Molecular Devices，Ltd．から入手
できる）を使用して行う。例えば、二次メッセンジャー
システムの活性化は、大きくは、細胞内シグナリング・
プロセスに燃料を供給するのに必要な代謝活性の増加の
結果、細胞からの少量の酸の押し出しをもたらす。細胞
の周囲の培地のｐＨ変化は小さく、マイクロフィジオメ
ーターによって検出できる。かくして、エネルギー利用
細胞内シグナリング経路に伴ういずれのレセプター
（例、Ｇ−蛋白質共役型受容体）の活性化も検出するこ
とができる。

【００９９】３．カルシウム分析 ＨＥＫ２９３細胞中で安定に発現されたレセプターは、
適当な階級順と力を有するアゴニストに対して強いカル
シウム応答を示す。ＨＥＫ２３９細胞で発現され、機能
的に結合してＰＬＣおよびカルシウム移動を活性化する
他の７ＴＭレセプターは非常に多く、限定するものでは
ないが、Ｃ５ａ、エンドセリン、ＩＬ−８等が包含され
る。レセプター・トランスフェクトまたはベクター制御
細胞におけるＨＥＫ２９３細胞の基底カルシウムレベル
は、通常１００ｎＭ〜２００ｎＭの範囲である。組み換
え体レセプターを発現しているＨＥＫ２９３細胞をフラ
２と共に負荷し、１日で、＞１５０の選択したリガンド
を、アゴニスト誘発カルシウム移動について評価する。
一時的カルシウム移動を与えるアゴニストを、ベクター
制御細胞中でテストし、そのカルシウム応答が該一時的
レセプター細胞に特異的か否か決定する。特異的なアゴ
ニスト誘発応答が同定されれば、応答を別の群の細胞に
おいて再現し、効能と関連するリガンドについての濃度
応答曲線で薬理的に特徴付ける。

【０１００】Ｃ．Ｇ−蛋白質α−サブユニットＧ α₁₆と
の共トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞を、通常、
造血細胞に存在するＧ−蛋白質のＧｑファミリーの一員
であるＧ−蛋白質α−サブユニットＧ α₁₆と共トランス
フェクションさせる。Ｇｓ、ＧｉおよびＧｑファミリー
構成員と結合する種々のレセプターを内因性ホスホリパ
ーゼＣと機能的に連結でき、Ｇ α₁₆と共発現すれば（Of
fermannsおよびSimon(1995)）、それらのＧ α₁₆活性化
能の指標となる。カルシウム分析は、レセプターの生理
的シグナリング機構とは独立して、リガンドのスクリー
ニングが都合よく行える。

【０１０１】実施例３ 遺伝子療法用のヒトＨＢＭＢＵ１４の発現 皮膚生検により治療対象から線維芽細胞を得る。得られ
た組織を組織培養培地に入れ、小さな片に分離する。組
織の小塊を組織培地フラスコの湿潤表面に載せる。約１
０個の片を各フラスコに入れる。フラスコを逆さにし、
密閉して室温で一夜放置する。室温で２４時間後、フラ
スコを逆にし、組織をフラスコの底に固定して残す。新
たな培地（例、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレ
プトマイシン加ハムＦ１２培地）を加える。ついで、組
織を３７℃にて約１週間インキュベートする。この時、
新たな培地を加え、ついで、数日ごとに交換する。培養
中でさらに２週間後、線維芽細胞の単層が出現する。こ
の単層をトリプシン処理し、大きなフラスコに掻き出
す。遺伝子治療用のベクターを制限酵素で消化し、発現
させるべきフラグメントをクローニングする。消化した
ベクターをウシ腸ホスファターゼで処理して自己連結を
防ぐ。脱ホスホリル化した鎖状ベクターをアガロースゲ
ル上で分画し、生成する。活性ＨＢＭＢＵ１４を発現で
きるＨＢＭＢＵ１４ｃＤＮＡを単離する。要すれば、ベ
クターにクローニングするげめにフラグメントの末端を
修飾する。例えば、５’オーバーハングは、ＤＮＡポリ
メラーゼで処理してブラント末端とすることができる。
３’オーバーハング末端は、Ｓ１ヌクレアーゼを使用し
て除去できる。Ｔ４ＤＮＡリガーゼで、リンカーをブラ
ント末端に連結できる。

【０１０２】等量のモロニーネズミ白血病ウイルス鎖状
主鎖とＨＢＭＢＵ１４フラグメントを混合し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを使用して連結する。連結混合物をイー・コ
リの形質転換に使用し、ついで、細菌をカナマイシン含
有寒天平板に接種する。カナマイシン表現型および制限
分析により、ベクターが適性に挿入された遺伝子を有す
ることを確認する。パッケージング細胞を、１０％ウシ
血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン加
ダツベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、集約密
度まで 組織培養で増殖させる。ＨＢＭＢＵ１４遺伝子
を含有するベクターを、標準的な技術でパッケージング
細胞に導入する。ＨＢＭＢＵ１４遺伝子を含む感染性ウ
イルス粒子を、今や産生細胞と称されるパッケージング
細胞から収集する。新たな培地を産生細胞に加え、適当
なインキュベーション期間の後、集約的産生細胞の平板
から培地を収集する。感染性ウイルス粒子を含む培地を
ＭＩＬＬＩＰＯＲフィルター（Bedford，MA）を通して
濾過し、剥離した産生細胞を除く。濾過した培地を線維
芽細胞の感染に使用する。培地を線維芽細胞のサブ集約
平板から除去し、速やかに、濾過した培地と置換する。
ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（Aldrich Chemical Co.，Milwauke
e，WI）を培地に入れて形質導入を容易にしてもよい。
適宜なインキュベーションの後、培地を除去し、新たな
培地と置換する。ウイルスの力価が高い場合は、実質的
に全ての線維芽細胞が感染し、選択は要しない。力価が
低い場合は、ｎｅｏまたはｈｉｓのような選択可能なマ
ーカーを有するレトロウイルスベクターを使用して形質
導入された細胞の増殖のため選択する必要がある。

【０１０３】操作された線維芽細胞を単独で、またはＣ
ＹＴＯＤＥＸ３ビーズのようなマイクロキャリヤービー
ズ上で集約するまで増殖させた後、ラットに注射する。
注射した線維芽細胞はＨＢＭＢＵ１４生成物を産生し、
該蛋白質の生物学的作用を宿主に運ぶ。本発明は、上記
の説明および実施例に具体的に記載したように実施でき
ることが明らかであろう。上記の教示の下で、多くの修
飾および変形が可能であり、したがって、それらも本発
明の範囲のものである。

【０１０４】配 列 表 （１）一般的情報： （i）出願人：エルシャワーバギー，ナビル・エイ バーグズマ，ダーク・ジェイ エリス，キャサリン・エイ （ii）発明の名称： ヒト７回貫通型レセプター （iii）配列の数：２ （iv）連絡先： （Ａ）名称：スミスクライン・ビーチャム・コーポレイ
ション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１９４０６−２７９９ （v）コンピューター読取り可能な形態： （Ａ）媒体形態：フロッピーデスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ
−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release＃１.０バージ
ョン１.３０ （vi）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （viii）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ハン，ウィリアム・テイ （Ｂ）登録番号：３４,３４４ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＡＴＧ５００２０ （ix）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５２１９ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０

【０１０５】（２） 配列番号：１の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２２３８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （ix）特徴 （Ａ）名前／キー：ＣＤＳ （Ｂ）ロケーション：３３２..１３５７ （xi）配列の記載：配列番号：１： AGCGACTTTT GGTTTCAAAA TAATTGAGCA CAGGATTTTA TGGAATGTGC TTAGGGGTCA 60 GTTATGAGTT GTCTCCCAGA TGGGTGAGAT CCTGAGAATT TTCAGGCTAA TGGAGAGTCC 120 TCATCCTGTC TGAGCAATTT CCCCTCAGAA TTGGTTATCT TCAATATACT GGACTGTGCT 180 GTTTCTACAC ATCCCAGTGG GTGGGTTTAG AAGATGACTA TTTGCCCCCT AAATGTGGTC 240 AATGGGATAG CAGGAAGACA AAGAATGCCA TCCTCAGCCC CAAATATAAT TCCTGGGTTC 300 TGACTCACAG GTGTTCATCA GAACAGACAC C ATG GCA GAG CAT GAT TAC CAT 352 Met Ala Glu His Asp Tyr His 1 5 GAA GAC TAT GGG TTC AGC AGT TTC AAT GAC AGC AGC CAG GAG GAG CAT 400 Glu Asp Tyr Gly Phe Ser Ser Phe Asn Asp Ser Ser Gln Glu Glu His 10 15 20 CAA GAC TTC CTG CAG TTC AGC AAG GTC TTT CTG CCC TGC ATG TAC CTG 448 Gln Asp Phe Leu Gln Phe Ser Lys Val Phe Leu Pro Cys Met Tyr Leu 25 30 35 GTG GTG TTT GTC TGT GGT CTG GTG GGG AAC TCT CTG GTG CTG GTC ATA 496 Val Val Phe Val Cys Gly Leu Val Gly Asn Ser Leu Val Leu Val Ile 40 45 50 55 TCC ATC TTC TAC CAT AAG TTG CAG AGC CTG ACG GAT GTG TTC CTG GTG 544 Ser Ile Phe Tyr His Lys Leu Gln Ser Leu Thr Asp Val Phe Leu Val 60 65 70 AAC CTA CCC CTG GCT GAC CTG GTG TTT GTC TGC ACT CTG CCC TTC TGG 592 Asn Leu Pro Leu Ala Asp Leu Val Phe Val Cys Thr Leu Pro Phe Trp 75 80 85 GCC TAT GCA GGC ATC CAT GAA TGG GTG TTT GGC CAG GTC ATG TGC AAG 640 Ala Tyr Ala Gly Ile His Glu Trp Val Phe Gly Gln Val Met Cys Lys 90 95 100 AGC CTA CTG GGC ATC TAC ACT ATT AAC TTC TAC ACG TCC ATG CTC ATC 688 Ser Leu Leu Gly Ile Tyr Thr Ile Asn Phe Tyr Thr Ser Met Leu Ile 105 110 115 CTC ACC TGC ATC ACT GTG GAT CGT TTC ATT GTA GTG GTT AAG GCC ACC 736 Leu Thr Cys Ile Thr Val Asp Arg Phe Ile Val Val Val Lys Ala Thr 120 125 130 135 AAG GCC TAC AAC CAG CAA GCC AAG AGG ATG ACC TGG GGC AAG GTC ACC 784 Lys Ala Tyr Asn Gln Gln Ala Lys Arg Met Thr Trp Gly Lys Val Thr 140 145 150 AGC TTG CTC ATC TGG GTG ATA TCC CTG CTG GTT TCC TTG CCC CAA ATT 832 Ser Leu Leu Ile Trp Val Ile Ser Leu Leu Val Ser Leu Pro Gln Ile 155 160 165 ATC TAT GGC AAT GTC TTT AAT CTC GAC AAG CTC ATA TGT GGT TAC CAT 880 Ile Tyr Gly Asn Val Phe Asn Leu Asp Lys Leu Ile Cys Gly Tyr His 170 175 180 GAC GAG GCA ATT TCC ACT GTG GTT CTT GCC ACC CAG ATG ACA CTG GGG 928 Asp Glu Ala Ile Ser Thr Val Val Leu Ala Thr Gln Met Thr Leu Gly 185 190 195 TTC TTC TTG CCA CTG CTC ACC ATG ATT GTC TGC TAT TCA GTC ATA ATC 976 Phe Phe Leu Pro Leu Leu Thr Met Ile Val Cys Tyr Ser Val Ile Ile 200 205 210 215 AAA ACA CTG CTT CAT GCT GGA GGC TTC CAG AAG CAC AGA TCT CTA AAG 1024 Lys Thr Leu Leu His Ala Gly Gly Phe Gln Lys His Arg Ser Leu Lys 220 225 230 ATC ATC TTC CTG GTG ATG GCT GTG TTC CTG CTG ACC CAG ATG CCC TTC 1072 Ile Ile Phe Leu Val Met Ala Val Phe Leu Leu Thr Gln Met Pro Phe 235 240 245 AAC CTC ATG AAG TTC ATC CGC AGC ACA CAC TGG GAA TAC TAT GCC ATG 1120 Asn Leu Met Lys Phe Ile Arg Ser Thr His Trp Glu Tyr Tyr Ala Met 250 255 260 ACC AGC TTT CAC TAC ACC ATC ATG GTG ACA GAG GCC ATC GCA TAC CTG 1168 Thr Ser Phe His Tyr Thr Ile Met Val Thr Glu Ala Ile Ala Tyr Leu 265 270 275 AGG GCC TGC CTT AAC CCT GTG CTC TAT GCC TTT GTC AGC CTG AAG TTT 1216 Arg Ala Cys Leu Asn Pro Val Leu Tyr Ala Phe Val Ser Leu Lys Phe 280 285 290 295 CGA AAG AAC TTC TGG AAA CTT GTG AAG GAC ATT GGT TGC CTC CCT TAC 1264 Arg Lys Asn Phe Trp Lys Leu Val Lys Asp Ile Gly Cys Leu Pro Tyr 300 305 310 CTT GGG GTC TCA CAT CAA TGG AAA TCT TCT GAG GAC AAT TCC AAG ACT 1312 Leu Gly Val Ser His Gln Trp Lys Ser Ser Glu Asp Asn Ser Lys Thr 315 320 325 TTT TCT GCC TCC CAC AAT GTG GAG GCC ACC AGC ATG TTC CAG TTA 1357 Phe Ser Ala Ser His Asn Val Glu Ala Thr Ser Met Phe Gln Leu 330 335 340 TAGGCCTTGC CAGGGTTTCG AGAAGCTGCT CTGGAATTTG CAAGGCATGG CTGTGCCCTC 1417 TTGATGTGGT GAGGCAGGCT TTGTTTATAG CTTGCGCATT CTCATGGAGA AGTTATCAGA 1477 CACTCTGGCT GGTTTGGAAT GCTTCTTCTC AGGCATGAAC ATGTACTGTT CTCTTCTTGA 1537 ACACTCATGC TGAAAGCCCA AGTAGGGGGT CTAAAATTTT TAAGGACTTT CCTTCCTCCA 1597 TCTCCAAGAA TGCTGAAACC AAGGGGGATG ACATGTGACT CCTATGATCT CAGGTTCTCC 1657 TTGATTGGGA CTGGGGCTGA AGGTTGAAGA GGTGAGCACG GCCAACAAAG CTGTTGATGG 1717 TAGGTGGCAC ACTGGGTGCC CAAGCTCAGA AGGCTCTTCT GACTACTGGG CAAAGAGTGT 1777 AGATCAGAGC AGCAGTGAAA ACAAGTGCTG GCACCACCAG GCACCTCACA GAAATGAGAT 1837 CAGGCTCTGC CTCACCTTGG GGCTTGACTT TTGTATAGGT AGATGTTCAG ATTGCTTTGA 1897 TTAATCCAGA ATAACTAGCA CCAGGGACTA TGAATGGGCA AAACTGAATT ATAAGAGGCT 1957 GATAATTCCA GTGGTCCATG GAATGCTTGA AAAATGTGCA AAACAGCGTT TAAGACTGTA 2017 ATGAATCTAA GCAGCATTTC TGAAGTGGAC TCTTTGGTGG CTTTGCATTT TAAAAATGAA 2077 ATTTTCCAAT GTCTGCCACA CAAACGTATG TAAATGTATA TACCCACACA CATACACACA 2137 TATGTCATAT ATTACTAGCA TATGAGTTTC ATAGCTAAGA AATAAAACTG TTAAAGTCTC 2197 CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 2238

【０１０６】（２） 配列番号：２の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３４２アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記載：配列番号：２： Met Ala Glu His Asp Tyr His Glu Asp Tyr Gly Phe Ser Ser Phe Asn 1 5 10 15 Asp Ser Ser Gln Glu Glu His Gln Asp Phe Leu Gln Phe Ser Lys Val 20 25 30 Phe Leu Pro Cys Met Tyr Leu Val Val Phe Val Cys Gly Leu Val Gly 35 40 45 Asn Ser Leu Val Leu Val Ile Ser Ile Phe Tyr His Lys Leu Gln Ser 50 55 60 Leu Thr Asp Val Phe Leu Val Asn Leu Pro Leu Ala Asp Leu Val Phe 65 70 75 80 Val Cys Thr Leu Pro Phe Trp Ala Tyr Ala Gly Ile His Glu Trp Val 85 90 95 Phe Gly Gln Val Met Cys Lys Ser Leu Leu Gly Ile Tyr Thr Ile Asn 100 105 110 Phe Tyr Thr Ser Met Leu Ile Leu Thr Cys Ile Thr Val Asp Arg Phe 115 120 125 Ile Val Val Val Lys Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Gln Gln Ala Lys Arg 130 135 140 Met Thr Trp Gly Lys Val Thr Ser Leu Leu Ile Trp Val Ile Ser Leu 145 150 155 160 Leu Val Ser Leu Pro Gln Ile Ile Tyr Gly Asn Val Phe Asn Leu Asp 165 170 175 Lys Leu Ile Cys Gly Tyr His Asp Glu Ala Ile Ser Thr Val Val Leu 180 185 190 Ala Thr Gln Met Thr Leu Gly Phe Phe Leu Pro Leu Leu Thr Met Ile 195 200 205 Val Cys Tyr Ser Val Ile Ile Lys Thr Leu Leu His Ala Gly Gly Phe 210 215 220 Gln Lys His Arg Ser Leu Lys Ile Ile Phe Leu Val Met Ala Val Phe 225 230 235 240 Leu Leu Thr Gln Met Pro Phe Asn Leu Met Lys Phe Ile Arg Ser Thr 245 250 255 His Trp Glu Tyr Tyr Ala Met Thr Ser Phe His Tyr Thr Ile Met Val 260 265 270 Thr Glu Ala Ile Ala Tyr Leu Arg Ala Cys Leu Asn Pro Val Leu Tyr 275 280 285 Ala Phe Val Ser Leu Lys Phe Arg Lys Asn Phe Trp Lys Leu Val Lys 290 295 300 Asp Ile Gly Cys Leu Pro Tyr Leu Gly Val Ser His Gln Trp Lys Ser 305 310 315 320 Ser Glu Asp Asn Ser Lys Thr Phe Ser Ala Ser His Asn Val Glu Ala 325 330 335 Thr Ser Met Phe Gln Leu 340

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトＨＢＭＢＵ１４の塩基配列（配列番号
１）およびその推定アミノ酸配列（配列番号２）であ
る。

【図２】 ヒトＨＢＭＢＵ１４の塩基配列（配列番号
１）およびその推定アミノ酸配列（配列番号２）であ
る。

【図３】 ヒトＨＢＭＢＵ１４の塩基配列（配列番号
１）およびその推定アミノ酸配列（配列番号２）であ
る。

【図４】 ヒトＨＢＭＢＵ１４の塩基配列（配列番号
１）およびその推定アミノ酸配列（配列番号２）であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 39/395 ＡＡＢ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 48/00 ＡＤＹ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＭ Ｃ０７Ｋ 14/705 ＡＢＦ 16/28 ＡＢＮ Ｃ１２Ｎ 5/10 ＡＣＬ Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＤＵ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ダーク・ジェイ・バーグスマ アメリカ合衆国19312ペンシルベニア州バ ーウィン、アイリッシュ・ロード271番 (72)発明者 キャサリン・イー・エリス アメリカ合衆国08028ニュージャージー州 グラスボロー、フォーダム・プレイス831 番

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）配列番号２のアミノ酸からなるポリ
   ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なく
   とも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド；（ｂ）
   配列番号２と同じアミノ酸をコードする遺伝コードの重
   複性によるポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと相補性
   のポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
   の少なくとも１５個の連続した塩基からなるポリヌクレ
   オチド；からなる群より選択されポリヌクレオチドから
   なる単離されたポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
   １記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
   １記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号１に示す塩基からなる請求項２
   記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号１に示す第１番目〜第２２３８
   番目の塩基からなる請求項２記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列番号２のアミノ酸からなるポリペプ
   チドをコードする請求項２記載のポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】（ａ）ＡＴＣＣ受託番号９８２２６に含ま
   れるヒトｃＤＮＡによって発現されると同じマチュア・
   ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少
   なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ受託番号９８２２６に含まれるヒトｃＤ
   ＮＡによって発現されると同じマチュア・ポリペプチド
   をコードするポリヌクレオチドの、遺伝コードの重複性
   によるポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに相補性
   のポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
   の少なくとも１５個の連続した塩基からなるポリヌクレ
   オチド；からなる群より選択されポリヌクレオチドから
   なる単離されたポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項２記載のＤＮＡを含有するベクタ
   ー。
9. 【請求項９】 請求項８のベクターを含む宿主細胞。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の宿主から前記ＤＮＡに
    よりコードされるポリペプチドを発現させることからな
    るポリペプチドの産生法。
11. 【請求項１１】 細胞から、請求項８に記載のベクター
    に含まれるヒトｃＤＮＡによってコードされるポリペプ
    チドが発現されるように該細胞を該ベクターで形質転換
    またはトランスフェクションすることからなるポリペプ
    チドを発現する細胞の産生法。
12. 【請求項１２】 配列番号２のアミノ酸配列と少なくと
    も７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペ
    プチド。
13. 【請求項１３】 配列番号２に示すアミノ酸配列からな
    るポリペプチド。
14. 【請求項１４】 請求項１２記載のポリペプチドに対す
    るアゴニスト。
15. 【請求項１５】 請求項１２記載のポリペプチドに対す
    る抗体。
16. 【請求項１６】 請求項１２記載のポリペプチドに対す
    るアンタゴニスト。
17. 【請求項１７】 治療上有効量の請求項１２記載のポリ
    ペプチドを患者に投与することからなるＨＢＭＢＵ１４
    の必要性を有する患者の治療法。
18. 【請求項１８】 該ポリペプチドをコードするＤＮＡを
    患者に与え、該ポリペプチドをin vivoで発現させるこ
    とにより該治療上有効量のポリペプチドを投与する請求
    項１７記載の方法。
19. 【請求項１９】 治療上有効量の請求項１６記載のアン
    タゴニストを患者に投与することからなるＨＢＭＢＵ１
    ４ポリペプチド阻害の必要性を有する患者の治療法。
20. 【請求項２０】 請求項１２記載のポリペプチドをコー
    ドする塩基配列における突然変異を測定することからな
    る該ポリペプチドの発現に関係する疾患または疾患の疑
    いを診断する方法。
21. 【請求項２１】 宿主から由来する試料中の請求項１２
    記載のポリペプチドの存在を分析することからなる診断
    方法。
22. 【請求項２２】 請求項１２記載のポリペプチドに対す
    るレセプターと結合し、それを活性化または阻害する化
    合物の同定法であって、化合物の結合に応じて検出可能
    なシグナルを提供できる第二の成分を伴う該ポリペプチ
    ドに対するレセプターを表面に発現している細胞を、ス
    クリーニングすべき化合物と接触させてレセプターと結
    合させ、該化合物とレセプターとの相互反応から生じる
    シグナルの存在または不存在を検出して、化合物がレセ
    プターと結合し、活性するか、阻害するかを測定するこ
    とからなる方法。